JP2005506037A - 脊髄および脳で発現される新規なヒトイオンチャンネルをコードする新規なヒト核酸分子およびポリペプチド - Google Patents

脊髄および脳で発現される新規なヒトイオンチャンネルをコードする新規なヒト核酸分子およびポリペプチド Download PDF

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Abstract

本発明は、新規なヒト陽イオンチャンネルをコードする新規なヒト核酸分子、およびそのような核酸分子によってコードされるタンパク質およびポリペプチドに関する。さらに詳細には、本発明の核酸分子は、脊髄および脳組織で発現され陽イオンチャンネルタンパク質のバニロイドおよびTRP(トランジエントレセプターポテンシャル)ファミリーとの配列ホモロジーおよび構造的ホモロジーを示すタンパク質またはポリペプチドをコードする新規なヒト遺伝子、たとえばhVR1d.1およびhVR1d.2を包含する。この新規なヒト陽イオンチャンネルに向けられた本発明のタンパク質およびポリペプチドは、カルシウム、ナトリウム、カリウムまたは他のイオンのホメオスタシス性機能障害が関与するヒトの疾患、たとえば、中枢神経系(CNS)の障害、たとえばアルツハイマー病やパーキンソン病などの変性神経障害、または他の障害、たとえば慢性の痛み、不安および抑うつ、卒中、心臓障害、たとえば不整脈、糖尿病、高カルシウム血症、低カルシウム血症、高カルシウム尿症、低カルシウム尿症、または免疫障害、胃腸(GI)管障害または腎臓または肝臓疾患に伴うイオン障害などの治療における薬剤の送達のための治療学的に価値のある標的である。

Description

【技術分野】
【0001】
本発明は、新規なヒトイオンチャンネルをコードする新規なヒト核酸分子、およびそのような核酸分子またはその縮重変異体によってコードされるタンパク質およびポリペプチドの単離および同定に関する。さらに詳しくは、本発明の核酸分子は、脊髄および脳組織で発現され、陽イオンチャンネルタンパク質のバニロイド(vanilloid)およびTRP(トランジエントレセプターポテンシャル(transient receptor potential))ファミリーに対して配列ホモロジーおよび構造上のホモロジーを示すタンパク質またはポリペプチドをコードする、hVR1dと称する新規なヒト遺伝子に関する。この新規なヒト陽イオンチャンネルに向けられた本発明のタンパク質およびポリペプチドは、カルシウム、ナトリウム、カリウムまたは他のイオンのホメオスタシス性機能障害が関与するヒトの疾患、たとえば、中枢神経系(CNS)の障害、たとえばアルツハイマー病やパーキンソン病などの変性神経障害、または他の障害、たとえば慢性の痛み、不安および抑うつ、卒中、心臓障害、たとえば不整脈、糖尿病、高カルシウム血症、低カルシウム血症、高カルシウム尿症、低カルシウム尿症、または免疫障害、胃腸(GI)管障害または腎臓または肝臓疾患に伴うイオン障害などの治療における薬剤の送達のための治療学的に価値のある標的である。
【背景技術】
【0002】
内部のイオン環境の制御は、生きている全ての細胞の極めて重要な機能である。外部環境とのイオンの交換は様々な手段によって制御されており、そのうち最も重要なのは種々の輸送体およびイオンチャンネルである。イオンチャンネルは非常に広範かつ多様なタンパク質のファミリーからなっており、細胞のホメオスタシス、ホルモンおよび神経伝達物質の放出、運動性、ニューロンの活動電位の生成および伝播および他の死活にかかわる細胞内および細胞間機能において重要な役割を果たしている。それゆえ、これらチャンネルは疾患の治療における治療的化合物の開発のための重要な標的である。
【0003】
バニロイドおよびTRPタンパク質ファミリーを含む多くのタンパク質が、イオンチャンネルを形成するとして記載されている。これらタンパク質は、様々な程度の選択性の陽イオンチャンネルとして、およびチャンネルの開閉(channel gating)について異なる(幾つかの場合には未知の)機構を有して機能することが示されている。たとえば、イオンチャンネルのTRPファミリーは、その幾つかが貯蔵−作動(store-operated)カルシウム(Ca2+)チャンネル、すなわちカルシウムの内部貯蔵が枯渇したときに細胞外のCa2+の細胞内への流入を可能とするように作動するイオンチャンネル、を形成すると思われる一群のタンパク質を含む(Zhuら、1996, Cell 85: 661-671)。TRPイオンチャンネルは、全てではないにしても殆どの動物組織で、ある形態で発現されると考えられている(Zhuら、上掲、661)。さらに、trp様またはtrp1と称する他のタンパク質が開示されており(Phillipsら、1992, Neuron 8: 631-642; Gilloら、1996, PNAS USA 93: 14146-14151)、またTRPタンパク質とTRPLタンパク質との間に協同的な相互作用が存在し、おそらくこれらタンパク質はチャンネルサブユニットとして貢献して多量体のCa2+チャンネルを形成することが示唆されている(Gilloら、上掲)。
【0004】
VR1またはバニロイドレセプターサブタイプ1としても知られるカプサイシン(capsaicin)レセプターはラットから単離されており、イオンチャンネルのTRPファミリーに構造的に関連するCa2+透過性の非選択的なイオンチャンネルとして特徴付けられている(Caterinaら、1997, Nature 389: 816-824)。ラットのVR1 cDNAは、838アミノ酸のタンパク質をコードする2,514ヌクレオチドのオープンリーディングフレームを含んでいる。ハイドロフォビシティー研究は、VR1が6つの膜貫通ドメインを含み、膜貫通領域5と6との間に短い疎水性のストレッチが存在し、これがイオン透過経路を表していることを示している。さらに、VR1は、該タンパク質のN末端に3つのアンキリンリピートドメインを含むことが開示されている(Caterinaら、上掲、820)。VR1はtrpタンパク質およびtrp1タンパク質と、トポロジー構成、複数のN末端アンキリンリピートの存在、および6つの膜貫通ドメインの内部および近傍でのアミノ酸配列ホモロジーにおいて近似していることが認められている(Caterinaら、上掲、820-821)。しかしながら、これらホモロジーの領域の外部ではVR1とTRP関連タンパク質との間に実際上、殆ど配列ホモロジーは存在しない。さらに、VR1はTRPタンパク質の幾つかがそうであるような貯蔵−作動Ca2+チャンネルではないこと、このタンパク質の発現は感覚ニューロンに限られていることが研究により示されている(Caterinaら、上掲、821および820の図6; Mezey, E.ら、2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 3655-3660)。
【0005】
ヒトVR1(当該技術分野では「hVR1」または「OTRPC1」としても知られる)は、PCT特許出願WO99/37675およびPCT特許出願WO00/29577に開示されており、これら特許出願は他のサブタイプであるヒトVR2(当該技術分野では「hVR2」、「VANILREP2」、「VRRP」、「VLR」または「OTRPC2」としても知られる)とともにヒトVR1のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を開示している。さらに、PCT特許出願WO99/37765は、VANILREP2およびその多型変異体のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を開示している。PCT出願WO99/37765に示されているVANILREP2タンパク質の配列は、PCT出願WO99/37675に示されているhVR2と本質的に同じであると思われる。同様にhVR2のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を開示する、PCT出願WO99/46377(EP953638A1に対応)、PCT出願WO00/22121およびGB特許出願2346882Aも参照のこと。
【0006】
陽イオンチャンネルのバニロイドファミリーの別の成員も同定されている。たとえば、SICと称するVR1のホモログがラットの腎臓から単離されている。このタンパク質は膜伸展不活化チャンネル(stretch-inactivating channel (SIC))として(すなわち、膜の伸展によって不活化される)、および腎臓および肝臓で主として発現されるものとして同定されている。SICはさらに、VR1と共通する同じ膜貫通および孔の配置を有するが、異なる電気生理学的特性を有すると記載されている(Suzukiら、March 1999, J. Biol. Chem. 274 (No.10): 6330-6335)。しかしながら、最近の報告は、SICがVR1と新たに同定されたVRサブタイプであるOTRPC4とのキメラであることを示している(たとえば、Strotmannら、October 2000, Nature Cell Biology 2: 695-702およびLiedtke W.ら、2000, Cell 103: 525-535)。さらに、バニロイドファミリーの成員間での構造的なホモロジーにも拘わらず、このファミリー内の各タンパク質は、たとえばコンダクタンスや種々のイオンに対する透過性において有意の差異を有することが当該技術分野において認められている(Suzukiら、上掲、6335)。
【0007】
バニロイドファミリーと比較的低い配列ホモロジー(<30%)を共有するものとして同定されている他の陽イオンチャンネルタンパク質はECaC(上皮カルシウムチャンネル)である。このタンパク質は最初、ウサギの腎細胞からクローニングされ、ウサギの近位小腸、腎臓および胎盤で発現されることがわかった。このタンパク質は、予測されるトポロジー構成および複数のNH末端アンキリンリピートの存在においてVR1およびTRPファミリーのレセプターと近似するものとして開示された。さらに、ECaC、VR1およびTRP関連タンパク質の間のアミノ酸配列ホモロジーが、イオン透過経路として予測される領域を含む6つの膜貫通セグメントの内部および近傍で認められた(Hoenderopら、March 1999, J. Biol. Chem. 274 (No. 13): 8375-8378)。しかしながら、これらの構造上および配列上のホモロジーにも拘わらず、6つの膜貫通セグメントの外部ではこれらのタンパク質間での配列ホモロジーは実際に低いものであり、「これらチャンネルの間での進化上の関連は遠いことを示唆している」(Hoenderopら、上掲、8377)。
【0008】
さらに最近、ECaCのヒトホモログであるhECaCが同定され、他のCa2+チャンネルと<30%の配列ホモロジーを有すること、腎臓、小腸および膵臓で高頻度に発現されることが開示されている(Mullerら、2000, Genomics 67: 48-53を参照)。
さらに他のCa2+輸送タンパク質であるCaT1がラットの十二指腸から同定されており、このタンパク質はECaC、VR1およびTRPイオンチャンネルと構造的に関連している。しかしながら、CaT1は、それぞれVR1およびTRPレセプターでは予測されるようなカプサイシンまたはカルシウム貯蔵の枯渇によっては刺激されず、それゆえCaT1はVR1またはTRPイオンチャンネルのサブタイプではないことが示唆されている(Pengら、August 1999, J. Biol. Chem. 274 (No. 32): 22739-22746)。さらに最近、CaT2と称するCaT1のホモログがラットで同定されている(Pengら、September 2000, J. Biol. Chem. 275 (36): 28186-28194)。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
最後に、上記に記載したタンパク質は明らかな構造上および配列上のホモロジーを有しているものの(Zhuら、上掲、668の図6D、Caterinaら、上掲、819の図5b、およびHoenderopら、8376の図1Bを比較せよ)、それにもかかわらず、これらタンパク質は組織発現、電気生理学的特性および機能の異なるパターンを示すのであり(たとえば、選択性と非選択性)、これらタンパク質が進化的な観点からは遠い関連を有するものの、特性および機能の有意に異なる多様な群のタンパク質であると当該技術分野で認められていることに注意すべきである(Suzukiら、上掲、6335; Hoenderopら、上掲、8377; およびCaterinaら、上掲、822)。この複雑なファミリーのタンパク質の様々な成員の概説のためには、Harteneckら、2000, Trends Neurosci. 23: 159-166を参照のこと。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明は、新規なヒトイオンチャンネルをコードする新規なヒト核酸分子、およびそのような核酸分子またはその縮重変異体によってコードされるタンパク質およびポリペプチドの単離および同定に関する。さらに詳しくは、本発明の核酸分子は、新規なヒト陽イオンチャンネルの生成または機能に関与するタンパク質またはポリペプチドをコードする、「hVR1d」と称する新規なヒト遺伝子に関する。本発明の新規なhVR1dタンパク質は、陽イオンチャンネルのTRPおよびバニロイドファミリーとある程度の配列ホモロジーおよび構造ホモロジーを示すが、異なる分布パターン、たとえば組織発現を有する別個のヒトチャンネルタンパク質を表すものである。本発明のhVR1dタンパク質は、脊髄および脳組織で高頻度に発現される。
【0011】
本発明の一つの態様に従い、新規なヒトhVR1dのcDNA配列およびそれに由来して発現されたタンパク質のアミノ酸配列が開示される。このcDNAは2つのスプライス形、hVR1d.1およびhVR1d.2にて単離されており、これらは該分子の3'末端の短いヌクレオチドセグメントの不在(hVR1d.1)または存在(hVR1d.2)において異なっている。これらhVR1d cDNAに対応するコードされたタンパク質は、イオンチャンネルのヒトバニロイドレセプターファミリーと中くらいのレベルのホモロジーを示す。
【0012】
本発明の構成は、核酸分子(本明細書では「核酸」とも称する)、たとえば新規なhVR1d.1およびhVR1d.2遺伝子産物をコードするhVR1d.1およびhVR1d.2核酸分子(組換えDNA分子、クローニングした遺伝子またはその縮重変異体、とりわけ天然に存在する変異体を含む)、およびそのような遺伝子産物に対する抗体またはその保存された変異体またはフラグメントを包含する。
【0013】
とりわけ、本発明の構成は、下記配列を含む核酸分子(本明細書において「hVR1d核酸分子または核酸」とも称する)を包含する:(a)図1Aおよび図1Bにそれぞれ示すヒトhVR1d.1およびhVR1d.2スプライス変異体、並びにそのアレル変異体およびホモログのヌクレオチド配列;(b)図2Aおよび図2Bにそれぞれ示すヒトhVR1d.1またはhVR1d.2遺伝子産物のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列;(c)機能的なドメインおよび個々のエクソンに対応するhVR1d.1またはhVR1d.2遺伝子産物の部分をコードするヌクレオチド配列;(d)ドメインの1つまたはそれ以上の全部または一部が欠失または変化した対応遺伝子産物の変異体をコードする、本明細書に記載の新規なhVR1d.1またはhVR1d.2核酸配列またはその一部を含むヌクレオチド配列;(e)異種ポリペプチドに融合した、hVR1d.1またはhVR1d.2遺伝子産物またはそのドメインの1つまたはそれ以上を含む融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列;(f)ヒトの疾患の診断または治療のために本発明の方法の一部として利用できる、hVR1d.1またはhVR1d.2遺伝子の内部のヌクレオチド配列、並びにこれら遺伝子にフランキングする染色体配列;および(g)上記配列に高度にストリンジェントな条件下または中くらいにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列。本発明の核酸は、hVR1d.1またはhVR1d.2遺伝子のcDNAおよびゲノムDNA分子を包含するが、これらに限られるものではない。
【0014】
本発明はまた、上記に記載した核酸分子の遺伝子産物、すなわち上記に記載したhVR1d核酸分子、たとえばhVR1d.1およびhVR1d.2核酸分子によってコードされ、組換え宿主系で発現されるタンパク質および/またはポリペプチドを包含する。好ましい態様において、本発明のhVR1dタンパク質は、図2A(配列番号2)および図2B(配列番号4)においてそれぞれ示されるアミノ酸配列によってコードされるタンパク質、または機能的に等価なその断片または誘導体を包含する。これらタンパク質は、当該技術分野で知られた組換え手段により、または化学合成法により製造することができる。
【0015】
本明細書に開示したhVR1d遺伝子および/または遺伝子産物のアンタゴニストおよびアゴニストも本発明に含まれる。そのようなアンタゴニストおよびアゴニストとしては、たとえば、本発明のhVR1d.1またはhVR1d.2タンパク質およびポリペプチドに対して向けられた小さな分子、大きな分子、および抗体が挙げられるであろう。本発明のアンタゴニストおよびアゴニストはまた、アンチセンスおよびリボザイム分子、および遺伝子または制御配列置換構築物などのヌクレオチド配列を含み、これらは開示したhVR1d核酸分子の発現を抑制または促進するのに用いることができる。
【0016】
本発明はさらに、本発明の核酸分子を含み該核酸分子を宿主生物で発現させるのに用いることのできるクローニングベクター(発現ベクターを含む)を包含する。本発明はまた、本発明の核酸分子を含みおよび/または発現させるべく遺伝子工学により作製した宿主細胞にも関する。さらに、これら核酸分子で形質転換した宿主生物、たとえばトランスジェニック動物、とりわけトランスジェニック非ヒト動物、特にトランスジェニック非ヒト哺乳動物も本発明に包含される。
【0017】
本発明はまた、陽イオン、たとえばCa2+、ナトリウムまたはカリウムチャンネル、他のイオンのホメオスタシスの機能不全または欠失が関与するヒトの疾患の診断方法および組成物にも関し、該疾患は、たとえば、中枢神経系(CNS)の障害、たとえばアルツハイマー病やパーキンソン病などの変性神経障害、または他の障害、たとえば慢性の痛み、不安および抑うつ、心臓障害、たとえば不整脈、または他の障害、たとえば糖尿病、高カルシウム血症、高カルシウム尿症、または免疫障害、胃腸(GI)管障害または腎臓または肝臓疾患に伴うイオン障害を含むが、これらに限られるものではない。そのような方法は、たとえば、患者試料中のhVR1d遺伝子の発現を測定するか、またはイオンチャンネルの機能不全を示すと思われる哺乳動物(ヒトを含む)のゲノムでの該遺伝子の変異を検出することを含む。本発明の核酸分子はまた、診断ハイブリダイゼーションプローブとしてまたは診断PCR分析のためのプライマーとして、hVR1d遺伝子変異、アレル変異、または制御欠損、たとえば該遺伝子の発現の欠陥を同定するのにも用いることができる。そのような診断PCR分析は、特定のhVR1d遺伝子変異、アレル変異、または制御欠損に関連する疾患を有する個体を診断するのに用いることができる。そのような診断PCR分析はまた、イオンチャンネル障害に罹りやすい個体を同定するのにも用いることができる。
【0018】
イオンチャンネル障害の治療の方法および組成物(医薬組成物を含む)もまた本発明に含まれる。そのような方法および組成物は、hVR1d、たとえばhVR1d.1またはhVR1d.2、の遺伝子発現および/または各遺伝子産物またはポリペプチドの活性レベルを変調することができる。そのような方法は、たとえば、ある種の他の遺伝子における欠損によって媒体される疾患の治療のためにhVR1d遺伝子の発現および/またはhVR1d遺伝子産物の活性を変調することを含む。
【0019】
そのような方法は、本発明の核酸の発現および/またはポリペプチドの活性を変調する化合物を同定するためのスクリーニング法、たとえば、hVR1d mRNAおよび/または遺伝子産物のレベルを測定するアッセイ、またはhVR1d活性、たとえば該遺伝子産物が細胞内へのCa2+の流入を可能とする能力のレベルを測定するアッセイをも包含する。
【0020】
たとえば、hVR1d遺伝子および/または遺伝子産物と相互作用する、たとえば該遺伝子の活性を変調するおよび/または該遺伝子産物に結合する、化合物を同定するのに用いることのできる細胞性および非細胞性のアッセイが知られている。そのような本発明の細胞ベースのアッセイでは、該遺伝子産物を発現する細胞、細胞株、または遺伝子操作した細胞または細胞株を利用する。
【0021】
一つの態様において、そのような方法は、hVR1d遺伝子を発現する細胞に化合物を接触させ、遺伝子発現、遺伝子産物の発現、または遺伝子産物の活性を測定し、ついでこのレベルを該化合物の不在下で該細胞により産生されたhVR1d遺伝子発現、遺伝子産物の発現、または遺伝子産物の活性のレベルと比較し、もしも該化合物の存在下で得られたレベルが該化合物の不在下で得られたレベルと異なっておれば、hVR1d遺伝子の発現および/または該遺伝子産物の合成または活性を変調する化合物が同定されるようにすることを含む。
【0022】
別の態様において、そのような方法は、宿主生物、たとえばhVR1dトランスジーンまたは変異hVR1dトランスジーンを発現するトランスジェニック動物に化合物を投与し、ついでhVR1d遺伝子の発現、遺伝子産物の発現、または遺伝子産物の活性を測定することを含む。この測定したレベルを、該化合物に暴露されていない宿主でのhVR1d遺伝子発現、遺伝子産物の発現、または遺伝子産物の活性のレベルと比較し、もしも宿主が該化合物に暴露されたときに得られるレベルが該宿主が該化合物に暴露されなかったときに得られるレベルと異なっておれば、hVR1d遺伝子の発現および/またはhVR1d遺伝子産物の合成または活性を変調する化合物が同定されることになる。
【0023】
これら方法によって同定される化合物は、イオンチャンネル障害、たとえば中枢神経系(CNS)の障害、たとえばアルツハイマー病やパーキンソン病などの変性神経障害、または他の障害、たとえば慢性の痛み、不安および抑うつ、心臓障害、たとえば不整脈、または他の障害、たとえば糖尿病、高カルシウム血症、高カルシウム尿症、または免疫障害、胃腸(GI)管障害または腎臓または肝臓疾患に伴うイオン障害の徴候を低減または除去する医薬化合物として用いることのできる治療用化合物を含む。
【0024】
本発明はまた、図2A(配列番号2)または図2B(配列番号4)に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列、または該配列の核酸の相補鎖を含む単離核酸にも関する。
本発明はまた、図1A(配列番号1)または図1B(配列番号3)に示す核酸配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができ、天然のhVR1dタンパク質の活性を有するhVR1dポリペプチドをコードする単離核酸にも関する。
【0025】
本発明はまた、図1A(配列番号1)に示す核酸配列を含む単離核酸にも関する。
本発明はまた、図1B(配列番号3)に示す核酸配列を含む単離核酸にも関する。
本発明はまた、図1A(配列番号1)または図1B(配列番号3)の単離核酸であって、該核酸がゲノム核酸またはcDNAであるものにも関する。
本発明はまた、図1A(配列番号1)または図1B(配列番号3)の単離核酸であって、該核酸がRNAであるものにも関する。
本発明はまた、図1A(配列番号1)または図1B(配列番号3)の単離核酸であって、該核酸がさらに標識を含むものにも関する。
【0026】
本発明はまた、hVR1dタンパク質またはポリペプチドをコードする本明細書に記載した核酸に異種タンパク質またはペプチドをコードする核酸配列がインフレームで連結してなる単離核酸にも関する。
本発明はまた、(a)hVR1d.1の欠失変異体をコードする核酸配列;(b)hVR1d.2の欠失変異体をコードする核酸配列;または(c)(a)または(b)の核酸配列の相補鎖をコードする核酸配列を含む核酸にも関する。
【0027】
本発明はさらに、配列番号1および/または配列番号3の単離核酸分子であって、ヌクレオチド配列がC末端かN末端のいずれかからの連続的なヌクレオチド欠失を含むものにも関する。
本発明はさらに、配列番号2および/または配列番号4の単離ポリペプチド分子であって、ポリペプチド配列がC末端かN末端のいずれかからの連続的なアミノ酸欠失を含むものにも関する。
【0028】
本発明はさらに、(a)hVR1d.1の付加変異体をコードする核酸配列;(b)hVR1d.2の付加変異体をコードする核酸配列;または(c)(a)または(b)の核酸配列の相補鎖をコードする核酸配列を含む核酸にも関する。
本発明はさらに、(a)hVR1d.1の置換変異体をコードする核酸配列;(b)hVR1d.2の置換変異体をコードする核酸配列;または(c)(a)または(b)の核酸配列の相補鎖をコードする核酸配列を含む核酸にも関する。
【0029】
本発明はさらに、本発明の核酸を含む組換えベクターに関する。
本発明はさらに、宿主細胞での本発明の核酸の発現を制御する転写および翻訳制御情報を含む制御ヌクレオチド配列に作動可能に連結した本発明の該配列を含む発現ベクターに関する。
本発明はさらに、宿主細胞での本発明の核酸の発現を制御する転写および翻訳制御情報を含む制御ヌクレオチド配列に作動可能に連結した本発明の該配列を含む発現ベクターに関する。
【0030】
本発明はさらに、本明細書に記載の発現ベクターおよびターゲティング手段を含む送達複合体に関する。
本発明はさらに、本発明の核酸を含む遺伝子操作した宿主細胞に関する。
本発明はさらに、宿主細胞での本明細書に記載の核酸配列の発現を制御する転写および翻訳制御情報を含む制御ヌクレオチド配列に作動可能に連結した本明細書に記載の該核酸を含む遺伝子操作した宿主細胞に関する。
本発明はさらに、宿主細胞での本明細書に記載の核酸配列の発現を制御する転写および翻訳制御情報を含む制御ヌクレオチド配列に作動可能に連結した本明細書に記載の該核酸を含む遺伝子操作した宿主細胞に関する。
【0031】
本発明はさらに、工程:(a)適当な培地で宿主細胞を培養してhVR1dポリペプチドを生成させ、ついで(b)該hVR1dポリペプチドを単離する、ことを含むhVR1dポリペプチドの製造方法に関する。
本発明はさらに、工程:(a)宿主細胞での本明細書に記載の核酸配列の発現を制御する転写および翻訳制御情報を含む制御ヌクレオチド配列に作動可能に連結した本明細書に記載の該核酸を含む遺伝子操作した宿主細胞を、適当な培地で培養してhVR1dポリペプチドを生成させ、ついで(b)該hVR1dポリペプチドを単離する、ことを含むhVR1dポリペプチドの製造方法に関する。
【0032】
本発明はさらに、hVR1dポリペプチドの製造方法であって、hVR1dポリペプチドがhVR1d.1またはhVR1d.2または機能的に等価なその誘導体である方法に関する。
本発明はさらに、hVR1dポリペプチドのエピトープに特異的に反応する抗体の製造方法に関する。
本発明はさらに、本発明の核酸を含むトランスジェニック動物の製造方法に関する。
【0033】
本発明はさらに、本発明の核酸によってコードされる実質的に純粋なポリペプチドに関する。
本発明はさらに、寄託クローンによって提供される核酸配列によってコードされる実質的に純粋なポリペプチドに関する。
本発明はさらに、図2A(配列番号2)または図2B(配列番号4)に示す実質的に純粋なヒトhVR1dポリペプチドに関する。
本発明はさらに、図2A(配列番号2)または図2B(配列番号4)に示すポリペプチドと少なくとも90%同一の実質的に純粋なポリペプチドに関する。
【0034】
本発明はさらに、本発明のポリペプチドおよび第二の異種ポリペプチドを含む融合タンパク質に関する。
本発明はさらに、治療学的有効量の本発明のポリペプチドおよび薬理学的に許容しうる担体を含む医薬製剤に関する。
【0035】
本発明はさらに、試料中の野生型または変異体hVR1d核酸分子の検出および/または定量のための試験キットであって、工程:該試料を本発明の核酸と接触させ、ついで野生型または変異体hVR1d核酸の存在または不在および/または量の指標として標識を検出および/または定量することを含む試験キットに関する。
【0036】
本発明はさらに、試料中の野生型または変異体hVR1dポリペプチドの検出および/または定量のための試験キットであって、工程:該試料を本発明の抗体と接触させ、ついで野生型または変異体hVR1d核酸の存在または不在および/または量の指標としてポリペプチド−抗体複合体を検出および/または定量することを含む試験キットに関する。
【0037】
本発明はさらに、hVR1d活性を変調する化合物の同定方法であって、(a)hVR1d遺伝子を発現する細胞に被験化合物を接触させ;(b)該細胞でのhVR1d遺伝子発現のレベルを測定し、ついで(c)(b)で得られたレベルを、該化合物の不在下で得られたhVR1d遺伝子発現と比較し、もしも(b)で得られたレベルが該化合物の不在下で得られたレベルと異なる場合には、hVR1d活性を変調する化合物が同定されることを含む方法に関する。
【0038】
本発明はさらに、hVR1d活性を変調する化合物の同定方法であって、(a)hVR1dポリペプチドを含む細胞に被験化合物を接触させ;(b)該細胞でのhVR1dポリペプチドまたは活性のレベルを測定し、ついで(c)(b)で得られたレベルを、該化合物の不在下で得られたhVR1dポリペプチドまたは活性と比較し、もしも(b)で得られたレベルが該化合物の不在下で得られたレベルと異なる場合には、hVR1d活性を変調する化合物が同定されることを含む方法に関する。
【0039】
本発明はさらに、イオンチャンネル関連障害を制御する化合物の同定方法であって、(a)本発明の核酸を発現する細胞に被験化合物を接触させ;ついで(b)該被験化合物がhVR1d活性を変調するか否かを決定することを含む方法に関する。
本発明はさらに、イオンチャンネル関連障害を制御する化合物の同定方法であって、(a)本発明の核酸に被験化合物を接触させ;ついで(b)該被験化合物が本発明の該核酸と相互作用するか否かを決定することを含む方法に関する。
【0040】
本発明はさらに、イオンチャンネル関連障害を制御する化合物の同定方法であって、(a)hVR1d制御配列に作動可能に連結したリポーター遺伝子を含む細胞または細胞溶解液に被験化合物を接触させ;ついで(b)該リポーター遺伝子産物の発現を検出することを含む方法に関する。
本発明はさらに、イオンチャンネル関連障害を制御する化合物の同定方法であって、(a)hVR1d転写物を含む細胞または細胞溶解液に被験化合物を接触させ;ついで(b)該hVR1d転写物の翻訳を検出することを含む方法に関する。
【0041】
本発明はさらに、患者においてイオンチャンネル関連障害を変調する方法であって、該患者に治療学的有効量のhVR1dポリペプチドを投与することを含む方法に関する。
本発明はさらに、患者においてイオンチャンネル関連障害を変調する方法であって、該hVR1dポリペプチドがhVR1d.1またはhVR1d.2、または機能的に等価なその誘導体であることを特徴とする方法に関する。
本発明はさらに、患者においてイオンチャンネル関連障害を変調する方法であって、該hVR1dポリペプチドがhVR1d.1またはhVR1d.2、または機能的に等価なその誘導体であり、該患者がヒトであることを特徴とする方法に関する。
【0042】
本発明はさらに、本発明の送達複合体の有効量を患者に投与することを含む、遺伝子療法の方法に関する。
本発明はさらに、hVR1dポリペプチドの活性を変調することを含む、イオンチャンネル関連障害の治療方法に関する。
本発明はさらに、hVR1dポリペプチドの活性を変調することを含み、該hVR1dポリペプチドがhVR1d.1またはhVR1d.2、または機能的に等価なその誘導体であることを特徴とする、イオンチャンネル関連障害の治療方法に関する。
【0043】
本発明はさらに、イオンチャンネル関連障害の治療方法であって、hVR1dポリペプチドの活性を変調することを含み、該hVR1dポリペプチドがhVR1d.1またはhVR1d.2、または機能的に等価なその誘導体であり、hVR1dポリペプチドの活性を増大するかまたは該活性と拮抗する化合物の有効量を投与することを含む方法に関する。
【0044】
本発明はさらに、hVR1d遺伝子の発現を低減させる化合物の有効量を投与することを含む、イオンチャンネル関連障害の治療方法に関する。
本発明はさらに、hVR1d遺伝子の発現を低減させる化合物の有効量を投与することを含み、該化合物が、hVR1d転写物をターゲティングし翻訳を抑制するアンチセンスまたはリボザイム分子をコードするオリゴヌクレオチドであることを特徴とする、イオンチャンネル関連障害の治療方法に関する。
【0045】
本発明はさらに、hVR1d遺伝子の発現を低減させる化合物の有効量を投与することを含み、該化合物が、hVR1d転写物をターゲティングし翻訳を抑制するアンチセンスまたはリボザイム分子をコードするオリゴヌクレオチドであり、該化合物が、hVR1d遺伝子のプロモーターと三重らせんを形成し転写を抑制することを特徴とする、イオンチャンネル関連障害の治療方法に関する。
【0046】
本発明はさらに、hVR1d遺伝子の発現を増大させる化合物の有効量を投与することを含む、イオンチャンネル関連障害の治療方法に関する。
本発明はさらに、薬理学的に許容しうる担体と混合した、hVR1d活性を活性化または抑制する化合物を含む、イオンチャンネル関連障害の治療のための医薬調合物に関する。
【0047】
本発明はさらに、hVR1dの生物学的活性を変調する化合物の同定方法であって、工程:(a)配列番号2または配列番号4の1つまたはそれ以上に示す配列を有するhVR1dと候補モデュレーター化合物とを混合し、ついでhVR1dの活性に対する候補モデュレーター化合物の作用を測定する、ことを含む方法に関する。
【0048】
本発明はさらに、イオンチャンネルの生物学的活性を変調する化合物の同定方法であって、工程:(a)配列番号2または配列番号4に示す配列を有するhVR1dを発現する宿主細胞と候補モデュレーター化合物とを混合し、ついで(b)発現されたhVR1dの活性に対する候補モデュレーター化合物の作用を測定する、ことを含む方法に関する。
【0049】
本発明はさらに、hVR1dの生物学的活性を変調する化合物の同定方法であって、工程:(a)本明細書に記載のベクターを有する宿主細胞と候補モデュレーター化合物とを混合し、その際、hVR1dが該細胞によって発現され、ついで(b)発現されたhVR1dの活性に対する候補モデュレーター化合物の作用を測定する、ことを含む方法に関する。
【0050】
本発明はさらに、hVR1dの生物学的活性を変調しうる化合物のスクリーニング方法であって、工程:(a)本明細書に記載の宿主細胞を用意し、(b)モデュレーター化合物の不在下でのhVR1dの生物学的活性を測定し、(c)該細胞を該モデュレーター化合物と接触させ、ついで(d)該モデュレーター化合物の存在下でのhVR1dの生物学的活性を決定し、その際、該モデュレーター化合物の存在下および該モデュレーター化合物の不在下でのhVR1dの活性の差異が該化合物の変調作用を示す、ことを含む方法に関する。
本発明はさらに、本明細書に記載の方法によって同定したヒトhVR1dの生物学的活性を変調する化合物に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【0051】
本発明は、新規なイオンチャンネルの形成または機能のための、新規な核酸分子並びに新規なタンパク質およびポリペプチドの単離および同定に関する。さらに詳しくは、本発明は、陽イオンチャンネルの形成または機能に関与する新規なヒト遺伝子hVR1dに関し、該遺伝子は2つの異なるスプライス変異体であるhVR1d.1およびhVR1d.2を含み、それぞれ対応するhVR1d.1およびhVR1d.2タンパク質および生物学的に活性なその誘導体または断片をコードする。hVR1dへの全ての言及は、特に明示的に断らない限りhVR1d.1およびhVR1d.2をも参照するものとする。
【0052】
本発明のhVR1d核酸分子は、単離した天然に存在する、または組換えにより製造した、ヒトhVR1d.1およびhVR1d.2核酸分子、たとえばDNA分子、クローニングした遺伝子またはその縮重変異体を含む。本発明の構成はまた、単離した天然に存在する、または組換えにより製造した、ヒトhVR1d.1およびhVR1d.2タンパク質またはポリペプチドをも包含する。
【0053】
さらに詳細には、本明細書に開示するのは本発明のhVR1d遺伝子の2つのスプライス変異体のDNA配列である。これら変異体は本明細書においてhVR1d.1およびhVR1d.2(図1Aおよび図1Bを参照)と称する。hVR1d.2のDNA配列は、hVR1d.1のDNA配列と比べて分子の3'末端に付加的な25塩基対を含んでいる。対応するhVR1d.1およびhVR1d.2タンパク質は、アミノ酸残基715までは同じアミノ酸配列であり、アミノ酸残基715でhVR1d.1は6つのアミノ酸C末端配列を含んでいるが、これはhVR1d.2タンパク質の31のアミノ酸C末端配列と異なっている(図2Aおよび図2Bを参照)。
【0054】
hVR1d.1(図2A)ポリペプチドの推定分子量は約81.3kDaと決定された。hVR1d.2(図2B)ポリペプチドの推定分子量は約84.3kDaと決定された。
hVR1d.1のコード領域に対応するポリヌクレオチドは、配列番号1のヌクレオチド1からヌクレオチド2160までである(図2A)。hVR1d.2のコード領域に対応するポリヌクレオチドは、配列番号1のヌクレオチド1からヌクレオチド2235までである(図2B)。
【0055】
好ましい態様において、本発明は、hVR1dの開始コドンを欠くポリヌクレオチド、それに加えてそれから得られるコードされたポリペプチドを包含する。詳細には、本発明は、配列番号1のヌクレオチド4から2160までに対応するポリヌクレオチド、および配列番号2のアミノ酸2から720までに対応するポリペプチドを包含する。該コード配列を含む組換えベクター、および該ベクターを含む宿主細胞もまた包含される。
【0056】
好ましい態様において、本発明は、hVR1d.2の開始コドンを欠くポリヌクレオチド、それに加えてそれから得られるコードされたポリペプチドを包含する。詳細には、本発明は、配列番号3のヌクレオチド4から2235までに対応するポリヌクレオチド、および配列番号4のアミノ酸2から745までに対応するポリペプチドを包含する。該コード配列を含む組換えベクター、および該ベクターを含む宿主細胞もまた包含される。
【0057】
図1に示すhVR1d cDNAに対応するタンパク質は、イオンチャンネルのヒトバニロイドレセプターファミリーと中くらいのレベルのホモロジーを示す、たとえば、報告されたVR1およびVR2およびOTRPC4タンパク質とは約41〜47%の同一性および49〜57%の類似性、および報告されたEcaCおよびCaT1およびCaT2タンパク質とは約30〜33%の同一性および41〜42%の類似性を示す。
【0058】
本発明のhVR1d cDNA配列およびコードされたタンパク質はまた、報告されたイオンチャンネルのバニロイドファミリーとその組織発現パターンが異なっている。たとえば、本発明のhVR1dタンパク質は、脳の脳梁(CC)、尾状核(CN)、および扁桃(A)などの脊髄および脳組織において高頻度に発現される。
本発明のhVR1dタンパク質は、該タンパク質のN末端セクションに複数のコンセンサスアンキリンドメイン(hVR1dの場合、3つのアンキリンドメイン)とともに6つの膜貫通ドメインを含むことが予測され、これはチャンネルのTRP−バニロイドファミリーの構造的な特徴である(図2Aおよび図2Bを参照)。
【0059】
詳細には、hVR1d.1ポリペプチドは、配列番号2(図2A)のアミノ酸約395からアミノ酸約415(TM1;配列番号9);アミノ酸約439からアミノ酸約463(TM2;配列番号10);アミノ酸約479からアミノ酸約499(TM3;配列番号11);アミノ酸約502からアミノ酸約520(TM4;配列番号12);アミノ酸約545からアミノ酸約564(TM5;配列番号13);および/またはアミノ酸約607からアミノ酸約625(TM6;配列番号14)に位置する6つの膜貫通ドメイン(TM1〜TM6)を含むことが予測された。この場合、「約」なる語は、上記で参照した膜貫通ドメインポリペプチドのN末端および/またはC末端を超えた1、2、3、4、5、6、7、8、9または10のアミノ酸を意味している。
【0060】
好ましい態様において、以下の膜貫通ドメインポリペプチドが本発明により包含される:MFFLSFCFYFFYNITLTLVSY(配列番号9)、LLGRMFVLIWAMCISVKEGIAIFLL(配列番号10)、FVFFIQAVLVILSVFLYLFAY(配列番号11)、YLACLVLAMALGWANMLYY(配列番号12)、FLFVYIAFLLGFGVALASLI(配列番号13)、および/またはILFLFLLITYVILTFVLLL(配列番号14)。これらポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも提供される。本発明はまた、本明細書に記載するように、これらhVR1d.1膜貫通ドメインポリペプチドの免疫原エピトープおよび/または抗原エピトープとしての使用をも包含する。
【0061】
本発明はまた、予測されたhVR1d.1の各膜貫通ドメイン間に介在しているポリペプチド配列をも包含する。これら領域はhVR1dかまたは細胞内のいずれかで溶媒接近可能なので(solvent accessible)、これら領域は各領域に特異的な抗体をデザインするのに特に有用である。そのような抗体はhVR1d完全長ポリペプチドのアンタゴニストまたはアゴニストとして有用であり、その活性を変調することができる。
【0062】
好ましい態様において、以下の膜貫通ドメイン間ポリペプチドが本発明により包含される:YRPREEEAIPHPLALTHKMGWLQ(配列番号15)、RPSDLQSILSDAWFH(配列番号16)、TRGFQSMGMYSVMIQKVILHDVLKFLFVYIAFLLGFGVAL(配列番号17)、および/またはEKCPKDNKDCSSYGSFSDAVLELFKLTIGLGDLNIQQNSKYP(配列番号18)。これらポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも提供される。本発明はまた、本明細書に記載するように、これらhVR1d.1膜貫通ドメイン間ポリペプチドの免疫原エピトープおよび/または抗原エピトープとしての使用をも包含する。
【0063】
詳細には、hVR1d.2ポリペプチドもまた、配列番号4(図2B)のアミノ酸約395からアミノ酸約415(TM1;配列番号9);アミノ酸約439からアミノ酸約463(TM2;配列番号10);アミノ酸約479からアミノ酸約499(TM3;配列番号11);アミノ酸約502からアミノ酸約520(TM4;配列番号12);アミノ酸約545からアミノ酸約564(TM5;配列番号13);および/またはアミノ酸約607からアミノ酸約625(TM6;配列番号14)に位置する6つの膜貫通ドメイン(TM1〜TM6)を含むことが予測された。この場合、「約」なる語は、上記で参照した膜貫通ドメインポリペプチドのN末端および/またはC末端を超えた1、2、3、4、5、6、7、8、9または10のアミノ酸を意味している。
【0064】
本発明は、本明細書に記載するように、図2Aおよび図2Bに示したアンキリンドメインおよび孔ループ領域に対応するポリペプチドの免疫原エピトープおよび/または抗原エピトープとしての使用を包含する。
タンパク質工学および組換えDNA法の知られた方法を用い、本発明のポリペプチドの特性を改善または改変した変異体を生成することができる。たとえば、生物学的な機能の実質的な喪失を伴うことなく該タンパク質のN末端またはC末端から1またはそれ以上のアミノ酸を欠失させることができる。Ronら、J. Biol. Chem. 268: 2984-2988 (1993)の著者は、3、8、または27のアミノ末端アミノ酸残基の欠失後でさえもヘパリン結合活性を有する変異体KGFタンパク質を報告している。同様に、インターフェロンガンマは、このタンパク質のカルボキシ末端から8〜10のアミノ酸残基を欠失した後に10倍までの一層高い活性を示した(Dobeliら、J. Biotechnology 7: 199-216 (1988))。
【0065】
さらに、変異体はしばしば天然タンパク質と同様の生物学的活性を保持していることを充分な証拠が示している。たとえば、Gayleおよび協同研究者(J. Biol. Chem. 268: 22105-22111 (1993))は、ヒトサイトカインIL−1aの広範な変異分析を行った。彼らはランダム突然変異誘発を用いて3,500を超える個々のIL−1a変異体を生成したが、これは該分子の全長にわたって変異体当たり平均2.5アミノ酸変化に対応するものであった。複数の変異を各可能なアミノ酸位置で調べた。研究者は、「該分子の大部分は(結合活性かまたは生物学的活性の)いずれかに殆ど影響を及ぼすことなく変えることができる」ことを見出した。実際、調べた3,500を超えるヌクレオチド配列のうち23の独特のアミノ酸配列だけが活性が野生型とは有意に異なるタンパク質を生成した。
【0066】
さらに、ポリペプチドのN末端またはC末端からの1またはそれ以上のアミノ酸の欠失が1またはそれ以上の生物学的機能の修飾または喪失という結果となったとしても、他の生物学的活性は依然として保持されている。たとえば、該タンパク質を認識する抗体を誘発および/または結合する欠失変異体の能力は、N末端またはC末端から該タンパク質の大部分を超えない残基が除去されたときに保持されている可能性が高いであろう。タンパク質のN末端またはC末端残基を欠失した特定のポリペプチドがそのような免疫原活性を保持しているか否かは、本明細書に記載した常法および当該技術分野で知られた他の方法により容易に決定することができる。
【0067】
あるいは、本発明のポリペプチドのそのようなN末端またはC末端欠失は、実際、該ポリペプチドの生物学的活性の1またはそれ以上の有意の増大という結果となるかもしれない。たとえば、多くのポリペプチドの生物学的活性は、いずれかまたは両方の末端の制御ドメインの存在によって支配されている。そのような制御ドメインは、活性化事象(たとえば、同族リガンドまたはレセプターへの結合、リン酸化、タンパク質加水分解的プロセシングなど)の代わりにそのようなポリペプチドの生物学的活性を有効に抑制する。それゆえ、ポリペプチドの制御ドメインを除去することにより、該ポリペプチドは活性化事象の不在下で有効に生物学的に活性にすることができる。
【0068】
好ましい態様において、以下のN末端hVR1d.1欠失ポリペプチドが本発明により包含される:配列番号2のM1-R720、S2-R720、F3-R720、I4-R720、C5-R720、R6-R720、P7-R720、R8-R720、G9-R720、G10-R720、G11-R720、R12-R720、L13-R720、E14-R720、T15-R720、D16-R720、S17-R720、R18-R720、V19-R720、A20-R720、A21-R720、G22-R720、G23-R720、W24-R720、T25-R720、A26-R720、G27-R720、S28-R720、H29-R720、T30-R720、V31-R720、G32-R720、K33-R720、E34-R720、Q35-R720、K36-R720、A37-R720、S38-R720、D39-R720、T40-R720、S41-R720、P42-R720、M43-R720、G44-R720、H45-R720、R46-R720、E47-R720、Q48-R720、G49-R720、A50-R720、S51-R720、I52-R720、G53-R720、D54-R720、G55-R720、G56-R720、E57-R720、T58-R720、A59-R720、G60-R720、E61-R720、G62-R720、G63-R720、E64-R720、R65-R720、P66-R720、S67-R720、V68-R720、R69-R720、S70-R720、G71-R720、S72-R720、G73-R720、D74-R720、V75-R720、E76-R720、Q77-R720、G78-R720、L79-R720、G80-R720、V81-R720、C82-R720、G83-R720、C84-R720、S85-R720、N86-R720、H87-R720、T88-R720、L89-R720、W90-R720、A91-R720、G92-R720、R93-R720、A94-R720、K95-R720、G96-R720、S97-R720、R98-R720、G99-R720、P100-R720、P101-R720、V102-R720、T103-R720、P104-R720、P105-R720、M106-R720、A107-R720、L108-R720、P109-R720、A110-R720、D111-R720、F112-R720、L113-R720、M114-R720、H115-R720、K116-R720、L117-R720、T118-R720、A119-R720、S120-R720、D121-R720、T122-R720、G123-R720、K124-R720、T125-R720、C126-R720、L127-R720、M128-R720、K129-R720、A130-R720、L131-R720、L132-R720、N133-R720、I134-R720、N135-R720、P136-R720、N137-R720、T138-R720、K139-R720、E140-R720、I141-R720、V142-R720、R143-R720、I144-R720、L145-R720、L146-R720、A147-R720、F148-R720、A149-R720、E150-R720、E151-R720、N152-R720、D153-R720、I154-R720、L155-R720、G156-R720、R157-R720、F158-R720、I159-R720、N160-R720、A161-R720、E162-R720、Y163-R720、T164-R720、E165-R720、E166-R720、A167-R720、Y168-R720、E169-R720、G170-R720、Q171-R720、T172-R720、A173-R720、L174-R720、N175-R720、I176-R720、A177-R720、I178-R720、E179-R720、R180-R720、R181-R720、Q182-R720、G183-R720、D184-R720、I185-R720、A186-R720、A187-R720、L188-R720、L189-R720、I190-R720、A191-R720、A192-R720、G193-R720、A194-R720、D195-R720、V196-R720、N197-R720、A198-R720、H199-R720、A200-R720、K201-R720、G202-R720、A203-R720、F204-R720、F205-R720、N206-R720、P207-R720、K208-R720、Y209-R720、Q210-R720、H211-R720、E212-R720、G213-R720、F214-R720、Y215-R720、F216-R720、G217-R720、E218-R720、T219-R720、P220-R720、L221-R720、A222-R720、L223-R720、A224-R720、A225-R720、C226-R720、T227-R720、N228-R720、Q229-R720、P230-R720、E231-R720、I232-R720、V233-R720、Q234-R720、L235-R720、L236-R720、M237-R720、E238-R720、H239-R720、E240-R720、Q241-R720、T242-R720、D243-R720、I244-R720、T245-R720、S246-R720、R247-R720、D248-R720、S249-R720、R250-R720、G251-R720、N252-R720、N253-R720、I254-R720、L255-R720、H256-R720、A257-R720、L258-R720、V259-R720、T260-R720、V261-R720、A262-R720、E263-R720、D264-R720、F265-R720、K266-R720、T267-R720、Q268-R720、N269-R720、D270-R720、F271-R720、V272-R720、K273-R720、R274-R720、M275-R720、Y276-R720、D277-R720、M278-R720、I279-R720、L280-R720、L281-R720、R282-R720、S283-R720、G284-R720、N285-R720、W286-R720、E287-R720、L288-R720、E289-R720、T290-R720、T291-R720、R292-R720、N293-R720、N294-R720、D295-R720、G296-R720、L297-R720、T298-R720、P299-R720、L300-R720、Q301-R720、L302-R720、A303-R720、A304-R720、K305-R720、M306-R720、G307-R720、K308-R720、A309-R720、E310-R720、I311-R720、L312-R720、K313-R720、Y314-R720、I315-R720、L316-R720、S317-R720、R318-R720、E319-R720、I320-R720、K321-R720、E322-R720、K323-R720、R324-R720、L325-R720、R326-R720、S327-R720、L328-R720、S329-R720、R330-R720、K331-R720、F332-R720、T333-R720、D334-R720、W335-R720、A336-R720、Y337-R720、G338-R720、P339-R720、V340-R720、S341-R720、S342-R720、S343-R720、L344-R720、Y345-R720、D346-R720、L347-R720、T348-R720、N349-R720、V350-R720、D351-R720、T352-R720、T353-R720、T354-R720、D355-R720、N356-R720、S357-R720、V358-R720、L359-R720、E360-R720、I361-R720、T362-R720、V363-R720、Y364-R720、N365-R720、T366-R720、N367-R720、I368-R720、D369-R720、N370-R720、R371-R720、H372-R720、E373-R720、M374-R720、L375-R720、T376-R720、L377-R720、E378-R720、P379-R720、L380-R720、H381-R720、T382-R720、L383-R720、L384-R720、H385-R720、M386-R720、K387-R720、W388-R720、K389-R720、K390-R720、F391-R720、A392-R720、K393-R720、H394-R720、M395-R720、F396-R720、F397-R720、L398-R720、S399-R720、F400-R720、C401-R720、F402-R720、Y403-R720、F404-R720、F405-R720、Y406-R720、N407-R720、I408-R720、T409-R720、L410-R720、T411-R720、L412-R720、V413-R720、S414-R720、Y415-R720、Y416-R720、R417-R720、P418-R720、R419-R720、E420-R720、E421-R720、E422-R720、A423-R720、I424-R720、P425-R720、H426-R720、P427-R720、L428-R720、A429-R720、L430-R720、T431-R720、H432-R720、K433-R720、M434-R720、G435-R720、W436-R720、L437-R720、Q438-R720、L439-R720、L440-R720、G441-R720、R442-R720、M443-R720、F444-R720、V445-R720、L446-R720、I447-R720、W448-R720、A449-R720、M450-R720、C451-R720、I452-R720、S453-R720、V454-R720、K455-R720、E456-R720、G457-R720、I458-R720、A459-R720、I460-R720、F461-R720、L462-R720、L463-R720、R464-R720、P465-R720、S466-R720、D467-R720、L468-R720、Q469-R720、S470-R720、I471-R720、L472-R720、S473-R720、D474-R720、A475-R720、W476-R720、F477-R720、H478-R720、F479-R720、V480-R720、F481-R720、F482-R720、I483-R720、Q484-R720、A485-R720、V486-R720、L487-R720、V488-R720、I489-R720、L490-R720、S491-R720、V492-R720、F493-R720、L494-R720、Y495-R720、L496-R720、F497-R720、A498-R720、Y499-R720、K500-R720、E501-R720、Y502-R720、L503-R720、A504-R720、C505-R720、L506-R720、V507-R720、L508-R720、A509-R720、M510-R720、A511-R720、L512-R720、G513-R720、W514-R720、A515-R720、N516-R720、M517-R720、L518-R720、Y519-R720、Y520-R720、T521-R720、R522-R720、G523-R720、F524-R720、Q525-R720、S526-R720、M527-R720、G528-R720、M529-R720、Y530-R720、S531-R720、V532-R720、M533-R720、I534-R720、Q535-R720、K536-R720、V537-R720、I538-R720、L539-R720、H540-R720、D541-R720、V542-R720、L543-R720、K544-R720、F545-R720、L546-R720、F547-R720、V548-R720、Y549-R720、I550-R720、A551-R720、F552-R720、L553-R720、L554-R720、G555-R720、F556-R720、G557-R720、V558-R720、A559-R720、L560-R720、A561-R720、S562-R720、L563-R720、I564-R720、E565-R720、K566-R720、C567-R720、P568-R720、K569-R720、D570-R720、N571-R720、K572-R720、D573-R720、C574-R720、S575-R720、S576-R720、Y577-R720、G578-R720、S579-R720、F580-R720、S581-R720、D582-R720、A583-R720、V584-R720、L585-R720、E586-R720、L587-R720、F588-R720、K589-R720、L590-R720、T591-R720、I592-R720、G593-R720、L594-R720、G595-R720、D596-R720、L597-R720、N598-R720、I599-R720、Q600-R720、Q601-R720、N602-R720、S603-R720、K604-R720、Y605-R720、P606-R720、I607-R720、L608-R720、F609-R720、L610-R720、F611-R720、L612-R720、L613-R720、I614-R720、T615-R720、Y616-R720、V617-R720、I618-R720、L619-R720、T620-R720、F621-R720、V622-R720、L623-R720、L624-R720、L625-R720、N626-R720、M627-R720、L628-R720、I629-R720、A630-R720、L631-R720、M632-R720、G633-R720、E634-R720、T635-R720、V636-R720、E637-R720、N638-R720、V639-R720、S640-R720、K641-R720、E642-R720、S643-R720、E644-R720、R645-R720、I646-R720、W647-R720、R648-R720、L649-R720、Q650-R720、R651-R720、A652-R720、R653-R720、T654-R720、I655-R720、L656-R720、E657-R720、F658-R720、E659-R720、K660-R720、M661-R720、L662-R720、P663-R720、E664-R720、W665-R720、L666-R720、R667-R720、S668-R720、R669-R720、F670-R720、R671-R720、M672-R720、G673-R720、E674-R720、L675-R720、C676-R720、K677-R720、V678-R720、A679-R720、E680-R720、D681-R720、D682-R720、F683-R720、R684-R720、L685-R720、C686-R720、L687-R720、R688-R720、I689-R720、N690-R720、E691-R720、V692-R720、K693-R720、W694-R720、T695-R720、E696-R720、W697-R720、K698-R720、T699-R720、H700-R720、V701-R720、S702-R720、F703-R720、L704-R720、N705-R720、E706-R720、D707-R720、P708-R720、G709-R720、P710-R720、V711-R720、R712-R720、R713-R720、および/またはT714-R720。これらポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた提供される。本発明はまた、本明細書に記載するように、これらN末端hVR1d.1欠失ポリペプチドの免疫原エピトープおよび/または抗原エピトープとしての使用をも包含する。
【0069】
好ましい態様において、以下のC末端hVR1d.1欠失ポリペプチドが本発明により包含される:配列番号2のM1-R720、M1-V719、M1-A718、M1-V717、M1-T716、M1-G715、M1-T714、M1-R713、M1-R712、M1-V711、M1-P710、M1-G709、M1-P708、M1-D707、M1-E706、M1-N705、M1-L704、M1-F703、M1-S702、M1-V701、M1-H700、M1-T699、M1-K698、M1-W697、M1-E696、M1-T695、M1-W694、M1-K693、M1-V692、M1-E691、M1-N690、M1-I689、M1-R688、M1-L687、M1-C686、M1-L685、M1-R684、M1-F683、M1-D682、M1-D681、M1-E680、M1-A679、M1-V678、M1-K677、M1-C676、M1-L675、M1-E674、M1-G673、M1-M672、M1-R671、M1-F670、M1-R669、M1-S668、M1-R667、M1-L666、M1-W665、M1-E664、M1-P663、M1-L662、M1-M661、M1-K660、M1-E659、M1-F658、M1-E657、M1-L656、M1-I655、M1-T654、M1-R653、M1-A652、M1-R651、M1-Q650、M1-L649、M1-R648、M1-W647、M1-I646、M1-R645、M1-E644、M1-S643、M1-E642、M1-K641、M1-S640、M1-V639、M1-N638、M1-E637、M1-V636、M1-T635、M1-E634、M1-G633、M1-M632、M1-L631、M1-A630、M1-I629、M1-L628、M1-M627、M1-N626、M1-L625、M1-L624、M1-L623、M1-V622、M1-F621、M1-T620、M1-L619、M1-I618、M1-V617、M1-Y616、M1-T615、M1-I614、M1-L613、M1-L612、M1-F611、M1-L610、M1-F609、M1-L608、M1-I607、M1-P606、M1-Y605、M1-K604、M1-S603、M1-N602、M1-Q601、M1-Q600、M1-I599、M1-N598、M1-L597、M1-D596、M1-G595、M1-L594、M1-G593、M1-I592、M1-T591、M1-L590、M1-K589、M1-F588、M1-L587、M1-E586、M1-L585、M1-V584、M1-A583、M1-D582、M1-S581、M1-F580、M1-S579、M1-G578、M1-Y577、M1-S576、M1-S575、M1-C574、M1-D573、M1-K572、M1-N571、M1-D570、M1-K569、M1-P568、M1-C567、M1-K566、M1-E565、M1-I564、M1-L563、M1-S562、M1-A561、M1-L560、M1-A559、M1-V558、M1-G557、M1-F556、M1-G555、M1-L554、M1-L553、M1-F552、M1-A551、M1-I550、M1-Y549、M1-V548、M1-F547、M1-L546、M1-F545、M1-K544、M1-L543、M1-V542、M1-D541、M1-H540、M1-L539、M1-I538、M1-V537、M1-K536、M1-Q535、M1-I534、M1-M533、M1-V532、M1-S531、M1-Y530、M1-M529、M1-G528、M1-M527、M1-S526、M1-Q525、M1-F524、M1-G523、M1-R522、M1-T521、M1-Y520、M1-Y519、M1-L518、M1-M517、M1-N516、M1-A515、M1-W514、M1-G513、M1-L512、M1-A511、M1-M510、M1-A509、M1-L508、M1-V507、M1-L506、M1-C505、M1-A504、M1-L503、M1-Y502、M1-E501、M1-K500、M1-Y499、M1-A498、M1-F497、M1-L496、M1-Y495、M1-L494、M1-F493、M1-V492、M1-S491、M1-L490、M1-I489、M1-V488、M1-L487、M1-V486、M1-A485、M1-Q484、M1-I483、M1-F482、M1-F481、M1-V480、M1-F479、M1-H478、M1-F477、M1-W476、M1-A475、M1-D474、M1-S473、M1-L472、M1-I471、M1-S470、M1-Q469、M1-L468、M1-D467、M1-S466、M1-P465、M1-R464、M1-L463、M1-L462、M1-F461、M1-I460、M1-A459、M1-I458、M1-G457、M1-E456、M1-K455、M1-V454、M1-S453、M1-I452、M1-C451、M1-M450、M1-A449、M1-W448、M1-I447、M1-L446、M1-V445、M1-F444、M1-M443、M1-R442、M1-G441、M1-L440、M1-L439、M1-Q438、M1-L437、M1-W436、M1-G435、M1-M434、M1-K433、M1-H432、M1-T431、M1-L430、M1-A429、M1-L428、M1-P427、M1-H426、M1-P425、M1-I424、M1-A423、M1-E422、M1-E421、M1-E420、M1-R419、M1-P418、M1-R417、M1-Y416、M1-Y415、M1-S414、M1-V413、M1-L412、M1-T411、M1-L410、M1-T409、M1-I408、M1-N407、M1-Y406、M1-F405、M1-F404、M1-Y403、M1-F402、M1-C401、M1-F400、M1-S399、M1-L398、M1-F397、M1-F396、M1-M395、M1-H394、M1-K393、M1-A392、M1-F391、M1-K390、M1-K389、M1-W388、M1-K387、M1-M386、M1-H385、M1-L384、M1-L383、M1-T382、M1-H381、M1-L380、M1-P379、M1-E378、M1-L377、M1-T376、M1-L375、M1-M374、M1-E373、M1-H372、M1-R371、M1-N370、M1-D369、M1-I368、M1-N367、M1-T366、M1-N365、M1-Y364、M1-V363、M1-T362、M1-I361、M1-E360、M1-L359、M1-V358、M1-S357、M1-N356、M1-D355、M1-T354、M1-T353、M1-T352、M1-D351、M1-V350、M1-N349、M1-T348、M1-L347、M1-D346、M1-Y345、M1-L344、M1-S343、M1-S342、M1-S341、M1-V340、M1-P339、M1-G338、M1-Y337、M1-A336、M1-W335、M1-D334、M1-T333、M1-F332、M1-K331、M1-R330、M1-S329、M1-L328、M1-S327、M1-R326、M1-L325、M1-R324、M1-K323、M1-E322、M1-K321、M1-I320、M1-E319、M1-R318、M1-S317、M1-L316、M1-I315、M1-Y314、M1-K313、M1-L312、M1-I311、M1-E310、M1-A309、M1-K308、M1-G307、M1-M306、M1-K305、M1-A304、M1-A303、M1-L302、M1-Q301、M1-L300、M1-P299、M1-T298、M1-L297、M1-G296、M1-D295、M1-N294、M1-N293、M1-R292、M1-T291、M1-T290、M1-E289、M1-L288、M1-E287、M1-W286、M1-N285、M1-G284、M1-S283、M1-R282、M1-L281、M1-L280、M1-I279、M1-M278、M1-D277、M1-Y276、M1-M275、M1-R274、M1-K273、M1-V272、M1-F271、M1-D270、M1-N269、M1-Q268、M1-T267、M1-K266、M1-F265、M1-D264、M1-E263、M1-A262、M1-V261、M1-T260、M1-V259、M1-L258、M1-A257、M1-H256、M1-L255、M1-I254、M1-N253、M1-N252、M1-G251、M1-R250、M1-S249、M1-D248、M1-R247、M1-S246、M1-T245、M1-I244、M1-D243、M1-T242、M1-Q241、M1-E240、M1-H239、M1-E238、M1-M237、M1-L236、M1-L235、M1-Q234、M1-V233、M1-I232、M1-E231、M1-P230、M1-Q229、M1-N228、M1-T227、M1-C226、M1-A225、M1-A224、M1-L223、M1-A222、M1-L221、M1-P220、M1-T219、M1-E218、M1-G217、M1-F216、M1-Y215、M1-F214、M1-G213、M1-E212、M1-H211、M1-Q210、M1-Y209、M1-K208、M1-P207、M1-N206、M1-F205、M1-F204、M1-A203、M1-G202、M1-K201、M1-A200、M1-H199、M1-A198、M1-N197、M1-V196、M1-D195、M1-A194、M1-G193、M1-A192、M1-A191、M1-I190、M1-L189、M1-L188、M1-A187、M1-A186、M1-I185、M1-D184、M1-G183、M1-Q182、M1-R181、M1-R180、M1-E179、M1-I178、M1-A177、M1-I176、M1-N175、M1-L174、M1-A173、M1-T172、M1-Q171、M1-G170、M1-E169、M1-Y168、M1-A167、M1-E166、M1-E165、M1-T164、M1-Y163、M1-E162、M1-A161、M1-N160、M1-I159、M1-F158、M1-R157、M1-G156、M1-L155、M1-I154、M1-D153、M1-N152、M1-E151、M1-E150、M1-A149、M1-F148、M1-A147、M1-L146、M1-L145、M1-I144、M1-R143、M1-V142、M1-I141、M1-E140、M1-K139、M1-T138、M1-N137、M1-P136、M1-N135、M1-I134、M1-N133、M1-L132、M1-L131、M1-A130、M1-K129、M1-M128、M1-L127、M1-C126、M1-T125、M1-K124、M1-G123、M1-T122、M1-D121、M1-S120、M1-A119、M1-T118、M1-L117、M1-K116、M1-H115、M1-M114、M1-L113、M1-F112、M1-D111、M1-A110、M1-P109、M1-L108、M1-A107、M1-M106、M1-P105、M1-P104、M1-T103、M1-V102、M1-P101、M1-P100、M1-G99、M1-R98、M1-S97、M1-G96、M1-K95、M1-A94、M1-R93、M1-G92、M1-A91、M1-W90、M1-L89、M1-T88、M1-H87、M1-N86、M1-S85、M1-C84、M1-G83、M1-C82、M1-V81、M1-G80、M1-L79、M1-G78、M1-Q77、M1-E76、M1-V75、M1-D74、M1-G73、M1-S72、M1-G71、M1-S70、M1-R69、M1-V68、M1-S67、M1-P66、M1-R65、M1-E64、M1-G63、M1-G62、M1-E61、M1-G60、M1-A59、M1-T58、M1-E57、M1-G56、M1-G55、M1-D54、M1-G53、M1-I52、M1-S51、M1-A50、M1-G49、M1-Q48、M1-E47、M1-R46、M1-H45、M1-G44、M1-M43、M1-P42、M1-S41、M1-T40、M1-D39、M1-S38、M1-A37、M1-K36、M1-Q35、M1-E34、M1-K33、M1-G32、M1-V31、M1-T30、M1-H29、M1-S28、M1-G27、M1-A26、M1-T25、M1-W24、M1-G23、M1-G22、M1-A21、M1-A20、M1-V19、M1-R18、M1-S17、M1-D16、M1-T15、M1-E14、M1-L13、M1-R12、M1-G11、M1-G10、M1-G9、M1-R8、および/またはM1-P7。これらポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた提供される。本発明はまた、本明細書に記載するように、これらC末端hVR1d.1欠失ポリペプチドの免疫原エピトープおよび/または抗原エピトープとしての使用をも包含する。
【0070】
好ましい態様において、以下のN末端hVR1d.2欠失ポリペプチドが本発明により包含される:配列番号4のM1-V745、S2-V745、F3-V745、I4-V745、C5-V745、R6-V745、P7-V745、R8-V745、G9-V745、G10-V745、G11-V745、R12-V745、L13-V745、E14-V745、T15-V745、D16-V745、S17-V745、R18-V745、V19-V745、A20-V745、A21-V745、G22-V745、G23-V745、W24-V745、T25-V745、A26-V745、G27-V745、S28-V745、H29-V745、T30-V745、V31-V745、G32-V745、K33-V745、E34-V745、Q35-V745、K36-V745、A37-V745、S38-V745、D39-V745、T40-V745、S41-V745、P42-V745、M43-V745、G44-V745、H45-V745、R46-V745、E47-V745、Q48-V745、G49-V745、A50-V745、S51-V745、I52-V745、G53-V745、D54-V745、G55-V745、G56-V745、E57-V745、T58-V745、A59-V745、G60-V745、E61-V745、G62-V745、G63-V745、E64-V745、R65-V745、P66-V745、S67-V745、V68-V745、R69-V745、S70-V745、G71-V745、S72-V745、G73-V745、D74-V745、V75-V745、E76-V745、Q77-V745、G78-V745、L79-V745、G80-V745、V81-V745、C82-V745、G83-V745、C84-V745、S85-V745、N86-V745、H87-V745、T88-V745、L89-V745、W90-V745、A91-V745、G92-V745、R93-V745、A94-V745、K95-V745、G96-V745、S97-V745、R98-V745、G99-V745、P100-V745、P101-V745、V102-V745、T103-V745、P104-V745、P105-V745、M106-V745、A107-V745、L108-V745、P109-V745、A110-V745、D111-V745、F112-V745、L113-V745、M114-V745、H115-V745、K116-V745、L117-V745、T118-V745、A119-V745、S120-V745、D121-V745、T122-V745、G123-V745、K124-V745、T125-V745、C126-V745、L127-V745、M128-V745、K129-V745、A130-V745、L131-V745、L132-V745、N133-V745、I134-V745、N135-V745、P136-V745、N137-V745、T138-V745、K139-V745、E140-V745、I141-V745、V142-V745、R143-V745、I144-V745、L145-V745、L146-V745、A147-V745、F148-V745、A149-V745、E150-V745、E151-V745、N152-V745、D153-V745、I154-V745、L155-V745、G156-V745、R157-V745、F158-V745、I159-V745、N160-V745、A161-V745、E162-V745、Y163-V745、T164-V745、E165-V745、E166-V745、A167-V745、Y168-V745、E169-V745、G170-V745、Q171-V745、T172-V745、A173-V745、L174-V745、N175-V745、I176-V745、A177-V745、I178-V745、E179-V745、R180-V745、R181-V745、Q182-V745、G183-V745、D184-V745、I185-V745、A186-V745、A187-V745、L188-V745、L189-V745、I190-V745、A191-V745、A192-V745、G193-V745、A194-V745、D195-V745、V196-V745、N197-V745、A198-V745、H199-V745、A200-V745、K201-V745、G202-V745、A203-V745、F204-V745、F205-V745、N206-V745、P207-V745、K208-V745、Y209-V745、Q210-V745、H211-V745、E212-V745、G213-V745、F214-V745、Y215-V745、F216-V745、G217-V745、E218-V745、T219-V745、P220-V745、L221-V745、A222-V745、L223-V745、A224-V745、A225-V745、C226-V745、T227-V745、N228-V745、Q229-V745、P230-V745、E231-V745、I232-V745、V233-V745、Q234-V745、L235-V745、L236-V745、M237-V745、E238-V745、H239-V745、E240-V745、Q241-V745、T242-V745、D243-V745、I244-V745、T245-V745、S246-V745、R247-V745、D248-V745、S249-V745、R250-V745、G251-V745、N252-V745、N253-V745、I254-V745、L255-V745、H256-V745、A257-V745、L258-V745、V259-V745、T260-V745、V261-V745、A262-V745、E263-V745、D264-V745、F265-V745、K266-V745、T267-V745、Q268-V745、N269-V745、D270-V745、F271-V745、V272-V745、K273-V745、R274-V745、M275-V745、Y276-V745、D277-V745、M278-V745、I279-V745、L280-V745、L281-V745、R282-V745、S283-V745、G284-V745、N285-V745、W286-V745、E287-V745、L288-V745、E289-V745、T290-V745、T291-V745、R292-V745、N293-V745、N294-V745、D295-V745、G296-V745、L297-V745、T298-V745、P299-V745、L300-V745、Q301-V745、L302-V745、A303-V745、A304-V745、K305-V745、M306-V745、G307-V745、K308-V745、A309-V745、E310-V745、I311-V745、L312-V745、K313-V745、Y314-V745、I315-V745、L316-V745、S317-V745、R318-V745、E319-V745、I320-V745、K321-V745、E322-V745、K323-V745、R324-V745、L325-V745、R326-V745、S327-V745、L328-V745、S329-V745、R330-V745、K331-V745、F332-V745、T333-V745、D334-V745、W335-V745、A336-V745、Y337-V745、G338-V745、P339-V745、V340-V745、S341-V745、S342-V745、S343-V745、L344-V745、Y345-V745、D346-V745、L347-V745、T348-V745、N349-V745、V350-V745、D351-V745、T352-V745、T353-V745、T354-V745、D355-V745、N356-V745、S357-V745、V358-V745、L359-V745、E360-V745、I361-V745、T362-V745、V363-V745、Y364-V745、N365-V745、T366-V745、N367-V745、I368-V745、D369-V745、N370-V745、R371-V745、H372-V745、E373-V745、M374-V745、L375-V745、T376-V745、L377-V745、E378-V745、P379-V745、L380-V745、H381-V745、T382-V745、L383-V745、L384-V745、H385-V745、M386-V745、K387-V745、W388-V745、K389-V745、K390-V745、F391-V745、A392-V745、K393-V745、H394-V745、M395-V745、F396-V745、F397-V745、L398-V745、S399-V745、F400-V745、C401-V745、F402-V745、Y403-V745、F404-V745、F405-V745、Y406-V745、N407-V745、I408-V745、T409-V745、L410-V745、T411-V745、L412-V745、V413-V745、S414-V745、Y415-V745、Y416-V745、R417-V745、P418-V745、R419-V745、E420-V745、E421-V745、E422-V745、A423-V745、I424-V745、P425-V745、H426-V745、P427-V745、L428-V745、A429-V745、L430-V745、T431-V745、H432-V745、K433-V745、M434-V745、G435-V745、W436-V745、L437-V745、Q438-V745、L439-V745、L440-V745、G441-V745、R442-V745、M443-V745、F444-V745、V445-V745、L446-V745、I447-V745、W448-V745、A449-V745、M450-V745、C451-V745、I452-V745、S453-V745、V454-V745、K455-V745、E456-V745、G457-V745、I458-V745、A459-V745、I460-V745、F461-V745、L462-V745、L463-V745、R464-V745、P465-V745、S466-V745、D467-V745、L468-V745、Q469-V745、S470-V745、I471-V745、L472-V745、S473-V745、D474-V745、A475-V745、W476-V745、F477-V745、H478-V745、F479-V745、V480-V745、F481-V745、F482-V745、I483-V745、Q484-V745、A485-V745、V486-V745、L487-V745、V488-V745、I489-V745、L490-V745、S491-V745、V492-V745、F493-V745、L494-V745、Y495-V745、L496-V745、F497-V745、A498-V745、Y499-V745、K500-V745、E501-V745、Y502-V745、L503-V745、A504-V745、C505-V745、L506-V745、V507-V745、L508-V745、A509-V745、M510-V745、A511-V745、L512-V745、G513-V745、W514-V745、A515-V745、N516-V745、M517-V745、L518-V745、Y519-V745、Y520-V745、T521-V745、R522-V745、G523-V745、F524-V745、Q525-V745、S526-V745、M527-V745、G528-V745、M529-V745、Y530-V745、S531-V745、V532-V745、M533-V745、I534-V745、Q535-V745、K536-V745、V537-V745、I538-V745、L539-V745、H540-V745、D541-V745、V542-V745、L543-V745、K544-V745、F545-V745、L546-V745、F547-V745、V548-V745、Y549-V745、I550-V745、A551-V745、F552-V745、L553-V745、L554-V745、G555-V745、F556-V745、G557-V745、V558-V745、A559-V745、L560-V745、A561-V745、S562-V745、L563-V745、I564-V745、E565-V745、K566-V745、C567-V745、P568-V745、K569-V745、D570-V745、N571-V745、K572-V745、D573-V745、C574-V745、S575-V745、S576-V745、Y577-V745、G578-V745、S579-V745、F580-V745、S581-V745、D582-V745、A583-V745、V584-V745、L585-V745、E586-V745、L587-V745、F588-V745、K589-V745、L590-V745、T591-V745、I592-V745、G593-V745、L594-V745、G595-V745、D596-V745、L597-V745、N598-V745、I599-V745、Q600-V745、Q601-V745、N602-V745、S603-V745、K604-V745、Y605-V745、P606-V745、I607-V745、L608-V745、F609-V745、L610-V745、F611-V745、L612-V745、L613-V745、I614-V745、T615-V745、Y616-V745、V617-V745、I618-V745、L619-V745、T620-V745、F621-V745、V622-V745、L623-V745、L624-V745、L625-V745、N626-V745、M627-V745、L628-V745、I629-V745、A630-V745、L631-V745、M632-V745、G633-V745、E634-V745、T635-V745、V636-V745、E637-V745、N638-V745、V639-V745、S640-V745、K641-V745、E642-V745、S643-V745、E644-V745、R645-V745、I646-V745、W647-V745、R648-V745、L649-V745、Q650-V745、R651-V745、A652-V745、R653-V745、T654-V745、I655-V745、L656-V745、E657-V745、F658-V745、E659-V745、K660-V745、M661-V745、L662-V745、P663-V745、E664-V745、W665-V745、L666-V745、R667-V745、S668-V745、R669-V745、F670-V745、R671-V745、M672-V745、G673-V745、E674-V745、L675-V745、C676-V745、K677-V745、V678-V745、A679-V745、E680-V745、D681-V745、D682-V745、F683-V745、R684-V745、L685-V745、C686-V745、L687-V745、R688-V745、I689-V745、N690-V745、E691-V745、V692-V745、K693-V745、W694-V745、T695-V745、E696-V745、W697-V745、K698-V745、T699-V745、H700-V745、V701-V745、S702-V745、F703-V745、L704-V745、N705-V745、E706-V745、D707-V745、P708-V745、G709-V745、P710-V745、V711-V745、R712-V745、R713-V745、T714-V745、D715-V745、F716-V745、N717-V745、K718-V745、I719-V745、Q720-V745、D721-V745、S722-V745、S723-V745、R724-V745、N725-V745、N726-V745、S727-V745、K728-V745、T729-V745、T730-V745、L731-V745、N732-V745、A733-V745、F734-V745、E735-V745、E736-V745、V737-V745、E738-V745、および/またはE739-V745。これらポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた提供される。本発明はまた、本明細書に記載するように、これらN末端hVR1d.2欠失ポリペプチドの免疫原エピトープおよび/または抗原エピトープとしての使用をも包含する。
【0071】
好ましい態様において、以下のC末端hVR1d.2欠失ポリペプチドが本発明により包含される:配列番号4のM1-V745、M1-S744、M1-T743、M1-E742、M1-P741、M1-F740、M1-E739、M1-E738、M1-V737、M1-E736、M1-E735、M1-F734、M1-A733、M1-N732、M1-L731、M1-T730、M1-T729、M1-K728、M1-S727、M1-N726、M1-N725、M1-R724、M1-S723、M1-S722、M1-D721、M1-Q720、M1-I719、M1-K718、M1-N717、M1-F716、M1-D715、M1-T714、M1-R713、M1-R712、M1-V711、M1-P710、M1-G709、M1-P708、M1-D707、M1-E706、M1-N705、M1-L704、M1-F703、M1-S702、M1-V701、M1-H700、M1-T699、M1-K698、M1-W697、M1-E696、M1-T695、M1-W694、M1-K693、M1-V692、M1-E691、M1-N690、M1-I689、M1-R688、M1-L687、M1-C686、M1-L685、M1-R684、M1-F683、M1-D682、M1-D681、M1-E680、M1-A679、M1-V678、M1-K677、M1-C676、M1-L675、M1-E674、M1-G673、M1-M672、M1-R671、M1-F670、M1-R669、M1-S668、M1-R667、M1-L666、M1-W665、M1-E664、M1-P663、M1-L662、M1-M661、M1-K660、M1-E659、M1-F658、M1-E657、M1-L656、M1-I655、M1-T654、M1-R653、M1-A652、M1-R651、M1-Q650、M1-L649、M1-R648、M1-W647、M1-I646、M1-R645、M1-E644、M1-S643、M1-E642、M1-K641、M1-S640、M1-V639、M1-N638、M1-E637、M1-V636、M1-T635、M1-E634、M1-G633、M1-M632、M1-L631、M1-A630、M1-I629、M1-L628、M1-M627、M1-N626、M1-L625、M1-L624、M1-L623、M1-V622、M1-F621、M1-T620、M1-L619、M1-I618、M1-V617、M1-Y616、M1-T615、M1-I614、M1-L613、M1-L612、M1-F611、M1-L610、M1-F609、M1-L608、M1-I607、M1-P606、M1-Y605、M1-K604、M1-S603、M1-N602、M1-Q601、M1-Q600、M1-I599、M1-N598、M1-L597、M1-D596、M1-G595、M1-L594、M1-G593、M1-I592、M1-T591、M1-L590、M1-K589、M1-F588、M1-L587、M1-E586、M1-L585、M1-V584、M1-A583、M1-D582、M1-S581、M1-F580、M1-S579、M1-G578、M1-Y577、M1-S576、M1-S575、M1-C574、M1-D573、M1-K572、M1-N571、M1-D570、M1-K569、M1-P568、M1-C567、M1-K566、M1-E565、M1-I564、M1-L563、M1-S562、M1-A561、M1-L560、M1-A559、M1-V558、M1-G557、M1-F556、M1-G555、M1-L554、M1-L553、M1-F552、M1-A551、M1-I550、M1-Y549、M1-V548、M1-F547、M1-L546、M1-F545、M1-K544、M1-L543、M1-V542、M1-D541、M1-H540、M1-L539、M1-I538、M1-V537、M1-K536、M1-Q535、M1-I534、M1-M533、M1-V532、M1-S531、M1-Y530、M1-M529、M1-G528、M1-M527、M1-S526、M1-Q525、M1-F524、M1-G523、M1-R522、M1-T521、M1-Y520、M1-Y519、M1-L518、M1-M517、M1-N516、M1-A515、M1-W514、M1-G513、M1-L512、M1-A511、M1-M510、M1-A509、M1-L508、M1-V507、M1-L506、M1-C505、M1-A504、M1-L503、M1-Y502、M1-E501、M1-K500、M1-Y499、M1-A498、M1-F497、M1-L496、M1-Y495、M1-L494、M1-F493、M1-V492、M1-S491、M1-L490、M1-I489、M1-V488、M1-L487、M1-V486、M1-A485、M1-Q484、M1-I483、M1-F482、M1-F481、M1-V480、M1-F479、M1-H478、M1-F477、M1-W476、M1-A475、M1-D474、M1-S473、M1-L472、M1-I471、M1-S470、M1-Q469、M1-L468、M1-D467、M1-S466、M1-P465、M1-R464、M1-L463、M1-L462、M1-F461、M1-I460、M1-A459、M1-I458、M1-G457、M1-E456、M1-K455、M1-V454、M1-S453、M1-I452、M1-C451、M1-M450、M1-A449、M1-W448、M1-I447、M1-L446、M1-V445、M1-F444、M1-M443、M1-R442、M1-G441、M1-L440、M1-L439、M1-Q438、M1-L437、M1-W436、M1-G435、M1-M434、M1-K433、M1-H432、M1-T431、M1-L430、M1-A429、M1-L428、M1-P427、M1-H426、M1-P425、M1-I424、M1-A423、M1-E422、M1-E421、M1-E420、M1-R419、M1-P418、M1-R417、M1-Y416、M1-Y415、M1-S414、M1-V413、M1-L412、M1-T411、M1-L410、M1-T409、M1-I408、M1-N407、M1-Y406、M1-F405、M1-F404、M1-Y403、M1-F402、M1-C401、M1-F400、M1-S399、M1-L398、M1-F397、M1-F396、M1-M395、M1-H394、M1-K393、M1-A392、M1-F391、M1-K390、M1-K389、M1-W388、M1-K387、M1-M386、M1-H385、M1-L384、M1-L383、M1-T382、M1-H381、M1-L380、M1-P379、M1-E378、M1-L377、M1-T376、M1-L375、M1-M374、M1-E373、M1-H372、M1-R371、M1-N370、M1-D369、M1-I368、M1-N367、M1-T366、M1-N365、M1-Y364、M1-V363、M1-T362、M1-I361、M1-E360、M1-L359、M1-V358、M1-S357、M1-N356、M1-D355、M1-T354、M1-T353、M1-T352、M1-D351、M1-V350、M1-N349、M1-T348、M1-L347、M1-D346、M1-Y345、M1-L344、M1-S343、M1-S342、M1-S341、M1-V340、M1-P339、M1-G338、M1-Y337、M1-A336、M1-W335、M1-D334、M1-T333、M1-F332、M1-K331、M1-R330、M1-S329、M1-L328、M1-S327、M1-R326、M1-L325、M1-R324、M1-K323、M1-E322、M1-K321、M1-I320、M1-E319、M1-R318、M1-S317、M1-L316、M1-I315、M1-Y314、M1-K313、M1-L312、M1-I311、M1-E310、M1-A309、M1-K308、M1-G307、M1-M306、M1-K305、M1-A304、M1-A303、M1-L302、M1-Q301、M1-L300、M1-P299、M1-T298、M1-L297、M1-G296、M1-D295、M1-N294、M1-N293、M1-R292、M1-T291、M1-T290、M1-E289、M1-L288、M1-E287、M1-W286、M1-N285、M1-G284、M1-S283、M1-R282、M1-L281、M1-L280、M1-I279、M1-M278、M1-D277、M1-Y276、M1-M275、M1-R274、M1-K273、M1-V272、M1-F271、M1-D270、M1-N269、M1-Q268、M1-T267、M1-K266、M1-F265、M1-D264、M1-E263、M1-A262、M1-V261、M1-T260、M1-V259、M1-L258、M1-A257、M1-H256、M1-L255、M1-I254、M1-N253、M1-N252、M1-G251、M1-R250、M1-S249、M1-D248、M1-R247、M1-S246、M1-T245、M1-I244、M1-D243、M1-T242、M1-Q241、M1-E240、M1-H239、M1-E238、M1-M237、M1-L236、M1-L235、M1-Q234、M1-V233、M1-I232、M1-E231、M1-P230、M1-Q229、M1-N228、M1-T227、M1-C226、M1-A225、M1-A224、M1-L223、M1-A222、M1-L221、M1-P220、M1-T219、M1-E218、M1-G217、M1-F216、M1-Y215、M1-F214、M1-G213、M1-E212、M1-H211、M1-Q210、M1-Y209、M1-K208、M1-P207、M1-N206、M1-F205、M1-F204、M1-A203、M1-G202、M1-K201、M1-A200、M1-H199、M1-A198、M1-N197、M1-V196、M1-D195、M1-A194、M1-G193、M1-A192、M1-A191、M1-I190、M1-L189、M1-L188、M1-A187、M1-A186、M1-I185、M1-D184、M1-G183、M1-Q182、M1-R181、M1-R180、M1-E179、M1-I178、M1-A177、M1-I176、M1-N175、M1-L174、M1-A173、M1-T172、M1-Q171、M1-G170、M1-E169、M1-Y168、M1-A167、M1-E166、M1-E165、M1-T164、M1-Y163、M1-E162、M1-A161、M1-N160、M1-I159、M1-F158、M1-R157、M1-G156、M1-L155、M1-I154、M1-D153、M1-N152、M1-E151、M1-E150、M1-A149、M1-F148、M1-A147、M1-L146、M1-L145、M1-I144、M1-R143、M1-V142、M1-I141、M1-E140、M1-K139、M1-T138、M1-N137、M1-P136、M1-N135、M1-I134、M1-N133、M1-L132、M1-L131、M1-A130、M1-K129、M1-M128、M1-L127、M1-C126、M1-T125、M1-K124、M1-G123、M1-T122、M1-D121、M1-S120、M1-A119、M1-T118、M1-L117、M1-K116、M1-H115、M1-M114、M1-L113、M1-F112、M1-D111、M1-A110、M1-P109、M1-L108、M1-A107、M1-M106、M1-P105、M1-P104、M1-T103、M1-V102、M1-P101、M1-P100、M1-G99、M1-R98、M1-S97、M1-G96、M1-K95、M1-A94、M1-R93、M1-G92、M1-A91、M1-W90、M1-L89、M1-T88、M1-H87、M1-N86、M1-S85、M1-C84、M1-G83、M1-C82、M1-V81、M1-G80、M1-L79、M1-G78、M1-Q77、M1-E76、M1-V75、M1-D74、M1-G73、M1-S72、M1-G71、M1-S70、M1-R69、M1-V68、M1-S67、M1-P66、M1-R65、M1-E64、M1-G63、M1-G62、M1-E61、M1-G60、M1-A59、M1-T58、M1-E57、M1-G56、M1-G55、M1-D54、M1-G53、M1-I52、M1-S51、M1-A50、M1-G49、M1-Q48、M1-E47、M1-R46、M1-H45、M1-G44、M1-M43、M1-P42、M1-S41、M1-T40、M1-D39、M1-S38、M1-A37、M1-K36、M1-Q35、M1-E34、M1-K33、M1-G32、M1-V31、M1-T30、M1-H29、M1-S28、M1-G27、M1-A26、M1-T25、M1-W24、M1-G23、M1-G22、M1-A21、M1-A20、M1-V19、M1-R18、M1-S17、M1-D16、M1-T15、M1-E14、M1-L13、M1-R12、M1-G11、M1-G10、M1-G9、M1-R8、および/またはM1-P7。これらポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた提供される。本発明はまた、本明細書に記載するように、これらC末端hVR1d.2欠失ポリペプチドの免疫原エピトープおよび/または抗原エピトープとしての使用をも包含する。
【0072】
さらに、本発明は、ブダペスト条約の規定に従ってアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)、10801、ユニバーシティー・ブールバール、マナサス、バージニア20110−2209に にATCC受託番号 で寄託してある配列番号1に対応するhVR1dクローンを提供する。
本発明の他の態様は、以下に記載するように、本発明のhVR1dタンパク質およびポリペプチドに対する抗体、およびイオンチャンネルの機能不全に関連するヒト疾患の診断および治療のための方法および組成物に関する。
【0073】
5.1.本発明のhVR1d核酸分子
本発明のhVR1d核酸、たとえばhVR1d.1およびhVR1d.2は、新規なヒトイオンチャンネルの形成および/または機能に関与するタンパク質またはポリペプチドをコードする新規なヒト核酸分子である。これら新規な核酸およびタンパク質は、陽イオンチャンネルタンパク質のTRPおよびバニロイドファミリー並びに当該技術分野で知られた他の陽イオンチャンネルタンパク質とある種の配列上および構造上のホモロジーを示すが、そのようなホモロジーを示すタンパク質は組織発現の差異とともにコンダクタンスや透過性などの機能において有意の差異を示すことが当該技術分野において知られている。そのようであるから、これら核酸分子およびこれらホモロジーを有する該分子によってコードされるタンパク質は、それぞれ多様で別個で独特の核酸およびタンパク質を依然として表しうることが認められる。
【0074】
本発明のhVR1d核酸分子は、以下の配列を含むものである:(a)図1Aまたは図1Bにそれぞれ示すhVR1d.1またはhVR1d.2のDNA配列;(b)図2Aまたは図2Bにそれぞれ示すhVR1d.1またはhVR1d.2のアミノ酸配列をコードする核酸配列;(c)図2Aまたは図2Bのアミノ酸配列をコードする核酸配列の相補鎖に高度にストリンジェントな条件下[たとえば、0.5M NaHPO、7%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、1mM EDTA中、65℃にてフィルター結合したDNAへハイブリダイゼーション、ついで0.1×SSC/0.1%SDS中、68℃にて洗浄(たとえば、Ausubel F. M.ら編、1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, Green Publishing Associates, Inc. and John Wiley & sons, Inc.、ニューヨーク、2.10.3頁を参照)]でハイブリダイズする核酸配列;または(d)図2Aまたは図2Bのアミノ酸配列をコードする核酸配列の相補鎖によりストリンジェントでない条件下、たとえば中くらいにストリンジェントな条件下[たとえば、0.2×SSC/0.1%SDS中、42℃にて洗浄(Ausubelら、1989上掲)]でハイブリダイズし、図2Aまたは図2Bに示す配列によってコードされるhVR1d遺伝子産物と機能的に等価な遺伝子産物をコードする核酸配列。本明細書において「機能的に等価」とは、本明細書に記載のhVR1d核酸分子によってコードされるhVR1d遺伝子産物と実質的に同様のインビボまたはインビトロ活性、たとえばイオンチャンネルの形成または機能を示すことのできるタンパク質をいう。
【0075】
本明細書において「hVR1d核酸分子」または「hVR1d核酸」なる語はまた、天然に存在する変異体またはその変異体アレルも含めて、(a)〜(d)の核酸配列の断片および/または縮重変異体をもいう。そのような断片としては、たとえば、該タンパク質の機能性ドメインに対応するhVR1dタンパク質の部分をコードする核酸配列が挙げられる。そのようなhVR1d核酸断片の一つの態様は、予測された孔ループを含む、hVR1dタンパク質の第五および第六膜貫通セグメントをコードするイントロンなしの連続したオープンリーディングフレームを含む核酸を含む。
【0076】
さらに、本発明のhVR1d核酸分子は、上記(a)〜(d)の核酸配列の少なくとも約6、好ましくは少なくとも約12、およびさらに好ましくは少なくとも約18の連続したヌクレオチドに高度にストリンジェントな条件下または中くらいにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする単離核酸、好ましくはDNA分子を含む。
【0077】
本発明のhVR1d核酸分子はまた、上記(a)〜(d)の核酸配列にハイブリダイズする、それゆえ相補鎖である、核酸分子、好ましくはDNA分子を含む。そのようなハイブリダイゼーション条件は、上記のように高度にストリンジェントまたは中くらいにストリンジェントであってよい。核酸分子がデオキシオリゴヌクレオチド(「オリゴ」)である場合は、高度にストリンジェントな条件は、たとえば、6×SSC/0.05%ピロリン酸ナトリウム中、37℃(14塩基オリゴの場合)、48℃(17塩基オリゴの場合)、55℃(20塩基オリゴの場合)、および60℃(23塩基オリゴの場合)で洗浄することを含む。本発明の核酸分子は、たとえばhVR1d遺伝子制御において有用な、またはhVR1d核酸配列の増幅反応におけるアンチセンスプライマーとして有用な、hVR1dアンチセンス分子をコードするかまたは該分子として作用してよい。さらに、そのような配列は、同様にhVR1d遺伝子制御に有用なリボザイムおよび/または三重らせん配列の一部として用いることができる。さらに、そのような分子は、診断方法の成分として用いることができ、それによって、たとえば、イオンチャンネルの機能不全が関与する疾患を引き起こすかまたは素因となる特定のhVR1dアレルまたは別の仕方でスプライスされたhVR1d転写物の存在を検出することができる。
【0078】
さらに、遺伝コードの縮重のため、hVR1d.1またはhVR1d.2のアミノ酸配列を実質的にコードする他のDNA配列を、hVR1dポリペプチドのクローニングおよび発現のために本発明の実施に用いることができる。そのようなDNA配列は、本発明のhVR1d核酸にストリンジェントな(高いまたは中くらいの)条件下でハイブリダイズすることのできる配列、または遺伝コードの縮重がなければストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることのできるであろう配列を含む。
【0079】
典型的に、本発明のhVR1d核酸は、図1Aまたは図1Bの核酸配列に対してヌクレオチドレベルで少なくとも約80%の全配列ホモロジー、さらに好ましくは少なくとも約85〜90%の全ホモロジー、および最も好ましくは少なくとも約95%の全ホモロジー(デフォールトパラメータを用いてCLUSTAL Wアルゴリズムにより決定(Thompson, J. D.ら、Nucleic Acids Research, 2(22): 4673-4680, (1994)))を示すべきである。
【0080】
本発明に従って用いることのできる変化したhVR1d核酸配列としては、上記と同じかまたは機能的に等価な遺伝子産物をコードする、修飾核酸分子(すなわち、変異した先端欠失した)という結果となる種々のヌクレオチド残基の欠失、付加または置換が挙げられる。遺伝子産物自体が、サイレントな変化となって機能的に等価なhVR1dポリペプチドを生成するようなhVR1dタンパク質配列内のアミノ酸残基の欠失、付加または置換を含んでいてよい。そのようなアミノ酸置換は、関与する残基の極性、電荷、溶解度、ハイドロフォビシティー、ハイドロフィリシティー、および/または両親媒性の類似性に基づいて行うことができる。たとえば、負に荷電したアミノ酸としてはアスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられ、正に荷電したアミノ酸としてはリジン、アルギニンおよびヒスチジンが挙げられ、類似のハイドロフィリシティー値を有する非電荷の極性頭部基を有するアミノ酸としては以下のものが挙げられる:ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、フェニルアラニン、チロシン。機能的に等価なhVR1dポリペプチドとしては、天然のhVR1dタンパク質と同じタイプの生物学的活性(たとえば、陽イオンチャンネル)を示すポリペプチドが挙げられるが、必ずしも同程度である必要はない。
【0081】
本発明の核酸分子または配列は、遺伝子産物のプロセシングおよび発現を修飾する変更を含む(これに限られるものでない)様々な目的のためにhVR1dコード配列を変えるべく遺伝子操作により作製することができる。たとえば、当該技術分野でよく知られた技術、たとえば部位特異的突然変異誘発を用い、新たな制限部位を挿入したり、グリコシル化のパターン、リン酸化などを変えるために変異を導入することができる。たとえば、酵母などのある種の発現系では宿主細胞は遺伝子産物を過度にグリコシル化する。そのような発現系を用いる場合には、N結合したグリコシル化部位を排除すべくhVR1dコード配列を変化させるのが好ましい。
【0082】
他の態様では、本発明のhVR1d核酸、たとえば修飾hVR1d核酸は、異種タンパク質コード配列に連結して融合タンパク質をコードするようにすることができる。好ましい態様によれば、hVR1dタンパク質の活性を有するポリペプチドをコードする本発明のhVR1d核酸またはその断片を、停止コドンで中断されることなく、またインフレームで、異種タンパク質またはペプチドをコードするヌクレオチド配列に連結させる。融合タンパク質は、hVR1d配列と異種タンパク質配列との間に開裂部位を含むようにし、それによってhVR1dタンパク質が異種残基から開裂できるようにすることができる。本発明の融合タンパク質をコードする核酸配列は、完全長のhVR1dコード配列、先端欠失したhVR1dをコードする配列、変異したhVR1dをコードする配列またはhVR1dのペプチド断片をコードする配列を含んでいてよい。
【0083】
本発明のhVR1d核酸分子はまた、hVR1d cDNAまたはゲノムhVR1d DNAを得るためのハイブリダイゼーションプローブとしても用いることができる。さらに、本発明の核酸は、他の種からhVR1d cDNAおよびゲノムDNAを単離するためのPCR増幅法においてプライマーとして用いることができる。
本発明のhVR1d遺伝子配列はまた、変異体hVR1d遺伝子アレルを単離するのに用いることができる。そのような変異体アレルは、イオンチャンネル機能不全に関連する遺伝子型を有することが知られているかまたは有すると提唱されている個体から単離することができる。ついで、変異体アレルおよび変異体アレル遺伝子産物は、以下のセクション5.4に記載するスクリーニング、治療および診断システムに利用することができる。さらに、そのようなhVR1d遺伝子配列は、イオンチャンネル機能不全に影響を及ぼし得るhVR1d遺伝子制御(たとえば、プロモーター)欠陥を検出するのに用いることができる。
【0084】
変異hVR1d遺伝子のcDNAの単離は、たとえば、PCR(当業者によく知られた技術(たとえば、米国特許第4,683,202号を参照))を用いて行うことができる。第一のcDNA鎖は、変異hVR1dアレルを有すると推定される個体において発現されることが知られているまたは発現されると思われる組織から単離したmRNAにオリゴdTオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせ、ついで新たな鎖を逆転写酵素で伸長させることにより合成する。ついで、cDNAの第二の鎖を、正常な遺伝子の5'末端に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを用いて合成する。ついで、これら2つのプライマーを用い、生成物をPCRにより増幅し、適当なベクター中にクローニングし、ついで当該技術分野でよく知られた方法によりDNA配列分析に供する。変異hVR1dのDNA配列を正常なhVR1dアレルと比較することにより、変異hVR1d遺伝子産物の機能の喪失または変更を引き起こしている変異を確認することができる。
【0085】
別法として、変異hVR1dアレルを有していると思われるまたは有することが知られている個体から得たDNAを用いてゲノムライブラリーを構築することができ、または変異hVR1dアレルを発現することが知られているまたは発現すると思われる組織からのRNAを用いてcDNAライブラリーを構築することができる。ついで、正常なhVR1d遺伝子またはその適当な断片は、標識してそのようなライブラリー中の対応の変異hVR1dアレルを同定するプローブとして用いることができる。ついで、変異hVR1d遺伝子配列を含むクローンを精製し、当該技術分野でよく知られた方法に従って配列分析に供することができる。
【0086】
他の態様によれば、たとえば、変異hVR1dアレルを有していると思われるまたは有することが知られている個体において、そのような変異アレルを発現することが知られているまたは発現すると思われる組織から単離したRNAから合成したcDNAを用いて発現ライブラリーを構築することができる。推定の変異組織によって生成された遺伝子産物は、下記セクション5.3に記載するように、正常なhVR1d遺伝子産物に対して産生した抗体とともに標準抗体スクリーニング法を用いて発現およびスクリーニングすることができる。スクリーニング法については、たとえば、Harlow, E.およびLane編、1988, "Antibodies: A Laboratory Manual"、コールドスプリングハーバープレス、コールドスプリングハーバーを参照。
【0087】
hVR1d変異が機能の変化した発現遺伝子産物という結果となる(たとえば、ミスセンスまたはフレームシフト変異の結果)場合には、抗hVR1d遺伝子産物抗体のポリクローナルセットは、変異hVR1d遺伝子産物と交差反応しやすいであろう。そのような標識抗体との反応によって検出したライブラリークローンは、当業者によく知られた方法に従って精製し、配列分析に供することができる。
【0088】
本発明の別の態様において、hVR1dのコード配列は、本明細書に開示するhVR1d遺伝子およびタンパク質の核酸および/またはアミノ酸配列に基づき、当該技術分野でよく知られた化学的方法を用いて全体または一部を合成することができる。たとえば、Caruthersら、1980, Nuc, Acids Res. Symp. Ser. 7: 215-233; CreaおよびHorn, 1980, Nuc. Acids Res. 9(10): 2331; MatteucciおよびCaruthers, 1980, Tetrahedron Letters 21: 719;およびChowおよびKempe, 1981, Nuc. Acids Res. 9(12): 2807-2817を参照。本発明はまた、(a)上記hVR1d核酸および/またはその相補鎖を含むDNAベクター;(b)コード配列の発現を指令する制御配列と作動可能に連結した上記hVR1dコード配列を含むDNA発現ベクター;および(c)コード配列の宿主細胞中での発現を指令する制御配列に作動可能に連結した上記hVR1dコード配列を含むべく遺伝子操作により作製した宿主細胞をも包含する。本明細書において使用する制御配列としては、誘導性および非誘導性のプロモーター、エンハンサー、オペレーターおよび発現を駆動および制御する当業者に知られた他の配列が挙げられるが、これらに限られるものではない。そのような制御配列としては、サイトメガロウイルスhCMV前初期遺伝子、SV40アデノウイルスの初期または後期プロモーター、lac系、trp系、TAC系、TRC系、ファージAの主オペレーターおよびプロモーター領域、fdコーティングタンパク質の制御領域、3−ホスホグリセリン酸キナーゼのプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモーター、および酵母α接合因子のプロモーターが挙げられるが、これらに限られるものではない。
【0089】
本発明はさらに核酸アナログを包含し、該核酸アナログとしては本明細書に記載の核酸分子に等価なペプチド核酸アナログが挙げられるが、これに限られるものではない。この場合に「等価」とは、上記に記載した核酸分子と同じ一次塩基配列を有する核酸アナログをいう。核酸アナログおよび核酸アナログの合成方法は当業者によく知られている。たとえば、Egholm, M.ら、1993, Nature 365: 566-568;およびPerry-O'Keefe, H.ら、1996, Proc. Natl. Acad. USA 93: 14670-14675を参照。
【0090】
5.2.hVR1dタンパク質およびポリペプチド
本発明のhVR1d核酸分子は、完全長hVR1dタンパク質、たとえばhVR1d.1またはhVR1d.2、機能的に活性なまたは等価なhVR1dタンパク質およびポリペプチド、たとえば変異した、先端欠失したまたは欠失した形態のhVR1d、hVR1dのペプチド断片、またはhVR1d融合タンパク質を含むhVR1dポリペプチドを適当な宿主細胞中で発現するのを指令する組換えDNA分子を生成するのに用いることができる。機能的に等価なhVR1dポリペプチドとしては、天然のhVR1dタンパク質と同じタイプの生物学的活性(たとえば、陽イオンチャンネルの形成および/または機能)を示すポリペプチドが挙げられるが、必ずしも同程度の活性である必要はない。
【0091】
好ましい態様において、本発明のタンパク質およびポリペプチドは、図2Aおよび図2Bにそれぞれ示すhVR1d.1およびhVR1d.2のアミノ酸配列を含む。これら配列は、6つの膜貫通ドメインおよびイオンチャンネルのTRP−バニロイドファミリーで保存されている全体ホモロジーを含む。さらに、図2Aおよび図Bのアミノ酸配列は、第一の膜貫通ドメインに先立つ該タンパク質のN末端セグメント中に3つのアンキリンドメインを含んでいる。
【0092】
本発明のhVR1dタンパク質およびポリペプチドは、hVR1d.1またはhVR1d.2のペプチド断片、たとえば該タンパク質の1またはそれ以上のドメインに対応するペプチド、変異した、先端欠失したまたは欠失した形態の該タンパク質およびポリペプチド、並びにhVR1d融合タンパク質を含み、これらhVR1dの誘導体は全て、一旦本明細書に開示のhVR1d核酸配列およびアミノ酸配列が得られたら当該技術分野でよく知られた方法により得ることができる。下記セクション5.1に記載するように、本明細書のタンパク質およびポリペプチドは、サイレントな変化となって機能的に等価なhVR1dポリペプチドを生成するようなhVR1dタンパク質配列内のアミノ酸残基の欠失、付加または置換を含んでいてよい。そのようなアミノ酸置換は、関与する残基の極性、電荷、溶解度、ハイドロフォビシティー、ハイドロフィリシティー、および/または両親媒性の類似性に基づいて行うことができる。たとえば、負に荷電したアミノ酸としてはアスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられ、正に荷電したアミノ酸としてはリジン、アルギニンおよびヒスチジンが挙げられ、類似のハイドロフィリシティー値を有する非電荷の極性頭部基を有するアミノ酸としては以下のものが挙げられる:ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、フェニルアラニン、チロシン。
【0093】
本発明の変異したまたは変化した形態のhVR1dタンパク質およびポリペプチドは、当該技術分野でよく知られたランダム突然変異誘発法かまたは部位特異的突然変異誘発法を用い、または化学的方法により、たとえばタンパク質合成法により(下記セクション5.1を参照)得ることができる。変異hVR1dタンパク質またはポリペプチドは、可変残基はたとえばアミノ酸残基の欠失または挿入によりまたは1またはそれ以上の異なるアミノ酸残基の置換により変えながら、機能にとって重要な領域は保持するように遺伝子操作により作製することができる。たとえば、ポリペプチドの可変位置での保存的な変化を行ってhVR1dの機能を保持した変異hVR1dポリペプチドを遺伝子操作により生成することができる。可変領域での非保存的な変化は、所望なら遺伝子操作によりhVR1dの機能を変えることができる。あるいは、機能の修飾(機能を増大させるかまたは低減するかのいずれか)が望まれる場合には、ポリペプチドの保存領域の欠失または非保存的な変化を遺伝子操作により作製することができる。
【0094】
hVR1dアミノ酸配列を含む融合タンパク質もまた、遺伝子操作および化学的なタンパク質合成法を含む当該技術分野で知られた方法により得ることができる。好ましい態様によれば、本発明の融合タンパク質は、hVR1dの活性を有するポリペプチドをコードする本発明のhVR1d核酸、またはその断片が、インフレームで、また停止コドンで中断されることなく、異種タンパク質またはペプチドをコードするヌクレオチド配列に連結してなる単離核酸分子によってコードされる。
【0095】
本発明の融合タンパク質は、関係のないタンパク質またはポリペプチド配列に連結した、完全長のhVR1dアミノ酸配列、hVR1dペプチド配列、たとえば1またはそれ以上の機能性ドメインをコードする配列、変異hVR1dアミノ酸配列または先端欠失したhVR1dアミノ酸配列を含むものを包含する。そのような融合タンパク質としては、hVR1d融合タンパク質を安定化しタンパク質のインビボでの半減期を長引かせるIgFc融合物、またはマーカー機能を付与する酵素、蛍光タンパク質またはルミネセンスタンパク質への融合物が挙げられるが、これらに限られるものではない。
【0096】
本発明の好ましい態様によれば、本発明のhVR1dタンパク質およびポリペプチド、およびその誘導体は、遺伝子操作法を用いて製造する。それゆえ、組換え法により生物学的に活性なhVR1dポリペプチドを発現させるため、下記セクション5.1に記載するように、該ポリペプチドをコードする核酸分子またはその機能的等価物を適当な発現ベクター、すなわち挿入したコード配列の転写および翻訳に必要な配列を含むベクターに挿入する。さらに詳細には、hVR1d核酸分子を、宿主細胞中での該hVR1d核酸の発現を制御する転写および/または翻訳制御情報を含む制御ヌクレオチド配列に作動可能に連結させる。かくして生成したhVR1d遺伝子産物、並びに組換えhVR1d発現ベクターでトランスフェクションまたは形質転換した宿主細胞および細胞株は様々な目的に用いることができる。これら目的としては、結合を競合的に抑制してhVR1d活性を「中和」しうるものを含めて、hVR1dタンパク質またはポリペプチドに結合する抗体(すなわち、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体)を生成すること、およびhVR1dアナログまたはリガンドをスクリーニングおよび選択することが挙げられるが、これらに限られるものではない。
【0097】
当業者によく知られた方法を用い、本発明のhVR1dコード配列および適当な転写および翻訳制御配列および/またはシグナルを含む発現ベクターを構築する。これら方法としては、インビトロ組換えDNA法、合成法およびインビボ組換え/遺伝子組換え法が挙げられる。たとえば、Maniatisら、1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual、コールドスプリングハーバーラボラトリー、ニューヨーク、およびAusubel F. M.ら編、1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience、ニューヨークを参照。Sambrookら、1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual、コールドスプリングハーバープレス、ニューヨークをも参照。
【0098】
様々な宿主−発現ベクター系を用いて本発明のhVR1dコード配列を発現させることができる。そのような宿主−発現系は、目的とするコード配列を産生させ、その後に精製するビヒクルを表すものであるが、適当なヌクレオチドコード配列で形質転換またはトランスフェクションしたときに対応のhVR1d遺伝子産物をインシトゥでおよび/または機能をインビボで示す細胞をも表す。これら宿主としては、hVR1dコード配列を組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNAまたはコスミドDNA発現ベクターで形質転換した細菌(たとえば、大腸菌、B. subtilis);hVR1dコード配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換した酵母(たとえば、SaccharomycesPichia);hVR1dコード配列を含む組換えウイルス発現ベクター(たとえば、バキュロウイルス)を感染させた昆虫細胞系;hVR1dコード配列を含む組換えウイルス発現ベクターを感染させた(たとえば、カリフラワーモザイクウイルス、CaMV;タバコモザイクウイルス、TMV)または組換えプラスミド発現ベクター(たとえば、Tiプラスミド)で形質転換した植物細胞系;または哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター(たとえば、メタロチオネインプロモーター)または哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター(たとえば、アデノウイルス後期プロモーターまたはワクシニアウイルス7.5Kプロモーター)を含む組換え発現構築物を有する哺乳動物細胞系(たとえば、COS、CHO、BHK、293、3T3)などの微生物が挙げられるが、これらに限られるものではない。
【0099】
これら系の発現配列の強さおよび特異性は様々であってよい。使用した宿主/ベクター系に応じて、構成的プロモーターおよび誘導性プロモーターを含む多くの適当な転写および翻訳配列のいずれをも発現ベクターに用いることができる。たとえば、細菌系でクローニングする場合には、バクテリオファージλのpL、plac、ptrp、ptac(ptrp−lacハイブリッドプロモーター)などの誘導性プロモーターを用いることができる;昆虫細胞系でクローニングする場合には、バキュロウイルスポリヘドリンプロモーターなどのプロモーターを用いることができる;植物細胞系でクローニングする場合には、植物細胞のゲノムに由来するプロモーター(たとえば、熱ショックプロモーター;RUBISCOの小サブユニットのプロモーター;クロロフィルa/b結合タンパク質のプロモーター)または植物ウイルスに由来するプロモーター(たとえば、CaMVの35S RNAプロモーター;TMVのコートタンパク質プロモーター)を用いることができる;哺乳動物細胞系でクローニングする場合には、哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター(たとえば、メタロチオネインプロモーター)または哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター(たとえば、アデノウイルス後期プロモーター;ワクシニアウイルス7.5Kプロモーター)を用いることができる;hVR1d DNAの複数のコピーを含む細胞株を生成する場合には、SV40、BPVおよびEBVベースのベクターを適当な選択マーカーとともに用いることができる。
【0100】
細菌系では、発現したhVR1dポリペプチドを意図した使用に応じて多くの発現ベクターを都合よく選択することができる。たとえば、抗体の生成またはhVR1d遺伝子産物の産生のために多量のhVR1dポリペプチドを産生させたい場合は、容易に精製可能な融合タンパク質産物の高レベルの発現を指令するベクターが望ましい。そのようなベクターとしては、大腸菌発現ベクターpUR278(Rutherら、1983, EMBO J. 2: 1791)(ハイブリッドhVR1d/lacZタンパク質が産生されるようにhVR1dコード配列を該ベクター中にlacZコード領域とインフレームでライゲートすることができる);pINベクター(Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13: 3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 264: 5503-5509)などが挙げられる。pGEXベクターもまたグルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現するのに用いることができる。一般に、そのような融合タンパク質は可溶性であり、溶解した細胞からアフィニティークロマトグラフィーによって、たとえば、グルタチオン−アガロースビーズに吸着させた後に遊離のグルタチオンの存在下で溶出することによって容易に精製することができる。pGEXベクターは、目的とするクローニングしたポリペプチドをGST残基から解離できるように、トロンビンまたは第Xa因子プロテアーゼ開裂部位を含むようにデザインされている。Boothら、1988, Immunol. Lett. 19: 65-70:およびGardellaら、1990, J. Biol. Chem. 265: 15854-15859; Pritchettら、1989, Biotechniques 7: 580をも参照。
【0101】
酵母では、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターを含む多くのベクターを用いることができる。概説については、たとえば、Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, 1988, Ausubel F. M.ら編、Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience, Ch. 13; Grantら、1987, Expression and Secretion Vectors for Yeast, in Methods in Enzymology, Wu & Grossman編、Acad. Press、ニューヨーク、Vol. 153, pp.516-544; Glover, 1986, DNA Cloning, Vol. II, IRL Press、ワシントンDC、Ch. 3;およびBitter, 1987, Heterologous Gene Expression in Yeast, Methods in Enzymology, Berger & Kimmel編、Acad. Press、ニューヨーク、Vol. 152, pp. 673-684;およびThe Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, 1982、コールドスプリングハーバープレス、Vol. IおよびIIを参照。
【0102】
昆虫系では、Autographa californica核多角体病ウイルス(AcNPV)を外来遺伝子を発現するベクターとして用いることができる。このウイルスはSpodoptera frugiperda細胞中で増殖する。hVR1dコード配列を該ウイルスの非必須領域(たとえば、ポリヘドリン遺伝子)中にクローニングし、AcNPVプロモーター(たとえば、ポリヘドリンプロモーター)の制御下に置くことができる。hVR1dコード配列の挿入がうまくいくと、ポリヘドリン遺伝子の不活化および非閉塞(non-occluded)組換えウイルス(すなわち、ポリヘドリン遺伝子によってコードされるタンパク質コートを欠くウイルス)の産生という結果となるであろう。ついで、これら組換えウイルスを用いてSpodoptera frugiperda細胞に感染させることができ、挿入した遺伝子は該細胞中で発現される(たとえば、Smithら、1983, J. Viol. 46: 584; Smith、米国特許第4,215,051号を参照)。
【0103】
哺乳動物細胞系では、多くのウイルスベースの発現系を利用することができる。アデノウイルスを発現ベクターとして用いる場合は、hVR1dコード配列をアデノウイルスの転写/翻訳制御複合体、たとえば後期プロモーターおよび三連の(tripartite)リーダー配列にライゲートすることができる。ついで、このキメラ遺伝子をアデノウイルスゲノムにインビトロまたはインビボ組換えにより挿入する。ウイルスゲノムの非必須領域(たとえば、領域E1またはE3)への挿入は、生存でき、感染した宿主中でhVR1dを発現する組換えウイルスという結果となるであろう(たとえば、Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sic. (USA) 81: 3655-3659を参照)。別法として、ワクシニア7.5Kプロモーターを用いることもできる(たとえば、Mackettら、1982, Proc. Natl. Acad. Sic. (USA) 79: 7415-7419; Mackettら、1984, J. Virol. 49: 857-864; Panicaliら、1982, Proc. Natl. Acad. Sic. 79: 4927-4931を参照)。
【0104】
挿入したhVR1dコード配列の有効な翻訳のためには特定の開始シグナルも必要である。これらシグナルとしては、ATG開始コドンおよび隣接配列が挙げられる。それ自身の開始コドンおよび隣接配列を含む全hVR1d遺伝子を適当な発現nベクターに挿入する場合には、追加の翻訳制御シグナルは必要ない。しかしながら、hVR1dコード配列の一部のみを挿入する場合には、ATG開始コドンを含む外来の翻訳制御シグナルを提供しなければならない。さらに、全挿入物の翻訳を確実にするために開始コドンはhVR1dコード配列の読取り枠と同じ位相でなければならない。これら外来翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然および合成の両者からの様々な起源のものであってよい。発現の効率は、適当な翻訳エンハンサー配列、転写ターミネーターなどを含めることによって促進することができる(たとえば、Bittnerら、1987, Methods in Enzymol. 153: 516-544)。
【0105】
さらに、挿入配列の発現を変調する、または所望の特定の仕方で遺伝子産物を修飾またはプロセシングする宿主細胞株を選択することができる。そのようなタンパク質産物の修飾(たとえば、グリコシル化)およびプロセシング(たとえば、開裂)はタンパク質の機能にとって重要である。様々な宿主細胞は、タンパク質の翻訳後プロセシングおよび修飾のための特徴的かつ特異な機構を有している。発現された外来タンパク質の正しい修飾およびプロセシングを確実にすべく、適当な細胞株または宿主系を選択することができる。この目的のため、一次転写物の適切なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化、およびリン酸化のための細胞機構を有する真核宿主細胞を用いることができる。そのような哺乳動物宿主細胞としては、CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、WI38などが挙げられるが、これらに限られるものではない。
【0106】
組換えタンパク質の長期にわたる高収率での産生のためには安定な発現が好ましい。たとえば、本発明のhVR1dポリペプチドを安定に発現する細胞株を遺伝子工学で作ることができる。それゆえ、ウイルスの複製起点を含む発現ベクターを用いるよりも、適当な発現制御配列(たとえば、プロモーター、エンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など)により制御されるhVR1d核酸分子、たとえばDNAおよび選択マーカーで宿主細胞を形質転換することができる。外来DNAの挿入後、遺伝子工学で作製した細胞を富培地で1〜2日増殖させ、ついで選択培地に切り換える。組換えプラスミド中の選択マーカーは選択に対して耐性を付与し、細胞が該プラスミドを染色体中に安定に組み込んで細胞増殖巣(foci)を形成するのを可能とし、この細胞増殖巣を今度はクローニングし、細胞株に拡張することができる。この方法は、hVR1dポリペプチドを細胞表面上に発現する細胞株を遺伝子工学により作製するのに都合よく用いることができる。そのように遺伝子工学により作製した細胞株は、hVR1dアナログまたはリガンドをスクリーニングするのに特に有用である。
【0107】
哺乳動物細胞がヒト細胞である場合、本発明のhVR1d核酸配列を発現できる発現系にはヒト人工染色体(HAC)系がある(たとえば、Harringtonら、1997, Nature Genetics 15: 345-355を参照)。
hVR1d遺伝子産物はまた、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ブタ、ミクロブタ(micro-pigs)、ヒツジ、ヤギ、および非ヒト霊長類、たとえばヒヒ、サル、およびチンパンジーなどのトランスジェニック動物でも発現させることができる。本明細書において「トランスジェニック」とは、異なる種からのhVR1d核酸配列を発現する動物(たとえば、ヒトhVR1d核酸配列を発現するマウス)、並びに内生の(すなわち、同じ種の)hVR1d核酸配列を過剰発現するように遺伝子操作した動物、または内生のhVR1d核酸配列をもはや発現しないように遺伝子操作した動物(すなわち、「ノックアウト」動物)、およびその子孫をいう。
【0108】
本発明によるトランスジェニック動物は当該技術分野でよく知られた方法を用いて製造することができ、これら方法としては、前核マイクロインジェクション(Hoppe, P. C.およびWagner, T. E., 1989、米国特許第4,873,191号);生殖細胞中へのレトロウイルス媒体遺伝子輸送(Van der Puttenら、1985, Proc. Natl. Acad. Sic. USA 82: 6148-6152);胚性幹細胞中への遺伝子ターゲティング(Thompsonら、1989, Cell 56: 313-321);胚のエレクトロポレーション(Lo, 1983, Mol. Cell. Biol. 3: 1803-1814);および精子媒体遺伝子輸送(Lavitranoら、1989, Cell 57: 717-723)などが挙げられるが、これらに限られるものではない。そのような技術の概説については、Gordon, 1989, Transgenic Animals, Intl. Rev. Cytol. 115: 171-229を参照。
【0109】
さらに、hVR1dトランスジーンを含むトランスジェニック動物クローンを作製するために当該技術分野で知られたいかなる方法も用いることができ、たとえば、除核した卵母細胞中への静止誘発した培養胚、胎仔または成体細胞からの核の核導入(Campbellら、1996, Nature 380: 64-66; Wilmutら、1997, Nature 385: 810-813)を用いることができる。
hVR1dコード配列を含み、生物学的に活性な遺伝子産物を発現する宿主細胞は、少なくとも4つの一般的な方法により同定することができる:(a)DNA−DNAまたはDNA−RNAハイブリダイゼーション;(b)「マーカー」遺伝子機能の存在または不在;(c)宿主細胞中でのhVR1d mRNA転写物の発現の測定による転写レベルの評価;および(d)イムノアッセイによりまたはその生物学的活性により測定した遺伝子産物の検出。
【0110】
第一の方法において、発現ベクター中に挿入したhVR1dコード配列の存在は、それぞれhVR1dコード配列の相同なヌクレオチド配列、またはその一部または誘導体を含むプローブを用いたDNA−DNAまたはDNA−RNAハイブリダイゼーションにより検出することができる。
第二の方法において、組換え発現ベクターおよび/または宿主系は、ある種の「マーカー」遺伝子機能の存在または不在に基づいて同定および選択することができる。たとえば、hVR1dコード配列がベクターのマーカー遺伝子配列内に挿入されると、hVR1dコード配列を含む組換え体はマーカー遺伝子機能の不在によって同定することができる。あるいは、マーカー遺伝子をhVR1d配列と縦列して、hVR1dコード配列の発現の制御に用いたプロモーターと同じかまたは異なるプロモーターの制御下に置くことができる。誘発または選択に応答したマーカーの発現は、hVR1dコード配列の発現を示す。
【0111】
選択マーカーとしては、抗生物質耐性、メトトレキセート耐性、形質転換表現型、およびバキュロウイルス中での閉塞体(occlusion body)の形成が挙げられる。さらに、チミジンキナーゼ活性(Wiglerら、1977, Cell 11:223)遺伝子、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Szybalska & Szybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48: 2026)遺伝子、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Lowyら、1980, Cell 22: 817)遺伝子を、それぞれtk、hgprt、またはaprt細胞に用いることができる。また、dhfr(メトトレキセートに対する耐性を付与する)(Wiglerら、1980, Proc. Natl. Acad. Sic. USA 77: 3567; O'Hareら、1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1572);gpt(ミコフェノール酸に対する耐性を付与する)(Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072);neo(アミノグリコシドG−418に対する耐性を付与する)(Colberre-Garapinら、1981, J. Mol. Biol. 150: 1);およびhygro(ハイグロマイシンに対する耐性を付与する)(Santerreら、1984, Gene 30: 147)については代謝拮抗物質耐性を選択の基礎に用いることができる。さらに別の選択遺伝子も記載されている、すなわち、trpB(細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用することを可能にする);hisD(細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用することを可能にする)(Hartman & Mulligan, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8047);およびODC(オルニチンデカルボキシラーゼ)(オルニチンデカルボキシラーゼインヒビターである2−(ジフルオロメチル)−DL−オルニチン(DFMO)に対する耐性を付与する)(McConlogue, 1987, Current Communications in Molecular Biology、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー編中)。
【0112】
第三の方法では、hVR1dコード領域の転写活性をハイブリダイゼーションアッセイにより評価することができる。たとえば、hVR1dコード配列またはその特定の部分に相同なプローブを用いたノーザンブロットによりRNAを単離および分析することができる。別法として、宿主細胞の全核酸を抽出し、そのようなプローブへのハイブリダイゼーションについてアッセイすることができる。
【0113】
第四の方法では、hVR1dタンパク質産物の発現を免疫学的に、たとえば、ウエスタンブロット、ラジオイムノ沈降、酵素結合イムノアッセイなどのイムノアッセイにより評価することができる。しかしながら、発現系の成功の最終的な試験には生物学的に活性なhVR1d遺伝子産物の検出が含まれる。hVR1d活性の検出には、結合アッセイおよびhVR1d活性の生物学的アッセイを含む(これらに限られるものではない)多くのアッセイを用いることができる。
【0114】
生物学的に活性なhVR1dポリペプチドを高レベルで産生するクローンが同定されたら、このクローンを拡張し、大量のポリペプチドを産生するのに用いることができ、該ポリペプチドは抗体を用いたイムノアフィニティー精製、免疫沈降またはクロマトグラフィー法(高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を含む)を含む(これらに限られるものではない)当該技術分野でよく知られた方法により精製することができる。
【0115】
hVR1dコード配列が開裂しうる融合タンパク質をコードするように遺伝子工学により作製されている場合には、精製はアフィニティー精製法を用いて容易に行うことができる。たとえば、コラゲナーゼ開裂認識コンセンサス配列をhVR1dのカルボキシ末端とプロテインAとの間に遺伝子工学により作製することができる。得られた融合タンパク質は、プロテインA残基に結合するIgGカラムを用いて容易に精製することができる。非融合hVR1dはコラゲナーゼ処理によりカラムから容易に放出することができる。他の例は、外来ポリペプチドをグルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質として発現するpGEXベクターの使用である。融合タンパク質は、クローニングした遺伝子とGST残基との間にトロンビンまたは第Xa因子開裂部位のいずれかを有するように遺伝子工学により作製することができる。融合タンパク質は、グルタチオンアガロースビーズへの吸着後にグルタチオンの存在下で溶出することによって細胞抽出物から容易に精製することができる。実際、hVR1d遺伝子産物配列と、精製に使用できる結合パートナーを有する第二のペプチドまたはタンパク質(たとえば、それに対するイムノアフィニティーカラムを調製できる抗原)との間にいかなる開裂部位または酵素開裂基質をも遺伝子工学により作製することができる。
【0116】
さらに、hVR1d融合タンパク質は、発現されるべき融合タンパク質に特異的な抗体を利用して容易に精製することができる。たとえば、Janknechtらによって記載された系は、ヒト細胞株で発現された非変性融合タンパク質の容易な精製を可能にする(Janknechtら、1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8972-8976)。この系では、目的遺伝子の読取り枠が6ヒスチジン残基からなるアミノ末端タグに翻訳可能に融合されるように、該遺伝子をワクシニア組換えプラスミド中にサブクローニングする。組換えワクシニアウイルスを感染させた細胞からの抽出物をNi2+ニトリロ酢酸−アガロースカラムに負荷し、ヒスチジン−タグタンパク質をイミダゾール含有緩衝液で選択的に溶出する。
【0117】
別法として、本発明のhVR1dタンパク質およびポリペプチドは、化学的方法を用いてhVR1dアミノ酸配列の全体または一部を合成することにより製造することができる。たとえば、ペプチドを固相法により合成し、樹脂から開裂し、ついで高速液体クロマトグラフィーにより精製することができる(たとえば、Creighton, 1983, Proteins Structures And Molecular Principles, W.H. Freeman and Co.、ニューヨーク、pp.50-60を参照)。合成ペプチドの組成は、アミノ酸分析またはシークエンシング(たとえば、エドマン分解法;Creighton, 1983, Proteins, Structures and Molecular Principles, W.H. Freeman and Co.、ニューヨーク、pp.34-49を参照)により確認することができる。
【0118】
hVR1dタンパク質、ポリペプチドおよびペプチド断片、変異した、先端欠失したまたは欠失した形態のhVR1dおよび/またはhVR1d融合タンパク質は、抗体の生成、診断アッセイの試薬として、イオン輸送が関与する他の細胞遺伝子産物の同定、イオンチャンネル障害の治療に使用する化合物のスクリーニングアッセイにおける試薬としてを含む(これらに限られるものではない)様々な用途のために調製することができる。
【0119】
5.3.hVR1dポリペプチドに対する抗体
本発明はまた、本発明のhVR1dポリペプチドに対する抗体および該抗体の製造方法をも包含し、これには1またはそれ以上のhVR1dエピトープまたはhVR1dの保存された変異体またはペプチド断片のエピトープを特異的に認識する抗体が含まれるが、これらに限られるものではない。
【0120】
そのような抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体(mAb)、ヒト化またはキメラ抗体、一本鎖抗体、Fabフラグメント、F(ab’)フラグメント、Fab発現ライブラリーにより産生されたフラグメント、抗イディオタイプ(抗Id)抗体、および以上のエピトープ結合フラグメントが挙げられるが、これらに限られるものではない。そのような抗体は、たとえば、生物学的試料中のhVR1dタンパク質またはポリペプチドの検出に用いることができ、それゆえ診断または予後法の一部として利用することができ、それによって患者はhVR1dの異常なレベルおよび/または該タンパク質の異常な形態の存在について試験することができる。そのような抗体はまた、たとえば、hVR1dレベルおよび/または活性に対する被験化合物の作用を評価するための化合物スクリーニングプロトコールとともに利用することができる。さらに、そのような抗体は、たとえば、患者に導入する前に正常なおよび/または遺伝子工学により作製したhVR1d発現細胞を評価するために、下記のセクション5.4に記載する遺伝子療法とともに用いることができる。
【0121】
hVR1dに対する抗体を産生するには、該タンパク質またはその一部を注射することにより様々な宿主動物を免疫する。そのような宿主動物としては、ウサギ、マウス、ラット、およびヒヒが挙げられる。免疫応答を増大させるため、宿主の種に応じて様々なアジュバントを用いることができ、これにはフロイントの(完全および不完全)アジュバント、水酸化アルミニウムなどの無機ゲル、界面活性剤、たとえばリソレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、および潜在的に有用なヒトアジュバント、たとえばBCG(bacille Calmette-Guerin)およびCorynebacterium parvumが含まれるが、これらに限られるものではない。
【0122】
ポリクローナル抗体は、抗原、たとえばhVR1dポリペプチド、またはその抗原性の機能性誘導体で免疫した動物の血清から得られる抗体分子の不均質な集団である。ポリクローナル抗体を産生するには、上記に記載したような宿主動物を上記に記載したアジュバントを添加したhVR1dポリペプチドを注射して免疫する。
【0123】
特定の抗原に対する抗体の均質な集団であるモノクローナル抗体は、培養中の連続的な細胞株による抗体分子の産生を提供する方法により得ることができる。これら方法としては、KohlerおよびMilsteinのハイブリドーマ法(1975, Nature 245: 495-497;および米国特許第4,376,110号)、ヒトB細胞ハイブリドーマ法(Kosborら、1983, Immunology Today 4: 72; Coleら、1983, Proc. Natl. Acad. Sic. USA 80: 2026-2030)、およびEBVハイブリドーマ法(Coleら、1985, Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp.77-96)が挙げられるが、これらに限られるものではない。そのような抗体は、IgG、IgM、IgE、IgA、IgDを含むいかなる免疫グロブリンのクラスおよびそのサブクラスであってよい。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマはインビトロまたはインビボで培養することができる。
【0124】
適当な抗原特異性のマウス抗体分子からの遺伝子を適当な生物学的活性のヒト抗体分子からの遺伝子とともにスプライスすることによるキメラ抗体の製造用に開発された方法(Morrisonら、1984, Proc. Natl. Acad. Sic. 81: 6851-6855; Neubergerら、1984, Nature 312: 604-608; Takedaら、1985, Nature 314: 452-454)を用いることができる。キメラ抗体とは、異なる部分が異なる動物種に由来する分子であり、たとえば、マウスmAbからの可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体である(たとえば、Cabillyら、米国特許第4,816,567号;Bossら、米国特許第4,816,397号を参照)。
【0125】
さらに、ヒト化抗体の製造のための方法が開発されている(たとえば、Queen、米国特許第5,585,089号を参照)。ヒト化抗体とは、非ヒト種からの1またはそれ以上のCDRおよびヒト免疫グロブリン分子からのフレームワーク領域を有する非ヒト種からの抗体分子である。
【0126】
別法として、一本鎖抗体の産生のために記載された方法(米国特許第4,946,778号;Bird, 1988, Science 242: 423-426; Hustonら、1988, Proc. Natl. Acad. Sic. USA 85: 5879-5883;およびWardら、1989, Nature 334: 544-546)をhVR1dに対する一本鎖抗体を産生するのに用いることができる。一本鎖抗体は、Fv領域の重鎖フラグメントおよび軽鎖フラグメントをアミノ酸架橋により連結して一本鎖ポリペプチドとすることにより生成する。
【0127】
さらに、hVR1dの特定のエピトープを認識する抗体フラグメントを当該技術分野でよく知られた方法により製造することができる。たとえば、そのようなフラグメントとしては、抗体分子のペプシン消化により製造できるF(ab’)フラグメント、およびF(ab’)フラグメントのジスルフィド架橋を還元することにより製造できるFabフラグメントが挙げられるが、これらに限られるものではない。あるいは、Fab発現ライブラリーを構築して(Huseら、1989, Science 246: 1275-1281)所望の特異性を有するモノクローナルFabフラグメントの迅速かつ容易な同定を可能とすることができる。
【産業上の利用可能性】
【0128】
5.4.本発明のhVR1d核酸分子、タンパク質およびポリペプチド、および抗体の用途
上記に記載したように、本発明のhVR1d核酸分子は、イオンチャンネル、さらに詳細には陽イオンチャンネルの形成および/または機能に関与するタンパク質をコードする。多くの細胞プロセスにおけるカルシウム、ナトリウムまたはカリウムなどの陽イオンの重要性を考慮すると、本発明のhVR1d核酸分子およびタンパク質およびポリペプチドはイオンチャンネル、さらに詳細には陽イオンチャンネルの機能不全が関与する様々なヒト疾患状態の診断および治療に有用である。たとえば、カルシウムは神経伝達物質、ホルモンおよび他の循環因子の放出、多くの制御遺伝子の発現並びにアポトーシスまたは細胞死の細胞プロセスにおいて役割を果たしている。カリウムは神経保護を提供しており、インスリンの分泌にも影響を及ぼす。ナトリウムは正常なニューロン活動電位の発生および進行の制御に関与している。リドカインなどのナトリウムチャンネルブロッカーは重要な鎮痛剤である。それゆえ、陽イオンチャンネルの機能不全は、多くのヒト疾患および障害、たとえば、CNS障害、たとえばアルツハイマー病やパーキンソン病などの変性神経障害、並びに慢性的な痛み、不安および抑うつなどの神経学的障害において役割を果たしている。イオンチャンネルの機能不全による影響を受ける他の疾患および障害としては、心臓障害、たとえば、不整脈、糖尿病、高カルシウム血症、高カルシウム尿症、または免疫学的障害、胃腸管障害または肝疾患に関連するイオンチャンネル機能不全が挙げられる。そのようであるから、これらイオンチャンネルの形成または機能に関与するタンパク質(およびこれらタンパク質をコードする核酸)は多くのヒト疾患の診断および治療に有用である。
【0129】
本発明の核酸分子、タンパク質およびポリペプチドの用途には、以下に記載するように、イオン/陽イオンチャンネル機能不全が関与するヒト疾患の予後的および診断的評価、およびそのような疾患への罹りやすさの個体の同定がある。他の用途としては、そのようなイオン/陽イオンチャンネル機能不全疾患の治療方法、hVR1d遺伝子媒体活性の変調方法、およびhVR1d媒体エフェクター機能の変調方法が挙げられる。
【0130】
さらに、本発明の核酸分子およびタンパク質およびポリペプチドは、本発明のhVR1d遺伝子の発現および/またはhVR1d遺伝子産物の活性を変調する化合物の同定のためのアッセイに用いることができる。そのような化合物としては、たとえば、陽イオンホメオスタシスまたは活性に関与する他の細胞産物または小さな分子が挙げられる。
【0131】
5.4.1.イオン関連障害の診断および予後
イオン、たとえば陽イオンの機能不全が関与するヒト疾患の診断および予後のための本発明の方法は、上記セクション5.1に記載のhVR1d核酸分子および配列などの試薬、および上記セクション5.3に記載のhVR1dタンパク質またはポリペプチド(そのペプチド断片を含む)に対する抗体を利用する。詳細には、そのような試薬は、たとえば、(1)hVR1d遺伝子変異の存在の検出、または非陽イオン機能不全状態と比べてhVR1d遺伝子mRNAの過剰または過少発現、または別のスプライスされた形態のhVR1d転写物(ある種のイオンホメオスタシス障害またはそのような障害への罹りやすさと相関関係がある)の定性的または定量的検出;および(2)非陽イオン機能不全状態と比較してhVR1d遺伝子産物の過剰な存在量または過少な存在量のいずれかの検出、または修飾した(たとえば、完全長未満)hVR1d遺伝子産物の存在(陽イオン機能不全状態またはそのような状態への進行と相関関係がある)の検出、のために用いることができる。
【0132】
本明細書に記載の方法は、たとえば、本明細書に記載の少なくとも1つの特定のhVR1d遺伝子核酸または抗hVR1d遺伝子抗体試薬を含む前もってパッケージングした試験キットを用いて行うことができ、この試験キットは、たとえば臨床場面において、イオン/陽イオンチャンネル/ホメオスタシスの異常を示す患者をスクリーニングおよび診断するため、およびそのような異常への素因を示す個体をスクリーニングおよび同定するために都合よく用いることができる。
【0133】
hVR1d変異の検出のためには、あらゆる有核細胞をゲノム核酸の採取のための出発物質として用いることができる。hVR1d転写物またはhVR1d遺伝子産物の検出のためには、hVR1d遺伝子が発現されるあらゆる細胞型または組織を用いることができる。
核酸ベースの検出法は下記5.4.1.1に記載してあり、一方、ペプチドベースの検出法は下記5.4.1.2に記載してある。
【0134】
5.4.1.1.hVR1d遺伝子核酸分子の検出
hVR1d遺伝子内の変異または多型は多くの方法を用いて検出することができる。あらゆる有核細胞からの核酸をそのようなアッセイ法の出発物質として用いることができ、当業者によく知られた標準的な核酸調製法に従って単離することができる。
【0135】
ゲノムDNAを生物学的試料のハイブリダイゼーションアッセイまたは増幅アッセイに用い、点変異、挿入、欠失および染色体再配置を含むhVR1d遺伝子構造が関与する異常を検出することができる。そのようなアッセイとしては、直接シークエンシング(Wong, C.ら、1987, Nature 330: 384-386)、一本鎖立体配座多型分析(SSCP;Orita, M.ら、1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2766-2770)、へテロ二本鎖分析(Keen, T.J.ら、1991, Genomics 11: 199-205; Perry, D. J. & Carrell, R.W., 1992)、変性勾配ゲル電気泳動(DGGE;Myers, R.M.ら、1985, Nucl. Acids Res. 13: 3131-3145)、化学的ミスマッチ開裂(Cotton, R. G.ら、1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 4397-4401)、およびオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション(Wallace, R. B.ら、1981, Nucl. Acids Res. 9: 879-894; Lipshutz, R. J.ら、1995, Biotechniques 19: 442-447)が挙げられるが、これらに限られるものではない。
【0136】
患者試料または他の適当な細胞採取源中のhVR1d遺伝子特異的な核酸分子の検出のための診断法は、たとえばPCRによる特定遺伝子配列の増幅、およびそれに続いてたとえば上記に列記したような当業者によく知られた方法を用いた増幅分子の分析を含む。これら方法のような分析方法を用い、hVR1d遺伝子変異が存在するか否かを決定するために増幅した配列を増幅すべき核酸がhVR1d遺伝子の正常なコピーのみを含むときに予期される配列と比較することができる。
【0137】
さらに、よく知られた遺伝子型決定法を用い、hVR1d遺伝子自体に存在する変異に極めて近接した多型の型分けを行うことができる。これら多型は、変異を有しやすいファミリー中の個体を識別するのに用いることができる。多型がhVR1d遺伝子中の変異に関して連鎖不平衡を示す場合には、そのような多型は変異を有しやすい一般集団中の個体を識別するのに用いることができる。このような仕方で用いることのできる多型としては、制限断片長多型(RFLP)(制限酵素標的配列中の配列の変異が関わる)、単一塩基多型および単純配列長多型(SSLP)が挙げられる。
【0138】
たとえば、Weber(米国特許第5,075,217号)は、(dC−dA)−(dG−dT)ショートタンデムリピートのブロックでの長さ多型に基づくDNAマーカーを記載している。(dC−dA)−(dG−dT)ブロックの平均距離は30,000−60,000bpであると推定される。そのような近接して位置するマーカーは高頻度の同時遺伝を示し、遺伝子変異、たとえばhVR1d遺伝子内の変異の同定、およびhVR1d変異に関連する疾患および障害の診断に有用である。
【0139】
さらに、Caskeyら(米国特許第5,364,759号)は、短いトリまたはテトラヌクレオチドの繰り返し配列を検出するためのDNAプロファイリングアッセイを記載している。このプロセスは、目的とするDNA、たとえばhVR1d遺伝子を抽出し、抽出した遺伝子を増幅し、ついで繰り返し配列を標識して個体DNAの遺伝子マップを作成することを含む。
hVR1dプローブもまたRFLPを直接同定するのに用いることができるであろう。さらに、本発明のhVR1d配列に由来するhVR1dプローブまたはプライマーは、YAC、BAC、PAC、コスミド、ファージまたはプラスミドなどのゲノムクローンを単離するのに用いることができるであろう。これらクローンに含まれるDNAは、標準的なハイブリダイゼーション法またはシークエンシング法を用いて単一塩基多型または単純配列長多型(SSLP)についてスクリーニングするのに用いることができる。
【0140】
hVR1d遺伝子に特異的な変異または多型の検出のための他の診断法としては、たとえば、試料、たとえば患者または他の適当な細胞採取源から得た組換えDNA分子、クローニングした遺伝子またはその縮重変異体を含む核酸を、上記セクション5.1に記載の組換えDNA分子、クローニングした遺伝子またはその縮重変異体を含む本発明のhVR1d核酸分子を含む1またはそれ以上の標識核酸試薬と、これら試薬がhVR1d遺伝子内の相補的配列に特異的にアニーリングするのに有利な条件下で接触およびインキュベートすることを含むハイブリダイゼーション法が挙げられる。好ましくは、これら核酸試薬の長さは少なくとも15〜30ヌクレオチドである。インキュベーション後、全てのアニーリングしていない核酸を核酸:hVR1d分子ハイブリッドから取り除く。ついでハイブリダイズした核酸の存在を、もしもそのような分子が存在するなら検出する。そのような検出スキームを用い、目的とする細胞型または組織からの核酸を、たとえば、膜、またはプラスチック表面(マイクロタイタープレートやポリスチレンビーズ上の表面など)などの固相支持体に固定化することができる。この場合、インキュベーション後にセクション5.1に記載の本発明のアニーリングしていない標識核酸分子は容易に除去される。残留するアニーリングした標識hVR1d核酸試薬の検出は、当該技術分野でよく知られた標準法を用いて行う。本発明の核酸分子がアニーリングしたhVR1d遺伝子配列は、hVR1d遺伝子変異が存在するか否かを決定するために正常なhVR1d遺伝子配列から予期されるアニーリングパターンと比較することができる。
【0141】
hVR1d遺伝子発現の定量的および定性的な側面もまたアッセイすることができる。たとえば、hVR1d遺伝子を発現することが知られている、または発現すると思われる細胞型または組織からのRNAを単離し、上記で記載したハイブリダイゼーション法またはPCR法を用いて試験することができる。単離した細胞は細胞培養液または患者に由来するものであってよい。培養液から採取した細胞の分析は、細胞ベースの遺伝子療法の一部として使用するために、またはhVR1d遺伝子の発現に対する化合物の影響を試験するために細胞を評価するうえで必要なステップである。そのような分析は、hVR1d遺伝子発現の活性化または不活化および別の仕方でスプライスされたhVR1d転写物の存在を含む、hVR1d遺伝子の発現パターンの定量的および定性的側面の両者を明らかにすることができる。
【0142】
そのような検出スキームの一つの態様において、目的とするRNA分子からcDNA分子を合成する(たとえば、RNA分子のcDNAへの逆転写により)。ついで、得られたcDNAの全部または一部をPCR増幅反応などの核酸増幅反応の鋳型として用いる。この方法の逆転写工程および核酸増幅工程において合成開始試薬(たとえば、プライマー)として用いる核酸試薬は、上記セクション5.1に記載の本発明のhVR1d核酸分子から選択する。そのような核酸試薬の好ましい長さは少なくとも9〜30ヌクレオチドである。
【0143】
増幅産物の検出のため、放射性標識または非放射性標識したヌクレオチドを用いて核酸増幅を行う。別法として、増幅産物が標準臭化エチジウム染色によりまたは他の適当な核酸染色プロトコール、たとえば定量的PCRを用いることにより視覚化されるように、充分な増幅産物を生成させる。
【0144】
そのようなRT−PCR法を用いてhVR1d転写物のサイズの差異(正常なまたは異常な別のスプライシングによる)を検出することができる。あるいは、そのような方法は、イオン機能不全障害を示すまたはそのような障害への素因を示す個体と比較した、正常な個体で検出される完全長および/または別の仕方でスプライスされたhVR1d転写物のレベルの定量的な差異を検出するのに用いることができる。
【0145】
特定の別の仕方でスプライスされた分子種の検出が望まれる場合には、そのような配列が存在しないと増幅が起こらないように適当なプライマーおよび/またはハイブリダイゼーションプローブを用いることができる。あるいは、図1Aおよび図1Bに示す配列を用い、利用すべきhVR1d転写物に特定のエクソンが存在するか不在であるかに応じて異なるサイズの断片を生成するプライマーを選択すべくプライマーペアを選択することができる。
【0146】
増幅法に代わる方法として、もしも充分な量の適当な細胞を得ることができるのであれば標準ノーザン分析を行うことができる。そのような方法を用い、hVR1d転写物の定量的な並びにサイズに関連した差異を検出することもできる。
さらに、hVR1d遺伝子発現アッセイをインシトゥで、すなわち、核酸の精製が必要ないように生検または切除から得た患者組織の組織切片(固定化したおよび/または凍結乾燥した)で直接、行うことができる。セクション5.1に記載の本発明の核酸分子をそのようなインシトゥ法のプローブおよび/またはプライマーとして用いることができる(たとえば、Nuovo, G. J., 1992, "PCR In Situ Hybridization: Protocols And Applications"、ラベンプレス、ニューヨークを参照)。
【0147】
5.4.1.2.hVR1d遺伝子産物の検出
上記で記載した野生型または変異体hVR1d遺伝子産物または保存されたその変化物またはペプチドに対する抗体もまた、イオンまたは陽イオン関連障害の診断および予後に用いることができる。そのような診断法は、hVR1d遺伝子発現レベルの異常の検出またはhVR1d遺伝子産物の構造および/または一時的な組織、細胞または細胞下の分布の異常の検出に用いることができる。抗体または抗体のフラグメントは、治療に有用な可能性のある化合物をスクリーニングしてhVR1d遺伝子発現およびhVR1dペプチド産生に対するその作用をインビトロで決定することができる。イオンおよび陽イオン関連障害に対して有用な作用を有する化合物を同定し、治療学的に有効な投与量を決定することができる。
【0148】
インビトロイムノアッセイを用いて、たとえばイオンまたは陽イオン関連障害に対する細胞ベースの遺伝子療法の効力を評価することができる。たとえば、hVR1dペプチドに対する抗体を用い、hVR1dペプチドを産生するように遺伝子工学により作製した細胞で達成されたhVR1d遺伝子発現レベルをインビトロで決定することができる。そのような分析は、治療的な効力をインビボで達成するのに必要な形質転換細胞の数の決定並びに遺伝子置換プロトコールの最適化を可能にするであろう。
【0149】
分析すべき組織または細胞型は、一般にhVR1d遺伝子を発現することが知られているかまたは発現すると思われるものを含む。使用するタンパク質単離法は、たとえば、Harlow, E.およびLane, D., 1988, "Antibodies: A Laboratory Manual"、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールドスプリングハーバー、ニューヨークに記載されているものであってよい。単離細胞は細胞培養液または患者から得ることができる。培養液から採取した細胞の分析は、細胞ベースの遺伝子療法の一部として用いるため、あるいはhVR1d遺伝子の発現に対する化合物の影響を試験するため、細胞の評価に必要な工程である。
【0150】
hVR1d遺伝子産物またはその保存された変化物またはペプチド断片の検出のための好ましい診断法は、たとえば、hVR1d遺伝子産物またはその保存された変化物(別の仕方でスプライスした転写物の結果である遺伝子産物を含む)またはペプチド断片を抗hVR1d遺伝子産物特異的抗体との反応性により検出するイムノアッセイを含む。たとえば、上記セクション5.3に記載のもののような抗体または抗体のフラグメントを用いてhVR1d遺伝子産物またはその保存された変化物またはそのペプチド断片の存在を定量的または定性的に検出することができる。抗体(またはそのフラグメント)はさらに、hVR1d遺伝子産物またはその保存された変化物またはそのペプチド断片のインシトゥ検出のため、免疫蛍光または免疫電子顕微鏡法として組織学的に用いることができる。インシトゥ検出は、患者から組織標本を採取し、ついで該組織標本に本発明の標識hVR1d抗体を加えることにより行う。抗体(またはフラグメント)は、生物学的試料の上に標識抗体(またはフラグメント)を重層することにより加えるのが好ましい。そのような手順の使用により、hVR1d遺伝子産物またはその保存された変化物またはペプチド断片の存在のみならず、調べた組織でのその分布をも決定することが可能になる。本発明を用い、そのようなインシトゥ検出を達成するために広範な組織学的方法(染色法など)のいずれをも改変することができることを当業者は容易に認識するであろう。
【0151】
hVR1d遺伝子産物またはその保存された変化物またはペプチド断片のイムノアッセイは、典型的に試料、たとえば生物学的流体、組織抽出物、新たに採取した細胞、または細胞培養液でインキュベートした細胞の溶解液を、hVR1d遺伝子産物またはその保存された変化物またはペプチド断片を同定しうる検出可能に標識した抗体の存在下でインキュベートし、ついで結合した抗体を当該技術分野でよく知られた多くの方法のいずれかにより検出することを含む。
【0152】
生物学的試料を、固相支持体または担体、たとえばニトロセルロース、または細胞、細胞粒子または可溶性タンパク質を固定化できる他の固相支持体と接触させ、固定化させる。ついで支持体を適当な緩衝液で洗浄し、ついで検出可能に標識したhVR1d遺伝子特異的抗体で処理する。ついで固相支持体を緩衝液で2度目の洗浄を行って未結合の抗体を除去する。ついで、固相支持体上の結合した標識の量を通常の手段により検出する。
【0153】
「固相支持体または担体」とは、抗原または抗体を結合することのできるあらゆる支持体を意図している。よく知られた支持体または担体としては、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および改変セルロース、ポリアクリルアミド、はんれい岩(gabbros)、および磁鉄鉱が挙げられる。担体の性質は、ある程度可溶性であるかまたは不溶性であってよい。支持体の材料は、結合した分子が抗原または抗体と結合することができる限り、実質的にあらゆる可能な構造的立体配置をとることができる。それゆえ、支持体の立体配置は、ビーズの場合のように球状であってもよいし、あるいは試験管の内部または棒の外部表面のように円筒状であってよい。あるいは、支持体表面はシート、試験片などのように平面であってよい。好ましい支持体としてはポリスチレンビーズが挙げられる。当業者であれば抗体または抗原を結合させるのに適した他の多くの担体を知っているであろうし、または日常的な実験によってそのような担体を確認することができるであろう。
【0154】
所定のロットの抗hVR1d遺伝子産物抗体の結合活性は、よく知られた方法に従って決定することができる。当業者であれば日常的な実験を用いることにより、各決定のための操作できるまたは最適のアッセイ条件を決定することができるであろう。
【0155】
hVR1d遺伝子産物特異的抗体を検出可能に標識できる方法の一つは、エンザイムイムノアッセイ(EIA)において抗体を酵素に結合させることである(Voller, A., "The Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)", 1978, Diagnostic Horizons 2: 1-7、マイクロバイオロジカル・アソシエーツ・クオータリー・パブリケーション、ウォーカースビル、メリーランド; Voller, A.ら、1978, J. Clin. Pathol. 31: 507-520; Butler, J. E. 1981, Meth. Enzymol. 73: 482-523; Maggio, E.(編), 1980, Enzyme Immunoassay、CRCプレス、ボカレイトン、フロリダ; Ishikawa, E.ら(編), 1981, Enzyme Immunoassay、科学書院、東京)。抗体に結合した酵素は、適当な基質、好ましくは発色原性基質と、たとえば分光分析、蛍光測定または可視的手段によって検出可能な化学的残基を生成するような仕方で反応するであろう。抗体を検出可能に標識するのに用いることのできる酵素としては、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌のヌクレアーゼ、デルタ−5−ステロイドイソメラーゼ、酵母のアルコールデヒドロゲナーゼ、アルファ−グリセリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼが挙げられるが、これらに限られるものではない。検出は酵素に対する発色原性基質を用いる比色法により行うことができる。検出はまた、基質の酵素反応の程度を同様に調製した標準との視覚的な比較によっても行うことができる。
【0156】
検出また、他のイムノアッセイのいずれを用いても行うことができる。たとえば、抗体または抗体フラグメントを放射性標識することにより、ラジオイムノアッセイ(RIA)を用いてhVR1d遺伝子ペプチドを検出することができる(たとえば、Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986を参照)。放射性同位体は、ガンマカウンターやシンチレーションカウンターの使用などの手段によって、またはオートラジオグラフィーによって検出することができる。
【0157】
抗体を蛍光化合物で標識することもできる。蛍光標識した抗体を適当な波長の光に暴露すると、その存在を蛍光によって検出することができる。最も一般的に用いられる蛍光標識化合物は、フルオレセインイソシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、o−フタルアルデヒドおよびフルオレスカミンである。
抗体はまた、152Euや他のランタニド系列などの蛍光放出金属を用いても検出可能に標識することができる。これら金属は、ジエチレントリアミン四酢酸(DTPA)やエチレンジアミン四酢酸(EDTA)などの金属キレート形成基を用いて抗体に結合させることができる。
【0158】
抗体はまた、化学ルミネセンス化合物に結合させることによって検出可能に標識することができる。ついで、化学ルミネセンス標識抗体の存在を、化学反応の際に生成するルミネセンスの存在を検出することによって決定する。特に有用な化学ルミネセンス標識化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、セロマティック(theromatic)アクリジンエステル、イミダゾール、アクリジン塩およびシュウ酸エステルである。
【0159】
同様に生物発光化合物を本発明の抗体を標識するのに用いることができる。生物発光は生物系で見出される化学ルミネセンスのタイプであり、触媒タンパク質が化学ルミネセンス反応の効率を増大させるものである。生物発光タンパク質の存在は、ルミネセンスの存在を検出することにより決定する。標識の目的のために重要な生物発光化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびエクオリンである。
【0160】
5.4.2.hVR1d活性を変調する化合物のスクリーニングアッセイ
スクリーニングアッセイを用いてhVR1d活性を変調する化合物を同定することができる。これら化合物としては、ペプチド、小さな有機または無機分子または巨大分子、たとえば核酸分子またはタンパク質などが挙げられ(これらに限られるものではない)、たとえばイオンまたは陽イオン関連障害の制御、神経伝達物質や他の細胞制御因子の放出などの細胞プロセスの変調、細胞の活性化または制御、細胞死および細胞膜特性の変化に利用することができる。これら化合物はまた、たとえば、hVR1d遺伝子産物、すなわちhVR1dタンパク質およびポリペプチドの生物学的機能の解明、これら生物学的機能の変調、およびイオンまたは陽イオン関連障害の症状の改善にも有用である。
【0161】
本発明の組成物は、これら化合物を1またはそれ以上含む医薬組成物を包含する。そのような医薬組成物は、下記セクション5.5で検討するようにして調合することができる。
さらに詳細には、これら化合物は、hVR1d遺伝子産物に結合する化合物、hVR1d遺伝子産物と相互作用する他のタンパク質に結合するおよび/または他のタンパク質とのhVR1d遺伝子産物の相互作用を妨害する化合物、およびhVR1d遺伝子の活性を変調する、すなわちhVR1d遺伝子発現のレベルを変調するおよび/またはhVR1d遺伝子産物またはタンパク質活性のレベルを変調する化合物を包含する。
【0162】
たとえば、アッセイを利用してhVR1d遺伝子の制御配列、たとえばプロモーター配列に結合する化合物を同定することができ(たとえば、Platt, K. A., 1994, J. Biol. Chem. 269: 28558-28562を参照)、そのような化合物はhVR1d遺伝子発現のレベルを変調することができる。さらに、機能的なアッセイを用いてhVR1d遺伝子産物活性を変調する化合物をスクリーニングすることができる。そのようなアッセイでは、hVR1dタンパク質またはポリペプチドの生物学的活性または機能に関するアゴニスト活性またはアンタゴニスト活性について、たとえばイオンまたは陽イオンの細胞内レベルの変化、制御因子放出の変化、または本発明のhVR1dタンパク質およびポリペプチドの他の活性または機能について、化合物をスクリーニングする。
【0163】
好ましい態様に従い、Ca2+流入(flux)アッセイを用いてhVR1d発現宿主細胞におけるカルシウムの取り込みをモニターすることができる。宿主細胞にCa2+感受性の蛍光標識染料(たとえば、Fluo-4、Fluo-3、Indo-1またはFura-2)で前もって負荷する、すなわち、細胞内カルシウムを染料で蛍光標識し、たとえば標識カルシウムの細胞内レベルに対する化合物の影響を決定し、対照細胞、たとえば目的とする化合物への暴露を欠く細胞の細胞内レベルと比較する。アゴニスト活性、すなわちhVR1d活性に対して刺激性の変調効果を有する化合物は、hVR1d発現細胞と接触させたときに対照細胞と比較して細胞内カルシウムの増大をもたらす化合物であり、一方、hVR1d活性に対してアンタゴニスト変調効果を有する化合物は、細胞内カルシウムの低減をもたらす化合物であろう。
【0164】
他のイオンのレベルまたは流入に対する化合物の効果をモニターする機能性のアッセイも同様に行うことができる;たとえば、カリウムのレベルはルビジウムの流入を用いてモニターすることができる。
スクリーニングアッセイはまた、本発明hVR1d遺伝子産物に結合しうる化合物を同定すべくデザインすることもできる。そのような化合物は、たとえば、野生型および/または変異体のhVR1d遺伝子産物の活性の変調、hVR1d遺伝子産物の生物学的機能の解明、および正常なhVR1d遺伝子産物の相互作用を妨害する化合物の同定のためのスクリーニングに有用であり、あるいはそれ自体でそのような相互作用を妨害することができる。
【0165】
hVR1d遺伝子産物に結合する化合物を同定するそのようなスクリーニングアッセイの原理は、hVR1d遺伝子産物と被験化合物との反応混合物を、これら2つの成分が相互作用して(すなわち結合して)複合体を形成するのに充分な条件下および時間で調製することを含み、該複合体は一過性の複合体を表してよく、反応混合物中で除去および/または検出することができる。たとえば、一つのアッセイは、hVR1d遺伝子産物または被験物質を固相に固定させ、ついで反応の終点で固相上に固定されたhVR1d遺伝子産物/被験化合物複合体を検出することを含む。そのような方法の一つの態様では、hVR1d遺伝子産物を固相表面に固定させ、被験化合物(固定していない)を直接または間接に標識する。
【0166】
固相表面上に固定された複合体の検出は、多くの仕方で行うことができる。前もって固定化していない成分を前もって標識してある場合は、固相表面上に固定化された標識の検出は複合体が形成されたことを示す。前もって固定化していない成分を前もって標識していない場合は、たとえば、前もって固定化されていない成分に特異的な標識抗体(該抗体は、今度は直接標識するかまたは標識抗Ig抗体で間接的に標識することができる)を用いて固相表面上に固定された複合体を検出することができる。
【0167】
別法として、反応は液相で行うことができ、反応生成物を未反応の成分から分離し、ついで、たとえば、溶液中に生成した複合体を固定させるhVR1d遺伝子産物または被験化合物に特異的な固定化抗体、および固定された複合体を検出する可能な複合体の他の成分に特異的な標識抗体を用い、複合体を検出することができる。
【0168】
hVR1d遺伝子産物活性を変調する化合物にはまた、hVR1d遺伝子産物と相互作用するタンパク質に結合する化合物も含まれる。これら変調化合物は、まずhVR1d遺伝子産物と相互作用するタンパク質を、たとえばタンパク質−タンパク質相互作用を検出するために当該技術分野で知られた標準法、たとえば同時免疫沈降、架橋および勾配またはクロマトグラフィーカラムによる同時精製により同定することによって同定することができる。これらのような方法を用いることにより、上記に記載した本発明のhVR1d遺伝子産物またはポリペプチドと相互作用するタンパク質を単離することができる。
【0169】
単離されたら、そのようなタンパク質は同定することができ、今度は標準法と組み合わせて用いて該タンパク質が相互作用するさらなるタンパク質を同定するのに用いることができる。たとえば、hVR1d遺伝子産物と相互作用するタンパク質のアミノ酸配列の少なくとも一部を当業者によく知られた方法、たとえばエドマン分解法(たとえば、Creighton, 1983, "Proteins: Structures and Molecular Principles", W. H. Freeman & Co.、ニューヨーク、pp. 34-49を参照)を用いて確認することができる。かくして得られたアミノ酸配列は、そのようなタンパク質をコードする遺伝子配列をスクリーニングするのに用いることのできるオリゴヌクレオチド混合物の作製のガイドとして用いることができる。スクリーニングは、たとえば、標準ハイブリダイゼーション法またはPCR法によって行うことができる。オリゴヌクレオチド混合物の作製およびスクリーニングの方法はよく知られている(たとえば、Ausubel、上掲、およびPCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, 1990, Innis, M.ら編、アカデミックプレス、ニューヨークを参照)。
【0170】
さらに、hVR1d遺伝子産物またはポリペプチドと相互作用するタンパク質をコードする遺伝子の同時同定という結果となる方法を用いることができる。これら方法は、たとえば、λgt11ライブラリーの抗体プロービングのよく知られた方法と同様の仕方でhVR1dタンパク質またはポリペプチドを用い、発現ライブラリーを標識hVR1dタンパク質またはポリペプチドでプロービングすることを含む。タンパク質相互作用をインビボで検出する一つの方法は、2ハイブリッド系である。この系の一つの版がChienら、1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 9578-9582に記載されており、Clontech(パロアルト、カリフォルニア)から市販されている。
【0171】
さらに、hVR1dとその相互作用または結合パートナーとの相互作用を妨害する化合物(上記で決定したもの)は、hVR1d遺伝子産物(変異体hVR1dタンパク質およびポリペプチドを含む)の活性を制御するのに有用である。そのような化合物としては、上記遺伝子産物に結合する分子、たとえばペプチドなどが挙げられるが、これらに限られるものではない。
【0172】
hVR1d遺伝子産物とその相互作用パートナーとの相互作用を妨害する化合物の同定に用いるアッセイ系の基本原理には、hVR1d遺伝子産物と相互作用パートナーとを含む反応混合物を、これら2つが相互作用および結合して複合体を形成するのに充分な条件下および時間で調製することが含まれる。抑制活性を有する化合物を試験するには、反応混合物を被験化合物の存在下および不在下で調製する。被験化合物は最初から反応混合物に含まれていてもよいし、あるいはhVR1d遺伝子産物およびその相互作用パートナーを加えた後の時点で加えてもよい。対照の反応混合物は被験化合物なしでまたはプラシーボとともにインキュベートする。ついで、hVR1d遺伝子産物と相互作用パートナーとの複合体の形成を検出する。複合体が対照反応液では形成されるが被験化合物を含む反応混合物では形成されないことは、該化合物がhVR1d遺伝子産物と相互作用パートナーとの相互作用を妨害することを示している。さらに、被験化合物と正常なhVR1d遺伝子産物とを含む反応混合物中での複合体の形成を、被験化合物と変異体hVR1d遺伝子産物とを含む反応混合物中での複合体形成と比較することもできる。この比較は、変異体のhVR1dタンパク質の相互作用は妨害するが正常なhVR1dタンパク質の相互作用は妨害しない化合物を同定するのが望まれる場合に重要である。
【0173】
hVR1d遺伝子産物と相互作用パートナーとの相互作用を妨害する化合物のアッセイは、不均一または均一形態で行うことができる。不均一アッセイは、hVR1d遺伝子産物かまたは結合パートナーのいずれかを固相上に固定させ、反応の終了時点で固相上に固定された複合体を検出することを含む。均一アッセイでは、全反応を液相で行う。いずれの方法においても、反応物の添加の順序は試験すべき化合物に関する様々な情報を得るために変えることができる。たとえば、hVR1d遺伝子産物と相互作用パートナーとの相互作用をたとえば競合反応により妨害する被験化合物は、反応を該被験物質の存在下で行うことによって、すなわち、被験物質をhVR1d遺伝子産物および相互作用パートナーよりも先にまたは同時に添加することによって同定することができる。あるいは、前もって生成した複合体を破壊する被験化合物、たとえば、一層高い結合定数によって複合体から成分の一つを置換する化合物は、複合体が生成した後に反応混合物に被験化合物を加えることによって試験することができる。様々な形態を以下に簡単に記載する。
【0174】
不均一アッセイ系では、hVR1d遺伝子産物かまたは相互作用パートナーのいずれかを固相表面に固定し、一方、固定されていない分子種は直接かまたは間接に標識する。実際にはマイクロタイタープレートを都合よく利用できる。固定した分子種は、非共有結合的な付着または共有結合的な付着により固定化できる。非共有結合的な付着は、固相表面をhVR1d遺伝子産物または相互作用パートナーの溶液でコーティングし、ついで乾燥することにより簡単に行うことができる。あるいは、固定させるべき分子種に特異的な固定化抗体を用いて該分子種を固相表面に固定することができる。固相表面は前もって調製し、貯蔵しておくことができる。
【0175】
アッセイを行うには、固定化した分子種のパートナーを被験化合物とともにまたは被験化合物なしでコーティング表面に暴露させる。反応完了後、未反応の成分を除去すると(たとえば洗浄により)、生成した複合体は固相表面に固定化されて残るであろう。固相表面上に固定された複合体の検出は、多くの仕方で行うことができる。固定していない分子種を前もって標識してある場合には、固相表面上に固定化された標識の検出は複合体が形成されたことを示している。固定していない分子種を前もって標識していない場合には、たとえば、最初に固定化していない分子種に特異的な標識抗体(該抗体は、今度は直接標識するかまたは標識抗Ig抗体で間接的に標識することができる)を用い、間接標識を用いてて固相表面上に固定された複合体を検出することができる。反応成分の添加の順序に応じて、複合体形成を抑制する化合物あるいは前もって生成した複合体を破壊する化合物を検出することができる。
【0176】
別法として、反応は被験化合物の存在下または不在下で液相にて行うことができ、反応生成物を未反応成分から分離し、ついで、たとえば溶液中に生成した複合体を固定する相互作用成分の一つに特異的な固定化抗体、および固定した複合体を検出する他のパートナーに特異的な標識抗体を用いて複合体を検出する。この場合も、反応物の添加の順序に応じて、複合体形成を抑制する化合物あるいは前もって生成した複合体を破壊する化合物を検出することができる。
【0177】
別の態様において、hVR1d遺伝子タンパク質と相互作用パートナーとの前もって生成した複合体であって、hVR1d遺伝子産物かまたはその相互作用パートナーのいずれかが標識されているが該標識によって生成されるシグナルは複合体の形成によって停止されるものを調製する(たとえば、Rubensteinによる米国特許第4109496号(この方法をイムノアッセイに利用している)を参照)。前もって生成した複合体から分子種の一方と競合し置換する被験物質の添加は、バックグラウンドを超えるシグナルの生成という結果となるであろう。このようにしてhVR1d遺伝子タンパク質/相互作用パートナーの相互作用を妨害する被験物質を同定することができる。
【0178】
本発明の別の態様において、これら同じ方法を、完全長のタンパク質の一方または両者に代えてhVR1dタンパク質および/または相互作用パートナーの結合ドメインに対応するペプチド断片を用いて行うことができる。当該技術分野で日常的に行われている多くの方法のいずれをも用いて結合部位を同定および単離することができる。これら方法としては、これらタンパク質の一つをコードする遺伝子の突然変異誘発および同時免疫沈降アッセイにおける結合の破壊のスクリーニングが挙げられるが、これに限られるものではない。ついで、複合体中の第二の分子種をコードする遺伝子における補償変異を選択することができる。各タンパク質をコードする遺伝子の配列分析は、相互作用、すなわち結合に関与しているタンパク質の領域に対応する変異を明らかにするであろう。あるいは、このセクションの上記で記載した方法を用いて一方のタンパク質を固相表面に固定させ、その標識した相互作用パートナーであってトリプシンなどのタンパク質分解酵素で処理しておいたものと相互させる(たとえば、結合させる)ことができる。洗浄後、相互作用する(たとえば、結合する)ドメインを含む短い標識ペプチドは固相物質に結合して残り、これを単離し、アミノ酸シークエンシングにより同定することができる。また、細胞内結合パートナーをコードする遺伝子が得られたら、タンパク質のペプチド断片を発現するように短い遺伝子セグメントを遺伝子工学により作製し、ついで該遺伝子セグメントを結合活性について試験し、精製または合成することができる。
【0179】
本発明のヒトHVR1dポリペプチドおよび/またはペプチドまたはその免疫学的断片またはオリゴペプチドは、様々な医薬スクリーニング法において治療用医薬または化合物をスクリーニングするのに用いることができる。そのようなスクリーニングアッセイに用いる断片は、溶液中に遊離状態であるか、固相支持体に付着されているか、細胞表面に保持されているか、または細胞内に位置していてよい。イオンチャンネルタンパク質と試験すべき試薬との間での結合複合体の形成の活性の低減または消滅を測定することができる。それゆえ、本発明は、本発明のHVR1dポリペプチドまたはその結合性の断片への特異的結合親和性について複数の化合物をスクリーニングまたは評価する方法であって、複数の化合物を用意し、複数の化合物のそれぞれをHVR1dポリペプチドまたはその結合性のペプチド断片と適当な条件下、結合させるに充分な時間にて混合し、ついで該複数の被験化合物のそれぞれへのHVR1dポリペプチドまたはペプチドの結合を検出し、それによってHVR1dポリペプチドまたはペプチドに特異的に結合する化合物を同定することを含む方法を提供する。
【0180】
新規なHVR1dポリペプチドおよび/またはペプチドの活性を変調する化合物の同定方法が本発明によって提供され、該方法は、潜在的なまたは候補化合物またはカルパインの生物学的活性の医薬モデュレーターを、HVR1dポリペプチドまたはペプチド、たとえば配列番号2に示すHVR1dアミノ酸配列と混合し、HVR1dポリペプチドまたはペプチドの生物学的活性に対する候補化合物または医薬モデュレーターの作用を測定することを含む。そのような測定しうる作用としては、たとえば、物理的な結合相互作用;適当なカルパイン基質を開裂する能力;天然のおよびクローニングしたHVR1d発現細胞株に対する作用;および他のカルパイン媒体された生理学的測定に対するモデュレーターの作用が挙げられる。
【0181】
本発明の新規なHVR1dポリペプチドの生物学的活性を変調する化合物の他の同定方法は、潜在的なまたは候補化合物またはカルパインの生物学的活性の医薬モデュレーターを、HVR1dポリペプチドを発現する宿主細胞と混合し、HVR1dポリペプチドの生物学的活性に対する該候補化合物または医薬モデュレーターの作用を測定することを含む。宿主細胞はまた、たとえば誘導性の発現によりHVR1dポリペプチドを発現するように誘導させることもできる。HVR1dポリペプチドに対する所定のモデュレーター候補の生理的作用を測定することもできる。それゆえ、特定のカルパインモデュレーターのための細胞アッセイは、HVR1dポリペプチドの身体的(physical)な生物学的活性の直接的な測定または定量であってもよいし、または生理的作用の測定または定量であってもよい。そのような方法では、本明細書に記載のHVR1dポリペプチドを用いるか、または本明細書に記載の発現ベクターを含む適当な宿主細胞中で過剰発現された組換えHVR1dポリペプチドを用いるのが好ましく、その際、該HVR1dポリペプチドは発現され、過剰発現され、または制御されない発現を受ける。
【0182】
本発明の他の側面は、HVR1dポリペプチドの生物学的活性を変調しうる化合物のスクリーニング方法であって、HVR1dポリペプチドまたはその機能性のペプチドまたは一部(たとえば、配列番号2)をコードする核酸配列を含む発現ベクター含む宿主細胞を用意し、モデュレーター化合物の不在下で発現されたHVR1dポリペプチドの生物学的活性を決定し、該細胞をモデュレーター化合物と接触させ、ついで該モデュレーター化合物の存在下で発現されたHVR1dポリペプチドの生物学的活性を決定することを含む方法を包含する。そのような方法において、モデュレーター化合物の存在下およびモデュレーター化合物の不在下でのHVR1dポリペプチドの活性の差異は該化合物の変調作用を示している。
【0183】
本発明によるアッセイにおいて、本質的にいかなる化合物をも潜在的なモデュレーターまたはリガンドとして用いることができる。カルパインモデュレーターとして試験される化合物は、いかなる小さな化合物、または生物学的存在(たとえば、タンパク質、糖、核酸、脂質)であってもよい。被験化合物は、一般に小さな化学的分子またはペプチドであろう。一般に、潜在的なモデュレーターとして用いる化合物は水溶液または有機(たとえば、DMSOベース)溶液に溶解させることができる。アッセイ工程を自動化し、あらゆる都合のよい入手原から化合物を提供することによって、大きな化学ライブラリーをスクリーニングすべくアッセイをデザインできる。アッセイは典型的に平行して、たとえば、ロボットアッセイにおいてマイクロタイタープレート上でマイクロタイター形態で行う。化合物の供給者としては、たとえば、Sigma(セントルイス、ミズーリ)、Aldrich(セントルイス、ミズーリ)、Sigma-Aldrich(セントルイス、ミズーリ)、Fluka Chemika-Biochemica Analytika(ブーフス、スイス)を含む多くの供給者がある。また、化合物を当該技術分野で知られた方法により合成してもよい。
【0184】
本明細書に記載した新規なHVR1dポリヌクレオチドおよびポリペプチドのモデュレーターの検出には、とりわけ高処理量スクリーニング法を想定することができる。そのような高処理量スクリーニング法は、典型的に多数の潜在的な治療用化合物(たとえば、リガンドまたはモデュレーター化合物)を含むコンビナトリアル化学またはペプチドライブラリーを用意することを含む。ついで、そのようなコンビナトリアル化学ライブラリーまたはリガンドライブラリーを1またはそれ以上のアッセイでスクリーニングして、所望の特徴的な活性を示すライブラリーの成員(たとえば、特定の化学種またはサブクラス)を同定する。かくして同定した化合物は、通常のリード化合物として用いるか、またはそれ自体、潜在的なまたは実際の治療剤として用いることができる。
【0185】
コンビナトリアル化学ライブラリーは、多数の化学構築ブロック(たとえば、アミノ酸などの試薬)を組み合わせることにより、化学的合成かまたは生物学的合成のいずれかにより生成した多様な化合物の集合である。一例として、一次コンビナトリアルライブラリー、たとえばポリペプチドまたはペプチドライブラリーは、所定の化合物の長さ(すなわち、ポリペプチドまたはペプチド化合物におけるアミノ酸数)についてあらゆる可能な仕方で化学的構築ブロックのセットを組み合わせることによって生成する。そのような化学的構築ブロックのコンビナトリアル混合によって、何百万という化合物を合成することができる。
【0186】
コンビナトリアル化学ライブラリーの調製およびスクリーニングは、関連技術分野の当業者によく知られている。コンビナトリアルライブラリーとしては、ペプチドライブラリー(たとえば、米国特許第5,010,175号;Furka, 1991, Int. J. Pept. Prot. Res., 37: 487-493;およびHoughtonら、1991, Nature, 354: 84-88)が挙げられるが、これに限られるものではない。化学的な多様なライブラリーを作製するための他の化学も用いることができる。化学的な多様なライブラリー化学の制限されない例としては、ペプトイド(peptoids)(PCT公開WO91/019735)、コードしたペプチド(PCT公開WO93/20242)、ランダムバイオ−オリゴマー(PCT公開WO/00091)、ベンゾジアゼピン(米国特許第5,288,514号)、ダイバーソマー(diversomers)、たとえばヒダントイン、ベンゾジアゼピンおよびジペプチド(Hobbsら、1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6909-6913)、ビニル様(vinylogous)ポリペプチド(Hagiharaら、1992, J. Amer. Chem. Soc., 114: 6568)、グルコースの足場(scaffolding)を有する非ペプチド性のペプチドミメチック(Hirschmannら、1992, J. Amer. Chem. Soc., 114: 9217-9218)、小化合物ライブラリーの同族有機合成(analogous organic synthesis of small compound libraries)(Chenら、1994, J. Amer. Chem. Soc., 116: 2661)、オリゴカルバメート(Choら、1993, Science, 261: 1303)、および/またはペプチド性ホスホネート(Campbellら、1994, J. Org. Chem., 59: 658)、核酸ライブラリー(Ausbel, BergerおよびSambrook、全て上記を参照)、ペプチド核酸ライブラリー(米国特許第5,539,083号)、抗体ライブラリー(たとえば、Vaughnら、1996, Nature Biotechnology, 14(3): 309-314およびPCT/US96/10287)、炭水化物ライブラリー(たとえば、Liangら、1996, Science, 274-1520-1522および米国特許第5,593,853号)、小有機分子ライブラリー(たとえば、ベンゾジアゼピン、Baum C & EN, Jan. 18, 1993, 33頁;および米国特許第5,288,514号;イソプレノイド、米国特許第5,569,588号;チアゾリジノンおよびメタチアザノン、米国特許第5,549,974号;ピロリジン、米国特許第5,525,735号および同第5,519,134号;モルホリノ化合物、米国特許第5,506,337号;など)が挙げられる。
【0187】
コンビナトリアルライブラリーの調製用のデバイスは市販されている(たとえば、357 MPS, 390 MPS, Advanced Chem Tech、ルイスビル、ケンタッキー;Symphony, Rainin、ウォバーン、マサチューセッツ;433A Applied Biosystems、フォスターシティー、カリフォルニア;9050 Plus, Millipore、ベッドフォード、マサチューセッツ)。さらに、非常に多くのコンビナトリアルライブラリーが市販されている(たとえば、ComGenex、プリンストン、ニュージャージー;Asinex、モスクワ、ロシア;Tripos, Inc.、セントルイス、ミズーリ;ChemStar, Ltd.、モスクワ、ロシア;3D Pharmaceuticals、エクストン、ペンシルベニア;Martek Biosciences、コロンビア、メリーランドなど)。
【0188】
一つの態様において、本発明は、イオンチャンネルを発現する細胞または組織を固相物質に結合させた高処理量形態の固相ベースのインビトロアッセイを提供する。そのような高処理量アッセイでは、数千までの異なるモデュレーターまたはリガンドを1日でスクリーニングすることが可能である。とりわけ、選択した潜在的なモデュレーターに対してマイクロタイタープレートの各ウエルを用いて別々のアッセイを行うことができるし、または濃度もしくはインキュベーション時間の影響が観察される場合には各5〜10のウエルを単一のモデュレーターを試験するのに用いることができる。それゆえ、単一のマイクロタイタープレートは約96のモデュレーターをアッセイすることができる。1536ウエルのプレートを用いる場合には、単一のプレートは約100〜約1500の異なる化合物を容易にアッセイすることができる。1日に幾つかの異なるプレートをアッセイすることが可能である;それゆえ、たとえば、記載した一体系を用いて約6,000〜20,000までの異なる化合物のアッセイスクリーニングが可能である。
【0189】
本発明の他の側面において、本発明はスクリーニングおよび小分子(たとえば、医薬)検出アッセイを包含し、該アッセイは所定のタンパク質、たとえばHVR1dポリペプチドまたはペプチドに結合することのできる小分子の検出および同定を含む。特に好ましいのは高処理量スクリーニング法に適したアッセイである。
そのような結合ベースの検出、同定、またはスクリーニングアッセイでは、機能性のアッセイは一般に必要とされない。必要なのは、標的タンパク質(好ましくは実質的に精製したもの)、および化合物(たとえば、リガンド、医薬、小分子)のライブラリーまたはパネルまたは該タンパク質標的への結合についてスクリーニングまたはアッセイすべき生物学的材料だけである。好ましくは、標的タンパク質に結合する大抵の小分子は、該タンパク質の機能性の領域または部位への優先的な一層高い親和性結合のために何らかの仕方で活性を変調するであろう。
【0190】
そのようなアッセイの例は、Pantolianoらの米国特許第6,020,141号および同第6,036,920号に記載されている蛍光ベースのサーマルシフトアッセイ(3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc.、3DP、エクストン、ペンシルベニア)である(J. Zimmerman, 2000, Gen. Eng. News, 20(8)をも参照)。このアッセイは、タンパク質−医薬またはリガンド複合体の熱変性曲線を分析することにより、結合の親和性決定に基づいて発現された(好ましくは精製した)イオンチャンネルポリペプチドに結合する小分子(たとえば、医薬、リガンド)の検出を可能にする。この方法により決定した医薬または結合分子は、所望なら本明細書に記載したもののような方法によりさらにアッセイして該分子が標的タンパク質の機能または活性に影響を及ぼしたり変調するか否かを決定することができる。
【0191】
HVR1dポリペプチドまたはペプチドを精製して生物学的結合またはリガンド結合活性を測定するため、採取源は全細胞溶解液であってよく、これは標準プロテアーゼインヒビターの存在下で連続的に凍結−解凍サイクル(たとえば、1〜3サイクル)を行うことによって調製することができる。HVR1dポリペプチドは、標準的なタンパク質精製法、たとえば以下に記載する特異的な抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより、またはこれも本明細書に記載した組換えHVR1dポリペプチド分子中に遺伝子工学により組み込んだエピトープタグに特異的なリガンドにより、部分的または完全に精製することができる。ついで、結合活性を本明細書に記載のようにして測定することができる。
【0192】
本発明によって提供される方法によって同定され、本発明によるHVR1dポリペプチドの生物学的活性または生理機能を変調または制御する化合物は、本発明の好ましい態様である。そのような変調化合物は、本明細書に記載の方法によって同定した化合物の治療学的有効量を新規なHVR1dポリペプチドによって媒体される状態の治療を必要とする個体に投与することにより、そのような状態を処置するための治療法に用いることができることが想定される。
さらに、本発明は、本発明のHVR1dポリペプチドによって媒体される疾患、障害、または状態の治療を必要とする個体の治療方法を提供し、該方法は、本明細書に記載の方法によって同定したHVR1d変調化合物の治療学的有効量を個体に投与することを含む。
【0193】
5.4.3.イオンチャンネル関連障害の治療方法および組成物
本発明はまた、hVR1d遺伝子産物発現または機能によって媒体または制御される障害または細胞プロセス、たとえば、hVR1dによって媒体される細胞活性化、シグナル伝達、細胞制御因子の放出などの治療または変調のための方法および組成物にも関する。さらに、hVR1dエフェクター機能はそのような方法および組成物により変調することができる。
【0194】
本発明の方法は、hVR1d遺伝子および遺伝子産物活性を変調する方法を包含する。ある場合には治療はhVR1d活性の増大、アップレギュレーションまたは活性化を必要とするであろうし、また他の場合には治療はhVR1d活性の低減、ダウンレギュレーションまたは抑制を必要とするであろう。「増大」および「低減」とは、変調処理の不在下での目的とする細胞型でのhVR1d活性と比較したhVR1d活性の差異レベルをいう。hVR1d活性の低減のための方法は以下のセクション5.4.3.1で検討する。hVR1d活性の増大のための方法は以下のセクション5.4.3.2で検討する。実施した特定の仕方に応じてhVR1d活性を増大または低減させうる方法は、以下のセクション5.4.3.3で検討する。
【0195】
5.4.3.1.hVR1d活性を低減する方法
イオンチャンネル/イオンホメオスタシス障害、たとえば、CNS障害、心臓障害または高カルシウム血症の好結果の治療は、hVR1d活性を低減させる方法によってもたらすことができる。活性の低減は、たとえば、hVR1d遺伝子産物(すなわち、タンパク質)の活性を直接低減させるか、および/またはhVR1d遺伝子発現のレベルを低減させることによって達成することができる。
【0196】
たとえば、上記セクション5.4.2に記載のアッセイにより同定したものなどのhVR1d遺伝子産物の活性を低減させる化合物を本発明に従って用い、イオンチャンネル/イオンホメオスタシス障害に伴う症状を改善することができる。上記で検討したように、そのような化合物としては、ペプチド(可溶性のペプチドを含む)、および小さな有機または無機分子が挙げられ(これらに限られるものではない)、hVR1dアンタゴニストと称する。そのような化合物の有効量および投与方法の決定法は、以下のセクション5.5に記載する。
【0197】
さらに、hVR1d遺伝子発現を抑制するアンチセンスおよびリボザイム分子もまたhVR1d遺伝子発現のレベルを低減させるのに用いることができ、それゆえ存在するhVR1d遺伝子産物のレベルを有効に低減させ、それによってhVR1dタンパク質活性のレベルを低減させることができる。さらに、三重らせん分子をhVR1d遺伝子発現レベルの低減に用いることができる。そのような分子は、野生型か、または適当な場合は変異体の標的遺伝子活性のいずれかを低減または抑制すべくデザインすることができる。そのような分子の産生および使用法は当業者によく知られている。
【0198】
アンチセンス法は、hVR1d遺伝子のmRNAに相補的なオリゴヌクレオチド(DNAかまたはRNAのいずれか)のデザインを含む。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、相補的なhVR1d遺伝子のmRNA転写物に結合し、翻訳を妨害するであろう。絶対的な相補性は好ましいが必要ではない。本明細書においてRNAの一部に「相補的な」配列とは、該RNAにハイブリダイズして安定な複合体を形成するに充分な相補性を有する配列を意味する;二本鎖アンチセンス核酸の場合には、該二本鎖の一本鎖を試験するか、または三本鎖の形成をアッセイすることができる。ハイブリダイズする能力は、相補性の程度およびアンチセンス核酸の長さの両者に依存するであろう。一般に、ハイブリダイズさせる核酸が長くなればなるほど、RNAとミスマッチする一層多くの塩基が含まれていてよく、依然として安定な二本鎖(または場合によっては三本鎖)を形成する。当業者は、ハイブリダイズした複合体の融点を決定する標準法の使用により、容認できるミスマッチの程度を確認することができる。
【0199】
メッセージの5'末端、たとえばAUG開始コドンまでおよび該コドンを含む5'非翻訳配列に相補的なオリゴヌクレオチドは、翻訳の抑制において最も有効に作用するに違いない。しかしながら、最近、mRNAの3'非翻訳配列に相補的な配列も同様にmRNAの翻訳の抑制において有効であることが示されている。一般に、Wagner, R., 1994, Nature 372: 333-335を参照。それゆえ、たとえば、図1に示すhVR1d.1またはhVR1d.2の核酸の5'かまたは3'のいずれかの非翻訳非コード領域に相補的なオリゴヌクレオチドを、内生hVR1d遺伝子のmRNAの翻訳を抑制するためのアンチセンス法に用いることができるであろう。
【0200】
mRNAの5'非翻訳領域に相補的なオリゴヌクレオチドは、AUG開始コドンの相補鎖を含んでいるべきである。mRNAのコード領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、それほど有効でない翻訳のインヒビターであるが、本発明に従って用いることができるであろう。標的または経路遺伝子のmRNAの5'、3'またはコード領域のいずれにハイブリダイズすべくデザインされているかに拘わらず、アンチセンス核酸は長さが少なくとも6ヌクレオチドでなければならず、好ましくはオリゴヌクレオチドは長さが6〜約50ヌクレオチドの範囲である。特別の側面において、オリゴヌクレオチドは少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも25ヌクレオチドまたは少なくとも50ヌクレオチドである。
【0201】
標的配列の選択の如何に拘わらず、まずインビトロでの研究を行ってアンチセンスオリゴヌクレオチドが遺伝子発現を抑制する能力を定量するのが好ましい。これらの研究は、アンチセンスによる遺伝子抑制とオリゴヌクレオチドの非特異的な生物学的作用とを識別する対照を用いるのが好ましい。また、これらの研究では標的RNAまたはタンパク質のレベルを内部対照RNAまたはタンパク質のレベルと比較するのが好ましい。さらに、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて得られた結果を対照のオリゴヌクレオチドを用いて得られた結果と比較するのが好ましい。対照オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドとほぼ同じ長さであること、および対照オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列は標的配列への特異的なハイブリダイゼーションを妨げるに必要なもの以上にはアンチセンス配列と異なっていないのが好ましい。
【0202】
オリゴヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖の、DNAまたはRNAまたはそのキメラな混合物または誘導体または修飾形であってよい。オリゴヌクレオチドは、たとえば、分子の安定性、ハイブリダイゼーションなどを向上させるため、塩基残基、糖残基、またはリン酸骨格を修飾することができる。
オリゴヌクレオチドはまた、ペプチド(たとえば、宿主細胞レセプターをインビボでターゲティングするため)や細胞膜(たとえば、Letsingerら、1989, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 6533-6556; Lemaitreら、1987, Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 648-652;PCT出願WO88/09810を参照)または血液脳関門(たとえば、PCT出願WO89/10134)を通した輸送を容易にする試薬、またはハイブリダイゼーションにより駆動される(hybridization-triggered)開裂試薬(たとえば、Krolら、1988, BioTechniques 6: 958-976を参照)またはインターカレート剤(たとえば、Zon, 1988, Pharm. Res. 5: 539-549を参照)などの他の追加基を含んでいてよい。たとえば、オリゴヌクレオチドは他の分子、たとえば、ペプチド、ハイブリダイゼーションにより駆動される架橋剤、輸送試薬、ハイブリダイゼーションにより駆動される開裂試薬などにコンジュゲートすることができる。
【0203】
本発明のオリゴヌクレオチドは、当該技術分野で知られた標準法により、たとえば自動DNA合成機(Biosearch, Applied Biosystemsなどから市販されているものなど)の使用により合成することができる。例として、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドをSteinら(1988, Nucl. Acids Res. 16: 3209)の方法により合成することができ、メチルホスホネートオリゴヌクレオチドを制御孔ガラスポリマー支持体の使用(Sarinら、1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 7448-7451)などにより調製することができる。
【0204】
アンチセンス分子はhVR1d遺伝子を発現する細胞にインビボで送達しなければならない。アンチセンスDNAまたはRNAを細胞に送達するために多くの方法が開発されている;たとえば、アンチセンス分子を組織部位に直接注入することができるし、または所望の細胞をターゲティングすべくデザインした修飾アンチセンス分子(たとえば、標的細胞表面上に発現されたレセプターまたは抗原に特異的に結合するペプチドまたは抗体に結合させたアンチセンス)を全身的に投与することができる。
【0205】
しかしながら、内生のmRNAの翻訳を抑制するに充分なアンチセンスの細胞内濃度を達成することはしばしば困難である。それゆえ、好ましい方法はアンチセンスオリゴヌクレオチドを強力なpolIIIまたはpolIIプロモーターの制御下に置いた組換えDNA構築物を利用する。そのような構築物を用いて患者で標的細胞をトランスフェクションさせると、内生のhVR1d遺伝子転写物と相補的な塩基対を形成するであろう一本鎖RNAの充分な量の転写という結果となり、それによってhVR1d遺伝子のmRNAの翻訳を妨害するであろう。たとえば、細胞によって取り込まれ、アンチセンスRNAの転写を指令するようにベクターをインビボで導入することができる。
【0206】
リボザイムは、RNAの特異的な開裂を触媒することのできる酵素的なRNA分子である(概説としては、たとえば、Rossi, J., 1994, Current Biology 4: 469-471を参照)。リボザイム作用のメカニズムは、相補的な標的RNAへのリボザイム分子の配列特異的なハイブリダイゼーション、およびそれに続くエンドヌクレアーゼ開裂を含む。リボザイム分子の構成は、標的遺伝子のmRNAに相補的な1またはそれ以上の配列を含んでいなければならず、mRNA開裂を担うよく知られた触媒配列を含んでいなければならない。この配列については、米国特許第5,093,246号(その全体を参照のため引用する)を参照。そのようなものとして、本発明の範囲には標的遺伝子タンパク質をコードするRNA配列のエンドヌクレアーゼ開裂を特異的かつ有効に触媒する遺伝子工学により作製したハンマーヘッドモチーフリボザイム分子が含まれる。hVR1d遺伝子のmRNA転写物を触媒的に開裂すべくデザインしたリボザイム分子もまた、hVR1d遺伝子のmRNAの翻訳および標的または経路遺伝子の発現を妨害するのに用いることができる(たとえば、PCT出願WO90/11364;Sarverら、1990, Science 247: 1222-1225を参照)。
【0207】
本発明のリボザイムはまた、Tetrahymena Thermophilaに天然に存在するもの(IVS、またはL−19IVS RNAとして知られる)やThomas Cechおよび彼の協同研究者によって広範に記載されているもの(Zaugら、1984, Science, 224: 547-578; ZaugおよびCech, 1986, Science, 231: 470-475; Zaugら、1986, Nature, 324: 429-433; PCT特許出願WO88/04300;BeenおよびCech, 1986, Cell, 47: 207-216)などのRNAエンドリボヌクレアーゼ(以下、「Cech型リボザイム」という)をも包含する。Cech型リボザイムは標的RNA配列にハイブリダイズする8塩基対の活性部位を有し、その後に標的RNAの開裂が起こる。本発明は、hVR1d遺伝子中に存在する8塩基対の活性部位配列をターゲティングするCech型リボザイムを包含する。
【0208】
アンチセンス法の場合のように、リボザイムは修飾オリゴヌクレオチドから構成することができ(たとえば、安定性、ターゲティングなどを改善するため)、hVR1d遺伝子を発現する細胞にインビボで送達させなければならない。好ましい送達法は、トランスフェクションした細胞が充分な量のリボザイムを産生して内生のhVR1d遺伝子メッセージを破壊し翻訳を抑制できるように、リボザイムを「コードする」DNA構築物を強力な構成的polIIIまたはpolIIプロモーターの制御下で使用することを含む。リボザイムはアンチセンス分子とは違って触媒であるので、有効であるには一層低い細胞内濃度が必要とされる。
【0209】
内生のhVR1d遺伝子発現はまた、ターゲティングした相同的組換えを用いて標的および/または経路遺伝子またはそのプロモーターを不活化または「ノックアウト」することによっても低減することができる(たとえば、Smithiesら、1985, Nature 317: 230-234; Thomas & Capecchi, 1987, Cell 51: 503-512; Thompsonら、1989 Cell 5: 313-321を参照)。たとえば、内生のhVR1d遺伝子に相同なDNA(hVR1d遺伝子のコード領域かまたは制御領域のいずれか)によってフランキングされた変異体の非機能性のhVR1d遺伝子(または完全に関連のないDNA配列)を選択マーカーおよび/または負の選択マーカーとともにまたはなしで用い、hVR1d遺伝子を発現する細胞をインビボでトランスフェクションすることができる。ターゲティングされた相同的組換えによるDNA構築物の挿入は、hVR1d遺伝子の不活化という結果となる。そのような方法はまた、イオン/陽イオン障害動物モデルを作製するのに用いることもできる。この方法は、適当なウイルスベクター、たとえばヘルペスウイルスベクターを用いて組換えDNA構築物を必要とされる部位にインビボで直接投与またはターゲティングできる場合に、ヒトにも適用できることに注意すべきである。
【0210】
別法として、内生のhVR1d遺伝子発現は、hVR1d遺伝子の制御領域(すなわち、hVR1d遺伝子のプロモーターおよび/またはエンハンサー)に相補的なデオキシヌクレオチド配列をターゲティングして三重らせん構造を形成させることによって低減することができ、該三重らせん構造は生体内の標的細胞中のhVR1d遺伝子の転写を妨害する(一般に、たとえば、Helene, C., 1991, Anticancer Drug Des. 6(6): 569-84; Helene, C.ら、1992, Ann. N. Y. Acad. Sci. 660: 27-36;およびMaher, L. J., 1992, Bioassays 14(12): 807-15を参照)。
【0211】
転写の抑制のための三重らせん形成に用いる核酸分子は一本鎖でなければならず、デオキシヌクレオチドから構成されていなければならない。これらオリゴヌクレオチドの塩基組成は、フーグスティーン型塩基対則により三重らせん形成を促進するようにデザインしなければならず、これには一般に二本鎖の一方の鎖上にプリンかまたはピリミジンのいずれかの相当の大きさの連なりを必要とする。ヌクレオチド配列はピリミジンベースであってよく、生成する三重らせんの3つの関連する鎖でTATおよびCGC+トリプレットという結果となるであろう。ピリミジンに富んだ分子は、二本鎖中の一本鎖のプリンに富んだ領域に対して該鎖と平行した方向で塩基相補性を提供する。さらに、たとえば、G残基の連なりを含むプリンに富んだ核酸分子を選択することができる。これら分子はGC対に富むDNA二本鎖と三重らせんを形成し、その際、プリン残基の大部分は標的二本鎖中の一本鎖に位置しており、三本鎖の3つの鎖でGGCトリプレットという結果となるであろう。
【0212】
別法として、三重らせん形成についてターゲティングできる潜在的な配列は、「スィッチバック」核酸分子を作製することにより増大させることができる。スィッチバック分子は、最初に二本鎖のうちの一方の鎖と塩基対を形成し、ついで他方の鎖と塩基対を形成できるように5'−3'、3'−5'交互に合成し、二本鎖の一方の鎖にプリンかまたはピリミジンのいずれかの相当の大きさの連なりが存在する必要がない。
【0213】
変異体のhVR1d遺伝子発現を抑制するために本明細書に記載のアンチセンス、リボザイムおよび/または三重らせん分子を用いる場合には、正常な標的遺伝子アレルによって産生されるmRNAの転写(三重らせん)および/または翻訳(アンチセンス、リボザイム)を極めて有効に低減または抑制できるので、存在する正常な標的遺伝子産物の濃度は正常な表現型に必要なものより低くてよい。そのような場合、実質的に正常なレベルのhVR1d遺伝子活性が保持されていることを確実にするため、正常な標的遺伝子活性を示すhVR1dポリペプチドをコードおよび発現する核酸分子を、使用したアンチセンス、リボザイム、または三重らせん処置のいずれに対しても感受性の配列を含まない細胞に遺伝子療法の方法により導入することができる。標的遺伝子が細胞外タンパク質をコードする場合には、標的遺伝子活性の必要なレベルを保持するために正常な標的遺伝子タンパク質を同時に投与するのが好ましい。
【0214】
本発明のアンチセンスRNAおよびDNA、リボザイム、および三重らせん分子は、当該技術分野で知られた方法により、たとえば、固相ホスホルアミダイト化学合成などの当該技術分野でよく知られたオリゴデオキシリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオチドを化学的に合成する方法により調製することができる。あるいは、RNA分子は、アンチセンスRNA分子をコードするDNA配列のインビトロおよびインビボ転写により調製することができる。そのようなDNA配列は、T7またはSP6ポリメラーゼプロモーターなどの適当なRNAポリメラーゼプロモーターを導入した広範なベクターに導入することができる。あるいは、使用したプロモーターに応じて構成的かまたは誘導的にアンチセンスRNAを合成するアンチセンスcDNA構築物を細胞株に安定に導入することができる。
【0215】
さらに、細胞内安定性および半減期を増大する手段として、DNA分子へのよく知られた修飾を本発明のhVR1d核酸分子に導入することができる。可能な修飾としては、該分子の5'末端および/または3'末端へのリボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドのフランキング配列の付加またはオリゴデオキシリボヌクレオチド骨格内のホスホジエステル結合の代わりのホスホロチオエートまたは2'O−メチルの使用が挙げられるが、これらに限られるものではない。
【0216】
5.4.3.2.hVR1d活性を増大する方法
イオン/陽イオン障害の好結果の治療は、hVR1d活性のレベルを増大させる方法によってもたらすことができる。活性の増大は、たとえば、hVR1d遺伝子産物の活性を直接増大させるか、および/またはhVR1d遺伝子発現のレベルを増大させることによって達成することができる。
【0217】
たとえば、上記セクション5.4.2に記載のアッセイにより同定したものなどのhVR1d活性を増大させる化合物は、イオン/陽イオン関連障害を治療するのに用いることができる。そのような分子としては、ペプチド(可溶性のペプチドを含む)、および小さな有機または無機分子が挙げられ(これらに限られるものではない)、hVR1dアゴニストと称する。
たとえば、化合物をイオン/陽イオン関連障害および徴候を治療するのに充分なレベルでそのような徴候を有する患者に投与することができる。当業者は、以下のセクション5.5に記載のような方法を用い、該化合物の有効で非毒性の投与量の濃度を決定する方法を容易に知るであろう。
【0218】
あるいは、投与すべき化合物がペプチド化合物である場合は、該ペプチド化合物をコードするDNA配列をイオン/陽イオン関連障害または徴候を示す患者に直接、該障害の徴候を改善するのに充分なペプチド化合物のレベルを生成するのに充分な濃度にて投与することができる。たとえばリポソーム投与などのような以下で検討する化合物の細胞内投与を達成するいずれの方法も、そのようなDNA分子の投与に用いることができる。細胞外で作用するペプチド化合物の場合は、イオン/陽イオン障害徴候の低減を引き起こすのに充分な循環濃度のペプチドとなる限り、そのようなペプチドをコードするDNA分子をいかなる細胞型によっても取り込ませ発現させることができる。
【0219】
イオン/陽イオン障害を生体の特定の部分または領域に局在化できる場合には、そのような変調ペプチドをコードするDNA分子を送達複合体の一部として投与することができる。そのような送達複合体は、適当な核酸分子およびターゲティング手段を含んでいてよい。そのようなターゲティング手段としては、たとえば、ステロール脂質、ウイルスまたは標的細胞特異的結合試薬が挙げられる。ウイルスベクターとしては、DNAを細胞に導入する他の粒子(たとえば、リポソーム)に加えて、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、およびレトロウイルスが挙げられるが、これらに限られるものではない。
【0220】
さらに、イオン/陽イオン関連障害に異所性のhVR1d遺伝子が関与している場合には、患者を遺伝子置換療法により処置することができる。正常なhVR1dタンパク質機能を有する正常なhVR1dタンパク質の産生を指令する正常なhVR1d遺伝子または該遺伝子の一部の1またはそれ以上のコピーを、たとえば上記で記載した送達複合体により細胞に挿入することができる。
そのような遺伝子置換法は、インビボかまたはインビトロのいずれかで行うことができる。目的とする細胞型内での発現を選択する方法が好ましい。インビボでの適用のためには、そのような方法は、たとえばhVR1d遺伝子配列の適当な局所投与を含む。
【0221】
hVR1d活性の全体のレベルを増大させるのに用いる他の方法は、適当なhVR1d遺伝子発現細胞、好ましくは自己細胞を、イオン/陽イオン関連障害の徴候を改善するのに充分な位置および数にて患者に導入することを含む。そのような細胞は、組換え細胞かまたは非組換え細胞のいずれであってもよい。患者においてhVR1d遺伝子発現の全体のレベルを増大させるために投与することのできる細胞には、hVR1d遺伝子を発現する正常な細胞が含まれる。これら細胞を、発現の解剖学的部位に投与するか、または生体の異なる部位の位置にて組織移植片の一部として投与することができる。そのような細胞レベルの遺伝子療法は当業者によく知られている(たとえば、Andersonら、米国特許第5,399,349号;MulliganおよびWilson、米国特許第5,460,959号を参照)。
hVR1d遺伝子配列はまた、自己の細胞にインビトロで導入することもできる。ついで、hVR1d遺伝子配列を発現するこれら細胞を、障害が治療され該障害の徴候が改善されるまで、好ましくは静脈内投与により患者に再導入することができる。
【0222】
5.4.3.3.他の変調法
本発明はまた、使用した特定の応用に応じてhVR1d活性レベルの増大かまたは低減のいずれかをもたらし、上記に記載したようなイオン/陽イオン関連障害の改善に導く変調法をも包含する。
変調能を示す抗体を本発明の方法に従ってイオン/陽イオン関連障害を治療するのに用いることができる。特定の抗体に応じて、変調作用はhVR1d活性の増大または低減であってよい。そのような抗体は、上記セクション5.3に記載の標準法を用い、完全長の野生型または変異体hVR1dタンパク質に対して、または該タンパク質の一部に対応するペプチドに対して産生させることができる。抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Fabフラグメント、一本鎖抗体、キメラ抗体などが挙げられるが、これらに限られるものではない。
【0223】
hVR1d遺伝子産物エピトープに結合する抗体またはFabフラグメントの領域を該遺伝子産物を発現する細胞に送達するため、リポフェクチンまたはリポソームを用いることができる。抗体のフラグメントを用いる場合には、hVR1dタンパク質の結合ドメインに結合する最小の抑制フラグメントが好ましい。たとえば、hVR1dタンパク質に結合する抗体の可変領域のドメインに対応するアミノ酸配列を有するペプチドを用いることができる。そのようなペプチドは、当該技術分野でよく知られた方法を用い、化学的に合成するかまたは組換えDNA法により製造することができる(たとえば、Creighton, 1983、上掲およびSambrookら、1989、上掲を参照)。別法として、細胞内エピトープに結合する中和抗体などの一本鎖抗体をも投与することができる。そのような一本鎖抗体は、たとえばMarascoら、1993, Procd. Natl. Acad. Sci. USA 90: 7889-7893に記載の方法を用い、一本鎖抗体をコードするヌクレオチド配列を標的細胞集団で発現させることにより投与することができる。
【0224】
5.5.医薬製剤および投与方法
上記に記載した化合物、たとえば核酸配列、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、および組換え細胞は、治療学的に有効な投与量にて患者に投与してイオン/陽イオン関連障害を治療または改善することができる。治療学的に有効な投与量とは、障害徴候の改善という結果となるに充分な量の化合物または細胞集団、あるいは障害徴候の改善となるに充分な濃度のhVR1d遺伝子産物を発現する核酸配列の量をいう。
【0225】
化合物の毒性および治療学的効能は、細胞培養または実験動物における標準的な医薬手順、たとえばLD50(集団の50%にとって致死的な投与量)およびED50(集団の50%において治療学的に有効な投与量)の決定により決定することができる。毒性作用と治療効果との投与量比は治療指数であり、LD50/ED50の比として表すことができる。大きな治療指数を示す化合物が好ましい。毒性の副作用を示す化合物を用いることもできるが、感染していない細胞への潜在的な障害を最小にし、それによって副作用を低減するため、そのような化合物を罹患組織の部位へターゲティングする送達系をデザインすべく注意が必要である。
【0226】
細胞培養アッセイおよび動物研究で得られたデータを、ヒトで使用する投与量の範囲を処方するのに用いることができる。そのような化合物の投与量は、毒性が全くないかまたは殆どなしで、ED50を含む循環濃度の範囲であるのが好ましい。投与量は、使用した剤型および使用した投与経路に応じてこの範囲で変えることができる。本発明の方法に用いる化合物については、治療的に有効な量はまず細胞培養アッセイから評価することができる。細胞培養において決定されるように、IC50(すなわち、徴候の最大抑制の半分を達成する被験化合物の濃度)を含む循環血漿濃度範囲を達成すべく動物モデルで投与量を処方することができる。そのような情報を用い、ヒトにおいて有用な投与量を一層正確に決定することができる。血漿中のレベルは、たとえば、高速液体クロマトグラフィーにより測定することができる。
【0227】
本発明に従って用いる医薬組成物は、1またはそれ以上の生理学的に許容しうる担体または賦形剤を用い、常法で調合することができる。
それゆえ、化合物および生理学的に許容しうるその塩および溶媒を、吸入(口または鼻のいずれかにより)または経口、口腔内、非経口または直腸投与による投与用に調合することができる。
【0228】
経口投与のためには、医薬組成物は、薬理学的に許容しうる賦形剤、たとえば結合剤(たとえば、前もってゼラチン化した(pregelatinized)トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース);充填剤(たとえば、乳糖、微結晶セルロースまたはリン酸水素カルシウム);滑沢剤(たとえば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ);崩壊剤(たとえば、ジャガイモデンプンまたはナトリウムデンプングリコレート(sodium starch glycolate));または湿潤剤(たとえば、ラウリル硫酸ナトリウム)を用いて通常の手段により調製した、たとえば、錠剤またはカプセル剤の形態をとることができる。錠剤は当該技術分野でよく知られた方法によりコーティングすることができる。経口投与用の液体製剤は、たとえば、液剤、シロップ剤または懸濁剤の形態をとることができ、あるいは使用前に水または他の適当なビヒクルで構成する乾燥製剤として調製することもできる。そのような液体製剤は、通常の手段により、薬理学的に許容しうる添加剤、たとえば、懸濁化剤(たとえば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または硬化食用脂質);乳化剤(たとえば、レシチンまたはアラビアゴム);非水性ビヒクル(たとえば、扁桃油、油状エステル、エチルアルコールまたは分留(fractionated)植物油);および保存剤(たとえば、p−ヒドロキシ安息香酸メチルまたはプロピルまたはソルビン酸)を用いて調製することができる。製剤はまた、適宜、緩衝塩、芳香剤、着色剤および甘味剤を含んでいてよい。
【0229】
経口投与用製剤は、活性化合物の制御放出をもたらすように適当に調合することができる。
口腔投与のためには、組成物は通常の仕方で調合した錠剤またはトローチの形態をとることができる。
吸入による投与のためには、本発明に従って使用する化合物をエアゾルスプレー提示の形態で、適当な噴射剤、たとえばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適当な気体を用いて圧縮パック(pressurized pack)またはネブライザーから都合よく送達する。圧縮エアゾル剤の場合は、計量した量を送達するバルブを提供することにより投与量単位を決定することができる。吸入器に使用するためのたとえばゼラチンのカプセルまたはカートリッジは、本発明の化合物と適当な基剤(たとえば、乳糖またはデンプン)との粉末混合物を含むように調合することができる。
【0230】
注射、たとえば巨丸(bolus)注射または連続注入による非経口投与(すなわち、静脈内または筋肉内)のために本発明の化合物を調合することができる。注射用製剤は、単位剤型、たとえばアンプルまたは多回投与容器(multi-dose containers)中にて、保存剤を添加して調製することができる。組成物は、たとえば油状ビヒクルまたは水性ビヒクル中の懸濁剤、液剤または乳剤などの剤型をとることができ、懸濁化剤、安定化剤および/または分散剤などの調合用剤を含んでいてよい。あるいは、活性成分は、適当なビヒクル、たとえば滅菌した発熱性物質不含の水を用いて使用前に構成するための粉末の形態であってよい。hVR1d発現細胞は静脈内投与により患者に導入するのが好ましい。
本発明の化合物はまた、たとえばカカオ油脂や他のグリセリドなどの通常の坐剤基剤を含む坐剤や保持(retention)浣腸などの直腸用組成物に調合することができる。
【0231】
上記に記載した製剤の他に、本発明の化合物はまたデポ製剤として調合することもできる。そのような長期間作用する製剤は、植込み(たとえば、皮下または筋肉内)によりまたは筋肉内注射により投与することができる。それゆえ、たとえば、本発明の化合物は、適当なポリマー性または疎水性の物質(たとえば、許容しうる油中の乳剤として)またはイオン交換樹脂を用いて、またはわずかに(sparingly)可溶な誘導体として、たとえばわずかに可溶な塩として調合することができる。
本発明の化合物は、所望なら、活性成分を含む1またはそれ以上の単位剤型を入れることのできるパックまたはディスペンサーデバイスにて調製することができる。パックは、ブリスターパックなどのように金属またはプラスチック箔を含んでいてよい。パックまたはディスペンサーデバイスは、投与の指示書を添付することができる。
【0232】
6.実施例:新規なhVR1d遺伝子およびそれがコードするタンパク質の同定
以下のセクションは、新規なヒトイオンチャンネルをコードする新規なヒト遺伝子配列の同定を記載する。
6.1.新規なhVR1d DNA配列のクローニング
一般に、全ての日常的な分子生物学的手順は、標準プロトコールに従うかまたは広範に市販されているキットおよび試薬によった。シークエンシングはすべて、市販のダイターミネーター(dye-terminator)を用いてABI373自動シークエンサーで行った。
【0233】
hVR1a、hVR1b、hVR1cおよびhVR2の公知の配列データを用い、ESTおよびゲノムパブリックデータベースをスクリーニングした。使用した配列サーチプログラムは、ギャップト(gapped)BLASTであった(S. F. Altschulら、1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402)。サーチは、質問(query)配列と有意の類似性を有するが同一ではないセグメントを含む3つの細菌人工染色体(BAC)配列をパブリックドメイン高処理量ゲノムデータベース中に同定した。これらBACのアクセッション番号は、AC025125、AC027040およびAC027796であった。レセプターのバニロイドファミリーと類似性を有するセグメントを非縮重タンパク質および核酸データベースに対して探索したところ、これらセグメントは潜在的な新規なバニロイドレセプターをコードすることがわかった。しかしながら、この時点で得られた配列情報は完全なコード配列を同定するには充分でなかった。ついで、3'および5'の両者のRACE法を用い(M. A. Frohmanら、1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8998)、ヒト脳ライブラリーから単離したcDNAクローンをシークエンシングすることにより、以下のようにして完全な配列データを得た。
【0234】
上記で最初にバニロイドレセプターに相同であるとして同定されたゲノムDNA配列、すなわちBAC配列からデザインしたPCRプライマーペアを用い、潜在的なcDNAクローンについてヒト脳cDNAライブラリーをスクリーニングした。さらに詳細には、以下のFrag3プライマーペア、すなわち、フォアウォードプライマー「Frag3−s」CGCAGTGCTGGAACTCTTCA(配列番号19)およびリバースプライマー「Frag3−a」CATCAGAGCAATGAGCATGTTGA(配列番号20)(リバースプライマーは5'末端にビオチンが結合していた)を用い、ゲノムDNAからhVR1d配列のビオチン化断片を増幅した。このDNA断片をゲル精製し、変性し、ついで標準プロトコールに従ってf1ヘルパーファージを用いて構築した環状一本鎖ヒト脳cDNAライブラリーにハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションは、50%ホルムアミド、1.5M NaCl、40mM NaPO(pH7.2)、5mM EDTAおよび0.2%SDS中、42℃で行った。
【0235】
ビオチン化DNA断片と環状DNAとのハイブリッドをストレプトアビジンマグネチックビーズ上に捕獲した。ビーズから熱放出した後、cDNAクローニングベクター中のT7プロモーター配列に相補的なプライマーを用いて二本鎖に変換した。ついで、二本鎖cDNAを大腸菌宿主細胞中にエレクトロポレーションにより導入し、得られたコロニーを最初のプライマーペアを用いたPCRによりスクリーニングして所望のcDNAを同定した。約20のPCR陽性クローンを得た。全てのクローンについて挿入サイズを決定し、最大の挿入を有する2つのクローンをDNAシークエンシング用に選択した。
【0236】
上記RACE法を用いてさらなる配列情報を得た。さらに詳細には、CLONTECH Laboratories, Inc.により調製したヒト胎仔脳Marathon cDNAライブラリーを鋳型として用いた。ネステッドPCR反応を用いて5'配列データを得た。ゲノム配列データから2つの遺伝子特異的プライマーは、増幅の第一ラウンドでは「1D5R2」(GCCCAGGATGTCGTTCTCTTCAGC(配列番号21))であり、その後のラウンドでは「1D5R3」(GATCCGCACTATCTCCTTGGTGTTGG(配列番号22))であった。3'配列データを得るには、遺伝子特異的プライマー「1D3R2」(ACTGAATGGAAGACGCACGTCTCCTTC(配列番号23))を用いて1ラウンドの増幅を用いた。5'および3'の両RACE増幅において、CLONTECHのプライマー「AP1」を第二のプライマーとして用いた。RACE生成物のクローニングは、Invitrogen CorporationのTOPO TA Cloning Kitを製造業社の指示に従って用いて行った。挿入サイズを制限消化により評価し、ついで最大の挿入を有するクローンをシークエンシングした。
【0237】
これら手順により得られた核酸配列を図1Aおよび図1Bに示す。図1Aおよび図1Bは、それぞれ新規なcDNAクローンhVR1dのコード配列の2つのスプライス変異体、すなわちhVR1d.1およびhVR1d.2を同定する。これから得られるタンパク質、すなわちhVR1d.1およびhVR1d.2スプライス変異体によってコードされるアミノ酸配列を図2Aおよび図2Bにそれぞれ示してある。
【0238】
実施例2−新規なヒトhVR1d.1およびhVR1d.2ポリペプチドの発現プロファイリング
上記に記載のhVR1d核酸を用いた発現プロファイリング研究を以下のようにして行った:上記で同定したBAC配列からPCRプライマーをデザインし、Applied BiosystemsのGeneAmp 5700を用いた定量的PCRによりhVR1d mRNAの組織レベルを測定した。フォアウォードプライマーはTGACCTGAACATCCAGCAGA(配列番号24)であり、リバースプライマーはAGCATGTTGAGGAGGAGAACA(配列番号25)であった。これらプライマーはhVR1d.1とhVR1d.2とを識別しなかった。PCR手順において、第一鎖cDNAを種々の組織採取源から単離した市販のmRNA(CLONTECH)から作製した。さらに、各アッセイに用いたcDNAの相対量を、全ての組織で等しい量で発現される遺伝子であるシクロフィリンに対するプライマーペアを用いた平行実験を行って決定した。シクロフィリンプライマーペアは各試料中のcDNA量に小さな変動を検出し、これらデータをhVR1dプライマーペアで得られたデータを正規化するのに用いた。PCRデータを、試験した組織での転写物の存在量の差異の相対評価に変換し、このデータを図4に示す。
【0239】
図4に示すように、hVR1dは種々の脳組織並びに脊髄組織で高頻度に発現される。脳組織に関しては、hVR1dは脳の脳梁(CC)、尾状核(CN)、および扁桃(A)で最も高頻度に発現される。
さらに、hVR1dのスプライス変異体(hVR1d.2)核酸の脳のサブ領域を含む種々の組織での相対的な発現を同定するため、さらなる発現プロファイリング実験を行った。実験は、以下のプライマーペアを用いて上記のようにして行った。フォアウォードプライマーはCGGAAACCTCGGTGTAGAAG(配列番号26)であり、リバースプライマーはTCATCCCTCAAAGCCTCTCT(配列番号27)であった。
【0240】
図5に示すように、hVR1d.2ポリペプチドはhVR1d.1ポリペプチドと極めて類似の発現プロフィルを有していた。しかしながら、図6に示すように、hVR1d.2ポリペプチドは脳のサブ領域では若干異なる発現を示した。とりわけ、hVR1d.2ポリペプチドはhVR1d.1ポリペプチドと比較して、視床および黒質で有意に一層高く発現され、扁桃ではより低い発現であった。この観察された差異的な発現は、hVR1d.1ポリペプチドとhVR1d.2ポリペプチドとの潜在的に関連しているがそれでも多様な役割を強調しており、これらポリペプチドのいずれか一方が種々の神経疾患および/または障害の治療のための医薬となりうる(druggable)標的として有用であることを示唆している。
【0241】
実施例3−本発明のHVR1d.1ポリペプチドおよびhVR1d.2ポリペプチドに対応するN末端およびC末端欠失変異体の製造方法
本明細書に記載するように、本発明は、本発明のHVR1d.1ポリペプチドおよびhVR1d.2ポリペプチドに対応するN末端およびC末端欠失の組み合わせに加えて、該N末端およびC末端欠失変異体の製造方法を包含する。そのような変異体を製造するために多くの方法が当業者に利用できる。そのような方法は、PCR増幅と遺伝子クローニング法との組み合わせを含む。分子生物学の当業者であれば本明細書において提供または参照した教示および/または当該技術分野で知られた他の標準法を用い、本発明の各欠失変異体を容易に作製できるであろうが、以下に例示的な方法を記載する。
【0242】
簡単に説明すると、完全長のHVR1d.1またはhVR1d.2ポリペプチド配列をコードする単離cDNAクローンを用い、意図するN末端および/またはC末端欠失変異体をPCR増幅し、その後にクローニングすべく、配列番号1または配列番号3の所望の5'位および3'位から得られた約15〜25ヌクレオチドの適当なプライマーをデザインすることができる。そのようなプライマーは、たとえば、5'プライマーおよび3'プライマーについてそれぞれ開始コドンおよび停止コドンを含んでいてよい。そのようなプライマーはまた、欠失変異後増幅のクローニングを容易にするために制限部位を含んでいてよい。さらに、プライマーは、たとえばflag−タグ配列、コザック配列、または本明細書で検討および/または参照する他の配列などのさらなる配列を含んでいてよい。
【0243】
たとえば、H394からR720までのN末端欠失変異体の場合は、この欠失変異体に対応するcDNA断片を増幅するのに以下のプライマーを用いることができる。
【表1】
Figure 2005506037
【0244】
たとえば、M1からN626までのC末端欠失変異体の場合は、この欠失変異体に対応するcDNA断片を増幅するのに以下のプライマーを用いることができる。
【表2】
Figure 2005506037
【0245】
代表的なPCR増幅の条件を以下に記載するが、当業者であれば効率的な増幅のために他の条件が必要となることを評価するであろう。10ngの鋳型DNA(HVR1d.1およびhVR1d.2のcDNAクローン)、200μMの4dNTP、1μMのプライマー、0.25UのTaq DNAポリメラーゼ(PE)、および標準Taq DNAポリメラーゼ緩衝液を用い、100μlのPCR反応混合液を調製する。典型的なPCRサイクル条件は以下のとおりである:
Figure 2005506037
【0246】
PCRの最終的な伸長工程の後、5Uのクレノー断片を加え、30度で15分インキュベートする。
断片をNotIおよびSalI制限酵素で消化した後、同様に消化した適当な発現および/またはクローニングベクター(とりわけ、pSport1)中にクローニングする。当業者であれば、他のプラスミドを同様に置換でき、ある環境では望ましいことを評価するであろう。ついで、消化した断片およびベクターをDNAリガーゼを用いてライゲートし、本明細書に記載する方法および/または当該技術分野で知られた他の方法を用いてコンピテントな大腸菌細胞を形質転換する。
【0247】
さらなるN末端欠失変異体を増幅するための5'プライマー配列は、下記式:
(S+(X*3))から((S+(X*3))+25)
(式中、「S」はHVR1d.1またはhVR1d.2遺伝子(配列番号1または配列番号3)の最初の開始コドンのヌクレオチド位置に等しく、「X」は意図するN末端欠失変異体の最もN末端側のアミノ酸に等しい)を参照して決定することができる。最初の項は、配列番号1または配列番号3のセンス鎖に対応して、5'プライマーの始めの5'ヌクレオチド位置を提供し、一方、第二の項は5'プライマーの終わりの3'ヌクレオチド位置を提供するであろう。プライマーの対応ヌクレオチド位置が決定されたら、たとえば該配列の5'末端に適用可能な制限部位配列を付加することにより最終的なヌクレオチド配列を作製することができる。本明細書で参照したように、ある環境では5'プライマーに他の配列(たとえば、コザック配列など)を付加することが望ましい。
【0248】
さらなるN末端欠失変異体を増幅するための3'プライマー配列は、下記式:
(S+(X*3))から((S+(X*3))−25)
(式中、「S」はHVR1d.1またはhVR1d.2遺伝子(配列番号1または配列番号3)の最初の開始コドンのヌクレオチド位置に等しく、「X」は意図するN末端欠失変異体の最もC末端側のアミノ酸に等しい)を参照して決定することができる。最初の項は、配列番号1または配列番号3のアンチセンス鎖に対応して、3'プライマーの始めの5'ヌクレオチド位置を提供し、一方、第二の項は3'プライマーの終わりの3'ヌクレオチド位置を提供するであろう。プライマーの対応ヌクレオチド位置が決定されたら、たとえば該配列の5'末端に適用可能な制限部位配列を付加することにより最終的なヌクレオチド配列を作製することができる。本明細書で参照したように、ある環境では3'プライマーに他の配列(たとえば、停止コドン配列など)を付加することが望ましい。当業者であれば、PCR増幅を最適化するために上記ヌクレオチド位置の改変が必要であることを評価するであろう。
【0249】
上記と同じ一般式を用い、本発明のC末端欠失変異体を増幅するための5'および3'プライマー配列を同定することができる。さらに、上記と同じ一般式を用い、本発明のN末端およびC末端欠失変異体の組み合わせを増幅するための5'プライマーおよび3'プライマー配列を同定することができる。当業者であれば、PCR増幅を最適化するために上記ヌクレオチド位置の改変が必要であることを評価するであろう。
【0250】
実施例4−分子進化的手法による本発明の生物学的活性/機能的特性を促進する方法
知られている最も生物学的に活性なタンパク質の多くは生物における特定の機能に対して極めて有効であるが、このようなタンパク質はしばしばトランスジェニック用、治療的、医薬的、および/または工業的な応用には望ましくない特性を有している。これら特性のうちでも短い生理的半減期は最も顕著な問題であり、タンパク質レベルおよびタンパク質のmRNAレベルのいずれでも存在する。半減期を延ばす能力は、たとえば、タンパク質を遺伝子療法、トランスジェニック動物の作製、タンパク質の生物プロセスによる産生および精製における使用、およびとりわけ化学的モデュレーターとしてのタンパク質の使用のためには特に重要である。それゆえ、一般的な工業的および医薬的応用へのタンパク質の適用性に加えて動物起源の疾患の治療のための治療剤としての応用を促進するような特性を有する単離タンパク質の新規な変異体を同定する必要性が存在する。
【0251】
それゆえ、本発明の一つの側面は、方向付けられた(directed)分子進化により本発明の特定の特性を促進する能力に関する。そのような促進は、これらに限られないが、キットの必須成分としての本発明の有用性、本発明の生理的な貢献、たとえばその溶解性、構造またはコドンの最適化、本発明の特定の生物学的活性(関連する酵素活性を含む)、タンパク質の酵素動力学、タンパク質のK、Kcat、K、Vmax、K、タンパク質−タンパク質活性、タンパク質−DNA結合活性、アンタゴニスト/抑制活性(直接または間接相互作用を含む)、アゴニスト活性(直接または間接相互作用を含む)、タンパク質の抗原性(たとえば、タンパク質の抗原性を増大させるかまたは低減させることが望ましい場合)、タンパク質の免疫原性、タンパク質がそれ自体または他のタンパク質と二量体、三量体、またはマルチマーを形成する能力、本発明の抗原的効力(疾患または疾患状態の予防的治療として、または病的遺伝子をターゲティングするためのエフェクターとしてのその後の使用を含む)に有用である。さらに、タンパク質の特定の特性を促進する能力はまた、酵素の特徴付けられた活性をその最初に特徴付けられた活性とは全く関連のない活性に変化させることにも応用できる。本発明の他の所望の促進は、それぞれの個々のタンパク質に特定のものであり、それゆえ当該技術分野でよく知られており、本発明により包含される。
【0252】
たとえば、遺伝子工学により作製したイオンチャンネルは、その同族リガンドへの結合後に構成的に活性であってよい。あるいは、遺伝子工学により作製したイオンチャンネルは、リガンド結合の不在下で構成的に活性であってよい。さらに他の例として、遺伝子工学により作製したイオンチャンネルは、イオンチャンネルの活性化に典型的に必要とされる制御因子および/または条件(たとえば、リガンドの結合、リン酸化、立体配座の変化、カルシウムの流入など)の全てよりも少ないもので活性化されることができる。そのようなイオンチャンネルは、上記に記載した用途のなかでもイオンチャンネルモデュレーターを同定するためのスクリーニングにおいて有用であろう。
【0253】
方向付けられた進化は幾つかの工程からなる。第一の工程は、目的とする遺伝子またはタンパク質の変異体のライブラリーを確立することである。最も重要な工程は、ついで同定しようとする活性を必然的に伴う変異体を選択することである。スクリーニングのデザインは必須である、なぜならスクリーニングは有用でない変異体を排除するのに充分選択的でなければならないが、全ての変異体を排除するほど厳格であってはならないからである。ついで、最後の工程は、前のスクリーニングからの最良の変異体を用いて上記工程を繰り返すことである。ついで、各連続サイクルを、たとえばスクリーニングの厳格さを増大させるなど、必要に応じて改変することができる。
【0254】
何年にもわたって巨大分子中に変異を導入するための多くの方法が開発されてきている。これらの方法の幾つかとしては、ランダム突然変異誘発、「誤りがちの(error-prone)」PCR、化学的突然変異誘発、部位特異的突然誘発、および当該技術分野でよく知られた他の方法(現在行われている突然変異誘発法の包括的な列挙のためには、Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual、コールドスプリングハーバープレス、コールドスプリング、ニューヨーク(1982)を参照)が挙げられる。一般に、そのような方法は、たとえば、タンパク質のコア機能的領域またはタンパク質の特定のドメインの(マルチドメインタンパク質の場合)機能を同定するための手段として用いられている。しかしながら、そのような方法は、近年、特別のまたは促進された特性を有する巨大分子変異体の同定に応用されている。
【0255】
ランダム突然変異誘発は、今日で最も広く認識されている方法である。典型的に、この方法は、「誤りがちの」PCRを用いるか(Moore, J.ら、Nature Biotechnology 14: 458 (1996)に記載されているように)または目的とする特定の領域に対応するランダムに合成したオリゴヌクレオチドの適用により(Derbyshire, K. M.ら、Gene, 46: 145-152 (1986)およびHill, DEら、Methods Enzymol., 55: 559-568 (1987)に記載されているように)行われている。両アプローチとも得ることのできる突然変異誘発のレベルに限界がある。しかしながら、いずれのアプローチも研究者が突然変異誘発の割合を有効に制御することができる。このことは、酵素の活性にとって有利な変異が極めて稀であることを考えると特に重要である。実際、あまりにも高い突然変異誘発レベルを使用すると有用な変異の所望の利点が相殺あるいは抑制されることがある。
【0256】
上記方法は両者とも巨大分子変異体のランダム化プールを作製するのに有効であるが、「DNAシャフリング」または「セクシュアル(sexual)PCR」と称する第三の方法が近年解明されている(WPC, Stemmer, PNAS, 91: 10747 (1994))。DNAシャフリングはまた、「方向付けられた分子進化」、「エクソンシャフリング」、「方向付けられた酵素進化」、「インビトロ進化」、および「人工進化」とも称される。そのような術語は当該技術分野で知られており、本発明により包含される。この新しく好ましい方法は、その結果得られる子孫においてプラスの特性を増進させるのみならず、同時にマイナスの特性を排除するという点で、これまでの方法の限界を明らかに克服するものである。
【0257】
DNAシャフリングは、このことをインビトロ組換えの原理を「誤りがちの」PCR法と組み合わせることによって達成する。実際にはDNアーゼIによって作製した遺伝子の小さな断片のランダムに消化したプールから開始し、ついで該ランダムな断片を「誤りがちの」PCRアセンブリー反応に導入する。PCR反応の間、ランダムなサイズのDNA断片はその同族鎖にハイブリダイズするのみならず、目的とするポリヌクレオチドの異なる領域(全体のポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションでは一般に見つからない領域)に対応する他のDNA断片にもハイブリダイズする。さらに、PCRアセンブリー反応は「誤りがちの」PCR反応条件を利用するので、全DNA断片に対してPCR反応のDNA合成工程でランダムな変異が導入され、反応のアニーリング工程の際に潜在的なハイブリダイゼーション部位をさらに多様なものにする。
【0258】
DNAシャフリング反応を行うには様々な反応条件を用いることができる。しかしながら、DNAシャフリングの特定の反応条件が、たとえばPNAS, 91: 10747 (1994)に記載されている。簡単には以下のとおりである:
DNAシャフリング反応に供すべきDNA基質を調製する。調製は、混入する細胞物質、化学物質、緩衝液、オリゴヌクレオチドプライマー、デオキシヌクレオチド、RNAなどから該DNAを単に単離する形態であってもよいし、たとえばQiagen, Inc.によって、またはPromega, Corp.によって提供されるもののようなDNA精製キットの使用を包含していてもよい。
【0259】
DNA基質が精製されたら、これをDNアーゼI消化に供する。約2〜4μgのDNA基質を、50mMトリス−HCl(pH7.4)/1mM MgClの100μl当たり0.0015単位のDNアーゼI(Sigma)で10〜20分間消化する。ついで、得られた10〜50bpの断片をDE81イオン交換紙(Whatman)まで電気泳動により2%低融点アガロースゲルを泳動させることにより精製するか、適当な分子量カットオフ値のMicrocon濃縮機(Amicon)で精製するか、または当該技術分野で知られた他の方法に加えてオリゴヌクレオチド精製カラム(Qiagen)を用いることができる。DE81イオン交換紙を用いるなら、10〜50bpの断片が1M NaCLを用いて該紙から溶出され、ついでエタノール沈殿させる。
【0260】
次に、得られた精製断片を、2mMの各dNTP、2.2mM MgCl、50mM KCl、10mMトリス塩酸(pH9.0)および0.1%トリトンX−100を含むPCR混合物を10〜30ng/μlの最終濃度で再懸濁することにより、PCRアセンブリー反応にかける。この時点ではプライマーを加えない。Taq DNAポリメラーゼ(Promega)は反応混合物100μlあたり2.5単位の割合で使用する。PCRプログラムは94℃で60秒;94℃で30秒、50〜55℃で30秒、および72℃で30秒を30〜45サイクル;続いて72℃で5分間。MJ Research(マサチューセッツ州ケンブリッジ)PTC−150サーモサイクラーを使用。アセンブリー反応が完了した後、得られたプライマーレス産物の1:40希釈液を、0.8μmの各プライマーを含むPCR混合物(アセンブリー反応に使用したものと同じ緩衝液混合物を使用)に導入し、この混合物を15サイクルのPCR(94℃で30秒、50℃で30秒、および72℃で30秒)にかける。ここにいうプライマーは、シャフリング反応に利用するポリヌクレオチドの核酸配列に対応するプライマーである。このプライマーは、当該技術分野で知られており本明細書でも言及する方法を使って修飾核酸塩基対からなってもよいし、追加の配列を(例えば制限部位、突然変異特異塩基対などを付加するために)含んでもよいだろう。
【0261】
結果として得られる、シャッフルされ、アセンブルされ、増幅された産物は、当該技術分野で周知の方法(例えばQiagen PCR精製キット)を使って精製した後、適当な制限酵素を使ってクローニングすることができる。
DNAシャフリングの変法は今までに数多く公表されているが、そのような変法は当業者には明らかであり、本発明に包含される。DNAシャフリング法は、Zhaoらが記載した方法(Nucl Acid Res., 25(6): 1307-1308 (1997))を使って、所望の突然変異誘発レベルに合わせることもできる。
【0262】
上述のように、ランダム化されたプールを作製したら、それを、所望の特徴を持つ変異体を同定するための特異的スクリーニングにかけることができる。変異体が同定されたら、その変異体に対応するDNAをDNA基質として使用して、新たなDNAシャフリングを開始することができるだろう。このシャフリング、最適化された興味ある変異体の選択、次いで再シャフリングというサイクルを、最終的な変異体が得られるまで繰り返すことができる。DNAシャフリング技術を使って作製された変異体を同定するために応用されるモデルスクリーニングの例は、次の刊行物に記載されている:J. C., Mooreら、J. Mol. Biol., 272: 336-347 (1997);F. R., Crossら、Mol. Cell. Biol., 18: 2923-2931 (1998)およびA. Crameri.ら、Nat. Biotech., 15: 436-438 (1997)。
【0263】
DNAシャフリングにはいくつかの利点がある。第1に、これは有益な突然変異を利用する。スクリーニングと組み合わせると、DNAシャフリングは、最適な突然変異の組合わせの発見を可能にし、最適な組合わせが母集団中の全ての突然変異を含むことを想定していない。第2に、組換えは点突然変異と同時に起こる。DNAポリメラーゼに小さい断片DNAプールから完全長遺伝子を合成させる効果は、バックグランド突然変異生成率である。ストリンジェントな選択方法との組合わせで、酵素活性が野生型酵素の16000倍まで進化している。要するに、バックグラウンド突然変異生成が遺伝子の可変性をもたらし、そこに組換えが作用して、活性を向上させたのである。
【0264】
組換えの第3の特徴は、それを使って有害な突然変異を除去できることである。上述のように、ランダム化の過程では、1つの有益な突然変異ごとに、少なくとも1つ以上の中立的または阻害的突然変異がありうる。そのような突然変異は、先の選択で選択された突然変異体のランダムサイズ断片に加えて、アセンブリー反応に過剰の野生型ランダムサイズ断片を含めることによって、除去することができる。次の選択中に、ポリヌクレオチド/ポリペプチド/酵素の最も活性な変異体の一部は、阻害的突然変異を失っているはずである。
【0265】
最後に、組換えは並列処理を可能にする。これは重大な利点である。というのも、タンパク質をより望ましくする特徴(例えば溶解度、活性など)はおそらく複数あるからである。2以上の望ましい特質を一度にスクリーニングすると、ますます困難になるので、分子進化の他の方法は阻害的になりがちである。しかし組換えを使用することにより、種々の特質について最適な代表的変異体のランダム化された断片を組み合わせて、複数の性質について一度に選択することが可能だろう。
【0266】
DNAシャフリングを本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドに応用して、所定の宿主におけるそれらの免疫原性を低下させることもできる。例えば、本発明の特定の変異体をDNAシャフリング技術を用いて作製および単離することができる。そのような変異体は所望する特徴の全てを持ちうるが、その新規な固有の構造ゆえに宿主中で高い免疫原性を示すかもしれない。具体的に述べると、所望する特徴は、もやは「自己」分子として認識されず「異物」として認識される非天然構造を、そのポリペプチドに持たせることになり、したがってその新規変異体に対する宿主の免疫応答を活性化するかもしれない。そのような制約は、例えば、天然タンパク質の生体異物オルソログの遺伝子配列のコピーを、新規変異体遺伝子の遺伝子配列と共に、DNAシャフリングの1以上のサイクルに含めることなどによって克服することができる。オルソログと新規変異体DNAのモル比は相応に変化させることができるだろう。理想的には、結果として得られる同定されたハイブリッド変異体は、その生体異物タンパク質が宿主免疫系を回避することを可能にしたコード配列の少なくとも一部を含み、さらに望ましい特徴を与える元の新規変異体のコード配列の少なくとも一部を含むだろう。
【0267】
また本発明は、DNAシャフリングの1以上のサイクルが、遺伝子鋳型DNAに加えて、既知のアレル配列をコードするオリゴヌクレオチド、最適化されたコドン配列、既知の変異体配列、既知のポリヌクレオチド多型配列、既知のオルソログ配列、既知のホモログ配列、新たなホモログ配列、新たな非ホモログ配列、別の種に由来する配列、ならびに上記のいくつかおよびその任意の組合わせを含むDNAシャフリング技術の、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの進化への応用を包含する。
【0268】
場合によって応用できる、または望ましい、関連方法は、上記の方法の他にも数多くある。それらの代表例には、参考文献として本明細書の一部を構成するPCT出願WO98/31700およびWO98/32845に論じられている方法がある。さらに、発明を発展させて、PCT出願WO98/13485、WO98/13487、WO98/27230、WO98/31837およびCrameri, A.ら、Nat. Biotech., 15: 436-438 (1997)にそれぞれ記載されているように、遺伝子治療、タンパク質工学、変異体を含む全細胞の進化、または本発明のポリヌクレオチドを含む全酵素経路の進化に理想的な変異体を作製するために、関連方法を本発明のポリヌクレオチドに応用することもできる。
【0269】
本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドに「DNAシャフリング」技術を応用する他の方法は、それらの応用案を含めて、例えば米国特許第5,605,793号;PCT出願WO95/22625;PCT出願WO97/20078;PCT出願WO97/35966;およびPCT出願WO98/42832;PCT出願に記載されている。上記の刊行物はその全目的のためにその全体が参照のため本明細書中に引用される。
【0270】
実施例5−hVR1dポリペプチドの推定イオンチャンネル活性を評価する方法
hVR1dポリペプチドの潜在的なイオンチャンネル活性を評価するために多くの方法を用いることができる。
hVR1dコードポリヌクレオチド配列を含む適当な哺乳動物発現ベクターでトランスフェクションしたCHO−K1細胞を、当該技術分野で知られた方法を用いて調製する。トランスフェクションの12時間後にトランスフェクションした細胞をカバースリップに移し、トランスフェクションの24時間後に電気生理学的測定を行う(22±2℃)。hVR1d発現CHO−K1細胞をGFP蛍光により検出する。膜電流を10または20kHzでデジタル化し、1kHzにてオフラインでデジタルにて濾過する。500m秒持続する電圧刺激を5−秒間隔で送り、100〜+100mVの電圧勾配または電圧段階とする。肉眼および単チャンネル電流のための内部ピペット溶液は、145mMのCs−メタンスルホネート、8mMのNaCl、5mMのATP、1mMのMgCl、10mMのEGTA、4.1mMのCaCl、および10mMのHepesを含んでいてよく、ATP添加後にCsOHでpHを7.2に調節する。標準細胞外溶液は、140mMのNaCl、5mMのCsCl、2.8mMのKCl、2mMのCaCl、1mMのMgCl、10mMのHepes、および10mMのグルコースを含んでいてよく、NaOHでpHを7.4に調節する。相対的なイオン透過性は、145mMのCs−メタンスルホネート、10mMのCsCl、5mMのATP、10mMのEGTA、および10mMのHepesを含むピペット溶液(pH7.2)、および110mMのNMDG、30mMのX(Na、Ca2+、K、またはCs)、10mMのHepes、および10mMのグルコース(pH7.4)を含む外部溶液を用いて測定する。1価イオンの相対的な透過性は、式:PX/PCs=([Cs]o/[X]o)exp[F(EX ECs)/RT]に従って計算することができる。PCa/PCs透過性比は、式:PCa/PCs={[Cs]oexp(FECs/RT)exp(FECa/RT)[exp(FECa/RT)+1]}/(4[Ca2+]o)に従って計算する。ここで、R、T、およびFは、それぞれ気体定数、絶対温度、およびファラデー定数である。統計的な比較は、分散の2方向(two-way)分析(ANOVA)および両側t検定をBonferroni補正で行う;P<0.05は統計的な有意を示す。
【0271】
実施例6−ポリペプチドの細菌発現
DNA配列の5'および3'末端に対応するPCRオリゴヌクレオチドプライマーを使って本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを増幅することにより、挿入断片を合成する。cDNAインサートの増幅に使用するプライマーは、好ましくは、増幅産物を発現ベクターにクローニングするために、BamHIおよびXbaIなどの制限部位をプライマーの5'末端に含むべきである。例えばBamHIおよびXbaIは、細菌発現ベクターpQE−9(Qiagen, Inc.、カリフォルニア州チャッツワース)上の制限酵素部位と一致する。このプラスミドベクターは抗生物質耐性(Amp)、細菌複製起点(ori)、IPTG調節性プロモーター/オペレーター(P/O)、リボソーム結合部位(RBS)、6−ヒスチジンタグ(6−His)、および制限酵素クローニング部位をコードしている。
【0272】
pQE−9ベクターをBamHIおよびXbaIで消化し、細菌RBSから始まる読み枠を保ちつつ、増幅断片をpQE−9ベクターにライゲートする。次に、そのライゲーション混合物を使って大腸菌M15/rep4株(Qiagen, Inc.)を形質転換する。大腸菌M15/rep4株はlacIリプレッサーを発現させ、かつ、カナマイシン耐性(Kan)を付与する複数コピーのプラスミドpREP4を含有する。LB平板上で成長するそれらの能力によって形質転換体を同定し、アンピシリン/カナマイシン耐性コロニーを選択する。プラスミドDNAを単離し、制限分析によって確認する。
【0273】
所望の構築物を含有するクローンを、Amp(100μfg/ml)とKan(25μg/ml)を両方とも添加したLB液体培地で終夜(O/N)液体培養する。そのO/N培養物を使って、1:100〜1:250の比率で大きい培養に接種する。光学密度600(O.D.600)が0.4〜0.6になるまで細胞を生育させる。次にIPTG(イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド)を最終濃度が1mMになるように加える。IPTGはlacIリプレッサーを不活化し、P/Oをきれいにして、遺伝子発現量の増加をもたらす。
【0274】
細胞をさらに3〜4時間生育する。次に、遠心分離(6000×gで20分)によって細胞を収集する。細胞ペレットを、カオトロピック試薬6M塩酸グアニジンに、4℃で3〜4時間撹拌することによって、可溶化する。遠心分離によって細胞破片を除去し、ポリペプチドを含む上清を、ニッケル−ニトリロ−三酢酸(「Ni−NTA」)アフィニティー樹脂カラム(上掲のQIAGEN, Inc.から入手可能)に負荷する。6×Hisタグを持つタンパク質は高い親和性でNi−NTA樹脂に結合し、簡単な一段階操作で精製することができる(詳細は「The QIAexpressionist」(1995, QIAGEN, Inc.、上掲)を参照)。
【0275】
簡単に述べると、6M塩酸グアニジン(pH8)中のカラムに上清を負荷し、そのカラムをまず10容量の6M塩酸グアニジン(pH8)で洗浄し、次に10容量の6M塩酸グアニジン(pH6)で洗浄し、最後に6M塩酸グアニジン(pH5)でポリペプチドを溶出させる。
次に、精製されたタンパク質を、リン酸緩衝食塩水(PBS)または50mM酢酸ナトリウム(pH6)緩衝液+200mM NaClに対して透析することによって再生する。あるいは、Ni−NTAカラム上に固定化している間にタンパク質をうまく再フォールディングさせることもできる。推奨する条件は次の通りである:プロテアーゼ阻害剤を含む500mM NaCl、20%グリセロール、20mMトリス塩酸(pH7.4)中の直線的な6M−1M尿素勾配を用いる再生。再生は1.5時間以上かけて行なうべきである。再生後に、250mMイミダゾールを加えることによって、タンパク質を溶出させる。イミダゾールは、PBSまたは50mM酢酸ナトリウム(pH6)緩衝液+200mM NaClに対する最終透析ステップによって除去される。精製されたタンパク質は4℃で保存するか、または−80℃で凍結する。
【0276】
実施例7−封入体からのポリペプチドの精製
大腸菌中で発現させたポリペプチドが封入体の形で存在する場合は、以下の代替方法を使って、そのポリペプチドを精製することができる。別段の指定がない限り、以下の工程は全て4〜10℃で行う。
大腸菌発酵の生産相が完了したら、細胞培養を4〜10℃に冷却し、15,000rpmでの連続的遠心分離(Heraeus Sepatech)によって細胞を収集する。細胞ペースト単位重量あたりの予想タンパク質収量と、必要な精製タンパク質量に基づいて、適当な量(重量)の細胞ペーストを、100mMトリス、50mM EDTAを含む緩衝液(pH7.4)に懸濁する。高剪断撹拌器を使って均一な懸濁液になるように細胞を分散させる。
【0277】
次に、その溶液をマイクロフルイダイザー(Microfuidics, Corp.またはAPV Gaulin, Inc.)に4000〜6000psiで2回通すことによって、細胞を溶解する。次に、ホモジネートをNaCl溶液と混合して0.5M NaClの最終濃度にした後、7000×gで15分間遠心分離する。得られたペレットを0.5M NaCl、100mMトリス、50mM EDTA、pH7.4で再び洗浄する。
得られた洗浄済封入体を1.5Mグアニジン塩酸塩(GuHCl)で2〜4時間可溶化する。7000×gで15分間の遠心分離の後、ペレットを捨て、ポリペプチド含有上清を4℃で終夜インキュベートして、さらにGuHCl抽出させる。
【0278】
高速遠心分離(30,000×g)で不溶性粒子を除去した後、GuHCl抽出物を、激しい撹拌によって50mMナトリウム、pH4.5、150mM NaCl、2mM EDTAを含む20容量の緩衝液とすばやく混合することにより、GuHCl可溶化タンパク質を再フォールディングさせる。再フィールディングした希釈タンパク質溶液を混合せずに4℃に12時間保った後、さらなる精製段階を行なう。
【0279】
再フォールディングしたポリペプチド溶液を清澄化するには、40mM酢酸ナトリウム(pH6.0)と平衡させた適当な表面積の0.16mm膜フィルター(例えばFiltron)を装着した接線濾過ユニットを前もって用意しておき、それを使用する。濾過した試料を陽イオン交換樹脂(例えばPoros HS-50, Perseptive Biosystems)にのせる。そのカラムを40mM酢酸ナトリウム(pH6.0)で洗浄し、同じ緩衝液中の250mM、500mM、1000mMおよび1500mM NaClで段階的に溶出する。溶出液の280nmでの吸光度を連続的にモニターする。画分を集め、SDS−PAGEでさらに分析する。
【0280】
次に、ポリペプチドを含有する画分をプールし、4容量の水と混合する。次に希釈した試料を、先に調製しておいた強陰イオン交換樹脂(Poros HQ-50, Perceptive Biosystems)と弱陰イオン交換樹脂(Poros CM-20, Perceptive Biosystems)との直列カラムのセットに負荷する。それらのカラムを40mM酢酸ナトリウム(pH6.0)と平衡させる。両カラムを40mM酢酸ナトリウム(pH6.0)、200mM NaClで洗浄する。次に、CM−20カラムを0.2M NaCl、50mM酢酸ナトリウム(pH6.0)から1.0M NaCl、50mM酢酸ナトリウム(pH6.5)までの範囲の10カラム容量の直線的勾配を使って溶出させる。流出液のA280を常にモニターしながら画分を集める。次に、ポリペプチドを含有する画分(例えば16%SDS−PAGEで決定)をプールする。
【0281】
得られたポリペプチドは、上記の再フォールディングステップおよび精製ステップ後に、95%を超える純度を示すべきである。5μgの精製タンパク質を負荷した場合、クーマシーブルー染色した16%SDS−PAGEゲルによって大きな汚染物質バンドが観察されてはならない。精製タンパク質はエンドトキシン/LPS汚染についても試験することができ、通例、LPS含量はLAL試験法で0.1ng/ml未満である。
【0282】
実施例8−バキュロウイルス発現系におけるポリペプチドのクローニングおよび発現
この実施例では、ポリペプチドを発現させるために、プラスミドシャトルベクターpAc373を使って、ポリヌクレオチドをバキュロウイルスに挿入する。典型的バキュロウイルス発現ベクターは、オートグラファ・カリフォルニカ(Autographa californica)核多核体病ウイルス(AcMNPV)の強力なポリヘドリンプロモーターを含み、その後ろに例えばBamHI、XbaIおよびAsp718などといった便利な制限酵素部位が続いている。ポリアデニル化が効率よく起こるように、シミアンウイルス40(「SV40」)のポリアデニル化部位がしばしば使用される。組換えウイルスの選択が容易なように、このプラスミドは、大腸菌由来のベータ−ガラクトシダーゼ遺伝子を、弱いショウジョウバエプロモーターの制御下に、同じ向きで含んでおり、その後ろにポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化シグナルが続いている。挿入される遺伝子の両側には、クローン化ポリヌクレオチドを発現させる生存可能なウイルスが、野生型ウイルスDNAとの細胞媒介相同組換えによって生成するように、ウイルス配列が隣接している。
【0283】
当業者にはよくわかるだろうが、その構築物が転写、翻訳、分泌などのシグナルを、例えばシグナルペプチドや、必要に応じてインフレームAUGを含めて、適切な位置に持つ限り、上記のベクターの代わりに、pVL941およびpAcIM1など、数多くの他のバキュロウイルスベクターを使用することができる。そのようなベクターは、例えばLuckowら、Virology 170: 31-39 (1989)に記載されている。
【0284】
DNA配列の5'および3'末端に対応するPCRオリゴヌクレオチドプライマーを使って、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを増幅することにより、挿入断片を合成する。cDNAインサートの増幅に使用するプライマーは、好ましくは、増幅産物を発現ベクターにクローニングするために、プライマーの5'末端に制限部位を含むべきである。具体的には、寄託されたクローンに含まれているcDNA配列を、AUG開始コドンと、本明細書で同定する天然のリーダー配列(当てはまる場合)を含めて、PCRプロトコールを使って増幅する。天然のシグナル配列をタンパク質の製造に使用する場合、使用するベクターは第2のシグナルペプチドを必要としない。もう一つの選択肢として、Summersら「A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures」Texas Agricultural Experimental Station Bulletin No.1555 (1987)に記載されている標準的方法を使って、バキュロウイルスリーダー配列を含むようにベクターを改変することができる。
【0285】
市販のキット(「Geneclean」BIO 101 Inc.、カリフォルニア州ラホーヤ)を使って1%アガロースゲルから増幅断片を単離する。次に、その断片を適当な制限酵素で消化し、再び1%アガロースゲルで精製する。
プラスミドを対応する制限酵素で消化する。プラスミドは、所望により、ウシ腸ホスファターゼを使って、当該技術分野で知られる常法により、脱リン酸化することができる。次に、市販のキット(「Geneclean」BIO 101 Inc.、カリフォルニア州ラホーヤ)を使って1%アガロースゲルからDNAを単離する。
【0286】
断片と脱リン酸化したプラスミドとをT4 DNAリガーゼで一つにライゲートする。大腸菌HB101または他の適切な大腸菌宿主、例えばXL−1 Blue細胞(Stratagene Cloning Systems、カリフォルニア州ラホーヤ)などを、ライゲーション混合物で形質転換し、培養プレートに広げる。個々のコロニーから得たDNAを消化し、消化産物をゲル電気泳動で解析することによって、上記プラスミドを含む細菌を同定する。クローン化された断片の配列は、DNA配列決定によって確認する。
【0287】
Felgnerら、Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 84: 7413-7417 (1987)に記載のリポフェクション法を使って、上記ポリヌクレオチドを含むプラスミド5μgを、市販の線状バキュロウイルスDNA(「BaculoGold(商標)バキュロウイルスDNA」、Pharmingen、カリフォルニア州サンディエゴ)1.0μgと同時にトランスフェクトする。1μgのBaculoGold(商標)ウイルスDNAと5μgのプラスミドとを、50μlの無血清グレース培地(Life Technologies Inc.、メリーランド州ゲーサーズバーグ)が入っているマイクロタイタープレートの滅菌ウェル中で混合する。その後、リポフェクチン10μlとグレース培地90μlを加え、混合し、室温で15分間インキュベートする。次に、血清を含まないグレース培地1mlが入っている35mm組織培養プレートに接種したSf9昆虫細胞(ATCC CRL 1711)に、上記トランスフェクション混合物を滴下する。次に、そのプレートを27℃で5時間インキュベートする。次に、トランスフェクション溶液をプレートから取り除き、10%ウシ胎児血清を添加したグレース昆虫培地1mlを加える。次に、培養を27℃で4日間続ける。
【0288】
4日後に上清を集め、SummersおよびSmith(上掲)に記載されているように、プラークアッセイを行なう。青色のプラークを生じるgal発現クローンの同定と単離が容易になるように「Blue Gal」(Life Technologies Inc.、ゲーサーズバーグ)を含むアガロースゲルを使用する(このタイプの「プラークアッセイ」に関する詳細な説明は、Life Technologies Inc.(ゲーサーズバーグ)が配布している昆虫細胞培養とバキュロウイルス学に関するユーザーズガイドの9〜10頁に記載されている)。適当なインキュベーション後に青色プラークをマイクロピペッター(例えばエッペンドルフ)の先端で拾う。次に、組換えウイルスを含有するその寒天を、200μlのグレース培地が入っているミクロ遠心管で再懸濁し、組換えバキュロウイルスを含有するその懸濁液を使って、35mmディッシュに接種したSf9細胞を感染させる。4日後に、これら培養皿の上清を収集し、4℃で保存する。
【0289】
ポリペプチドの発現を確認するために、10%熱不活化FBSを添加したグレース培地でSf9細胞を生育する。その細胞を、上記ポリヌクレオチドを含む組換えバキュロウイルスに約2の感染多重度(「MOI」)で感染させる。6時間後に培地を除去し、メチオニンおよびシステインを欠くSF900II培地(Life Technologies Inc.、メリーランド州ロックビルから入手可能)に置換する。42時間後に5μCiの35S−メチオニンおよび5μCiの35S−システイン(Amershamから入手可能)を加える。細胞をさらに16時間培養した後、遠心分離によって収集する。上清中のタンパク質および細胞内タンパク質をSDS−PAGEと、それに続くオートラジオグラフィー(放射性標識した場合)によって解析する。
精製タンパク質のアミノ末端のアミノ酸配列のマイクロシークエンシングを使って、産生されたタンパク質のアミノ末端配列を決定してもよい。
【0290】
実施例9−哺乳類細胞におけるポリペプチドの発現
本発明のポリペプチドは哺乳類細胞中で発現させることができる。典型的な哺乳類発現ベクターは、mRNAの転写の開始を媒介するプロモーター配列、タンパク質コード配列、ならびに転写の終結および転写物のポリアデニル化に必要なシグナルを含有する。他の配列には、エンハンサー、コザック配列、およびRNAスプライシングの供与部位と受容部位とに挟まれた介在配列などがある。効率の高い転写は、SV40の初期および後期プロモーター、レトロウイルス、例えばRSV、HTLVI、HIVIなどのロングターミナルリピート(LTR)、およびサイトメガロウイルス(CMV)の初期プロモーターを使って達成される。しかし細胞の配列(例えばヒトアクチンプロモーター)を使用することもできる。
【0291】
本発明の実施に使用する適切な発現ベクターとしては、例えばpSVLおよびpMSG(Pharmacia、スウェーデン・ウプサラ)、pRSVcat(ATCC37152)、pSV2dhfr(ATCC37146)、pBC12MI(ATCC67109)、pCMVSport2.0およびpCMVSport3.0などのベクターが挙げられる。使用することができるであろう哺乳類宿主細胞には、例えばヒトのHela、293、H9およびJarkat細胞、マウスのNIH3T3およびC127細胞、Cos1、Cos7およびCV1、ウズラQC1−3細胞、マウスL細胞およびチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞などがある。
あるいは、本ポリヌクレオチドが染色体に組み込まれている安定細胞株中で、本ポリペプチドを発現させることもできる。dhfr、gpt、ネオマイシン、ハイグロマイシンなどの選択可能マーカーとの同時トランスフェクションにより、トランスフェクトされた細胞の同定および単離が可能になる。
【0292】
コードされているタンパク質を大量に発現させるために、導入された遺伝子を増幅することもできる。DHFR(ジヒドロ葉酸レダクターゼ)マーカーは、数百コピー、さらには数千コピーもの目的遺伝子を保持する細胞株を開発するのに役立つ(例えばAlt, F. W.ら、J. Biol. Chem., 253: 1357-1370 (1978); Hamlin, J. L.およびMa, C., Biochem. et Biophys. Acta, 1097: 107-143 (1990); Page, M. J.およびSydenham, M. A., Biotechnology 9: 64-68 (1991)を参照)。もう一つの有用な選択マーカーは酵素グルタミンシンターゼ(GS)である(Murphyら、Biochem J. 227: 277-279 (1991); Bebbingtonら、Bio/Technology 10: 169-175 (1992))。これらのマーカーを使用して、哺乳類細胞を選択培地中で生育し、最も高い耐性を持つ細胞を選択する。それらの細胞株には増幅された遺伝子が染色体に組み込まれている。チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞とNSO細胞は、しばしばタンパク質の生産に使用される。
【0293】
本明細書に概説するプロトコールに従って、本発明のポリヌクレオチドを増幅する。タンパク質の生産に天然のシグナル配列を使用する場合、ベクターは第2のシグナルペプチドを必要としない。もう一つの選択肢として、天然のシグナル配列を使用しない場合は、異種シグナル配列を含むようにベクターを改変することができる(例えばWO96/34891を参照)。市販のキット(「Geneclean」BIO 101 Inc.、カリフォルニア州ラホーヤ)を使って、1%アガロースゲルから増幅断片を単離する。次に、断片を適当な制限酵素で消化し、再び1%アガロースゲルで精製する。
次に、増幅断片を同じ制限酵素で消化し、1%アガロースゲルで精製する。次に、単離した断片と、脱リン酸化したベクターとを、T4 DNAリガーゼで一つにライゲートする。次に、大腸菌HB101またはXL−1 Blue細胞を形質転換し、プラスミドpC6に挿入された断片を含む細菌を、例えば制限酵素解析を用いて同定する。
【0294】
活性なDHFR遺伝子を欠くチャイニーズハムスター卵巣細胞を形質転換に使用する。5μgの発現プラスミドを、リポフェクチン(Filgnerら,上掲)を使って、0.5μgのプラスミドpSVneoと同時トランスフェクトする。プラスミドpSV2−neoは優性選択可能マーカー、G418を含む抗生物質群に対する耐性を付与する酵素をコードするTn5由来のneo遺伝子を含有する。1mg/mlのG418を添加したアルファ−MEMに細胞を接種する。2日後に、細胞をトリプシン処理し、10、25または50ng/mlのメトトレキセートと1mg/mlのG418とを添加したハイブリドーマクローニングプレート(Greiner、ドイツ)中のアルファ−MEMに接種する。約10〜14日後に、単クローンをトリプシン処理し、次に様々な濃度のメトトレキセート(50nM、100nM、200nM、400nM、800nM)を使用して、6ウエルペトリ皿または10mlフラスコに接種する。次に、最も高いメトトレキセート濃度で生育するクローンを、さらに高濃度のメトトレキセート(1μM、2μM、5μM、10mM、20mM)を含む新しい6ウエルプレートに移す。同じ操作を100〜200μMの濃度で生育するクローンが得られるまで繰返す。所望の遺伝子産物の発現を、例えばSDS−PAGEとウェスタンブロットとによって、または逆相HPLC分析によって分析する。
【0295】
実施例10−タンパク質融合物
本発明のポリペプチドは、好ましくは、他のタンパク質に融合される。これらの融合タンパク質は様々な用途に使用することができる。例えば、Hisタグ、HAタグ、プロテインA、IgGドメイン、およびマルトース結合タンパク質への本ポリペプチドの融合は、精製を容易にする(本明細書の実施例参照:EP A 394,827;Trauneckerら、Nature 331: 84-86 (1988)も参照)。また、IgG−1、IgG−3およびアルブミンへの融合は生体内半減期を増加させる。本発明のポリペプチドに融合された核局在化シグナルは、そのタンパク質を特定の細胞内位置に誘導することができ、共有結合したヘテロ二量体またはホモ二量体は、融合タンパク質の活性を増加または減少させることができる。融合タンパク質は、2以上の機能を持つキメラ分子を作り出すこともできる。最後に、融合タンパク質は、融合タンパク質の溶解度および/または安定性を、非融合タンパク質と比べて増加させることができる。上述したタイプの融合タンパク質はいずれも、IgG分子へのポリペプチドの融合を概説する以下のプロトコールに変更を加えることによって製造することができる。
【0296】
簡単に述べると、IgG分子のヒトFc部分は、下記の配列の5'および3'末端をまたぐプライマーを使って、PCR増幅することができる。これらのプライマーは、発現ベクター(好ましくは哺乳類発現ベクター)へのクローニングを容易にする便利な制限酵素部位も持つべきである。クローニングされるポリヌクレオチドには停止コドンは含まれないことに注意すべきである。そうしなければ、融合タンパク質が産生されないことになる。
タンパク質の生産には天然のシグナル配列を使用することができる(当てはまる場合)。もう一つの選択肢として、天然のシグナル配列を使用しない場合は、異種シグナル配列を含むようにベクターを改変することができる(例えばWO96/34891および/または上掲の米国特許第6,066,781号を参照)。
【0297】
ヒトIgG Fc領域:
GGGATCCGGAGCCCAAATCTTCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAATTCGAGGGTGCACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACTCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTAAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAACCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCAAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAGTGCGACGGCCGCGACTCTAGAGGAT(配列番号32)。
【0298】
実施例11−ポリペプチドからの抗体の作製
本発明の抗体は様々な方法で製造することができる(「Current Protocols」第2章参照)。そのような方法の一例として、本発明のポリペプチドを発現させる細胞を動物に投与して、ポリクローナル抗体を含む血清の産生を誘導する。好ましい一方法では、タンパク質の調製物を調製し、それを精製して、天然の夾雑物を実質的に含まないようにする。次に、より比活性の高いポリクローナル抗血清を産生させるために、そのような調製物を動物に導入する。
【0299】
最も好ましい方法では、本発明の抗体はモノクローナル抗体(またはそのタンパク質結合性断片)である。そのようなモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術を使って製造することができる(Koehlerら、Nature 256: 495 (1975); Koehlerら、Eur. J. Immunol. 6: 511 (1976); Koehlerら、Eur. J. Immunol. 6: 292 (1976); Hammerlingら「Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas」(Elsevier、ニューヨーク、1981)の563〜681頁)。一般に、このような手法では、ポリペプチドによる、より好ましくはポリペプチド発現細胞による、動物(好ましくはマウス)の免疫が行なわれる。そのような細胞は任意の適当な組織培養培地で培養してよいが、細胞は、10%ウシ胎仔血清(約56℃で不活化したもの)ならびに約10g/lの非必須アミノ酸、約1,000U/mlのペニシリンおよび約100μg/mlのストレプトマイシンを添加したアール変法イーグル培地で培養することが好ましい。
【0300】
上記マウスの脾細胞を摘出し、適当な骨髄腫細胞株と融合する。本発明では任意の適切な骨髄腫細胞株を使用することができるが、ATCCから入手できる親骨髄腫細胞株(SP2O)を使用することが好ましい。融合後、得られたハイブリドーマ細胞をHAT培地中に選択的に維持し、次に、Wandsらが記載しているように(Gastroenterology 80: 225-232 (1981))、限界希釈法によってクローン化する。次に、そのような選択によって得られたハイブリドーマ細胞をアッセイして、本ポリぺプチドを結合する能力を持つ抗体を分泌するクローンを同定する。
【0301】
別法として、本ポリペプチドに結合することができる抗体は、抗イディオタイプ抗体を用いる二段階法で製造することもできる。そのような方法では、抗体自体が抗原であり、それゆえに第二の抗体に結合する抗体を得ることができるという事実を利用する。この方法では、タンパク質特異抗体を使って、動物、好ましくはマウスを免疫する。次に、そのような動物の脾細胞を使ってハイブリドーマ細胞を作製し、そのハイブリドーマ細胞をスクリーニングして、上記タンパク質特異抗体に結合するというその能力を本ポリペプチドによって遮断することができる抗体を産生するクローンを同定する。そのような抗体は、上記タンパク質特異抗体に対する抗イディオタイプ抗体を含み、動物を免疫してさらなるタンパク質特異抗体の形成を誘導するために使用することができる。
【0302】
本発明の抗体のFabおよびF(ab')断片ならびに他の断片を本明細書に開示する方法に従って使用できることは理解されるだろう。そのような断片は通例、パパイン(Fab断片を製造する場合)やペプシン(F(ab')断片を製造する場合)などの酵素を使って、タンパク質分解的開裂によって製造される。別法として、タンパク質結合性断片は、組換えDNA技術の応用によって、または合成化学によって製造することもできる。
【0303】
ヒトでの抗体の生体内使用には「ヒト化」キメラモノクローナル抗体を使用することが好ましいかもしれない。そのような抗体は、上述のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞に由来する遺伝子構築物を使って製造することができる。キメラ抗体の製造方法は当該技術分野では知られている(概観するには、Morrison, Science 229: 1202 (1985); Oiら、BioTechniques 4: 214 (1986); Cabillyら、米国特許第4,816,567号; Taniguchiら、EP171496; Morrisonら、EP173494; Neubergerら、WO8601533; Robinsonら、WO8702671; Boulianneら、Nature 312: 643 (1984); Neubergerら、Nature 314: 268 (1985)を参照)。
【0304】
さらに、もう一つの好ましい方法として、本発明のポリペプチドに対する抗体を植物内で産生させてもよい。具体的方法は、米国特許第5,959,177号および第6,080,560号に開示されており、これらの特許は参照のためその全体が本明細書に引用される。これらの方法は、抗体を発現させる方法を記載しているだけでなく、外来の多量体型タンパク質(すなわち抗体など)を植物内で組み立てて、植物からそのような抗体を分泌させる手段も記載している。
【0305】
本発明は上記の具体的な態様によって範囲が限定されるものではなく、これらは本発明の個々の側面の単なる例示的な説明に過ぎないものであって、機能的に等価な方法および成分は本発明の範囲に含まれる。実際、本明細書に示し記載したものに加えて本発明の種々の改変は、上記の記載および添付の図面から当業者には明らであろう。そのような改変は添付の特許請求の範囲に包含されることを意図している。
発明の背景、詳細な説明、および実施例に挙げた各文献(特許、特許出願、雑誌記事、抄録、実験マニュアル、書籍、または他の公表物を含む)の全内容は、参照のため本明細書中に引用される。さらに、本願と共に提出される配列表のハードコピー、および対応するコンピュータで読み取り可能な形態は、ともに参照のため本明細書中に引用される。
【図面の簡単な説明】
【0306】
【図1A】ヒトhVR1d.1の核酸配列である。推定の開始コドンは太字で示してあり、停止コドンは下線を付してある。
【図1B】ヒトhVR1d.2の核酸配列である。推定の開始コドンは太字で示してあり、停止コドンは下線を付してある。
【図2A】ヒトhVR1d.1のアミノ酸配列であり、6つの膜貫通ドメインは太字で示してあり、アンキリンドメインには下線を付してあり、孔ループ領域は囲んである。
【図2B】ヒトhVR1d.2のアミノ酸配列であり、6つの膜貫通ドメインは太字で示してあり、アンキリンドメインには下線を付してあり、孔ループ領域は囲んである。
【0307】
【図3】報告されたバニロイドレセプターhVR1、hVR2、OTRPC4、およびhECaCとのhVR1d.2のアミノ酸配列のアラインメント(GCGパイルアッププログラムを使用)。
【図4】hVR1dの組織発現プロフィル。
【図5】hVR1dスプライス変異体であるhVR1dの組織発現プロフィル。
【図6】hVR1dスプライス変異体であるhVR1d.2の脳のサブ領域での組織発現プロフィル。

Claims (26)

  1. 以下よりなる群の成員を含む単離核酸:
    (a)図2Aまたは図2B(配列番号2または4)に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列;
    (b)請求項1に記載の核酸分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができ、天然のhVR1dタンパク質の活性を有するhVR1dポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離核酸;
    (c)図1Aに示す核酸配列を含む単離核酸;
    (d)図1Bに示す核酸配列を含む単離核酸;
    (e)ATCC受託番号 の核酸配列を有する単離ポリヌクレオチド;
    (f)配列番号1のヌクレオチド4〜2160による核酸配列を有し、該ヌクレオチドが配列番号2から開始コドンを差し引いたポリペプチドをコードしている単離ポリヌクレオチド;
    (g)配列番号1のヌクレオチド4〜2160による核酸配列を有し、該ヌクレオチドが開始コドンを含む配列番号2のポリペプチドをコードしている単離ポリヌクレオチド;
    (h)配列番号3のヌクレオチド4〜2235による核酸配列を有し、該ヌクレオチドが配列番号4から開始コドンを差し引いたポリペプチドをコードしている単離ポリヌクレオチド;
    (i)配列番号3のヌクレオチド4〜2235による核酸配列を有し、該ヌクレオチドが開始コドンを含む配列番号4のポリペプチドをコードしている単離ポリヌクレオチド;
    (j)(a)から(i)のいずれかの核酸配列の相補鎖;
    (k)hVR1dタンパク質またはポリペプチドをコードする(a)から(i)のいずれかの核酸が、異種タンパク質またはペプチドをコードする核酸配列にインフレームで連結してなる単離核酸;
    (l)以下をコードする核酸配列を含む核酸:(a)hVR1d.1の欠失変異体;(b)hVR1d.2の欠失変異体;または(c)(a)または(b)の核酸配列の相補鎖;
    (m)以下をコードする核酸配列を含む核酸:(a)hVR1d.1の置換変異体;(b)hVR1d.2の置換変異体;または(c)(a)または(b)の核酸配列の相補鎖。
  2. 請求項1に記載の核酸を含む組換えベクター。
  3. 宿主細胞中での核酸の発現を制御する転写および翻訳制御情報を含む制御ヌクレオチド配列に作動可能に連結した請求項1に記載の核酸を含む発現ベクター。
  4. 請求項1に記載の核酸を含む遺伝子工学により作製した宿主細胞。
  5. 宿主細胞中での核酸の発現を制御する転写および翻訳制御情報を含む制御ヌクレオチド配列に作動可能に連結した請求項1に記載の核酸を含む、遺伝子工学により作製した宿主細胞。
  6. (a)請求項4に記載の宿主細胞を適当な培地で培養してhVR1dポリペプチドを産生させ、ついで
    (b)該hVR1dポリペプチドを単離する
    工程を含む、hVR1dポリペプチドの製造方法。
  7. (a)請求項5に記載の宿主細胞を適当な培地で培養してhVR1dポリペプチドを産生させ、ついで
    (b)該hVR1dポリペプチドを単離する
    工程を含む、hVR1dポリペプチドの製造方法。
  8. hVR1dポリペプチドがhVR1d.1またはhVR1d.2または機能的に等価なその誘導体である、請求項6または7に記載の方法。
  9. hVR1dポリペプチドのエピトープに特異的に反応する抗体調製物。
  10. 請求項1に記載の核酸を含むトランスジェニック動物。
  11. 請求項1に記載の核酸によりコードされる実質的に純粋なポリペプチド。
  12. 図2Aまたは図2B(配列番号2または4)に示す実質的に純粋なヒトhVR1dポリペプチド。
  13. 図2Aまたは図2B(配列番号2または4)に示すポリペプチドと少なくとも90%同一である実質的に純粋なポリペプチド。
  14. 請求項13に記載のポリペプチドと第二の異種ポリペプチドとを含む融合タンパク質。
  15. 請求項11に記載のポリペプチドの治療学的有効量および薬理学的に許容しうる担体を含む医薬製剤。
  16. 試料中の野生型または変異体hVR1d核酸分子の検出および/または定量用試験キットであって、該試料を請求項1に記載の核酸と接触させ、ついで野生型または変異体hVR1d核酸の存在または不在および/または量の指標として標識を検出および/または定量する、工程を含む試験キット。
  17. hVR1d活性を変調する化合物の同定方法であって、
    (a)被験化合物をhVR1d遺伝子を発現する細胞と接触させ、
    (b)該細胞でのhVR1d遺伝子の発現レベルを測定し、ついで
    (c)(b)で得られたレベルを該化合物の不在下で得られたhVR1d遺伝子の発現と比較し、その際、(b)で得られたレベルが該化合物の不在下で得られたレベルと異なる場合にはhVR1d活性を変調する化合物が同定される
    ことを含む方法。
  18. イオンチャンネル関連障害を制御する化合物の同定方法であって、
    (a)被験化合物を請求項1に記載の核酸を発現する細胞と接触させ、ついで
    (b)該被験化合物がhVR1d活性を変調するか否かを決定する
    ことを含む方法。
  19. イオンチャンネル関連障害を制御する化合物の同定方法であって、
    (a)被験化合物を、hVR1d制御配列に作動可能に連結したリポーター遺伝子を含む細胞または細胞溶解液と接触させ、ついで
    (b)リポーター遺伝子産物の発現を検出する
    ことを含む方法。
  20. イオンチャンネル関連障害を制御する化合物の同定方法であって、
    (a)被験化合物をhVR1d転写物を含む細胞または細胞溶解液と接触させ、ついで
    (b)該hVR1d転写物の翻訳を検出する
    ことを含む方法。
  21. hVR1dポリペプチドの治療学的有効量を患者に投与することを含む、患者においてイオンチャンネル関連障害を変調する方法。
  22. hVR1dポリペプチドの活性を変調することを含む、イオンチャンネル関連障害の治療方法。
  23. hVR1dポリペプチドの活性を増大させるかまたは該活性と拮抗する化合物の有効量を投与することを含む、請求項22に記載の方法。
  24. hVR1d遺伝子の発現を低減させる化合物の有効量を投与することを含む、イオンチャンネル関連障害の治療方法。
  25. hVR1dの生物学的活性を変調する化合物の同定方法であって、
    (a)候補モデュレーター化合物を配列番号2に示す配列を有するhVR1dと混合し、ついで
    (b)hVR1dの活性に対する該候補モデュレーター化合物の作用を測定する
    ことを含む方法。
  26. 請求項25に記載の方法によって同定したヒトhVR1dの生物学的活性を変調する化合物。
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