JP2005517440A - γδT細胞を製造するための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
−それらはガンマデルタT細胞を80%を超えて含み、そして
−それらは生存する機能的ガンマデルタT細胞を1億個を超えて含む。
−血液細胞調製物(一般的にはサイタフェレーシスの細胞)をガンマデルタT細胞の合成活性化化合物、ならびにインターロイキン−2およびインターロイキン−15から成る群より選択されるサイトカイン存在下に培養し、かつ上記培養を細胞密度が実質的に5.106細胞/ml、好ましくは3.106未満に維持する条件で実施すること、および
−生じた細胞の一部または全てを回収し、上記細胞が機能的ガンマデルタT細胞を含んでいること、を含む。
発明の方法は、これにより大量の未分画血液細胞を含む生物調製物からガンマデルタT細胞を効率的に製造できるようになることに関し有益である。従って方法は、血液、血漿または血清サンプル、例えばサイタフェレーシスのサンプルに直接実施されるだろう。一般には血液の単核細胞調製物、特に末梢血由来調製物が用いられる。末梢血細胞調製物は通常TまたはBリンパ細胞を約30〜70%、NK細胞を5〜15%、そしてガンマデルタT細胞を1〜5%含んでいる。もちろん発明の方法を実施する前の生物調製物を処理して、例えば特定の細胞亜集団を選別する、または特定の細胞亜集団を除くことは可能である。しかしながら、発明の機能的ガンマデルタT細胞細胞組成物の製造にはこのような前処理は必要ない。即ち、方法は一般には被験者より採集した血液細胞サンプル、特には全単核細胞(言い換えれば未分画細胞)サンプルに直接実施する。上記サンプルは全血(PBMC)を対象としたサイタフェレーシスまたはフィコール勾配法のような、当業者周知の、世界中で臨床使用されている通常の方法により得ることができる。発明の実施に関する好適細胞源は、サイタフェレーシスで得るもののように、全末梢単核細胞から構成されている。従って、具体的実施態様では、本発明の方法は、サイタフェレーシスまたはサイタフェレーシスの一部を上記条件の下に培養する第一工程を含む。サイタフェレーシスは一般に109個を超えた単核細胞を提供する。1回のサイタフェレーシスからは複数の小分けサンプルを調製することができ、それらは発明の方法により個別に処理できる。従ってある患者については、発明のガンマデルタT細胞の複数バッチを個別かつ異なった時に製造できる。この小分けにより、細胞に対する品質および機能活性試験の実施が可能となり、組成物の安全性をより正確に知ることができる。
発明の方法の優れた一側面はガンマデルタT細胞の合成活性化化合物の使用である。即ち発明は、合成化合物を利用した単一の代謝活性化だけでガンマデルタT細胞を効果的かつ方向づけられた活性化および増幅できることを示している。
具体的化合物は次の通りである:
3−(ブロモメチル)−3−ブタノール−1−イル−2リン酸(BrHPP)
3−(ヨードメチル)−3−ブタノール−1−イル−2リン酸(IHPP)
3−(クロロメチル)−3−ブタノール−1−イル−2リン酸(CIHPP)
3−(ブロモメチル)−3−ブタノール−1−イル−3リン酸(BrHPPP)
3−(ヨードメチル)−3−ブタノール−1−イル−3リン酸(IHPPP)
α,γ−ジ−[3−(ブロモメチル)−3−ブタノール−1−イル]−3リン酸(diBrHTP)
α,γ−ジ−[3−(ヨードメチル)−3−ブタノール−1−イル]−3リン酸(diIHTP)
3,4−エポキシ−3−メチル−1−ブチル−2リン酸(Epox−PP)
3,4−エポキシ−3−メチル−1−ブチル−3リン酸(Epox−PPP)
α,γ−ジ−3,4−エポキシ−3−メチル−1−ブチル−3リン酸(diーEpox−TP)
発明の方法はサイトカイン(単独または場合により、他の生物活性作用物質と組合せもしくは結合して)、特にインターロイキンを利用する。このサイトカインはインターロイキン−2またはインターロイキン15が有利である。事実本明細書は、同じ受容体を利用する前記インターロイキンが、上記条件においてガンマデルタT細胞を効率的に産生することを示している。
−ガンマデルタT細胞合成活性化化合物およびサイトカイン存在下に単核細胞を培養し、前記サイトカインが第一有効投与量存在する第一の培養工程、および
−上記サイトカインの第二有効投与量存在下に上記細胞を培養し、上記第二有効投与量が上記第一有効投与量より高い第二の培養工程。
発明の方法は、活性化化合物(培養開始時)およびサイトカイン存在下に一定期間、ガンマデルタT細胞を選択的に活性化および増幅できる条件で細胞を培養することを含む。
−それらはガンマデルタT細胞を80%超、有利には85%超、さらに有利には90%を超えて含んでおり、そして
−それらは1億個超の生存して機能するガンマデルタT細胞を含んでいる。
得た細胞は即時使用しても、貯蔵を考慮し処理してもよい。一般に、細胞は特にポリマーまたは中性蛋白質のような安定化剤を含有する培地に包まれる。ヒト血清アルブミン(HAS)を使用することが有利であり、また非経口等級の調製物が市販されている。ここに示す結果は、それらを注射することを考慮し、細胞を4℃でヒト血清アルブミン溶液の形に調剤できることを示す。この局面での発明の具体的目的は、ガンマデルタT細胞およびヒト血清アルブミンを、一般には2〜10%、有利には約4%含む組成物である。
−本明細書に記載の方法に従い細胞を培養すること、
−獲得した細胞の一部または全てを回収し、前記細胞が機能的ガンマデルタT細胞を含むこと、そして
−細胞を医薬的に許容可能な作用物質または担体を用いて調剤すること、
を含む、方法に関する。
培養10〜20日後にガンマ9デルタ2T細胞の純度が80%超であり、1億個超のガンマ9デルタ2細胞を獲得することを目的とする5000万個超の未分画PMBC細胞から開始するガンマ9デルタ2T細胞の増幅
IA−材料
血液サンプル
3名の健康供血者かそれぞれから6−mLチューブ(ACD:クエン酸デキストロース)に全血を採血し、室温に貯蔵した。血液はサンプリング後約18時間に処理した。
健康供血者よりサイタフェレーシスバッグ(1/2ボディーマス(body mass))を採取し、室温に貯蔵した。MNC(単核細胞)は採取後約18時間に処理した。
合成またはその他の各種培養培地を使用した。細胞はRPMI培地(Sigma、参照番号R0883)で、場合により使用直前にL−グルタミン酸(0.3g/l最終濃度)を補充し培養した。
用いたヒト組換え体インターロイキン−2は、1800万IUを含むProleukin(Aldesleukin)(Chiron BV、参照番号FRC01A)であり、RPMI/10%HS培地中に360,000IU/mlの濃度になるよう小分けし−20℃に貯蔵した。Ficoll(「リンパ球分離媒体」)は、密度1.077±0.001(Sigma、参照番号913353)で使用した。ヒト血清アルブミンはアルブミン−LFB4%であり、これは販売許可番号558632−9を取得している。DMSOおよび生理食塩水はBraun Medical社より得た。
用いた培養用具は表2に掲載した。
用いた抗体は表3に掲載した。
Ficoll+全血からのリンパ球の分離
この方法は細胞生物学研究室で一般に用いられている。簡単に述べると、全血をFicoll処理し、PBMCをFicoll勾配で回収する。Ficollを濯ぎ流し、「Coulter Multisizer II」を用い細胞数を測定した(一定の条件および一定の供血者について異なる3サンプルについて)。PBMCを10%DMSO(4%ヒト血清アルブミンまたはFCS中)を含む凍結溶液中に凍結した。
この操作はサンプルからの「血小板除去」を行う第一段階を含み、この段階は以下のようにして各サイタフェレーシスバッグについて行った:
サイタフェレーシスバッグの中身を50mlチューブに移し、これに2倍量のRPMI培地を加えた。チューブを200gで遠心分離し、上清を廃棄した。沈殿物を一つにまとめ(プール)、RPMI培地に懸濁した(適宜50mlまで)。細胞数を測定し、再度約400g(20℃)で遠心分離した。再び上清を廃棄し、沈殿物を最終濃度が約5億細胞/mlになるようウシ胎児血清に懸濁した。細胞数を測定し、細胞濃度を約3億細胞/mlにウシ胎児血清をつかって調節した。細胞懸濁液は通常氷上(4℃)に置いた。MNCを5から15%DMSO(4%のヒト血清アルブミンまたはFCS溶液中に)を含む凍結溶液中に凍結するか、または直接培養できる。
凍結パラメータを最適化するために、4%ヒト血清アルブミンもしくはFCSに懸濁した細胞を冷蔵凍結液(20%DMSOおよび4%ヒト血清アルブミンもしくはFSC)に容量対容量で希釈した。作業中、細胞懸濁液の入ったチューブを振とうしてから冷蔵容器内に入れるかまたは氷片上に置くと有利である。ホモジナイズした混合物を1.8mlの凍結用チューブに分注し(チューブあたり1ml)、これを凍結箱に入れて−80℃で保管した。その後凍結チューブは液体窒素に移動して保管した(最低でも4時間後)。
24ウエルプレートでの培養で用いる「リンパ球数/ウエル面積」の比が約1.106細胞/1.9cm2に等しくなるように、各種容器(または培養用具)内に接種するMNC数を選んだ(表4参照)。
PBMCおよびMNCを24ウエルプレートを使い、ウエルあたり100万細胞の割合で、RPMI/10%FCS/3μM BrHPP/120IU/mlIL−2溶液1.5ml(60万細胞/mlに相当)で培養した。
細胞は加湿した5%CO2大気中、37℃で、RPMI/10%FCS/360IU/mlIL−2の中で培養し、維持した。最初の培地交換は4日目に培地を追加する形で行い、以後3日おきに行った。このようにしてIL2濃度は培養期間中増加した。
−Coulterカウンターによる全生細胞数測定
−CD56/CD3二重標識
−Vδ2/CD3/CD69三重標識
−アイソタイプコントロール:IgG1k−FITC/R−PE/cyC
−フローサイトメトリー(FACScan、Becton Dickinson)によるデータ取得
得た細胞に各種試験を実施し、機能活性を評価した。具体的には上記試験は、細胞の細胞傷害活性およびそのTNF産生に関する。
培地選択
ヒトリンパ球の培養、特にガンマ9デルタ2T細胞の培養にはヒト血清を補充した培地が最も適していると考えられたが、これは主に血清増殖因子が種特異的種であることが多いことに拠る。しかしこの様な培地は、生物学的リスクと大量のヒト血清の使用することから、臨床的調製および使用が極めて難しい。
培養終了時に大量のガンマ9デルタ2T細胞を産生することを目的とすることから、場合により凍結して細胞バンクにできる、多数の細胞を含む供給源を用いて開始することに関心があった。考え得る供給源の一つは、サイタフェレーシスで獲得する単核細胞である。しかしこの方法は細胞を変化させ、十分な細胞増殖を妨げる可能性がある。サイタフェレーシスのサンプルは多数の赤血球を含むことが多いため、血小板除去直後に、または血小板除去してからFicoll処理した後にMNCの増殖を試験した(材料と方法参照)。この様にしてサイタフェレーシス由来の細胞については、十分な増殖を示すことができるか試験し、確認した。この試験をまず小規模(24ウエルプレート、材料と方法参照)で実施し、表6に3名の供血者の結果を示す。
10日後の細胞濃度維持研究
IIA−ガンマ9デルタ2T細胞の増幅
前記方法に基づく別の実験を、特に記載ない限りにおいて実施例1と同一の材料と方法を用い、3名の新規供血者(D623、D762、D711)のMNCについて実施した。培養開始条件は同一である。培地50mlを4日目と7日目に加えた。10日目に細胞を分析し、細胞数を測定した。10日目まで培養は3重に実施した(供血者一人あたり同一培養を3個行った)。次に細胞密度を3濃度(20万、50万および100万個/ml、各濃度について3重培養を一つ用いた)に調節し、細胞密度パラメータの影響を調べた。次に3日ごとに培養物を分析し、密度が200万細胞/mlを越えた場合には、10日目に密度を調節した。結果を表8に示す。
刺激後、天然のガンマ9デルタ2T細胞はTNF(「組織壊死因子」)のようなサイトカインを産生し、幾つかの癌細胞に傷害性を示す。具体的にはガンマ9デルタ2T細胞は、Daudi(骨髄腫)細胞株を特異的に溶解するが、RAJI細胞株は溶解しないことが判っている。
凍結MNC細胞に関する増殖試験
特に本法の実際的な実行方法は、凍結細胞を用いて開始できることであろう。事実、サイタフェレーシスは20〜40億個の細胞を提供できるが、この数は小分け凍結して、同一サイタフェレーシスより複数培養できる数に相当する。
注射調製物向け細胞製剤
ヒトへ注射する場合には、FCSを排除し、細胞を医薬的に許容可能な緩衝液内に取り込まなければならない。HSAを4%含有する媒体を試験した。
2種類の凍結媒体:DMSO濃度10%の4%HSA液、DMSO濃度7.5%のFCS液。
両媒体を3細胞濃度:2500、5000、15000万細胞/mlについて試験した。
増幅プロトコールは、細胞数を7日目以降50万個/mlに維持した以外は実施例IIに同じであった。
Claims (20)
- ガンマデルタTリンパ球組成物を調製する方法であって、培養開始時にガンマデルタTリンパ球の合成活性化化合物の存在下に少なくとも5000万個の単核細胞を含む生物調製物を培養し、続いてサイトカイン存在下に培養する工程を少なくとも1つ含む方法。
- 生物調製物が血液、血漿または血清サンプルである、請求項1に記載の方法。
- 生物調製物がサイタフェレーシスに由来するものである、請求項2に記載の方法。
- 生物調製物が10.107個を超えた細胞を含む、請求項1から3のいずれか1項に記載の方法。
- 生物調製物があらかじめ凍結されている、請求項1から4のいずれか1項に記載の方法。
- 細胞を培養中約5.106細胞/ml未満の密度に維持する、請求項1から5のいずれか1項に記載の方法。
- 細胞を約10日以上、好ましくは10から25日の間の期間培養する、請求項1から6のいずれか1項に記載の方法。
- ガンマデルタTリンパ球の合成活性化化合物がガンマデルタTリンパ球のT細胞受容体リガンドである、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- ガンマデルタTリンパ球の合成活性化化合物をホスホハロヒドリン化合物、ホスホエポキシド化合物およびビスホスホナート化合物より成る群から選択する、請求項8に記載の方法。
- ガンマデルタTリンパ球の合成活性化化合物を以下の化合物より成る群:
3−(ブロモメチル)−3−ブタノール−1−イル−2リン酸(BrHPP)
3−(ヨードメチル)−3−ブタノール−1−イル−2リン酸(IHPP)
3−(クロロメチル)−3−ブタノール−1−イル−2リン酸(CIHPP)
3−(ブロモメチル)−3−ブタノール−1−イル−3リン酸(BrHPPP)
3−(ヨードメチル)−3−ブタノール−1−イル−3リン酸(IHPPP)
α,γ−ジ−[3−(ブロモメチル)−3−ブタノール−1−イル]−3リン酸(diBrHTP)
α,γ−ジ−[3−(ヨードメチル)−3−ブタノール−1−イル]−3リン酸(diIHTP)
3,4−エポキシ−3−メチル−1−ブチル−2リン酸(Epox−PP)
3,4−エポキシ−3−メチル−1−ブチル−3リン酸(Epox−PPP)
α,γ−ジ−3,4−エポキシ−3−メチル−1−ブチル−3リン酸(diーEpox−TP)
から選択する、請求項9に記載の方法。 - サイトカインをインターロイキン−2およびインターロイキン−15より成る群から選択する、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- サイトカインを約150U/ml〜約500U/mlの範囲を含む濃度で使用する、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 得られる組成物が次の特徴:
−組成物はガンマデルタT細胞を80%を超えて含み、かつ
−組成物は1億個を超える、生存する機能的ガンマデルタT細胞を含む、
を有する、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。 - 機能的ガンマデルタTリンパ球を含む細胞組成物を調製する方法であって、前記方法が少なくとも:
−サイタフェレーシス由来の細胞を、ガンマデルタTリンパ球の合成活性化化合物、ならびにインターロイキン−2およびインターロイキン−15から成る群より選択されるサイトカインの存在下で培養し、ここで前記培養を細胞密度が実質的に5.106細胞/ml未満に確実に維持する条件で実施すること、および
−得られた細胞の一部または全てを回収し、ここで上記細胞が機能的ガンマデルタTリンパ球を含んでいること、を含む方法。 - ガンマデルタTリンパ球を基礎とする医薬組成物を調製する方法であって、前記方法が:
−請求項1から14のいずれか1項に記載の方法に従い細胞を培養すること、
−得られた細胞の一部または全てを回収し、ここで上記細胞が機能的ガンマデルタTリンパ球を含んでいること、および
−細胞を医薬的に許容可能な担体または賦形剤に調剤すること、
を含む方法。 - 機能的ガンマデルタTリンパ球が、80%超を構成し、かつ1億個超のガンマデルタTリンパ球を含む細胞集団を含む医薬組成物。
- ヒト血清アルブミンを追加して含む、請求項16に記載の組成物。
- 同時、別々または長期間にわたり用いることを意図して、IL−2およびIL−15より成る群から好んで選択されるサイトカインを追加して含む、請求項16または17のいずれかに記載の組成物。
- 機能的ガンマデルタTリンパ球を少なくとも80%含み、かつ1億個超のガンマデルタTリンパ球を含む、血液細胞のインビトロまたはエキソビボ培養物。
- 被検体の免疫防御を刺激するための、特に感染症もしくは寄生虫病、または癌を処置するための医薬組成物を調製するための、請求項19に記載の細胞培養物の使用。
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