JP2005519609A - Pit−1及びカッパ−カゼイン遺伝子多型の分析による良好な乳生産資質を有する可能性のある動物の同定方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は、Pit-1及びΚ−カゼイン遺伝子の多型の分析によって、動物の乳生産潜在能力を判定するための方法及びキットに関連する。特に、本発明は有利な乳生産形質を表す遺伝子型を有する哺乳類を同定する方法に関し、該方法において、Pit-1遺伝子の対立遺伝子A及び/又はT、及びΚ-カゼイン遺伝子の対立遺伝子Bが同時に存在することが、前記哺乳類における乳生産及びタンパク質生産の高い潜在能力を示す。
Description
前記選択は、同じ形質を有する動物を交配させ、その形質が次世代に優勢になることを期待することによって、数世代にわたって行われる。
この種の選択は、必要とする時間の長さ故の数々の不利益を有し、またその分野の熟練した飼育者による判定を必要とする。
この飼育者による判定は、観察と仮定に基づいており、それ故に経験に関連したある程度の主観を含んでいる。さらに、ある世代においてそのような方法により選択された形質が、次世代に伝えられるとは限らない。
生産量(例えばソマトトロピン中枢の遺伝子)及び乳品質(例えばタンパク質の変動に関する遺伝子)の両方に関する。
a)前記哺乳類のDNAを含む生物学的サンプル(または組織)を得る工程;
b)前記哺乳類のPit-1及びκ-カゼイン遺伝子の多型を分析する工程、ここで、Pit-1遺伝子の対立遺伝子A及び/又はT並びにκ-カゼイン遺伝子の対立遺伝子Bが同時に存在することが、前記哺乳類における乳生産及びタンパク質生産の高い潜在能力を示す。
5'-ATCATTTATGGCCATTCCACCAAAG-3'(配列番号:1)及び
5'-GCCCATTTCGCCTTCTCTGTAACAGA-3'(配列番号:2)。
カッパFプライマー:5'-CCGAAGCAGTAGAGAGCACTGTAG-3'(配列番号:3)
カッパRプライマー:5'-TCTCAGGTGGGCTCTCAATAACTT-3'(配列番号:4)
カッパVicプローブ:5'-TACTCTAGAAGATTCTC-3'(配列番号:5)
カッパFamプローブ:5'-TACTCTAGAAGCTTCTC-3'(配列番号:6)。
5'-AAACCATCATCTCCCTTCTT-3'(配列番号:7)
5'-AATGTACAATGTGCCTTCTGAG-3' (配列番号:8)。
・エクソン6における対立遺伝子特異的増幅用:
5'-CAGAGAGAAAAACGGGTGAAGACAAGCATG-3'(配列番号:9);対立遺伝子Bに特異的;
5'-CAGAGAGAAAAACGGGTGAAGACAAGCATA-3'(配列番号:10);対立遺伝子Aに特異的;及び
5'-AGATAGAGGGAAAGATATAGTGAAAGGGACAG-3'(配列番号:11);逆プライマーとして;
・エクソン2における対立遺伝子特異的増幅用:
5'-C TGC CAT CAC GCC ATA GTT C-3'(配列番号:12),対立遺伝子Cに特異的;
5'-C TGC CAT CAC GCC ATA GTT T-3'(配列番号:13),対立遺伝子Tに特異的;及び
5'-CA ACA GGA CTT CAT TAT TCT GTT CCT CAT TAT TCT GTT CCT T -3'(配列番号:14)逆プライマーとして。
PIT-1 Fプライマー:5'-CATTCGAGATGCTCCTTAGAAATAGTAA-3'(配列番号:15);
PIT-1Rプライマー:5'-GTTTTGTAACCGAAGGCAGAGAGA-3'(配列番号:16);
PIT-1MGB FAMプローブ:5'-AACTCTGATTTAGGCTTG-3'(対立遺伝子A用)(配列番号:17);及び
PIT-1MGB VICプローブ:5'-AACTCTGATTCAGGCTT-3'(対立遺伝子B用)(配列番号:18)。
5'-AAACCATCATCTCCCTTCTT-3'(配列番号:7);及び
5'-AATGTACAATGTGCCTTCTGAG-3'(配列番号:8);
及びκ-カゼイン遺伝子のヌクレオチド5345を含む断片を増幅するための次のプライマー:
5'-ATCATTTATGGCCATTCCACCAAAG-3'(配列番号:1)及び
5'-GCCCATTTCGCCTTCTCTGTAACAGA-3'(配列番号:2)
を具備してよい:
さらなる側面において、本発明は、ウシにおける有利な乳生産形質を表す遺伝子型を同定するためのキットに関し、Pit-1遺伝子の断片の対立遺伝子特異的増幅及び/又は検出を実行するためのオリゴヌクレオチド、及びκ-カゼイン遺伝子の断片の対立遺伝子特異的増幅及び/又は検出を実行するためのオリゴヌクレオチドを具備する。
5'-CAGAGAGAAAAACGGGTGAAGACAAGCATG-3' (配列番号:9);対立遺伝子Bに特異的;
5'-CAGAGAGAAAAACGGGTGAAGACAAGCATA-3'(配列番号:10);対立遺伝子Aに特異的;及び
5'-AGATAGAGGGAAAGATATAGTGAAAGGGACAG-3'(配列番号:11);逆プライマーとして。
5'-C TGC CAT CAC GCC ATA GTT C-3'(配列番号:12),対立遺伝子Cに特異的;
5'-C TGC CAT CAC GCC ATA GTT T-3'(配列番号:13),対立遺伝子Tに特異的;及び
5'-CA ACA GGA CTT CAT TAT TCT GTT CCT CAT TAT TCT GTT CCT T -3'(配列番号:14)逆プライマーとして。
カッパFプライマー:CCGAAGCAGTAGAGAGCACTGTAG(配列番号:3);
カッパRプライマー:TCTCAGGTGGGCTCTCAATAACTT(配列番号:4);
カッパVicプローブ:TACTCTAGAAGATTCTC(配列番号:5);
カッパFamプローブ:TACTCTAGAAGCTTCTC(配列番号:6);
また、次のプライマー及びプローブが、Pit-1遺伝子の断片の対立遺伝子特異的検出のためのオリゴヌクレオチドを構成する:
PIT-1 Fプライマー:CATTCGAGATGCTCCTTAGAAATAGTAA(配列番号:15);
PIT-1Rプライマー:GTTTTGTAACCGAAGGCAGAGAGA(配列番号:16);
PIT-1MGB FAMプローブ:AACTCTGATTTAGGCTTG(対立遺伝子A用)(配列番号:17);及び
PIT-1MGB VICプローブ:AACTCTGATTCAGGCTT(対立遺伝子B用)(配列番号:18)。
RFLP分析によるカッパ−カゼインのA及びB対立遺伝子の判定
反応混合物は、H2O,10×バッファー、2mM MgCl2、20pmolのプライマー、0.2mMのdNTPs、100ng/25μlのDNA、及び0.6U/25μlのポリメラーゼ[Goldstar DNA Polymerase, EUROGENTEC]で構成される。PCR反応サイクルは、最初に、96℃で3分間の変性期間、続いて94℃で1分間、66℃で1分間、及び72℃で1分間を40サイクルで構成した。末端伸長期間は72℃で10分間行った。
5'-GCCCATTTCGCCTTCTCTGTAACAGA-3'。
対立遺伝子特異的検出によるカッパ-カゼインのA及びB対立遺伝子の判定
反応混合物は、プライマー及びプローブの存在下、Taq Man Univesal PCR master mix(Applied Biosystems Inc)から構成した。
カッパRプライマー 900nM
Fam カッパプローブ 200nM
Vic カッパプローブ 200nM
水で容積を5μlにした。
Fプライマー:CCGAAGCAGTAGAGAGCACTGTAG(配列番号:3);及び
Rプライマー:TCTCAGGTGGGCTCTCAATAACTT(配列番号:4);
プローブ:
Vicプローブ:TACTCTAGAAGATTCTC(配列番号:5);及び
Famプローブ:TACTCTAGAAGCTTCTC(配列番号:6)。
RFLP分析によるPit-1遺伝子のA及びB対立遺伝子の判定
ヌクレオチド1178におけるPit-1遺伝子の多型を次のプライマーを用いて分析した:
5'-AAACCATCATCTCCCTTCTT-3'(配列番号:7);及び
5'-AATGTACAATGTGCCTTCTGAG-3'(配列番号:8)。
該増幅の産物は、451塩基対の断片であった。この断片を、制限酵素Hinf1と共にインキュベーションすることで、二つの対立遺伝子を識別することができた:対立遺伝子AはHinf1によって切断されず、対立遺伝子BはHinf1の制限サイトを含み、これは244及び207塩基対を有する二つの断片を生じさせる。
対立遺伝子特異的増幅によるPit-1遺伝子のエクソン6のA及びB対立遺伝子の判定
この方法は、PCRのために、3´末端に位置するヌクレオチドが異なる二つのプライマーを用いることに基づく。この相違は、遺伝子の二つの対立遺伝子のうちの一つに関するプライマーの特異性に起因する。従ってこの方法は、それぞれの対立遺伝子に特異的プライマーを用い、制限酵素の使用は必要としない。
5'-CAGAGAGAAAAACGGGTGAAGACAAGCATG-3'(配列番号:9);対立遺伝子Bに特異的;
5'-CAGAGAGAAAAACGGGTGAAGACAAGCATA-3'(配列番号:10);対立遺伝子Aに特異的;
5'-AGATAGAGGGAAAGATATAGTGAAAGGGACAG-3'(配列番号:11);逆プライマーとして。
対立遺伝子特異的増幅によるPit-1遺伝子のエクソン2のC及びT対立遺伝子の判定
第二の多型サイトを、Pit-1遺伝子における一本鎖コンホメーション多型(SSCP)を用いて判定した。遺伝子の多型部分の配列が、同定されるべき原因変異を生じさせる。これはタンパク質トランス活性化領域のセリンのコドン65でのA→G移行であった。アミノ酸はこの変異によっては改変されなかった。この変異に起因する二つの対立遺伝子は、SSCPにおいて三つの多型プロフィールが存在することの原因である。
Pit-T : 5'-C TGC CAT CAC GCC ATA GTT T-3' (配列番号:13)
Pit-R : 5'-CA ACA GGA CTT CAT TAT TCT GTT CCT CAT TAT TCT GTT CCT T-3' (配列番号:14)。
Pit-1遺伝子(エクソン6)の影響とκ-カゼイン遺伝子の影響の組合せ
1100のホルスタインの雄牛のサンプルについて、ヌクレオチド5345の点変異でのκ-カゼインの遺伝子の遺伝子型が、変異Bを変異Aと区別したAlexanderら(1988)によって決定された。遺伝子型AA、AB及びBBの頻度は次の通り:それぞれ、75%、23%及び2%であり、対立遺伝子Aの86.5%及び対立遺伝子Bの13.5%に対応している。それらはハーディー・ワインベルグの法則に従う。これらの頻度は、Van Eenennaam及びMedrano(1991)が1152のホルスタイン雌牛から得たもの(82%A及び18%B)及びRonら(1994)が119のホルスタイン雄牛から得たもの(78.6%AA,20.5%AB、及び0.9%BB)と類似している。
異なる遺伝子で研究された対立遺伝子の置換の影響は、1100のカナディアンホルスタイン雄牛の109443の娘の総量2397037催乳から算出した。公式の催乳データは、「カナディアンデイリーネットワーク」による。表2は、平均値、標準偏差、305日間の催乳を基本に生産された乳、脂肪、及びタンパク質の量の計算された最大及び最小値を示す。比較的高い標準偏差及び比較的広い最大-最小幅は、このサンプルの乳生産性に関する多様性を示している。これらの値は、高い性能の雌牛及びそれより劣る他の雌牛を含む非選択サンプルの特徴である。
対立遺伝子の確率は、カナダの動物モデルを単純化したバージョンに導入した。
y=Xh+Tt+Qr+Zp+Z*a+e
ここで:
y=305日間の催乳生産のベクトル(乳、脂肪、またはタンパク質);
h=固定された群れ-年-季節(10月〜2月及び3月〜9月)−パリティ(早いまたは高い)効果のベクトル;
t=固定された催乳(1〜6またはそれ以上)−歳分類−催乳月の影響のベクトル;
r=転換された対立遺伝子確率での2回帰係数のベクトル;
p=無作為な持続的環境効果のベクトル;
a=無作為な多遺伝子効果のベクトル;
e=無作為な残りの効果のベクトル;
X,T,Z及びZ*=h,t,p及びa〜yに関連した出現率マトリックス;及び
Q=2-カラム回帰可変マトリックス、それぞれの対立遺伝子確率につき1カラム(Pit-1、Κ-カゼイン)。
Claims (23)
- 有利な乳生産形質を表す遺伝子型を有する哺乳類を同定するための方法であって、
a)前記哺乳類のDNAを含む生物学的サンプルを得る工程;
b)前記哺乳類のPit-1及びκ-カゼイン遺伝子の多型を分析する工程、ここで、Pit-1遺伝子の対立遺伝子A及び/又はT並びにκ-カゼイン遺伝子の対立遺伝子Bが同時に存在することが、前記哺乳類における乳生産及びタンパク質生産の高い潜在能力を示す;
を具備する方法。 - 有利な乳生産形質を表す遺伝子型を有する哺乳類を同定するための方法であって、前記ウシからの生物学的サンプルにおいて、前記哺乳類のPit-1及びκ-カゼイン遺伝子の多型を分析することを具備し、ここで、Pit-1遺伝子の対立遺伝子A及び/又はT並びにκ-カゼイン遺伝子の対立遺伝子Bが同時に存在することが、前記哺乳類における乳生産及びタンパク質生産の高い潜在能力を示す方法。
- 前記哺乳類はウシである、請求項1または2に記載の同定方法。
- 請求項1〜3に記載の同定方法であって、前記κ-カゼインの対立遺伝子Bの存在が、チーズの生産に有利であるラクトダイナモグラフィー的な乳品質をも示す方法。
- 前記工程a)が動物の毛嚢由来からの細胞を用いて行われる、請求項1〜4に記載の同定方法。
- 前記工程b)が、κ-カゼイン遺伝子について、前記κ-カゼイン遺伝子のヌクレオチド5345を含む断片を増幅させることと、該増幅産物を制限酵素Hinflで消化させることとによる制限断片長多型(RFLP)によって行われる、請求項1〜5に記載の同定方法。
- 前記ヌクレオチド5345を含むκ-カゼイン遺伝子断片が、次のプライマーで増幅されることを特徴とする、請求項6に記載の同定方法:
5'-ATCATTTATGGCCATTCCACCAAAG-3' (配列番号:1)及び
5'-GCCCATTTCGCCTTCTCTGTAACAGA-3' (配列番号:2)。 - 前記工程b)が、κ-カゼイン遺伝子について、対立遺伝子特異的増幅及び/又は検出によって行われる、請求項1〜5の何れかに記載の同定方法。
- κ-カゼイン遺伝子の対立遺伝子特異的増幅が、次のプライマー:
5'-CCGAAGCAGTAGAGAGCACTGTAG-3'(配列番号:3);
5'-TCTCAGGTGGGCTCTCAATAACTT-3'(配列番号:4);
及び次のプローブ:
Vic:5'-TACTCTAGAAGATTCTC-3'(配列番号:5);
Fam:5'-TACTCTAGAAGCTTCTC-3'(配列番号:6);
を用いて行われる、請求項8に記載の同定方法。 - 前記工程b)が、Pit-1遺伝子について、前記Pit-1遺伝子のヌクレオチド1178を含む断片を増幅させることと、該増幅産物を制限酵素Hinflで消化させることとによる制限断片長多型分析(RFLP)によって行われる、請求項1〜9の何れか一項に記載の同定方法。
- 前記ヌクレオチド1178を含むPit-1遺伝子断片が、次のプライマーで増幅される請求項10に記載の同定方法:
5'-AAACCATCATCTCCCTTCTT-3'(配列番号:7)
5'-AATGTACAATGTGCCTTCTGAG-3'(配列番号:8)。 - 前記工程b)が、Pit-1遺伝子について、対立遺伝子特異的増幅及び/又は検出によって行われる、請求項1〜9の何れか一項に記載の同定方法。
- 前記Pit-1遺伝子の対立遺伝子特異的増幅は、次のプライマー:
5'-CAGAGAGAAAAACGGGTGAAGACAAGCATG-3'(配列番号:9);対立遺伝子Bに特異的;
5'-CAGAGAGAAAAACGGGTGAAGACAAGCATA-3'(配列番号:10);対立遺伝子Aに特異的;及び、
逆プライマーとして5'-AGATAGAGGGAAAGATATAGTGAAAGGGACAG -3' (配列番号:11);
を用いてエクソン6において行われる、請求項12に記載の同定方法。 - 前記Pit-1遺伝子の対立遺伝子特異的増幅は、次のプライマー:
5'-C TGC CAT CAC GCC ATA GTT C -3'(配列番号:12),対立遺伝子Cに特異的;
5'-C TGC CAT CAC GCC ATA GTT T -3'(配列番号:13),対立遺伝子Tに特異的;及び、
逆プライマーとして5'-CA ACA GGA CTT CAT TAT TCT GTT CCT CAT TAT TCT GTT CCT T -3'(配列番号:14);
を用いて、エクソン2において行われる、請求項12に記載の同定方法。 - 前記Pit-1遺伝子の対立遺伝子特異的増幅は、次のプライマー:
PIT-1 F プライマー: 5'-CATTCGAGATGCTCCTTAGAAATAGTAA -3' (配列番号:15);
PIT-1 R プライマー: 5'-GTTTTGTAACCGAAGGCAGAGAGA -3' (配列番号:16);
PIT-1MGB FAMプローブ: 5'-AACTCTGATTTAGGCTTG -3' (対立遺伝子A用)(配列番号:17);及び、
PIT-1MGB VICプローブ: 5'-AACTCTGATTCAGGCTT -3' (対立遺伝子B用)( 配列番号:18);
を用いてエクソン6において行われる、請求項12に記載の同定方法。 - ウシにおける有利な乳生産形質を表す遺伝子型を同定するためのキットであって、Pit-1遺伝子のヌクレオチド1178を含む断片を増幅するためのオリゴヌクレオチド、κ-カゼイン遺伝子のヌクレオチド5345を含む断片を増幅させるためのオリゴヌクレオチド、及び制限酵素Hinflを具備するキット。
- 前記Pit-1遺伝子のヌクレオチド1178を含む断片を増幅させるための前記オリゴヌクレオチドは、次のプライマー:
5'-AAACCATCATCTCCCTTCTT-3' (配列番号:7)
5'-AATGTACAATGTGCCTTCTGAG-3' (配列番号:8)
から成り、前記κ-カゼイン遺伝子のヌクレオチド5345を含む断片を増幅させるための前記オリゴヌクレオチドは、次のプライマー:
5'-ATCATTTATGGCCATTCCACCAAAG-3'(配列番号:1)
5'-GCCCATTTCGCCTTCTCTGTAACAGA-3'(配列番号:2)
から成ることを特徴とする、請求項16に記載のキット。 - ウシにおいて有利な乳生産形質を表す遺伝子型を同定するためのキットであって、Pit-1遺伝子の断片の対立遺伝子特異的増幅及び/又は検出を行うためのオリゴヌクレオチド、及び、κ-カゼイン遺伝子の断片の対立遺伝子特異的増幅及び/又は検出を行うためのオリゴヌクレオチドを具備するキット。
- 前記Pit-1遺伝子の断片の対立遺伝子特異的増幅のためのオリゴヌクレオチドは、次のプライマーである、請求項18に記載のキット:
5'-CAGAGAGAAAAACGGGTGAAGACAAGCATG-3'(配列番号:9);対立遺伝子Bに特異的;
5'-CAGAGAGAAAAACGGGTGAAGACAAGCATA-3'(配列番号:10);対立遺伝子Aに特異的;及び、
逆プライマーとして5'-AGATAGAGGGAAAGATATAGTGAAAGGGACAG-3'(配列番号:11)。 - 前記Pit-1遺伝子の断片の対立遺伝子特異的増幅のためのオリゴヌクレオチドは、次のプライマーである、請求項18に記載のキット:
5'-C TGC CAT CAC GCC ATA GTT C-3'(配列番号:12);対立遺伝子Cに特異的;
5'-C TGC CAT CAC GCC ATA GTT T-3'(配列番号:13);対立遺伝子Tに特異的;及び、
逆プライマーとして5'-CA ACA GGA CTT CAT TAT TCT GTT CCT CAT TAT TCT GTT CCT T -3'(配列番号:14)。 - 前記Pit-1遺伝子の断片の対立遺伝子特異的検出のためのオリゴヌクレオチドは、次のプライマー:
PIT-1Fプライマー:5'-CATTCGAGATGCTCCTTAGAAATAGTAA-3'(配列番号:15);
PIT-1Rプライマー:5'-GTTTTGTAACCGAAGGCAGAGAGA-3'(配列番号:16);
及び次のプローブ:
PIT-1MGB FAMプローブ:5'-AACTCTGATTTAGGCTTG-3'(対立遺伝子A用)(配列番号:17);及び
PIT-1MGB VICプローブ:5'-AACTCTGATTCAGGCTT-3'(対立遺伝子B用)(配列番号:18);
である、請求項18に記載のキット。 - 前記κ-カゼイン遺伝子の断片の対立遺伝子特異的検出のためのオリゴヌクレオチドは、次のプライマー:
5'-CCGAAGCAGTAGAGAGCACTGTAG-3'(配列番号:3);
5'-TCTCAGGTGGGCTCTCAATAACTT-3'(配列番号:4);
及び次のプローブ:
Vic:5'-TACTCTAGAAGATTCTC-3'(配列番号:5);
Fam:5'-TACTCTAGAAGCTTCTC-3'(配列番号:6);
である、請求項18に記載のキット。 - ウシの乳又は肉生産能力を判定する遺伝子マーカーであって、前記Pit-1遺伝子の195位置のアデニンが、良好な乳生産の特徴を示し、また、Pit-1遺伝子の195位置のグアニンが良好な肉生産の特徴を示す、遺伝子マーカー。
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