JP2005511539A - 有機塩素剤農薬に対する卵黄抗体を生産するための方法 - Google Patents

有機塩素剤農薬に対する卵黄抗体を生産するための方法 Download PDF

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Abstract

本発明は小分子有機塩素剤農薬に対する卵黄抗体を生産する方法に関連し、当該方法は、家禽鳥類の胸部筋肉において所望のハプテン−タンパク質接合体により周期的免疫化をすること及び当該抗体を5週間隔で卵黄から収穫することを含んで成る。

Description

発明の分野
本発明は、小分子有機塩素系農薬に対して結合する卵黄抗体の生産に関連する。本発明は、所望のハプテン−タンパク質接合体による家禽鳥類の胸部筋肉での周期的免疫化にも関連する。
発明の背景
有機塩素系農薬は、組織中に蓄積する殺虫剤の一般に大多数を占め、そしてそれらは非常に長い半減期を有するので分解することが難しい。
有機塩素系殺虫剤は作物の、穀物、果物、野菜、マメ科植物、綿、コーヒー及び茶、森林の処理、公衆衛生及びイエ蚊/マラリア抑制計画のために幅広く使用されている。
小有機分子の農薬などは、それら自身、免疫原性ではないが、タンパク質など適切な担体に対する化学接合後に免疫原性になりうる。接合と担体タンパク質の部位と性質は、生産される抗体の特異性と親和性に対して、当業者が十分には予測できないような態様で影響を及ぼす。例えば、DDA−GABA(ウシ血清アルブミンと結合した本発明中で使用されているハプテンに対して非常に関連のある化合物)の調製で、DDTと有用に反応する抗血清を生産する接合体は生産されなかった(Amitarani,B.E.,Akmal Pasha and Karanth N.G.K.(1998,データ未公開))。
近年、抗体(ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体)を生産する技術が開発されてきており、それにより非常に相同性が高く、非常に特異性の高い抗体が生産可能になる。一般に、ポリクローナル抗体は診断産業において非常に良く使用されている。最も共通して、それらは、ウサギ、マウス、ラット、ウマ及びヒツジなどの動物中で発生せしめられている。この形態の抗体生産法は、いくつかの不都合な点を有し、それは大型のホニュウ動物は維持するの支出がかさむことであり、しかも小型のホニュウ動物は抗体を少量しか生産しないことだ。加えて、動物から血液を周期的に引き出すことに対する要請がある(Deignanら、2000)。獲得されるIgG(抗体)の量は通常3〜8mg/ml血清である。この方法には、抗体を獲得するためにウサギを数回出血せしめることも伴い、何故なら、力価が2〜3回のブースト後第8〜10日目の間でのみ最高であるからだ。モノクローナル抗体は、動物をタンパク質で免疫化し、当該動物から抗体生産細胞を獲得し、そして当該抗体生産細胞とメラノーマ細胞の系統即ち、腫瘍細胞とを融合せしめ、モノクローンとして単離されて培養されるハイブリドーマを生産する、ことによって生産されている。モノクローナルハイブリドーマは、in vitroで培養されているかあるいは細胞、腹水流体もしくは腫瘍を含む宿主動物の血清いずれかに由来しうる。各抗体生産細胞は単一のユニーク抗体を生成するので、ハイブリドーマの各モノクローナル培養により同族抗体が生産される。ハイブリドーマクローンの全てではなくて、メラノーマ細胞と抗体生産細胞との融合によりもたらされるものが、所望の農薬(又はかかるクラスの分子の農薬特性を示す官能基)に対して特異的であり、何故なら、多くのハイブリドーマが抗体を生産するだろうし、そしてそれが接種された動物は外来物質との反応を引き起こしているからである。対象抗原に対する抗体がクローンごとに異なっていてさえも、抗体は様々な細胞によって生産されているので、同分子の様々な抗原決定基と反応しうる。従って、各クローンから生じる抗体を獲得し、そしてその対象農薬との反応性の試験を行い、そしてその特異性を、どのような有機塩素系農薬がそれを認識するか詳細に特定することによって、試験することが必要である。更に、所定の抗体又は抗血清機能のみを特異的免疫アッセイ形式又は構成において特定することも必要である。Polson及びLoshe、Uの米国特許第4,387,272号及び4,550,019号は、卵黄抗体の生産を主張し、そして免疫の受身伝達の多くの用途において使用されている。
Stolleらの米国特許第4,748,018号は、卵黄の経口摂取を繰り返すよってHEYに対する寛容性を予め高め、しかる後に、選定の細菌抗原に対するHEY抗体の腹腔内注射することを含んで成る細菌感染に対する受動免疫化の方法を開示している。
Tokoroらの米国特許第5,080,895号は、抗細菌雌鶏卵黄抗体の経口投与よる新生子豚の大腸菌(E.Coli)赤痢の予防法を開示している。
Hamada、S.、Infection and Immunity Vol.59(No.11):pp.4161〜4167(1991)及びOtake、S.、J.Dental Research Vol.70(No.3):pp.162〜166(1991)を参照にすれば、経口的にS.ミュータンス(S.mutans)に対する雌鶏卵黄抗体を経口的に投与する受動免疫化の手段によってラットを虫歯から保護するBeckの結果を再現している。
Bartz.Cら、Infectious Disease Vol.142(No.3):pp.439〜441(1980)を参照にすれば、免疫化された雌鶏の卵の水溶性断片を経口投与することによってマウスにおけるマウスロタウィルス感染症を予防している。
Yokoyama、H.ら、Infection and Immunity Vol.60(No.3):pp.998〜1007(1992)を参照にすれば、免疫化された雌鶏の卵に由来する粗製の卵黄免疫グロブリン断片を経口投与することによって腸管毒素原生大腸菌感染症から新生子豚を受動的に保護することに成功している。
Yolken、R.らの動物の研究、Pediatrics、Vol.81(No.2):pp.291〜295(1988);及びJournal Clint Immunol Vol.10(No.10):80S〜87S(1990)を参照にすれば、ヒトのロタウィルス感染症など腸管感染症の予防と治療のために抗ウィルス性HEY免疫グロブリンを経口投与することを提案している。免疫グロブリンの経口投与するための方法と処方は公知である(Hardieの米国特許第4,477,432号)。しかし、農薬など小分子に対する卵黄抗体の生産に関する報告はない。
発明の開示
本発明の主たる目的は、有機塩素系殺虫剤に対する、超免疫化雌鶏の卵黄に由来する抗体(HEY抗体)を提供することである。
本発明の他の目的は、一貫して多量の、回収及び保存が容易でありうる、高い力価及び特異的抗体の連続供給を供することである。
本発明の更なる目的は、非侵襲性故に動物を出血せしめる必要がない抗体を提供することである。
本発明の更なる他の目的は、ホニュウ動物を使用して生産されたポリクローナル抗体とモノクローナル抗体のどちらとも同じかあるいはそれ以上に感受性である抗体を提供することである。
発明の概要
本発明は、家禽鳥類を胸部筋肉において、所望のハプテン−タンパク質接合体により周期的免疫化することによって、小分子有機塩素系農薬に対して結合する卵黄抗体を生産する方法に関連する。抗体は卵黄から5週間隔の後に収穫されている。
発明の説明
従って、本発明は小分子有機塩素系農薬に対して結合する卵黄抗体を生産するための方法を供し、当該方法は:
(a)家禽鳥類から適切なものを選択し;
(b)前記家禽鳥類を既知の完全アジュバントで免疫し、当該アジュバントmlごとには熱殺菌し且つ乾燥させたマイコバクテリウム・チュベルクロシス(Mycobacterium tuberculosis)(H37Ra、ATCC25177)1mg、0.85mlのパラフィン及び0.15mlのマンニドモノオレエートを含んで成り;
(c)前記鳥類を胸部筋肉において、DDT−OHハプテン、オクタクロロサイクリックハプテン、2,4,5トリクロロフォキシ酢酸βアラニンからなる群から選択された接合体1000μgで免疫し;
(d)前記鳥類を再度、段階(c)で示したハプテン−タンパク質接合体、500μgの所望のハプテン接合体で免疫し;
(e)前記鳥類をハプテン−タンパク質接合体で2、3及び5週の間隔にて免疫せしめ;
(f)この後、前記鳥類を当該鳥類が卵を産む限り5週間隔でハプテン−タンパク質接合体で免疫し;
(g)前記鳥類の卵黄から抗体を収穫する、
段階を含んで成る。
本発明の実施態様は、所望のハプテン−タンパク質接合体がDDT、エンドスルファン及びHCHに対する結合特性を有する。
本発明の他の実施態様は、ハプテン−タンパク質接合体、即ち、DDTに対して結合するDDT−OHの生産であり、それは以下のとおり:
(a)2,2−ビス(4−クロロフェニル)−1,1,1−トリクロロエタノールを一晩、ピリジン中で過剰の無水コハク酸を使用し、スクシニル化してN−ヒドロキシスクシンイミドを獲得し;
(b)N−ヒドロキシスクシンイミド183.5mg、0.5mmolをジクロロメタン中、ジシクロヘキシルウレアとジメチルアミノピリジン触媒の存在下にて1:1:1:1.2(ハプテン:NHS:DCC:DMAP)の比で反応せしめ、N−ヒドロキシスクシンイミド活性エステルへと転換させ;そして
(c)ジシクロへキシルウレアを単離してジクロロメタンを蒸発せしめることによって、接合において使用するためのDDT−OHハプテンの活性エステルを獲得する、
ことである。
本発明の更なる他の実施態様は、ハプテン−タンパク質接合体、即ち、エンドスルファンに対して結合するオクタクロロサイクリックハプテンの生産であり、それは以下のとおり:
(a)約3.73gのヘプタクロルを0.1molの氷酢酸中で、加熱することによって溶かし;
(b)1.085gの次亜塩素酸Tert−ブチルを、0.1mmolの氷酢酸中に溶かし、そして段階(a)で獲得した第一溶液に加え;
(c)この混合物を水浴中1時間に渡り還流せしめ;
(d)ヘプタクロルのアセチルクロロ誘導体の微細結晶を分離し;
(e)前記結晶をアセトンで洗浄して空気で乾燥させ;
(f)結晶生成物を約3.02gの収量融点238℃で獲得し、1.09g;
(g)前記生成物を処理し、プレハプテン1,3,4,5,6,7,8,8−オクタクロロ−2−ヒドロキシ−4,7−メタノ−3a、及び4,7,7a−テトラヒドロインダンを獲得し;
(h)前記プレハプテンをジクロロメタン中、N−ヒドロキシスクシンイミドを加えることによって溶かしてこの混合物を0℃に冷却し;そして
(i)ジシクロへキシルカルボジイミド、その後ジメチルアミノピリジンを加え;
(j)この混合物を一晩撹拌し;そして
(k)ジクロロメタンをろ過してジクロロメタンを蒸発せしめエンドスルファンの活性エステルを獲得する、
ことである。
更に尚本発明の他の実施態様は、ヘキサクロロへキサンに対して結合する接合体、2,4,5−トリクロロフェノキシ酢酸β−アラニントリクロロベンゼン(TCB)ハプテンの生産であり、それは以下のとおり:
(a)5.95mlの塩化チオニル(950mmol)中、10mM、2.55gの2,4,5トリクロロフェノキシ酢酸を懸濁することによってβ−アラニンスペーサーアームを2,4,5トリクロロフェノキシ酢酸に対して加え;
(b)1時間に渡り還流し、そして反応しなかった塩化チオニルを蒸発によって除去し;
(c)この生成物をβ−アラニン9mmol、0.66gと7.4mlの1MのNaOH中0℃で撹拌し;
(d)前記生成物を16時間超に渡り室温で加温し;
(e)生成される酸を酸性化することによって単離し;
(f)酢酸エチル中へと分配し;
(g)水と塩水で洗浄し;
(h)2,4,5−トリクロロフェノキシ酢酸(2,4,5−T)を不純物として含有する粗製生成物のハプテンをある収量で得て;
(i)前記不純物をアセトン中に溶かしトリクロロベンゼン(TCB)ハプテンの無色のフレークを獲得し;
(j)前記無色TCBハプテンをろ過してアセトンで洗浄して空気中で乾燥させ;
(k)シリカゲルで予め被覆されたアルミニウムプレート及び溶離液としてクロロホルムとメタノール85:15の混合物を使用し、アセトン中2%のo−トルイジンを噴霧してUV光線/日光へ露すことによって検出されたTLC分析におけるRf値0.45の1つのスポットが、169〜70℃の融解範囲にて示され;
(l)融解範囲102〜104℃におけるハプテン2,4,5-T-βアラニンの活性エステルを、ジクロロメタン中に溶かすことによって合成し;
(m)N−ヒドロキシスクシンイミドを加え、そしてその混合物を氷浴中で冷却し;
(n)ジメチルスルホキシド(DMSO)を前記混合物に対しハプテンが溶ける迄滴下し;
(o)ジシクロへキシルカルボジイミドを前記混合物に対して加え、しかる後にジメチルアミノピリジン触媒を加え;
(p)前記混合物を一晩撹拌して温度を室温へと徐々に高め;
(q)ろ過してアセトンを蒸発せしめ;そして
(r)活性エステルを無色固体として分離する、
ことである。
本発明の更なる他の実施態様において、抗体の収穫は以下のとおり:
(a)卵黄(yolk)を破裂させずに卵黄(eggyolk)を獲得し;
(b)100mlのトリス緩衝液生理食塩水を卵黄10mlごとに加え;
(c)遠心によって沈殿物を除去し;
(d)この上清に対して、塩化マグネシウムとリンタングステン酸の沈殿化溶液を遠心のために加え;
(e)ペレットを捨て;
(f)前記上清に対して水溶性タンパク質画分12%ポリエチレングリコールを加え;
(g)10分に渡りインキュベートして再度遠心し;
(h)抗体を沈殿させ;
(i)沈殿を溶かすために10mlの10mMリン酸緩衝液を加え;
(j)抗体溶液を0℃に冷却し;
(k)10mlの予め冷却しておいたエタノールを加え;
(l)溶液を4℃で遠心して沈殿物を10mMのリン酸緩衝液中に溶かし;そして
(m)リン酸緩衝液に対する透析を4℃で24時間に渡り行い抗体の産物を獲得する、
ことで行われている。
本発明の更なる実施態様では、抗体の収穫は以下のとおり:
(a)卵黄を、卵黄膜を破裂させずに卵殻から獲得し;
(b)各10mlの卵黄ごとに、10mlの蒸留水を加え;
(c)約0.15%のκカラーギナンを加えて30分に渡り室温で撹拌し;
(d)溶液をろ過して15分に渡り遠心し;
(e)20mMのリン酸緩衝液pH8.0により調製したDEAE−セファセルカラムを通過させ;
(f)0.2Mのリン酸緩衝液pH8.0で溶出させ;
(g)溶出物を回収して280nmでの吸光度を読み;そして
(h)抗体を含有するピーク画分をプールして4℃で保存する、
ことでも行われうる。
本発明の更なる他の実施態様は、卵黄から脂質が、リンタングステン酸と塩化マグネシウムの沈殿化溶液を使用して2度沈殿され、そして遠心されて、上清から抗体が最大75%の収率で獲得されている。
本発明の更なる他の実施態様において、脂質の除去後に獲得された水溶性タンパク質画分のpHは、抗体を更に沈殿させ、80〜90%の収率で獲得するために、pH5.0に調整されている。
本発明の更なる他の実施態様は、抗体の収率が73%程度である。
本発明の更に他の実施態様において、超免疫卵(hyper immune egg)は毎日回収されており、そして更なる使用迄40℃で保存されている。
本発明の更に他の実施態様において、抗体の生産は免疫化の第7日目から始まりそして60日に渡り続く。
本発明の更なる実施態様では、生産された抗体の力価は165〜225mg/mlである。
本発明の更なる他の実施態様において、卵黄抗体の生産は、ホニュウ動物を使用して生産されたポリクローナル/モノクローナル抗体に対し、一層/同等の感受性である。
本発明の更に他の実施態様は、農薬の小分子に関連する卵黄抗体の生産である。
本発明の更に他の実施態様は、以下の:
a)(DDT−1,1’−(2,2,2−トリクロロエチレン)ビス(4−クロロベンゼン)、
b)HCH−1,2,3,4,5,6−ヘキサクロロへキサン、
c)エンドスルファン−6,7,8,9,10,10−ヘキサクロロ−1,5,5a,6,9,9a,ヘキサヒドロ−6,9−メタノ−2,3,4,−ベンゾジオキサチエピン−3−オキシド、
から選択された有機塩素系殺虫剤に対して結合する卵黄抗体の生産である。
以下の例は本発明を例示するために与えられており、従って本発明の範囲を限定するように解釈されるべきではない。
実施例
実施例−1
卵黄を卵殻から慎重に卵膜を破裂させることなく取り出した。前記膜に対して接着していたアルブミンを全体的に洗い流した。そして卵黄膜を破裂せしめ、そして漏斗を介して測定用シリンダーへと移した。卵黄各10mlに対して、トリス塩類緩衝溶液を100ml加えた。形成された沈殿を遠心によって除去した。この上清に対して、塩化マグネシウムとリンタングステン酸の沈殿化溶液を加えて再度遠心した。ペレットを捨て、そしてこの上清に対していわゆる水溶性タンパク質画分12%ポリエチレングリコールを加え、そして10分に渡りインキュベートして遠心した。抗体が沈殿する。10mlの10mMリン酸緩衝液を加えて沈殿を溶かした。次いで、この抗体溶液を0℃に冷却して10mlの予め冷却しておいたエタノールを加えた。この溶液を4℃で遠心して、沈殿物を10mMのリン酸緩衝液中に溶かしてリン酸緩衝液中4℃で24時間に渡り透析した。収率60%。
実施例−2
卵黄から脂質を、リンタングステン酸と塩化マグネシウムの沈殿化溶液を使用することで、上清から2度沈殿させて遠心した。収率−75%。
実施例−3
脂質を除去した後に獲得した水溶性タンパク質画分のpHを調べ、抗体を更に沈殿させるためにpH5.0に調整した。収率−80〜90%。
卵黄を卵殻から慎重に卵膜を破裂させることなく取り出した。前記膜に対して接着していたアルブミンを全体的に洗い流した。そして卵黄膜を破裂せしめ、そして漏斗を介して測定用シリンダーへと移した。卵黄各10mlに対して、蒸留水を10ml加えた。0.15%のκカラーギナンを加えて室温で30分に渡り撹拌した。次いで、この溶液をろ過して10,000gで15分に渡り遠心した。この上清溶液のpHを8.0に設定し、そして20mMのリン酸緩衝液pH8.0で調製されたDEAE−セファセルカラムを通過せしめた。抗体を0.2Mのリン酸緩衝液pH8.0で溶出させた。溶出物を回収して280nmでの吸光度を読んだ。抗体を含むピーク画分をプールして4℃で保存した。収率−73%。
これらの抗体の効率も本発明を通じて推定されている。
利点
本発明の主な利点は以下のとおりである。
(a)超免疫化雌鶏の卵黄に由来する抗体(HEY抗体)の免疫学的手段のための使用は、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体に伴う制限を解消する。何故なら本発明の方法は、一貫して多量の、高い力価特異的且つ感受性の、容易に回収及び保存できる抗体の連続供給を担うからである。
(b)アッセイの感度はウサギ抗体以上である。
(c)家禽鳥類を免疫する方法は非侵襲性であり且つ検体に対する親和性が良い。
ニワトリによって生産された抗体のウサギを超える利点は更に以下の表Iに供した表形式で説明している。
Figure 2005511539

Claims (15)

  1. 小分子有機塩素系農薬に対して結合する卵黄抗体を生産するための方法であって、当該方法は:
    (a)適切な家禽鳥類を選択し;
    (b)前記家禽鳥類を既知の完全アジュバントで免疫し、当該各アジュバントmlごとには熱殺菌し且つ乾燥させたマイコバクテリウム・チュベルクロシス(Mycobacterium tuberculosis)(H37Ra、ATCC25177)1mg、0.85mlのパラフィン及び0.15mlのマンニドモノオレエートを含んで成り;
    (c)前記鳥類を胸部筋肉において、DDT−OHハプテン、オクタクロロサイクリックハプテン、2,4,5トリクロロフォキシ酢酸βアラニンから選択された接合体1000μgで免疫し;
    (d)前記鳥類を再度、段階(c)で示したハプテン−タンパク質接合体、500μgの所望のハプテン接合体で免疫し;
    (e)前記鳥類をハプテン−タンパク質接合体で2、3及び5週の間隔にて免疫し;
    (f)この後、前記鳥類を当該鳥類が卵を産む限り5週間隔にてハプテン−タンパク質接合体で免疫せしめ;
    (g)前記鳥類の卵黄から抗体を収穫する、
    段階を含んで成る方法。
  2. 前記所望のハプテン−タンパク質接合体が、DDT、エンドスルファン及びヘキサクロロへキサンに対する結合特性を有する、請求項1に記載の方法。
  3. 請求項1の段階(c)において使用されているような、ハプテン−タンパク質接合体、即ち、DDTに対し結合するDDT−OHを生産する方法であって、
    (a)2,2−ビス(4−クロロフェニル)−1,1,1−トリクロロエタノールを一晩、ピリジン中で過剰の無水コハク酸を使用しスクシニル化してN−ヒドロキシスクシンイミドを獲得し;
    (b)N−ヒドロキシスクシンイミド183.5mg、0.5mmolをジクロロメタン中、ジシクロヘキシルウレアとジメチルアミノピリジン触媒の存在下1:1:1:1.2(ハプテン:NHS:DCC:DMAP)の比で反応せしめ、N−ヒドロキシスクシンイミド活性エステルへと転換させ;そして
    (c)ジシクロへキシルウレアを単離してジクロロメタンを蒸発せしめることによって、接合において使用するためのDDT−OHハプテンの活性エステルを獲得する、
    請求項1に記載の方法。
  4. 請求項1の段階(c)において使用されているような、ハプテン−タンパク質接合体、即ち、エンドスルファンに対して結合するオクタクロロサイクリックハプテンを生産する方法であって:
    (a)約3.73gのヘプタクロルを0.1molの氷酢酸中、加熱することによって溶かし;
    (b)1.085gの次亜塩素酸Tert−ブチルを0.1mmolの氷酢酸中に溶かし、そして段階(a)で獲得した第一溶液に加え;
    (c)この混合物を水浴中1時間に渡り還流せしめ;
    (d)ヘプタクロルのアセチルクロロ誘導体の微細結晶を分離し;
    (e)前記結晶をアセトンで洗浄して空気で乾燥させ;
    (f)結晶生成物を、約3.02gの収量、融点238℃で獲得し、1.09g;
    (g)前記生成物を処理しプレハプテン1,3,4,5,6,7,8,8−オクタクロロ−2−ヒドロキシ−4,7−メタノ−3a、及び4,7,7a−テトラヒドロインダンを獲得し;
    (h)前記プレハプテンをジクロロメタン中、N−ヒドロキシスクシンイミドを加えることによって溶かしてこの混合物を0℃に冷却し;
    (i)ジシクロへキシルカルボジイミド、その後ジメチルアミノピリジンを加え;
    (j)この混合物を一晩撹拌し;そして
    (k)ジクロロメタンをろ過してジクロロメタンを蒸発せしめエンドスルファンの活性エステルを獲得する、
    請求項1に記載の方法。
  5. 段階(c)のように、ヘキサクロロへキサンに対して結合する接合体ハプテン、2,4,5−トリクロロフェノキシ酢酸β−アラニン(TCB)ハプテンを生産する方法であって:
    (a)5.95mlの塩化チオニル(950mmol)中、10mM、2.55gの2,4,5トリクロロフェノキシ酢酸を懸濁することによってβ−アラニンスペーサーアームを2,4,5トリクロロフェノキシ酢酸に対して加え;
    (b)1時間に渡り還流し、そして反応しなかった塩化チオニルを蒸発によって除去し;
    (c)この生成物をβ−アラニン(9mmol、7.4mlの1MのNaOH中0.66g)と0℃で撹拌し;
    (d)前記生成物を16時間超に渡り室温で加温し;
    (e) 生成される酸を酸性化することによって単離し;
    (f)酢酸エチル中へと分配し;
    (g)水と塩水で洗浄し;
    (h)2,4,5−トリクロロフェノキシ酢酸(2,4,5−T)を不純物として含有する粗製生成物ハプテンをある収量で得て;
    (i)前記不純物をアセトン中に溶かしトリクロロベンゼン(TCB)ハプテンの無色のフレークを獲得し;
    (j)前記無色TCBハプテンをろ過してアセトンで洗浄して空気中で乾燥させ;
    (k)シリカゲルで予め被覆されたアルミニウムプレート及び溶離液としてクロロホルムとメタノール85:15の混合物を使用し、アセトン中2%のo−トルイジンを噴霧してUV光線/日光へ露らすことによって検出されたTLC分析におけるRf値0.45の単一のスポットが、融点169〜70℃の融解範囲にて示され;
    (l) 融解範囲102〜104℃におけるハプテン2,4,5-T-βアラニンの活性エステルを、ジクロロメタン中に溶かすことによって合成し;
    (m)N−ヒドロキシスクシンイミドを加えてこの混合物を氷浴中で冷却し;
    (n)ジメチルスルホキシド(DMSO)を前記混合物に対しハプテンが溶ける迄滴下し;
    (o)ジシクロへキシルカルボジイミドを前記混合物に対して加え、しかる後にジメチルアミノピリジン触媒を加え;
    (p)前記混合物を一晩撹拌して温度を室温へと徐々に高め;
    (q)ろ過してアセトンを蒸発せしめ;そして
    (r)活性エステルを無色固体として分離する、
    請求項1に記載の方法。
  6. 請求項1の段階(g)に記載の抗体を収穫する方法であって:
    (a)卵黄(yolk)を破裂せずに卵黄(eggyolk)を獲得し;
    (b)100mlのトリス緩衝液塩類溶液を卵黄10mlごとに加え;
    (c)遠心によって沈殿物を除去し;
    (d)上清に対して、塩化マグネシウムとリンタングステン酸の沈殿化溶液を遠心のために加え;
    (e)ペレットを捨て;
    (f)前記上清に対して水溶性タンパク質画分12%ポリエチレングリコールを加え;
    (g)10分に渡りインキュベートして再度遠心し;
    (h)抗体を沈殿させ;
    (i)沈殿を溶かすために10mlの10mMリン酸緩衝液を加え;
    (j)抗体溶液を0℃に冷却し;
    (k)10mlの予め冷却しておいたエタノールを加え;
    (l)溶液を4℃で遠心して沈殿物を10mMのリン酸緩衝液中に溶かし;そして
    (m)リン酸緩衝液に対する透析を4℃で24時間に渡り行い抗体の産物を獲得する、
    請求項1に記載の方法。
  7. 請求項1の段階(g)に記載の抗体を収穫する方法であって:
    (a)卵黄を、卵黄膜を破裂させることなく卵殻から獲得し;
    (b)各10mlの卵黄ごとに、10mlの蒸留水を加え;
    (c)約0.15%のκカラーギナンを加えて30分に渡り室温で撹拌し;
    (d)この溶液をろ過して15分に渡り遠心し;
    (e)20mMのリン酸緩衝液pH8.0により調製したDEAE−セファセルカラムを通過させ;
    (f)0.2Mのリン酸緩衝液pH8.0で溶出せしめ;
    (g)溶出物を回収して280nmでの吸光度を読み;そして
    (h)抗体を含有するピーク画分をプールして4℃で保存する、
    ことでも行うことができる、請求項1に記載の方法。
  8. 卵黄から脂質が、リンタングステン酸と塩化マグネシウムの沈殿化溶液を使用することで2度沈殿され、そして遠心され、上清から抗体を最大75%の収率で獲得する、請求項6に記載の方法。
  9. 脂質の除去後に獲得された水溶性タンパク質画分のpHは、抗体を更に沈殿させ、80〜90%の収率で獲得するために、pH5.0に調整されている、請求項6に記載の方法。
  10. 抗体の収率が73%程度である、請求項7に記載の方法。
  11. 超免疫卵(hyper immune egg)が毎日回収され、そして更なる使用迄40℃で保存されている、請求項1に記載の方法。
  12. 前記抗体の生産が免疫化後、第7日目に始まり、そして60日に渡り続く、請求項1に記載の方法。
  13. 生産された抗体の力価が165〜225mg/mlである、請求項1に記載の方法。
  14. 前記卵黄抗体の生産は、ホニュウ動物を使用して生産されたポリクローナル/モノクローナル抗体に対し、一層/同等の感受性である、請求項1に記載の方法。
  15. 前記卵黄抗体の生産が農薬の小分子に関連する、請求項1に記載の方法。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4550019A (en) * 1978-03-22 1985-10-29 South Africa Inventions Development Corporation Manufacture and use of fowl egg antibodies
WO1992012427A1 (en) * 1991-01-08 1992-07-23 United States Department Of Energy Monoclonal antibodies to cyclodiene insecticides and method for detecting the same
WO1993021949A1 (en) * 1992-04-23 1993-11-11 Vanderbilt University Immunological detection and quantification of 8-(cycloalkyl or aromatic) substituted-1,3-dipropylxanthines
US6069230A (en) * 1994-11-10 2000-05-30 Promega Corporation High level expression and facile purification of proteins, peptides and conjugates for immunization, purification and detection applications
DE19737453A1 (de) * 1997-08-25 1999-03-04 Biolog Chemisches I Hoppegarte Aviäre, vitelline, gegen pharmakologisch wirksame Substanzen gerichtete Antikörper

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2022501375A (ja) * 2018-09-20 2022-01-06 ウニベルシダージ デ アベイロUniversidade De Aveiro 卵黄から抗体を精製するプロセス、その製品及び使用

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