JP2005519129A - エアロゾル薬物送達のための凝集粒子 - Google Patents

Abstract

本発明は、患者が吸入するための薬物送達ビヒクルを提供する。この薬物送達ビヒクルは、１種類以上の薬物が充填され、ともに架橋されて凝集物を形成する、直径０．１〜１．０ミクロンの間の生体適合性粒子を含む。この凝集物はまた、臨床的画像化のためのコントラスト増強剤の送達を提供し得る。本発明はまた、本発明の凝集物を生成する方法、この凝集物を含む薬学的組成物、およびこの凝集物を含む薬学的組成物の吸入による患者への薬物またはコントラスト増強剤の送達のための方法を提供する。

Description

（関連出願の引用）
本出願は、米国仮特許出願第６０／３６１，９６１号（２００２年３月５日出願）に対する優先権を主張する。この開示は、その全体が本明細書中に参考として援用される。

（発明の分野）
本発明は、ともに化学的に架橋されて、凝集物を形成する薬物含有粒子を含む呼吸用薬物送達ビヒクルに関する。この凝集物は、患者の気道へ吸入され、ここでこの薬物は、粒子から制御可能に放出される。本発明はまた、凝集物を生成するための方法、この凝集物を含む薬学的組成物、およびこのような薬学的組成物を患者に送達することにより患者を処置するための方法に関する。

（背景）
薬物の患者への送達は、薬物を血流に入らせるか、または血液中に入らせることなく局所的に作用させるという目的で、種々の方法を用いて行われ得る。例えば、特定の薬物は、経口摂取によって患者に送達され、消化管を通って血流に入る。しかし、薬物の経口送達は、欠点がある。１つの欠点は、血流に達する前に、消化管において経口投与薬物が徹底的に代謝および分解され得ることである。その結果、摂取された薬物のごく一部しか、実際に血流に達しない。例えば、タンパク質およびペプチドの治療剤は、消化管中では非常に安定性が乏しく、経口投与するのが困難である。経口経路による薬物送達の別の欠点は、 消化された薬物が血流に入るために必要な時間が極めて長い可能性があることである。最終的に、薬物の摂取は、患者が胃を悪くすることになり得る。

薬物送達の別の方法は、非経口経路（注射ともいわれる）である。しかし、注射は、患者の皮膚が穿刺されなければならないという点で、侵襲性の送達方法である。皮膚の穿刺は患者にとって痛いだけでなく、穿刺は、患者が種々の病原性微生物に感染する可能性を増大させる。さらに、患者は気乗りしないかもしれず、薬物投与目的では、彼ら自身が注射することはできないかもしれない。

薬物送達の新たな経路が、明らかになっており、これは、上記で議論されたより伝統的な薬物送達方法に固有の問題のいくつかを軽減する。肺へまたは呼吸器への薬物送達は、薬物送達の１つの新たな方法である。呼吸器用薬物送達において、薬物は、患者の肺に吸入される。薬物の吸入は、例えば、エアロゾルまたは吸入器の使用を通じて達成される。一旦肺に入ると、肺胞を通る経路によって薬物が血流に入る。あるいは、薬物は、例えば、喘息の場合のように、気道中に残り、局所的に作用し得る。

薬物の呼吸器への送達は、多くの利点を有する。最初に、吸入による薬物送達は、侵襲性でなく、患者にとって非常に簡便である。呼吸器への送達は、経口送達できない薬物に適している。なぜなら、多くの薬物は、肺において比較的安定であるからである。呼吸器用薬物送達の別の利点は、肺１つあたり７０平方メートルに近い、肺胞において利用可能な非常に大きな表面積である。肺胞を介して、吸入された薬物は、血流に入り得る。この大きな表面積の結果、薬物が血流へ迅速に入る。肺経路を経由する薬物送達はまた、身体から薬物を排除する他の薬物送達様式に共通する、最初の経路である肝臓および腎臓の影響を避ける。

いくつかの非常に重要なヒト疾患は、肺を含む気道に罹患することもまた重要である。喘息は、そのような疾患の１つである。嚢胞性線維症は、別のそのような疾患である。薬物の呼吸器への送達は、これらの疾患にとって特に重要である。なぜなら、気道へ直接送達することは、薬物が局所的に作用することを可能にし、ここで薬物の効果は、この疾患の症状を軽減するために必要とされるからである。このような疾患を処置するために、その吸入された薬物が、全身循環に入ることは必ずしも必要ではない。

呼吸器への送達において薬物が血流へ迅速に入ることは有利であるが、通常は、吸入して２〜３時間後に、ほとんどの薬物が肺に残らない。このことは、特に、一定時間にわたって薬物を血流にゆっくりと放出することが有利である場合、または薬物を肺に残ったままにして、局所的に作用させることが望ましい場合には、問題であり得る。現在、ゆっくりとした放出を達成するために、薬物の反復低レベル投薬が、必要とされる。これまで、肺における薬物滞留を増大させ、血流への薬物の放出速度を制御する、吸入される薬物処方物を得ることは、成功していなかった。吸入される薬物の種々の処方物が、この問題を解決しようとする取り組みにおいて試みられてきた。しかし、これらの処方物は、乾燥粉末処方物においても液体処方物においても、肺における薬物の再現性のある増大した持続時間を生じず、肺における合成ポリマーまたは他の乾燥粉末賦形剤の存在のような新たな問題を生じさせずに、血流への吸入した薬物の長期化した放出を生じることもなかった。

制御放出を生じる送達システムがないことは、薬物以外の因子について不利である。例えば、Ｘ線ベースの画像化技術（コンピュータ連動断層撮影またはＣＴを含む）および核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）技術は、コントラスト増強剤を利用する。コントラスト増強剤は、身体の組織へと送達され、そこに局在し、その組織を、画像化技術が使用された場合にその薬剤が局在しない周囲の組織から区別するという効果を有する。画像化のためのコントラスト増強剤の制御放出を生じる良好な送達システムはない。

従って、呼吸器への送達を使用する薬物およびコントラスト増強剤の長期放出または制御放出を達成することは困難であるので、肺へ吸入された、レザバからの薬物またはコントラスト増強剤の制御放出を提供する吸入送達システムが必要である。２つの型の肺からの薬物およびコントラスト増強剤の制御放出が必要である。第１は、肺へ吸入される薬物のレザバからの比較的ゆっくりとした、一定速度の放出を提供するシステムが必要である。第２は、肺における薬物のレザバからの薬物放出の変更可能かつ制御可能な速度を提供するシステムが必要である。肺からの薬物の制御可能な放出を提供するシステムにおいて、これは、薬物が肺へ吸入された後ですら、肺からの薬物放出の速度が制御され得る場合にさらに望ましい。

（発明の要旨）
本発明に従って、吸入された薬物の制御放出が、化学的に架橋された粒子凝集物の使用を通じて達成され得、この粒子は、薬物を含むか、または薬物と結合されることが発見された。架橋された粒子凝集物の患者による吸入は、患者の気道への薬物の送達を生じ、患者の気道において、その薬物は、粒子から制御可能に放出される。

従って、本発明は、新たな組成物として、化学的に架橋された粒子の凝集物、特に生体再吸収性（ｂｉｏｒｅｓｏｒｂａｂｌｅ）の粒子の凝集物として提供され、これらの粒子は、直径約０．１〜１．０ミクロンの平均サイズを有する。好ましくは生体再吸収性または生分解性の粒子はまた、薬物または他の生物学的に活性な物質を含むかまたはこれらの結合される。凝集物からの薬物の放出速度は、凝集物の粒子をともに保持する化学的架橋の性質および密度の適切な選択によって制御される。凝集物からの薬物の放出速度はまた、凝集物の粒子をともに保持する化学的架橋の切断によって制御される。別の実施形態において、この粒子の化学的に架橋された凝集物は、画像化のためのコントラスト増強剤を含むかまたはこれと結合される。

別の局面において、本発明は、薬物含有凝集物またはコントラスト増強剤含有凝集物を含む、本発明の薬学的組成物を提供する。凝集物の架橋を切断する物質を含む薬学的組成物もまた提供され、このような組成物は、薬物またはコントラスト増強剤を含有する凝集物の薬学的組成物の吸入と同時または吸入に続いて、患者の気道へと送達される。凝集物架橋を切断する物質の目的は、凝集物の粒子からの薬物またはコントラスト増強剤の放出速度を制御することである。薬物含有凝集物および架橋切断物質の両方を含む薬学的組成物またはコントラスト増強剤含有凝集物および架橋切断物質の両方を含む薬学的組成物もまた、提供される。

なお別の実施形態において、本発明は、薬物含有凝集物を含む薬学的組成物、架橋切断物質を含む組成物、またはこの凝集物および架橋切断物質の両方を含む組成物の気道への送達によって、患者を処置するための方法を提供する。

別の実施形態において、本発明は、細胞、組織、器官または身体部分の引き続く画像化のためのコントラスト増強剤を含む薬学的組成物を投与するための方法を提供する。

（発明の詳細な説明）
（定義）
別段示されなければ、本明細書中で使用される以下の用語は、以下の意味を有する。

「粒子」とは、任意の、ほぼ球形の物体をいう。

「架橋」とは、２つの粒子を互いに結合する共有結合的化学結合または連結をいう。

「切断剤（ｃｌｅａｖｅｒ）」とは、架橋を分断または切断する物質をいう。

「係留分子（tether）」とは、粒子の表面に反応性化学基を結合する分子をいう。

「スペーサー」とは、複数の反応性化学基を含む分子をいい、その反応性化学基の各々は、粒子の表面に結合した反応性化学基と反応し得る。

「反応性粒子」とは、反応性化学基が、粒子の表面に結合した粒子をいい、これらは、互いに架橋され得るが、未だ架橋されていない。

「凝集物」とは、化学的架橋によって互いに結合された複数の粒子をいう。

「薬物」とは、ヒトまたは動物患者の身体へ投与または取り込まれる場合に、身体の機能のうちの１以上を改変し得る任意の物質をいう。

「呼吸用薬物」とは、患者の気道への吸入によって、患者へ送達されるか、または送達されることが意図される薬物をいう。

「コントラスト増強剤」とは、ヒトまたは動物の患者の身体へ投与または取り込まれ、細部、組織または器官内に局在する場合、画像化技術がその細胞、組織または器官を試験するために使用されている場合にそれらの細胞、組織または器官を増強するか、または薬剤が局在していない細胞、組織または器官をそれらから区別し得る、任意の物質をいう。

「充填」とは、粒子または凝集物と薬物を結合するか、これらに薬物を付着するか、またはこれらに薬物をカプセル化するために使用される方法をいう。

「薬学的組成物」とは、患者に投与することが意図される、一般には薬物、またはコントラスト増強剤を含む成分の凝集物をいう。

「治療的に有効な」量とは、所望の治療結果を達成するために必要とされる薬物または薬物の薬学的組成物の量をいう。

「薬物送達ビヒクル」とは、患者の身体への組成物中の薬物の送達を可能にするかまたは容易にする薬学的組成物の成分をいう。

「コントラスト増強剤ビヒクル」とは、患者の身体への組成物中のコントラスト増強剤の送達を容易にする薬学的組成物の成分をいう。

「制御放出」とは、本発明の薬学的組成物中の薬物が、薬物送達ビヒクルが患者の肺中にある場合のような生理学的条件下でその送達ビヒクルから放出される速度を制御する能力をいう。

本発明に従って、呼吸器用薬物およびコントラスト増強剤が、薬物送達ビヒクル、直径約０．１〜１．０ミクロンの平均サイズを有する架橋された粒子から形成される薬物充填凝集物を含む薬学的組成物として使用することによって、制御放出特性を示すようにされ得ることを見出した。特に、呼吸器用薬物が患者の気道内部で薬物送達ビヒクルから放出される速度は、凝集物を形成するために粒子をともに結合する架橋の性質および密度、ならびに凝集物を形成する粒子のサイズおよび数を適切に選択することによって効率的に制御され得ることが見出された。

本発明は、図１、２、３および４を参照してより容易に理解され得る。ここで図面、特に図１を参照すると、２つの反応粒子１の間の化学的架橋の形成を例示する模式図が示される。左側のこの反応粒子１は、粒子２、複数の係留分子３、および係留分子３に結合した複数の反応性化学基４を含む。右側の反応粒子１は、粒子２および複数の反応性化学基４を含む。この右側の反応粒子１は、係留分子３を有さない。示されるように、反応性化学基４は、左側に示されるように、係留分子３によって粒子２へと結合され得るか、または右側に示されるように、粒子２に直接結合され得る。反応粒子１の各々の表面に結合された反応性化学基４は、化学反応を受け、その結果、１以上の架橋５が形成される。その架橋された粒子は、図１で示されるように、２つの架橋された粒子を含む凝集物６を形成する。

ここで図２を参照すると、スペーサー分子との反応による２つの粒子の間の化学的架橋の形成を例示する模式図が示される。２つの反応粒子１が示され、これらはともに、粒子２、複数の係留分子３および係留分子３に結合した複数の反応性化学基４を含む。スペーサー分子７もまた示され、これは、少なくとも２つの反応性化学基４を有する。示されるように、反応性化学基４（これは、各反応粒子１の一部である）は、そのスペーサー７の一部である異なる化学反応基４との化学反応を受ける。架橋５が、２つの反応粒子１の間で形成される。架橋された粒子は、図２に示されるように、２つの架橋された粒子を含む凝集物６を形成する。

ここで図３を参照すると、架橋された凝集物を形成するための複数の反応粒子との間の化学的架橋の形成を示す模式図が示される。この模式図は、化学反応を受けて、凝集物６を形成する、複数の反応粒子１を例示する。この模式図は、凝集物６を示すために図１および２に示されるものが、複数の架橋された粒子を含み得るように拡張している。その凝集物６は、図３に示される二次元のみでなく、三次元において架橋された粒子を有する。この模式図はまた、１つの反応粒子の表面に結合された反応基の複数が化学反応を受けて、凝集物（ここで各反応粒子が、複数の他の反応粒子に結合される）を生成し得ることを示す。

図４を参照すると、凝集物の架橋の切断を例示する模式図が示される。この模式図は、「切断」と表示された矢印の左側に凝集物６を示す。この矢印は、凝集物６の反応性粒子をともに保持する架橋のいくつかの分断または切断を示す。架橋の切断の結果は、「切断」と表示された矢印の右側に示される。架橋の切断を受けた個々の反応性粒子１が右側に示される。この矢印の右側に示される凝集物６は、もともとの凝集物、少ない架橋の切断を受けた反応性粒子を示す。図４に模式的に示される切断反応は、凝集物によって運ばれる薬物が、薬物含有凝集物が送達された患者の気道内に放出される１様式を示す。

（粒子）
本発明の凝集物を形成するために使用される粒子は、任意の多くの生体適合性材料から作製される。生体適合性材料は、患者の身体に対して、そこに送達された場合に毒性でない材料である。このような材料は、好ましくは、有機性であり、ポリマーまたは非ポリマーであり得る。このような材料のいくつかの例は、脂質および生分解性ポリマー、またはこれらの組み合わせである。このような生分解性ポリマーとしては、例えば、直鎖状ポリエステルファミリー（例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、またはポリカプロラクトン）に由来するポリマー、ならびに全てのラクチド 対 グリコリド比、および両方ともＬ−ラクチドまたは（Ｄ，Ｌラクチド）のそれらが結合したコポリマー（例えば、ポリ（ラクチド−コグリコリド）が挙げられる。ポリマー（例えば、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリジオキサノン、およびポリヒドロキシブチレート（ｐｏｌｙｈｙｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ））もまた、使用され得る。粒子は、好ましくは、直径０．１〜１．０ミクロンの間である。このような生体適合性粒子はまた、好ましくは、生分解性である。生分解性は、粒子が、身体において最終的に分断されるかまたは分解され、これらの粒子のいかなる残留物も、身体から消散されるかまたは除去されることを意味する。これは、患者の気道において経時的に粒子の形成がないという点で有利である。

１実施形態において、リポソームは、凝集物を形成するために粒子として使用される。種々の異なる型のリポソームが、当該分野で周知である。一般に、リポソームは、内部空洞を含む球状粒子である。リポソームの壁は、一般に、脂質、特にリン脂質の二重層から構成される。リポソームを作製するために使用され得る多くの脂質およびリン脂質がある。これらの脂質およびリン脂質もまた、当該分野で周知である。リポソーム、ならびに脂質およびリン脂質のうちの多くの型が、参考文献（例えば、米国特許第５，０４９，３８９号（Ｒ．Ｒａｄｈａｋｒｉｓｈｎａｎに対して発行）、ならびにＳｔｏｒｍおよびＣｒｏｍｍｅｌｉｎ，１９９８，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ，１：１９−３１）に記載され、これらの記載は、それらの全体が本明細書中に参考として援用される。本発明のリポソームは、好ましくは、個体の肺における界面活性剤の脂質組成に類似した脂質組成を有する。

本発明のリポソームは、リポソームを作製するための当該分野で標準的な方法のいずれかによって調製され得る。種々のこのような方法が公知である。いくつかのこのような方法としては、乾燥脂質の水和、有機溶液のエバポレーションによって生じる脂質の揮発性有機溶液の水溶液への導入、および洗剤（detergent）または界面活性剤の除去のための脂質および洗剤または界面活性剤の水溶液の透析が挙げられる。これらの方法のうちの多くは、米国特許第５，０４９，３８９号、ＳｔｏｒｍおよびＣｒｏｍｍｅｌｉｎ，１９９８，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ，１：１９−３１ならびにＳｚｏｋａおよびＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ，１９７８，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，７５：４１９４−８に記載され、これらの記載は、それらの全体が本明細書中に参考として援用される。

リポソームが作製された後に、本発明の実施においても使用され得るリポソームを操作するための、当該分野で周知の技術がある。例えば、標準的な技術により作製されるリポソームの調製物は、作製された後にサイズおよび膜状態（lamellarity）（すなわち、壁の厚み）が変動し得る。リポソームを高剪断力に供すること、膜を通してのリポソームの押し出しまたはリポソームの超音波処理のような技術は、所望のサイズのリポソームを選択するかまたは所望のサイズを有するようにリポソームを改変するかのいずれかのために使用され得る。リポソームのこれらの方法による操作の後に、リポソームのサイズ分布が測定されて、所望のサイズのリポソームが確実に得られるようにされる。当該分野で周知の技術（例えば、Ｆｒａｕｎｈｏｆｅｒ回折および力学的光散乱（ＤＬＳ）が、リポソームのサイズ分布を測定するために使用される。このような技術は、Ｆｒａｕｎｈｏｆｅｒ回折の場合に、測定されたリポソームと同じ光散乱特性を有する球体の直径である同等の球状直径を測定する。ＤＬＳの場合、同等の球体直径は、測定されたリポソームと同じ拡散係数を有する球体の直径である。

別の局面において、生体適合性ポリマーから作製される粒子は、凝集物の粒子として使用される。このような粒子は、中実または中空のいずれかであり得、種々の密度を有し得、約１〜５００ｎｍの範囲の直径を有する、およそ球形である。本発明の凝集物において使用され得る、多くのこのような粒子は、市場から購入され得る。例えば、Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｆｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｄｉａｎａ）は、多くのこのような粒子を販売している。

本発明の粒子は、これらの表面に結合した反応性化学基を有する。このような結合は、直接であり得るかまたは係留によってであり得る。

（粒子は、薬物またはコントラスト増強剤と結合される）
本発明の粒子は、薬物を含むか、薬物に付着されるか、または薬物と結合され、その結果、この薬物は、凝集物を含む薬学的組成物の吸入の際に、患者の気道に送達される。この様な粒子は、薬物を「充填された」といわれる。粒子が、薬物を充填される方法は、「充填」といわれる。

本発明の凝集物による送達が意図される薬物としては、インスリン、シプロフロキサシン、ロイプロリド、トブラマイシン、シクロスポリン、インターフェロン、アンチトリプシン、プロテアーゼインヒビター、デオキシリボヌクレアーゼ、組換えアデノウイルスなどが挙げられる（ＡｄｊｅｉおよびＧｕｐｔａ，１９９７，Ｉｎｈａｌａｔｉｏｎ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと）。

本発明における使用のために特に好ましい薬物は、呼吸器用薬物である。このような呼吸器用薬物は、気道（例えば、肺を含む）の疾患または罹患を処置するように設計されたものであり得る。このような疾患の１つの特定のよい例は、喘息である。本発明を使用して有利に送達される薬物は、例えば、呼吸器系路によって患者に送達される場合に特によく機能するものであってもよいし、他のどの送達経路によっても患者に送達することが困難または不可能な薬物であってもよい。

コントラスト増強剤はまた、本発明の凝集物を形成するために使用される粒子に充填され得る。コントラスト増強剤を含む凝集物は、ＣＴ、ＭＲＩなどのような画像化技術において有用である。ＣＴにおいて使用される代表的なコントラスト増強剤としては、種々のヨード化化合物（例えば、イオヘキソールおよびイオジキサノール（ともに非イオン性化合物））およびヘキサブリックス（イオン性化合物）が挙げられる。他のコントラスト増強剤が、ＣＴにおいて使用され、凝集物においても使用され得る。ＭＲＩにおいて使用される代表的なコントラスト増強剤としては、ガドリニウムおよびジスプロジウムが挙げられる。ＭＲＩにおいて使用される他のコントラスト増強剤としては、鉄粒子などが挙げられる。任意のこれらの薬物は、本発明の凝集物において使用され得る。さらに、凝集物の調製物は、１種類を超えるコントラスト増強剤を含み得る。一例において、凝集物は、ＣＴにおいて使用するためのコントラスト増強剤およびＭＲＩにおいて使用するための別個のコントラスト増強剤を含み、このことによって、ＣＴおよびＭＲＩの両方での画像化にあたってコントラストを増強する組成物が提供される。

さらに、凝集物は、１種類以上のコントラスト増強剤に加えて、１種類以上の薬物を含み得る。このような凝集物は、送達後に、身体中の薬物の動きまたは分布を追跡（ｔｒａｃｋ）または追跡（ｆｏｌｌｏｗ）ために有用である。

本発明は、凝集物を作製するプロセスにおいて、粒子の薬物充填が、行われる場合に何の制限も含まないことに注意すべきである。例えば、充填は、反応性粒子がともに架橋されて、凝集物を形成する前に行われ得る。あるいは、充填は、粒子が共に架橋されて、凝集物を形成した後に行われ得る。

リポソームが、本発明の粒子として使用される場合、リポソームに粒子を充填するための、当該分野で公知の種々の技術がある。一般に、性質が親水性の薬物は、リポソーム粒子の内部空洞に充填されるかまたは結合される。性質が親油性の薬物は、一般に、リポソーム粒子の脂質二重層に充填されるかまたは結合される。受動的充填において、リポソームは、使用される薬物の溶液中に形成される。能動的充填において、種々の方法が、当該分野で公知である。能動的充填の１つの型（ｐＨベースの充填といわれる）において、タンパク質は、薬物分子から解離され、薬物をリポソームに入らせ、そこにとどまらせる（ＣｅｈおよびＬａｓｉｃ，１９９７，Ｊ Ｃｏｌｌｏｉｄ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｓｃｉ，１８５：９−１８）。別の型の能動的充填（硫酸アンモニウム充填といわれる）において、薬物は、硫酸アンモニウム勾配の存在に起因して、リポソームに入る（ＣｅｈおよびＬａｓｉｃ，１９９７，Ｊ Ｃｏｌｌｏｉｄ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｓｃｉ，１８５：９−１８）。なお別の方法において、リポソーム内のキレート剤は、その中の薬物の捕獲を生じ、リポソームへの薬物のさらなる拡散を生じる（Ｃｏｌｂｅｒｎによる特許番号ＷＯ００２３０５２、ＷｏｒｋｉｎｇおよびＳｌａｔｅｒ、標題「リポソーム捕獲トポイソメラーゼインヒビター」）。上記の技術はまた、ポリマー粒子へと薬物を充填するために使用される。

粒子への薬物の充填の後に、充填されず、かつ粒子と結合しなかった薬物を除去する工程が使用され得る。このような工程は、イオン交換、ダイアフィルトレーション、または粒子もしく凝集物の超遠心分離を使用する洗浄のような技術を含み得る。

（架橋）
本発明の反応性粒子は、ともに架橋されて、凝集物を形成する。この架橋は、別の反応性粒子に結合される、反応性化学基の間で共有化学結合が形成される場合に生じるか、または共有結合が、反応性粒子とスペーサー分子の一部である反応性化学基との間で形成される場合に生じる。使用され得る種々の反応性化学基がある。いくつかの例は、−ＮＨ_２、−ＣＯＯＨおよび−ＳＨである。互いに反応する反応性化学基が、同一であることは必要条件ではない。互いに反応する反応性化学基は、異なり得る。しかし、本発明の反応性化学基は、互いに反応して、共有化学結合を形成する。好ましくは、本発明の架橋は、生体適合性であり、かつ患者に対して非毒性である。

一実施形態において、この反応性化学基は、反応性粒子の表面に直接結合され得る。別の実施形態において、この反応性化学基は、係留分子によって粒子に結合され得る。１つのこのような係留分子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。互いに反応する反応性化学基が、同じ様式で反応性粒子に結合することは必要条件ではない。例えば、反応性粒子に直接結合される反応性化学基が、係留分子によって別の粒子に結合される反応性化学基と反応することであり得る。しかし、互いに反応する反応性化学基は、直接結合されるかまたは係留分子を介して結合されるかのいずれかで、同様の様式で反応性粒子に結合されることであり得る。この反応性化学基は、粒子作製のプロセスの間に粒子に結合され得るか、または粒子が作製された後に粒子に結合され得る。また、この反応性化学基は、粒子が薬物を充填される前、その間またはその後に粒子に結合され得る。表面に化学反応性基が既に結合された本発明の特定の粒子は、市場から購入され得る。

互いと直接結合して架橋を形成する反応性化学基の反応に加えて、スペーサー分子は、互いに反応性粒子を架橋するために使用され得る。スペーサーは、直鎖状分子または分枝状分子を含み得る。スペーサーは、好ましくは、１〜５００ｎｍの長さである。スペーサー分子は、少なくとも２つの反応性化学基を含む。

異なる化学的架橋および異なるスペーサー分子の使用を通じて、凝集物内の架橋された粒子の間の距離を変化させることが可能であることもまた理解されるはずである。例えば、スペーサー分子が使用されていない架橋を含む凝集物において、凝集物内の粒子は、平均して、凝集物内の互いに比較的近い距離であり得る。スペーサー分子が使用されて、架橋を形成する架橋を含む凝集物において、凝集物内の粒子は、平均して、凝集物内の互いに比較的遠い距離であり得る。このように異なる架橋を選択することは、密度を変化させ、従って、薬物が凝集物から放出される速度を制御する方法である。例えば、粒子が互いに比較的近い（すなわち、高密度）凝集物において、薬物放出の速度は、比較的遅い。粒子が互いから比較的遠い（すなわち、低密度の）凝集物において、薬物放出の速度は、比較的速い。

架橋化学のいくつかの異なる実施形態は、以下に記載される。スペーサー分子を利用しない架橋は、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣともいわれる）を使用して、異なる粒子上での連結の間の架橋反応を開始する、以下に示される化学反応によって例示される。以下に示される化学反応において、化合物ＩにおけるＲ_１基は、粒子を代表し、その結合された−ＣＯＯＨ基は、粒子表面に結合された連結を代表する。化合物ＩＶにおけるＲ_２基は、第２の粒子を代表し、その結合された−ＮＨ_２基は、その粒子の表面に結合された連結を代表する。ＥＤＣ（化合物ＩＩ）と、化合物Ｉとの反応は、反応中間体として、化合物ＩＩＩの形成を生じる。以下に示されるように、このＲ_１粒子は、化合物ＩＩＩ反応中間体（すなわち、周りがボックスで囲まれたＲ_１−ＣＯＯ基）において、ＥＤＣに結合される。化合物ＩＶ（第２の粒子を含む）と化合物ＩＩＩとの反応は、架橋された粒子Ｒ_１およびＲ_２を代表する化合物Ｖの形成を生じる。

スペーサー分子を利用する架橋は、スペーサー分子としてスルホ−［エチレングリコビス（スクシンイミジルスクシネート）］（Ｓ−ＥＧＳともいわれる）を使用する、以下に示される化学反応によって例示される。以下に示される化学反応において、化合物Ｉは、Ｓ−ＥＧＳの分子を代表する。化合物ＩＩは、Ｒ−ＮＨ_２の２つの別個の分子を代表する。化合物ＩＩの各Ｒ基は、粒子を代表する。各粒子は、その表面に結合される−ＮＨ_２基を有する。粒子に結合された−ＮＨ_２基とＳ−ＥＧＳとの反応は、化合物ＩＩＩの形成を生じる。化合物ＩＩＩは、架橋された粒子を代表し、Ｓ−ＥＧＳによって架橋されたＲ粒子および−ＮＨ連結を示す。Ｓ−ＥＧＳ分子の炭素−酸素骨格は、凝集物の架橋の一部として残っていることに注意のこと。

上記の２つの反応に加えて、粒子をともに架橋して、凝集物を形成するために使用され得る多くの他の型の化学が存在し得ることに注意すべきである。種々の異なる反応性化学基が使用され得る。上記の−ＣＯＯＨおよび−ＮＨ_２連結に加えて、いくつかの他の反応性化学基は、−ＣＨＯ、ＳＯ_４−、およびスクシンイミドエステルである。特定の型の反応性化学基、およびどのようにこれらの化学反応基を粒子に結合するかは、凝集物を形成するために使用される特定の粒子に依存し得ることが注意すべきである。さらに、種々の異なるスペーサーが可能である。いくつかの他のスペーサーは、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、およびポリプロピレンオキシド鎖である。

架橋反応の程度が、以下に記載されるように、凝集物のサイズを制御するため、または種々の層を有する凝集物の作製を可能にするために制限または停止され得ることもまた理解されるべきである。種々の手段が、架橋の形成を生じる化学反応を制限または停止するために存在する。１つのこのような手段は、１以上の反応物の量を制限することである。他のこのような手段が、このような化学的架橋反応を制限または停止するために存在する。このような手段は、化学の分野の当業者に周知である。

本発明の架橋は、切断可能なまたは切断可能でない（すなわち、恒久的）かのいずれかであり得ることにも注意すべきである。切断可能な架橋は、好ましくは、化学物質（本明細書中では「切断剤」といわれる）の添加によって分断され得る（すなわち、互いに２つの粒子を結合する共有化学結合のうちの１つが破壊される）ものである。凝集物の切断可能な架橋が切断される場合、粒子は、凝集物から解離され、好ましくは、解離された粒子から薬物が放出される速度は、変化される。粒子からの薬物の拡散速度は、その露出された表面積に比例し、従って、増大した表面積は、薬物の放出速度の増加をもたらすことが、当該分野で周知である。切断剤物質による切断可能な架橋の切断は、所定の切断剤物質が、全ての型の架橋を切断するわけではないという点で特異的である。好ましくは、所定の切断剤物質は、１または数個の異なる架橋に特異的である。非切断可能架橋は、切断剤物質が存在しない架橋であるか、または分断することができない架橋である。切断剤物質は、係留分子内またはスペーサー分子内のいずれかの共有結合化学結合を分断することによって機能し得る。好ましくは、切断剤物質は、スペーサー分子内の共有結合を分断する。

さらに、切断可能な架橋は、天然に切断可能または誘導的に切断可能のいずれかであり得る。天然に切断可能な架橋は、凝集物の患者への投与後に、気道において切断される架橋であり、その切断は、個体の気道内に通常に存在する物質によって引き起こされる。従って、特定の架橋を切断可能な個体の気道内に通常存在する切断剤があり、このような架橋は、天然に切断可能な架橋といわれる。この場合、凝集物の天然に切断可能な架橋の切断は、患者への外因性切断剤の投与なしに生じる。本発明は、さらなる切断剤が、患者に外因的に投与され得ることを排除しない。このような切断剤は、凝集物と同時に（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ）または同時に（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔｌｙ）患者に投与され得る。このような切断剤はまた、凝集物の投与に続いて、患者に投与され得る。

一例において、粒子は、ジチオベンジル（ＤＴＢ）ウレタン連結を用いて凝集物を形成するように架橋される。このような連結は、遊離チオールによって切断されるジスルフィド結合を有する。粒子間のジスルフィド結合のいくらかの切断を引き起こし得る、低レベルのシスチンおよびグルタチオンが肺に存在する間、「切断剤」としての遊離チオールのさらなる添加は、粒子をともに保持する連結の切断および凝集物からの遊離粒子の遊離によって、薬物放出の加速を誘発する。

遊離チオールによって切断可能である凝集物を架橋するための一例において、ｏ−ジチオベンジルカルバメート（ＤＴＢ−ウレタン）連結部分またはｐ−ジチオベンジルカルバメート（ＤＴＢ−ウレタン）連結部分を含むメトキシポリ（エチレングリコール）−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ）結合体が使用される。化学的連結またはチオールによるその切断は、以下に示される。ＤＴＢ−ウレタン連結は、以下に示されるように、脂質（ＤＳＰＥ）とｍＰＥＧとの間に位置する。このジスルフィド連結結合体は、システインで切断可能であり、その天然の形態にあるホスファチジルエタノールアミン脂質の再生を生じる。

誘導的に切断可能な架橋は、架橋を切断し得る、気道内に通常存在する切断剤物質が存在しない架橋である。誘導的に切断可能な架橋を切断するために、切断剤物質を、それらが、患者の気道中に既にある凝集物の架橋と接触するように、患者に外因的に投与しなければならない。あるいは、誘導的に切断可能な架橋は、凝集物と混合した切断剤物質によって切断され得、凝集物が投与される同じ時間に患者に投与される。誘導的に切断可能な架橋の一例は、上記の化合物ＩＩＩにおけるＳ−ＥＧＳスペーサーによって形成される架橋である。この架橋は、ヒドロキシルアミンによって切断可能である。誘導可能に切断可能な架橋の別の例は、例えば、チオール化合物によって切断される架橋である。他の例は、加水分解可能な架橋である。

切断剤のような化合物の有用性は、これらが、凝集物がそれらの結合した薬物を放出する速度を制御するために使用され得ることである。例えば、架橋を切断することによって、凝集物は、結合した薬物が放出される速度を増し得る。個々の粒子は、架橋の切断の結果として、凝集物から放出されても、放出されなくてもよい。凝集物が、架橋の切断以外の機構によって、それらの結合した薬物を放出する速度を制御する物質が意図される。例えば、１つのこのような化学物質は、例えば、凝集物のリポソームまたはポリマー粒子の解離によって、粒子からの薬物の放出を引き起こし得る。

（凝集物）
本発明の凝集物は、共に架橋されている少なくとも２つの反応性粒子を含む。好ましくは、凝集物は、共に架橋されている１０〜数千の間の粒子を含む。凝集物の寸法は、凝集物が、好ましくは、三次元の各々において１個より多くの粒子の厚みであるようにされるが、任意の次元において３００個程度の粒子の厚みであってもよい。凝集物は、三次元の各々においてほぼ類似の厚みまたは長さを有し得る。凝集物は、一般に、任意の寸法において長さが１０〜５０ミクロンの間であり得る。

本発明の凝集物はまた、それらの空力学的直径によって規定される。Ｅｄｗａｒｄｓら，米国特許第５，８７４，０６４号および同第６，２５４，８５４Ｂ１号によって記載されるように、「空力学的直径」の特性は、物体（例えば、凝集物）が、肺胞へ吸入され得るか否かを決定するために使用され得る。空力学的直径（ｄ_ａｅｒ）は以下のように規定される：

ここでｄは、凝集物の幾何的直径であり、ρは、比重である。Ｅｄｗａｒｄｓの特許に述べられるように、肺胞におけるエアロゾル中の物体の最大堆積（約６０％）は、ｄ_ａｅｒ＝３ミクロンで得られる。本発明の凝集物についての受容可能なｄ_ａｅｒは、好ましくは１〜１０ミクロンであり、より好ましくは、２〜７ミクロンであり、最も好ましくは、２〜５ミクロンである。薬物を肺胞に送達することが所望されない場合、凝集物についてのｄ_ａｅｒは、これらの値の範囲の外側であってもよい。例えば、肺に達するが、肺胞には達しない凝集物について、ｄ_ａｅｒは、１０〜１５ミクロン程度の大きさであり得る。

凝集物の空力学的直径は、カスケードインパクターの使用により測定される。カスケードインパクターは、直径が減少する相互接続した一連の管と、各管がより小さい直径の次の管に接続している点に位置する堆積表面（例えば、スライドまたはプレート）とからなる。上記凝集物を含むエアロゾルは、一定の容積速度で、最大直径の管の中へと引き込まれる。このエアロゾルは、一定体積でこの機器を通って移動するので、このエアロゾルがより小さい各管に進行すると、そのエアロゾルがこれらの管を通って移動する速度が増加する。エアロゾルにおける最大ｄ_ａｅｒの凝集物は、最大直径を有する管である最初の管の末端に位置する関連する堆積表面上に衝突する。次第に小さいｄ_ａｅｒの凝集物は、続く堆積表面上に衝突する。エアロゾルが上記機器を通って移動するのが終了した後、堆積表面は、上記機器から取り出され、種々の堆積表面上に堆積された凝集物が取り出され、そして計数される。上記機器は、以前に較正されているので、既知のｄ_ａｅｒの対象を含むエアロゾルを使用して、ｄ_ａｅｒと、粒子が堆積する特定の堆積表面との関係が、知られる。この関係を使用して、エアロゾル中の凝集物のｄ_ａｅｒ分布が決定される。エアロゾル中の対象のｄ_ａｅｒを決定するためにカスケードインパクターを使用することは、当該分野で周知である。カスケードインパクターの１つの周知の供給源は、Ａｎｄｅｒｓｅｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓである。

上記凝集物の重要な局面は、凝集物の一部になる個々の粒子が、少なくとも１つの他の粒子（好ましくは、１つより多くの他の粒子）に、形成される架橋を介して結合することである。１つより多くの他の粒子への粒子の結合は、可能である。なぜなら、本発明において使用される粒子は、好ましくは、その表面に結合した多数の反応性化学基を有するからである。これらの反応性化学基は、好ましくは、球状粒子またはほぼ球状の粒子の表面全体を覆う。好ましくは、これらの反応性化学基のうちのほとんどまたはすべてが、他の粒子の表面上に存在する反応性化学基とか、またはスペーサーと、架橋を形成可能である。

しかし、凝集物の一部であるどの粒子も、１つより多くの他の粒子と架橋を形成することが、必要条件ではないことが、明らかであるはずである。凝集物の外部表面上に位置する粒子は、たった１つの他の粒子と架橋を形成し得る。他の反応性化学基と架橋を形成可能である粒子の表面上に位置するすべての反応性化学基が、からずしも架橋を形成する必要はないこともまた、明らかであるはずである。粒子の表面上に位置するいくつかの（または多くでさえある）反応性化学基は、その粒子が、凝集物の一部であり、かつ１つより多くの他の粒子と結合しているとしても、架橋を形成しないかもしれない。

種々の密度の架橋を有する凝集物が生成され得ることが、本発明の重要な局面である。例示的例として、その表面上に１００個の反応性化学基を有する反応性粒子を考える。複数のそのような粒子が、互いに反応して、２つの異なる凝集物を形成する。最初の凝集物において、各粒子の表面上にある利用可能な１００個の反応性基のうちの８０個が、架橋を形成する。第２凝集物において、各粒子の表面上にある利用可能な１００個の反応性基のうちの３０個が、架橋を形成する。第１の凝集物は、第２の凝集物が有するよりも高密度の架橋を有することが、言われ得る。凝集物の密度の差異は、凝集物からの薬物放出の速度が制御される一方法である。

切断可能な架橋および切断不可能な架橋の両方を含む凝集物が生成され得ることもまた、本発明の重要な局面である。切断可能な架橋は、自然切断可能な架橋および誘導切断可能な架橋の一方または両方であり得る。また、切断不可能な架橋に対する切断可能な架橋の相対比は、変化し得る。例えば、凝集物中の切断不可能な架橋の比率は、薬物がその凝集物から放出される速度を遅くするために、切断可能な架橋の比率に対して増加され得る。

凝集物の粒子をともに保持する架橋におけるこれらの変化（例えば、架橋の密度、切断不可能な架橋に対する切断可能な架橋の比率など）に加えて、単一の凝集物は、種々の型の粒子から構成され得る。例えば、薬物を充填された粒子と、薬物を充填されていない粒子との両方を含む、凝集物が、生成され得る。凝集物はまた、２つ以上の特定の型（各々の粒子型は、異なる薬物を充填されているか、または異なる濃度の同じ薬物を充填されている）から作製され得る。薬物を含む粒子と、他の物質（例えば、切断剤）を充填されている他の粒子）とを有する凝集物もまた、作製され得る。

粒子、架橋、またはその両方の異なる「層」から構成される凝集物が企図されることもまた、本発明の重要な局面である。例示的例は、ほぼ球状であり、かつ約１００粒子の厚さであるかまたは直径１００粒子を有する、凝集物である。そのような凝集物が２つの層を有することを考える。第１の層は、ほぼ球状の凝集物の中心と、その凝集物の中心から直径５０粒子内にあるその凝集物のすべての粒子を含む。そのような凝集物の第２の層は、その凝集物の中心から直径５０粒子より遠いすべての粒子を含む。この凝集物の第２の層は、その凝集物の一番遠い５０粒子の殻を含む。ここで、このような凝集物の２つの層各々が異なると考える。例えば、第１の層を含む粒子に、薬物が充填され、第２の層を含む粒子には、薬物は充填されない。別の例は、第１の層を含む粒子は、切断可能な架橋によって互いに結合され、一方、第２の層を含む粒子は、切断不可能な架橋によって互いに結合される。なお別の例は、この凝集物の第１の層を含む粒子は、比較的高密度である架橋によって互いに結合され、一方、この凝集物の第２の層を含む粒子は、比較的低密度である架橋によって互いに結合される。このような凝集物の層の間の差異は、粒子、架橋、薬物に基づき、この凝集物のこれらの成分または他の成分の任意の組み合わせが、容易に企図され得る。さらに、２つの層だけが存在することは、このような凝集物の限定ではない。２つより多くの層を（２個と１０個との間の層、１０個と５０個との間の層、または５０個より多くの層さえも）有する凝集物が、企図される。そのような「層状」を伴う凝集物の設計は、薬物を放出する凝集物を制御された様式にする方法である。

（薬学的組成物）
好ましくは、その凝集物は、患者の肺の中に吸入され得る組成物中にある。その凝集物を含む粒子は、１つ以上の薬物が充填されるので、その凝集物は、吸入後に患者の気道へと薬物を投与するために使用される。１つの実施形態において、その凝集物は、その凝集物により送達される薬物が患者の血流中に入り得るように、肺の肺胞中に吸入される。

本発明の凝集物が気道中に吸入されるために、この凝集物は、好ましくは、患者に投与される薬学的組成物の一部である。そのような薬学的組成物は、好ましくは、水性懸濁物であるが、この凝集物は、乾燥もされ得る。リポソームを含む凝集物の乾燥は、例えば、糖、グルコース、トレハロース、およびラフィノースのような物質を、脂質二重層を安定化するために使用する。この凝集物を乾燥するための好ましい方法は、凍結乾燥である。この凝集物を乾燥するための別の方法は、噴霧乾燥である。両方の方法は、当業者にとって周知である。

このような薬学的組成物を生成するための方法は、当該分野で公知である。薬学的組成物を生成するための１つの参考文献は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ Ｐａ．である。

（薬学的組成物の投与）
本発明の薬学的組成物は、ヒト患者または動物患者に、好ましくは呼吸経路によって、投与される。呼吸経路により投与される処方物は、一般には、経口エアロゾル処方物である。そのような処方物は、種々の様式で、呼吸経路を介して投与され得る。

そのようなエアロゾル薬物処方物を調合するための広範に使用されている一方法は、噴霧剤として公知である液化ガス中にてその薬物の処方物を作製する工程を包含する。その薬物は、噴霧剤中または組み合わせスラリー−溶液中に、溶解または懸濁され得る。その処方物は、容器に備えられた用量測定バルブの作動によって分配される。そのバルブは、各作動の際に、固定された所定量の薬物処方物を一貫して放出するように設計されている。その処方物が、高蒸気圧の噴霧剤による用量測定バルブを通って容器から押し出された時、その噴霧剤は、迅速に蒸発し、迅速に移動する雲のような非常に微細な薬物処方物粒子または薬物処方物小滴が残る。その後、この雲は、患者の口へと向けられる。エアロゾル用量測定バルブの作動と同時に、患者は、この薬物処方物粒子を肺の中へと吸入する。この様式で薬物を分配するためのシステムは、定量噴霧式吸入器（ＭＤＩ）として公知である。

リポソームに関して、ＭＤＩ装置は、噴霧剤中に懸濁されている定量の乾燥リポソームを送達するために、従来の加圧式噴霧剤噴霧デバイスを使用する。このシステムは、適切な噴霧剤中にあるリポソーム長期懸濁物を必要とするので、この懸濁物のリポソーム成分および噴霧剤成分は、貯蔵に関してリポソーム安定性について選択されなければならない。これと一貫して、選択される脂質は、乾燥リポソームが、認識された加圧溶媒貯蔵温度において噴霧剤溶媒中で完全であるままであるようでなければならない。この状態は、通常は、噴霧乾燥プロセスにより課せられる制約によって満たされる。

一方法において、この薬物は、小さい粒子ミストを形成するためにエアロゾル化され得る適切な溶媒中に溶解される。この薬物溶液は、液圧式ネブライザまたは超音波式ネブライザによってか、またはより簡便には、加圧フッ化炭素噴霧剤（すなわち、液化ガス）を含む内臓式ネブライザによって、エアロゾル化され得る。このエアロゾルミストの吸入（すなわち、このミストを口または鼻から気道中に吸い込むこと）は、気道の種々の部位（上部鼻咽喉領域、気管気管支領域、および肺領域を含む）に薬物含有エアロゾル粒子を堆積させるように作用する。後者の領域において、この薬物は、全身作用のために血流中に迅速に吸収するための機会を有する。

また、先行技術において周知であるのは、薬物が、粒子状形態（乾燥粉末としてか、または適切なキャリア溶媒系における微粉懸濁物としてのいずれか）で投与される、吸入システムである。代表的には、その薬物は、フッ化炭素型噴霧剤溶媒中に微粉形態で懸濁されている水溶性化合物である。エアロゾル化後、その噴霧剤溶媒のほとんどが、フラッシュエバポレーションを介して失われる。

本発明は、以下の実施例を参照することによってより良好に理解され得る。以下の実施例は、本発明を例示するために提供され、本発明を限定するためには提供されない。

（実施例１−リポソームの調製）
２つの異なる型のリポソームを調製した。１つの型のリポソームは、その表面に結合した−ＣＯＯＨ基（すなわち、反応性化学基）を有する係留分子（ｔｅｔｈｅｒ）としてのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（ＭＷ＝２０００）を有し、この−ＣＯＯＨ基は、リポソームに結合はしていないＰＥＧ分子末端に結合していた。第２の型のリポソームは、その表面に結合した−ＮＨ_２反応性化学基を有するＰＥＧ係留分子（ｔｅｔｈｅｒ）を有し、この−ＮＨ_２反応性化学基は、リポソームに結合していないＰＥＧ分子末端に結合していた。これらのリポソームを作製するために、２０ｍＭの全液体を含む１０ｍｌ溶液を調製した。この溶液における脂質の内訳は、４０％コレステロール（３０．９ｍｇ、ＭＷ ３８６．７）、５５％ジパルミチルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）（８０．７ｍｇ、ＭＷ ７３４）および５％のＤＰＰＥ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ（ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン）（３０．９ｍｇ、ＭＷ ２７４１．４６）結合体もしくはＤＰＰＥ−ＰＥＧ−ＮＨ_２結合体（２７．１ｍｇ、ＭＷ ２７１３．４６）のいずれかであった。これらの成分を、１ｍｌのエタノール中に溶解し、４９℃に加温した。９ｍｌのＭＥＳ緩衝液もまた、４９℃まで加温した。その後、このＭＥＳ緩衝液を、エタノール中の脂質に添加し（すなわち、これらの脂質を水和し）、この混合物を４９℃にてさらに３０分間インキュベートした。その後、この脂質混合物を、０．２μＭ Ｌｉｐｅｘ膜フィルターに１０回押し出して通して、サイズ０．２ミクロンのリポソームを得た。その後、押し出したリポソームを、１０００ｍｌの０．４５％生理食塩水に対して２回透析した。透析後、この脂質溶液の大部分を、２．３ｍｌの１００ｍＭ ＭＥＳ緩衝液を添加することによって還元した。最終溶液の塩分濃度は、１．３５％であった。

この２組のリポソームを、動的光散乱（ＤＬＳ）によって分析して、リポソームのサイズ分布を測定した。図５を参照されたい。このデータは、リポソームの平均サイズが、直径１００ｎｍと２００ｎｍとの間にあることを示す。

（実施例２−リポソーム凝集物の作製）
上記実施例１に記載したリポソームを使用して反応を実施して、上記リポソームを架橋させて凝集物を形成した。１つの反応において、ＮＨ_２リポソームのみを使用した。これらのリポソームを、スルホ−［エチレングリコビス（スクシンイミジルスクシネート）］（Ｓ−ＥＧＳとも呼ばれる）を使用することによって、互いに架橋させた。１つの反応において、０．２ｍｌのＮＨ_２リポソーム（約６．７×１０^１０リポソーム）と２．２ｍｇのＳ−ＥＧＳとを、合計１０ｍｌのリン酸緩衝液中で混合させた。第２の反応において、０．３ｍｌのＮＨ_２リポソーム（約１×１０^１１リポソーム）と３ｍｇのＳ−ＥＧＳとを、１０ｍｌのリン酸緩衝液中で混合した。第３の反応において、０．３ｍｌのＮＨ_２リポソームと、６ｍｇのＳ−ＥＧＳとを、１０ｍｌのリン酸緩衝液中で混合し、室温で一晩反応させた。凝集のために、５０〜１５０倍モル過剰のスルホ−ＥＧＳを、ＮＨ_２基に対して使用した。上記３組の凝集リポソームを、Ｆｒａｕｎｈｏｆｅｒ回折によって分析して、凝集物のサイズ分布を測定した。図６を参照されたい。このデータは、約１０ミクロンと５０ミクロンとの間の凝集物の平均直径を示す。凝集されなかったリポソームの直径は、約０．１ミクロン〜０．５ミクロンであった。

他の研究において、ＮＨ_２リポソームを、ＤＭＳ（ジメチルスベリミデート・２ＨＣｌ）を使用して、凝集させた。ＤＭＳは、一級アミンと反応し得かつその間に安定な共有結合を形成し得る、ホモ二官能性イミドエステルである。そのアミンとＤＭＳとのカップリング反応を、ＰＢＳまたはクエン酸−生理食塩水緩衝液中で、ｐＨ範囲７〜１０において実行した。使用したＤＭＳの量は、ＰＥＧ上のＮＨ_２基に対して８０〜３００倍モル過剰であった。このＤＭＳを、緩衝液中に溶解した直後に、既知量のリポソーム懸濁物に添加した。この反応混合物を、室温にて一定して攪拌した。これらの凝集物をＦｒａｕｎｈｏｆｅｒ回折によって分析して、その凝集物のサイズ分布を測定した（図１１）場合、その凝集粒子のサイズが、２つの領域内に入ることが観察された。１つのピークは、１μｍより小さいサイズの粒子を含んだ。これは、残っている親リポソームまたはおそらく低凝集凝集物を示す。もう１つのピークは、２〜３０μｍの間のサイズを有する凝集物を含んだ。このピークは、４μｍで最大値を示す。

他の研究において、ＮＨ_２リポソームを、ＤＴＢＰ（ジメチル３，３’−ジチオビスプロピオンイミデート・２ＨＣｌ）を使用して凝集させた。ＤＴＢＰは、ＤＭＳと類似するホモ二官能性イミドエステルであり、唯一の差異は、ＤＴＢＰがチオール切断性であることである。凝集のために、ＰＥＧ上のＮＨ_２基に対して１５０〜４４０倍モル過剰のＤＴＢＰを使用した。これらの凝集物をＦｒａｕｎｈｏｆｅｒ回折によって分析して凝集物のサイズ分布を測定した（図１２）場合、１５〜１５０μｍの間のサイズを示す大きな凝集物が観察された。このピークは、７０μｍで最大値を有する。この特定の研究において、非凝集粒子についてのピークは現れない。このことは、親リポソームの大部分が凝集されたことを示す。

（実施例３−リポソームによるインスリンのカプセル化および凝集物の形成）
９ｍｌの０．９％ ＮａＣｌ、ｐＨ２．６中に１０ｍｇのインスリンを溶解することによって、混合物を作製した。ＤＰＰＥ−ＰＥＧ−ＮＨ_２結合体（ＭＷ２７１３．４６）を１ｍｌのエタノール中に溶解して２０ｍＭ溶液を作製することによって、別の混合物を作製した。この２つの混合物を、水浴中で別個に加熱して、脂質を乾燥させた。その後、乾燥脂質を、上記インスリン溶液と混合することによって水和した。形成したリポソームを、０．２ミクロン膜に通して１０回押し出した。押し出し後、そのｐＨを、ＨＣｌまたはＮａＯＨを使用して５．１に調整して、遊離インスリンおよびカプセル化インスリンの両方の沈殿を引き起こした。沈殿した遊離インスリンを、０．８μｍフィルターにこの懸濁物を通してこの沈殿物をフィルター上に保持させることによって、リポソームから分離した。その後、透析を使用して、外部相中にあるエタノールおよび残っているインスリンを除去した［Ｆｉｓｈｅｒ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃからのＳｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒバイオテックセルロースエステル膜（１００，０００ダルトンＭＷＣＯ）］。その後、これらのリポソームをクエン酸緩衝液に対して透析した。このリポソームのサイズを、ＤＬＳによって測定し、それが直径約０．２ミクロンであることが示された。

これらのリポソームが凝集される前に、その中にカプセル化されたインスリンの量を測定した。インスリンカプセル化を、それらのリポソームを３０容量％メタノールで溶解してＨＰＬＣにより全インスリンをアッセイすることによって、測定した。その結果を、二重層が厚さ４ｎｍを有し、各分子が０．６５ｎｍ^２の二重層断面積を有するという仮定に基づく、理論上のカプセル化推定値と比較した。図１０から、これらのリポソーム中にカプセル化された薬物の量が、単膜リポソームについての理論値と二重膜リポソームについての理論値との間にあることが、観察され得る。

その後、１０ｍｌのリポソームサンプルを、３００ｍｌの０．９％ ＮａＣｌ，ｐＨ２．６に対して透析し、その後、１０００ｍｌのリン酸緩衝液に対して一晩透析した。その後、０．３ｍｌのリポソームを、実施例２に上記されたようにＳ−ＥＧＳを使用して凝集させた。凝集物のサイズを、これもまた上記のようにＦｒａｕｎｈｏｆｅｒ回折を使用して測定して、それが直径約３０ミクロンであることが示された。

凝集物の空力学的直径を測定した。凝集物を、ネブライザを使用して、Ａｎｄｅｒｓｅｎカスケードインパクター機器中に噴霧した。コントロールとして、凝集されなかったリポソームもまた、このカスケードインパクター中に噴霧した。その後、各実験について、このカスケードインパクタープレートを収集し、このプレート上に収集された物質を、このプレートを界面活性剤溶液で洗浄することによって除去した。このプレートから得たサンプルのインスリン含量を、ＥＬＩＳＡを使用して測定した。このデータが、図７に示される。このデータは、凝集物の５０％が、呼吸可能な範囲（１〜５μｍの間）にあることを示す。

別の研究において、インスリン含有リポソームを、実施例２に記載されるように、ＤＴＢＰを使用して凝集させた。これらの凝集物のサイズ分布は、Ｆｒａｕｎｈｏｆｅｒ回折により測定すると、１０〜９０μｍの間であった。カスケードインパクターにより測定した空力学的直径分布が、図１３に示される。その結果は、凝集物の空力学的直径によって、それらが非常に呼吸可能であることを示す。凝集物の約７０％が、呼吸可能な範囲（１〜５μｍ）にある空力学的直径を有した。これらの直径は、Ｆｒａｕｎｈｏｆｅｒ技術により測定した幾何学的直径よりも明らかにかなり小さい。

（実施例４−噴霧の間のインスリン含有凝集物の安定性）
噴霧の間の凝集物の安定性を調査するために、噴霧後にカプセル化されたままであるインスリン画分を測定した。インスリンを含むリポソームのＤＴＢＰ凝集処方物（および非凝集コントロールリポソーム）を、Ｐａｒｉｊｅｔ ＬＣネブライザを使用して噴霧した。噴霧物を、クエン酸緩衝液を含む三角フラスコ中に収集した。すべての場合において、噴霧処方物（親リポソームおよび非凝集リポソームの両方）の約２０％を収集した。カプセル化薬物の損失を、収集した噴霧物の透析によって評価した。その結果が図１４に示される。この結果は、上記調製物各々についてのカプセル化インスリンの画分を比較する。この結果は、リポソームの場合はカプセル化薬物の約８０％の損失を示すが、凝集処方物は、カプセル化薬物の比較的少ない損失を示す。詳細には、カプセル化インスリンの約２０％のみしか、ＤＴＢＰ凝集物から漏出しなかった。これらのデータは、上記凝集物が、噴霧の際にほぼ完全のままであることを示す。

（実施例５−凝集物架橋の切断）
ポリスチレンラテックス粒子を、リポソームの凝集について上記されたような切断可能なＥＧＳ化学を使用して、凝集させた。得られた凝集物（Ｆｒａｕｎｈｏｆｅｒ平均直径約８０ミクロンを有する）を、ｐＨ８．４の炭酸−重炭酸緩衝液中でインキュベートし、１．２％ ｖ／ｖヒドロキシルアミンで処理した。その凝集物をＦｒａｕｎｈｏｆｅｒ回折によって特徴付けた。得られたサイズ分布が図９に示される。このデータは、架橋の切断が生じるにつれ、時間とともに凝集物のサイズが低下することを示す。凝集物の架橋のこのような切断は、薬物が粒子から放出される速度を増加させる。なぜなら、増加した表面積が、放出媒体に露出されるからである。

別の研究において、ＤＴＢＰ凝集リポソームの切断を試験した。ＤＴＢＰ凝集物の切断を、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を３７℃で用いて達成した。このデータ（図１５）は、切断時の凝集物サイズの減少を示す。

（実施例６−リポソーム凝集物からのインスリンの放出速度）
実施例２および３に記載されるようにＳ−ＥＧＳで凝集したインスリン含有リポソームの凝集物を、ｐＨ７．２のリン酸緩衝化生理食塩水中でインキュベートした。その外相を、特定の時間間隔で１００，０００分子量カットオフ膜に通す透析によってリポソームから分離し、ＵＶ吸収によって分析した。この透析膜を通ったインスリンの量は、凝集物から放出された量と等しかった。なぜなら、この凝集物自体は、この膜を通るには大き過ぎたからである。リポソームをＴｗｅｅｎ−２０（市販の界面活性剤）の１０％ ｖ／ｖ溶液で溶解して、肺投与後のリポソームの迅速な再集合をシミュレートした、同じ実験も実施した。このデータが、図８に示される。このデータは、再集合したリポソームと比較して遅い、凝集物からのインスリン放出を示す。

下記の一連の実験において、種々の処方物からのインスリンのインビトロ放出もまた、評価した。これらの研究において、市販の肺界面活性剤置換物であるＳｕｒｖａｎｔａ（登録商標）（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して、肺環境をシミュレートした。薬物調製物およびＳｕｒｖａｎｔａ（登録商標）（それぞれ、３：１容積比）を、ｐＨ７．４のクエン酸緩衝液中に浸漬した透析バッグ（３００，０００ ＭＷＣＯ）中に３７℃でインキュベートした。外相からサンプルを採取し、それをＨＰＬＣにおいてインスリンについてアッセイした。

図１６は、親リポソームからのインスリン放出と、スルホ−ＥＧＳ凝集物からのインスリン放出との比較を示す。コアリポソームからのインスリン放出は、最初の３０分間の間の初期バーストと、その後の漸進的安定を示した。スルホ−ＥＧＳ凝集物は、同様の初期バーストを示した。その放出がプラトーに達した時、その凝集物を、４．５ｍｇ／ｍＬのヒドロキシルアミンとともにインキュベートすることによって切断した。この切断剤の導入は、明らかに、インスリン放出の加速を引き起こした。ヒドロキシルアミンの導入の２時間後、この放出はほぼ２倍になった。その後、この放出はプラトーに達し、その後、分解に起因して次第に減少した。

切断剤の多回適用により引き起こされるインスリン放出プロフィールが、図１７に示される。親リポソームからの放出は、初期バーストを示し、４時間後に次第にプラトーに達した。スルホ−ＥＧＳ凝集物の場合、放出は、ヒドロキシルアミンの添加後に加速された。この切断剤の添加１．５時間後に、この放出は２倍を超えた。この放出がプラトーに達した後、より多くの切断剤を添加することによって、さらなる切断を引き起こした。この放出はまた、明らかに加速された。

図１６および１７に示される研究を、長時間にわたって３７℃にて実施した。これらの条件下で、界面活性剤中にあるタンパク質分解酵素の存在に起因するインスリンの分解が予期された。従って、透析膜の外相においてモニターしたインスリンは、実際の放出より少なかった。これは、処方物を透析バッグから収集して残ったインスリンを測定した、各研究の最後に確認された。すべての場合において、リポソームから失われる実際のインスリンは、放出されたとして測定されたインスリンより２〜３倍多かった。このことは、図１６および１７に示されるようなインスリン放出が、示されるように実際には多かったことを示す。

図１８は、ＤＴＢＰ−凝集物からのシプロフロキサシンの放出を示す。シプロフロキサシンを、５０ｍＭ脂質含量のリポソーム中に遠隔充填した。ブランクリポソームを、４００ｍＭ硫酸アンモニウム非緩衝化溶液中で調製した。このリポソームを、２５０ｍＬの脱イオン水に対して２時間（１０，０００ＭＷＣＯ透析チューブを使用して）透析して、リポソームの外相からエタノールおよび硫酸アンモニウムを除去した。シプロフロキサシンを、ｐＨ５．５の脱イオン水中に５０℃にて溶解した。シプロフロキサシン溶液を、リポソーム懸濁物中に添加し、その温度を５２℃に維持した。遠隔充填手順は、その温度を、氷浴を使用して迅速に低下させることによって、１時間後に終了した。その後、その懸濁物を、リポソーム懸濁物をｐＨ５．５の３００ｍＬ脱イオン水に対して４時間透析することによって、未捕捉シプロフロキサシンから分離した。リポソームを、実施例２に記載されるように、ＤＴＢＰ化学を使用して凝集させた。

図１８は、この場合にモニターされた放出が、インスリンの場合よりもかなり多かったことを示す。なぜなら、シプロフロキサシンは、インスリンと同じ程度まで肺界面活性剤中で分解しないからである。従って、モニターされる放出は、実際の放出とより近いと考えられる。初期バーストの後、凝集物からの薬物放出はプラトーに達した。ＤＴＴの添加が切断を引き起こした。これは完全であると考えられた。なぜなら、２０倍モル過剰の切断剤を使用したからである。切断は、切断剤添加の３時間以内に、カプセル化薬物の３５％の放出をもたらした。

上記の研究すべてにおいて、切断後の凝集物が親リポソームより多くの薬物を放出したことが観察された。

上記は、好ましい実施形態の単なる詳細な説明に過ぎないことが理解されるべきである。従って、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、種々の改変および等価物がなされ得ることが、当業者にとって明らかであるはずである。本出願において同定されているすべての参考文献、特許および特許公開は、その全体が参考として本明細書中に援用される。上記に示される特定の実施例は、単なる例示に過ぎず、本明細書中に記載される本発明の範囲を限定することは意図されない。

本発明は、以下の図面を参照することによってより容易に理解され得る。
図１は、２つの反応粒子の間の化学的架橋の形成を例示する模式図である。 図２は、スペーサー分子との反応による２つの反応粒子の間の化学的架橋の形成を例示する模式図である。 図３は、架橋された凝集物を形成するための複数の反応粒子の間の化学的架橋の形成を例示する模式図である。 図４は、凝集物の架橋の部分的切断を例示する模式図である。 図５は、空力学的光散乱によって測定されたＣＯＯＨリポソームおよびＮＨ_２リポソームのサイズ分布を示す。 図６は、Ｆｒａｕｎｈｏｆｅｒ回折によって測定された、Ｓ−ＥＧＳを用いて形成されたリポソームの凝集物のサイズ分布、および凝集物したリポソームのサイズ分布を示す。 図７は、カスケードインパクターで測定された、凝集物したインスリン含有リポソームおよび凝集していないインスリン含有リポソームの空力学的直径を示す。 図８は、凝集したリポソームおよび再アセンブリされたリポソームの放出速度を示す。 図９は、リポソーム凝集物のＳ−ＥＧＳ架橋のヒドロキシルアミンによる切断を示す。 図１０は、インスリン充填リポソームの実験データと比較した、７５ｍＭ リポソームの理論的カプセル化効率を示す。 図１１は、凝集していないリポソームとの、５０．４３ｍｇ／ｍｌのＤＭＳと凝集し１日後に分析したリポソーム（３７．５ｍＭ 脂質）のＦｒａｕｎｈｏｆｅｒ回折によるサイズ分布の比較を示す。 図１２は、凝集していないリポソームとの、１５０．８３２ｍｇ／ｍｌのＤＴＢＰと凝集し１日後に分析したリポソーム（７５ｍＭ 脂質）のＦｒａｕｎｈｏｆｅｒ回折によるサイズ分布の比較を示す。 図１３は、カスケードインパクターを使用した、インスリンを含む凝集していないリポソームおよびＤＴＢＰ−凝集したリポソームの空力学的特性を示す。 図１４は、異なるリポソーム処方物について噴霧化した際の、充填されたインスリンの喪失を示す。 図１５は、切断された凝集物（切断のために、０．７ｍｌの凝集物を、クエン酸緩衝液で１．４２ｍｌへと希釈し、４．９３ｍｇ／ｍｌのＤＴＴで、３７℃にて２または４時間切断した）との、４５．８６ｍｇ／ｍｌのＤＴＢＰと凝集したインスリンカプセル化リポソーム（３７．５ｍＭ 脂質）のＦｒａｕｎｈｏｆｅｒ回折によるサイズ分布の比較を示す。 図１６は、親リポソームおよび（ヒドロキシルアミンを使用する）切断後のスルホ−ＥＧＳ−凝集物からのインスリン放出を示す。 図１７は、親リポソームおよび（ヒドロキシルアミンを用いる）多重切断後のスルホ−ＥＧＳ−凝集物からのインスリン放出を示す。 図１８は、ＤＴＴを用いる切断後のＤＴＢＰ−凝集物からのシプロフロキサシンの放出を示す。

Claims (20)

1. 生理学的環境中でインキュベートされた場合に、薬物の制御放出を示す薬物送達ビヒクルであって、該薬物送達ビヒクルは、以下：
   １以上の薬物を充填した少なくとも２種類の生体適合性粒子の凝集物、
   を含み、
   ここで該生体適合性粒子は、その表面と結合している複数の反応性基を有し、かつ互いに化学的に架橋されて、該凝集物を形成し；
   ここで該生体適合性粒子は、直径が０．１〜１．０ミクロンの間の平均サイズを有し；そして
   ここで該凝集物は、哺乳動物被験体によって吸入され得るサイズである、
   薬物送達ビヒクル。
2. 請求項１に記載の薬物送達ビヒクルであって、前記生体適合性粒子は、生体再吸収性または生体分解性の材料から形成される、薬物送達ビヒクル。
3. 請求項１に記載の薬物送達ビヒクルであって、前記凝集物は、１〜１０ミクロンの間の空力学的直径を有する、薬物送達ビヒクル。
4. 請求項１に記載の薬物送達ビヒクルであって、前記生体適合性粒子は、１種類以上の脂質または１種類以上の生分解性ポリマーから形成される、薬物送達ビヒクル。
5. 請求項１に記載の薬物送達ビヒクルであって、前記生体適合性粒子は、リポソームである、薬物送達ビヒクル。
6. 請求項１に記載の薬物送達ビヒクルであって、前記反応性化学基のうちの１以上は、粒子表面に直接結合される、薬物送達ビヒクル。
7. 請求項１に記載の薬物送達ビヒクルであって、前記反応性化学基のうちの１以上は、係留分子を介して該粒子に結合される、薬物送達ビヒクル。
8. 請求項１に記載の薬物送達ビヒクルであって、前記凝集物を形成する前記生体適合性粒子のうちの２つ以上は、スペーサーを介して化学的に架橋される、薬物送達ビヒクル。
9. 請求項１に記載の薬物送達ビヒクルであって、前記凝集物を形成する前記生体適合性粒子のうちの２つ以上は、切断可能な共有結合またはスペーサーによって架橋される、薬物送達ビヒクル。
10. 請求項１に記載の薬物送達ビヒクルであって、前記凝集物を形成する前記粒子のうちの２つ以上は、切断可能でない共有結合またはスペーサーによって架橋される、薬物送達ビヒクル。
11. １以上の請求項１に記載の薬物送達ビヒクルを含む薬学的組成物であって、該薬学的組成物は、哺乳動物被験体によって吸入され得る形態である、薬学的組成物。
12. 請求項１１に記載の薬学的組成物であって、該薬学的組成物は、経口エアロゾルの形態である、薬学的組成物。
13. 請求項１１に記載の薬学的組成物であって、該薬学的組成物は、前記凝集物中の２つ以上の粒子を架橋する１つ以上の共有結合またはスペーサーを切断し得る、１種類以上の物質をさらに含む、薬学的組成物。
14. 請求項１１に記載の薬学的組成物であって、該薬学的組成物は、溶媒、プロペラント、糖、塩、緩衝化剤、防腐剤、薬学的に受容可能なキャリア、賦形剤、および治療剤からなる群より選択される１種類以上の成分を含む、薬学的組成物。
15. 送達ビヒクルを画像化するために、１種類以上のコントラスト増強剤を哺乳動物被験体に送達するための制御放出送達ビヒクルであって、該制御放出送達ビヒクルは、
    １種類以上のコントラスト増強剤を充填した少なくとも２つの生体適合性粒子の凝集物、
    を含み、
    ここで該生体適合性粒子は、その表面と結合している複数の反応性基を有し、かつ互いに化学的に架橋されて、該凝集物を形成しており；
    ここで該生体適合性粒子は、直径が約０．１ミクロン〜１．０ミクロンの間の平均サイズを有し；そして
    ここで該凝集物は、哺乳動物被験体によって吸入され得るサイズである、制御放出送達ビヒクル。
16. 請求項１５に記載のコントラスト増強剤送達ビヒクルであって、前記生体適合性粒子は、生体再吸収性または生分解性の材料から形成される、コントラスト増強剤送達ビヒクル。
17. 請求項１５に記載のコントラスト増強剤送達ビヒクルであって、前記凝集物は、１〜１０ミクロンの空力学的直径を有する、コントラスト増強剤送達ビヒクル。
18. 請求項１５に記載のコントラスト増強剤送達ビヒクルであって、前記生体適合性粒子は、１種類以上の脂質または１種類以上の生分解性ポリマーから形成される、コントラスト増強剤送達ビヒクル。
19. 請求項１に記載のコントラスト増強剤送達ビヒクルであって、前記凝集物を形成する前記生体適合性粒子のうちの２つ以上は、スペーサーによって化学的に架橋される、コントラスト増強剤送達ビヒクル。
20. 請求項１に記載のコントラスト増強剤送達ビヒクルであって、前記凝集物を形成する前記生体適合性粒子のうちの２つ以上は、切断可能な共有結合またはスペーサーによって架橋される、薬物送達ビヒクル。

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