JP2005512107A - 遠心スペクトロメータ - Google Patents

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Abstract

遠心スペクトロメータは、その中にキャビティまたはブレード(12)が形成された固体ロータ(10)を有する。使用中には、各ブレードは緩衝溶液で満たされ、分離対象試料は、分離チャネル(24)の端部に位置する試料ウェル(32)内に配置される。ロータは制御された速度で回転し、これと同時に、ブレードの全長に沿って制御された電位差が印加される。その結果生じる電界は、ブレードの形状によって径方向距離の関数として変化する。試料は複数のバンドに分離され、これらが遠心力と変化する電界の組み合わさった影響下でチャネル(24)に沿って移動する。各バンドは、それらの電荷質量比に応じて異なる平衡点を中心とする。バンドの位置は、読出しヘッド(36)によって決定される。この装置のダイナミック・レンジは、回転速度および印加電圧を変えることによって制御することができる。

Description

本発明は遠心スペクトロメータに関する。特に、複数の生物細胞、複数の高分子またはその他の複数の対象を分離するためのスペクトロメータに関するが、これに限定されるわけではない。本発明はさらに、複数の生体分子の配列決定およびソーティング、ならびに細胞のソーティングの分野一般に関する。
従来、生体分子の配列決定およびソーティングならびに細胞のソーティングは、電気泳動を利用して行われている。多種多様な手法が考えられるが、大部分は完了までにかなりの時間がかかる。さらに、比較的迅速に結果を読み出すか(バンドは細くなるが互いに接近する)、読出しを遅らせるか(バンド間は離れるがバンド自体は広くなり拡散が大きくなる)、兼ね合いを計る必要もある。
本発明の目的は、従来技術のこうした困難を少なくとも軽減することである。
本発明の他の目的は、簡略かつ好都合ですぐに使えるスペクトロメータ、および複数の対象を分離する方法を提供することである。
本発明の第1の態様によれば、複数の対象を分離する方法であって、
(a)前記対象を分離チャネル内に配置するステップと、
(b)前記チャネルを回転させて、前記対象にかかる遠心力を発生させるステップと、
(c)前記チャネルに沿って変化する電界を発生させるステップと、
(d)前記遠心力および前記電界の組み合わさった影響下で、前記対象を前記チャネルに沿って移動させて分離するステップとを含む方法が提供される。
本発明の別の態様によれば、
(a)径方向に延びるブレードと、
(b)使用中にブレードに沿って変化する電界を形成する電界形成手段とを含むスペクトロメータのロータであって、
軸の周りに回転したときに、遠心力および電界の組み合わさった影響下でブレード内の対象が移動して分離される、スペクトロメータのロータが提供される。
さらに、本発明は、上記で規定したようなスペクトロメータのロータを含むスペクトロメータにも及ぶ。このスペクトロメータは、ロータの角速度と電界の一方または両方を同時に制御するコントローラを含むことができる。これらの制御を結びつけて、スペクトロメータのダイナミック・レンジをユーザが変更できるようにすることができることが好ましい。
本発明は、分離したバンドが時間経過とともに広がらないように、それらを(ポテンシャル井戸内に)集中させることにより、従来の電気泳動方式に対する優位性を有する。これにより、分解能が高くなるという利点が得られる。本発明の方法および装置は、いくつかの実施形態でダイナミック・レンジを変化させることができるだけでなく、スループットを高く、ダイナミック・レンジを大きくすることもできる。
複数のブレードをロータに形成した場合には、天然のSDS−page処理した複数のタンパク質試料を並行して分離して、従来の2Dタンパク質マップに代わるものを提供することができ、速度に関して、かなりの利点を有する。
本発明を利用して、何らかの比較的簡単な試料調製を用いて、DNAの配列決定および1つのヌクレオチドの多形性の分析を行うことができる。本発明の方法および装置では、従来の配列決定装置よりも長いDNA鎖を分解することができることもある。
本発明は、従来の細胞選別機に比べて動作が非常に速いので、細胞のソーティングにきわめて有効であるとも予想される。
いくつかの実施形態で、本発明は、関心のある特定のバンド(分離された細胞、タンパク質、DNAまたはその他の対象の)をさらに分析するために抽出する可能性も考慮に入れている。
ほとんどの実施形態では、分離対象は、遠心力と電界の組み合わさった影響下で、液体緩衝剤(例えば食塩水)の中を移動する。ただし、その他の実施形態で、分子その他の分離対象が気体緩衝剤の中を移動する、または真空キャビティ内を移動することも考えられる。
本発明は、DNAやRNA、タンパク質などの生体分子の選択、ソーティング、および適切ならそれらの配列決定のために使用されるだけでなく、生物細胞、気体または蒸気分子、ならびに微粒子などのその他様々な小さな対象の分離にも適用することができる。本発明は、明確なq/m値を有する任意の対象を選別するために使用することができる。
本発明は、複数の方法で実施することができる。以下、例として、添付の図面を参照しながら様々な具体的な実施形態について述べる。
図1は、本発明の第1の実施形態によるスペクトロメータのロータを示す概略図である。このロータは、周方向に垂直な側辺を有するいくつかのキャビティ即ちブレード12がその内部に切削形成された、剛性材料(鋼など)製の平坦な円形ディスクまたはプラットフォームからなる。図1には4枚のブレードが示してあるが、実際にはこれより多くても少なくてもよい。
各ブレードは、平らな内側縁部14から、ディスク10の外周付近に位置するブレード端部16まで径方向に延びる。ブレードの一辺は直線縁部18で画定され、他方の一辺は成形縁部20で画定される。キャビティ12の中に、直線縁部18と平行な垂直壁面があり、これがキャビティを2つの部分、すなわち細い分離チャネル24と緩衝剤(例えば食塩水)領域26とに分割している。この壁面の長手方向沿いのどこかに、小さな開口または隙間(図示せず)が形成されている。これにより分離チャネル24と緩衝剤領域26とが直通することができるので、使用中には、分離チャネル内にも緩衝剤が入ることになる。各緩衝剤領域26は、供給チャネル28によって中央ウェル30に結合される。ディスク10の上面および下面にUV透過カバー(図示せず)を接着し、これによりキャビティを密封している。これらのカバーは全体を透過性にすることもできるし、あるいは分離チャネル24の上下のみを透過性にすることによって径方向に延びる4本の細い読出しストリップを画定することもできる。必要に応じて、電気的絶縁を維持するために、キャビティの壁面を非導電性材料でコーティングすることもできる。
このロータを使用できるようにするには、上側カバーにあけた中央孔(図示せず)を通して導電性緩衝剤(例えば食塩水)を中央ウェル30に流し入れ、さらに供給チャネル28を介して緩衝剤領域26に流し込む。そこから、この溶液は前述の壁面の隙間を通って分離チャネル24を満たす。生体分子、細胞またはその他の分離対象を含む試料は、各分離チャネル24の内側端部にあるウェル32の中に配置される。上側カバーにあけた小さな孔(図示せず)から、これらのウェルに入れることができる。
分離プロセスを開始するには、角速度を制御しながらディスク10を中央スピンドル34の周りで高速回転させる。これと同時に、好ましくは内側縁部14に正電圧を印加してブレード端部16に負電圧を印加することにより、各ブレード内の緩衝溶液に対して径方向の電位差を与える。これを行うために、ブレード端部には電極(図示せず)が設けられ、内側端部14の表面は別の電極(図示せず)で被覆されている。
2つの分離力、すなわち遠心力F=mrωおよび電気力の影響により、分離対象はウェル32から分離チャネル24に沿って移動する。回転速度が不変であると仮定すると、遠心力はチャネルの長さ方向にrとともに変化するが、電気力は変化しない。縁部20の形状により、キャビティ内の電界は径方向距離に対して非線形に変化する。壁面22はキャビティ内の電界にほとんどあるいはまったく影響を及ぼさないので、分離チャネル24内の電界は緩衝剤領域26内の電界とほぼ同じである(すなわち、等電位線は壁面22を横切って延びる)。したがって、分離対象は、該対象がチャネル内を移動した距離に応じて非線形に変化する電界を受けることになり、距離と力の関係は、成形縁部20の詳細な形状によって決まることになる。ここで、壁面は、単に試料が緩衝剤領域26内に拡散するのを防ぎ、読出しを容易に行うことができる線形チャネル内に試料を密に閉じこめておくためのものであることを理解されたい。
印加電圧、回転速度および成形縁部20の形状に応じて、分子その他の分離対象はチャネルに沿って移動して、やがて外向きの遠心力が電界による内向きの力と正確に釣り合うポテンシャル井戸の底に到達する。以下でさらに詳細に示すが、特定の対象の平衡点は、その緩衝剤環境内での有効電荷質量比q/mによって決まる。したがって、試料は、それぞれが特有のq/m値を表すいくつかの異なるバンドに自動的に分離する。バンドの位置はポテンシャル井戸の最低点によって決まるので、バンド幅は平衡に達した後も不変であり、時間が経過しても実質的に拡散しない。
バンドの位置を読み出すために、読取りヘッド36を利用する。このヘッドは、ディスクを横切って径方向に移動できるように、可動ヘッド・ポジショナ38に取り付けられる。別法として、このヘッドを細長い形状にして、固定してもよい。ヘッドは、バンドの蛍光を検出するなど、分子に固有の、またはレーザその他の光源で引き起こすことができる、都合のよい任意の機構によりバンドの位置を読み取ることができる。しかしながら、ヘッドは、各バンドに固有のUV吸収を検出するように構成されたUV検出器からなることが好ましい。これは、UV透過性下側カバーと、試料と、UV透過性上側カバーとにUV光(図示せず)を照射した後で、ヘッド36で検出を行うことにより実施することができる。ヘッドが受光した光の量を測定することにより、試料が吸収したUVの量を決定することができる。
この照射は、ディスク前面にわたって均一に行うこともできるし、コンピュータによる制御の下で選択的に行うこともできる(例えば1つのバンドまたは1つのバンド群のみに照射する)。
次に図11を参照すると、図1に示すようなロータとともに使用するスペクトロメータ制御システムが例示してある。例えばマイクロコンピュータであるスペクトロメータ制御装置110は、ブレードの外側端部および内側端部にそれぞれ電圧を供給する第1および第2の電圧調整器112、114を制御する。制御装置110は、回転コントローラ116も制御する。回転コントローラ116は、ディスク10を回転させる可変速モータ118の回転速度を調節するものである。ヘッド36の読出し結果は制御装置110に送られ、これにより、測定されたバンド位置に応じて、必要なら回転速度および電圧を自動的にまたはユーザが調節することができる。スペクトロメータは、測定したバンド位置に関する情報を、例えばコンピュータ画面またはデータ取込み・記録システムからなる出力120に供給する。
電圧と、これと同時にディスクの回転速度とを手動または自動で変化させることにより、様々なq/m範囲にわたってバンド分解を行うことができるようにスペクトロメータを調整することができる。以下でさらに詳細に示すが、電圧および/または回転速度を適切に変化させることで、ユーザは、装置の精度(測定できるq/mの範囲の幅)だけでなく、その範囲の始点も調整することができる。換言すれば、スペクトロメータが反応するq/m「ウィンドウ」の大きさおよび位置は、両方とも変化させることができる。
関心のある特定のバンドがシステムによって検出されると、必要に応じて、電圧および/または回転速度を変化させて、自動制御下またはユーザ制御下で、ブレード端部16の付近の収集点またはチャネル40(図1)までそのバンドを移動させることができる。その後、さらなる調査のために、選択した試料のバンドを、その点から手動または自動で収集することができる。
上述のように、各ブレード内の電界の形状、したがって分離チャネルに沿った距離に応じた電界強度の変化は、ブレードの形状によって決まる。これは、図1に示すものと同じである必要はなく、そのときどきの用途に応じて、特に分子、細胞またはその他の分離対象の特性に基づいて選ぶことができる。ただし、好ましくは、電界の形成は、1より大きいrの累乗と共に電気力が変化するように行われる。
次に、この形状を決定するいくつかの考慮すべき事項について簡単に述べる。まず、平衡点においては、遠心力と電気力が釣り合っていなければならないことを想起されたい。回転軸から径方向距離rだけ離れた位置において質量mの分子にかかる遠心力は、以下の通りである。
Figure 2005512107
ロータのブレードの両端に印加される電界は、次のようになる。
Figure 2005512107
ここで、qは分子の見かけの電荷、kは電界の大きさを決定する正の係数、Cは電界の希釈係数、すなわち半径に対する二乗依存からの線形偏差の大きさを示す係数である。この定数は、適切な形状のロータ・ブレードを自由に作成するために有用である。二乗の項は標準値であり、rの項が何乗(≧1)でも同様に考慮することができることに留意されたい。
式(1)および(2)から、分子にかかる合計の力は以下の通りである。
Figure 2005512107
ここで、緩衝剤の浮力の影響は無視している。この因子は、遠心力に対抗する力である。合計の力は、質量m−mの分子にかかる遠心力に等しい。ここで、mは分子の質量、mは分離している1つの分子が押しのける緩衝剤の質量である。ここでは、一定密度の緩衝剤を想定している(実際には問題にならない)。
式(3)より、平衡状態では、以下のような関係が成り立つ。
Figure 2005512107
したがって、以下のようになる。
Figure 2005512107
負の解は平衡が不安定である状態に相当し、無視することができる。式(5)は、以下のように書き直すこともできる。
Figure 2005512107
これより、平衡状態が電荷と質量の比によって決まることが分かる。
式(2)により、以下のような電界を形成する。
Figure 2005512107
この電界は、r=0を基準点として、rにおける電位V(r)の関数として書き表すことができる。
Figure 2005512107
ここで、iはブレード内を流れる電流、Rは電気抵抗である。緩衝剤の抵抗率はρとする(例えば1×TBE緩衝剤での測定値は82Ωm以下)。
以下の分析では、成形壁20(図1)の形状を適当に選ぶことによって、所望の電界形状を実現する。ロータのブレードの長手方向に沿って適当に位置決めした電極を形成することによって、必要な電界を生成することもできる。
次のような式を書くことができる。
Figure 2005512107
ここで、w(r)はrにおけるブレードの幅、Dはブレードの奥行きである。式(7)、(8)および(9)より、以下のようにw(r)が導かれる。
Figure 2005512107
最大分離距離rにおいてw(r)=wとおき、最小半径rでw(r)=wとおく。式(10)より、以下のようになる。
Figure 2005512107
ブレード全体の抵抗は、以下のようになる。
Figure 2005512107
ブレードの両端間の電圧はV=iRであり、式(12)から以下のようになる。
Figure 2005512107
最後に、各値が上記のような場合に生じるポテンシャル井戸を算出することができ、以下のようになる。
Figure 2005512107
考えられる1つの構成は以下の通りである。
Figure 2005512107
Figure 2005512107
電流を除く上記表中のすべての数値は、ユーザによって選択される。電流は、式(13)およびオームの法則により算出する。
図4は、上記の構成パラメータの場合のロータの形状を示す図である。この例では、4枚のブレードがあり、そのそれぞれが幅1mm、長さ15mmの分離チャネルを有する。
図5は、この構成におけるこれらのブレードの1枚の正確な形状をさらに詳細に示す図である。
図6は、この構成における様々なポテンシャル井戸を半径の関数として示す図である(単位はジュール)。最も浅い曲線は、q/m値が10(SI単位系)である場合に相当し、最も深い曲線は10+15,000である場合に相当する。
図7は、所与のq/m範囲における平衡点の分布を示す図である。
次に、バンドの予想分解能について考える。言うまでもなく、これは温度によって決まる。簡潔にするために、この試料が気体と同様の振る舞いをし、熱エネルギーを以下のように表すことができるものと仮定する。
Figure 2005512107
ここで、Tは温度、kはボルツマン定数である。熱の移動により引き起こされるバンドの広がりを理解するための1つの方法は、ある分子が所与の熱エネルギーEで平衡点からどの程度離れることができるかを調べることである。これを算出するには、rが平衡点に相当し、Wが熱エネルギーに相当する、すなわちW=Eであるとして、式(14)をrについて解けばよい。図8は、試料温度を25℃、38℃、50℃とした場合の、様々なq/mの値に対するバンド幅の推定値を示す図である。25℃と50℃の間でほとんど差がないことが分かるであろう。
隣接するq/m値をどの程度分解できるかを推定するには、様々なq/mについてq/mとq/m+1400がどの程度離れているかを調べればよい。これを図9に示す。最後に、図10は、各バンドに分解するためにはそれらが互いに1バンド幅分離間していなければならないものと仮定して、1cmあたりいくつのバンドまで分解できるかを示す図である。
上記内容から、図4に示すブレード構成を使用し、パラメータも上記のものを使用すると、5〜10のph環境で蛋白質分子を分離するのに必要な電界を発生させることができると結論付けることができる。ポテンシャル井戸は、ブレードの全長のかなりの部分にわたってきわめて良好なバンド分解を達成できるほど深い。
ブレード縁部を成形することが、分離チャネルの長手方向に変化する電界を発生させる唯一の方法というわけではない。図2に別の実施形態を示す。図2では、図1と同様の部分は図1と同じ参照番号で示してある。
図2に示す実施形態では、ブレードの緩衝剤領域および成形縁部20の代わりに、分離チャネル24の一辺を画定する可変抵抗壁面50を用いている。径方向距離に応じて変化する壁面の抵抗の変化の仕方を変えることで、距離に応じて変化する電界の変化の仕方も変えることができる。
更に、別の実施形態を図3に概略的に示す。この実施形態では、分離するのは液体ではなく蒸気または気体であり、分離チャネルの代わりに密封真空チャンバ58を用いる。分析対象の気体試料は、回転軸に近い方のチャンバの一端にある試料導入手段62によってチャンバの容積60内に導入される。気体試料は、遠心力ならびに電界形成ワイヤ64によって生成される電界の影響を受けて、径方向軸66に沿って真空中を移動する。ワイヤ64の形状および配列は、電界が必要なかたちで径方向位置と共に変化するように選択される。液体の場合と同様に、気体または蒸気試料自体に固有のUV吸収も含めて、都合のよい任意の機構を読出しに使用することができる。
電界形成ワイヤを使用して(可変抵抗壁面50の代わりに)、図2の実施形態の段階的に変化する電界を形成することもできる。段階的に変化する電界は、ワイヤまたは電極を不均一な間隔で配置し、隣接する電極間の電位差はそれぞれ等しくすることにより、あるいはワイヤまたは電極を均一の間隔で配置し、それぞれの間の電位差を不均一にすることにより、発生させることができる。
ディスク10内にブレードおよび分離チャネルを切削またはその他の方法で形成することは簡便な方法であるが、言うまでもなく、その他にも数多くの作製方法が考えられ得る。例えば、各ブレードを別個に作製し、その後これらのブレードを、回転中の剛性を持たせるための共通の支持体に取り付けることもできる。ブレードの数は図示のものより多くすることも少なくすることもできる。このシステムは、この遠心装置の機械的強度によってのみ制約を受ける。
ロータは、標準的な(速度制御可能な)遠心装置内に収めるのに適したサイズおよび形状にすることができる。読取りヘッドを位置決めする機構は、従来のCDプレイヤーで用いられるものに類似したもの、またはまったく同じものでもよい。
径方向位置に応じて電界強度を変化させるだけでなく、分離チャネルを湾曲させることによって、分離チャネル24の長手方向に沿った有効遠心力も径方向位置に応じて(1乗以外の累乗まで)変化させることができる。湾曲したチャネルでは、チャネルに沿って試料を移動させようとする分解された遠心力は、径方向に対するチャネルの角度によって決まる。この角度を径方向距離に応じて変化させることにより、この分解された力も径方向距離に応じて(すなわちチャネルの距離に応じて)変化することになる。
調査する試料によっては、何らかの前処理を行うことが望ましいこともある。例えば、DNA断片を分離する際には、q/m値に確実に差が出るように、各断片に一定の大きな質量を付加することが望ましいこともある。試料中の各対象、例えば各タンパク質に一定の電荷(例えば+1)を印加することもできる。各対象の電荷が常に一定であれば、スペクトロメータは質量の直接読取りを与えることになる。
本発明の第1の実施形態によるスペクトロメータのロータを示す図である。 第2の実施形態によるその他のロータを示す図である。 第3の実施形態によるロータのキャビティを示す図である。 図1と同様のロータのその他の構成を示す図である。 図4のロータのブレードの1つの形状をさらに詳細に示す図である。 図4の構成に関して考えられるポテンシャル井戸を半径の関数として示す図である。 図4の構成における、所与のq/m範囲に対する平衡点の分布を示す図である。 異なる温度に対する、バンド幅のq/m依存性を示す図である。 隣り合うq/m値をどの程度まで分解できるかをq/mの関数として示す図である。 25℃の温度で、1センチメートルあたりいくつのバンドに分解できるかをq/mの関数として示す図である。 スペクトロメータの制御システムを概略的に示す図である。

Claims (25)

  1. 複数の対象を分離する方法であって、
    (a)前記対象を分離チャネル内に配置するステップと、
    (b)前記チャネルを回転させて、前記対象にかかる遠心力を発生させるステップと、
    (c)前記チャネルに沿って変化する電界を発生させるステップと、
    (d)前記遠心力および前記電界の組み合わさった影響下で、前記対象を前記チャネルに沿って移動させて分離するステップとを含む方法。
  2. 前記対象が生体分子である、請求項1に記載の方法。
  3. 前記対象がタンパク質である、請求項2に記載の方法。
  4. 前記対象がDNA断片またはRNA断片である、請求項2に記載の方法。
  5. 前記対象が生物細胞である、請求項1に記載の方法。
  6. 前記対象が気体分子または蒸気分子である、請求項1に記載の方法。
  7. 前記対象が、遠心力がそれに対抗する電界による力と等しくなるそれぞれの平衡点まで移動する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記チャネルが回転する角速度を変化させることによって前記対象の移動を制御するステップを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記チャネルの第1の端部および第2の端部にそれぞれ印加される第1の電圧および第2の電圧を制御することによって前記対象の移動を制御するステップを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
  10. さらなる調査のために対象を収集することができる収集点まで関心のある対象を移動させるために前記対象の移動を制御する、請求項8または9に記載の方法。
  11. (a)径方向に延びるブレードと、
    (b)使用中にブレードに沿って変化する電界を形成する電界形成手段とを含むスペクトロメータのロータであって、
    軸の周りに回転したときに、遠心力および電界の組み合わさった影響下でブレード内の対象が移動して分離される、スペクトロメータのロータ。
  12. 前記電界形成手段が、前記ブレードの第1の端部に第1の電圧を印加する第1の電極と、前記ブレードの径方向に離間した第2の端部に第2の電圧を印加する第2の電極とを含む、請求項11に記載のスペクトロメータのロータ。
  13. 前記ブレードの側壁が、該ブレードの長手方向に沿って変化する抵抗を有する、請求項12に記載のスペクトロメータのロータ。
  14. 前記ブレードの幅が、その長手方向に沿って変化する、請求項12に記載のスペクトロメータのロータ。
  15. 前記ブレードが、平行な側面を有する分離チャネルと、可変幅緩衝剤領域とを含み、前記分離チャネルが使用中に分離対象を受けるように配置される、請求項14に記載のスペクトロメータのロータ。
  16. 前記ブレードが、ディスク状ロータ本体のキャビティによって画定される、請求項11から15のいずれか一項に記載のスペクトロメータのロータ。
  17. 選択した分離済み対象をそこから収集することができる収集点をブレード上に含む、請求項11から16のいずれか一項に記載のスペクトロメータのロータ。
  18. 前記電界形成手段が、ブレード内に成形された電極を含むことを含む、請求項11に記載のスペクトロメータのロータ。
  19. 前記ブレードが、液体または気体の緩衝剤内で分離する対象を受けるように配置される、請求項11から18のいずれか一項に記載のスペクトロメータのロータ。
  20. 前記ブレードが真空キャビティを画定する、請求項11から18のいずれか一項に記載のスペクトロメータのロータ。
  21. モータと、ロータの角速度を制御するモータ制御装置とを組み合わせた、請求項11から20のいずれか一項に記載のスペクトロメータのロータを含むスペクトロメータ。
  22. 電界を生成して制御する手段を含む、請求項21に記載のスペクトロメータ。
  23. ロータの角速度および電界の両方を同時に制御するコントローラを含む、請求項22に記載のスペクトロメータ。
  24. 第1および第2の電極の両方にユーザが規定した電圧を印加する手段を含む、請求項12に従属する請求項22に記載のスペクトロメータ。
  25. 第1および第2の電圧とロータの角速度とを同時に制御するコントローラを含む、請求項24に記載のスペクトロメータ。
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