JP2005501037A - 心血管安全性アッセイ - Google Patents
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Abstract
Description
【0001】
本発明は心血管の安全性アッセイの分野に関し、そして個体に心臓毒性(cardiotoxicity)を誘導する能力について試験化合物をスクリーニングするためのアッセイおよびキットを提供する。該アッセイおよびキットは、アステミゾール(astemizole)とHERGカリウムチャンネルとの相互作用を、新規治療薬および他の作用物質の開発中に化合物の潜在的な心臓毒性を予測するために活用することができるという知見に基づく。本発明は化学化合物ライブラリーの高処理量スクリーニングに特に有利な用途がある。
【背景技術】
【0002】
発明の背景
数種の薬剤は、心臓の再分極(すなわち、表面心電図のQT間隔として「測定される」)を、特に過剰投与または薬物動態学的相互作用の場合に生命を脅かす可能性がある心室不整脈(ventricular arrhythmias)、例えばトルサード・ド・ポワント(TdP)が起こり得る程度まで延長し得るという証拠が得られた。
【0003】
TdPを起こす、または起こさずにQT間隔の延長を誘導することが報告された薬剤の数は増え続けている(非特許文献1)。50種もの臨床的に利用可能な、または未だ調査用の非−心血管剤および心血管非−抗不整脈剤が関係してきた。新旧両方の多数の薬剤が市場から引き上げられ、またはその販売が制限された。中でも重要な事は、これらの薬剤を市場に出してから薬剤とQT間隔の延長および/またはTdPとの関係が初めて認識されるまでに、通常、年で測定される間隔があることである。したがって新規な化学的物体の潜在的副作用を、それらが新規治療薬および/または他の作用物質として開発される初期段階で、ヒトに最初に使用する前に調査することは有益である。
【0004】
新規治療薬の本開発における重要な要素は、化学化合物ライブラリーの高処理量スクリーニング(High Throughput Screening:HTS)からなる。製薬会社は構造的に異なる化合物の大きなコレクションを確立し、これが薬剤標的リード同定プログラム(drug target lead identification program)に関する出発点としての役を果たす。典型的な会社の化合物コレクションは現在、100,000から1,000,000の間の別個の化学的物体を含んでなる。2〜3年前までは1日およびアッセイあたり数千の化合物の処理で十分であると考えられていたが、今日では製薬会社は1週間に数十万の化合物を試験する超高処理量スクリーニング技術を目標としている。典型的なHTS関連スクリーニング形式では、アッセイは96、384または1536ウェルプレートのようなマルチ−ウェルマイクロプレート中で行われる。これらプレートの使用により、自動化試薬分配器およびロボットピペット装置の使用のような自動化が促進される。さらに組換えタンパク質のような生化学物質に関するサイクル時間、経費および資源を減らすために、HTS関連スクリーニングは好ましくはアッセイで試験する各化合物について室温で1回の測定を行う。
【0005】
リード評価プロセス(lead evaluation process)における決定的基準は、薬剤のQT延長および/またはTdPとの潜在的関係の早期の認識となるだろう。しかし現在展開しているHTS技術において同定される多数の化合物にうまく対処することができる、心臓毒性を評価するために利用可能な信頼性があり迅速で容易なスクリーニング法は存在しない。本発明の目的は、アステミゾールとHERGカリウムチャンネルとの相互作用を、新規治療薬および他の作用物質の開発中に化合物の心臓毒性を予測するために活用することができるという知見に基づくアッセイおよびキットを提供することにより、当該技術分野におけるこの問題を解決することである。
【0006】
現在利用できるインビトロモデルは、ヘテロロガスな発現系、非凝集細胞、単離された組織および単離された完全な(ランゲンドルフ(Langendorf)−潅流)心臓を含んでなる。すべてのモデルでカリウム電流遮断の効果は、微小電極または共焦点顕微鏡を使用した(非特許文献2)膜電位の2極電圧クランプ記録(非特許文献3)またはパッチ−クランプ記録(非特許文献4)を使用したいずれかのイオン電流の測定により評価される。前述のいずれの方法も実験手順の複雑さ、遅いサイクル時間および供給材料の性質(すなわち、単離された組織およびそれらの非凝集細胞)ならびに試験結果の信頼性といった観点からHTSスクリーニングに使用することはできない。
【0007】
驚くべきことには本発明者は、HERGチャンネルの特異的リガンドとして標識したアステミゾールを使用した結合アッセイを、化合物とQT延長および/またはTdPとの潜在的関係を予測するために使用できることを見いだした。この結合アッセイは前述の問題を解決し、そしてHTS関連スクリーニング形式に展開することができる。
【0008】
同様のアッセイがChadwick C.et al(非特許文献5)により記載され、ここで[3H]−ドフェチリド(dofetilide)が心遅延整流性(cardiac delayed rectifier)K+チャンネルに特異的な放射能リガンドとして同定された。この文献ではさらに、多数の抗不整脈化合物のドフェチリド置換とカリウムチャンネル遮断活性との間の良好な相関を証明した。この結合アッセイは薬剤−チャンネル相互作用を分子レベルで特性決定するために役立つ。
【0009】
このアッセイで標識したドフェチリドは、分子あたり2個の3H−標識の包含をもたらす3H−交換によりジブロモ前駆体から調製された。分子あたりの3H−標識数と結合アッセイの感度との間には直接的な相関がある。本発明は、1分子のアステミゾールあたり3個の3H−標識の包含をもたらす[33H]−メチルヨージドでの反応にデスメチルアステミゾール前駆体を使用するので、上記に優る改良された結合アッセイを提供する。このようにして得られた放射能リガンドの比活性は、[3H]−ドフェチリドの比活性よりも1.5〜2倍高い。
【0010】
さらにドフェチリドアッセイは、モルモットのオス成体から単離した心室筋細胞が単離から6時間以内に使用しなければならなかったことからもHTS関連スクリーニング形式に使用することはできなかった。さらに36%の単離細胞が生存し、そしてこの結合アッセイに使用することができただけであった。HTS関連スクリーニングに使用するためには、出発材料が容易に、しかも十分な量で得られるべきである。本発明はHERGカリウムチャンネルを安定に発現しているHEK293細胞の膜調製物を使用するので、この問題を解決する。該細胞は培養中、十分な量で維持することができ、動物モデルの必要性および供給を回避し、そして細胞膜を結合アッセイに使用するので、これは後に使用するために−80℃で結合アッセイに即使用可能なアリコートとして保存することができる。Chadwick et al.により記載されたドフェチリド結合アッセイのさらなる欠点は、インキューベーションプロトコールと関係がある点である。生きている筋細胞を使用する時、インキューベーションは34℃の生理学的温度で行わなければならない。これはアッセイがHTS関連スクリーニング形式で行われる場合に、疑うことなくアッセイの経費、可能なサイクル時間、および複雑さを増す。驚くべきことには、本発明は膜調製物を室温でインキューベーションできることが証明されたので、この問題を解決する。特にHERGについて測定した動力学的特性が温度に顕著に依存し、そして差異が幾つかの報告で観察された差異は生理学的温度、すなわち35℃で試験を実施すると消失すると結論したZhoe Z.et al.(非特許文献4)による実験を考慮する。
【0011】
本発明のこのおよび他の観点を本明細書で以下に記載する。
【非特許文献1】
W.Haverkamp et al.(2000) Cardiovascular Research 47,219−233)
【非特許文献2】
Dall’Asta V.et al.(1997) Exp.Cell.Research 231,260−268)
【非特許文献3】
Dascal N.(1987) Crit.Rev.Biochem 22,341−356)
【非特許文献4】
Zhou Z.et al.(1998) Biophysical Journal 74,230−241
【非特許文献5】
Chadwick C.et al.,(1993)Circulation Research,72,707−714)
【0012】
発明の要約:
本発明は、個体に心臓毒性を誘導する能力について試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供し、該方法はHERGまたはその断片を含む供給源を、参照化合物および試験化合物と、参照化合物および試験化合物がHERGポリペプチドチャンネルに結合できる十分な時間インキューベーションし、そしてHERGに結合した参照化合物の量に及ぼす試験化合物の効果を測定することを含んでなる。
【0013】
本発明の好適な態様では、アッセイは配列番号2のアミノ酸配列を含んでなるHERGポリペプチドチャンネルまたはその断片を表面に発現する細胞、好ましくはHEK293細胞の膜調製物を;標識した参照化合物とインキューベーションすることからなる。ここで該標識した参照化合物は、個体に心不整脈(cardiac arrhythmia)を誘導することができる薬剤、好ましくは該標識した参照化合物は[3H]−アステミゾールである。上記を試験化合物と一緒にインキューベーションし、そしてHERGポリペプチドチャンネルへ結合した参照化合物の量に及ぼす試験化合物の効果を測定する。さらなる態様では、測定手段はインキューベーション混合物から過剰な未結合の標識した参照化合物を除去するための分離手段、および標識した参照化合物の検出手段からなり、ここで後者は好ましくはシンチレーションカウンティングを使用した放射能標識した測定からなる。
【0014】
本発明はさらに個体に心臓毒性を誘導する能力について化合物をスクリーニングするための高処理量アッセイを提供し、このアッセイは;
a)表面に配列番号2の配列に少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を有するHERGポリペプチドチャンネルまたはその断片を発現する細胞の膜調製物を、標識した参照化合物と、参照化合物のHERGポリペプチドチャンネルへの結合を可能とする十分な時間接触させ;
b)表面に配列番号2の配列に少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を有するHERGポリペプチドチャンネルまたはその断片を発現する細胞の膜調製物を、試験化合物と一緒に工程a)の標識した参照化合物と、参照化合物および試験化合物のHERGポリペプチドチャンネルへの結合を可能とする十分な時間接触させ;
c)工程a)でHERGチャンネルへ結合した標識した参照化合物の量を測定し;
d)工程b)でHERGチャンネルへ結合した標識した参照化合物の量を測定し;そしてe)工程a)で測定したHERGチャンネルへ結合した標識した参照化合物の量と、工程b)で測定したHERGポリペプチドチャンネルへ結合した標識した参照化合物の量とを比較することを含んでなる。
【0015】
高処理量スクリーニングアッセイの好適な態様では、膜調製物は表面に配列番号2からなるアミノ酸配列によりコードされるHERGポリペプチドチャンネルを発現する細胞、好ましくはHEK293細胞に由来する。高処理量スクリーニングアッセイのさらなる態様では、標識した参照化合物はアステミゾール、好ましくは[3H]−アステミゾールである。
【0016】
また本発明は、化合物が個体に心臓毒性を誘導する能力をスクリーニングするためのキット、ならびに本発明のアッセイにおけるポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび適当な参照化合物を含む試薬の使用を包含する。
詳細な記述
本発明は心血管の安全性アッセイの分野に関し、そして個体に心臓毒性を誘導する能力について試験化合物をスクリーニングするためのアッセイおよびキットを提供する。該アッセイおよびキットは、アステミゾールとHERGカリウムチャンネルとの相互作用を、新規治療薬および他の作用物質の開発中に化合物の心臓毒性を予測すために活用することができるという知見に基づく。本発明は化学化合物ライブラリーの高処理量スクリーニングに特に有利な用途がある。
【0017】
本発明の1つの態様では、試験化合物をスクリーニングするためのアッセイは;a)HERGまたはその断片を含む供給源を、i)参照化合物、ii)試験化合物とインキューベーションし;そしてb)HERGに結合した参照化合物の量に及ぼす試験化合物の効果を測定することを含んでなる。
【0018】
本発明の特別な態様では、アッセイは個体に心不整脈を誘導する試験化合物の能力を評価するために使用する。
【0019】
本明細書で使用する用語「試験化合物」は、心不整脈を誘導する能力が本発明によるアッセイで評価される化学的に定められた分子を称する。試験化合物には限定するわけではないが、薬剤、リガンド(天然または合成)、ポリペプチド、ペプチド、ペプチド模造物、多糖、サッカリド、糖タンパク質、核酸、ポリヌクレオチドおよび低有機分子を含む。1つの態様では、試験化合物は化合物の既存ライブラリーを含んでなる。別の態様では、試験化合物は化合物の新規ライブラリーを含んでなる。
【0020】
本明細書で使用する用語「参照化合物」は、個体に心臓毒性を誘導することができる薬剤を称する。参照化合物には限定するわけではないが、アステミゾール、テルフェナジン(terfenadine)、エリスロマイシン(erythromycin)、スパルフロキサイン(sparfloxain)、プロブコール(probucol)、テロジリン(terodiline)およびセルチンドール(sertindole)を含む。
【0021】
本明細書で使用する用語「HERG」は、ヒトエーテル−ア−ゴー−ゴー−関連遺伝子(Human Ether−a−go−go−Related Gene)チャンネルを称する。これは多くの細胞型で作用電位の再分極の制御に役割を果たす遅延整流性カリウムチャンネルである。HERGは元はヒト海馬からクローン化され、そして心臓で強く発現する。本発明によるHERGポリペプチドには、配列番号2の配列に少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を有する単離され、そして精製されたタンパク質またはその断片を含む。さらなる態様では、本発明によるHERGポリペプチドチャンネルは配列番号2のアミノ酸配列を含んでなるアミノ酸配列を有する。好適な態様では、本発明によるHERGポリペプチドは配列番号2からなる。
【0022】
定めた配列および断片の変異体も本発明の一部を構成する。変異体には保存的アミノ酸の変化により元の配列から変化した配列を含み、ここで「保存的アミノ酸の変化」は、特定のアミノ酸の当該技術分野で認識されている置換性に基づき、元の分子の生物学的活性に影響を及ぼすことなく元の配列の1以上のアミノ酸残基(1つまたは複数)の置換を称する(例えば、M.Dayhoff、タンパク質配列および構造の地図で(In Atlas of Protein Sequence and Structure)、第5巻、追補3、第345〜352頁、1987を参照にされたい)。さらなる変異体は数個、5〜10、1〜5、または1〜2個のアミノ酸が任意の組み合わせで置換、削除または付加されている変異体である。
【0023】
2以上の配列の同一性および類似性を比較するための方法は、当該技術分野では周知である。すなわち例えば、ウィンコンシン配列分析パッケージ(Winconsin Sequence Analysis Package)、第9.1バージョン(Devreux J.et al,Nucleic Acids Res.,12,387〜395,1984)で利用可能なプログラム、例えばプログラムBESTFITおよびGAPは、2つのポリヌクレオチド間の同一性の%、および2つのポリペプチド配列間の同一性の%および類似性の%を決定するために使用することができる。BESTFITはSmith and Waterman(J.Mol.Biol.,147,195〜197,1981)の「ローカルホモロジー(local homology)」アルゴリズムを使用し、そして2つの配列間の類似性が最高の1領域を見いだす。BESTFITは長さが異なる2つのポリヌクレオチドおよび2つのポリペプチド配列を比較するためにより適し、プログラムはより短い配列が長い配列の一部分を表すことを想定している。対照的にGAPは2つの配列を並べ、Neddleman and Wunsch(J.Mol.Biol.,48,443〜453,1970)のアルゴリズムに従い「最大類似性」を見いだす。GAPはほぼ同じ長さの配列を比較するためにより適し、そして整列は全長にわたると期待される。好ましくは各プログラムで使用するパラメーター「ギャップ加重値」および「長さの加重値」は、それぞれポリヌクレオチド配列について50および3、そしてポリペプチド配列について12および4である。好ましくは同一性および類似性の%は、比較される2つの配列が最適に並列配置された時に決定される。配列間の同一性および/または類似性を決定するための他のプログラムも当該技術分野では既知であり、例えばそれはBLASTファミリーのプログラム(Altschul S F et al.,Nucleic Acids Res.,25:3389〜3402,1997)である。
【0024】
当業者は本発明のポリペプチド、すなわちHERGポリペプチドチャンネルが例えばハイブリダイゼーション、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅、またはデノボDNA合成を含む複数の組換えDNA技術(例えばT.Maniatis et al.モレキュラークローニング:ア ラボラトリーマニュアル(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)、第2版、第14章(1989))により得ることができると認識するだろう。このようにさらなる態様では、本発明は本発明によるアッセイまたはキットでHERGポリペプチドまたはその断片をコードする単離され、そして精製されたポリヌクレオチドの使用を提供する。別の態様では本発明は、配列番号1のポリヌクレオチド配列を含んでなるHERGポリペプチドチャンネルまたはその断片をコードする単離され、そして精製されたポリヌクレオチドの使用を提供する。好適な態様では、本発明は配列番号1のポリヌクレオチド配列からなるHERGポリペプチドチャンネルをコードする単離され、そして精製されたポリヌクレオチドの使用を提供する。
【0025】
用語「その断片」は、該断片が元のタンパク質中で連続する5以上のアミノ酸を含んでなるような、あるいは該断片が元のポリヌクレオチド中で15以上の核酸を含んでなるような、配列が本明細書に開示されたタンパク質またはポリヌクレオチド分子の一片(a piece)またはサブ領域を記載する。用語「その断片」は「機能的断片」を含むことを意図し、ここで単離された断片、片またはサブ領域は、受容体タンパク質の活性部位、結合部位またはリン酸化部位のような機能的に明らかな領域を含んでなる。機能的断片はクローニング技法により生産することができ、あるいは選択的スプライシング技法の天然産物としてでもよい。
【0026】
本明細書で使用する「単離された」とは、問題のポリヌクレオチド、タンパク質およびポリペプチドまたはそれらの各断片がそのインビボの環境から取り出されたので、当業者により、限定するわけではないがシークエンシング、制限消化、部位特異的突然変異誘発法および核酸断片用の発現ベクターへのサブクローニングのような操作にかけられ、そして問題のタンパク質またはタンパク質断片を、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、アミノ酸シークエンシングおよびペプチド消化を行うための好機を与えるに十分な量で得られる、という事実を指す。したがって本明細書に記載する核酸は、全細胞または細胞溶解物で、または部分的に、実質的に、または全部が精製された状態で存在することができる。
【0027】
ポリペプチドは環境的混入物から精製された時に「精製された」と考えられる。すなわち細胞から単離されたポリペプチドは、標準法により細胞の成分から精製された時に実質的に精製されたと考えられるが、化学的に合成されたポリペプチド配列は、その化学的前駆体から精製された時に実質的に精製されたと考えられる。「実質的に純粋」なタンパク質または核酸は、典型的にはサンプルの少なくとも85%を構成し、より大きな割合が好ましい。タンパク質または核酸分子の純度を決定する1つの方法は、ポリアクリルアミドまたはアガロースのようなマトリックス中で調製物を電気泳動することによる。純度は染色後に単一バンドの出現により証明される。純度を評価する他の方法にはクロマトグラフィーおよび分析的遠心を含む。
【0028】
本明細書で使用する用語「結合を可能にする十分な時間」とは、HERGポリペプチドチャンネルに結合した標識した参照化合物の検出可能な量を生じるために必要な時間を称する。この検出可能な量を生じるために必要な時間は、アッセイ系に依存して変動するだろう。当業者はアッセイ系に基づきHERGポリペプチドチャンネルに結合する標識した参照化合物の検出可能な量を生じるために十分な時間の量を知っている。
アッセイ
本発明のアッセイは、ポリペプチドチャンネルに結合する化合物をスクリーニングするために当該技術分野で一般的に知られている多くの形式で設計することができる。
【0029】
本発明のアッセイは、アステミゾールとHERGカリウムチャンネルとの相互作用を、新規治療薬および他の作用物質の開発中に化合物の心臓毒性を予測するために活用することができるという事実を有利に活用する。
【0030】
したがって本発明は試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供し、このアッセイはa)HERGまたはその断片を含む供給源を;i)参照化合物、ii)試験化合物とインキューベーションし;そしてb)HERGに結合した参照化合物の量に及ぼす試験化合物の効果を測定することを含んでなる。
【0031】
本発明の第1の態様では、HERGを含む供給源が配列番号2の配列に少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を有するHERGまたはその断片をコードする単離され、そして精製されたタンパク質である。
【0032】
本発明の第2の態様では、HERGを含む供給源が配列番号2のアミノ酸配列を含んでなるHERGまたはその断片をコードする単離され、そして精製されたタンパク質である。
【0033】
本発明のさらなる態様では、HERGを含む供給源が表面にHERGポリペプチドチャンネルまたはその断片を発現する細胞である。
【0034】
本発明の別の態様では、HERGを含む供給源は表面にHERGポリペプチドチャンネルまたはその断片を発現する細胞の膜調製物である。
【0035】
本発明の別の態様では、参照化合物は個体に心臓毒性を誘導することができる化合物であり、好ましくはアステミゾール、テルフェナジン、エリスロマイシン、スパルフロキサイン、プロブコール、テロジリンおよびセルチンドールからなる群から選択される。好適な態様では、参照化合物はアステミゾールである。本発明のさらなる目的は、参照化合物が標識され、好ましくは放射能標識されたアッセイを提供することである。
【0036】
好適な態様では、個体に心臓毒性を誘導する能力について試験化合物をスクリーニングするためのアッセイは、a)表面に配列番号2からなるアミノ酸配列によりコードされるHERGポリペプチドチャンネルを発現する細胞の膜調製物を、i)[3H]−アステミゾール、ii)試験する化合物とインキューベーションし;そしてHERGに結合した参照化合物の量に試験化合物が及ぼす効果を測定することからなる。参照化合物の標識はこの効果を測定するために使用し、ここで該標識はとりわけシンチレーションカウンティングを使用して測定することができる。
【0037】
本発明によるアッセイの特別な態様は、試験化合物をスクリーニングするための高処理アッセイからなり、このアッセイは:a)表面に配列番号2の配列に少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を有するHERGポリペプチドチャンネルまたはその断片を発現する細胞の膜調製物を、標識した参照化合物と、参照化合物のHERGポリペプチドチャンネルへの結合を可能とする十分な時間接触させ;b)表面に配列番号2の配列に少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を有するHERGポリペプチドチャンネルまたはその断片を発現する細胞の膜調製物を、試験化合物と一緒に工程a)の標識した参照化合物と、参照化合物および試験化合物のHERGポリペプチドチャンネルへの結合を可能とする十分な時間接触させ;c)工程a)でHERGチャンネルへ結合した標識した参照化合物の量を測定し;d)工程b)でHERGチャンネルへ結合した標識した参照化合物の量を測定し;そしてe)工程a)で測定したHERGチャンネルへ結合した標識した参照化合物の量と、工程b)で測定したHERGポリペプチドチャンネルへ結合した標識した参照化合物の量とを比較することを含んでなる。
【0038】
さらなる態様では、高処理量スクリーニングアッセイの膜調製物は配列番号2のアミノ酸配列を含んでなるHERGポリペプチドチャンネルまたはその断片を表面に発現する細胞の膜調製物からなる。
【0039】
本発明の好適な態様では、高処理量スクリーニングアッセイの膜調製物は配列番号2のアミノ酸配列からなるHERGポリペプチドチャンネルを表面に発現する細胞、好ましくはHEK293細胞の膜調製物からなる。
【0040】
さらなる好適な態様では、高処理量スクリーニングアッセイにおける標識した参照化合物は[3H]−標識アステミゾールからなる。該標識はとりわけシンチレーションカウンティングを使用して測定することができる。
【0041】
別の特別な態様では、本発明は試験化合物をスクリーニングするための高処理量近接検出アッセイを提供し、アッセイは;
i)近接検出アッセイに参加することができる第1標識で標識したHERG;
ii)近接検出アッセイに参加することができる第2標識で標識した参照化合物:
iii)工程i)のHERGおよび工程ii)の参照化合物を試験化合物と一緒に、参照化合物および試験化合物のHERGへの結合を可能とする十分な時間接触させ;そして
iv)工程i)のHERGと工程ii)の参照化合物との間の相互作用を、HERGおよび参照化合物が相互作用した時に第1標識と第2標識の近接により検出することを含んでなる。
【0042】
HERGおよび参照化合物の相互作用によりもたらされる第2標識への第1標識の近接は、検出可能なシグナルの生成を生じる。これは例えばシンチレーション近接アッセイ(scintillation proximity assay:SPA)系により達成することができ、ここで標識の1つはSPAでの使用に適する放射能標識であり、そしてもう1つの標識は固相中に含まれる蛍光剤である。検出可能なシグナルは、標識したHERGタンパク質が標識した参照化合物と相互作用し、放射能標識が蛍光剤の十分近くに運ばれた時に発生する光エネルギーである。シンチレーション近接アッセイ技法は、米国特許第4,568,649号明細書に記載されている。
【0043】
あるいは検出可能なシグナルは存在しているシグナル出力、例えば蛍光の変化でもよい。蛍光共鳴エネルギー転移(Fluorescencs resonance energy transfer:FRET)はこの原理で作用する方法であり、そしてTsien R.et al.(Tsien R.et al.(1993)Trends Cell Biol.3:242−245)により記載されている。これは2種類の蛍光分子、供与体および受容体を採用して、これらが互いに十分に近接した時、供与体分子の蛍光が受容体分子により吸収され、そして別の波長の光が発生する。すなわちHERGと参照化合物のように2つの分子間に相互作用がある時、その各々はこれら蛍光分子の1つで標識され、検出可能なシグナルが生成する。
【0044】
上に記載したそのような近接アッセイにより、本発明によるスクリーニングアッセイは1段階で、すなわち濾過のような分離手段を使用してインキューベーション混合物から過剰な標識した参照化合物を除去する分離工程を必要とせずに行うことができる。
【0045】
高処理量近接検出アッセイの好適な態様ではHERGを、コートされたシンチレーション近接アッセイビーズのような固体相に含まれる蛍光剤で標識し、そして参照化合物を放射能標識し、好ましくは参照化合物は式(III)のアステミゾールである。
【0046】
【化1】
【0047】
当業者はアステミゾールとHERGの結合が:
a)HERGポリペプチドチャンネルとアステミゾールとの結合部位の構造にプローブを付け;
b)結合中にアステミゾールと相互作用するHERGポリペプチドチャンネルの結合部位の接触する原子を同定し;
c)(b)で同定した原子と相互作用する試験化合物を設計してHERG−アステミゾール相互作用に影響を及ぼし;そして
d)該設計した試験化合物を、HERGまたはその断片を含む供給源と接触させて、該化合物がHERGへ結合した標識したアステミゾールの量に影響を与える能力を測定する、ことにより、前述の結合に影響を及ぼす化合物の構造に基づく、または合理的な設計法に使用することもできると容易に考えるだろう。
【0048】
さらにこれは通常、反復法になると考えられる。
キット
本発明は上記アッセイに使用することができるキットも提供する。1つの態様では、キットはa)HERGを含む供給源;b)参照化合物を含んでなる。
【0049】
第1の態様では、キットは;i)配列番号2の配列に少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を有するHERGまたはその断片をコードする単離され、そして精製されたタンパク質;ii)配列番号2のアミノ酸配列を含んでなるHERGまたはその断片をコードする単離され、そして精製されたタンパク質;iii)表面にHERGポリペプチドチャンネルまたはその断片を発現する細胞;またはiv)表面にHERGポリペプチドチャンネルまたはその断片を発現する細胞の膜調製物から選択されるHERGを含む供給源を含んでなる。
【0050】
さらなる態様では、キットはアステミゾール、テルフェナジン、エリスロマイシン、スパルフロキサイン、プロブコール、テロジリンおよびセルチンドールからなる群から選択される参照化合物を含んでなる。好適な態様では、参照化合物はアステミゾールである。本発明のさらなる目的は、参照化合物が標識され、好ましくは放射能標識されたキットを提供することである。
【0051】
特別な態様では、単離され、そして精製されたHERGポリペプチドチャンネルが固体支持体、好ましくはコートされたシンチレーション近接ビーズのような固体支持体を含んでなる蛍光剤に結合している。
【0052】
このように特別な態様では、キットはa)固体支持体に結合した単離され、そして精製されたHERGポリペプチドチャンネルまたはその断片;およびb)標識した参照化合物を含んでなる。好ましくはこの特別な態様はa)固体支持体を含んでなる蛍光剤に結合した、配列番号2のアミノ酸配列からなる単離され、そして精製されたHERGポリペプチドチャンネル;およびb)放射能標識した参照化合物、好ましくは[3H]−標識したアステミゾールを含んでなるキットからなる。
【0053】
別の特別な態様では、キットはa)表面に配列番号2の配列からなるHERGポリペプチドチャンネルを発現する細胞、好ましくはHEK293細胞の膜調製物、b)[3H]−標識したアステミゾール;およびc)HERGに結合した標識した参照化合物の量を測定する手段を含んでなる。
【0054】
測定手段は、過剰な未結合の標識した参照化合物をインキューベーション混合物から除去するための分離手段および標識した参照化合物の検出手段からなる。当業者は過剰な未結合の標識した参照化合物をインキューベーション混合物から除去するために利用できる分離手段を知っている。該分離手段には限定するわけではないが、磁気ビーズ、遠心技術および濾過技術を含む。標識した参照化合物の検出手段は、使用する標識に依存する。該標識は蛍光または放射能標識である。熟練者は使用する標識に依存して利用できる検出手段を知っている。
【0055】
特別な態様では、分離手段はGF/B濾過(ワットマン(Whatman)社、クリフトン、ニュージャージー州)からなる。別の特別な態様では、検出手段はTopcount(パッカード(Packard)、メリデン、コネチカット州)でのシンチレーションカウンティングからなる。
【0056】
さらなる態様では、本発明のキットはさらにアッセイを行うための使用説明書および/またはマルチウェルプレートを含んでなる。
【0057】
本発明は以下の実施例の詳細を参照にしてより良く理解されると思われるが、当業者はこれらが特許請求の範囲をより完全に記載するような本発明の具体的説明のみであると容易に理解するだろう。さらに本出願を通じて、さまざまな刊行物を引用する。これら刊行物の開示は引用により本出願に編入し、本発明が関係する当該技術分野の状況をより完全に説明する。
【実施例1】
【0058】
DNA構築物およびHEK293細胞のトランスフェクション
HERG cDNA(Genbank寄託番号:U04270(配列番号1))をpcDNA3ベクター(インビトロゲン(Invitrogen))のbamHI/EcoRI部位にサブクローン化した。このベクターはCMVプロモーターおよびSV40プロモーターを含み、これらはそれぞれ挿入されたcDNA(HERG)およびネオマイシン耐性遺伝子の発現を駆動する。HEK293細胞はこの構築物を用いてリン酸カルシウム沈殿法(ギブコ(Gibco))またはリポフェクタミン法(ギブコ)によりトランスフェクトした。800μg/mlジェネティシン(G418;ギブコ)で15〜20日間選択した後、単一コロニーをクローニングシリンダーで取り出し、そしてHERG電流について試験した。安定にトランスフェクトされた細胞は10%ウシ胎児血清および400μg/mlジェネティシンを補充した最少必須培地(MEM)で培養した。
【0059】
電気生理学的実験のために、細胞を培養皿からトリプシン処理により回収し、標準MEM培地で2回洗浄し、そしてポリ−L−リシンをコートした小さいペトリ皿にまいた。実験は細胞をまいてから1〜2日後に行った。
【実施例2】
【0060】
HERGカリウムチャンネルで安定にトランスフェクトされたHEK293細胞の膜調製物
HERGチャンネルcDNAで安定にトランスフェクトされたHEK293細胞は、10%ウシ胎児血清および抗生物質を濃縮したDMEM培養基で成長させた。集めた細胞はTris−HCl 50mM pH7.4中でUltraturraxホモジナイザーを使用して均一化し、そしてホモジネートを10分間、23,500×gでSorvall遠心機中で遠心した。細胞膜は、再−均一化および再遠心により1回洗浄した。膜をTris−HCl 50mM pH7.4に懸濁し、アリコートに分け、そして−80℃で保存した。
【実施例3】
【0061】
アステミゾールの放射能標識
【0062】
【化2】
【0063】
4.6gのアステミゾール(I)(10ミリモル)の溶液(80mlの48%の臭化水素酸水溶液中)を撹拌し、そして2時間還流した。反応混合物を室温に冷却し、そして形成した沈殿を濾過し、そして水で洗浄した。固体をN,N−ジメチルホルムアミド(20ml)および水(20ml)の混合物に溶解し、そして混合物は濃水酸化アンモニウム水溶液をゆっくりと撹拌しながら加えることによりアルカリ性とした。次に水(100ml)を加え、そして混合物を1時間撹拌した。沈殿を濾過し、そして18時間風乾して、デスメチルアステミゾール(II)を得た。
【0064】
この量から画分を取り、そしてHypersylODS(5μm)結合相のステンレス鋼カラム(7.1mmID×300mm)での調製用HPLCを介して数部に分けて徹底的に精製してアステミゾールを含まないデスメチルアステミゾールを得た。検出は282nmで行い、そして溶出は4.0ml/分の流速でアセトニトリル−水−ジイソプロピルアミン(56:44:0.2、容量/容量)を用いてイソクラティックに行った。
【0065】
【化3】
【0066】
HPLC精製デスメチルアステミゾール(II)(26.7mg、60マイクロモル)の画分をN,N−ジメチルホルムアミド(1.0ml)に溶解した。この溶液に1N水酸化ナトリウム水溶液(60μl、60マイクロモル)を加えた。混合物を室温で25分間撹拌し、そしてトルエン中で前冷却した(−78℃)[33H]−メチルヨージド(370MBq)溶液に滴下した。反応混合物をボルテックスで混合し、そして次に冷却せずに3時間静置した。トルエンを40℃の水浴上で吸引圧にて反応混合物から蒸発させ、そして残渣は上記のように数部に分けて調製用HPLCを介して精製した。画分を含む生成物を合わせ、そして70mlにメタノールでデプレート(deplete)させて、198MBqの全放射活性および3.14TBq/ミリモル(85Ci/ミリモル)の比活性を有する[3H]−アステミゾール(III)を得た。
【実施例4】
【0067】
放射能リカンド結合アッセイ
膜は解凍し、そしてインキューベーションバッファー(Hepes 10nM pH7.4、40mM KCl、20mM KH2PO4、5mM MgCl2、0.5mM KHCO3、10mM グルコース、50mM グルタメート、20mM アスパルテート、14mM ヘプタン酸、1mM EGTA、0.1% BSA)で再度、均一化し、そして20〜100μgタンパク質を[3H]−アステミゾールと25℃で60分間、競合剤の存在下または不存在下でインキューベーションし、続いてFiltermate196回収器(パッカード、メリデン、コネチカット州)を使用してGF/Bフィルター上で迅速に濾過した。フィルターを氷冷したリンスバッファー(Tris−HCl 25mM pH7.4、130mM NaCl、5.5mM KCl、5mM グルコース、0.8mM MgCl2、50μM CaCl2、0.1% BSA)で徹底的にすすいだ。フィルターに結合した放射活性はTopcount(パッカード、メリデン、コネチカット州)でシンチレーションカウンティングにより測定し、そして結果を1分あたりのカウント(cpm)として表した。
【0068】
最初に非特異的結合を測定するためのバッファー、放射能リガンドおよび化合物を含む種々のパラメーターを、至適条件を選択するために調査した。飽和結合実験では、[3H]−アステミゾールの濃度を上げながら膜とインキューベーションし、バッファー中に再懸濁した。非特異的結合は、10μM 66204の存在下で測定した(図1)。
【0069】
インキューベーションバッファー中に存在するBSAおよび/またはシクロデキストリン、および実験前に化合物を添加する様々な方法の効果は、22種の参照化合物の結合親和性を電気生理学的データと比較することにより調査した。化合物をDMSOに溶解し、そしてMultiprobeIIピペッティングステーション(パッカード、メリデン、コネチカット州)を使用して同じ溶媒でさらに希釈した。すべての実験で最終的なDMSO濃度は1%であった。この分析から化合物はDMSOストック溶液から直接加えることができると思われる。BSAおよび/またはシクロデキストリンの添加により化合物の溶解性を上げる試みは、相関を有意に向上させなかった。
【実施例5】
【0070】
全−細胞電圧クランプ技法(パッチクランプ)
溶液:浴溶液は(mMで)150NaCl、4KCl、5グルコース、10HEPES、1.8CaCl2および1MgCl2(NaOHでpH7.4にした)を含んだ。ピペット溶液は(mMで)120KCl、5EGTA、10HEPES、4MgATP、0.5CaCl2および2MgCl2(KOHでpH7.4にした)を含んだ。化合物はDMSOに溶解して10−2Mまたは10−1Mのストック溶液を得た。対照(=浴溶液+DMSO)および試験溶液(=浴溶液+DMSO+試験する化合物)は、0.3%、0.1%または0.03%DMSOを含んだ。試験および対照溶液はY−管系を使用して実験中の細胞に適用し、実験中の細胞に接近して溶液を迅速に交換した(0.5秒未満)。
電気生理学的測定:HERGを発現する付着したHEK293細胞を含むペトリ皿を、パッチクランプタワー(Patch Clamp Tower)の台に固定した。倒立顕微鏡を使用して細胞を観察した。ペトリ皿は室温で浴溶液を一定に潅流した。
【0071】
パッチピペットはさらに火で仕上げることなく水平フラミング/ブラウン(Flaming/Brown)マイクロピペットプラーを使用してホウ珪酸ガラスキャピラリーから引いた。使用した微小電極はピペット溶液を充填した時、1.5から3MΩの間の入力抵抗を有した。
【0072】
細胞の膜電流はEPC−9パッチクランプ増幅器によりパッチクランプ技術を用いて明確な膜電位で測定した。データを得、そしてPuls and Pulsefit(HEKA)、DataAcess(Bruxton)およびIgor(Wavemetrics)プログラムを使用して分析した。電流シグナルはロー−パスフィルターにかけ、そして続いてデジタル化した。液間電位差は密閉を確立する前に電気的に正した。膜を破壊した後、細胞の電気容量および一連の抵抗はEPC−9パッチクランプ増幅器の回路を使用して補正した。
【0073】
保持電位は−80mVであった。HERG電流(K+−選択的な外側電流)は、+60mVに対して2秒間、脱分極した後、−40mVで最大の末尾電流(tail current)として測定した。パルスサイクリングレイト(pulse cycling rate)は15秒であった。各試験パルスの前に、短いパルス(0.5秒)を保持電位から−60mVに与えて漏電を測定した。全−細胞の立体配置を確立した後、5分間の平衡期間によりピペット溶液で細胞の内部潅流を可能とした。その後、試験パルスを5分間与えて制御された条件下でのHERG電流を定量した。パルスプロトコールを続行している間、潅流を対照溶液から薬剤含有溶液に切り替えた。薬剤の効果は薬剤の添加から5分後に測定した。細胞あたり1〜3種の薬剤濃度を試験した(累積的に適用した)。
測定のパラメーター分析:HERG電流は−80mVの保持電流から始めて+60mVに対して2秒間、脱分極した後、−40mVで最大の末尾電流として測定した。
【0074】
対照溶液の存在下で測定した最初の5分間に、HERG−媒介膜K+電流の振幅は時間とともに次第に低下した(ラン−ダウン)。化合物による遮断の程度を正確に定量するために、この連続的なK+電流のラン−ダウンを考慮しなければならない。したがってK+電流のタイムコース(−40mVで測定)を対照溶液中で最初の5分間に対して指数的に合わせ、そして残りの実験については外挿した。これらの外挿は、薬剤が与えられなかった場合に予想される電流の振幅を与える。化合物による遮断の程度を決定するために、測定された電流の比率は、各々の測定された電流の振幅を同時点で合った電流の値で割ることにより算出した。
【実施例6】
【0075】
結合アッセイの薬物動態学的評価
結合アッセイの薬物動態学的評価のために、322種の化合物をそれらが[3H]−アステミゾールのHERGチャンネルへの結合を阻害する能力について8種の濃度で試験し、そしてpIC50−値を非−線型回帰分析により算出した。pIC50値が利用できる場合、結合およびパッチクランプに関して効力の順位(スペルマン(Spearman))を比較した。
【0076】
パッチクランプアッセイで化合物が4つの濃度未満でのみ試験された場合、スコアは以下の基準に従い結合−およびパッチクランプデータの両方に割り当てた:
スコア1:10−6M以上でpIC50<6または遮断%<50%
スコア2:10−6から10−8Mの間で6から8の間のpIC50または遮断%<50%
スコア3:10−8以下でpIC50>8または遮断%>50%
42種の参照化合物がHERGチャンネルから[3H]−アステミゾール結合を置換する効力の順位は、遅延整流性K+電流の急激な活性化の機能的遮断について、電気生理学的データとよく相関する(rsp=0.87)(図2)。
【0077】
試験した化合物の94%について、結合データはパッチクランプデータと相関する。2%の場合で、結合アッセイスコアがパッチクランプアッセイよりも高く、そして残る4%については反対であり、すなわちパッチクランプアッセイのスコアが結合アッセイよりも高い。
【0078】
結合データと電気生理学的データとの間のこの良好な相関から見て、放射能標識リガンド結合アッセイは潜在的な心血管副作用を予測するために最初のスクリーニングツールとして使用できると結論することができる。
【図面の簡単な説明】
【0079】
【図1A−B】図1AはHERGチャンネルcDNAで安定にトランスフェクトしたHEK293細胞の細胞膜調製物に対する[3H]−アステミゾールの飽和結合を示す。TBは測定された全結合を表し、NSBは測定された非特異的結合を表し、そしてSBは測定された特異的結合を表す。 図1Bは飽和結合実験に関するスキャッチャード(Scatchard)分析を示す。適合した線から、3.07±2.26nM(n=11)のKDを、3260±900fmol/mgタンパク質のBmax(最大結合)を用いて決定できた(n=11)。
【図2】電気生理学的パッチクランプデータと比べた42種の参照化合物の結合親和性を示す。 0.87のスピアルマン(Spearman)順位相関係数を得ることができた。
Claims (36)
- 試験化合物をスクリーニングするためのアッセイであって:
a)HERGまたはその断片を含む供給源を;
i)参照化合物、
ii)試験化合物、
とインキューベーションし;そして
b)HERGに結合した参照化合物の量に及ぼす試験化合物の効果を測定する、
ことを含んでなる上記アッセイ。 - 個体に心臓毒性を誘導する能力について試験化合物をスクリーニングするためのアッセイであって:
a)HERGまたはその断片を含む供給源を;
i)参照化合物、
ii)試験化合物、
とインキューベーションし;そして
b)HERGに結合した参照化合物の量に及ぼす試験化合物の効果を測定する、
ことを含んでなる上記アッセイ。 - 個体に心不整脈を誘導する能力について試験化合物をスクリーニングするためのアッセイであって:
a)HERGまたはその断片を含む供給源を;
i)参照化合物、
ii)試験化合物、
とインキューベーションし;そして
b)HERGに結合した参照化合物の量に及ぼす試験化合物の効果を測定する、
ことを含んでなる上記アッセイ。 - HERGを含む供給源が:
i)配列番号2の配列に少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を有するHERGまたはその断片をコードする単離され、そして精製されたタンパク質;
ii)配列番号2のアミノ酸配列を含んでなるHERGまたはその断片をコードする単離され、そして精製されたタンパク質;
iii)表面にHERGポリペプチドチャンネルまたはその断片を発現する細胞;または
iv)表面にHERGポリペプチドチャンネルまたはその断片を発現する細胞の膜調製物、
からなる群から選択される請求項1ないし3のいずれか1項に記載のアッセイ。 - HERGを含む供給源が、表面に配列番号2からなるHERGポリペプチドチャンネルを発現する細胞の膜調製物である、請求項1ないし3のいずれか1項に記載のアッセイ。
- 参照化合物が個体に心臓毒性を誘導することができる、請求項1ないし3のいずれか1項に記載のアッセイ。
- 参照化合物がアステミゾール、テルフェナジン、エリスロマイシン、スパルフロキサイン、プロブコール、テロジリンおよびセルチンドールからなる群から選択される、請求項1ないし3のいずれか1項に記載のアッセイ。
- 参照化合物がアステミゾールである請求項1ないし3のいずれか1項に記載のアッセイ。
- 参照化合物が標識されている請求項1ないし3のいずれか1項に記載のアッセイ。
- 参照化合物が放射能標識されている請求項9に記載のアッセイ。
- 参照化合物が[H3]−アステミゾールである請求項10に記載のアッセイ。
- 試験化合物をスクリーニングするための高処理量アッセイであって;
a)表面に配列番号2の配列に少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を有するHERGポリペプチドチャンネルまたはその断片を発現する細胞の膜調製物を、標識した参照化合物と、参照化合物のHERGポリペプチドチャンネルへの結合を可能とする十分な時間接触させ;
b)表面に配列番号2の配列に少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を有するHERGポリペプチドチャンネルまたはその断片を発現する細胞の膜調製物を、試験化合物と一緒に工程a)の標識した参照化合物と、参照化合物および試験化合物のHERGポリペプチドチャンネルへの結合を可能とする十分な時間接触させ;
c)工程a)でHERGチャンネルへ結合した標識した参照化合物の量を測定し;
d)工程b)でHERGチャンネルへ結合した標識した参照化合物の量を測定し;そしてe)工程a)で測定したHERGチャンネルへ結合した標識した参照化合物の量と、工程b)で測定したHERGポリペプチドチャンネルへ結合した標識した参照化合物の量とを比較する、
ことを含んでなる上記アッセイ。 - 試験化合物をスクリーニングするための高処理量近接検出アッセイであって;
i)近接検出アッセイに参加することができる第1の標識で標識したHERG;
ii)近接検出アッセイに参加することができる第2の標識で標識した参照化合物:
iii)工程i)のHERGおよび工程ii)の参照化合物を試験化合物と一緒に、参照化合物および試験化合物のHERGへの結合を可能とする十分な時間接触させ;そして
iv)工程i)のHERGと工程ii)の参照化合物との間の相互作用を、HERGおよび参照化合物が相互作用した時に第1の標識と第2の標識の近接により検出する、
ことを含んでなる上記アッセイ。 - a)HERGを含む供給源;
b)参照化合物、
を含んでなるキット。 - HERGを含む供給源が;
i)配列番号2の配列に少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を有するHERGまたはその断片をコードする単離され、そして精製されたタンパク質;
ii)配列番号2のアミノ酸配列を含んでなるHERGまたはその断片をコードする単離され、そして精製されたタンパク質;
iii)表面にHERGポリペプチドチャンネルまたはその断片を発現する細胞;またはiv)表面にHERGポリペプチドチャンネルまたはその断片を発現する細胞の膜調製物、
から選択される請求項16に記載のキット。 - HERGを含む供給源が、固体支持体に結合した単離され、そして精製されたHERGポリペプチドチャンネルまたはその断片である、請求項16に記載のキット。
- 固体支持体が固体支持体を含んでなる蛍光剤である請求項18に記載のキット。
- HERGを含む供給源が、配列番号2からなるアミノ酸配列によりコードされるHERGポリペプチドチャンネルを表面に発現する細胞の膜調製物からなる、請求項16に記載のキット。
- 上記細胞がHEK293細胞である請求項20に記載のキット。
- 参照化合物がアステミゾール、テルフェナジン、エリスロマイシン、スパルフロキサイン、プロブコール、テロジリンおよびセルチンドールからなる群から選択される、請求項16ないし21のいずれか1項に記載のキット。
- 参照化合物が標識されている請求項16ないし21のいずれか1項に記載のキット。
- 参照化合物が放射能標識されている請求項23に記載のキット。
- 参照化合物が[H3]−アステミゾールである請求項24に記載のキット。
- 過剰な未結合標識参照化合物をインキューベーション混合物から除去する手段を場合により含んでなる、請求項23に記載のキット。
- 分離手段がGF/B濾過からなる請求項23に記載のキット。
- 請求項1ないし3のいずれか1項に記載のアッセイにおいて、配列番号2のアミノ酸配列を含んでなるHERGまたはその断片をコードする単離され、そして精製されたタンパク質の使用。
- 請求項1ないし3のいずれか1項に記載のアッセイにおいて、配列番号1の核酸配列を含んでなるHERGまたはその断片をコードする単離され、そして精製されたポリヌクレオチドの使用。
- 請求項1ないし3のいずれか1項に記載のアッセイにおいて、配列番号2のアミノ酸配列を含んでなるHERGポリペプチドチャンネルまたはその断片を表面に発現する細胞の使用。
- 請求項1ないし3のいずれか1項に記載のアッセイにおいて、配列番号2のアミノ酸配列を含んでなるHERGポリペプチドチャンネルまたはその断片を表面に発現する細胞の膜調製物の使用。
- 請求項1ないし3のいずれか1項に記載のアッセイにおいて、配列番号2からなるアミノ酸配列によりコードされるHERGポリペプチドチャンネルを表面に発現する細胞の膜調製物の使用。
- 請求項1ないし3のいずれか1項に記載のアッセイにおけるアステミゾールの使用。
- 請求項1ないし3のいずれか1項に記載のアッセイにおける標識されたアステミゾールの使用。
- 請求項1ないし3のいずれか1項に記載のアッセイにおける放射能標識されたアステミゾールの使用。
- 請求項1ないし3のいずれか1項に記載のアッセイにおける[H3]−アステミゾールの使用。
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