JP2005501524A - アポトーシスを調節する薬剤 - Google Patents

Abstract

本発明は、疾患プロセスに関与する薬剤の同定に、一般的に関連し、そしてより具体的にはアポトーシス誘導の阻害に関与する遺伝子、核酸配列、タンパク質配列およびアミノ酸配列の同定に関連する。本発明は、アポトーシス誘導を促進するために、リボザイムをコードする核酸、リボザイム自体の同定、およびこれらの使用にもまた関連する。本発明は、細胞内で、アポトーシス誘導の阻害に関与する遺伝子、核酸配列、タンパク質配列、およびアミノ酸配列を提供する。本発明はまた、これらの遺伝子のＲＮＡ相関性および核酸配列を提供する。本明細書中で開示される、遺伝子と相互作用する単離された核酸分子、核酸配列およびＲＮＡ相関性をさらに提供するので、アポトーシス誘導に対する単離核酸分子の阻害効果が低下し、従ってアポトーシス誘導を促進する。

Description

【技術分野】
【０００１】
本発明は、疾患プロセスに関与する薬剤の同定に、一般的に関連し、そしてより具体的にはアポトーシス誘導の阻害に関与する遺伝子、核酸配列、タンパク質配列およびアミノ酸配列の同定に関連する。本発明は、アポトーシス誘導を促進するために、リボザイムをコードする核酸、リボザイム自体の同定、およびこれらの使用にもまた関連する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
アポトーシス、またはプログラム化された細胞死は、変性死または壊死と基本的に対照的である、遺伝子指向性細胞自滅の活性化プロセスである。アポトーシス細胞死は、細胞収縮、染色体の凝縮化、細胞質の小疱形成、上昇した膜透過性および染色体間のＤＮＡ切断によって特徴付けられる。
【０００３】
アポトーシスを介するプログラム化された細胞死のプロセスは、種々の正常な生物学的事象および病原性の生物学的事象と関連し、そして多くの関連しない刺激によって、誘導され得る。胚形成、免疫系の応答、ウイルス感染細胞の除去、および組織恒常性の維持を含む多くの生物学的プロセスは、アポトーシスを含む。アポトーシスの生物学的調節における変化は、加齢の間もまた生じ、そして多くの加齢に関する状態および疾患に関与する。
【０００４】
正常な生理学において、アポトーシスの役割が演じられるので、このようなプロセスにおいて生じるアポトーシスの欠如は、疾患に寄与し得る。例えば、アポトーシスのプロセスの阻害が癌形成または癌増殖に関与する実質的な証拠が、蓄積されている。結果として、アポトーシス細胞死の誘導を介する癌細胞の除去が、癌治療における有望なアプローチと、ここでは考えられる。癌処置に首尾よく使用されている、種々の化学療法的化合物および電離放射線が（例えば、野生型ｐ５３のような、周知のアポトーシス誘導遺伝子を活性化することによって）、腫瘍細胞内におけるアポトーシスを誘導することを示している。
【０００５】
しかし、癌および他の疾患の状態におけるアポトーシス誘導プロセスは、複雑であり、そしてアポトーシスを調節することに関与する遺伝子および遺伝子生成物を同定するために、行われるさらに多くの必要事項がある。このことに関して、アポトーシスを阻害する遺伝子または遺伝子生成物の活性に影響する新しい薬剤の発見は、各種の条件下で治療的有用性を有する。本発明は、これらの必要事項に取り組み、そして同様に関連する利点を提供する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、細胞内でアポトーシス誘導の阻害に関与する遺伝子、核酸配列、タンパク質配列およびアミノ酸配列を提供する。本発明はまた、これらの遺伝子および核酸配列のＲＮＡ相関性を提供する。本明細書中で開示される、遺伝子と相互作用する単離された核酸分子、核酸配列およびＲＮＡ相関性をさらに提供するので、アポトーシス誘導に対するこれらの阻害効果は低下し、従って、アポトーシス誘導が促進される。
【０００７】
本発明の単離核酸分子としては、リボザイムをコードするヌクレオチド配列が挙げられる。本発明のリボザイムは、ハイブリダイズする「基質結合配列」を有し、そして遺伝子および本明細書中で開示される遺伝子配列によってコードされるｍＲＮＡの相補的配列を切断し、従ってアポトーシスを促進する。リボザイムをコードする発現ベクター、ベクターを含む細胞、およびリボザイム発現細胞は、本発明の範囲内に含まれる。さらに、例えば、実施例６に示されるように、本発明のリボザイムを、細胞内に直接に（すなわち、ベクター使用なしに）誘導し得る。
【０００８】
本発明は、このような細胞内に、本発明のリボザイムを導入することによって、細胞（例えば、癌細胞のようなアポトーシス誘導に耐性の細胞）内のアポトーシス誘導を促進するための方法をさらに提供する。例えば、これらの細胞を、本発明のリボザイムをコードする発現ベクターで形質転換し得、そして必要に応じて薬剤誘導アポトーシスを細胞内に導入し得る。
【０００９】
本発明は、細胞（例えば、アポトーシス誘導に耐性の細胞）内で、アポトーシス誘導を促進し得る薬剤を同定するための方法をさらに提供する。この方法は、薬剤およびタンパク質もしくはポリペプチドのレベルまたは活性の測定と共に、本明細書中で開示される遺伝子および遺伝子配列、またはこれらの遺伝子もしくは遺伝子配列自体によってコードされるタンパク質またはポリペプチドを接触することを含有する。レベルにおける低下は、薬剤がアポトーシス誘導を促進し得ることを示す。代表的な薬剤としては、アンチセンスオリゴヌクレオチド、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、ならびに低分子の薬物が挙げられる。
【００１０】
（発明の詳細な説明）
本発明は、リボザイムをコードする単離された核酸分子を提供し、各リボザイムは、アポトーシス誘導の阻害に関与する標的核酸分子を認識する、「基質結合配列」を有する。本発明のリボザイムは、標的核酸分子に結合し、そしてこれらを切断し、それによってアポトーシス誘導のインヒビターとして機能するリボザイムの能力を損なう、触媒的ＲＮＡ分子である。本発明のリボザイムを、本明細書中で記載される方法によって同定および選択する。これらは、「ヘアピン」リボゾーム、「ハンマーヘッド」リボゾーム、または当該分野で公知である任意の他の型のリボザイムである。
【００１１】
図１は、ヘアピンリボザイム（配列番号１）の基本構造、およびヌクレオチド配列（囲みの中（Ｓｈａｄｅｄ）、大文字）、ならびに標的基質（Ｎまたはｎ＝任意のヌクレオチド）の相補的ヌクレオチド配列（小文字；配列番号２）に対するその関係を示す。ヘアピンリボザイムは、ヌクレオチドの１７位の５’末端から始まる非基質的結合配列を有する５０〜５４個のヌクレオチドＲＮＡ分子からなる。ヘアピンリボザイムは、リボザイムと基質との間で形成する、２個のらせん状ドメイン（らせん３および４）および３個のループ（ループ２、３および４）および２個のさらなるらせん（らせん１および２）からなるヘアピンに似た、二次元構造へと折り畳まれる。らせん２の長さを４塩基対で固定し、そしてらせん１の長さは、代表的に、６から１０個の塩基対で変動する。リボザイムによる基質ヌクレオチドの認識は、構造５’−ＧＵＧ−３’または５’−ＧＵＡ−３’を有する代表的な基質認識部位を有する、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対合を介して生じる。最大活性に関して、ＲＮＡ標的基質は、矢印によって示されるように、Ｇの５’の直後で生じる切断を有する、反対側のループ１であるループ中にＧＵＣを含み得る。ヘアピンリボザイムの触媒（しかし、基質結合しない）活性を、ループ２中の５’−ＡＡＡ−３’を５’−ＣＧＵ−３’へと変異させることによって無効にし得る。
【００１２】
ハンマーヘッドリボザイムの一般構造を、その標的ＲＮＡ配列（配列番号４）と共に図２（配列番号３）に示す。本発明内での使用に適切なハンマーヘッドリボザイムは、好ましくは、配列ＮＵＨを認識し、ここでＮはＧ、Ｕ、Ｃ、またはＡのいずれかであり、そしてＨは、Ｃ、Ｕ、またはＡである。本発明のヘアピンリボザイムの認識部位（５’−ＧＵＣ−３’または５’−ＧＵＡ−３’）が、ハンマーヘッド認識部位（５’−ＮＵＨ−３’）のサブセットであり、その結果、全てのヘアピン認識部位は、当然、ハンマーヘッド認識部位である（しかし、逆は、真実ではない）ことが理解される。
【００１３】
キメラのハンマーヘッドリボザイム（すなわち、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド）を、切断に適切なＮＵＨ配列を認識するように設計する。一般的には、殆どまたは全ての結合アームおよびステムループは、ＤＮＡを含む。対照的に、一般的には、触媒性ドメイン（図２で、結合アームとステムループとの間に示される）は、ＲＮＡを含む。
【００１４】
改変は、ステムループまたは触媒性ドメイン領域での塩基組成の改変は、インビトロでの切断によってアッセイされる、リボザイムの触媒活性を増大し得る。ＷＯ ００／３２７６５を参照のこと。塩基の糖の２位での改変（例えば、ＲＮＡ塩基のこの位置での−ＯＣＨ_３を置換すること）は、リボザイムの安定性を増大し得る。他の安定化置換基としては、以下が挙げられる：−ＯＣ_１〜６アルキル、−Ｆまたは他のハロゲン、アミノ、アジド、ニトロ、およびフェニル。米国特許第５，２９８，６１２号を参照のこと。
【００１５】
用語 リボザイムの「基質結合配列」とは、本明細書中で使用される場合、塩基対が標的核酸の相補的配列（本明細書中では「リボザイム配列タグ」または「ＲＳＴ」といわれる）を有するリボザイムの部分をいう。例えば、図１（配列番号：）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）の配列の５’末端での１６個のヌクレオチドは、ヘアピンリボザイムの基質結合配列に関する一般式を表す。これは、リボザイム機能のために必要であり得る、これらの２つのアーム間の標的ヌクレオチドおよび任意の必要なヌクレオチド（例えば、ＡＡＧＡまたはＡＡＧＣ）を有するらせんを形成する２つのアームを含む。ハンマーヘッドリボザイムの基質結合配列に関する一般式は、標的ＲＮＡ（配列番号４）の相補的配列（ＲＳＴ）と並べて示される基質結合配列と共に、図２（配列番号３）に示される。
【００１６】
全てのヘアピンリボザイムの構造における基本的類似性に起因して、これらを選抜きの特定の基質結合配列を有するリボザイムを得るために改変し得る。例えば、配列５’−ＮＮＮＮＮ^＊ＧＵＣＮＮＮＮＮＮＮＮ（配列番号７）を有するＲＮＡを切断する「ＧＵＣリボザイム」の基質結合配列を、リボザイムの基質結合配列の５’末端から９位の塩基を変更することによって、配列５’−ＮＮＮＮＮ^＊ＧＵＡＮＮＮＮＮＮＮＮ（配列番号８）を有するＲＮＡを切断する「ＧＵＡリボザイム」の基質結合配列に改変し得る。これらの配列の両方において、Ｎは、Ｇ，Ｕ，Ｃ、またはＡのいずれかであり；そしてアスタリスクは、標的ＲＮＡの切断が生じる部位を示す。
【００１７】
好ましい「ＧＵＣヘアピンリボザイム」は、一般式５’−（Ｎ）_{（６〜１０）}ＡＧＡＡ（Ｎ）_４−３’（配列番号９）（ここで、ＮがＧ、Ｔ、Ｃ、またはＡのいずれかである）を有する基質結合配列を有する。好ましい「ＧＵＡヘアピンリボザイム」は、一般式５’−（Ｎ）_{（６〜１０）}ＣＧＡＡ（Ｎ）_４−３’（配列番号１０）（ここで、ＮがＧ、Ｔ、Ｃ、またはＡのいずれかであり得る）を有する基質結合配列を有する。これらの式に基づいて、本明細書中で開示される特定のリボザイムの基質結合配列の場合において、配列はまた、２個以下のヌクレオチドがこの配列の５’末端から１〜５位のいずれかにおいて異なる、バリエーションを含む。このことは、基質結合配列の５’末端での最初の５個のヌクレオチド内の１個または２個の塩基を変化し得、そしてリボザイムの機能的活性をなおも保持し得ることを意味する。
【００１８】
同様に、一旦、特定のヘアピンリボザイムの基質結合配列が同定されると、ハンマーヘッドリボザイムに関する等量の基質結合配列を操作することが比較的容易である。ハンマーヘッドの基質結合配列の一般構造は、リボザイムの結合アームの５’末端で６〜９個の塩基、および他の結合アームの３’末端で６〜９個の塩基を含む。例えば、以下のアプローチを使用し得る：１）目的の特定ヘアピンリボザイムのＲＮＡ標的のリボザイム配列タグ（ＲＳＴ）を同定する；２）ＲＳＴの３’末端での最初の６〜９個のヌクレオチドに対して相補的な場合、ハンマーヘッドの５’末端での最初の６〜９個のヌクレオチドを特定する；３）ＲＳＴの５’末端でのヌクレオチドに対して相補的な場合、ハンマーヘッドの３’末端での最初の５個のヌクレオチドを特定する；そして４）ＲＳＴに対して相補的である一方で、３’末端からの塩基８がＡである場合、ハンマーヘッドの３’末端から６および７位でのヌクレオチドを特定する。
【００１９】
従って、本発明のリボザイムは、以下を含み得ることが理解される：ａ）リボザイムの一方の結合アームの部分として、本明細書中で開示される、リボザイムの基質結合配列のいずれかの３、４、５、６、７、８または９個の連続した塩基；およびｂ）リボザイムの他方の結合アームの部分として、リボザイムの基質結合配列の残りの連続した塩基のいずれかの３、４、５、６、７、８、または９個の連続した塩基。
【００２０】
ハンマーヘッドリボザイムは、本明細書中で開示される基質結合配列（例えば、ＲＡＰ６の基質結合配列（配列番号１９）の２〜８、および１３〜１６の塩基、またはＥｓｔ２−２の基質結合配列（配列番号９７）の２〜８および１３〜１６の塩基）のうち、１個の配列を組み込むことによって設計され得る。あるいは、他の基質結合配列（例えば、ＲＡＰ２（配列番号１７）、ＲＡＰ４：（配列番号１８）、ＲＡＰ１０（配列番号２０）、ＲＡＰ５９４（配列番号２１）、ＮＨＭＣＺＦ−４（配列番号４６）、Ｅｓｔ２−１（配列番号９６）、ＦＡ５−ＶＲ１（配列番号１３４）およびＦＡ５−ＶＲ５（配列番号１３８））の２〜８および１３〜１６の塩基。確かに、本明細書中で開示される任意のリボザイム基質結合配列の２〜８および１３〜１６の塩基を、同様にハンマーヘッドリボザイム中に組み込み得る。
【００２１】
好ましいキメラのハンマーヘッドリボザイムは、配列番号５であり、これを、ＲＡＰ６（配列番号１９）の塩基配列に組み込むために、そしてＲＡＰ６相補的ＲＳＴ（配列番号２４）に結合するように設計した。別の好ましいキメラのハンマーヘッドリボザイムは、配列番号６であり、これを、Ｅｓｔ２−２（配列番号９７）の塩基配列を組み込むために、そしてＥｓｔ２−２相補的ＲＳＴ（配列番号９９）に結合するために設計した。以下の実施例６に開示されるように、これら２種類のキメラのハンマーヘッドリボザイムを、細胞（例えば、癌細胞）中のアポトーシス誘導を促進するために、単独または組み合わせて使用し得る。好ましくは、これらの細胞は、アポトーシスに対して耐性である。好ましくは、これらのリボザイムを、アポトーシス誘導剤（例えば、Ｆａｓ）と組み合わせて使用する。
【００２２】
これらの好ましいリボザイムにおいて、ステムループは、１，３−プロピレン−ジオールリンカーを含む。未反応のジオールの一方の−ＯＨを、−Ｏ（ＤＭＴ）（ＤＭＴはジメトキシトリチルである）によって置換し；そして他方の−ＯＨを、−Ｏ−Ｐ（Ｏ−ＣＮ−Ｅｔ）−Ｎ（イソプロピル）_２によって置換する。リボザイム中に組み込まれる場合、各−ＯＨを、−Ｏ（ＰＯ_４）によって置換する。
【００２３】
本明細書中で使用される場合、用語「未改変塩基」とは、糖（デオキシリボースまたはリボフラノース）の５−炭素に結合するリン酸を有する、糖の１−炭素に結合される、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシルまたはチミンの塩基のうちの１つを意味する。塩基は、１個の塩基の３−炭素と次の塩基の５−炭素との間のリン酸ジエステル結合を介して互いに結合する。
【００２４】
本明細書中で使用される場合、用語「改変塩基」とは、その化学構造を以下のように改変する任意の塩基を意味する。アデニンを改変して、以下を生じ得る：６−ジメチル−アミノ−プリン、６−メチル−アミノ−プリン、２−アミノ−プリン、２，６−ジアミノ−プリン、６−アミノ−８−ブロモ−プリンまたは６−アミノ−８−フルオロ−プリン。シトシンを改変して、以下を生じ得る：５−ブロモ−シトシン、５−フルオロ−シトシン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−シトシン、Ｎ−メチル−シトシン、２−チオ−シトシン、または２−ピリドン。グアニンを改変して、以下を生じ得る：８−ブロモ−グアニン、８−フルオログアニン、２−アミノ−プリン、ヒポキサンチン（ｈｙｐｏｚａｎｔｈｉｎｅ）（イノシン）、７−デアザ−グアニン、または６−チオ−グアニン。ウラシルを改変して、以下を生じ得る：３−メチル−ウラシル、５，６−ジヒドロ−ウラシル、４−チオ−ウラシル、チミン、５−ブロモ−ウラシル、５−ヨード−ウラシル、または５−フルオロ−ウラシル。チミンを改変して、以下のものを生じ得る：３−メチル−チミン、５，６−ジヒドロ−チミン、４−チオ−チミン、ウラシル、５−ブロモ−ウラシル、５−ヨード−ウラシル、または５−フルオロ−ウラシル。このような修飾および他の修飾（例えば、ハロゲン置換基、ヒドロキシ置換基、アミン置換基、アルキル置換基、アジド置換基、ニトロ置換基、およびフェニル置換基）を作製する方法は、米国特許第５，８９１，６８４号；および米国特許第５，２９８，６１２号に開示される。本発明は、１個以上の塩基が修飾される配列を含む。
【００２５】
さらに、塩基の糖部分を、ハンマーヘッドリボザイムの塩基に関して、上記で開示されるように修飾し得る。本発明は、１個以上の塩基がそのように修飾される配列を含む。
【００２６】
本明細書中で使用される場合、用語「核酸」または「核酸分子」とは、一本鎖形態または二本鎖形態のいずれかでの、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、そのオリゴマーおよびポリマーをいう。詳細に限定されない限り、この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有する、天然ヌクレオチドの公知のアナログを含む核酸を包含する。例えば、本明細書中で開示される場合、このようなアナログは、置換基（例えば、糖部分の２位におけるメトキシ）を有するアナログを含む。文脈によって別に示されない限り、この用語は、遺伝子、遺伝子によってコードされるｃＤＮＡおよびｍＲＮＡと共に、交換可能に使用される。
【００２７】
本明細書中で使用される場合、句「〜をコードするヌクレオチド配列」とは、例えば、リボザイム、ｍＲＮＡ、ＲＮＡ構造など、または特定のタンパク質もしくはペプチドの一次アミノ酸配列に関する、配列情報を含む核酸をいう。リボザイムに関連して、他に示されない限り、明白に特定されるコードヌクレオチド配列はまた、その標的核酸に対するリボザイムの特異性に実質的に影響しない配列を、暗黙のうちにカバーする。タンパク質またはペプチドに関連して、他に示されない限り、明白に特定されるコードヌクレオチド配列はまた、同様のアミノ酸配列をコードする塩基配列中のバリエーション（例えば、縮重コドン置換基）を暗黙のうちに含む。本発明はまた、保存的アミノ酸置換基を有するタンパク質またはペプチドを意図する。保存的に置換され得るアミノ酸の同一性は、当業者に周知である。ネイティブの配列の縮重コドンを、特定の宿主細胞において優先的なコドンと適合するように選択し得る。
【００２８】
本明細書中で使用される場合、用語 所定のＤＮＡ配列の「ＲＮＡ相関物（ｃｏｒｒｅｌａｔｅ）」とは、「Ｕ」を有する配列が「Ｔ」の代用とされることを意味する。例えば、配列番号１９が全ての「ｎ」が、「Ｕ」（ウラシル）の場合、これは、全ての「ｎ」が「Ｔ」（チミン）である配列番号１９に対するＲＮＡ相関物である。本発明は、本明細書中で開示される全ての基質結合配列および相補的ＲＳＴの全てのＲＮＡ相関物を包含する。
【００２９】
用語「配列の同一性」とは、２個以上の核酸配列または２個以上のアミノ酸配列を比較する場合、デフォルトパラメータを使用するＢＬＡＳＴ ２．０コンピュータアライメントを意味する。ＢＬＡＳＴ ２．０探索は、例えば、Ｔａｔｉａｎａら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１７４：２４７−２５０（１９９９）によって記載され、そして例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｏｒｆ／ｂｌ２．ｈｔｍｌで利用可能である。
【００３０】
本明細書中で使用される場合、用語「中程度にストリンジェントな条件」とは、最初の配列と実質的に同一性を有する、第二の核酸分子に対して、ある核酸分子を結合し得るハイブリダイゼーション条件を意味する。中程度にストリンジェントな条件とは、４２℃で、５０％ホルムアミド、５ Ｘ Ｄｅｎｈａｒｔ’ｓ溶液、５ Ｘ ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中でのフィルター結合核酸のハイブリダイゼーション、次いで、５０℃で０．２ Ｘ ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳでの洗浄と等価な条件である。「高度にストリンジェントな条件」は、４２℃での５０％ホルムアミド、５ Ｘ Ｄｅｎｈａｒｔ’ｓ溶液、５ Ｘ ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中でのフィルター結合核酸のハイブリダイゼーション、次いで、６５℃で０．２ Ｘ ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳでの洗浄と等価な条件である。他の適切な中程度にストリンジェントな条件および高度にストリンジェントな条件は、当該分野で公知であり、例えば、以下に記載される：Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９２）、およびＡｎｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｒｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ ＭＤ（１９９８）。
【００３１】
一般的には、中程度にストリンジェントな条件下で第二の核酸分子にハイブリダイズする核酸分子は、比較される２つの配列の長さにわたって、約６０％よりも高い同一性、好ましくは、約７０％よりも多い同一性、および、より好ましくは、約８０％よりも高い同一性を有する。高度にストリンジェントな条件下で、第二の核酸分子にハイブリダイズする核酸分子は、比較される２つの配列の長さにわたって、約９０％よりも高い同一性、好ましくは、約９２％よりも高い同一性、そして、より好ましくは、約９５％よりも高い同一性を有する。
【００３２】
本明細書中で使用される場合、核酸またはタンパク質に関して使用されるときの用語「単離された」とは、核酸またはタンパク質が、自然状態で、通常、結合する多くの他の細胞成分に関して、単離されていることを示す。例えば、目的の「単離された」遺伝子は、遺伝子に隣接し、そして目的の特定の遺伝子の産物以外の遺伝子産物をコードする、オープンリーディングフレームから分離されている遺伝子であり得る。このような遺伝子は、多くの方法（例えば、研究室での合成、制限酵素による消化、またはＰＣＲを含む）によって得られ得る。同様に、「単離された」タンパク質は、天然の供給源から実質的に精製され得るか、または研究室内で合成し得る。「実質的に精製された」核酸またはタンパク質は、電気泳動ゲルにおいて、本質的に１つのバンドを生じ、そして少なくとも８５％純粋、より好ましくは、少なくとも９５％純粋、そして最も好ましくは、少なくとも９９％純粋である。
【００３３】
本明細書中で使用される場合、用語「発現ベクター」としては、細胞においてＲＮＡへと転写され得る、ヌクレオチド配列を有する、組換え発現カセットが挙げられる。この細胞は、転写されたｍＲＮＡをタンパク質へとさらに翻訳し得る。発現ベクターは、プラスミド、ウイルス、または核酸フラグメントであり得る。代表的に、発現ベクターの組換えカセット部分としては、ｃｉｓの機能的連結によって、プロモーター、または他の調節配列に作動可能に連結される、転写されるコードヌクレオチド配列（例えば、リボザイム）が挙げられる。本発明に従い、本発明のリボザイムをコードするヌクレオチド配列を含む、発現ベクターを、宿主としてベクターに適切な細胞を形質転換するために使用し得る。細菌性細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）を含む原核細胞および哺乳動物の細胞を含む真核細胞の両方を、この目的のために使用し得る。
【００３４】
本明細書中で使用される場合、用語「プロモーター」としては、以下が挙げられる：転写開始部位に近接する核酸配列（例えば、ポリメラーゼ結合部位）および、必要に応じて、細胞内のヌクレオチド配列の転写を指向する、遠位エンハンサーまたはリプレッサーエレメント（これは、転写の開始部位からの数千の塩基対にあり得る）。この用語は、殆どの環境条件下および発生または細胞分化の段階で活性である、「構成的」プロモーター（例えば、ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター）、ならびに細胞外刺激（例えば、特定の温度変化または特定の化学物質への曝露）に応答する転写を開始する「誘導性」プロモーターの両方を含む。プロモーターおよび他の調節エレメント（例えば、複製の起点）、および／または染色体組込みエレメント（例えば、レトロウイルスの長い末端反復配列（「ＬＴＲ」）、もしくはアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）逆方向末端反復配列（「ＩＴＲ」）を、ＢａｒｂｅｒらのＷＯ ００／０５４１５に記載されるように、本発明のリボザイムをコードする発現ベクター中に組み込み得る。
【００３５】
本明細書中で使用される場合、用語「発現する」とは、オープンリーディングフレームを含む所定の核酸を、ＲＮＡ分子を生成するために転写することを意味する。所定の核酸を転写し、そして翻訳して、ポリペプチドを生成することもまた意味する。この用語を、リボザイムの転写をいうために使用し得るが、リボザイムは、代表的に、タンパク質へと翻訳されない。なぜならば、それが活性的な（触媒的な）核酸として機能するからである。
【００３６】
本明細書中で使用される場合、用語「遺伝子産物」とは、所定の核酸の転写によって生成されるＲＮＡか、または所定の核酸の翻訳によって生成されるポリペプチドのいずれかをいう。
【００３７】
本明細書中で使用される場合、用語「形質導入する」は、（例えば、発現ベクターを用いて）細胞の膜の内側への外来の核酸分子の導入を意味する。外来のＤＮＡは、細胞のゲノムを構成する染色体ＤＮＡ中に組み込まれても（共有結合される）、組み込まれなくてもよい。外来のＤＮＡは、プラスミドのようなエピソームのエレメント上で維持され得る。真核生物細胞において、安定に形質導入された細胞は、一般に外来ＤＮＡが染色体に組み込まれ、結果染色体複製を介して娘細胞に受け継がれる細胞であるか、または安定に維持される染色体外プラスミドを含む細胞である。この安定性は、外来ＤＮＡを含む娘細胞の集団からなる細胞株またはクローンを確立する真核細胞生物の能力によって示される。
【００３８】
本明細書中で使用される場合、用語「トランスフェクション」は、（例えば、発現ベクターを用いて）外来核酸分子の取り込みによる細胞の遺伝的改変を意味する。
【００３９】
本明細書中で使用される場合、用語「リボザイム遺伝子ベクターライブラリー」は、ウイルスベクターまたは他のベクターの収集物における（代表的には発現カセット内に）リボザイムをコードする遺伝子の収集物を意味する。ベクターは、むきだしであってもカプシド中に含まれていてもよい。リボザイム遺伝子ベクターライブラリーの増殖(ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ)は、ＢａｒｂｅｒらへのＷＯ００／０５４１５に記載されるように実施され得る。リボザイム遺伝子ベクターライブラリーのリボザイムをコードする遺伝子は、適切な細胞への形質導入および転写の後、リボザイムの収集物を産生する。
【００４０】
下記の実施例１に記載されるように、本発明の好ましい実施形態に従って、無作為なレトロウイルスリボザイム遺伝子ベクターライブラリーが増殖された。次いで、レトロウイルスリボザイム遺伝子ベクターライブラリーは、下記の実施例２に記載されるように、ＤＬＤ−１結腸癌細胞に形質導入するために使用された。ＤＬＤ−１結腸癌細胞は、アポトーシスに耐性であること（アポトーシスの誘導を促進する、Ｆａｓ（ＣＤ９５）の抗体誘発（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ）によって示されるように）がわかっているので、ＤＬＤ−１結腸癌細胞が選択された。次いで、この細胞は、アポトーシス誘導に供され、そしてアポトーシスを起こした細胞が同定され、分離された。ゲノムＤＮＡがアポトーシスを起こした細胞から単離され、そしてリボザイム遺伝子が奪還された。
【００４１】
実施例２に記載されるように、３回の連続的なベクター形質導入、アポトーシス誘導、細胞選択およびリボザイム遺伝子奪還が実施された。３回目の選択後に、発明者らは、リボザイム遺伝子ベクターライブラリーが形質導入された細胞のおおよそ５〜６％（コントロール細胞の１〜２％に対して）がアポトーシスに入っていることを見出した。
【００４２】
リボザイム遺伝子のヌクレオチド配列の解析において、発明者らは、５つのリボザイム基質結合配列が顕著であることを観察した（実施例２、表１〜５を参照のこと）。下記の実施例２に記載されるように、次いで、アポトーシス誘導を促進することに関して、これら５つのリボザイム基質結合配列の有効性が確かめられた。
【００４３】
下記の実施例３により完全に記載されるように、本発明の好ましい実施形態に従い、アポトーシス誘導の阻害に関連する遺伝子が同定された。リボザイムは配列相補性により、同系標的（ｃｏｇｎａｔｅ ｔａｒｇｅｔ）を認識するので、本発明のリボザイムの基質結合配列（表１〜５を参照のこと）は、本発明のリボザイムにより切断され、アポトーシス誘導の阻害に関連するＲＮＡのリボザイム配列タグ（ＲＳＴ）を同定するために使用された。本発明のリボザイムの同系標的の、同定されたＲＳＴはまた下記の表１〜５で示される。
【００４４】
本発明は、下記の表１〜５に列挙される任意の相補的ＲＳＴ；ＮＨＭＣＺＦ−４、Ｅｓｔ２−１、Ｅｓｔ２−２、ＦＡ５−ＶＲ１またはＦＡ５−ＶＲ５に対する相補的ＲＳＴ；あるいは下記の表７および表９に列挙される相補的ＲＳＴを含む、単離された分子を提供する。さらに、これらの分子の任意のものは、１５０塩基以下、１２５塩基以下、１００塩基以下、９０塩基以下、８０塩基以下、７０塩基以下、６０塩基以下、５０塩基以下、４０塩基以下、３０塩基以下、２５塩基以下、または１６塩基の長さであり得る。これらの分子はアポトーシスの誘導を阻害し得るか、あるいは、アポトーシスの誘導を促進する薬物を同定するために使用され得る。
【００４５】
一旦、本発明のリボザイムの同系標的のＲＳＴが同定されると、本発明者らは、本発明に従い同定される１以上のＲＳＴ配列（表１〜表５）を含む遺伝子および遺伝子フラグメントを同定するために、「ＢＬＡＳＴ」プログラム（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）を使用して、種々の公共の遺伝子データベース（ｎｒ（重複のない）データベース、ＥＳＴ（Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｔａｇ）ヒトデータベース、ＥＳＴマウスデータベース、ｄｂＥＳＴデータベースなどのような）ＥＳＴの検索を行った。下記の実施例３でより完全に記載されるように、この検索は、公共のデータベース中の遺伝子配列といくつかの完全な一致を明らかにした。
【００４６】
本発明に従って、同定されたＲＳＴと一致する遺伝子配列のアポトーシス阻害における関与を、次いで、確認した（下記の実施例３を参照のこと）。「検証（ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ）」リボザイムが、同定された遺伝子の公知の配列に基づいて、同定された遺伝子のＲＳＴに相補的な基質結合配列を有するように構築され、そしてこれらは、本発明に従い、レトロウイルスベクターでの発現のために設計された。次いで、検証リボザイムは、細胞中で発現され、そして本発明に従い、アポトーシス誘導を促進する能力について解析された。この結果は、実施例３で示される。
【００４７】
本発明は、アポトーシス誘導の阻害に関与するＥＳＴ２（配列番号３１）を含む、さらなる核酸配列を提供する（実施例３を参照のこと）。約１．７ｋｂ（配列番号１４６）、約２ｋｂ（配列番号１４８）、約２．３ｋｂ（配列番号１５０）、約２．６ｋｂ（配列番号１５２）、約３．４ｋｂ（配列番号１５５）、約４．１ｋｂ（配列番号１５７）および約５．５ｋｂ（配列番号１６６）の「コンティグ（ｃｏｎｔｉｇ）」または隣接する配列を含むか、またはこの配列からなる配列が、本発明に具体的に含まれ、そして実施例５に記載される。これらの配列の各々のＲＮＡ相関物ならびにこれらの配列の任意のものと９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、および最も好ましくは９９％の配列同一性を有する化合物がまた、提供される。中程度の条件下または、より好ましくはストリンジェント条件下でこれらの配列の任意のものとハイブリダイズする化合物がまた、提供される。
【００４８】
本発明はまた、アポトーシスの誘導に対して耐性の細胞におけるアポトーシスの誘導を促進する方法を提供する。この方法は、本発明のリボザイムを細胞（例えば、アポトーシスに対して耐性の細胞）に導入する工程を包含する。この方法は、アポトーシス誘導耐性細胞に、本発明の基質結合配列を有するリボザイムをコードする発現ベクターを形質導入する工程を包含し得る。あるいは、例えば、実施例６に示されるように、本発明のリボザイムは、細胞に直接に（すなわち、ベクターを使用せずに）導入され得る。
【００４９】
本発明のこれらのリボザイムは、表１〜５に列挙される基質結合配列（配列番号１７〜２１）、ＮＨＭＣＺＦ−４（配列番号４６）、表７および９に列挙される配列（配列番号５０〜７２および１００〜１１２）、表８に列挙される配列（配列番号９６〜９７）、ＦＡ５−ＶＲ１（配列番号１３４）およびＦＡ５−ＶＲ５（配列番号１３８）を含むリボザイム、および本明細書に記載されるように設計された基質結合配列を有し、そして本明細書中に開示される任意の遺伝子（ＮＨＭＣＺＦ（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＡＬ０９６８８０（配列番号２７））、ＦＬＪ２２１６５（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＡＫ０２５８１８（配列番号４０））、ＦＡＰＰ２（配列番号４２）またはヒトＰＡＴＺ（配列番号２９）を含む）と結合し切断する任意の他のヘアピンリボザイムまたはハンマーヘッドリボザイムを含む。
【００５０】
本発明はまた、本明細書中に開示される核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を提供する。例えば、４．１ｋｂコンティグ（配列番号１５７）の塩基３〜９６２によってコードされるアミノ酸配列である、配列番号１５８を含むか、または配列番号１５８からなる化合物が提供される。５．５ｋｂコンティグ（配列番号１６６）の塩基１〜９９９によってコードされるアミノ酸配列である、配列番号１６７を含むか、または配列番号１６７からなる化合物もまた、提供される。これらのアミノ酸配列（配列番号１５８、１６７）と８０％、８５％、８８％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％および、最も好ましくは９９％アミノ酸同一性を有する化合物もまた提供される。これらのアミノ酸配列（配列番号１５８、１６７）の２５アミノ酸、２０アミノ酸、１５アミノ酸、または１０アミノ酸あるいはより多くの連続的なアミノ酸を含むかまたはこれらのアミノ酸からなる化合物が、さらに提供される。
【００５１】
本発明はまた、本明細書中に開示される核酸配列によってコードされる、さらなるアミノ酸配列を提供する。例えば、ＮＨＭＣＺＦ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＬ０９６８８０（配列番号２７））、ＦＡＰＰ２（配列番号４２）およびヒトＰＡＴＺ（配列番号２９）によってそれぞれコードされるアミノ酸配列である、配列番号１６９、１７０および１７１を含むか、またはこれらの配列からなる化合物が、提供される。これらのアミノ酸配列（配列番号１６９、１７０または１７１）と８０％、８５％、８８％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％および、最も好ましくは９９％アミノ酸同一性を有する化合物もまた提供される。これらのアミノ酸配列（配列番号１６９、１７０または１７１）の２５アミノ酸、２０アミノ酸、１５アミノ酸、または１０アミノ酸あるいはより多くの連続的なアミノ酸を含むかまたはこれらのアミノ酸からなる化合物が、さらに提供される。
【００５２】
上記に記載されるアミノ酸配列を含む化合物は、細胞におけるアポトーシスの誘導を阻害するために使用され得る。あるいは、これらの化合物は、細胞におけるアポトーシスの誘導を促進する薬物を同定するために求められ得る。
【００５３】
従って、本発明は、細胞におけるアポトーシスの誘導を促進する薬物を同定する方法を提供する。このような方法は、以下の工程を包含する：１）ａ）本明細書中に記載される本発明のＲＳＴを含む標的分子；またはｂ）上に記載されるアミノ酸配列を含む標的分子と結合する、薬物の能力を評価する工程；および細胞に薬物を導入し、アポトーシスのレベル（このレベルの増加は、その薬物がアポトーシスの誘導を促進することを示す）を測定する工程。
【００５４】
本発明に従って、アポトーシス誘導に耐性である細胞は、本明細書中で上に記載される方法によって、アポトーシス誘導に感受性にされ得、そしてこの細胞は、次いで、この細胞におけるアポトーシスを誘導するために、アポトーシス誘導薬物に接触され得る。この方法は、白血病細胞のような癌細胞、ならびに膀胱癌細胞、脳癌細胞、肺癌細胞、結腸癌細胞、膵臓癌細胞、乳癌細胞、卵巣癌細胞、子宮頸部癌細胞、肝膵臓癌細胞、胃癌細胞、リンパ腺癌細胞、前立腺癌細胞などのような他の癌細胞を処置するために特に有用である。種々の周知のアポトーシス誘導薬物の任意のものが、この目的のために使用され得る。好ましいアポトーシス誘導薬物は、「デスレセプター」型細胞表面タンパク質（Ｂａｋｅｒら、（１９９６）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．１２：１〜９）を誘発する薬物であり、この薬物としては、Ｆａｓ、ＴＮＦ−αレセプター、ＴＲＡＩＬレセプターなどが挙げられる。特に好ましいアポトーシス誘導薬物は、実施例で記載されるようなＦＡＳレセプターに対する抗体または可溶性ＦＡＳリガンドのような、ＦＡＳレセプターを誘発する薬物である（Ｃａｌｉｇｉｕｒｉらに対する米国特許第６，０４２，８２６号を参照のこと）。他の適切なアポトーシス誘導薬物としては、アダマンチル誘導体（Ｐｆａｈｌらに対する米国特許第６,１２７，４１５号を参照のこと）、２−ニトロイミダゾール誘導体（Ｏｈｙａｍａらに対する米国特許第５，９２９，０１４号を参照のこと）、ベンザミジンリボシド（Ｊａｙａｒａｍらに対する米国特許第５，９０２，７９２号を参照のこと）、分枝したアポジェニックペプチド（Ｒｏｊｋｏらに対する米国特許第５，５９１，７１７号を参照のこと）、５−ＦＵ、シスプラチン、ビンクリスチン、メトトレキサート、ドキシルビシンのような化学療法剤などが挙げられる。
【００５５】
本発明はまた、アポトーシスの誘導に耐性である細胞においてアポトーシスの誘導を促進する方法（細胞で発現される、アポトーシス誘導の阻害に関連するタンパク質のレベルを減少させる工程、そして次いで、細胞がアポトーシスを起こすことを誘導するために、上記の薬物のようなアポトーシス誘導薬物と細胞を接触させる工程を包含する）を提供する。アポトーシス阻害に関連するタンパク質のレベルを減少させる工程は、好ましくは、そのタンパク質をコードする細胞内のＲＮＡのレベルを減少させることによって達成される。本発明の一つの実施形態に従って、リボザイムが、そのタンパク質をコードするＲＮＡを切断することを可能にする基質結合配列を有するリボザイムをコードする発現ベクターを細胞に形質導入することによって、この工程が達成される。アポトーシスの誘導を促進することにおいて有効であることが示されている、本明細書中に開示される任意のリボザイムが、この目的のために使用され得る。
【００５６】
本発明の別の実施形態に従って、細胞中の標的タンパク質のレベルを減少させる工程は、細胞を、本明細書中に開示されるリボザイムの基質結合配列の任意の部分に相補的であるアンチセンス化合物と接触させることによって実施され得る。
【００５７】
本発明のこの実施例との関連において使用され得る、このアンチセンス化合物は、好ましくは、約８〜約３０核酸塩基との間（すなわち、約８〜約３０の連結したヌクレオシド）、より好ましくは約１２〜約２５核酸塩基を含み、そして構造において直線または環状であり得る。こららのアンチセンス化合物は、改変された骨格または非天然のヌクレオシド間連結を含むオリゴヌクレオチドを含み得る。好ましい改変されたオリゴヌクレオチド骨格としては、例えば、通常の３’−５’連結を有するホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルホスホネートおよび他のアルキルホスホネート（３’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含む）、ホスフィネート、ホスホラミデート（３’−アミノホスホラミデートおよびアミノアルキルホスホラミデートを含む）、チオノホスホラミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステルならびに２’−５’で連結されたこれらのアナログ、およびヌクレオシド単位の隣接した対が３’−５’から５’−３’、または２’−５’から５’−２’へと結合した逆の極性を有するものが挙げられる。アンチセンス化合物を調製する方法は、当該分野で周知である（例えば、米国特許第６,２１０，８９２号を参照のこと）。
【００５８】
本発明のなお別の実施形態に従って、細胞内で発現される（ＤＬＤ−１結腸癌細胞においてＦａｓの誘発によるアポトーシスの誘導を阻害するような）タンパク質の比活性が、そのタンパク質と結合し、その活性を阻害する薬物で細胞を処置することによって、さらに減少され得る。この目的に適切な薬物は、ペプチド、核酸、または有機化合物などであり得る。タンパク質活性を調節するタンパク質結合薬物を選択するためのバイオアッセイは、当該分野で周知である（例えば、米国特許第５，６１８，７２０号を参照のこと）。
【００５９】
本発明はまた、被験体における癌の増殖を阻害する方法（本明細書中で開示される基質結合配列を有するリボザイムをコードするヌクレオチドの配列を含む、有効量の発現ベクターを被験体に投与する工程を含む方法）を提供する。 発現ベクターは、好ましくは、適切なキャリアと組み合わせて投与される。このベクターが投与された後、リボザイムは、細胞内で発現され、そして本明細書中に記載されるように、アポトーシス誘導が促進された。本明細書中で開示されるように、被験体は、アポトーシスをさらに誘導し、そして腫瘍の増殖を減少させるために、必要に応じてアポトーシス誘導薬物で処置され得る。
【００６０】
ベクターまたはアポトーシス誘導薬物の投与は、経口、舌下の静脈内、皮下、経皮、筋肉内、皮内などを含む、任意の適切な経路を通る投与であり得る。任意の種々の非毒性の薬学的に受容可能なキャリアが処方物に使用され得、キャリアとして以下が挙げられる：グルコース、ラクトース、アラビアゴム、マンニトール、スターチペースト、マグネシウムトリシリケート、タルク、コーンスターチ、ケラチン、コロイド状のシリカ、ポテトスターチ、尿素、デキストランなど。処方される物質は、注射可能溶液、滅菌された水性または非水性の溶液、懸濁液または乳状液、錠剤、カプセルなどのような任意の種々の形態をとり得る。
【００６１】
本明細書中で記載される場合、句「有効量」は、レシピエントに有益な効果（これは、癌の増殖の阻害である）を与えるために十分に高い循環濃度を提供するために十分な送達可能物の用量をいう。ベクターの送達可能物では、投与されるベクターの濃度は、十分な標的細胞を形質転換するために十分であるべきである。送達可能アポトーシス誘導送達可能物では、その濃度は、十分な数の標的細胞において、アポトーシスを誘導するために十分であるべきである。
【００６２】
任意の特定の被験体について、具体的な治療および送達可能物に有効な用量レベルは、処置される障害、障害の重篤度、投与される特定の化合物の活性、投与の経路、特定の化合物のクリアランスの速度、処置の期間、この特定の化合物と組み合わせて使用されるかまたは同時に使用される薬物、年齢、患者の体重、性別、食事および全身の健康、および医療分野および科学において周知の同様の因子が挙げられる、種々の因子に依存する。投薬量レベルは、代表的には約０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲であり；約０．０５〜１０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲内のレベルを含む。
【００６３】
オリゴヌクレオチドプローブを調製するための、当該分野で公知の方法は、本発明のオリゴヌクレオチドプローブを調製するために、効果的に使用され得る。例えば、ＢｅａｕｃａｇｅおよびＣａｒｒｕｔｈｅｒｓ（１９８１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２２：１８５９〜１８６２；Ｍａｔｔｅｕｃｃｉら、（１９８１）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３：３１８５；Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版）、１〜３巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌら（編）（１９８７）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８７）；ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ（編）（１９８５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ；ＧａｌｌおよびＰａｒｄｕｅ（１９６９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６３：３７８−３８３；ならびにＪｏｈｎら、（１９６９）Ｎａｔｕｒｅ ２２３：５８２〜５８７を参照のこと。
【００６４】
代表的には、ハイブリダイゼーションを検出するために使用されるプローブは、検出を促進するために標識されるが、その代わりとして、標的核酸が標識され得る。プローブまたは核酸標的は、ハイブリダイズされたポリヌクレオチドの存在を検出するために代表的に使用されるいくつかの方法のうちのいずれか一つによって標識され得る。検出の最も一般的な方法は、^３Ｈ、^１２５Ｉ、^３５Ｓ，^１４Ｃ、または^３２Ｐ標識化プローブなどを用いてのオートラジオグラフィーの使用である。他の標識としては、標識化抗体に結合するリガンド、フルオロフォア、化学発光薬物、酵素、および標識化リガンドに対する特異的結合対メンバーとして働き得る抗体が挙げられる。例えば、Ｂｕｒｄｏｎ，Ｒ．Ｈ．，ｖａｎ Ｋｎｉｐｐｅｎｂｅｒｇ，Ｐ．Ｈ．（編）（１９８５）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，９〜２０頁のＴｉｊｓｓｅｎ，Ｐ．，「Ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｎｄ Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ」を参照のこと。
【００６５】
本発明はまた、アポトーシスの誘導を阻害するタンパク質に対する結合特異性をもつ抗体を提供する；この抗体はまた、アポトーシス誘導に対する阻害に関与するポリペプチドのレベルまたは活性を検出するために使用され得る。好ましい実施形態において、この抗体は、本明細書中で開示される遺伝子または核酸配列によってコードされるタンパク質またはペプチド（すなわち、アミノ酸配列）に対する結合特異性を有する。
【００６６】
本明細書中で使用される場合、用語「抗体」は、２つの重鎖および２つの軽鎖（会合して、各抗体分子内に２つの結合部位を形成する）を含む。この用語はまた、抗体のフラグメント（例えば、Ｆａｂ’２フラグメントおよびＦａｂ’、Ｆｖ、ｓＦｖなどの単一の結合部位をもつフラグメント）も企図する。この用語は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、または免疫された動物の抗血清に存在するようなポリクローナル抗体の集合を含む。
【００６７】
本明細書中で使用される場合、句「結合特異性」は、タンパク質またはペプチドに結合する抗体との関係において、異種のタンパク質および他の生体物質（ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）の集団の存在下で、そのタンパク質の存在を決定する結合反応をいう。従って、指定されたイムノアッセイ条件下で、指定の抗体は、特定のタンパク質に結合し、そしてサンプル中に存在する他のタンパク質に顕著には結合しない。
【００６８】
ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を製造する方法は、当業者に公知である。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｗｉｌｅｙ／Ｇｒｅｅｎｅ，ＮＹ；ならびにＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８９）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ；Ｓｔｉｔｅｓら（編）Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第４版）Ｌａｎｇｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｌｏｓ Ａｌｔｏｓ，ＣＡ；Ｈｕｓｅら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５〜１２８１；およびＷａｒｄら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４〜５４６、ならびにこれらに引用される参考文献を参照のこと。
【００６９】
本明細書中に記載される診断方法は、例えば、（例えば、乳癌、卵巣癌および前立腺癌のような）固形腫瘍（癌腫および肉腫）に存在する、アポトーシス誘導に耐性である癌細胞の同定に適用できる。このような方法は、アポトーシス誘導の阻害に関与するとして、本明細書中に同定されるＲＳＴを有する分子産物をコードする核酸の検出を包含する。
【００７０】
サンプル中の核酸の変化した発現または構造を検出するための、種々の定性的アッセイおよび定量的アッセイは、当該分野で周知であり、そして一般に相補的プライマーまたはプローブ（試薬と呼び得る）への標的配列のハイブリダイゼーションを含む。このようなアッセイとしては、例えば、インサイチュハイブリダイゼーション（これは、使用される形式に依存して、核酸分子の変化した染色体位置、遺伝子変化したコピー数、または変化したＲＮＡ存在量を検出するために使用され得る）が挙げられる。他のアッセイとしては、例えば、ＲＮＡブロットおよびＲＮａｓｅプロテクションアッセイ（これらは、ＲＮＡの存在量および完全性を決定するために使用され得る）；ＤＮＡブロット、（これは、ＤＮＡのコピー数および完全性を決定するために使用され得る）；ＳＳＣＰ解析（これは、ＰＣＲ産物中またはＲＴ−ＰＣＲ産物中のようなＤＮＡ中の単一点変異を検出し得る）；およびＰＣＲ、転写および翻訳共役アッセイ（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ Ｔｅｓｔ；ここで、ＤＮＡ中の変異は、電気泳動ゲルにおける変化したタンパク質生成物によって決定される）が挙げられる。さらなるアッセイとしては、例えばＲＦＬＰ解析によるかまたは特異的ＳＮＰを決定することによる、遺伝子決定のための当該分野において公知の方法が挙げられる。アポトーシス誘導耐性調節因子核酸分子の発現または構造における変化を検出するための適切なアッセイ形式および試薬は、同定することを所望する変化に依存して、当業者によって決定され得る。
【００７１】
本発明はまた、アポトーシス誘導調節活性を調整する化合物を同定するために、リボザイム形質導入細胞およびチップアレイ技術を使用する高スループット薬物発見方法を包含する。アレイ技術をリボザイムノックダウンと組み合わせることによって、薬物は、所定の経路に対する効果について迅速にスクリーニングされ得る。一旦、所定の表現型を導く発現プロフィールが決定されると、さらなるアレイが、関連する、調節されたＥＳＴ配列を用いて製造され得る。アレイは、薬物処理された細胞由来のｍＲＮＡでスクリーニングされ得る。リボザイム処理されたプロフィールと一致するプロフィールが、同定され得る。この方法で同定された薬物での処置は、所望の表現型を付与すると予測され得る。
【００７２】
この方法論は、これらの標的遺伝子の機能を所望の表現型（すなわち、アポトーシスの調整）に結びつけることを可能にする。これらの遺伝子標的標的の活性を阻害し、その結果、例えば、アポトーシス誘導に対する低減した耐性を生じる低分子薬物、リボザイム薬物、または抗体薬物は、当業者により同定され得る。遺伝子標的は、既存の低分子ライブラリーでスクリーニングされ得る高スループットアッセイを開発するために使用され得る。さらに、表面タンパク質または分泌タンパク質を発現する遺伝子は、抗体開発の標的であり得る。この遺伝子産物に特異的な抗体は、好ましくは、ヒト抗体を作製するためのトランスジェニックマウス系において作製され得る。さらに、これらのアポトーシス誘導耐性調節因子を標的にするキメラリボザイム薬物が、上に説明されるように設計され得る。
【００７３】
本明細書中で使用される場合、「アポトーシス誘導調節因子の活性に応答性の標的分子」は、細胞中に存在する標的分子と結合するかまたはこれを化学的に改変するアポトーシス誘導調節因子を意味する。例えば、アポトーシス誘導調節因子が、例えば、転写性の遺伝子調節における使用のためのＤＮＡ結合活性を有する場合、この活性に応答性の標的分子は、特定のアポトーシス誘導調節因子に認識および結合されるヌクレオチドの配列を含む核酸である。このアポトーシス誘導調節因子が、例えば、セリン／トレオニンキナーゼドメインを有することに起因するプロテインキナーゼ活性を有する場合、この活性に応答性の標的分子は、適切なセリンまたはトレオニンキナーゼ認識部位を有するタンパク質である。同様に、プロテアーゼ活性について、応答性の標的分子は、アポトーシス誘導調節因子により切断されるタンパク質である。
【００７４】
薬物スクリーニングのために測定されるアポトーシス誘導調節因子活性がＤＮＡ結合である場合、このような結合は、この核酸エレメントに作動可能に連結されるレポーター遺伝子の発現をアッセイすることによって決定され得る。この場合、試験化合物の非存在下と比較して、試験化合物の存在下での、レポーター遺伝子の発現量または活性の増加は、その化合物がアポトーシス誘導調節因子ＤＮＡ結合阻害活性を有することを示す。発現活性の増加の大きさは、試験化合物のアポトーシス誘導調節因子阻害活性と相関する。例示的なレポーター遺伝子としては、アポトーシス誘導、ＥＧＦＰおよびハイグロマイシン耐性遺伝子が挙げられる。
【００７５】
本明細書中で使用される場合、用語「核酸エレメント」は、アポトーシス誘導発現の調節に関して使用される場合、アポトーシス誘導発現を調整する核酸領域をいう。例示的な核酸エレメントとしては、アポトーシス誘導５’プロモーターおよび制御領域または他の転写調節領域、ならびに転写されたｍＲＮＡの翻訳調節領域をいう。一般に、この核酸エレメントは、５’プロモーターおよび制御領域である。
【００７６】
同様に、アポトーシス誘導調節因子の活性を増加または増強する化合物もまた、同定され得る。アポトーシス誘導調節因子およびアポトーシス誘導調節因子により調整される核酸エレメントに添加された試験化合物（試験化合物の非存在下と比較して、アポトーシス誘導活性またはアポトーシス誘導もしくは作動可能に核酸エレメントと連結されたリポーター遺伝子もしくは作動可能に核酸エレメントと連結されたリポーター遺伝子の発現の量もしくは比率を減少させる）は、その化合物がアポトーシス誘導調節因子の活性を増加することを示す。従って、本発明は、アポトーシス誘導調節因子の活性を調整する化合物を同定する方法を提供する。
【００７７】
アポトーシス誘導調節因子活性を阻害または増加する化合物を同定するための反応系は、アポトーシス誘導調節因子を含む本質的に任意のサンプル、物質またはそれらの成分を使用して調製され得る。このような方法のために使用される、アポトーシス誘導調節因子を含むサンプルは、例えば、（例えば、正常細胞または腫瘍細胞のアポトーシス誘導遺伝子由来の核酸あるいはアポトーシス誘導調節因子によって調整される核酸エレメントをレポーター遺伝子に連結するハイブリッド構築物を使用する）インビトロ転写または翻訳システム系であり得る。あるいは、正常細胞から得られる核酸およびタンパク質がまた、使用され得る。なぜなら、アポトーシス誘導調節因子は、正常細胞においても作用し得るからである。アポトーシス誘導調節因子を含むサンプルは、さらに、細胞抽出物、細胞画分、あるいは、例えば、（アポトーシス誘導調節因子によって調整される核酸エレメントを含む細胞培養物または動物モデルのような）インビボ系に由来し得る。アポトーシス誘導またはレポーター遺伝子の発現レベルあるいは活性は、アポトーシス誘導調節因子に対する試験化合物の調整効果を決定するための反応系において測定され得る。このような測定は、本明細書中に記載される方法および当業者に周知の方法を使用して決定され得る。
【００７８】
要約すると、アポトーシス誘導調節因子供給源は、上に記載のアポトーシス誘導調節因子によって調整される核酸エレメントまたはタンパク質と合わされ、そして試験化合物の存在下または非存在下でインキュベートされる。試験化合物の存在下におけるアポトーシス誘導またはレポーター遺伝子の発現レベルもしくは活性は、試験化合物の非存在下におけるものと比較される。アポトーシス誘導またはレポーター遺伝子の発現レベルもしくは活性における少なくとも約２０％の増加を提供する試験化合物は、アポトーシス誘導調節因子活性化因子、またはアゴニストであると考えられ、そして癌のような新生物疾患の処置のための潜在的な治療用化合物である。同様に、アポトーシス誘導調節因子またはレポーター遺伝子の発現レベルもしくは活性における約２０％以上減少させるそれらの試験化合物は、アポトーシス誘導調節因子の活性を減少させる化合物またはアポトーシス誘導調節因子アンタゴニストであると考えられる。このようなアンタゴニストは、例えば、移植された細胞または外植された（続いて移植される）細胞における細胞増殖または細胞の生存を促進するための治療法として使用され得る。アポトーシス誘導調節因子活性を調整することが同定された化合物は、所望であれば、それがアポトーシス誘導発現また活性に対するアポトーシス誘導調節因子の活性に影響することを確認するために、さらなるインビトロ研究またはインビボ研究に供され得る。
【００７９】
上記のアッセイに関して適切な試験化合物は、インビボまたはインビトロでアポトーシス誘導調節因子の活性を阻害し得ることが疑われる任意の物質、分子、化合物、分子または化合物の混合物、あるいは任意の他の組成物（例えば、細胞増殖阻害活性を有する化合物）であり得る。この試験化合物は、タンパク質、多糖および核酸を含む生物学的ポリマーのような高分子であり得る。アポトーシス誘導調節因子阻害活性についてスクリーニングされ得る試験化合物の供給源としては、例えば、有機低分子、ペプチド、ポリペプチド、ＤＮＡ、およびＲＮＡのライブラリーが挙げられる。さらに、試験化合物は、種々の基準に基づいて、予め選択され得る。例えば、適切な試験化合物は、細胞増殖に関して公知の阻害活性または増強活性を有するように選択され得る。あるいは、この試験化合物は、無作為に選択され、本発明のスクリーニング方法によって試験され得る。試験化合物は、単一の濃度あるいは、例えば、アポトーシス誘導調節因子に対する最適な調整活性を決定するために、濃度範囲で反応系に投与され得る。
【００８０】
薬物スクリーニングが所望されるアポトーシス誘導調節因子の活性は、プロテインキナーゼ活性であり得る。例えば、セリン／トレオニンキナーゼドメインを有するアポトーシス誘導調節因子は、調整される活性がプロテインキナーゼ活性である薬物スクリーニングのために使用され得る。プロテインキナーゼアッセイは、当業者に周知である（例えば、米国特許第５，５３８，８５８号および同５，７５７，７８７号；Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，２０９：３４８〜３５３（１９９３）を参照のこと）。
【００８１】
薬物スクリーニングが所望されるアポトーシス誘導調節因子の活性はまた、ＧＴＰ結合活性であり得る。例えば、ＧＴＰ結合部位を有するアポトーシス誘導調節因子は、調整される活性がＧＴＰ結合である薬物スクリーニングのために使用され得る。ＧＴＰ結合活性を有するアポトーシス誘導調節因子は、例えば、アポトーシス誘導発現を調節することを介して細胞増殖を調節し得るか、または細胞周期コントロール、タンパク質分泌、および細胞内小胞相互作用に対する影響を有し得る。ＧＴＰ結合アッセイは、当業者に周知である（例えば、Ｈｉｌｌｍａｎらに対する米国特許第５，８４０，９６９号を参照のこと）。
【００８２】
薬物スクリーニングが所望されるアポトーシス誘導調節因子の活性はまた、ホルモン結合活性であり得る。例えば、ホルモン結合部位を有するアポトーシス誘導調節因子は、調整される活性がホルモン結合である薬物スクリーニングのために使用され得る。アポトーシス誘導調節因子に結合するホルモンは、エストロゲンのようなステロイドホルモンまたはタンパク質ベースのホルモンであり得る。レセプターエストロゲン結合アッセイを含むレセプターホルモン結合アッセイは、当業者に周知である（例えば、Ｓｉｍｏｎらに対する米国特許第６，２０４，０６７号を参照のこと）。
【００８３】
本発明はまた、本発明の方法を実施するためのキットを提供する。このようなキットは、アポトーシスの誘導の阻害に関与するポリペプチドまたは遺伝子にそれぞれ特異的な抗体またはオリゴヌクレオチドプローブのような、本発明の１以上の試薬を含む。このような薬剤は、適切な酵素、色素、放射性同位体などを使用して、検出可能に標識され得る。このキットはまた、本発明の試薬への結合に特異的なさらなる試薬ならびに必要な化学物質および緩衝剤を含み得る。
【００８４】
以下の実施例は、本発明の例示を意図されるが、本発明を制限するものでない。
【実施例】
【００８５】
（実施例１）
（レトロウイルス無作為リボザイム遺伝子ベクターライブラリーの調製）
この実施例は、レトロウイルス無作為リボザイム遺伝子ベクターライブラリーの調製（アポトーシス誘導を容易にすることに関与する基質認識配列を有するリボザイムを選択および同定するための方法における第１工程）を記載する。このライブラリーを、本質的にＷＯ００／０５４１５（Ｂａｒｂｅｒら）に記載されるように調製した。プラスミドベースのレトロウイルスリボザイムライブラリーを、ベクターｐＬＰＲ中に作製した。ベクターｐＬＰＲ−１ｋｂは、以下を含む：１）Ｍｏｌｏｎｅｙレトロウイルスゲノムの５’および３’長末端反復（ＬＴＲ）；２）ｔＲＮＡｖａｌプロモーターを介して、リボザイム遺伝子について意図される位置に１ｋｂスタッファー（ｓｔｕｆｆｅｒ）インサートを有する、リボザイム遺伝子のための転写カセット；および３）ＳＶ４０プロモーター駆動ピュ−ロマイシン耐性。この設計において、スタッファーインサートを除去し、無作為リボザイムライブラリーインサートに置き換え、ｔＲＮＡｖａｌプロモーター制御下で転写させた。
【００８６】
このｐＬＰＲ−１ｋｂベクター（図３を参照のこと）をプラスミドｐＬＰＲを、ＢａｍＨＩで３７℃一晩消化することにより調整し、フェノール：クロロホルム抽出し、そしてエタノール沈殿させた。次いで、再懸濁したＤＮＡを、ＭｌｕＩで３７℃一晩消化した。この二重消化は、１ｋｂのスタッファーフラグメントを切除する。生じた６ｋｂプラスミドベクターＤＮＡフラグメントをアガロースゲル電気泳動により精製した。
【００８７】
合成し、アニ−リング緩衝液（５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２）中で９０℃に加熱し、次いで室温までゆっくりと冷却することにより、１：３：３（オリゴ１：オリゴ２：オリゴ３）のモル比でアニ−リングした３つのオリゴヌクレオチドから、無作為リボザイムライブラリーインサートを調製した。３つのオリゴヌクレオチドは、以下の配列を有した。
オリゴ１：５’−ｐＣＧＣＧＴＡＣＣＡＧＧＴＡＡＴＡＴＡＣＣＡＣＧＧＡＣＣＧＡＡＧＴＣＣＧＴＧＴＧＴＴＴＣＴＣＴＧＧＴＮＮＮＮＴＴＣＴＮＮＮＮＮＮＮＮＧＧＡＴＣＣＴＧＴＴＴＣＣＧＣＣＣＧＧＴＴＴ−３’（配列番号１１）
オリゴ２：５’−ｐＧＴＣＣＧＴＧＧＴＡＴＡＴＴＡＣＣＴＧＧＴＡ−３’（配列番号１２）
オリゴ３：５’−ｐＣＧＡＡＡＣＣＧＧＧＣＧＧＡＡＡＣＡＧＧ−３’（配列番号１３）
オリゴ１においてＮで示す位置のＡ、Ｔ、Ｃ、およびＧヌクレオチドの無作為な取り込みは、オリゴヌクレオチド合成中に全てのＮ位でＡ、Ｔ、Ｃ、およびＧ試薬を予め混合することによって達成した。従って、３つのオリゴヌクレオチド（配列番号１１、１２、１３）をアニ−リングすることによって形成したリボザイムインサートライブラリーは、無作為なヌクレオチドをもつ８つの位置（リボザイムのヘリックス１に相当する）、および無作為なヌクレオチドをもつ４つの無作為位置（リボザイムのヘリックス２に相当する）を含む（図１を参照のこと）。
【００８８】
ｐＬＰＲ−１ｋｂベクターＤＮＡフラグメントを、０．５ｐｍｏｌのベクター、８倍モル過剰のアニーリングしたオリゴヌクレオチドおよび１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを使用して、無作為リボザイムインサートライブラリーに一晩連結した。生じたベクターのライブラリー（ｐＬＰＲ−ライブラリーと示す）を、ウルトラコンピテントＤＨ１２Ｓ細菌にエレクトロポレートした。レトロウイルスプラスミドリボザイムライブラリーを含む、全部で５×１０^７細菌コロニーを得た。
【００８９】
レトロウイルスプラスミドリボザイムライブラリーを含む細菌コロニーを、マスターストックとしてアリコートにプールし、そして−８０℃で冷凍した。６０ｍｌのＬＢ培地中に１ｍｌのマスターストックを３０℃で一晩培養することによって、作業ストックを作製した。作業ストックの１ｍｌアリコートを使用して、３０℃一晩のインキュベーションにより５００ｍｌ細菌培養物を作製した。次いで、レトロウイルスＤＮＡを、５００ｍｌ細菌培養物から抽出し、そしてライブラリー選択のためのウイルスベクターを調製するために使用した。
【００９０】
トリプルトランスフェクション（ｔｒｉｐｌｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）技術を用いて、リボザイムライブラリープラスミドからウイルスベクターを作製した。この手法では、３．５×１０^４細胞／ｃｍ^２の濃度でＣＦ２細胞を蒔いた。翌日、２．２×１０^８のＣＦ２細胞を、１２ｍｌのカチオン脂質（ＴｒａｎｓＩＴ−ＬＴ１；Ｐａｎ Ｖｅｒａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）と混合した２０ｍｌの３種類のプラスミド混合物を含む、６６５ｍｌの無血清培養液トランスフェクション培養液中で６時間、インキュベートした。このプラスミド混合物は、リボザイム遺伝子ライブラリープラスミド（またはコントロールリボザイムプラスミド）、モロニー−マウスウイルスのｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子をコードするプラスミドおよび小包性口内炎ウイルス−Ｇ遺伝子をコードするプラスミドを２：３：１の比率で含んだレトロウイルス粒子を含む細胞上澄みを、トランスフェクションの２日後から、２４時間ごとに集め始めた。ウイルスを含む上澄みを、０．４μｍフィルターを通して濾過し、ＨＴ１０８０細胞（Ｂａｒｂｅｒら、ＷＯ ００／０５４１５を参照のこと）を用いた標準的なアッセイで滴定した。
【００９１】
ｐＬＰＲへのランダム化したヘアピンリボザイム遺伝子のクローニングの後、プラスミドライブラリーの「ランダムさ（ｒａｎｄｏｍｎｅｓｓ）」は、Ｂａｒｂｅｒら、ＷＯ ００／０５４１５中に記載されているように評価された。ランダムな部位における、信頼限界９５％の４つのヌクレオチドの頻度は、Ｇ：２２．３±６．１、Ａ：３１．９±７．０、Ｔ：２７．３±７．８そしてＣ：１８．０１±１５．１と算出された。各々の塩基に期待される頻度は２５％であるので、各々の塩基はランダムに現れる（Ｃを除く、Ｃは期待値より僅かに低い）と考えられる。これらの変化は、恐らく、オリゴヌクレオチドの化学的合成の間の、ヌクレオチドの偏った取り込みの結果であり、ライブラリーの複雑性を減少させ得る。
【００９２】
ライブラリーの複雑性の機能的な評価ついて、インビトロでの切断は、ライブラリープール中に既知のＲＮＡ基質を標的とするリボザイムが存在するかどうかを決定するのに、有用である。このインビトロでの切断は、１つの反応液における全てのリボザイムライブラリーのインビトロ転写を含み、次いで、細胞起源およびウイルス起源の両方の、多種の異なるＲＮＡ基質を切断するプールの能力を試験した。適切には７つの既知のＲＮＡ標的のうちの６つの標的であり、これらの標的は、インビトロ転写ライブラリーにより効率的に切断される。この量的分析は、リボザイム遺伝子ライブラリーの顕著な複雑さを示唆し、７つの標的のうちの１つの標的の切断の欠失は、上述に記載した塩基組成により示される、僅かな非ランダム性を反映し得る。
【００９３】
（実施例２：哺乳類細胞へのランダムリボザイム遺伝子ベクターライブラリーの導入、およびアポトーシス誘導関連ヌクレオチド配列の選択）
この実施例は、アポトーシス誘導に関連するリボザイムを同定するための方法を記載する。実施例１に記載されるｐＬＰＲライブラリーベクターおよびコントロールベクター、ｐＬＰＲ−ＴＬ３を、ＤＬＤ−１結腸癌腫細胞（ＡＴＣＣ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ）の形質導入に用いた。コントロールベクターは、リボザイムライブラリー遺伝子の代わりにＨＣＶリボザイムコントロール遺伝子を有する、ｐＬＰＲ−ライブラリーベクター（図２参照のこと）とは異なる。
【００９４】
形質導入に対して、ＤＬＤ−１細胞をＴ２２５フラスコ（約６×１０^７細胞）中で約７０％コンフルーエンス（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）まで増幅させた。ライブラリーをコードするレトロウイルスベクターと一緒に、感染多重度（ＭＯＩ）１で、３７℃で２４時間インキュベーションすることにより、細胞の形質導入を行った。
【００９５】
レトロウイルスベクターと一緒にインキュベーションした後、形質導入培地をアスピレーションにより除き、ピューロマイシン（２μｇ／ｍｌ）を含む増殖培地と入れ替えた。翌日、２μｇ／ｍｌのピューロマイシンを含む培地で細胞をリフィード（ｒｅｆｅｅｄ）した。レトロウイルスベクターの安定導入が選択されるように、この細胞を１０日間〜１４日間、選択培地で培養した。この選択過程の間、細胞を３日ごとにリフィードした。
【００９６】
安定選択の後、この細胞を、ＣＤ９５（クローン１１、ＰａｎＶｅｒａ）に対する、精製ＩｇＭライゲーション抗体（１６０ｎｇ／ｍｌで添加される）と共に１８時間のインキュベーションすることによるアポトーシス誘導に供した。次いで、二重染色プロトコルにより、アポトーシスの細胞を同定した。導入後、第１工程において、基本的に製造業者（Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ／Ｍａｎｈｅｉｍ）により記述されたように、細胞をトリプシンにより除去し、ＰＢＳで２回洗浄し、結合緩衝液中で懸濁し、次いで、Ａｎｎｅｘｉｎ−Ｖ−ＦＩＴＣ／ＰＩで染色した。Ａｎｎｅｘｉｎ−Ｖは、アポトーシスの初期に、内側の細胞膜空間から転座して、細胞膜の外側の表面に輸送されるホスファチジルセリンに結合する。同時に起こるプロピジウムヨーダイド（ＰＩ）染色（ＤＮＡ染色）はまた、アポトーシスが進行している細胞集団由来の壊死細胞の同定および排除に用いられた。
【００９７】
引き続き、アポトーシスの細胞の同定において、小さな可変性を提供すると思われる、ＴＵＮＥＬアッセイ（Ｒｏｃｈｅ）を用いた。以下の染色（もしくはＴＵＮＥＬ）を行う場合、この細胞は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）による分類に供される。ゲノムＤＮＡを、ＦＡＣＳで選別したＡｎｎｅｘｉｎ−Ｖポジティブ／ＰＩネガティブ細胞またはＴＵＮＥＬポジティブ細胞から単離し、次いで、リボザイム遺伝子をＤＮＡのＰＣＲ増幅によりレスキューした。
【００９８】
リボザイム遺伝子は、ＱＩＡｍｐ Ｂｌｏｏｄ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて、細胞から抽出された１μｇのゲノムＤＮＡを５つの別々のアリコートで実施したＰＣＲレスキューにより、ＦＡＣＳ選択された細胞集団からレスキューされた。ＰＣＲは、ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄシステム（Ｐａｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ）を用いて、初めの変性を９４℃で１０分間、以降９４℃で２０秒間、６５℃で３０秒間および７２℃で３０秒間の３５サイクルで実施した。ベクター内にアニーリングするＰＣＲプライマー、５’−ＧＧＣＧＧＧＡＣＴＡＴＧＧＴＴＧＣＴＧＡＣＴＡＡＴ−３’（配列番号１４）、および５’−ＧＧＴＴＡＴＣＡＣＧＴＴＣＧＣＣＴＣＡＣＡＣＧＣ−３’（配列番号１５）は、リボザイム遺伝子を含む、３００塩基対のフラグメントを増幅した。リボザイム遺伝子のプールを含む、プールされたＰＣＲ産物を、１％アガロースゲルでの電気泳動により単離し、ゲル抽出キット（Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製し、次いで、ＢａｍＨＩおよびＭｌｕＩを用いて消化し、同じ酵素で消化したベクターｐＬＰＲにライゲーションした。ライゲーションしたＤＮＡを使用して、エレクトロポレーションによりＤＨ１２Ｓ Ｅ．ｃｏｌｉ細菌を形質導入した。全ての細菌培養液を、アンピシリンを含むＬＢ−Ａｇａｒプレート上にプレートし、３７℃で終夜培養した。生じた細菌のコロニーをプールし、レトロウイルスベクターを産生するために、精製したＤＮＡを（実施例１で前述したように）トリプルトランスフェクションプロトコルに使用した。個々のコロニーはまた、ベクタープライマー５’ＣＴＧＡＣＴＣＣＡＴＣＧＡＧＣＣＡＧＴＧＴＡＧＡＧ−３’（配列番号１６）を用いて、標準的なダイデオキシ法により配列決定された。
【００９９】
連続的なベクター形質導入、アポトーシス誘導、ＦＡＣＳ選択およびリボザイム遺伝子レスキューを３回実施した。３回目のＦＡＣＳ選択では、コントロールベクターでは１〜２％でアポトーシスが始まったのと比較して、およそ５〜６％のｐＬＲＰライブラリー形質導入細胞でアポトーシスが始まったことが示された。これらの結果は、ライブラリー形質導入細胞の漸進的な選択が、アポトーシスを促進するリボザイムのリボザイムプールを増やしたことを示している。
【０１００】
３回目のＰＣＲレスキューに続くリボザイム遺伝子挿入物の分析は、いくつかのリボザイム基質結合配列の増加を示した。５つの優性リボザイム基質結合配列（ＲＡＰ２（配列番号１７）、ＲＡＰ４（配列番号１８）、ＲＡＰ６（配列番号１９）、ＲＡＰ１０（配列番号２０）およびＲＡＰ５９４（配列番号２１）と指定される）を同定した。これらの同定されたリボザイムの各々の基質結合配列を、表１〜５の１列目に並べる。
【０１０１】
【表１】

【０１０２】
【表２】

【０１０３】
【表３】

【０１０４】
【表４】

【０１０５】
【表５】

【０１０６】
アポトーシス誘導の促進に対する、ライブラリーから選択された個々のリボザイムの有効性を、ＤＬＤ−１細胞のトランスフェクト、その後アポトーシス誘導の分析により決定した。この目的のために、表１〜５に示したＲＡＰ配列を有するリボザイムをコードする核酸配列を、１ｋｂのスタファー（ｓｔｕｆｆｅｒ）の代わりに、ｐＬＰＲにクローニングした。ベクターＬＰＲ−ＴＬ３はコントロールとして使用した。
【０１０７】
トランスフェクトのために、ＤＬＤ−１細胞をＴ７５フラスコ内で約７０％のコンフルーエンシー（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）（約５×１０^６細胞）まで増殖させた。次いで、培地を除去し、０．８ｍｌの無血清Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ）と入れ替えた。細胞を脂質−プラスミドＤＮＡ複合体を含む複合体とともに、３７℃で４時間インキュベートした。
【０１０８】
脂質−プラスミドＤＮＡ複合体は、脂質試薬リポフェクタミン（ＧＩＢＣＯ）（１μｇの（単一のリボザイムをコードする、またはコントロールＬＰＲ−ＴＬ３の）ＤＮＡに対して４μｌの脂質試薬の比率）を組合せることにより調製した。使用前に、脂質／ＤＮＡ複合体を室温で２０分間で形成させた。
【０１０９】
複合体と共に細胞をインキュベーションした後、トランスフェクション培地をアスピレーションにより除去し、完全増殖培地と入れ替えた。ピューロマイシン（２μｇ／ｍｌ）を含む増殖培地中での選択の前に、この細胞を２４時間培養した。翌日、ピューロマイシン（２μｇ／ｍｌ）を含む培地で細胞をリフィードした。細胞を回収し、２週間増殖させた。
【０１１０】
次いで、この細胞を、ＣＤ９５ライゲーション抗体での誘導でアポトーシスを起こす能力を試験した。全てのケースにおいて、個々のライブラリーで選択された基質結合配列を有するリボザイムをコードしているベクターでのトランスフェクションで、先に観察された表現型（−−アポトーシスの誘導が増加した（トランスエフェクトした／選択したＤＬＤ−１細胞集団の１０〜２０％））を確認した。
【０１１１】
（実施例３：アポトーシス誘導の阻害に関連する遺伝子の同定）
この実施例は、細胞のＣＤ９５抗体によるアポトーシスの誘導を阻害することに関連する細胞遺伝子を同定する方法を示す。リボザイムは配列相補性により同系の標的を認識するので、特定の表現型に関連するリボザイムの基質結合配列は、表現型に関連する標的遺伝子中に存在するリボザイム配列タグ（ＲＳＴ）の規定に用いられ得る。本明細書中で用いられるリボザイムライブラリーにおいて、ＲＳＴは１６塩基長であり、標的中の必要なＮＧＵＣの周辺に、２つの標的結合アーム（ヘリックス１およびヘリックス２）を含む（図１を参照のこと）。
【０１１２】
上記の表１〜５の２列目に、各々のライブラリー由来基質結合配列に対して相補的なＲＳＴ（配列番号２２〜２６）を示す。各々のケースにおいて、Ｈｅｌｉｘ２配列に相当する初めの４塩基（５’末端）およびＨｅｌｉｘ１に相当する最後の８塩基は、対応する基質結合配列に対して、明らかな（ｄｉｒｅｃｔ）ワトソン−クリック塩基相補体である。ＲＳＴの５’末端から５つ目の位置の塩基は特定される必要はなく、「Ｎ」と表わされる。ＲＳＴ中の「Ｎ」で３’に位置する３塩基は、遺伝子配列ＧＴＣに相当し、これは転写後「ＧＵＣリボザイム」（図１参照のこと）によって認識される必要不可欠な同系の配列ＧＵＣとなる。
【０１１３】
ＣＤ９５抗体によるアポトーシス誘導に対する阻害に関連する遺伝子の同定のために、Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（「ＢＬＡＳＴ」）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）を用いて、表１〜５に示されるＲＳＴの存在について、遺伝子および発現配列タグ（ＥＳＴ）の公開データベースを検索した。ＢＬＡＳＴ検索のパラメータは、「ワードサイズ（ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ）」＝７、および「期待値」＝１，０００である。ＲＳＴのＮＧＵＣ配列の「Ｎ」中のＡ、Ｔ、ＣおよびＧを用いて、各々のＲＳＴに対して、４回の検索を行った。
【０１１４】
ＲＡＰ４−ＲＳＴおよびＲＡＰ１０−ＲＳＴのＢＬＡＳＴ検索では、実質的に結果は得られなかった（非ヒト配列との不完全な一致のみ）。対照的に、ＲＡＰ２−ＲＳＴおよびＲＡＰ６−ＲＳＴのＢＬＡＳＴ検索では、公開配列において、完全に一致するいくつかの配列が同定され、ＲＡＰ５９４−ＲＳＴのＢＬＡＳＴ検索では、離れた２つの１５／１６ヌクレオチドの一致が同定された。
【０１１５】
ＲＡＰ６−ＲＳＴは、ｎｒ（非重複性）データベースに位置付けられたＮＨＭＣＺＦ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＬ０９６８８０）（配列番号２７）内の配列と完全に一致した。（「Ｎｏｖｅｌ Ｈｕｍａｎ ｍＲＮＡ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｚｉｎｃ Ｆｉｎｇｅｒ ＣＨ２ Ｄｏｍａｉｎｓ」と標題のつけられた）ＮＨＭＣＺＦ遺伝子は、マウスＭＡＺＲ（配列番号２８）およびヒトＰＡＴＺ（配列番号２９）遺伝子配列との、高い程度の同一性を有し、また、ｎｒデータベースに位置付けられる。ＲＡＰ６−ＲＳＴはまた、本明細書の後述中でＥＳＴ６と称される、ＥＳＴ ｇｉ：８７４１３９（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｈ０９３１７）（配列番号３０）内の配列と完全に一致した。
【０１１６】
ＲＡＰ２−ＲＳＴは、本明細書の後述中でＥＳＴ２と称される、ＥＳＴフラグメントｙｆ５６ａ０６．ｒ１（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｒ１２４２０）（配列番号３１）内の配列との完全な一致が見つかった。その後のＢＬＡＳＴ検索では、別の８つのＥＳＴフラグメント内の配列との完全な一致が得られた。
【０１１７】
６０２３１８８１０Ｆ１（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＢＧ１１６７４７）（配列番号３２）；
６０２３１７３４３Ｆ１（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＢＧ１１５９２０）（配列番号３３）；
６０２２８１６６６Ｆ１（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＢＧ１１１２３６）（配列番号３４）；
６０２２４８９８４Ｆ１（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＢＦ６９２６２４）（配列番号３５）；
６０１４３４１２３Ｆ１（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＢＦ８９２９５１）（配列番号３６）；
ＤＫＦＺｐ７６１ｏ０７１５（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＬ１３８０５９）（配列番号：３７）；
ｃｒ２２ｅ０３（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＩ７５４２５８）（配列番号３８）；および
ｚｗ０５ｈ０３（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＡ４９５９２９）（配列番号３９）。
【０１１８】
以下の実施例６に記載したように、引き続き、このＥＳＴ２および、前述に記載した８つのさらなるＥＳＴフラグメントは、推定上のｃＤＮＡ ＦＬＪ２２１６５（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＫ０２５８１８（配列番号４０））のフラグメントと重複していることが決定された。
【０１１９】
ＲＡＰ５９４−ＲＳＴは、ｎｒデータベース中の２つの遺伝子配列の１５／１６ヌクレオチドと一致した。一致したうちの１つはＣＳＮＫ２Ａ１（ＧＥＮＢＡＮＫ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００１８９５．１）（配列番号４１）であり、そして別の１つはＦＡＰＰ２（ＧＥＮＢＡＮＫ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿０３２６３９）（配列番号４２）であった。
【０１２０】
ＣＤ９５ライゲーション抗体を用いたアポトーシス誘導の阻害における、ＮＨＭＣＺＦ遺伝子（配列番号２７）の関連が、以下で確かめられた：遺伝子の他のセグメントがさらなるＲＳＴ部分として機能し得るか否かを決定するために、ＮＨＭＣＺＦ遺伝子のヌクレオチド配列が調べられ、そして、これらの６つの推定上のＲＳＴと相補的な基質結合部位を有する「有効なリボザイム」を、以下の表６に列挙したように操作した。
【０１２１】
【表６】

【０１２２】
次いで、表６に示される基質結合配列を有するリボザイムをコードしているレトロウイルス発現プラスミドを生成し、実施例１および実施例２で記載したように、ＤＬＤ−１細胞を、ベクターのトランスフェクション後のＣＤ９５アポトーシス誘導に対して試験した。これらのうちの１つ、ＮＨＭＣＺＦ−４（配列番号４６）（この相補的なＲＳＴは、ＡＴＧＧＡＧＴＣＴＧＡＴＧＧＧＧ（配列番号４９）である）は、ＣＤ９５ライゲーション抗体によるアポトーシスの誘導を促進する表現型を提供する。これは、ＮＨＭＺＣＦ遺伝子がアポトーシスの阻害に関連しているというＲＡＰ６に基づく元の発見を確認した。
【０１２３】
ＮＨＭＺＣＦ遺伝子に対するさらなるＲＳＴおよび相補的なリボザイム基質結合部位を、以下の表７に提供する。
【０１２４】
【表７−１】

【０１２５】
【表７−２】

【０１２６】
アポトーシスの阻害において、ＥＳＴ２クローン（配列番号３１）の関与を確認するために、以下の表８に列挙した基質結合配列を有する「有効なリボザイム」を操作した。
【０１２７】
【表８】

【０１２８】
次いで、表８に示される基質結合配列を有するリボザイムをコードするレトロウイルス発現プラスミドを作成し、そして、上記実施例１および実施例２に記載されるように、ＤＬＤ−１細胞を、プラスミドでのトランスフェクション後のアポトーシス誘導をトリガーするＣＤ９５に対して試験した。両方の「有効なリボザイム」とも、アポトーシス誘導を促進している表現型を提供した。それらの各々の相補的なＲＳＴは、配列番号９８および配列番号９９である。このことにより、アポトーシス阻害においてＥＳＴ２が関与しているＲＡＰ２に基づいて、最初の知見が立証された。
【０１２９】
ＦＬＪ２２１６５（配列番号：４０）との重複に基づく、ＥＳＴ２遺伝子および相補的リボザイム基質結合部位に対する、さらなるＲＳＴを以下の表９に提供する。
【０１３０】
【表９−１】

【０１３１】
【表９−２】

【０１３２】
同様に、アポトーシス阻害においてＥＳＴ６クローンの関与を確認するために、ＥＳＴ６について、以下の表１０に列挙した基質結合配列を有する「有効なリボザイム」を操作し、これらのリボザイムをコードするレトロウイルス発現プラスミドで、ＤＬＤ−１細胞をトランスフェクトした。しかしこの場合、いずれの「有効なリボザイム」も、アポトーシス誘導を促進している表現型を提供せず、この過程におけるＥＳＴ６の関与は確認されなかった。
【０１３３】
【表１０】

【０１３４】
ＲＡＰ５９４に適合する２つのＢＬＡＳＴ−−ＣＳＮＫ２Ａ１（配列番号４１）またはＦＡＰＰ２（配列番号４２）のどちらが正しい適合なのかを決定するために、ＣＳＮＫ２Ａ１について、以下の表１１に列挙した基質結合配列を有する「有効なリボザイム」を操作し、そして、ＦＡＰＰ２について、以下の表１２に列挙した基質結合配列を有する「有効なリボザイム」を操作した。
【０１３５】
【表１１】

【０１３６】
【表１２】

【０１３７】
次いで、これらのリボザイムをコードしているレトロウイルス発現プラスミドでＤＬＤ−１細胞をトランスフェクトし、Ｆａｓ−媒介性アポトーシスを起こす能力について、この細胞をアッセイした。表１１に列挙した標的となる有効なリボザイムはいずれも、ＤＬＤ−１細胞内におけるＦａｓ−媒介性アポトーシスに対する感受性を付与できなかった。しかし、ＦＡ５−ＶＲ１およびＦＡ５−ＶＲ５の両方とも、Ｆａｓによる誘導後に、ＤＬＤ−１にアポトーシスを起こすことが出来た。これらの２つの有効なリボザイムの相補的ＲＳＴ配列は、それぞれ配列番号１４０および配列番号１４１である。このことは、ＦＡＰＰ２遺伝子がＲＡＰ５９４の標的であること、ＲＡＰ５９４がアポトーシス阻害に関与していることを確証した。
【０１３８】
（実施例４）
（標的ノックダウンの確認）
この実施例は、上述の実施例に記載された方法によって同定されるＲＮＡ標的のノックダウンを確認する、または減少レベルを確認する方法を記載する。ＤＬＤ−１細胞を、コントロールプラスミド（ＬＰＲ−ＴＬ３）、もしくはＲＡＰ２またはＥＳＴ２−１リボザイム遺伝子を発現するレトロウイルスプラスミドのいずれかでトランスフェクトした。トランスフェクションおよびピューロマイシンでの選択を、上述で記載したように実施した。ＲＮＥＡＳＹ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、総ＲＮＡを細胞から抽出した。このＲＮＡを、ＴａｑＭａｎプローブ（配列番号１４２）およびプライマーセット（配列番号１４３および配列番号１４４）の設計のためにテンプレートとしてＥＳＴ２配列を用いて、ＴａｑＭａｎリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより分析した。５μｇの細胞サンプル由来総ＲＮＡを分析に使用した。ＬＲＰ−ＴＬ３をコントロールとして使用した。この結果は、ＲＡＰ２リボザイム（配列番号１７）および、ＴＶ２−１または有効なリボザイムＥｓｔ２−１（配列番号９６）としても知られる「有効なリボザイム」ＲＴＶ２−１が、ＥＳＴ２標的遺伝子の有意なノックダウン、またはｍＲＮＡの減少（ＲＡＰ２リボザイム（配列番号１７）を使用した場合は３０％の減少、そしてＥｓｔ−２（配列番号９６）を使用した場合は２０％の減少）（図６参照のこと）を引き起こしたことを示した。
【０１３９】
（実施例５）
（ＲＮＡ標的の細胞内での発現の確認）
この実施例は、前述の実施例３で同定した部分遺伝子配列（ＥＳＴ２（配列番号３１）が、両腫瘍細胞株および正常細胞の両方で通常発現される、より長いｍＲＮＡの一部であることを確認する方法を記載する。メッセンジャーＲＮＡを、５つの結腸癌細胞株（ＤＬＤ−１；ＳＷ４８０；ＨＴ−２９；Ｃｏｌｏ２２０；ＳＷ１４１７）から調製した。このＲＮＡは、ＲＮＥＡＳＹキットおよびオリゴｄＴ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて調製した。正常な結腸組織由来のメッセンジャーＲＮＡを購入し（ＲｅｓＧｅｎ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、調製した。１μｇのｍＲＮＡを、各々のサンプルごとに１％のアガロースゲル上にロードした。ノーザンブロットおよびブロットの放射活性プロービングを、当業者に公知のプロトコルにより実施した。このプローブを、テンプレートとしてＥＳＴ２（配列番号３１）およびプライマーＴＶ２−Ｒ（配列番号１４３）およびプライマーＥＳＴ２プローブＦ（配列番号１４５）を用いて、ＰＣＲにより生成した。ブロットは、細胞株および正常結腸組織の両方に見られる、およそ７〜７．５ｋｂの長さの単一のバンドを検出することができた（図７参照のこと）。このことは、ＥＳＴ２（配列番号３１）配列が、腫瘍細胞株および正常組織の両方で発現されるより大きなｍＲＮＡの一部であることを示す。
【０１４０】
（実施例６）
（ＥＳＴ２遺伝子に対する全長ｃＤＮＡの単離、アセンブリおよび配列）
この実施例は、前述の実施例３で同定したＥＳＴ２フラグメントを含む遺伝子の、全長ｃＤＮＡのアセンブリの過程を記載する。ＣＡＰコンティグ（ｃｏｎｔｉｇ）アセンブリプログラム（Ｉｎｄｉａｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｉｏａｒｃｈｉｖｅ）を用いる場合、最初のコンティグは重複ｃＤＮＡ ＦＬＪ２２１６５（配列番号４０）および、ＲＡＰ２ ＲＳＴ（配列番号２２）と一致する９つのＥＳＴ（配列番号３１〜３９）から構成される。この最初のコンティグ配列（配列番号１４６）のサイズは、およそ１．７ｋｂであった。このコンティグフラグメントをクエリー配列として使用して、ＢＬＡＳＴ検索を行ったところ、重複するＥＳＴ配列６０１４８６３４２Ｆ１（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＢＥ８７７７７５）（配列番号１４７）が同定され、しかも、コンティグの５’末端を全体約２ｋｂ（配列番号１４８）まで伸長した。
【０１４１】
プライマーを設計するために、ガイドおよびテンプレートとして上記コンティグを用いて、遺伝子の全長を単離およびクローニングするために、ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の高速増幅）を行った。この初期ＲＡＣＥプロトコルを、ＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて、結腸および胎盤のｍＲＮＡサンプル（ＲｅｓＧｅｎ／Ｉｎｖｉｒｔｏｇｅｎ）の両方で実施した。逆転写反応での開始に使われたプライマーは、キットに添付のオリゴｄＴであった。遺伝子特異的プライマー（５’−ＣＡＣＡＴＣＣＣＴＣＡＴＴＡＴＡＧＴＣＡＧＡＡＡＧ−３’；配列番号１４９）は２ｋｂコンティグ（配列番号１４８）中のヌクレオチド７３８〜７６２にアニーリングし、ネステッド（ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲを実施するキット中の内部（ｉｎｔｅｒｎａｌ）プライマーと共に使用した。このＲＡＣＥの手順は、キットに提供されるマニュアル中に記載されているように行った。ネステッドＰＣＲ産物をＴＡ Ｔｏｐｏベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、制限酵素（ＲＥ）消化により分析した。コンティグの配列に基づいて制限酵素マップを構築し、予想されるクローンをＳｐｅＩおよびＮｓｉＩで別々に消化した。これらのデータは、胎盤ｍＲＮＡからのＲＡＣＥ反応でのみ、予想されるクローンが得られることが示された。予測的ＲＥパターンを有するクローンの配列を決定した（Ｒｅｔｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ．）。この配列決定のデータから、クローンがすべて２ｋｂコンティグと重複し、そして実際に、５’末端の約３００ヌクレオチドのコンティグを伸長し、よって、約２．３ｋｂの新しいコンティグ（配列番号１５０）が作られたことを示した。長さが約７ｋｂ〜約７．５ｋｂと推定される（上記実施例５を参照のこと）遺伝子の全長はまだ得られていないので、この遺伝子をクローニングするために、ｍＲＮＡの長さを「ウォークダウン（ｗａｌｋ ｄｏｗｎ）」する必要がある。
【０１４２】
次いで、コンティグがさらに伸長し得るかどうかを調べるために、ＢＬＡＳＴ検索に対して、この２．３ｋｂコンティグ（配列番号：１５０）をクエリー配列として使用した。この検索で、２．３ｋｂコンティグと重複し、この配列が５’末端で約３００塩基より長く伸長されて約２．６ｋｂのコンティグ（配列番号：１５２）が作られる、ＥＳＴフラグメントｈｖ７９Ｆ０２（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＢＥ３２７６９３）（配列番号：１５１）を得た。次いで、ＮＣＢＩでヒトゲノム配列を検索するために、このコンティグをクエリー配列として使用した。この検索結果は、このコンティグが、第１染色体に試験的に当てはめられた領域に対して９８％を超える同一性でハイブリダイズすることを示した。
【０１４３】
次いで、２．６ｋｂコンティグが第１染色体にハイブリダイズする、５’末端の約３ｋｂ〜５ｋｂの配列に基づいて、一連の１０個のプライマーを設計した。これらのプライマーを、胎盤ｍＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ）のＲＡＣＥのＰＣＲ反応におけるコンティグ特異的プライマーと併用して、前もって行うｃＤＮＡ調製に利用した。これらのプライマーのうちの２つのプライマー（５’−ＴＡＡＣＡＡＴＣＣＴＴＴＧＧＡＡＧＴＣＡＣＴＡＣＴＧＧ−３’；配列番号：１５３）（５’−ＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＴＴＧＣＴＡＡＧＡＧＧ−３’；配列番号：１５４）からのＰＣＲ反応は、予想されたサイズの産物を与え、その産物をＴＡ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングして配列を決定した。この配列データは、これらのＰＣＲ産物が２．６ｋｂコンティグの配列と重複し、コンティグの５’末端を約８００ｂｐ伸長させて合計約３．４ｋｂ（配列番号１５５）の遺伝子フラグメントとなることを示した。
【０１４４】
次いで、Ｃｅｌｅｒａ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｇｒｏｕｐの独自の転写産物データベースを検索するために、この３．４ｋｂコンティグ（配列番号１５５）をクエリー配列として使用した。この検索で、３．４ｋｂコンティグ（配列番号１５５）の５’領域と有意に重複し、コンティグが５’末端で約７５０ｂｐ伸長されて系約４．１ｋｂの新しいコンティグ（配列番号１５７）が作られる、Ｃｅｌｅｒａ転写産物ｈＣＴ １７８２９６０（配列番号１５６）がヒットした。
【０１４５】
上記に記載した７５０ｂｐが本当にその遺伝子を伸長したかを決定するために、プライマー設計に対するテンプレートとして、４．１ｋｂコンティグ（配列番号１５７）のこの７５０ｂｐの領域を用いて、ＰＣＲ実験を行った。コンティグ特異的プライマー（配列番号１６１、配列番号１６２および配列番号１６３）を組み合わせて、これらのプライマー（配列番号１５９および１６０）を用いた場合、ＰＣＲ産物の期待されるサイズが得られた。配列決定は、これらのＰＣＲ産物が３．４ｋｂコンティグ（配列番号１５５）と重複し、そして、５’末端の新しい７５０ｂｐが、コンティグを明らかに約４．１ｋｂ伸長したことが確認された。
【０１４６】
４．１ｋｂコンティグ（配列番号１５７）の配列は、コードされるタンパク質（配列番号１５８）が仮定のタンパク質ＫＩＡＡ０４５６（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＢ００７９２５）（配列番号１６５）と有意な同一性を有し、ＧＴＰａｓｅ活性化プロテインと考えられるオープンリーディングフレーム（ヌクレオチド３〜９６２）を含む。このことは、Ｆａｓ誘導性アポトーシスに対する耐性の付与への関与が本明細書中で示される遺伝子が、ＧＴＰａｓｅ活性化プロテインをコードし得ることを示唆する。
【０１４７】
胎盤ｃＤＮＡにおいて、約７ｋｂのｍＲＮＡを見つけることが出来ないことは、上述の実施例５で記載されたものと同じプローブを用いた、結腸組織、脳組織および胎盤組織由来のｍＲＮＡに対する新たなノーザンブロットの実施を促した。その結果は、ＥＳＴ２を含む遺伝子が、発現している組織に依存して異なるサイズのｍＲＮＡを有することを示した。結腸組織は約７ｋｂのｍＲＮＡを含んだ；胎盤は約４．５ｋｂのｍＲＮＡを有した；そして脳は、２種類のｍＲＮＡ（約５．５ｋｂの優勢なバンド、および約７ｋｂのマイナーなバンド）を含んだ。したがって、上述に記載されたＲＡＣＥおよびコンティグアセンブリ結果は、胎盤中に見られるメッセージのサイズと一致する。
【０１４８】
アセンブリコンティグが本当のメッセンジャーＲＮＡを示すか否かを決定するために、λファージ脳ｃＤＮＡライブラリー（Ｈｕｍａｎ Ｂｒａｉｎ Ｌａｒｇｅ−Ｉｎｓｅｒｔ ｃＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をスクリーニングした。このライブラリーは、およそ５．５ｋｂのｍＲＮＡ、およびおよそ７ｋｂのｍＲＮＡの両方を含み、後者が大腸組織中に見られるメッセージのサイズと一致するので、選択された。これらの研究に対するプローブは、コンティグの３’末端に見られる５００ｂｐのＮｓｉＩフラグメントであり、ノーザンブロットのために使用されたプローブの約５０塩基上流に位置する。選択された脳ライブラリーから、５．５ｋｂ種のｍＲＮＡを容易に得られ、配列を決定した（配列番号１６６）。この脳ライブラリー由来の５．５ｋｂｃＤＮＡの配列は、４．１ｋｂコンティグ（配列番号１５７）の完全な配列を含み、配列の５’末端および３’末端の両末端で伸長する。遺伝子の５’末端でこのコンティグを伸長する配列はまた、４．１ｋｂコンティグ（配列番号１５７）中に見られ、さらに上述に記載したＧＴＰａｓｅプロテインとの配列同一性を有するオープンリーディングフレームを伸長する。
【０１４９】
（実施例６）
（インビトロでの効力）
この実施例は、癌細胞をアポトーシスに対してより感受性を高くし、より処置に対して応答するようにすることにより、リボザイムが癌細胞を処置し得ることを示す。
【０１５０】
具体的には、Ｆａｓ耐性の膀胱癌細胞株を選択した（癌における役割を含む、Ｆａｓ／Ｆａｓリガンドシステムの役割に関して、例えば、Ｇｒｕｓｓら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．；１８１：１２３５〜３８（１９９５）；Ｋａｇｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６５：５２８〜５３０（１９９４）；Ｎａｇａｔａら、Ｃｅｌｌ、８８：３５５〜６５（１９９７）；Ｒｕｎｉｃ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．、８１：３１１９〜２２（１９９６）；Ｓｕｄａら，Ｃｅｌｌ、７５：１１６９〜７８（１９９３）；およびＰｅｒａｂｏら、Ｕｒｏｌｏｇｙ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、６：１６３〜６９（２００１））を参照のこと。これらの細胞は、以下のリボザイム基質結合配列の１つもしくは両方でトランスフェクトされた：１）Ｔｖ２−２（ＥＳＴ２−２（配列番号９７））；およびｂ）Ｓｒ６（ＲＡＰ６（配列番号１９））。これらの結合配列は、トランスフェクションに用いられる、合成による、キメラＤＮＡ／ＲＮＡハンマーヘッドリボザイム構造の各部分であった（それぞれ、配列番号６および配列番号５）。使用した特定の細胞株は、６７歳の女性の膀胱の頚部の脱分化移行上皮癌（ＴＣＣ）に由来する、ＴＣＣＳＵＰであった。
【０１５１】
これらの細胞を、１）Ｔｖ２−２；２）ＳＲ６；３）「スクランブル（ｓｃｒａｍｂｌｅｄ）」コントロール（Ｔｖ２−２またはＳＲ６と同一の構造であるが、既知の任意の遺伝子と結合できない、さらなる非特異的配列を有しない）；または４）Ｔｖ２−２よびＳＲ６の１：１の比率での組合せ、のいずれかでトランスフェクトした。
【０１５２】
製造業者の推奨（ＧＴＳ、ＣＡ−ＵＳＡ）に従って、細胞をトランスフェクトした。簡単に言うと、細胞をプレートし、２４時間以降にＧｅｎｅ Ｐｏｒｔｅｒキットを用いて異なるリボザイムをトランスフェクトした。さらに２４時間後、細胞をＦａｓ抗体で処理した。１８時間後、細胞をＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ検出法で分析した。これらの実験の結果を図８に示す。
【０１５３】
図８に示されるように、Ｆａｓのないこれらのリボザイムの存在と比較して、Ｆａｓと連結された、示された基質結合配列を有する各々のリボザイムの存在は、アポトーシスを受けた細胞のパーセンテージを劇的に増加させた。さらに、Ｆａｓを有する両リボザイムの組合せは、アポトーシスが進行している細胞のパーセンテージを２倍より多くした。従って、この実施例は、Ｔｖ２−２およびＳＲ６は細胞のＦａｓ耐性を引き上げることができ、その結果、それらの細胞をアポトーシスに対して敏感にし、従って、より処置に対して応答するようにする。
【０１５４】
学術論文、特許出願、特許および他の刊行物を含む、本明細書中の全ての参考文献は、その全体が参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【０１５５】
【図１】図１は、ヘアピン型リボザイムの一般構造およびヌクレオチド配列（大文字）（配列番号１）および基質ＲＮＡ（小文字）（配列番号２）とのその相互作用を示す。
【図２】図２は、ハンマーヘッド型リボザイムの一般構造およびヌクレオチド配列（大文字）（配列番号３）、基質ＲＮＡ（小文字）（配列番号４）とのその相互作用を示す。
【図３】図３は、ＲＡＰ６のキメラのハンマーヘッド型リボザイムの構造（配列番号５）を示す。この図において、「ｐｒ」は、プロピレンジオールを示し；残りの大文字（例えば、Ｔ，Ｃ，ＧおよびＡ）は、ＤＮＡ塩基を示し；小文字は、ＲＮＡ塩基を示し；そして下線の小文字は、塩基の糖部分の２位で付加される−ＯＣＨ_３を有するＲＮＡ塩基を示す。
【図４】図４は、ＴＶ２−２（Ｅｓｔ２−２）キメラのハンマーヘッド型リボザイム（配列番号６）の構造を示す。この図において、「ｐｒ」は、プロピレンジオールを示し；残りの大文字（例えば、Ｔ，Ｃ，ＧおよびＡ）は、ＤＮＡ塩基を示し；小文字は、ＲＮＡ塩基を示し；そして下線のある小文字は、塩基の糖部分の２位で付加される−ＯＣＨ_３を有するＲＮＡ塩基を示す。
【図５】図５は、リボザイム遺伝子ベクターのライブラリーを、クローン化するために使用されるｐＬＰＲレトロウイルスベクターを示す。
【図６】図６は、ＲＡＰ２リボザイムおよびＴＶ２−１（Ｅｓｔ２−１）リボザイムを使用して、ＥＳＴ２遺伝子のｍＲＮＡ標的ノックダウンのＴａｑｍａｎ分析を示す。
【図７】図７は、大腸腫瘍細胞および正常な大腸組織のノーザンブロット分析のＸ線像を示す。
【図８】図８は、以下でトランスフェクトされる場合の、癌細胞（未分化移行細胞癌の膀胱細胞）におけるアポトーシスレベルを示す：１）ＴＶ２−２（Ｅｓｔ２−２）キメラのハンマーヘッド型リボザイム；２）ＴＶ２−２（Ｅｓｔ２−２）キメラのハンマーヘッド型リボザイムおよびＦａｓ；３）ＳＲ６（ＲＡＰ６）キメラのハンマーヘッド型リボザイム；４）ＳＲ６（ＲＡＰ６）キメラのハンマーヘッド型リボザイムおよびＦａｓ；５）ＴＶ２−２（Ｅｓｔ２−２）キメラのハンマーヘッド型リボザイム、およびＳＲ６（ＲＡＰ６）キメラのハンマーヘッド型リボザイム；ならびに６）ＴＶ２−２（Ｅｓｔ２−２）キメラのハンマーヘッド型リボザイム、およびＳＲ６（ＲＡＰ６）キメラのハンマーヘッド型リボザイムおよびＦａｓ。

Claims (40)

1. 単離分子であって、該単離分子は、配列番号１９のうちの塩基２〜８を含有し、そして配列番号１９のうちの塩基１３〜１６もまた含有し、ここで、糖部分の１位に各々存在する１個以上の塩基は、該糖部分の２位に−ＯＨ、−ＯＣ_１〜６アルキル、ハロ、アミノ、アジド、ニトロまたはフェニルを、独立してかつ必要に応じて有し、そしてここで、１個以上の塩基は、必要に応じてさらに改変され、改変塩基を生じる、単離分子。
2. 単離分子であって、該単離分子は、配列番号９７のうちの塩基２〜８を含有し、そして配列番号９７のうちの塩基１３〜１６もまた含有し、ここで、糖部分の１位に各々存在する１個以上の塩基は、該糖部分の２位に−ＯＨ、−ＯＣ_１〜６アルキル、ハロ、アミノ、アジド、ニトロ、またはフェニルを、独立してかつ必要に応じて有し、そしてここで、１個以上の塩基は、必要に応じてさらに改変され、改変塩基を生じる、単離分子。
3. 請求項１または２に記載の分子であって、ここで、前記塩基はさらに改変されない、分子。
4. 請求項３に記載の分子であって、ここで、配列番号１９のうちの塩基２，４および５が、各々チミンであり、そして配列番号９７の塩基１６がウラシルである、分子。
5. 請求項１または２に記載の分子であって、配列番号５のうちの塩基８〜１１をさらに含有する、分子。
6. 請求項４に記載の分子であって、配列番号５のうちの塩基８〜１５をさらに含有する、分子。
7. 請求項１または２に記載の分子であって、ここで、前記糖部分の２位の全てではなく、少なくとも１個が、−ＯＨ、−ＯＣ_１〜６アルキル、ハロ、アミノ、アジド、ニトロ、またはフェニルを有する、分子。
8. 組成物であって、請求項１に記載の分子および請求項２に記載の分子を含有し、ここで、前記塩基は、必要に応じてさらに改変されない、組成物。
9. 請求項４に記載の分子であって、ここで、塩基６および７の各々の糖部分の２位が、−ＯＣＨ_３である、分子。
10. 請求項４に記載の分子であって、配列番号５を含有する、分子。
11. 請求項４に記載の分子であって、配列番号６を含有する、分子。
12. 請求項４に記載の分子であって、配列番号５からなる、分子。
13. 請求項４に記載の分子であって、配列番号６からなる、分子。
14. ハンマーヘッド型リボザイムであって、請求項５または７に記載の分子を含有する、ハンマーヘッド型リボザイム。
15. 細胞内でアポトーシス誘導を促進する方法であって、該方法は、該細胞内に、請求項１に記載の分子を導入する工程を包含する、方法。
16. 請求項１５に記載の方法であって、ここで、前記細胞がアポトーシスに対して耐性である、方法。
17. 請求項１６に記載の方法であって、ここで、前記細胞が癌細胞である、方法。
18. 請求項１７に記載の方法であって、前記細胞をアポトーシス誘導剤と接触させる工程をさらに含有する、方法。
19. 請求項１８に記載の方法であって、ここで前記薬剤がＦａｓである、方法。
20. 前記細胞内でアポトーシス誘導を促進する方法であって、該方法は、該細胞内に、請求項２に記載の分子を導入する工程を包含する、方法。
21. 請求項２０に記載の方法であって、ここで前記細胞がアポトーシスに対して耐性である、方法。
22. 請求項２１に記載の方法であって、ここで前記細胞が癌細胞である、方法。
23. 請求項２２に記載の方法であって、前記細胞をアポトーシス誘導剤と接触させる工程をさらに含有する、方法。
24. 請求項２３に記載の方法であって、ここで、前記薬剤がＦａｓである、方法。
25. 細胞内でアポトーシス誘導を促進する方法であって、該方法は、該細胞内に、請求項１および２に記載の分子を導入する工程を、包含する方法。
26. 請求項２５に記載の方法であって、ここで、前記細胞がアポトーシスに対して耐性である、方法。
27. 請求項２６に記載の方法であって、ここで、前記細胞が癌細胞である、方法。
28. 請求項２７に記載の方法であって、該方法は、前記細胞をアポトーシス誘導剤と接触させる工程をさらに含有する、方法。
29. 請求項２８に記載の方法であって、ここで前記薬剤がＦａｓである、方法。
30. 単離化合物であって、配列番号１５８、または配列番号１５８と９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含有する、単離化合物。
31. 単離化合物であって、配列番号１６７のうちの１〜２４７のアミノ酸、または配列番号１６７のうちの１〜２４７のアミノ酸と９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含有する、単離化合物。
32. 請求項３１に記載の前記単離化合物であって、配列番号１６７、または配列番号１６７と９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含有する、単離化合物。
33. 前記細胞内で、アポトーシス誘導を促進する分子を同定する方法であって、該方法は、以下の工程：
    ａ．該分子を化合物と接触させる工程であって、該分子は、配列番号１５８のうちの１０個以上の隣接アミノ酸、または配列番号１６７のうちのアミノ酸１〜２４７のうちの１０個以上の隣接アミノ酸を含有する、工程；
    ｂ．該分子を細胞内に導入する工程；および
    ｃ．前記細胞内のアポトーシスレベルの増加が、該分子がアポトーシス誘導を促進することを示す場合、前記細胞内でアポトーシスレベルを測定する工程、
    を包含する、方法。
34. 前記単離分子であって、配列番号１４６、または配列番号１４６と９５％以上の同一性を有する分子を含有する、単離分子。
35. 請求項３４に記載の前記単離分子であって、配列番号１４８または配列番号１４８と９５％以上の同一性を有する分子を含有する、単離分子。
36. 請求項３４に記載の前記単離分子であって、配列番号１５０、または配列番号１５０と９５％以上の同一性を有する分子を含有する、単離分子。
37. 請求項３４に記載の前記単離分子であって、配列番号１５２、または配列番号１５２と９５％以上の同一性を有する分子を含有する、単離分子。
38. 請求項３４に記載の前記単離分子であって、配列番号１５５、または配列番号１５５と９５％以上の同一性を有する分子を含有する、単離分子。
39. 請求項３４に記載の前記単離分子であって、配列番号１５７、または配列番号１５７と９５％以上の同一性を有する分子を含有する、単離分子。
40. 請求項３４に記載の前記単離分子であって、配列番号１６６、または配列番号１６６と９５％以上の同一性を有する分子を含有する、単離分子。

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