JP2005500512A - アルファ−ヒドロキシ酸またはベータ−ジケトンも含有している溶液中のグルコースの検出 - Google Patents
アルファ−ヒドロキシ酸またはベータ−ジケトンも含有している溶液中のグルコースの検出 Download PDFInfo
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Abstract
アルファ−ヒドロキシ酸またはベータ−ジケトンも含んでいることができる試料中のグルコースの存在または濃度を決定するための組成物および方法。この方法は、少なくとも２つのグルコース認識要素を有する化合物であって、そのグルコース認識要素が、上記の化合物とグルコースとの相互作用がその化合物とアルファ−ヒドロキシ酸またはベータ−ジケトンとの相互作用よりも安定になるように配向されているそのような化合物を、アルファ−ヒドロキシ酸またはベータ−ジケトンの存在が該決定を実質的に妨害しないように使用するものである。
Description
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００１年１月５日に出願された米国特許出願第０９／７５４，２１７号の一部継続出願であり、かつ２００１年１０月１８日に出願された米国特許出願第６０／３２９，７４６号および２００１年２月２１日に出願された米国特許出願第６０／２６９，８８７号の利益を主張するものである。
【０００２】
連邦承認の研究または開発に関する陳述
該当しない。
発明の背景
１．発明の分野
本発明は、α−ヒドロキシ酸またはβ−ジケトンのような潜在妨害性の化合物も含んでいることがある試料中のグルコースの検出に関する。
２．関連技術の説明
グルコースを含めて炭水化物のフェニルボロン酸による錯化はずっと以前から知られており、その相互作用の可逆性は糖類のクロマトグラフ分離の基礎として役立ってきた。具体的にいうと、１９５９年にLorandおよびEdwardsはフェニルボロン酸と多数の飽和ポリオールとの水系会合の会合定数を報告した；結合相互作用は非常に弱（例えば、エチレングリコールのＫd＝３６０ｍＭ）から適度に強（例えば、グルコースのＫd＝９．１ｍＭ）までの範囲に及んだ。J. Yoon等のBioorganic and Medicinal Chemistry、１（４）：２６７−７１（１９９３）を参照されたい。結合機構は、ボロネート部分（boronate moiety）上のヒドロキシル基に対するグルコース上の隣接ヒドロキシル基の結合によって起こると考えられる。
【０００３】
米国特許第５，５０３，７７０号明細書（James等）は、グルコースを含めて糖類に結合すると高強度の蛍光を発する蛍光性ボロン酸含有化合物について記載している。この蛍光性化合物は、発蛍光団(fluorophore)を含む分子構造、少なくとも１つのフェニルボロン酸部分、および窒素原子がフェニルボロン酸と分子内相互作用するように上記フェニルボロン酸部分の付近に配置されている少なくとも１個のアミン提供窒素原子を有する。このような相互作用は、それによってその化合物をして糖結合形成時に蛍光を発せしめる。T. James等のJ. Am. Chem. Soc.、１１７（３５）：８９８２−８７（１９９５）も参照されたい。
【０００４】
さらに、血中グルコースを検出するためにアントリルボロン酸含有化合物を使用する蛍光センサーがこの技術分野で知られている。例えば、J. Yoon等のJ. Am. Chem. Soc.、１１４：５８７４−５８７５（１９９２）は、アントリルボロン酸がグルコースおよびフルクトースの結合を含めて炭水化物結合の形成信号を発するための蛍光化学的センサーとして使用できることを述べている。
【０００５】
残念ながら、グルコースと上記の様式で相互作用する化合物にはヒドロキシル基を有する他の化合物と相互作用する傾向があり、かくして、特に妨害量のラクテート、アセトアセテート等を含んでいることがある生理的試料を検定するときにグルコース検定の特異性を低下させる。例えば、糖尿病患者の中には、血中ラクテートレベルが５ミリモル／リットル超である乳酸アシドーシスになるものもいる。従って、ラクテートのような潜在妨害性のヒドロキシル化合物に対して比較的に不感受性であるグルコース検定の大きな必要が残されている。
【０００６】
発明の簡潔な要約
１つの面において、本発明は、アルファ−ヒドロキシ酸またはベータ−ジケトンも含んでいることがある試料中のグルコースの存在または濃度を検出する方法であって：
ａ）少なくとも２つのグルコース認識要素を有する化合物に試料を曝露する工程にして、そのグルコース認識要素が、上記化合物とグルコースとの相互作用がその化合物とα−ヒドロキシ酸またはβ−ジケトンとの相互作用よりも安定になるように配向されており、ここで該化合物は、この化合物が該試料中のグルコースに曝露されると濃度依存性様式で変化する検出可能な特質を有する検出可能部分も含んでいるそのような工程；および
ｂ）該検出可能特質のいかなる変化も測定し、それによって該試料中のグルコースの存在または濃度を決定する工程にして、この場合α−ヒドロキシ酸またはβ−ジケトンの存在は該決定を実質的に妨害しないそのような工程
を含む上記の方法に関する。
【０００７】
もう１つの面において、本発明は、次の構造：
【０００８】
【化１】
【０００９】
を有する化合物であるが、但しこのインジケーター化合物はそれに関連付けられる少なくとも１個の検出可能部分を、直接的にか、または固体支持体または高分子マトリックスの一部としてのいずれかで含んでいるそのような化合物に関する：但し、上記の式において：
―Ｒ1およびＲ2は同一または異なるものであって、次の：ｉ）水素、ｉｉ）Ｒ8部分のpKaおよび加水分解安定性を変える置換基、ｉｉｉ）検出可能部分、またはｉｖ）場合によって検出可能部分を含んでいる固体支持体または高分子マトリックスに結合することが可能な結合基から選ばれ；
―Ｒ3は水素、または場合によって検出可能部分を含んでいる固体支持体または高分子マトリックスに結合することが可能な結合基であり；
―Ｒ4およびＲ5は同一または異なるものであって、次の：ｉ）水素、ｉｉ）Ｒ8部分のpKaおよび加水分解安定性を変える置換基、ｉｉｉ）検出可能部分、またはｉｖ）検出可能部分を場合によって含んでいる固体支持体または高分子マトリックスに結合することが可能な結合基から選ばれ；
―各Ｚは独立に炭素または窒素であり；
―Ｒ6およびＲ7は同一または異なるものであって、ｉ）ゼロ〜１０個の隣接するまたは分枝した炭素および／またはヘテロ原子を有する結合基、またはｉｉ）検出可能部分を場合によって含んでいる固体支持体または高分子マトリックスに結合することが可能な結合基であり；
―Ｒは、次の：ｉ）炭素、酸素、窒素、硫黄およびリンより成る群から選ばれる１〜１０個の隣接する原子を含んでいる脂肪族および／または芳香族スペーサー、ｉｉ）検出可能部分、またはｉｉｉ）検出可能部分を場合によって含んでいる固体支持体または高分子マトリックスに結合することが可能な結合基から選ばれ；
―各Ｒ8は同一または異なるものであって、保護されていないときにグルコース中に存在するビシナルジオール基と相互作用することが可能である、場合によって保護されている部分であり；そして
―Ｒ9およびＲ10は同一または異なるものであって、ｉ）水素、ｉｉ）検出可能部分、ｉｉｉ）ａ）検出可能部分を場合によって含んでいる固体支持体または高分子マトリックスに結合することが可能な結合基であるか、および／またはｂ）前記化合物の物理的性質を変えることができる官能基を含む基である。
【００１０】
もう１つの面において、本発明は上記化合物を含む検出系に関する。
発明の詳細な記述
１つの面において、本発明はα−ヒドロキシ酸またはβ−ジケトンのような妨害性化合物も含んでいることがある試料中のグルコースの存在または濃度を検出する方法を提供する。このような潜在妨害性の化合物に、ラクテート、アセトアセテート、β−ヒドロキシ酪酸等々がある。
【００１１】
本発明は、試料中のグルコースを認識することはできるが、その試料中の妨害性化合物を認識する可能性は少ないインジケーター化合物を用いて行われる。インジケーター化合物は、そのインジケーター化合物とグルコースとの相互作用がそのインジケーター化合物と妨害性化合物との相互作用よりも安定になるように配向されている少なくとも２つのグルコース認識要素を有する。
【００１２】
適した認識要素は、グルコースと、特にグルコース中に存在するジオール基と好ましくは可逆的な相互作用をすることが可能な部分を含む。幾つかのこのような認識要素は公知であり、それには、好ましくは、ボロン酸、ボロン酸イオン、亜ヒ酸、亜ヒ酸イオン、テルル酸、テルル酸イオン、ゲルマニウム酸、ゲルマニウム酸イオン等々がある。ホウ素を含んでいる認識要素が最も好ましい。認識要素は、使用するまで、保護基でキャップしておくことができることは分かるだろう。このような基は周知であって、ネオペンチルグリコール、ピナコール等々がある。ある特定の態様において、キャップ付き認識要素は、その化合物が使用されるべき媒体中でそのキャップが外される（例えば、実施例５を参照されたい）。
【００１３】
認識要素は、それら認識要素の少なくとも２種をグルコース分子と相互作用させるように、互いに適切な距離があけられていることが好ましく、その結果として増加した特異性がもたらされる。一般に、認識要素はこれらの要素間に原子約３０個までのスペーサーを有することができる。認識要素はそれらがグルコースと相互作用するときに約６Å離れていることができるように配向配置されているのが好ましい。
【００１４】
本発明のインジケーター化合物は、この化合物がグルコースを含んでいる試料に曝露されるときに濃度依存性様式で変化する検出可能な特質を有する。多くのこのような特質は知られており、本発明においても利用することができる。例えば、インジケーター化合物は発光性（蛍光性若しくは燐光性）または化学発光性部分、吸光系部分等々を含んでいることができる。インジケーター化合物はエネルギー供与体部分およびエネルギー受容体部分を含んでいることができ、その各々はインジケーター化合物がグルコースと相互作用するときに検出可能な変化が現れるように互いに一定間隔をおいて配置されている。インジケーター化合物は、グルコースが存在しないときに発蛍光団が消光体によって消光されるように配列されているそのような発蛍光団および消光体を含んでいることができる。そのような状況において、グルコースが存在すると、そのインジケーターは、消光体を、蛍光が発せられるように発蛍光団から十分遠くに移動させる配置変化を受ける。逆に、発蛍光団および消光体を、グルコースの非存在下においてそれらが十分に隔てられ、発蛍光団が蛍光を発するように配置することができる；グルコースと相互作用すると発蛍光団と消光体は消光を引き起こすに足るほど近くに移動せしめられる。この配置変化の着想は、ここで参照することにより本明細書に含められる、「検体の検出（Detection of Analytes）」と題される、２００１年１月５日に出願された、本出願人による出願中の米国特許出願第０９／７５４，２１９号明細書中でさらに詳しく説明されている。
【００１５】
あるいはまた、インジケーターは認識要素と相互作用することができる発蛍光団のような部分、またはグルコースの非存在下で発蛍光団が蛍光を発するように認識要素に対して空間的に配置されているもう１つの部分を含むことができる。グルコースを添加すると直ぐに、グルコースは、発蛍光団と認識要素との相互作用、または発蛍光団と認識要素に対して空間的に配置されている他の部分との相互作用と競争し、蛍光の低下を引き起こす。その着想の１例が実施例６で説明されている。インジケーターは、発蛍光団が認識要素またはグルコースの非存在下において認識要素に対して空間的に配置されているもう１つの部分と相互作用するときに発蛍光団が蛍光を発しないか、または比較的低レベルの蛍光を発するように選ぶことができることも認められるだろう。グルコースを添加すると直ぐに、グルコースは、発蛍光団と認識要素との相互作用、または発蛍光団と認識要素に対して空間的に配置されている他の部分との相互作用と競争し、蛍光の増加を引き起こす。
【００１６】
他の検出可能な部分として、光誘発電子移動または誘導効果によるグルコースの相互作用で蛍光が影響を受けるものが挙げられる。これらには、ここで参照することにより本明細書に含められる、１９９９年３月１１日に出願された（そして１９９９年９月１６日にPCT国際出願ＷＯ第９９／４６６００号として公開された）出願中の米国特許出願第０９／２６５，９７９号明細書に開示されているランタニドキレート；ポリ芳香族炭化水素およびそれらの誘導体；クマリン類；BoDiPy；ダンシル；カテコール類等々がある。検出可能部分のもう１つの種類を挙げると、アリザリンレッド等々を含めてインジケーター化合物がグルコースと相互作用すると直ちに吸光スペクトルが変化するものがある。検出可能部分のもう１つの種類として、近接効果、例えばダンシル／ダブシル（dabsyl）等々のようなエネルギー供与体／受容体ペアによって蛍光が変調されるものが挙げられる。
【００１７】
検出可能な特質は、好ましくは、吸収特性（例えば、吸収能および／またはスペクトルシフト）、蛍光減衰時間（時間領域（time domain）または周波数領域の測定により決定）、蛍光強度、蛍光の異方性または偏光における変化のような検出可能なスペクトル変化；発光スペクトルのスペクトルシフト；時間分解異方性減衰（時間領域または周波数領域の測定により決定）の変化等々である。
【００１８】
本発明のインジケーター化合物は、それらが可溶性である場合は、望むならば溶解状態で直接使用することができる。他方、所望とされる用途が求めるならば、インジケーター化合物は、ガラス、プラスチック、高分子材料等々のような不溶性の表面またはマトリックス上またはその内部に（機械的閉じ込めまたは共有若しくはイオン結合のような手段によって）固定化することもできる。インジケーター化合物が、例えば他の重合体内に閉じ込められるとき、その閉じ込め材料は、好ましくは、グルコースとインジケーター化合物との間に適切な相互作用を可能にするために、グルコースが十分に透過できるものであるべきである。
【００１９】
インジケーター化合物が水に貧溶解性または不溶性であり、しかもなお水性媒体中での検出が望まれるならば、そのインジケーター化合物を、ここで参照することにより内容が本明細書に含まれる、２０００年８月４日に出願された、出願中の米国特許出願第０９／６３２，６２４号明細書に記載される親水性高分子を形成させるために、親水性単量体と共重合させてもよい。
【００２０】
好ましいインジケーター化合物は、次の構造：
【００２１】
【化２】
【００２２】
を有する；但しこのインジケーター化合物はそれに関連付けられる少なくとも１個の検出可能部分を、直接的にか、または固体支持体若しくは高分子マトリックスの一部としてのいずれかで含んでいる：但し、上記の式において：
―Ｒ1およびＲ2は同一または異なるものであって、次の：ｉ）水素、ｉｉ）Ｒ8部分のpKaおよび加水分解安定性を変える置換基、ｉｉｉ）検出可能部分、またはｉｖ）検出可能部分を場合によって含んでいる固体支持体または高分子マトリックスに結合することが可能な結合基から選ばれ；
―Ｒ3は水素、または検出可能部分を場合によって含んでいる固体支持体または高分子マトリックスに結合することが可能な結合基であり；
―Ｒ4およびＲ5は同一または異なるものであって、次の：ｉ）水素、ｉｉ）Ｒ8部分のpKaおよび加水分解安定性を変える置換基、ｉｉｉ）検出可能部分、またはｉｖ）検出可能部分を場合によって含んでいる固体支持体または高分子マトリックスに結合することが可能な結合基から選ばれ；
―各Ｚは独立に炭素または窒素であり；
―Ｒ6およびＲ7は同一または異なるものであって、ｉ）ゼロ〜１０個の隣接するまたは分枝した炭素および／またはヘテロ原子を有する結合基、またはｉｉ）検出可能部分を場合によって含んでいる固体支持体または高分子マトリックスに結合することが可能な結合基であり；
―Ｒは、次の：ｉ）炭素、酸素、窒素、硫黄およびリンより成る群から選ばれる１〜１０個の隣接する原子を含んでいる脂肪族および／または芳香族スペーサー、ｉｉ）検出可能部分、またはｉｉｉ）検出可能部分を場合によって含んでいる固体支持体または高分子マトリックスに結合することが可能な結合基から選ばれ；
―各Ｒ8は同一または異なるものであって、保護されていないときにグルコース中に存在するビシナルジオール基と相互作用することが可能である、場合によって保護されている部分であり；そして
―Ｒ9およびＲ10は同一または異なるものであって、ｉ）水素、ｉｉ）検出可能部分、ｉｉｉ）ａ）検出可能部分を場合によって含んでいる固体支持体または高分子マトリックスに結合することが可能な結合基であるか、および／またはｂ）前記化合物の物理的性質を変えることができる官能基を含む基である。
【００２３】
Ｒ8部分のpKaおよび加水分解安定性を変える適切な基は当業者には直ちに明らかになると思われるが、これにはハロゲン；ニトロ；アミノ；ハロゲン置換アルキル；場合によって置換されているカルボニル；アシル；ケト；ニトリル；アミド；エステル；アルコキシ等々のような基がある。
【００２４】
どのような置換基にも適した結合基としては、さらに反応することができるか、または重合体若しくは支持体に結合することが可能な官能基の中で終わっている１個または２個以上のヘテロ原子を含むことができる、分枝していてもよいし、あるいは置換されていてもよい約１〜約２０個の隣接原子を含む基を挙げることができる。適した結合基の例に、次の全てが場合によって置換されているアルキル、アリール、アシル、ポリアミド、ポリエーテルおよびそれらの組み合わせがある。
【００２５】
Ｒ9およびＲ10として、さらに、溶解性、pKa等々のような化合物の物理的性質を変えることができる官能基を挙げることができる。例えば、これら官能基に、場合によって置換されているカルボキシレート、アミノ基、四級アンモニウム基、スルホネート、PEG等々がある。
【００２６】
置換基のどれかが検出可能部分であるとき、それは検出可能部分をインジケーター化合物の残部に結合させる適切な結合基を含んでいることもできることは理解されるだろう。適した結合基に上記で挙げたものがある。適した検出可能部分には前記で定義されたものがある。
【００２７】
Ｒ8は、好ましくは、ボロン酸、ボロン酸イオン、亜ヒ酸、亜ヒ酸イオン、テルル酸、テルル酸イオン、ゲルマニウム酸、ゲルマニウム酸イオンおよびそれらの組み合わせより成る群から選ばれる。
【００２８】
また、前記の定義から、本発明の化合物および検出システムは高分子の形態をしていることができることも理解されるだろう。かくして、（認識要素および検出可能部分を含んでいる）ある１つの一体化合物（integral compound）は、これを現存重合体に結合させることもできるし、あるいは単量体の形をしたそのような一体化合物を重合させるか、または他の適切な単量体と共重合させて重合体を形成することもできる。あるいはまた、２つの別々の単量体成分（例えば、認識要素を含んでいるもの、および検出可能部分を含んでいるもの）を、結果として得られる重合体がシステムの必要な全ての要素を含むように共重合させることができる（実施例６を参照されたい）。
【００２９】
本発明のインジケーター化合物には、エネルギー、医学および農業の分野におけるインジケーターとしての用途を含めて多数の用途が存在する。例えば、本発明のインジケーター化合物は、血液、血漿、血清、間質液、髄液、尿、唾液、眼内液、リンパ液、涙液または汗のような生理的緩衝液または同液体中のより低いレベルまたはより高いレベルのグルコースを検出するために用いることができ、かくして糖尿病および副腎機能不全症のような病気を診断またはモニターするのに価値のある情報を提供する。
【００３０】
ヒト治療用のグルコースの医学的／製薬学的製造にはモニターと制御が必要である。
農業における本発明の用途に、大豆、その他の農産物中のグルコースレベルを検出する用途がある。グルコースは、ワイン用ブドウのような価値の高い産物に決定的に重要な収穫期決定の際に注意深くモニターされなければならない。グルコースは発酵プロセスにおいて最も高価な炭素源および装入原料であるので、動力用アルコールの製造では最適の反応器供給速度制御のためにグルコースをモニターすることが重要である。国際的に最大量のグルコースおよび発酵性（ビシナルジオール）の糖を消費するソフトドリンクおよび発酵飲料の製造中における品質管理には、グルコース濃度の反応器混合および制御が決定的に重要である。
【００３１】
インジケーター化合物が蛍光性インジケーター置換基を含むとき、この技術分野では色々な検出技術も知られている。例えば、本発明の化合物は蛍光検知装置において使用することもできるし（例えば、米国特許第５，５１７，３１３号明細書）、あるいは目視検査用の試験紙のような高分子材料に結合させることもできる。この後者の技術は、例えば、グルコースの測定を、リトマス紙片を用いてｐＨを測定するのと類似した方法で可能にする。本明細書で説明される化合物は、また、Shimadzu、Hitachi、Jasco、Beckman、その他が製作する分光蛍光計または臨床分析装置のような標準のベンチトップ分析機器で単純試薬として使用することもできる。これらの分子は、また、Ocean Optics（Dunedin、Florida）またはOriel Opticsが製作する光ファイバーに基づくセンサーおよび分析蛍光計用の検体特異性化学的／光学的信号変換手段となる。
【００３２】
ここで参照することにより開示が本明細書に含まれる米国特許第５，５１７，３１３号明細書は、本発明の化合物を用いて液体媒体中のグルコースの存在または濃度を決定することができる蛍光検知装置について記載している。この検知装置は、蛍光インジケーター分子含有マトリックス（以後「蛍光性マトリックス」）の層状アレイ、高域フィルターおよび光検出器を含む。この装置において、光源、好ましくは発光ダイオード（“LED”）は、インジケーター材料内に、またはインジケーターマトリックスが配置されている導波管中に、光源からの入射光がインジケーター分子をして蛍光を発せしめるように少なくとも部分的に配置されている。高域フィルターは発せられた光を光検出器に到達できるようになし、同時に光源からの散乱入射光を濾過して取り除く。米国特許第５，５１７，３１３号明細書に記載される装置で用いられるインジケーター分子の蛍光は、グルコースの局部的存在によって変調、例えば減衰または増強せしめられる。
【００３３】
米国特許第５，５１７，３１３号明細書に記載されるセンサーにおいて、インジケーター分子を含んでいる材料は検体透過性である。従って、検体は周囲の試験媒体からその材料の中に拡散することができ、それによってインジケーター化合物によって発せられる蛍光に影響が及ぼされる。光源、インジケーター化合物含有材料、高域フィルターおよび光検出器は、インジケーター化合物によって発せられる蛍光の少なくとも一部分が光検出器に突き当たり、周囲の媒体中におけるグルコースの濃度を示す電気信号を発生させるように配置されている。
【００３４】
本発明のインジケーター化合物を使用するための他の可能な態様に従い、検知装置もここで参照することにより全てが本明細書に含まれる米国特許第５，９１０，６６１号、同第５，９１７，６０５号および同第５，８９４，３５１号明細書に記載されている。
【００３５】
本発明の化合物は、また、例えば生体内で血中グルコースレベルを連続的にモニターする移植可能装置で用いることもできる。適した装置は、例えば、ここで参照することにより全てが本明細書に含まれる１９９９年８月２６日に出願された出願中の米国特許出願第０９／３８３，１４８号明細書、並びに米国特許第５，８３３，６０３号、同第６，００２，９５４号および同第６，０１１，９８４号明細書に記載されている。
【００３６】
本発明の化合物は、この技術分野の当業者であれば、過度の実験をすることなく、例えば以下において説明される一般的手法と一致する反応機構を含めて公知の反応機構および試薬を容易に用いて製造することができる。
【００３７】
実施例１
アントラセン誘導体とMAPTACとの水溶性共重合体
Ｉ．水溶性重合体中に共重合されたモノ−ボロネート−アントラセンインジケーターの合成
Ａ．９−［３−（メタクリルアミド）プロピルアミノ］メチルアントラセン
Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド塩酸塩（１１．８２ｇ、６６．０ミリモル、３．０当量）およびDBMP（禁止剤として１０ｍｇ）の２５０ｍＬのCHCl3中における０℃の懸濁液に、DIEA（１８．５ｇ、２５．０ｍＬ、１４４ミリモル、６．５当量）を２０分の期間にわたって滴下した。この混合物を５℃まで加温し、次いで０℃まで再冷却した。この冷却された混合物に、９−クロロメチルアントラセン（５．０ｇ、２２ミリモル）のCHCl3（１００ｍＬ）中溶液を１時間の期間にわたって滴下した。続いて、この混合物を２５℃において１時間、５０℃において１２時間、次いで７０℃において２時間攪拌した。この時点で、この混合物を４ｘ６０ｍＬずつの水で洗浄し、そしてその合わされた水性層をCH2Cl2で抽出した。その合わされた有機抽出物を無水のNa2SO4上で乾燥し、デカントし、そして真空中で濃縮した。その粗製物質をシリカゲルクロマトグラフィー（フラッシュシリカゲル、２−５％CH3OH／CH2Cl2）で精製して２．４４ｇ（３３％）の固体生成物をもたらした。
TLC：Merckシリカゲル６０プレート、Ｒｆ：９０／１０のCH2Cl2／CH3OHで０．３９、ＵＶ（２５４／３６６）、ニンヒドリン染色で確認。
【００３８】
Ｂ．９−［Ｎ−［２−（５，５−ジメチルボリナン−２−イル）ベンジル］−Ｎ−［３−（メタクリルアミド）プロピルアミノ］メチルアントラセン
９−［３−（メタクリルアミド）プロピルアミノ］メチルアントラセン（２．４４ｇ、７．３４ミリモル）およびDBMP（禁止剤として１０ｍｇ）の２００ｍＬのCHCl3中における０℃の溶液に、DIEA（２．８５ｇ、３．８４ｍＬ、２２．０ミリモル、３．０当量）を一部ずつ１０分の期間にわたって加え、続いて（２−ブロモメチルフェニル）ボロン酸ネオペンチルエステル（２．４９ｇ、８．８１ミリモル、１．２当量）を３０分の期間にわたって滴下した。続いてこの混合物を２５℃において２０時間攪拌した。この時点で、この混合物を水で洗浄し、その合わされた水性層をCH2Cl2で抽出した。その合わされた有機抽出物を無水のNa2SO4上で乾燥し、デカントし、そして真空中で濃縮した。その粗製物質をシリカゲルクロマトグラフィー（フラッシュシリカゲル、２−５％のCH3OH／CH2Cl2）で精製して２．５０ｇ（７６％）の淡黄色の結晶性固体をもたらした。
Ｍｐ：７２−７３℃
TLC：Merckシリカゲル６０プレート、Ｒｆ：９０／１０のCH2Cl2／CH3OHで０．３６、ＵＶ（２５４／３６６）、ニンヒドリン染色で確認。
【００３９】
Ｃ．９−［Ｎ−［２−（５，５−ジメチルボリナン−２−イル）ベンジル］−Ｎ−［３−（メタクリルアミド）プロピルアミノ］メチルアントラセンとMAPTACとの水溶性共重合体（１：２０モル比）
９−［Ｎ−［２−（５，５−ジメチルボリナン−２−イル）ベンジル］−Ｎ−［３−（メタクリルアミド）プロピルアミノ］メチルアントラセン（０．０４９０ｇ、０．１０５ミリモル）と［３−（メタクリルアミド）プロピル］トリメチルアンモニウムクロリド（MAPTAC 、５０重量％水溶液、０．４８ｇ、０．９０ｍＬ、２．１ミリモル、２０当量）との１．５ｍＬのエチレングリコール中溶液に、４，４’−アゾビス（シアノ吉草酸（０．００８ｇ、０．０３ミリモル、総単量体の１．４モル％）を加えた。この溶液をアルゴンガスで５分間パージし、次いで暗所で６０℃まで昇温して１８時間加熱した。この時点で、この粘稠な溶液を２５℃まで冷却し、５ｍＬの水で希釈し、そして酢酸セルロース膜（MWCO３５００）を通して３ｘ４Ｌの水に対して透析した。この透析物質を乾燥状態まで濃縮して０．３３９ｇ（６８％）の黄色ガラス状固体をもたらした。
【００４０】
ＩＩ．グルコースおよびラクテートによる蛍光の変調
この実施例で製造された共重合体（単一の認識要素を含む）の蛍光のグルコースおよびラクテートによる変調を測定した。図１は、ａ）０−２０ｍＭのグルコース；ｂ）０−２０ｍＭのラクテートを含んでいるPBS中における上記共重合体（１：２０モル比）の０．５ｍｇ／ｍＬ溶液の正規化された蛍光発光（４２０ｎｍにおけるＩ／Ｉ0）を示す。スペクトルは、Shimadzu RF-5301スペクトル蛍光計を使用し、３６５ｎｍにおいて励起；励起スリット１．５ｎｍ；発光スリット５ｎｍ；周囲温度を用いて記録された。誤差バーは各データ点について二重値（duplicate values）による標準偏差である。この共重合体の蛍光はグルコースおよびラクテートの存在によって影響を受けた。
【００４１】
実施例２
水溶性重合体に共有結合されているビス−ボロネートインジケーターのグルコースおよび潜在的生理的妨害による変調
Ｉ．ビス−ボロネート−アントラセンインジケーターの単一メタクリレート単量体の合成
【００４２】
【化３】
【００４３】
Ａ．９，１０−ビス［［２−（２−ヒドロキシエトキシ）エチルアミノ］メチル］アントラセン
２−（２−アミノエトキシ）エタノール（３１．４ｇ、３０．０ｍＬ、２９９ミリモル、２０．９当量）の４０ｍＬのCHCl3中における２３℃の溶液に、９，１０−ビス（クロロメチル）アントラセン（３．９４ｇ、１４．３ミリモル）を加えた。この溶液を暗所で６７時間攪拌した。この時点で、１００ｍＬのCH2Cl2を加え、そして１ｘ５０ｍＬずつおよび２ｘ１００ｍＬずつのNaHCO3（飽和水溶液）で洗浄した。その有機抽出物を無水のNa2SO4上で乾燥し、濾過し、そして濃縮して４．６７ｇ（７９％）の黄色粉末をもたらした。生成物（RP-HPLCで〜８５％純粋）をそのまま次に続けた。
HPLC条件：HP 1100 HPLCクロマトグラフ、Vydac 201TP・１０ｘ２５０ｍｍカラム、０．１００ｍＬ注入、２ｍＬ／分、３７０ｎｍ検出、Ａ＝水（０．１％HFBA）およびＢ＝MeCN（０．１％HFBA）、勾配：１０％Ｂ・２分、１０−８０％Ｂ・１８分超、８０−１００％Ｂ・２分超、１００％Ｂ・２分、保持時間１５．６分。
【００４４】
【化４】
【００４５】
Ｂ．９，１０−ビス［Ｎ−［２−（５，５−ジメチルボリナン−２−イル）ベンジル］−Ｎ−［２−（２−ヒドロキシエトキシ）エチルアミノ］メチル］アントラセン
９，１０−ビス［［２−（２−ヒドロキシエトキシ）エチルアミノ］メチル］アントラセン（４．０２ｇ、９．７５ミリモル）、DIEA（１２．６ｇ、１７．０ｍＬ、９７．５ミリモル、１０．０当量）および（２−ブロモメチルフェニル）ボロン酸ネオペンチルエステル（１３．７ｇ、４８ミリモル、４．９当量）の１２５ｍＬのCHCl3中における２３℃の溶液を暗所で４６時間攪拌した。この時点で、この反応混合物を初めに回転蒸発により、次いで真空ポンプを用いて濃縮してDIEAを除去した。その残分をアルミナカラムクロマトグラフィー（１５０ｇの活性中性アルミナ、０−３％のCH3OH／CH2Cl2）で精製して、放置すると凝固する５．６７ｇ（７０％）の粘稠な油をもたらした。生成物（RP-HPLCで〜８５％純粋）をそのまま次に続けた。
TLC：Merck塩基性アルミナプレート、Ｒｆ：９５／５のCH2Cl2／CH3OHで０．３３、ＵＶ（２５４／３６６）で観察
HPLC条件：HP 1100 HPLCクロマトグラフ、Vydac 201TP・１０ｘ２５０ｍｍカラム、０．１００ｍＬ注入、２ｍＬ／分、３７０ｎｍ検出、Ａ＝水（０．１％HFBA）およびＢ＝MeCN（０．１％HFBA）、勾配：１０％Ｂ・２分、１０−８０％Ｂ・１８分超、８０−１００％Ｂ・２分超、１００％Ｂ・２分、保持時間１８．８分。
【００４６】
【化５】
【００４７】
Ｃ．９−［Ｎ−［２−（５，５−ジメチルボリナン−２−イル）ベンジル］−Ｎ−［２−（２−メタクロイルオキシエトキシ）エチルアミノ］メチル］−１０−［Ｎ−［２−（５，５−ジメチルボリナン−２−イル）ベンジル］−Ｎ−［２−（２−ヒドロキシエトキシ）エチルアミノ］メチル］アントラセン（単一メタクリレート単量体）
９，１０−ビス［Ｎ−［２−（５，５−ジメチルボリナン−２−イル）ベンジル］−Ｎ−［２−（２−ヒドロキシエトキシ）エチルアミノ］メチル］アントラセン（０．２９８ｇ、０．３５９ミリモル）、メタクリル酸（０．３０４ｇ、０．３００ｍＬ、３．５３ミリモル、９．８４当量）、DCC（０．９６５ｇ、４．６８ミリモル、１３．０当量）およびＮ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（０．０２０ｇ、０．１６ミリモル、０．４６当量）の１５ｍＬのCH2Cl2中における２３℃の溶液を暗所で４時間攪拌した。この時点で、この反応混合物を濾過し、そして回転蒸発により濃縮した。その残分をアルミナカラムクロマトグラフィー（５０ｇの活性中性アルミナ、０−４％のCH3OH／CH2Cl2）で精製して０．１５０ｇ（４７％）の黄色の固体をもたらした。
FAB MS：C52H66B2N2O9の計算値・[Ｍ]+８８５；実測値・[M+1]+８８６
TLC：Merck塩基性アルミナプレート、Ｒｆ：９５／５のCH2Cl2／CH3OHで０．４５、ＵＶ（２５４／３６６）で観察。
HPLC：HP 1100 HPLCクロマトグラフ、Vydac 201TP・１０ｘ２５０ｍｍカラム、０．１００ｍＬ注入、２ｍＬ／分、３７０ｎｍ検出、Ａ＝水（０．１％HFBA）およびＢ＝MeCN（０．１％HFBA）、勾配：１０％Ｂ・２分、１０−８０％Ｂ・１８分超、８０−１００％Ｂ・２分超、１００％Ｂ・２分、保持時間２１分。
【００４８】
Ｄ．９−［Ｎ−［２−（５，５−ジメチルボリナン−２−イル）ベンジル］−Ｎ−［２−（２−メタクロイルオキシエトキシ）エチルアミノ］メチル］−１０−［Ｎ−［２−（５，５−ジメチルボリナン−２−イル）ベンジル］−Ｎ−［２−（２−ヒドロキシエトキシ）エチルアミノ］メチル］アントラセンとTMAMAとの水溶性共重合体（モル比１：５０）
［２−（メタクリルオキシ）エチル］トリメチルアンモニウムクロリド（TMAMA 、７０重量％水溶液、単量体０．３４４ｇ、１．６６ミリモル、５０当量）の０．６００ｍＬの水中溶液に、９−［Ｎ−［２−（５，５−ジメチルボリナン−２−イル）ベンジル］−Ｎ−［２−（２−メタクロイルオキシエトキシ）エチルアミノ］メチル］−１０−［Ｎ−［２−（５，５−ジメチルボリナン−２−イル）ベンジル］−Ｎ−［２−（２−ヒドロキシエトキシ）エチルアミノ］メチル］アントラセン（０．００２４ｇ、０．００３３ミリモル）の３．００ｍＬのMeOH中溶液を加えた。この混合物に４，４’−アゾビス（４−シアノ吉草酸）（０．００７５ｇ、０．０２７ミリモル、総単量体の１．６モル％）を加えた。この溶液を０．４μの膜フィルターを通して濾過し、窒素ガスでパージし、次いで暗所で５５℃において１６時間加熱した。この時点で、その粘稠な溶液を２５℃まで冷却し、そして真空中で濃縮した。その残分を２０ｍＬの水で希釈し、そして０．２μの膜フィルターを通して濾過した。この重合体溶液を酢酸セルロース膜（MWCO３５００）を通して２ｘ４Ｌの水に対して透析した。この透析から３８．５ｍＬの重合体溶液が得られた。この溶液の一部分を乾燥状態になるまで濃縮すると、溶液１．０ｍＬ当たり重合体０．００７５ｇであることが示された。重合体の総収量０．２８９ｇ（７７％）。
【００４９】
ＩＩ．グルコース、ラクテートおよびアセトアセテートによる蛍光の変調
この実施例で製造された共重合体（２つの認識要素を含む）の蛍光のグルコース、ラクテートおよびアセトアセテートによる変調を測定した。図２は、ａ）０−２０ｍＭのグルコース；ｂ）０−２０ｍＭのラクテート；ｃ）０−２０ｍＬのリチウムアセトアセテートを含んでいるPBS中におけるアントラセン−ビス−ボロネート−TMAMA（１：５０モル比）共重合体の１．５ｍｇ／ｍＬ溶液の正規化された蛍光発光（４２８ｎｍにおけるＩ／Ｉ0）を示す。スペクトルはShimadzu RF-5301スペクトル蛍光計を使用し、３６５ｎｍにおいて励起；励起スリット１．５ｎｍ；発光スリット１．５ｎｍ；周囲温度を用いて記録された。共重合体の蛍光はグルコースの存在によって影響されたが、ラクテートまたはアセトアセテートの存在によっては影響されなかった。
【００５０】
実施例３
ビス−ボロネート−アントラセンインジケーターの蛍光に対するグルコースの用量応答効果に及ぼす溶解状態ラクテートの影響
【００５１】
【化６】
【００５２】
Ａ．９，１０−ビス［［２−（tert−ブトキシカルボニル）エチルアミノ］メチル］アントラセン
β−アラニン tert−ブチルエステル塩酸塩（３．０６ｇ、１６．８ミリモル、５．０９当量）、DIEA（４．２７ｇ、５．７５ｍＬ、３３．０ミリモル、１０．００当量）および９，１０−ビス（クロロメチル）アントラセン（０．９１０ｇ、３．３１ミリモル）の７５ｍＬのCHCl3中における２３℃の溶液を暗所で９３時間攪拌した。この時点で、この溶液を濾過し、そして１ｘ４０ｍＬずつおよび２ｘ６０ｍＬずつのNaHCO3（飽和水溶液）で洗浄した。その有機抽出物を無水のNa2SO4上で乾燥し、濾過し、そして濃縮して粗製の黄色固体をもたらした。その残分をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（３０ｇのグラビティー等級（gravity grade）ゲル、０−３％のCH3OH／CH2Cl2）で精製して１．０６ｇ（６５％）の粘稠な黄色−橙色生成物をもたらした。生成物をそのまま次に続けた。
TLC：Merckシリカゲル６０プレート、Ｒｆ：９５／５のCH2Cl2／CH3OHで０．３３、ＵＶ（２５４／３６６）で観察。
【００５３】
【化７】
【００５４】
Ｂ．９，１０−ビス［Ｎ−［２−（５，５−ジメチルボリナン−２−イル）ベンジル］−Ｎ−［２−（tert−ブトキシカルボニル）エチルアミノ］メチル］アントラセン
９，１０−ビス［［２−（tert−ブトキシカルボニル）エチルアミノ］メチル］アントラセン（１．６０ｇ、３．２５ミリモル）、DIEA（４．４５ｇ、６．００ｍＬ、３４．４ミリモル、１０．６当量）および（２−ブロモメチルフェニル）ボロン酸ネオペンチルエステル（４．８０ｇ、１７．０ミリモル、５．２２当量）の３０ｍＬのCHCl3中における２３℃の溶液を暗所で４．５日間攪拌した。この時点で、この混合物に４５ｍＬのCHCl3を加え、この混合物を２ｘ２５ｍＬずつのNaHCO3（飽和水溶液）で洗浄した。その有機抽出物を無水のNa2SO4上で乾燥し、濾過し、そして濃縮して粗製の赤味を帯びた油状物を得た。その残分をアルミナカラムクロマトグラフィー（１００ｇの活性中性アルミナ、０−３％のCH3OH／CH2Cl2）で精製して〜３．５ｇの橙色固体をもたらした。この生成物を溶解し、続いて白色沈殿（DIEA-HBr塩）を形成させた。この溶液を濾過し、その濾液を濃縮して２．７２ｇ（９３％）の橙色固体をもたらした。生成物（RP-HPLCで＞８０％純粋）をそのまま次に続けた。
TLC：Merck塩基性アルミナプレート、Ｒｆ：９５／５のCH2Cl2／CH3OHで０．６６、ＵＶ（２５４／３６６）で観察
HPLC条件：HP 1100 HPLCクロマトグラフ、Vydac 201TP・１０ｘ２５０ｍｍカラム、０．１００ｍＬ注入、２ｍＬ／分、３７０ｎｍ検出、Ａ＝水（０．１％HFBA）およびＢ＝MeCN（０．１％HFBA）、勾配：１０％Ｂ・２分、１０−８０％Ｂ・１８分超、８０−１００％Ｂ・２分超、１００％Ｂ・２分、保持時間２３．９分。
【００５５】
【化８】
【００５６】
Ｃ．９，１０−ビス［Ｎ−（２−ボロノベンジル）−Ｎ−［３−（プロパノイル）アミノ］メチル］アントラセン
９，１０−ビス［Ｎ−［２−（５，５−ジメチルボリナン−２−イル）ベンジル］−Ｎ−［２−（tert−ブトキシカルボニル）エチルアミノ］メチル］アントラセン（０．５５６ｇ、０．６２０ミリモル）の５ｍＬの、２０％TFA／CH2Cl2中における２３℃の溶液を暗所で２５時間攪拌した。この時点で、その反応混合物をＮ2ガスの流れの下で濃縮した。その残分を３ｘ１０ｍＬずつのエーテルを用いて摩砕して粉末化した。その残留固体を真空中で乾燥して０．３５１ｇ（８７％）のふわふわした黄色粉末をもたらした。
FAB MS：グリセロールマトリックス；C42H46B2N2O10（ビスグリセロール付加物）の計算値・[Ｍ]+７６０；実測値・[M]+７６０
HPLC：HP 1100 HPLCクロマトグラフ、Waters・５ｘ１００ｍｍのNovaPac HR C18カラム、０．０２５ｍＬ注入、０．７５ｍＬ／分、１．５ｍＬ注入ループ、３６０ｎｍ検出、Ａ＝水（０．１％HFBA）およびＢ＝MeCN（０．１％HFBA）、勾配：１０％Ｂ・２分、１０−８０％Ｂ・１８分超、８０−１００％Ｂ・２分超、１００％Ｂ・２分、保持時間１６．７分。
【００５７】
Ｄ．グルコースおよびラクテートによる蛍光の変調
この実施例で製造されたインジケーター化合物（２つの認識要素を含む）の蛍光のグルコースおよびラクテートによる変調を測定した。図３は、ａ）０−１０ｍＭのグルコース、０ｍＭのラクテート；ｂ）０−１０ｍＭのグルコース、２ｍＭのラクテート；ｃ）０−１０ｍＭのグルコース、５ｍＭのラクテートを含んでいるPBS中におけるビス−カルボキシレート−ビス−ボロネートアントラセンインジケーターの７５μＭ溶液の蛍光（於４２８ｎｍ）を示す。スペクトルはShimadzu RF-5301スペクトル蛍光計を使用し、３６５ｎｍにおいて励起；励起スリット１．５ｎｍ；発光スリット１．５ｎｍ；周囲温度を用いて記録された。全ての点が三回測定され、この場合±１ＳＤ誤差バーが含まれていた。ラクテートの存在はグルコースによるインジケーターの蛍光変調に実質的に影響を及ぼさなかった。
【００５８】
実施例４
インジケーターがヒドロゲル中に共有結合で固定化されているときの、グルコース対ラクテートおよびアセトアセテートに対するビス−ボロネートグルコースインジケーターの選択性
Ｉ．二元（dual）−メタクリルアミド単量体の製造
【００５９】
【化９】
【００６０】
Ａ．９，１０−ビス［３−（メタクリルアミド）プロピルアミノ］メチルアントラセン
９，１０−ビス（クロロメチル）アントラセン（１．５ｇ、５．４５ミリモル）、DIEA（２８．１７ｇ、３８．００ｍＬ、２１８ミリモル、４０当量）、Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド塩酸塩（９．７６ｇ、５４．５ミリモル、１０．０当量）および〜５ｍｇのBHTの２００ｍＬのCHCl3中における２３℃の懸濁液を暗所で４０℃において４日間攪拌した。この時点で、その温度を４５℃まで上げ、その混合物を３日間以上攪拌した。この時点で沈殿が形成された。この混合物を濾過し、その固体生成物を最低量のCH2Cl2に溶解した。一晩で所望生成物のビス塩酸塩である黄色結晶性固体が生成した（３．１５ｇ、定量的）。
TLC：Merck塩基性アルミナプレート、Ｒｆ：９０／１０のCH2Cl2／CH3OHで０．３１、ＵＶ（２５４／３６６）で観察
HPLC：HP 1100 HPLCクロマトグラフ、Waters・５ｘ１００ｍｍのNovaPac HR C18カラム、０．１００ｍＬ注入、０．７５ｍＬ／分、３６０ｎｍ検出、Ａ＝水（０．１％HFBA）およびＢ＝MeCN（０．１％HFBA）、勾配：１０％Ｂ・２分、１０−８０％Ｂ・１８分超、８０−１００％Ｂ・２分超、１００％Ｂ・２分、保持時間１５．０分。
【００６１】
【化１０】
【００６２】
Ｂ．９，１０−ビス［Ｎ−［２−（５，５−ジメチルボリナン−２−イル）ベンジル］−Ｎ−［３−（メタクリルアミド）プロピルアミノ］メチルアントラセン（二元メタクリルアミド単量体）
９，１０−ビス［３−（メタクリルアミド）プロピルアミノ］メチルアントラセン（０．０６５０ｇ、遊離アミン１．３４ミリモル）、DIEA（０．６１２ｇ、０．８２５ｍＬ、４．７４ミリモル、３．５５当量）、（２−ブロモメチルフェニル）ボロン酸ネオペンチルエステル（１．３４ｇ、４．７４ミリモル、３．５５当量）およびBHT（禁止剤として５ｍｇ）の２０ｍＬのCHCl3中における２３℃の溶液を暗所で５日間攪拌した。この時点で、この反応混合物を真空中で濃縮し、その残分をアルミナクロマトグラフィー（２００ｇの活性中性アルミナ、０−２％のCH3OH／CH2Cl2）で精製して０．４６５ｇ（３９％）の非常に粘稠な黄色の油状物をもたらした。
TLC：Merck塩基性アルミナプレート、Ｒｆ：９０／１０のCH2Cl2／CH3OHで０．５９、ＵＶ（２５４／３６６）で観察
HPLC：HP 1100 HPLCクロマトグラフ、Waters・５ｘ１００ｍｍのNovaPac HR C18カラム、０．０５０ｍＬ注入、０．７５ｍＬ／分、３６０ｎｍ検出、Ａ＝水（０．１％HFBA）およびＢ＝MeCN（０．１％HFBA）、勾配：１０％Ｂ・２分、１０−８０％Ｂ・１８分超、８０−１００％Ｂ・２分超、１００％Ｂ・２分、保持時間１６．９分。
【００６３】
Ｃ．グルコースインジケーターを持つＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドヒドロゲルの製造
Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド（４０重量％）およびＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（０．８重量％）のエチレングリコール中溶液を調製した。９，１０−ビス［Ｎ−［２−（５，５−ジメチルボリナン−２−イル）ベンジル］−Ｎ−［３−（メタクリルアミド）プロピルアミノ］メチルアントラセン（１７．８ｍｇ、２ｘ１０−５モル）および４０μＬの過硫酸アンモニウム水溶液（５重量％）を、１ｍＬのエチレングリコール単量体溶液と合わせた。得られた溶液を、窒素でパージされたグローブボックスの中に入れた。この単量体配合物に、重合を加速するためにＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミンの水溶液（８０μＬ、５重量％）を加えた。得られた配合物を、顕微鏡スライドおよび１００ミクロンのステンレス鋼製スペーサーから組み立てられた型の中に注ぎ入れた。窒素雰囲気中に８時間保持しておいた後、その型をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）（PBS１０ｍＭ、ｐＨ＝７．４）の中に入れ、それら顕微鏡スライドを分離し、そしてそのヒドロゲルを取り除いた。このヒドロゲルを、１ｍＭのラウリル硫酸ナトリウム塩および１ｍＭのEDTAナトリウム塩を含んでいる１００ｍＬのPBSで３日間洗浄した；この溶液は毎日替え、続いてDMF／PBS（容量で１０／９０、３ｘ１００ｍＬ）で、最後にPBS（ｐＨ＝７．４、３ｘ１００ｍＬ）で洗浄した。得られたヒドロゲル重合体を、０．２重量％のナトリウムアジドおよび１ｍＭのEDTAを含んでいるPBS（PBS１０ｍＭ、ｐＨ＝７．４）の中に貯蔵した。
【００６４】
ＩＩ．グルコース、ラクテートおよびアセトアセテートによる蛍光の変調
この実施例で製造されたインジケーター化合物（２つの認識要素を含む）の蛍光のグルコース、ラクテートおよびアセトアセテートによる変調を測定した。図４は、色々な量のナトリウム−Ｌ−ラクテート、リチウムアセトアセテートまたはα−Ｄ−グルコースを含んでいる、０．２％のNaN3および１ｍＭのEDTAを有する１０ｍＭのPBS（ｐＨ＝７．４）中におけるこの実施例のグルコース認識分子を含んでいるヒドロゲルの正規化蛍光発光（４２７ｎｍにおけるＩ／Ｉ0）を示す。データは、Shimadzu RF-5301スペクトル蛍光計を使用し、温度制御試料ホルダーを用いて低感度、３７℃において、３６５ｎｍにおいて励起（スリット＝３ｎｍ）および発光４２７ｎｍ（スリット＝３ｎｍ）を用いて記録した。３ｍＬの所望溶液が入っているキュベットを測定前に３７℃において１５分間平衡化させた。各ヒドロゲルは４つの独立した試料中で測定した。誤差バーは各データ点について四重値（quadruplicate values）による標準偏差である。グルコース認識分子を含むヒドロゲルは前に説明したように製造された。これらヒドロゲルをガラススライドの上に載せ、そしてPMMAキュベット中のポリエステルメッシュで入射光に対して４５°の角度でカバーした。ナトリウム Ｌ−ラクテート［Aldrich］１、５、１０および２０ｍＭ、リチウムアセトアセテート［Aldrich］５、１０および２０ｍＭおよびα−Ｄ−グルコース１、２、４、５、１０および２０ｍＭの、０．２％のNaN3および１ｍＭのEDTAを含んでいるｐＨ７．４の１０ｍＭのPBS中における溶液を調製した。上記共重合体の蛍光はグルコース存在によって影響されたが、ラクテートまたはアセトアセテートの存在によっては影響されなかった。
【００６５】
実施例５
ビス−ボロネート認識および近接消光信号発生を利用するラクテートに対するグルコースの選択性
Ａ．Ｎ−（２，２−ジエトキシエチル）−４−ブロモ−１，８−ナフタルイミド
４−ブロモ−１，８−ナフタル酸無水物（１０．０ｇ、３６．１ミリモル）およびアミノアセトアルデヒドジエチルアセタール（４．８１ｇ、５．２６ｍＬ、３６．１ミリモル、１当量）の４５ｍＬのEtOH中懸濁液を４５℃において３日間攪拌した。この時点で、得られた懸濁液を濾過し、EtOHで洗浄し、その残分を乾燥して１３．３ｇ（９４％）の淡褐色の固体生成物をもたらした。
TLC：Merckシリカゲル６０プレート、Ｒｆ：９８／２のCH2Cl2／CH3OHで０．１７、ＵＶ（２５４／３６６）で観察
HPLC：HP 1100 HPLCクロマトグラフ、Waters・５ｘ１００ｍｍのNovaPac HR C18カラム、０．０５０ｍＬ注入、０．７５ｍＬ／分、１．５ｍＬ注入ループ、３６０ｎｍ検出、Ａ＝水（０．１％HFBA）およびＢ＝MeCN（０．１％HFBA）、勾配：１０％Ｂ・２分、１０−８０％Ｂ・１８分超、８０−１００％Ｂ・２分超、１００％Ｂ・２分、保持時間２４．２分。
【００６６】
Ｂ．Ｎ−（２，２−ジエトキシエチル）−４−ブチルアミノ−１，８−ナフタルイミド
Ｎ−（２，２−ジエトキシエチル）−４−ブロモ−１，８−ナフタルイミド（０．７９７ｇ、２．０３ミリモル）およびｎ−ブチルアミン（１．４８ｇ、２．００ｍＬ、２０．２ミリモル、９．９６当量）の８ｍＬのNMP中溶液を４５℃で６６時間加熱した。この時点で、得られた懸濁液を２５℃まで放冷し、続いて濾過した。その残分を５０ｍＬのエーテルを用いて溶解させ、そして３ｘ５０ｍＬの水で抽出した。その有機抽出物を無水のNa2SO4上で乾燥し、濾過し、そして濃縮して粗製黄色粉末をもたらした。この粗製物質をシリカゲルクロマトグラフィー（２５ｇのグラビティー等級ゲル、０−１％のCH3OH／CH2Cl2）で精製して０．６３９ｇ（８２％）の黄色粉末をもたらした。
TLC：Merckシリカゲル６０プレート、Ｒｆ：９５／５のCH2Cl2／CH3OHで０．１７、ＵＶ（２５４／３６６）で観察
HPLC：HP 1100 HPLCクロマトグラフ、Waters・５ｘ１００ｍｍのNovaPac HR C18カラム、０．０５０ｍＬ注入、０．７５ｍＬ／分、１．５ｍＬ注入ループ、４５０ｎｍ検出、Ａ＝水（０．１％HFBA）およびＢ＝MeCN（０．１％HFBA）、勾配：１０％Ｂ・２分、１０−８０％Ｂ・１８分超、８０−１００％Ｂ・２分超、１００％Ｂ・２分、保持時間２３．５分。
【００６７】
Ｃ．Ｎ−（２−オキソエチル）−４−ブチルアミノ−１，８−ナフタルイミド
Ｎ−（２，２−ジエトキシエチル）−４−ブチルアミノ−１，８−ナフタルイミド（０．６２２ｇ、１．６２ミリモル）およびｐ−トルエンスルホン酸一水和物（０．０１０ｇ、０．０５３ミリモル、０．０３２当量）の２５ｍＬのアセトン中溶液を２５℃で１８時間攪拌した。この時点で、この溶液を濃縮し、その残分をシリカゲルクロマトグラフィー（２５ｇのグラビティー等級ゲル、０−１％のCH3OH／CH2Cl2）で精製して０．４７０ｇ（９４％）の橙色固体をもたらした。
TLC：Merckシリカゲル６０プレート、Ｒｆ：９５／５のCH2Cl2／CH3OHで０．６１、ＵＶ（２５４／３６６）で観察
1H NMR（４００MHZ、CDCl3）；δ１．０３（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ）、１．５３（ｍ，２Ｈ）、１．７８（ｍ，２Ｈ）、３．３８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ）、５．０２（ｓ，２Ｈ）、６．６４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．６Ｈｚ）、７．５２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．４，８．３Ｈｚ）、８．０８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１Ｈｚ，８．５Ｈｚ）、８．３８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．３Ｈｚ）、８．６４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．０，７．３Ｈｚ）、９．７５（ｓ，１Ｈ）
HPLC：HP 1100 HPLCクロマトグラフ、Waters・５ｘ１００ｍｍのNovaPac HR C18カラム、０．０５０ｍＬ注入、０．７５ｍＬ／分、１．５ｍＬ注入ループ、４５０ｎｍ検出、Ａ＝水（０．１％HFBA）およびＢ＝MeCN（０．１％HFBA）、勾配：１０％Ｂ・２分、１０−８０％Ｂ・１８分超、８０−１００％Ｂ・２分超、１００％Ｂ・２分、保持時間１９．６分。
【００６８】
Ｄ．Ｎ−（４−ジメチルアミノベンジル）−１，６−ジアミノヘキサン
４−ジメチルアミノベンズアルデヒド（１．００ｇ、６．７０ミリモル）、Na2SO4（６．７０ｇ、４７．２ミリモル、７．０４当量）および１，６−ジアミノヘキサン（３．８９ｇ、３３．５ミリモル、５．００当量）の２０ｍＬの無水EtOH中懸濁液を、暗所において、窒素ガス雰囲気下で、２５℃において１８時間攪拌した。この時点で、この溶液を濾過し、その濾液にNaBH4（１．７３ｇ、４５．８ミリモル、６．８４当量）を加えた。この懸濁液を２５℃において５時間攪拌した。この時点で、この反応混合物を濃縮し、その残分を５０ｍＬの水に溶解し、そして３ｘ５０ｍＬのエーテルで抽出した。その合わせた有機抽出物を２ｘ５０ｍＬの水で洗浄した。その合わせた水性抽出物を２ｘ５０ｍＬのエーテルで抽出した。その合わせた有機抽出物をNa2SO4上で乾燥し、濾過し、そして濃縮して１．３５ｇ（８１％）の粘稠な油状物をもたらした。
TLC：Merckシリカゲル６０プレート、Ｒｆ：８０／１５／５のCH2Cl2／CH3OH／iPrNH2で０．５８、ニンヒドリン染色、ＵＶ（２５４／３６６）で観察
HPLC：HP 1100 HPLCクロマトグラフ、Waters・５ｘ１００ｍｍのNovaPac HR C18カラム、０．０５０ｍＬ注入、０．７５ｍＬ／分、１．５ｍＬ注入ループ、２８０ｎｍ検出、Ａ＝水（０．１％HFBA）およびＢ＝MeCN（０．１％HFBA）、勾配：１０％Ｂ・２分、１０−８０％Ｂ・１８分超、８０−１００％Ｂ・２分超、１００％Ｂ・２分、保持時間１３．３分。
【００６９】
Ｅ．Ｎ−２−［５−（Ｎ−４−ジメチルアミノベンジル）アミノヘキシル］アミノエチル）−４−ブチルアミノ−１，８−ナフタルイミド
Ｎ−（２−オキソエチル）−４−ブチルアミノ−１，８−ナフタルイミド（０．３４６ｇ、１．１１ミリモル）の２５ｍＬの無水MeOH中懸濁液に、Ｎ−（４−ジメチルアミノベンジル）−１，６−ジアミノヘキサン（０．５５４ｇ、２．２２ミリモル、２．００当量）および酢酸（０．０６７ｇ、１．１ミリモル、１．０当量）の２０ｍＬの無水MeOH中溶液を加えた。この混合物にNaCNBH3（０．０７０ｇ、１．１ミリモル、１．０当量）の５ｍＬの無水MeOH中溶液を加えた。この反応混合物を２５℃において１５時間攪拌した。この時点で、そのMeOHを回転蒸発により除去し、その残分を３０ｍＬの水に溶解した。この溶液を１Ｎ HClでｐＨ２に調整し、次いで２５℃において１時間攪拌した。この時点で、この溶液を１Ｎ NaOHでｐＨ１２に調整し、続いて３ｘ５０ｍＬのCH2Cl2で抽出した。その合わせた有機抽出物を３ｘ５０ｍＬの水で洗浄し、無水のNa2SO4上で乾燥し、濾過し、そして濃縮して粗製の褐色の油状物をもたらした。この粗製物質をシリカゲルクロマトグラフィー（３５ｇのフラッシュ等級ゲル、０−５０％のCH3OH／CH2Cl2、次いで４５／５０／５のCH3OH／CH2Cl2／iPrNH2）で精製して０．１９０ｇ（３２％）のジアミン生成物をもたらした。
FAB MS：C33H45N5O2の計算値・[M]+５４４；実測値・[M]+５４４
TLC：Merckシリカゲル６０プレート、Ｒｆ：８０／２０のCH2Cl2／CH3OHで０．４２、ニンヒドリン染色およびＵＶ（２５４／３６６）で観察
HPLC：HP 1100 HPLCクロマトグラフ、Waters・５ｘ１００ｍｍのNovaPac HR C18カラム、０．０５０ｍＬ注入、０．７５ｍＬ／分、１．５ｍＬ注入ループ、４５０ｎｍ検出、Ａ＝水（０．１％HFBA）およびＢ＝MeCN（０．１％HFBA）、勾配：１０％Ｂ・２分、１０−８０％Ｂ・１８分超、８０−１００％Ｂ・２分超、１００％Ｂ・２分、保持時間１７．６分。
【００７０】
Ｆ．Ｎ−２−［５−（Ｎ−４−ジメチルアミノベンジル）−５−［２−（５，５−ジメチルボリナン−２−イル）ベンジル］アミノヘキシル］−［２−（５，５−ジメチルボリナン−２−イル）ベンジル］アミノエチル−４−ブチルアミノ−１，８−ナフタルイミド
Ｎ−２−［５−（Ｎ−４−ジメチルアミノベンジル）アミノヘキシル］アミノエチル）−４−ブチルアミノ−１，８−ナフタルイミド（０．１５０ｇ、０．２７６ミリモル）およびDIEA（０．３５５ｇ、０．４７８ｍＬ、２．８１ミリモル、１０．０当量）の５ｍＬのCHCl3中溶液に、（２−ブロモメチルフェニル）ボロン酸ネオペンチルエステル（０．３９０ｇ、１．３８ミリモル、５．００当量）の２ｍＬのCHCl3中溶液を加えた。この溶液を続いて２５℃において２７時間攪拌した。この時点で、この混合物を濃縮し、その残分をアルミナカラムクロマトグラフィー（１００ｇの活性中性アルミナ、１−５％のCH3OH／CH2Cl2）で精製して０．０２４ｇ（１９％）の粘稠な褐色の油状物をもたらした。
FAB MS（グリセロールマトリックス）：C53H67B2N5O8の計算値・[M]+９２４（ボロン酸のビスネオペンチルエステルの代わりにビスグリセロール付加物）；実測値・[M]+９２４
TLC：Merck中性アルミナプレート、Ｒｆ：８０／２０のCH2Cl2／CH3OHで０．６２、ＵＶ（２５４／３６６）で観察
HPLC：HP 1100 HPLCクロマトグラフ、Waters・５ｘ１００ｍｍのNovaPac HR C18カラム、０．０５０ｍＬ注入、０．７５ｍＬ／分、１．５ｍＬ注入ループ、４５０ｎｍ検出、Ａ＝水（０．１％HFBA）およびＢ＝MeCN（０．１％HFBA）、勾配：１０％Ｂ・２分、１０−８０％Ｂ・１８分超、８０−１００％Ｂ・２分超、１００％Ｂ・２分、保持時間２０．７分。
【００７１】
Ｇ．Ｎ−２−［５−（Ｎ−４−ジメチルアミノベンジル）−５−［２−（ボロノ）ベンジル］アミノヘキシル］−［２−（ボロノ）ベンジル］アミノエチル−４−ブチルアミノ−１，８−ナフタルイミド（nBuF−ヘキサ−Ｑ ビス−ボロネート）
グルコースの研究で使用される遊離のビスボロン酸生成物は、MeOH／PBS緩衝系中へのＮ−２−［５−（Ｎ−４−ジメチルアミノベンジル）−５−［２−（５，５−ジメチルボリナン−２−イル）ベンジル］アミノヘキシル］−［２−（５，５−ジメチルボリナン−２−イル）ベンジル］アミノエチル−４−ブチルアミノ−１，８−ナフタルイミドの溶解の結果として生ずる。
【００７２】
Ｈ．グルコースおよびラクテートによる蛍光の変調
この実施例で製造されたインジケーター化合物（２つの認識要素を含む）の蛍光のグルコースおよびラクテートによる変調を測定した。図５は、ａ）０−２０ｍＭのグルコース；ｂ）０−２０ｍＭのラクテートを含んでいる７０／３０のMeOH／PBS中におけるインジケーター化合物の０．０１５ｍＭ溶液の正規化蛍光発光（５３５ｎｍにおけるＩ／Ｉ0）を示す。スペクトルはShimadzu RF-5301スペクトル蛍光計を使用し、４５０ｎｍにおいて励起；励起スリット１．５ｎｍ；発光スリット１．５ｎｍ；周囲温度を用いて記録された。誤差バーは各データ点について三重値（triplicate values）による標準偏差である。インジケーターの蛍光はグルコースの存在によって影響されたが、ラクテートの存在によっては実質的に影響されなかった。
【００７３】
実施例６
Ｎ−［３−（メタクリルアミド）プロピル］−３，４−ジヒドロキシ−９，１０−ジオキソ−２−アントラセンスルホンアミド（アリザリンレッドＳ単量体）およびα，α’−ビス［Ｎ−［２−（５，５−ジメチルボリナン−２−イル）ベンジル］−Ｎ−［３−（メタクリルアミド）プロピルアミノ］−１，４−キシレン（ビスボロン酸単量体）を含むアクリルアミドゲルに及ぼすグルコースまたはラクテートの影響
Ａ．３，４−ジヒドロキシ−９，１０−ジオキソ−２−アントラセンスルホニルクロリド
３，４−ジヒドロキシ−９，１０−ジオキソ−２−アントラセンスルホン酸ナトリウム塩（１．４ｇ、３．９ミリモル）を３０ｍＬのクロロスルホン酸と合わせ、そして９０℃に昇温して５時間加熱し、その後にその溶液を０℃まで冷却し、そして１００ｇの氷の中に注ぎ入れた。氷が溶けた後、その溶液をCH2Cl2（３ｘ１００ｍＬ）で抽出し、塩化メチレン抽出物を合わせ、Na2SO4で乾燥し、そして蒸発させて０．８７ｇの固体を生成させた（収率６６％）。
【００７４】
Ｂ．Ｎ−［３−（メタクリルアミド）プロピル］−３，４−ジヒドロキシ−９，１０−ジオキソ−２−アントラセンスルホンアミド：
３，４−ジヒドロキシ−９，１０−ジオキソ−２−アントラセンスルホニルクロリド（９６ｍｇ、０．２８ミリモル）およびＮ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド塩酸塩（１０８ｍｇ、０．６ミリモル）を２０ｍＬのCH2Cl2と合わせた。この懸濁液にEt3N（３０３ｍｇ、３ミリモル）を加えた。この混合物を室温で２４時間攪拌し、濾過し、そして溶媒を蒸発させた。得られた固体を、溶離剤としてCH2Cl2／MeOH（９０／１０）を用いるSiO2（１０ｇ）上でのカラムクロマトグラフィーに付した。生成物は赤色固体（８０ｍｇ、収率６４％）として得られた。
FAB MS：C21H20N2O7Sの計算値・Ｍ+４４５；実測値・Ｍ+４４５
HPLC：HP 1100 HPLCクロマトグラフ、Waters・５ｘ１００ｍｍのNovaPac HR C18カラム、０．１００ｍＬ注入、０．７５ｍＬ／分、２ｍＬ注入ループ、３７０ｎｍ検出、Ａ＝水（０．１％HFBA）およびＢ＝MeCN（０．１％HFBA）、勾配：１０％Ｂ・２分、１０−８０％Ｂ・１８分超、８０−１００％Ｂ・２分超、１００％Ｂ・２分、保持時間１７．６７分。
【００７５】
Ｃ．α，α’−ビス［３−（メタクリルアミド）プロピルアミノ］−１，４−キシレン
Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド塩酸塩（３．００ｇ、１６．８ミリモル、２．２１当量）、DIEA（６．５ｇ、８．８ｍＬ、５０ミリモル、６．６当量）、テレフタルジカルボキサアルデヒド（１．０２ｇ、７．６０ミリモル）およびNa2SO4（１０．７ｇ、７５．３ミリモル、９．９１当量）の７５ｍＬの無水MeOH中溶液を、暗所で２５℃において１８時間攪拌した。この時点で、さらなるNa2SO4（１０．７ｇ、７５．３ミリモル、９．９１当量）を加え、そして攪拌を６時間以上続けた。この時点で、この溶液を濾過し、その濾液にNaBH4（１．７３ｇ、４５．７ミリモル、６．０１当量）を一部ずつ分けて加え、続いて２５℃において２１時間攪拌した。この懸濁液をセライトを通して濾過し、その濾液を濃縮した。その残分を１００ｍＬのCH2Cl2に溶解し、そして１ｘ２５ｍＬの飽和NaHCO3水溶液で洗浄した。その有機抽出物を無水Na2SO4上で乾燥し、濾過し、そして濃縮して粘稠な油をもたらした。この生成物そのまま次に続けた。
【００７６】
HPLC：HP 1100 HPLCクロマトグラフ、Vydac 201TP・１０ｘ２５０ｍｍカラム、０．１００ｍＬ注入、２．００ｍＬ／分、２６０ｎｍ検出、Ａ＝水（０．１％HFBA）およびＢ＝MeCN（０．１％HFBA）、勾配：１０％Ｂ・２分、１０−８０％Ｂ・１８分超、８０−１００％Ｂ・２分超、１００％Ｂ・２分、保持時間１５．８分。
【００７７】
Ｄ．α，α’−ビス［Ｎ−［２−（５，５−ジメチルボリナン−２−イル）ベンジル］−Ｎ−［３−（メタクリルアミド）プロピルアミノ］−１，４−キシレン
α，α’−ビス［３−（メタクリルアミド）プロピルアミノ］−１，４−キシレン（２．９４ｇ、７．６１ミリモル）、DIEA（２．９７ｇ、４．００ｍＬ、２３．０ミリモル、３．０２当量）、（２−ブロモメチルフェニル）ボロン酸ネオペンチルエステル（６．５０ｇ、２３．０ミリモル、３．０２当量）およびBHT（禁止剤として５ｍｇ）の７５ｍＬのCH2Cl2中における２５℃の溶液を暗所で２８時間攪拌した。この時点で、この混合物を１ｘ２５ｍＬの飽和NaHCO3水溶液で洗浄した。その有機抽出物を無水Na2SO4上で乾燥し、濾過し、そして濃縮した。その残分に２００ｍＬのエーテルを加え、その懸濁液を１８時間攪拌した。この懸濁液を濾過し、その残分をCH2Cl2に溶解し、濾過し、そしてその濾液を濃縮した。その固体残分に１５０ｍＬのエーテルを加え、その懸濁液を１８時間攪拌した。この時点で、この懸濁液を濾過して１．９８ｇ（３３％）のふわふわしたピンク色の粉末をもたらした。
FAB MS：C46H64B2N4O6の計算値・[Ｍ]+７９０；実測値・[Ｍ；１]+７９１
HPLC：HP 1100 HPLCクロマトグラフ、Waters・５ｘ１００ｍｍのNovaPak HR C18カラム、０．０５０ｍＬ注入、０．７５ｍＬ／分、２８０ｎｍ検出、Ａ＝水（０．１％HFBA）およびＢ＝MeCN（０．１％HFBA）、勾配：１０％Ｂ・２分、１０−８０％Ｂ・１８分超、８０−１００％Ｂ・２分超、１００％Ｂ・２分、保持時間１３．４分。
【００７８】
Ｅ．Ｎ−［３−（メタクリルアミド）プロピル］−３，４−ジヒドロキシ−９，１０−ジオキソ−２−アントラセンスルホンアミド（アリザリンレッドＳ単量体）およびα，α’−ビス［Ｎ−［２−（５，５−ジメチルボリナン−２−イル）ベンジル］−Ｎ−［３−（メタクリルアミド）プロピルアミノ］−１，４−キシレンを含むアクリルアミドゲルの製造
３０重量％のアクリルアミドおよび０．８重量％のＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドを含むエチレングリコール溶液を調製した。Ｎ−［３−（メタクリルアミド）プロピル］−３，４−ジヒドロキシ−９，１０−ジオキソ−２−アントラセンスルホンアミド（１．５ｍｇ、３．３８ｘ１０-6モル）およびα，α’−ビス［Ｎ−［２−（５，５−ジメチルボリナン−２−イル）ベンジル］−Ｎ−［３−（メタクリルアミド）プロピルアミノ］−１，４−キシレン（２８ｍｇ、３．５４ｘ１０-5モル）を、８００μＬのエチレングリコール単量体溶液および４０μＬの過硫酸アンモニウム５重量％水溶液と合わせた。この配合物を、窒素でパージされたグローブボックスの中にガラス製顕微鏡スライドおよび１００ミクロンのステンレス鋼製スペーサーから組み立てられた型と共に入れた。重合を加速するためにＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミンの水溶液（４０μＬ、５重量％）を加え、そして最終配合物をガラス製型の中に注ぎ入れた。その型を窒素雰囲気下で１６時間放置し、その後その配合物をPBS（ｐＨ＝７．４）の中に浸漬し、そしてそのガラススライドを分離してヒドロゲル重合体を薄膜の形で与えた。この得られたヒドロゲル薄膜を、１ｍＭのラウリル硫酸ナトリウム塩を含んでいる１００ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水で３日間洗浄した；この溶液は毎日替え、続いてMeOH／PBS（容量で２０／８０、３ｘ１００ｍＬ）で、最後にPBS（ｐＨ＝７．４、３ｘ１００ｍＬ）で洗浄した。ヒドロゲル重合体を、０．２重量％のナトリウムアジドおよび１ｍＭのEDTAナトリウム塩を含んでいるPBS（PBS１０ｍＭ、ｐＨ＝７．４）の中に貯蔵した。
【００７９】
Ｆ．グルコースおよびラクテートによる吸光度の変調
この実施例で製造されたインジケーターヒドロゲル（２つの認識要素を含む）の吸光度のグルコースおよびラクテートによる変調を測定した。上記アクリルアミドゲルを実施例４で説明したものと同じ方法でPMMAセルにはめ込んだ。所望の量のグルコースまたは乳酸ナトリウムを含んでいる、ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を水浴中で３７℃に加熱し、そしてゲルを含んでいる上記のPMMAセルの中に入れ、その後にそのPMMAセルを３７℃で１５分間平衡化させた。各グルコースまたはラクテート濃度の吸光度測定を３回行った。各測定で、ブランクとして６５０ｎｍでの吸光度を用い、Ａ（６５０ｎｍ）をＡ（４５０ｎｍ）およびＡ（５３０ｎｍ）の全ての値から差し引いた。
【００８０】
図６は、４ｍＭのアリザリンレッドＳ単量体および４４ｍＭのビスボロン酸単量体を含んでいる、グルコース有りおよびグルコース無しのアクリルアミドゲル（３０％）の吸光スペクトルを示す。図７は、４ｍＭのアリザリンレッドＳ単量体および４４ｍＭのビスボロン酸単量体を含んでいるアクリルアミドゲル（３０％）の吸光度に及ぼすグルコースの影響を示す。図８は、４ｍＭのアリザリンレッドＳ単量体および４４ｍＭのビスボロン酸単量体を含んでいるアクリルアミドゲル（３０％）の吸光度に及ぼす乳酸ナトリウムの影響を示す。インジケーターの吸光度はグルコースの存在によって影響されたが、ラクテートの存在によっては実質的に影響されなかった。
【００８１】
Ｇ．グルコースおよびラクテートによる蛍光の変調
この実施例６に実質的に従って合成した（但し、１．９ｍｇのＮ−［３−（メタクリルアミド）プロピル］−３，４−ジヒドロキシ−９，１０−ジオキソ−２−アントラセンスルホンアミドおよび３５ｍｇのα，α’−ビス［Ｎ−［２−（５，５−ジメチルボリナン−２−イル）ベンジル］−Ｎ−［３−（メタクリルアミド）プロピルアミノ］−１，４−キシレンが用いられた）アクリルアミドゲルの蛍光の変調を測定した。
【００８２】
実験は、可変温度付属装置を備えたShimadzu RF-5301 PCスペクトル蛍光計（励起、於４７０ｎｍ；スリット３／１０ｎｍ；高感度）で行われた。アクリルアミドゲルを、PMMA蛍光セル中に４５°の角度で接着されている１枚のガラススライドに取り付けた。そのセルを２．５ｍＬのPBS（ｐＨ＝７．４）で満たし、そして３７℃に加熱した。グルコース（１００ｍＭおよび５００ｍＭ）のPBS（ｐＨ＝７．４）中原液を調製し、そして水浴中で３７℃に加熱した。加熱グルコース原液のアリコートをPMMAセルに周期的に加え、その間５５０ｎｍにおける蛍光強度を時間の関数としてモニターした（２分毎に１回測定）。PMMAセル中のグルコース濃度は、YSIモデル２３００STATと、さらにはグルコース分析器を用いて測定した。図９に示される結果は、グルコースの添加はインジケーターヒドロゲルの蛍光強度を低下させることを示している。同じ影響が図１０でも見られ、それは同タイプのゲルの蛍光スペクトルに及ぼすグルコースの影響を示している。
【００８３】
その影響は次の理由のために起こると考えられる。アリザリンレッドＳ（レポーター分子）のメタクリルアミド単量体はビシナルジオール官能基および単量体官能基を含んでいる（以下の構造を参照されたい）。水溶液中および有機溶媒中では、アリザリンレッドＳ単量体およびビス−ボロネート認識要素単量体（以下の構造を参照されたい）は、互いに可逆反応をしてボロネートエステルを形成することができる。この可逆反応において形成されるボロネートエステル分子は蛍光性であり、一方アリザリンレッドＳ単量体は、それ自身では、水溶液中およびMeOHのような有機溶媒中で蛍光発光を事実上示さない。かくして、アリザリンレッドＳは、グルコース認識要素に結合すると、例えば吸光度および蛍光の量子収率のようなその光学的性質を変える。
【００８４】
【化１１】
【００８５】
単量体官能価を有するアリザリンレッドＳおよび単量体官能価を有するグルコース認識要素の溶液は、ヒドロゲル単量体および架橋剤と共に製造することができる。この混合物の共重合は、色々な小サイズおよび中サイズの分子へと拡散できるヒドロゲル物質を生成させ；かくして検体の検出および定量をすることが可能である。例えばグルコースのような検体はヒドロゲルマトリックスの内部に拡散し、そして認識要素に予め結合されているレポーター分子を置換する。このことはヒドロゲル膜の光学的性質に変化を引き起こす；それが今や認識要素に結合していないより多くの数のレポーター分子を含んでいるからである。
【００８６】
この実施例で製造されたインジケーター化合物（２つの認識要素を含む）の蛍光のグルコースおよびラクテートによる変調も測定した。この実験は、可変温度付属装置を備えるShimadzu RF-5301 PCスペクトル蛍光計（励起、於４７０ｎｍ；スリット５／１０ｎｍ；低感度）で行われた。アクリルアミドゲルを、PMMA蛍光セル中に４５°の角度で接着されている１枚のガラススライドに取り付けた。そのセルを２．５ｍＬのPBS（ｐＨ＝７．４）で満たし、そして水浴中で３７℃に加熱した。PBS（ｐＨ＝７．４）中のナトリウムラクテート（１００ｍＭ）原液を調製し、そして水浴中で３７℃に加熱した。PBS（ｐＨ＝７．４）中のグルコース（１００ｍＭおよび５００ｍＭ）の原液を調製し、そして水浴中で３７℃に加熱した。加熱ラクテート原液のアリコートをPMMAセルに周期的に加え、その間５５０ｎｍにおける蛍光強度をラクテート濃度が８ｍＭに達するまで時間の関数としてモニターした（２分毎に１回測定）。次いで、加熱グルコース原液のアリコートをPMMAセルに周期的に加え、その間５５０ｎｍにおける蛍光強度を時間の関数としてモニターした（２分毎に１回測定）。PMMAセル中のグルコース濃度は、YSIモデル２３００STATと、さらにはグルコース分析器を用いて測定した。図１１に示される結果は、ラクテートの添加はインジケーターヒドロゲルの蛍光強度に有意の影響を及ぼさず、そしてその後のグルコースの添加がインジケーターヒドロゲルの蛍光強度を低下させたことを示している。
【００８７】
実施例７
ビス−ボロネート−アントラセンの単一メタクリルアミド単量体
【００８８】
【化１２】
【００８９】
Ａ．９−クロロメチル−１０−［［２−（２−ヒドロキシエトキシ）エチルアミノ］メチル］アントラセン塩酸塩
９，１０−ビス（クロロメチル）アントラセン（５．１８ｇ、１８．８ミリモル、３．９９当量）の２００ｍＬのNMP中懸濁液に、２−（２−アミノエトキシ）エタノール（０．４９５ｇ、０．４７５ｍＬ、４．７１ミリモル）を加えた。この混合物を暗所で１７時間攪拌した。この時点で、この反応混合物を真空下において５０℃で〜５０ｍＬになるまで濃縮した。その残分をシリカゲルクロマトグラフィー（１５０ｇのグラビティー等級シリカゲル、０−１０％のCH3OH／CH2Cl2）で精製して０．４２５ｇ（２８％）の黄色／橙色の固体をもたらした。
TLC：Merckシリカゲル６０プレート、Ｒｆ：７０／３０のCH2Cl2／CH3OHで０．７２、ＵＶ（２５４／３６６）、ニンヒドリン染色で確認
HPLC：HP 1100 HPLCクロマトグラフ、Vydac 201TP・１０ｘ２５０ｍｍカラム、０．１００ｍＬ注入、２ｍＬ／分、３７０ｎｍ検出、Ａ＝水（０．１％HFBA）およびＢ＝MeCN（０．１％HFBA）、勾配：１０％Ｂ・２分、１０−８０％Ｂ・１８分超、８０−１００％Ｂ・２分超、１００％Ｂ・２分、保持時間１６．１分。
【００９０】
【化１３】
【００９１】
Ｂ．９−［［２−（２−ヒドロキシエトキシ）エチルアミノ］メチル］−１０−［［（３−メタクリルアミド）プロピルアミノ］メチル］アントラセン
Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド塩酸塩（３．０８ｇ、１７．２ミリモル、４．２当量）、DIEA（５．１９ｇ、７．００ｍＬ、４０．１ミリモル、９．８当量）およびBHT（〜３ｍｇ）の１２５ｍＬのCHCl3中における２３℃の懸濁液に、９−クロロメチル−１０−［［２−（２−ヒドロキシエトキシ）エチルアミノ］メチル］アントラセン塩酸塩（１．５６ｇ、４．１０ミリモル）の２５ｍＬのCHCl3中溶液を滴下した。この混合物を次に暗所で９２時間攪拌した。この時点で、この反応混合物を濾過し、そして２ｘ４０ｍＬのNaHCO3（飽和水溶液）で洗浄した。その有機抽出物を無水Na2SO4上で乾燥し、濾過し、そして濃縮して粘着性の橙色固体をもたらし、これをアルミナクロマトグラフィー（５０ｇの活性中性アルミナ、０−５％のCH3OH／CH2Cl2）で精製して０．３６４ｇ（２０％）の橙色の固体をもたらした。
TLC：Merckシリカゲル６０プレート、Ｒｆ：７０／３０のCH2Cl2／CH3OHで０．１６、ＵＶ（２５４／３６６）、ニンヒドリン染色で確認
HPLC：HP 1100 HPLCクロマトグラフ、Vydac 201TP・１０ｘ２５０ｍｍカラム、０．１００ｍＬ注入、２ｍＬ／分、３７０ｎｍ検出、Ａ＝水（０．１％HFBA）およびＢ＝MeCN（０．１％HFBA）、勾配：１０％Ｂ・２分、１０−８０％Ｂ・１８分超、８０−１００％Ｂ・２分超、１００％Ｂ・２分、保持時間１６．８５分。
【００９２】
【化１４】
【００９３】
Ｃ．９−［Ｎ−［２−（５，５−ジメチルボリナン−２−イル）ベンジル］−Ｎ−［３−（メタクリルアミド）プロピルアミノ］メチル］−１０−［Ｎ−［２−（５，５−ジメチルボリナン−２−イル）ベンジル］−Ｎ−［２−（２−ヒドロキシエトキシ）エチルアミノ］メチル］アントラセン（単一メタクリルアミド単量体）
９−［［２−（２−ヒドロキシエトキシ）エチルアミノ］メチル］−１０−［［（３−メタクリルアミド）プロピルアミノ］メチル］アントラセン（０．３４３ｇ、０．７６３ミリモル）、DIEA（０．９６５ｇ、１．３０ｍＬ、９．８当量）および（２−ブロモメチルフェニル）ボロン酸ネオペンチルエステル（１．０９ｇ、３．８５ミリモル、５．０当量）の２０ｍＬのCHCl3中における２３℃の溶液を暗所で２５時間攪拌した。この時点で、この反応混合物を初めに回転蒸発により、次いで真空ポンプを用いて濃縮してDIEAを除去した。その残分をアルミナクロマトグラフィー（４０ｇの活性中性アルミナ、０−１０％のCH3OH／CH2Cl2）で精製して０．２９９ｇ（４６％）の黄橙色固体をもたらした。この化合物は、これを前に述べた適切な単量体と共重合させ、脱保護して、グルコースを検出するために使用することができる。
FAB MS：C51H65B2N3O7の計算値・[Ｍ]+８５４；実測値・[Ｍ+1]+８５５
TLC：Merck塩基性アルミナプレート、Ｒｆ：９５／５のCH2Cl2／CH3OHで０．３５、ＵＶ（２５４／３６６）で観察
HPLC：HP 1100 HPLCクロマトグラフ、Vydac 201TP・１０ｘ２５０ｍｍカラム、０．１００ｍＬ注入、２ｍＬ／分、３７０ｎｍ検出、Ａ＝水（０．１％HFBA）およびＢ＝MeCN（０．１％HFBA）、勾配：１０％Ｂ・２分、１０−８０％Ｂ・１８分超、８０−１００％Ｂ・２分超、１００％Ｂ・２分、保持時間１９．７分。
【００９４】
実施例８
ビス−ボロネート−アントラセンの二元メタクリレート単量体
【００９５】
【化１５】
【００９６】
Ａ．９，１０−ビス［Ｎ−［２−（５，５−ジメチルボリナン−２−イル）ベンジル］−Ｎ−［２−（２−メタクロイルオキシエトキシ）エチルアミノ］メチル］アントラセン
９，１０−ビス［Ｎ−［２−（５，５−ジメチルボリナン−２−イル）ベンジル］−Ｎ−［２−（２−ヒドロキシエトキシ）エチルアミノ］メチル］アントラセン（０．１００ｇ、０．１２０ミリモル；実施例２を参照されたい）、メタクリル酸（０．１１２ｇ、０．１１０ｍＬ、１．３０ミリモル、１０．８当量）、DCC（０．３１６ｇ、１．５３ミリモル、１２．８当量）およびＮ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（０．０１４ｇ、０．１１ミリモル、０．９２当量）の５ｍＬのCH2Cl2中溶液を０℃において１時間、次いで２３℃において２２時間攪拌した。この時点で、この反応混合物を濾過し、そして回転蒸発により濃縮した。その残分をアルミナカラムクロマトグラフィー（３０ｇの活性中性アルミナ、０−２％のCH3OH／CH2Cl2）で精製して０．０３０ｇ（２６％）の黄色の固体をもたらした。この化合物は、これを前に説明した適切な単量体と共重合させ、脱保護して、グルコースを検出するために使用することができる。
FAB MS：C56H70B2N2O10の計算値・[Ｍ]+９５３；実測値・[Ｍ]+９５１
TLC：Merck塩基性アルミナプレート、Ｒｆ：９５／５のCH2Cl2／CH3OHで０．６７、ＵＶ（２５４／３６６）で観察
HPLC：HP 1100 HPLCクロマトグラフ、Waters・５ｘ１００ｍｍのNovaPak HR C18カラム、０．１００ｍＬ注入、０．７５ｍＬ／分、２ｍＬ注入ループ、３７０ｎｍ検出、Ａ＝水（０．１％HFBA）およびＢ＝MeCN（０．１％HFBA）、勾配：１０％Ｂ・２分、１０−８０％Ｂ・１８分超、８０−１００％Ｂ・２分超、１００％Ｂ・２分、保持時間１９．６分。
【００９７】
実施例９
二元５−アミノペンチルビス−ボロネート−アントラセン
【００９８】
【化１６】
【００９９】
Ａ．９，１０−ビス［［５−（ｔ−BOC）−アミノペンチルアミノ］メチル］アントラセン
９，１０−ビス（クロロメチル）アントラセン（０．２８ｇ、１ミリモル）、DIEA（７．０ｍＬ、４０ミリモル）、モノ−ｔ−ブトキシカルボニル １，５−ジアミノペンタン（３．７５ｇ、１０ミリモル）および５０ｍＬのCHCl3の懸濁液を、暗所において４５℃で２日間攪拌した。この溶液を飽和H2O／NaHCO3で洗浄し、その有機相を乾燥し（Na2SO4）、そしてその溶媒を蒸発させた。その残分をアルミナクロマトグラフィー（４０ｇの活性中性アルミナ、９５／５容量％のCH2Cl2／MeOH）で精製して０．５５ｇの粘稠な油状物をもたらした。この物質をそのまま次の工程に用いた。
【０１００】
【化１７】
【０１０１】
Ｂ． ９，１０−ビス［Ｎ−［２−（５，５−ジメチルボリナン−２−イル）ベンジル］−Ｎ−［５−（ｔ−BOC）−アミノペンチルアミノ］メチル］アントラセン
９，１０−ビス［［５−（ｔ−BOC）−アミノペンチルアミノ］メチル］アントラセン（０．３ｇ、０．４９ミリモル）、DIEA（０．３５ｍＬ、２ミリモル）および（２−ブロモメチルフェニル）ボロン酸ネオペンチルエステル（０．５６６ｇ、２．０ミリモル）の２０ｍＬのCH2Cl2中溶液を暗所において２５℃で２日間攪拌した。この時点で、この反応混合物を真空中で濃縮し、その残分をアルミナクロマトグラフィー（６０ｇの活性中性アルミナ、９８／２容量％のCH2Cl2／MeOH）で精製して０．４０１ｇ（２０％）の黄色の油状物をもたらした。この物質をそのまま次の工程に用いた。
【０１０２】
【化１８】
【０１０３】
Ｃ．９，１０−ビス［Ｎ−（２−ボロノベンジル）−Ｎ−［５−アミノペンチルアミノ］メチル］アントラセン・トリフルオロ酢酸塩
９，１０−ビス［Ｎ−［２−（５，５−ジメチルボリナン−２−イル）ベンジル］−Ｎ−［５−（ｔ−BOC）−アミノペンチルアミノ］メチル］アントラセン（０．４ｇ、０．３９ミリモル）を２０ｍＬのCH2Cl2／TFA（８０／２０容量％）に溶解した。この溶液を１２時間攪拌し、その溶媒を蒸発させ、その残分を１０ｍＬのエーテルで洗浄した。合計３７３ｍｇの固体が得られた（収率７２％）。生成物はRP-HPLCで〜８０％純度であった。この化合物は、これを前に説明した適切な単量体と共重合させ、脱保護して、グルコースを検出するために用いることができる。
【０１０４】
HPLC：HP 1100 HPLCクロマトグラフ、Waters・５ｘ１００ｍｍのNovaPak HR C18カラム、０．０５０ｍＬ注入、０．７５ｍＬ／分、３６０ｎｍ検出、Ａ＝水（０．１％HFBA）およびＢ＝MeCN（０．１％HFBA）、勾配：１０％Ｂ・２分、１０−８０％Ｂ・１８分超、８０−１００％Ｂ・２分超、１００％Ｂ・２分、保持時間１６．０分。
【０１０５】
実施例１０
【０１０６】
【化１９】
【０１０７】
Ａ．Ｎ−２−（tert−ブトキシカルボニル）アミノエチル−４−ブロモナフタレン−１，８−ジカルボキシミド
Ｎ−ｔ−Boc−エチレンジアミン（Fluka社、１．６ｇ、１０ミリモル）および４−ブロモ−１，８−ナフタル酸無水物（Aldrich社、２．７７ｇ、１０ミリモル）を６０ｍＬの無水エタノールと合わせ、この懸濁液を６０℃で２０時間攪拌し、室温まで冷却し、そして濾過した。得られた固体を３０ｍＬの冷EtOHで洗浄し、そして真空下で乾燥した。収量３．８４ｇ（９１％）。NMR（CDCl3）：δ１．２８（９Ｈ，ｓ）；３．５２（２Ｈ，ｔ）；４．３５（２Ｈ，ｔ）；４．９２（１Ｈ，ｓ）；７．８４（１Ｈ，ｔ）；８．０４（１Ｈ，ｄ）；８．４２（１Ｈ，ｄ）；８．５８（１Ｈ，ｄ）；８．６７（１Ｈ，ｄ）。
【０１０８】
【化２０】
【０１０９】
Ｂ．Ｎ−２−（tert−ブトキシカルボニル）アミノエチル−４−（Ｎ’−メチルアミノエチルアミノ）ナフタレン−１，８−ジカルボキシミド
Ｎ−メチルエチレンジアミン（１．４８ｇ、２０ミリモル）を２ｍＬの１−メチル−２−ピロリジノン（NMP）と合わせ、続いてＮ−２−（tert−ブトキシカルボニル）アミノエチル−４−ブロモナフタレン−１，８−ジカルボキシミド（０．３５ｇ、０．８４５ミリモル）を添加した。この結果得られた溶液を４５℃で４０時間攪拌し、その後NMPおよびＮ−メチルエチレンジアミンを真空下で蒸発させた。得られた残分をカラムクロマトグラフィー（２０ｇのシリカゲル、初めCH2Cl2／MeOH（９０／１０）、次いでCH2Cl2／MeOH／Et3N（７５／２０／５））に付した。黄色の固体が得られた（０．３１１ｇ、収率８９％）。純度をRP-HPLCでチェックした。
【０１１０】
【化２１】
【０１１１】
Ｃ．Ｎ−アミノエチル−４−（Ｎ’−アミノエチレン−Ｎ”−［２−（ボロノ）ベンジル］メチルアミノ）ナフタレン−１，８−ジカルボキシミド・トリフルオロ酢酸塩：
Ｎ−２−（tert−ブトキシカルボニル）アミノエチル−４−（Ｎ’−メチルアミノエチルアミノ）ナフタレン−１，８−ジカルボキシミド（０．３ｇ、０．７３ミリモル）、２−ブロモメチルフェニルボロン酸ピナコールエステル（０．６ｇ、２ミリモル）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−Ｎ−エチルアミン（１．３ｇ、８ミリモル）および１０ｍＬのCH2Cl2を合わせた。この溶液を２０時間攪拌し、続いて２ｇのPS-Trisamine樹脂（Argonaut Technologies社、３．３８ミリモル／ｇ）を加えた。この反応混合物および樹脂を１０時間かき混ぜ、その後その樹脂を濾過によって取り出し、そしてCH2Cl2（２ｘ２０ｍＬ）で洗浄した。合わせたCH2Cl2溶液を蒸発させ、そして真空下で乾燥した。この結果得られた橙色の残分に、２０容量％のTFAおよび５容量％のトリイソプロピルシランを含む塩化メチレン溶液を加えた。この結果得られた溶液を室温で１０時間攪拌し、その後その溶媒を蒸発させ、その残分をエーテルと共に摩砕して黄色の固体をもたらした。この固体を濾過し、そして真空中で乾燥した（収量５８０ｍｇ）。この物質の純度をRP-HPLCでチェックした。この固体をそのまま次の工程で用いた。
【０１１２】
【化２２】
【０１１３】
Ｄ．Ｎ−（３−ボロノ−５−ニトロベンズアミド）エチル−４−（Ｎ’−アミノエチレン−Ｎ”−［２−（ボロノ）ベンジル］メチルアミノ）ナフタレン−１，８−ジカルボキシミド：
Ｎ−アミノエチル−４−（Ｎ’−アミノエチレン−Ｎ”−［２−（ボロノ）ベンジル］メチルアミノ）ナフタレン−１，８−ジカルボキシミド・トリフルオロ酢酸塩（０．２２５ｇ、０．４ミリモル）、３−カルボキシ−５−ニトロフェニルボロン酸（０．０８５ｇ、０．４ミリモル）、ジフェニルホスホリルアジド（０．１３ｍＬ、０．６ミリモル）および２ｍＬの無水DMFを合わせた。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−Ｎ−エチルアミン（０．７ｍＬ、４ミリモル）を加え、その溶液を２０時間攪拌した。その反応混合物にエーテル（１０ｍＬ）を加え、その不溶性残分を分離し、そして５ｍＬのCH2Cl2と共に音波処理して橙色の固体をもたらし、その固体を濾過し、そして真空下で乾燥した（３８ｍｇ、収率１５％）。この固体の純度はRP-HPLCでチェックした。NMR（dmso-d6/D20、９０／１０）：δ２．３２（３Ｈ，ｓ）；２．８２（２Ｈ，ｔ）；３．５８（２Ｈ，ｔ）；３．６５（２Ｈ，ｔ）；３．７０（２Ｈ，ｓ）；６．６５（１Ｈ，ｄ）；７．０−７．３（４Ｈ，ｍ）；７．６８（１Ｈ，ｔ）；８．１８（１Ｈ，ｄ）；８．４２（１Ｈ，ｄ）；８．４７（１Ｈ，ｄ）；８．１−８．３５（３Ｈ，ｍ）。
【０１１４】
Ｅ．Ｎ−（３−ボロノ−５−ニトロベンズアミド）エチル−４−（Ｎ’−アミノエチレン−Ｎ”−［２−（ボロノ）ベンジル］メチルアミノ）ナフタレン−１，８−ジカルボキシミドのグルコースとの相互作用についての蛍光でモニターする試験
この実験は、MeOH／リン酸緩衝生理食塩水（PBS、１０ｍＬ、ｐＨ＝７．４）中で行われた。Ｎ−（３−ボロノ−５−ニトロベンズアミド）エチル−４−（Ｎ’−アミノエチレン−Ｎ”−［２−（ボロノ）ベンジル］メチルアミノ）ナフタレン−１，８−ジカルボキシミドのMeOH／PBS（５０／５０容量％）中における濃度は１５ｍＭであった。グルコース濃度は０ｍＭから５０ｍＭまで変えられ、またＬ−ナトリウムラクテート濃度を０ｍＭから７ｍＭまで変えた。実験はShimadzu RF-5301 PCスペクトル蛍光計で行った：励起波長は４３０ｎｍに設定し、発光は４８０−６５０ｎｍの範囲、スリット幅３／１．５ｎｍ、高感度PMTでモニターした。
【０１１５】
結果は図１２および１３に示されるが、それらは、この試料のインジケーターの蛍光はグルコースの存在によって影響されたが、ラクテートの存在によっては影響されなかったことを示している。
【図面の簡単な説明】
【０１１６】
【図１】実施例１に記載されるインジケーターの正規化された蛍光発光（４２０ｎｍにおけるＩ／Ｉ0）を図示する。
【図２】実施例２に記載されるインジケーターの正規化された蛍光発光（４２８ｎｍにおけるＩ／Ｉ0）を図示する。
【図３】実施例３に記載されるインジケーターの正規化された蛍光発光（４２８ｎｍにおけるＩ／Ｉ0）を図示する。
【図４】実施例４に記載されるインジケーターの正規化された蛍光発光（４２７ｎｍにおけるＩ／Ｉ0）を図示する。
【図５】実施例５に記載されるインジケーターの正規化された蛍光発光（５４０ｎｍにおけるＩ／Ｉ0）を図示する。
【図６】実施例６に記載されるインジケーターの吸光スペクトルを図示する。
【図７】実施例６に記載されるインジケーターの吸光度の比（４５０ｎｍ／５３０ｎｍ）を図示する。
【図８】実施例６に記載されるインジケーターの吸光度の比（４５０ｎｍ／５３０ｎｍ）を図示する。
【図９】実施例６に記載されるインジケーターの正規化された蛍光発光（Ｉ／Ｉ0、於５５０ｎｍ）を図示する。
【図１０】実施例６に記載されるインジケーターの、グルコースの非存在下および１００ｍＭのグルコースの存在下における吸光スペクトルを図示する。
【図１１】実施例６に記載されるインジケーターのグルコースおよびラクテートの存在下における正規化された蛍光発光（Ｉ／Ｉ0、於５５０ｎｍ）を図示する。
【図１２】実施例１０に記載される、グルコースに曝露されたインジケーターの正規化された蛍光発光（Ｉ／Ｉ0、於５２５ｎｍ）を図示する。
【図１２】実施例１０に記載される、ラクテートに曝露されたインジケーターの正規化された蛍光発光（Ｉ／Ｉ0、於５３０ｎｍ）を図示する。
関連出願の相互参照
本出願は、２００１年１月５日に出願された米国特許出願第０９／７５４，２１７号の一部継続出願であり、かつ２００１年１０月１８日に出願された米国特許出願第６０／３２９，７４６号および２００１年２月２１日に出願された米国特許出願第６０／２６９，８８７号の利益を主張するものである。
【０００２】
連邦承認の研究または開発に関する陳述
該当しない。
発明の背景
１．発明の分野
本発明は、α−ヒドロキシ酸またはβ−ジケトンのような潜在妨害性の化合物も含んでいることがある試料中のグルコースの検出に関する。
２．関連技術の説明
グルコースを含めて炭水化物のフェニルボロン酸による錯化はずっと以前から知られており、その相互作用の可逆性は糖類のクロマトグラフ分離の基礎として役立ってきた。具体的にいうと、１９５９年にLorandおよびEdwardsはフェニルボロン酸と多数の飽和ポリオールとの水系会合の会合定数を報告した；結合相互作用は非常に弱（例えば、エチレングリコールのＫd＝３６０ｍＭ）から適度に強（例えば、グルコースのＫd＝９．１ｍＭ）までの範囲に及んだ。J. Yoon等のBioorganic and Medicinal Chemistry、１（４）：２６７−７１（１９９３）を参照されたい。結合機構は、ボロネート部分（boronate moiety）上のヒドロキシル基に対するグルコース上の隣接ヒドロキシル基の結合によって起こると考えられる。
【０００３】
米国特許第５，５０３，７７０号明細書（James等）は、グルコースを含めて糖類に結合すると高強度の蛍光を発する蛍光性ボロン酸含有化合物について記載している。この蛍光性化合物は、発蛍光団(fluorophore)を含む分子構造、少なくとも１つのフェニルボロン酸部分、および窒素原子がフェニルボロン酸と分子内相互作用するように上記フェニルボロン酸部分の付近に配置されている少なくとも１個のアミン提供窒素原子を有する。このような相互作用は、それによってその化合物をして糖結合形成時に蛍光を発せしめる。T. James等のJ. Am. Chem. Soc.、１１７（３５）：８９８２−８７（１９９５）も参照されたい。
【０００４】
さらに、血中グルコースを検出するためにアントリルボロン酸含有化合物を使用する蛍光センサーがこの技術分野で知られている。例えば、J. Yoon等のJ. Am. Chem. Soc.、１１４：５８７４−５８７５（１９９２）は、アントリルボロン酸がグルコースおよびフルクトースの結合を含めて炭水化物結合の形成信号を発するための蛍光化学的センサーとして使用できることを述べている。
【０００５】
残念ながら、グルコースと上記の様式で相互作用する化合物にはヒドロキシル基を有する他の化合物と相互作用する傾向があり、かくして、特に妨害量のラクテート、アセトアセテート等を含んでいることがある生理的試料を検定するときにグルコース検定の特異性を低下させる。例えば、糖尿病患者の中には、血中ラクテートレベルが５ミリモル／リットル超である乳酸アシドーシスになるものもいる。従って、ラクテートのような潜在妨害性のヒドロキシル化合物に対して比較的に不感受性であるグルコース検定の大きな必要が残されている。
【０００６】
発明の簡潔な要約
１つの面において、本発明は、アルファ−ヒドロキシ酸またはベータ−ジケトンも含んでいることがある試料中のグルコースの存在または濃度を検出する方法であって：
ａ）少なくとも２つのグルコース認識要素を有する化合物に試料を曝露する工程にして、そのグルコース認識要素が、上記化合物とグルコースとの相互作用がその化合物とα−ヒドロキシ酸またはβ−ジケトンとの相互作用よりも安定になるように配向されており、ここで該化合物は、この化合物が該試料中のグルコースに曝露されると濃度依存性様式で変化する検出可能な特質を有する検出可能部分も含んでいるそのような工程；および
ｂ）該検出可能特質のいかなる変化も測定し、それによって該試料中のグルコースの存在または濃度を決定する工程にして、この場合α−ヒドロキシ酸またはβ−ジケトンの存在は該決定を実質的に妨害しないそのような工程
を含む上記の方法に関する。
【０００７】
もう１つの面において、本発明は、次の構造：
【０００８】
【化１】
を有する化合物であるが、但しこのインジケーター化合物はそれに関連付けられる少なくとも１個の検出可能部分を、直接的にか、または固体支持体または高分子マトリックスの一部としてのいずれかで含んでいるそのような化合物に関する：但し、上記の式において：
―Ｒ1およびＲ2は同一または異なるものであって、次の：ｉ）水素、ｉｉ）Ｒ8部分のpKaおよび加水分解安定性を変える置換基、ｉｉｉ）検出可能部分、またはｉｖ）場合によって検出可能部分を含んでいる固体支持体または高分子マトリックスに結合することが可能な結合基から選ばれ；
―Ｒ3は水素、または場合によって検出可能部分を含んでいる固体支持体または高分子マトリックスに結合することが可能な結合基であり；
―Ｒ4およびＲ5は同一または異なるものであって、次の：ｉ）水素、ｉｉ）Ｒ8部分のpKaおよび加水分解安定性を変える置換基、ｉｉｉ）検出可能部分、またはｉｖ）検出可能部分を場合によって含んでいる固体支持体または高分子マトリックスに結合することが可能な結合基から選ばれ；
―各Ｚは独立に炭素または窒素であり；
―Ｒ6およびＲ7は同一または異なるものであって、ｉ）ゼロ〜１０個の隣接するまたは分枝した炭素および／またはヘテロ原子を有する結合基、またはｉｉ）検出可能部分を場合によって含んでいる固体支持体または高分子マトリックスに結合することが可能な結合基であり；
―Ｒは、次の：ｉ）炭素、酸素、窒素、硫黄およびリンより成る群から選ばれる１〜１０個の隣接する原子を含んでいる脂肪族および／または芳香族スペーサー、ｉｉ）検出可能部分、またはｉｉｉ）検出可能部分を場合によって含んでいる固体支持体または高分子マトリックスに結合することが可能な結合基から選ばれ；
―各Ｒ8は同一または異なるものであって、保護されていないときにグルコース中に存在するビシナルジオール基と相互作用することが可能である、場合によって保護されている部分であり；そして
―Ｒ9およびＲ10は同一または異なるものであって、ｉ）水素、ｉｉ）検出可能部分、ｉｉｉ）ａ）検出可能部分を場合によって含んでいる固体支持体または高分子マトリックスに結合することが可能な結合基であるか、および／またはｂ）前記化合物の物理的性質を変えることができる官能基を含む基である。
【００１０】
もう１つの面において、本発明は上記化合物を含む検出系に関する。
発明の詳細な記述
１つの面において、本発明はα−ヒドロキシ酸またはβ−ジケトンのような妨害性化合物も含んでいることがある試料中のグルコースの存在または濃度を検出する方法を提供する。このような潜在妨害性の化合物に、ラクテート、アセトアセテート、β−ヒドロキシ酪酸等々がある。
【００１１】
本発明は、試料中のグルコースを認識することはできるが、その試料中の妨害性化合物を認識する可能性は少ないインジケーター化合物を用いて行われる。インジケーター化合物は、そのインジケーター化合物とグルコースとの相互作用がそのインジケーター化合物と妨害性化合物との相互作用よりも安定になるように配向されている少なくとも２つのグルコース認識要素を有する。
【００１２】
適した認識要素は、グルコースと、特にグルコース中に存在するジオール基と好ましくは可逆的な相互作用をすることが可能な部分を含む。幾つかのこのような認識要素は公知であり、それには、好ましくは、ボロン酸、ボロン酸イオン、亜ヒ酸、亜ヒ酸イオン、テルル酸、テルル酸イオン、ゲルマニウム酸、ゲルマニウム酸イオン等々がある。ホウ素を含んでいる認識要素が最も好ましい。認識要素は、使用するまで、保護基でキャップしておくことができることは分かるだろう。このような基は周知であって、ネオペンチルグリコール、ピナコール等々がある。ある特定の態様において、キャップ付き認識要素は、その化合物が使用されるべき媒体中でそのキャップが外される（例えば、実施例５を参照されたい）。
【００１３】
認識要素は、それら認識要素の少なくとも２種をグルコース分子と相互作用させるように、互いに適切な距離があけられていることが好ましく、その結果として増加した特異性がもたらされる。一般に、認識要素はこれらの要素間に原子約３０個までのスペーサーを有することができる。認識要素はそれらがグルコースと相互作用するときに約６Å離れていることができるように配向配置されているのが好ましい。
【００１４】
本発明のインジケーター化合物は、この化合物がグルコースを含んでいる試料に曝露されるときに濃度依存性様式で変化する検出可能な特質を有する。多くのこのような特質は知られており、本発明においても利用することができる。例えば、インジケーター化合物は発光性（蛍光性若しくは燐光性）または化学発光性部分、吸光系部分等々を含んでいることができる。インジケーター化合物はエネルギー供与体部分およびエネルギー受容体部分を含んでいることができ、その各々はインジケーター化合物がグルコースと相互作用するときに検出可能な変化が現れるように互いに一定間隔をおいて配置されている。インジケーター化合物は、グルコースが存在しないときに発蛍光団が消光体によって消光されるように配列されているそのような発蛍光団および消光体を含んでいることができる。そのような状況において、グルコースが存在すると、そのインジケーターは、消光体を、蛍光が発せられるように発蛍光団から十分遠くに移動させる配置変化を受ける。逆に、発蛍光団および消光体を、グルコースの非存在下においてそれらが十分に隔てられ、発蛍光団が蛍光を発するように配置することができる；グルコースと相互作用すると発蛍光団と消光体は消光を引き起こすに足るほど近くに移動せしめられる。この配置変化の着想は、ここで参照することにより本明細書に含められる、「検体の検出（Detection of Analytes）」と題される、２００１年１月５日に出願された、本出願人による出願中の米国特許出願第０９／７５４，２１９号明細書中でさらに詳しく説明されている。
【００１５】
あるいはまた、インジケーターは認識要素と相互作用することができる発蛍光団のような部分、またはグルコースの非存在下で発蛍光団が蛍光を発するように認識要素に対して空間的に配置されているもう１つの部分を含むことができる。グルコースを添加すると直ぐに、グルコースは、発蛍光団と認識要素との相互作用、または発蛍光団と認識要素に対して空間的に配置されている他の部分との相互作用と競争し、蛍光の低下を引き起こす。その着想の１例が実施例６で説明されている。インジケーターは、発蛍光団が認識要素またはグルコースの非存在下において認識要素に対して空間的に配置されているもう１つの部分と相互作用するときに発蛍光団が蛍光を発しないか、または比較的低レベルの蛍光を発するように選ぶことができることも認められるだろう。グルコースを添加すると直ぐに、グルコースは、発蛍光団と認識要素との相互作用、または発蛍光団と認識要素に対して空間的に配置されている他の部分との相互作用と競争し、蛍光の増加を引き起こす。
【００１６】
他の検出可能な部分として、光誘発電子移動または誘導効果によるグルコースの相互作用で蛍光が影響を受けるものが挙げられる。これらには、ここで参照することにより本明細書に含められる、１９９９年３月１１日に出願された（そして１９９９年９月１６日にPCT国際出願ＷＯ第９９／４６６００号として公開された）出願中の米国特許出願第０９／２６５，９７９号明細書に開示されているランタニドキレート；ポリ芳香族炭化水素およびそれらの誘導体；クマリン類；BoDiPy；ダンシル；カテコール類等々がある。検出可能部分のもう１つの種類を挙げると、アリザリンレッド等々を含めてインジケーター化合物がグルコースと相互作用すると直ちに吸光スペクトルが変化するものがある。検出可能部分のもう１つの種類として、近接効果、例えばダンシル／ダブシル（dabsyl）等々のようなエネルギー供与体／受容体ペアによって蛍光が変調されるものが挙げられる。
【００１７】
検出可能な特質は、好ましくは、吸収特性（例えば、吸収能および／またはスペクトルシフト）、蛍光減衰時間（時間領域（time domain）または周波数領域の測定により決定）、蛍光強度、蛍光の異方性または偏光における変化のような検出可能なスペクトル変化；発光スペクトルのスペクトルシフト；時間分解異方性減衰（時間領域または周波数領域の測定により決定）の変化等々である。
【００１８】
本発明のインジケーター化合物は、それらが可溶性である場合は、望むならば溶解状態で直接使用することができる。他方、所望とされる用途が求めるならば、インジケーター化合物は、ガラス、プラスチック、高分子材料等々のような不溶性の表面またはマトリックス上またはその内部に（機械的閉じ込めまたは共有若しくはイオン結合のような手段によって）固定化することもできる。インジケーター化合物が、例えば他の重合体内に閉じ込められるとき、その閉じ込め材料は、好ましくは、グルコースとインジケーター化合物との間に適切な相互作用を可能にするために、グルコースが十分に透過できるものであるべきである。
【００１９】
インジケーター化合物が水に貧溶解性または不溶性であり、しかもなお水性媒体中での検出が望まれるならば、そのインジケーター化合物を、ここで参照することにより内容が本明細書に含まれる、２０００年８月４日に出願された、出願中の米国特許出願第０９／６３２，６２４号明細書に記載される親水性高分子を形成させるために、親水性単量体と共重合させてもよい。
【００２０】
好ましいインジケーター化合物は、次の構造：
【００２１】
【化２】
を有する；但しこのインジケーター化合物はそれに関連付けられる少なくとも１個の検出可能部分を、直接的にか、または固体支持体若しくは高分子マトリックスの一部としてのいずれかで含んでいる：但し、上記の式において：
―Ｒ1およびＲ2は同一または異なるものであって、次の：ｉ）水素、ｉｉ）Ｒ8部分のpKaおよび加水分解安定性を変える置換基、ｉｉｉ）検出可能部分、またはｉｖ）検出可能部分を場合によって含んでいる固体支持体または高分子マトリックスに結合することが可能な結合基から選ばれ；
―Ｒ3は水素、または検出可能部分を場合によって含んでいる固体支持体または高分子マトリックスに結合することが可能な結合基であり；
―Ｒ4およびＲ5は同一または異なるものであって、次の：ｉ）水素、ｉｉ）Ｒ8部分のpKaおよび加水分解安定性を変える置換基、ｉｉｉ）検出可能部分、またはｉｖ）検出可能部分を場合によって含んでいる固体支持体または高分子マトリックスに結合することが可能な結合基から選ばれ；
―各Ｚは独立に炭素または窒素であり；
―Ｒ6およびＲ7は同一または異なるものであって、ｉ）ゼロ〜１０個の隣接するまたは分枝した炭素および／またはヘテロ原子を有する結合基、またはｉｉ）検出可能部分を場合によって含んでいる固体支持体または高分子マトリックスに結合することが可能な結合基であり；
―Ｒは、次の：ｉ）炭素、酸素、窒素、硫黄およびリンより成る群から選ばれる１〜１０個の隣接する原子を含んでいる脂肪族および／または芳香族スペーサー、ｉｉ）検出可能部分、またはｉｉｉ）検出可能部分を場合によって含んでいる固体支持体または高分子マトリックスに結合することが可能な結合基から選ばれ；
―各Ｒ8は同一または異なるものであって、保護されていないときにグルコース中に存在するビシナルジオール基と相互作用することが可能である、場合によって保護されている部分であり；そして
―Ｒ9およびＲ10は同一または異なるものであって、ｉ）水素、ｉｉ）検出可能部分、ｉｉｉ）ａ）検出可能部分を場合によって含んでいる固体支持体または高分子マトリックスに結合することが可能な結合基であるか、および／またはｂ）前記化合物の物理的性質を変えることができる官能基を含む基である。
【００２３】
Ｒ8部分のpKaおよび加水分解安定性を変える適切な基は当業者には直ちに明らかになると思われるが、これにはハロゲン；ニトロ；アミノ；ハロゲン置換アルキル；場合によって置換されているカルボニル；アシル；ケト；ニトリル；アミド；エステル；アルコキシ等々のような基がある。
【００２４】
どのような置換基にも適した結合基としては、さらに反応することができるか、または重合体若しくは支持体に結合することが可能な官能基の中で終わっている１個または２個以上のヘテロ原子を含むことができる、分枝していてもよいし、あるいは置換されていてもよい約１〜約２０個の隣接原子を含む基を挙げることができる。適した結合基の例に、次の全てが場合によって置換されているアルキル、アリール、アシル、ポリアミド、ポリエーテルおよびそれらの組み合わせがある。
【００２５】
Ｒ9およびＲ10として、さらに、溶解性、pKa等々のような化合物の物理的性質を変えることができる官能基を挙げることができる。例えば、これら官能基に、場合によって置換されているカルボキシレート、アミノ基、四級アンモニウム基、スルホネート、PEG等々がある。
【００２６】
置換基のどれかが検出可能部分であるとき、それは検出可能部分をインジケーター化合物の残部に結合させる適切な結合基を含んでいることもできることは理解されるだろう。適した結合基に上記で挙げたものがある。適した検出可能部分には前記で定義されたものがある。
【００２７】
Ｒ8は、好ましくは、ボロン酸、ボロン酸イオン、亜ヒ酸、亜ヒ酸イオン、テルル酸、テルル酸イオン、ゲルマニウム酸、ゲルマニウム酸イオンおよびそれらの組み合わせより成る群から選ばれる。
【００２８】
また、前記の定義から、本発明の化合物および検出システムは高分子の形態をしていることができることも理解されるだろう。かくして、（認識要素および検出可能部分を含んでいる）ある１つの一体化合物（integral compound）は、これを現存重合体に結合させることもできるし、あるいは単量体の形をしたそのような一体化合物を重合させるか、または他の適切な単量体と共重合させて重合体を形成することもできる。あるいはまた、２つの別々の単量体成分（例えば、認識要素を含んでいるもの、および検出可能部分を含んでいるもの）を、結果として得られる重合体がシステムの必要な全ての要素を含むように共重合させることができる（実施例６を参照されたい）。
【００２９】
本発明のインジケーター化合物には、エネルギー、医学および農業の分野におけるインジケーターとしての用途を含めて多数の用途が存在する。例えば、本発明のインジケーター化合物は、血液、血漿、血清、間質液、髄液、尿、唾液、眼内液、リンパ液、涙液または汗のような生理的緩衝液または同液体中のより低いレベルまたはより高いレベルのグルコースを検出するために用いることができ、かくして糖尿病および副腎機能不全症のような病気を診断またはモニターするのに価値のある情報を提供する。
【００３０】
ヒト治療用のグルコースの医学的／製薬学的製造にはモニターと制御が必要である。
農業における本発明の用途に、大豆、その他の農産物中のグルコースレベルを検出する用途がある。グルコースは、ワイン用ブドウのような価値の高い産物に決定的に重要な収穫期決定の際に注意深くモニターされなければならない。グルコースは発酵プロセスにおいて最も高価な炭素源および装入原料であるので、動力用アルコールの製造では最適の反応器供給速度制御のためにグルコースをモニターすることが重要である。国際的に最大量のグルコースおよび発酵性（ビシナルジオール）の糖を消費するソフトドリンクおよび発酵飲料の製造中における品質管理には、グルコース濃度の反応器混合および制御が決定的に重要である。
【００３１】
インジケーター化合物が蛍光性インジケーター置換基を含むとき、この技術分野では色々な検出技術も知られている。例えば、本発明の化合物は蛍光検知装置において使用することもできるし（例えば、米国特許第５，５１７，３１３号明細書）、あるいは目視検査用の試験紙のような高分子材料に結合させることもできる。この後者の技術は、例えば、グルコースの測定を、リトマス紙片を用いてｐＨを測定するのと類似した方法で可能にする。本明細書で説明される化合物は、また、Shimadzu、Hitachi、Jasco、Beckman、その他が製作する分光蛍光計または臨床分析装置のような標準のベンチトップ分析機器で単純試薬として使用することもできる。これらの分子は、また、Ocean Optics（Dunedin、Florida）またはOriel Opticsが製作する光ファイバーに基づくセンサーおよび分析蛍光計用の検体特異性化学的／光学的信号変換手段となる。
【００３２】
ここで参照することにより開示が本明細書に含まれる米国特許第５，５１７，３１３号明細書は、本発明の化合物を用いて液体媒体中のグルコースの存在または濃度を決定することができる蛍光検知装置について記載している。この検知装置は、蛍光インジケーター分子含有マトリックス（以後「蛍光性マトリックス」）の層状アレイ、高域フィルターおよび光検出器を含む。この装置において、光源、好ましくは発光ダイオード（“LED”）は、インジケーター材料内に、またはインジケーターマトリックスが配置されている導波管中に、光源からの入射光がインジケーター分子をして蛍光を発せしめるように少なくとも部分的に配置されている。高域フィルターは発せられた光を光検出器に到達できるようになし、同時に光源からの散乱入射光を濾過して取り除く。米国特許第５，５１７，３１３号明細書に記載される装置で用いられるインジケーター分子の蛍光は、グルコースの局部的存在によって変調、例えば減衰または増強せしめられる。
【００３３】
米国特許第５，５１７，３１３号明細書に記載されるセンサーにおいて、インジケーター分子を含んでいる材料は検体透過性である。従って、検体は周囲の試験媒体からその材料の中に拡散することができ、それによってインジケーター化合物によって発せられる蛍光に影響が及ぼされる。光源、インジケーター化合物含有材料、高域フィルターおよび光検出器は、インジケーター化合物によって発せられる蛍光の少なくとも一部分が光検出器に突き当たり、周囲の媒体中におけるグルコースの濃度を示す電気信号を発生させるように配置されている。
【００３４】
本発明のインジケーター化合物を使用するための他の可能な態様に従い、検知装置もここで参照することにより全てが本明細書に含まれる米国特許第５，９１０，６６１号、同第５，９１７，６０５号および同第５，８９４，３５１号明細書に記載されている。
【００３５】
本発明の化合物は、また、例えば生体内で血中グルコースレベルを連続的にモニターする移植可能装置で用いることもできる。適した装置は、例えば、ここで参照することにより全てが本明細書に含まれる１９９９年８月２６日に出願された出願中の米国特許出願第０９／３８３，１４８号明細書、並びに米国特許第５，８３３，６０３号、同第６，００２，９５４号および同第６，０１１，９８４号明細書に記載されている。
【００３６】
本発明の化合物は、この技術分野の当業者であれば、過度の実験をすることなく、例えば以下において説明される一般的手法と一致する反応機構を含めて公知の反応機構および試薬を容易に用いて製造することができる。
【００３７】
実施例１
アントラセン誘導体とMAPTACとの水溶性共重合体
Ｉ．水溶性重合体中に共重合されたモノ−ボロネート−アントラセンインジケーターの合成
Ａ．９−［３−（メタクリルアミド）プロピルアミノ］メチルアントラセン
Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド塩酸塩（１１．８２ｇ、６６．０ミリモル、３．０当量）およびDBMP（禁止剤として１０ｍｇ）の２５０ｍＬのCHCl3中における０℃の懸濁液に、DIEA（１８．５ｇ、２５．０ｍＬ、１４４ミリモル、６．５当量）を２０分の期間にわたって滴下した。この混合物を５℃まで加温し、次いで０℃まで再冷却した。この冷却された混合物に、９−クロロメチルアントラセン（５．０ｇ、２２ミリモル）のCHCl3（１００ｍＬ）中溶液を１時間の期間にわたって滴下した。続いて、この混合物を２５℃において１時間、５０℃において１２時間、次いで７０℃において２時間攪拌した。この時点で、この混合物を４ｘ６０ｍＬずつの水で洗浄し、そしてその合わされた水性層をCH2Cl2で抽出した。その合わされた有機抽出物を無水のNa2SO4上で乾燥し、デカントし、そして真空中で濃縮した。その粗製物質をシリカゲルクロマトグラフィー（フラッシュシリカゲル、２−５％CH3OH／CH2Cl2）で精製して２．４４ｇ（３３％）の固体生成物をもたらした。
TLC：Merckシリカゲル６０プレート、Ｒｆ：９０／１０のCH2Cl2／CH3OHで０．３９、ＵＶ（２５４／３６６）、ニンヒドリン染色で確認。
【００３８】
Ｂ．９−［Ｎ−［２−（５，５−ジメチルボリナン−２−イル）ベンジル］−Ｎ−［３−（メタクリルアミド）プロピルアミノ］メチルアントラセン
９−［３−（メタクリルアミド）プロピルアミノ］メチルアントラセン（２．４４ｇ、７．３４ミリモル）およびDBMP（禁止剤として１０ｍｇ）の２００ｍＬのCHCl3中における０℃の溶液に、DIEA（２．８５ｇ、３．８４ｍＬ、２２．０ミリモル、３．０当量）を一部ずつ１０分の期間にわたって加え、続いて（２−ブロモメチルフェニル）ボロン酸ネオペンチルエステル（２．４９ｇ、８．８１ミリモル、１．２当量）を３０分の期間にわたって滴下した。続いてこの混合物を２５℃において２０時間攪拌した。この時点で、この混合物を水で洗浄し、その合わされた水性層をCH2Cl2で抽出した。その合わされた有機抽出物を無水のNa2SO4上で乾燥し、デカントし、そして真空中で濃縮した。その粗製物質をシリカゲルクロマトグラフィー（フラッシュシリカゲル、２−５％のCH3OH／CH2Cl2）で精製して２．５０ｇ（７６％）の淡黄色の結晶性固体をもたらした。
Ｍｐ：７２−７３℃
TLC：Merckシリカゲル６０プレート、Ｒｆ：９０／１０のCH2Cl2／CH3OHで０．３６、ＵＶ（２５４／３６６）、ニンヒドリン染色で確認。
【００３９】
Ｃ．９−［Ｎ−［２−（５，５−ジメチルボリナン−２−イル）ベンジル］−Ｎ−［３−（メタクリルアミド）プロピルアミノ］メチルアントラセンとMAPTACとの水溶性共重合体（１：２０モル比）
９−［Ｎ−［２−（５，５−ジメチルボリナン−２−イル）ベンジル］−Ｎ−［３−（メタクリルアミド）プロピルアミノ］メチルアントラセン（０．０４９０ｇ、０．１０５ミリモル）と［３−（メタクリルアミド）プロピル］トリメチルアンモニウムクロリド（MAPTAC 、５０重量％水溶液、０．４８ｇ、０．９０ｍＬ、２．１ミリモル、２０当量）との１．５ｍＬのエチレングリコール中溶液に、４，４’−アゾビス（シアノ吉草酸（０．００８ｇ、０．０３ミリモル、総単量体の１．４モル％）を加えた。この溶液をアルゴンガスで５分間パージし、次いで暗所で６０℃まで昇温して１８時間加熱した。この時点で、この粘稠な溶液を２５℃まで冷却し、５ｍＬの水で希釈し、そして酢酸セルロース膜（MWCO３５００）を通して３ｘ４Ｌの水に対して透析した。この透析物質を乾燥状態まで濃縮して０．３３９ｇ（６８％）の黄色ガラス状固体をもたらした。
【００４０】
ＩＩ．グルコースおよびラクテートによる蛍光の変調
この実施例で製造された共重合体（単一の認識要素を含む）の蛍光のグルコースおよびラクテートによる変調を測定した。図１は、ａ）０−２０ｍＭのグルコース；ｂ）０−２０ｍＭのラクテートを含んでいるPBS中における上記共重合体（１：２０モル比）の０．５ｍｇ／ｍＬ溶液の正規化された蛍光発光（４２０ｎｍにおけるＩ／Ｉ0）を示す。スペクトルは、Shimadzu RF-5301スペクトル蛍光計を使用し、３６５ｎｍにおいて励起；励起スリット１．５ｎｍ；発光スリット５ｎｍ；周囲温度を用いて記録された。誤差バーは各データ点について二重値（duplicate values）による標準偏差である。この共重合体の蛍光はグルコースおよびラクテートの存在によって影響を受けた。
【００４１】
実施例２
水溶性重合体に共有結合されているビス−ボロネートインジケーターのグルコースおよび潜在的生理的妨害による変調
Ｉ．ビス−ボロネート−アントラセンインジケーターの単一メタクリレート単量体の合成
【００４２】
【化３】
Ａ．９，１０−ビス［［２−（２−ヒドロキシエトキシ）エチルアミノ］メチル］アントラセン
２−（２−アミノエトキシ）エタノール（３１．４ｇ、３０．０ｍＬ、２９９ミリモル、２０．９当量）の４０ｍＬのCHCl3中における２３℃の溶液に、９，１０−ビス（クロロメチル）アントラセン（３．９４ｇ、１４．３ミリモル）を加えた。この溶液を暗所で６７時間攪拌した。この時点で、１００ｍＬのCH2Cl2を加え、そして１ｘ５０ｍＬずつおよび２ｘ１００ｍＬずつのNaHCO3（飽和水溶液）で洗浄した。その有機抽出物を無水のNa2SO4上で乾燥し、濾過し、そして濃縮して４．６７ｇ（７９％）の黄色粉末をもたらした。生成物（RP-HPLCで〜８５％純粋）をそのまま次に続けた。
HPLC条件：HP 1100 HPLCクロマトグラフ、Vydac 201TP・１０ｘ２５０ｍｍカラム、０．１００ｍＬ注入、２ｍＬ／分、３７０ｎｍ検出、Ａ＝水（０．１％HFBA）およびＢ＝MeCN（０．１％HFBA）、勾配：１０％Ｂ・２分、１０−８０％Ｂ・１８分超、８０−１００％Ｂ・２分超、１００％Ｂ・２分、保持時間１５．６分。
【００４４】
【化４】
Ｂ．９，１０−ビス［Ｎ−［２−（５，５−ジメチルボリナン−２−イル）ベンジル］−Ｎ−［２−（２−ヒドロキシエトキシ）エチルアミノ］メチル］アントラセン
９，１０−ビス［［２−（２−ヒドロキシエトキシ）エチルアミノ］メチル］アントラセン（４．０２ｇ、９．７５ミリモル）、DIEA（１２．６ｇ、１７．０ｍＬ、９７．５ミリモル、１０．０当量）および（２−ブロモメチルフェニル）ボロン酸ネオペンチルエステル（１３．７ｇ、４８ミリモル、４．９当量）の１２５ｍＬのCHCl3中における２３℃の溶液を暗所で４６時間攪拌した。この時点で、この反応混合物を初めに回転蒸発により、次いで真空ポンプを用いて濃縮してDIEAを除去した。その残分をアルミナカラムクロマトグラフィー（１５０ｇの活性中性アルミナ、０−３％のCH3OH／CH2Cl2）で精製して、放置すると凝固する５．６７ｇ（７０％）の粘稠な油をもたらした。生成物（RP-HPLCで〜８５％純粋）をそのまま次に続けた。
TLC：Merck塩基性アルミナプレート、Ｒｆ：９５／５のCH2Cl2／CH3OHで０．３３、ＵＶ（２５４／３６６）で観察
HPLC条件：HP 1100 HPLCクロマトグラフ、Vydac 201TP・１０ｘ２５０ｍｍカラム、０．１００ｍＬ注入、２ｍＬ／分、３７０ｎｍ検出、Ａ＝水（０．１％HFBA）およびＢ＝MeCN（０．１％HFBA）、勾配：１０％Ｂ・２分、１０−８０％Ｂ・１８分超、８０−１００％Ｂ・２分超、１００％Ｂ・２分、保持時間１８．８分。
【００４６】
【化５】
Ｃ．９−［Ｎ−［２−（５，５−ジメチルボリナン−２−イル）ベンジル］−Ｎ−［２−（２−メタクロイルオキシエトキシ）エチルアミノ］メチル］−１０−［Ｎ−［２−（５，５−ジメチルボリナン−２−イル）ベンジル］−Ｎ−［２−（２−ヒドロキシエトキシ）エチルアミノ］メチル］アントラセン（単一メタクリレート単量体）
９，１０−ビス［Ｎ−［２−（５，５−ジメチルボリナン−２−イル）ベンジル］−Ｎ−［２−（２−ヒドロキシエトキシ）エチルアミノ］メチル］アントラセン（０．２９８ｇ、０．３５９ミリモル）、メタクリル酸（０．３０４ｇ、０．３００ｍＬ、３．５３ミリモル、９．８４当量）、DCC（０．９６５ｇ、４．６８ミリモル、１３．０当量）およびＮ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（０．０２０ｇ、０．１６ミリモル、０．４６当量）の１５ｍＬのCH2Cl2中における２３℃の溶液を暗所で４時間攪拌した。この時点で、この反応混合物を濾過し、そして回転蒸発により濃縮した。その残分をアルミナカラムクロマトグラフィー（５０ｇの活性中性アルミナ、０−４％のCH3OH／CH2Cl2）で精製して０．１５０ｇ（４７％）の黄色の固体をもたらした。
FAB MS：C52H66B2N2O9の計算値・[Ｍ]+８８５；実測値・[M+1]+８８６
TLC：Merck塩基性アルミナプレート、Ｒｆ：９５／５のCH2Cl2／CH3OHで０．４５、ＵＶ（２５４／３６６）で観察。
HPLC：HP 1100 HPLCクロマトグラフ、Vydac 201TP・１０ｘ２５０ｍｍカラム、０．１００ｍＬ注入、２ｍＬ／分、３７０ｎｍ検出、Ａ＝水（０．１％HFBA）およびＢ＝MeCN（０．１％HFBA）、勾配：１０％Ｂ・２分、１０−８０％Ｂ・１８分超、８０−１００％Ｂ・２分超、１００％Ｂ・２分、保持時間２１分。
【００４８】
Ｄ．９−［Ｎ−［２−（５，５−ジメチルボリナン−２−イル）ベンジル］−Ｎ−［２−（２−メタクロイルオキシエトキシ）エチルアミノ］メチル］−１０−［Ｎ−［２−（５，５−ジメチルボリナン−２−イル）ベンジル］−Ｎ−［２−（２−ヒドロキシエトキシ）エチルアミノ］メチル］アントラセンとTMAMAとの水溶性共重合体（モル比１：５０）
［２−（メタクリルオキシ）エチル］トリメチルアンモニウムクロリド（TMAMA 、７０重量％水溶液、単量体０．３４４ｇ、１．６６ミリモル、５０当量）の０．６００ｍＬの水中溶液に、９−［Ｎ−［２−（５，５−ジメチルボリナン−２−イル）ベンジル］−Ｎ−［２−（２−メタクロイルオキシエトキシ）エチルアミノ］メチル］−１０−［Ｎ−［２−（５，５−ジメチルボリナン−２−イル）ベンジル］−Ｎ−［２−（２−ヒドロキシエトキシ）エチルアミノ］メチル］アントラセン（０．００２４ｇ、０．００３３ミリモル）の３．００ｍＬのMeOH中溶液を加えた。この混合物に４，４’−アゾビス（４−シアノ吉草酸）（０．００７５ｇ、０．０２７ミリモル、総単量体の１．６モル％）を加えた。この溶液を０．４μの膜フィルターを通して濾過し、窒素ガスでパージし、次いで暗所で５５℃において１６時間加熱した。この時点で、その粘稠な溶液を２５℃まで冷却し、そして真空中で濃縮した。その残分を２０ｍＬの水で希釈し、そして０．２μの膜フィルターを通して濾過した。この重合体溶液を酢酸セルロース膜（MWCO３５００）を通して２ｘ４Ｌの水に対して透析した。この透析から３８．５ｍＬの重合体溶液が得られた。この溶液の一部分を乾燥状態になるまで濃縮すると、溶液１．０ｍＬ当たり重合体０．００７５ｇであることが示された。重合体の総収量０．２８９ｇ（７７％）。
【００４９】
ＩＩ．グルコース、ラクテートおよびアセトアセテートによる蛍光の変調
この実施例で製造された共重合体（２つの認識要素を含む）の蛍光のグルコース、ラクテートおよびアセトアセテートによる変調を測定した。図２は、ａ）０−２０ｍＭのグルコース；ｂ）０−２０ｍＭのラクテート；ｃ）０−２０ｍＬのリチウムアセトアセテートを含んでいるPBS中におけるアントラセン−ビス−ボロネート−TMAMA（１：５０モル比）共重合体の１．５ｍｇ／ｍＬ溶液の正規化された蛍光発光（４２８ｎｍにおけるＩ／Ｉ0）を示す。スペクトルはShimadzu RF-5301スペクトル蛍光計を使用し、３６５ｎｍにおいて励起；励起スリット１．５ｎｍ；発光スリット１．５ｎｍ；周囲温度を用いて記録された。共重合体の蛍光はグルコースの存在によって影響されたが、ラクテートまたはアセトアセテートの存在によっては影響されなかった。
【００５０】
実施例３
ビス−ボロネート−アントラセンインジケーターの蛍光に対するグルコースの用量応答効果に及ぼす溶解状態ラクテートの影響
【００５１】
【化６】
Ａ．９，１０−ビス［［２−（tert−ブトキシカルボニル）エチルアミノ］メチル］アントラセン
β−アラニン tert−ブチルエステル塩酸塩（３．０６ｇ、１６．８ミリモル、５．０９当量）、DIEA（４．２７ｇ、５．７５ｍＬ、３３．０ミリモル、１０．００当量）および９，１０−ビス（クロロメチル）アントラセン（０．９１０ｇ、３．３１ミリモル）の７５ｍＬのCHCl3中における２３℃の溶液を暗所で９３時間攪拌した。この時点で、この溶液を濾過し、そして１ｘ４０ｍＬずつおよび２ｘ６０ｍＬずつのNaHCO3（飽和水溶液）で洗浄した。その有機抽出物を無水のNa2SO4上で乾燥し、濾過し、そして濃縮して粗製の黄色固体をもたらした。その残分をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（３０ｇのグラビティー等級（gravity grade）ゲル、０−３％のCH3OH／CH2Cl2）で精製して１．０６ｇ（６５％）の粘稠な黄色−橙色生成物をもたらした。生成物をそのまま次に続けた。
TLC：Merckシリカゲル６０プレート、Ｒｆ：９５／５のCH2Cl2／CH3OHで０．３３、ＵＶ（２５４／３６６）で観察。
【００５３】
【化７】
Ｂ．９，１０−ビス［Ｎ−［２−（５，５−ジメチルボリナン−２−イル）ベンジル］−Ｎ−［２−（tert−ブトキシカルボニル）エチルアミノ］メチル］アントラセン
９，１０−ビス［［２−（tert−ブトキシカルボニル）エチルアミノ］メチル］アントラセン（１．６０ｇ、３．２５ミリモル）、DIEA（４．４５ｇ、６．００ｍＬ、３４．４ミリモル、１０．６当量）および（２−ブロモメチルフェニル）ボロン酸ネオペンチルエステル（４．８０ｇ、１７．０ミリモル、５．２２当量）の３０ｍＬのCHCl3中における２３℃の溶液を暗所で４．５日間攪拌した。この時点で、この混合物に４５ｍＬのCHCl3を加え、この混合物を２ｘ２５ｍＬずつのNaHCO3（飽和水溶液）で洗浄した。その有機抽出物を無水のNa2SO4上で乾燥し、濾過し、そして濃縮して粗製の赤味を帯びた油状物を得た。その残分をアルミナカラムクロマトグラフィー（１００ｇの活性中性アルミナ、０−３％のCH3OH／CH2Cl2）で精製して〜３．５ｇの橙色固体をもたらした。この生成物を溶解し、続いて白色沈殿（DIEA-HBr塩）を形成させた。この溶液を濾過し、その濾液を濃縮して２．７２ｇ（９３％）の橙色固体をもたらした。生成物（RP-HPLCで＞８０％純粋）をそのまま次に続けた。
TLC：Merck塩基性アルミナプレート、Ｒｆ：９５／５のCH2Cl2／CH3OHで０．６６、ＵＶ（２５４／３６６）で観察
HPLC条件：HP 1100 HPLCクロマトグラフ、Vydac 201TP・１０ｘ２５０ｍｍカラム、０．１００ｍＬ注入、２ｍＬ／分、３７０ｎｍ検出、Ａ＝水（０．１％HFBA）およびＢ＝MeCN（０．１％HFBA）、勾配：１０％Ｂ・２分、１０−８０％Ｂ・１８分超、８０−１００％Ｂ・２分超、１００％Ｂ・２分、保持時間２３．９分。
【００５５】
【化８】
Ｃ．９，１０−ビス［Ｎ−（２−ボロノベンジル）−Ｎ−［３−（プロパノイル）アミノ］メチル］アントラセン
９，１０−ビス［Ｎ−［２−（５，５−ジメチルボリナン−２−イル）ベンジル］−Ｎ−［２−（tert−ブトキシカルボニル）エチルアミノ］メチル］アントラセン（０．５５６ｇ、０．６２０ミリモル）の５ｍＬの、２０％TFA／CH2Cl2中における２３℃の溶液を暗所で２５時間攪拌した。この時点で、その反応混合物をＮ2ガスの流れの下で濃縮した。その残分を３ｘ１０ｍＬずつのエーテルを用いて摩砕して粉末化した。その残留固体を真空中で乾燥して０．３５１ｇ（８７％）のふわふわした黄色粉末をもたらした。
FAB MS：グリセロールマトリックス；C42H46B2N2O10（ビスグリセロール付加物）の計算値・[Ｍ]+７６０；実測値・[M]+７６０
HPLC：HP 1100 HPLCクロマトグラフ、Waters・５ｘ１００ｍｍのNovaPac HR C18カラム、０．０２５ｍＬ注入、０．７５ｍＬ／分、１．５ｍＬ注入ループ、３６０ｎｍ検出、Ａ＝水（０．１％HFBA）およびＢ＝MeCN（０．１％HFBA）、勾配：１０％Ｂ・２分、１０−８０％Ｂ・１８分超、８０−１００％Ｂ・２分超、１００％Ｂ・２分、保持時間１６．７分。
【００５７】
Ｄ．グルコースおよびラクテートによる蛍光の変調
この実施例で製造されたインジケーター化合物（２つの認識要素を含む）の蛍光のグルコースおよびラクテートによる変調を測定した。図３は、ａ）０−１０ｍＭのグルコース、０ｍＭのラクテート；ｂ）０−１０ｍＭのグルコース、２ｍＭのラクテート；ｃ）０−１０ｍＭのグルコース、５ｍＭのラクテートを含んでいるPBS中におけるビス−カルボキシレート−ビス−ボロネートアントラセンインジケーターの７５μＭ溶液の蛍光（於４２８ｎｍ）を示す。スペクトルはShimadzu RF-5301スペクトル蛍光計を使用し、３６５ｎｍにおいて励起；励起スリット１．５ｎｍ；発光スリット１．５ｎｍ；周囲温度を用いて記録された。全ての点が三回測定され、この場合±１ＳＤ誤差バーが含まれていた。ラクテートの存在はグルコースによるインジケーターの蛍光変調に実質的に影響を及ぼさなかった。
【００５８】
実施例４
インジケーターがヒドロゲル中に共有結合で固定化されているときの、グルコース対ラクテートおよびアセトアセテートに対するビス−ボロネートグルコースインジケーターの選択性
Ｉ．二元（dual）−メタクリルアミド単量体の製造
【００５９】
【化９】
Ａ．９，１０−ビス［３−（メタクリルアミド）プロピルアミノ］メチルアントラセン
９，１０−ビス（クロロメチル）アントラセン（１．５ｇ、５．４５ミリモル）、DIEA（２８．１７ｇ、３８．００ｍＬ、２１８ミリモル、４０当量）、Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド塩酸塩（９．７６ｇ、５４．５ミリモル、１０．０当量）および〜５ｍｇのBHTの２００ｍＬのCHCl3中における２３℃の懸濁液を暗所で４０℃において４日間攪拌した。この時点で、その温度を４５℃まで上げ、その混合物を３日間以上攪拌した。この時点で沈殿が形成された。この混合物を濾過し、その固体生成物を最低量のCH2Cl2に溶解した。一晩で所望生成物のビス塩酸塩である黄色結晶性固体が生成した（３．１５ｇ、定量的）。
TLC：Merck塩基性アルミナプレート、Ｒｆ：９０／１０のCH2Cl2／CH3OHで０．３１、ＵＶ（２５４／３６６）で観察
HPLC：HP 1100 HPLCクロマトグラフ、Waters・５ｘ１００ｍｍのNovaPac HR C18カラム、０．１００ｍＬ注入、０．７５ｍＬ／分、３６０ｎｍ検出、Ａ＝水（０．１％HFBA）およびＢ＝MeCN（０．１％HFBA）、勾配：１０％Ｂ・２分、１０−８０％Ｂ・１８分超、８０−１００％Ｂ・２分超、１００％Ｂ・２分、保持時間１５．０分。
【００６１】
【化１０】
Ｂ．９，１０−ビス［Ｎ−［２−（５，５−ジメチルボリナン−２−イル）ベンジル］−Ｎ−［３−（メタクリルアミド）プロピルアミノ］メチルアントラセン（二元メタクリルアミド単量体）
９，１０−ビス［３−（メタクリルアミド）プロピルアミノ］メチルアントラセン（０．０６５０ｇ、遊離アミン１．３４ミリモル）、DIEA（０．６１２ｇ、０．８２５ｍＬ、４．７４ミリモル、３．５５当量）、（２−ブロモメチルフェニル）ボロン酸ネオペンチルエステル（１．３４ｇ、４．７４ミリモル、３．５５当量）およびBHT（禁止剤として５ｍｇ）の２０ｍＬのCHCl3中における２３℃の溶液を暗所で５日間攪拌した。この時点で、この反応混合物を真空中で濃縮し、その残分をアルミナクロマトグラフィー（２００ｇの活性中性アルミナ、０−２％のCH3OH／CH2Cl2）で精製して０．４６５ｇ（３９％）の非常に粘稠な黄色の油状物をもたらした。
TLC：Merck塩基性アルミナプレート、Ｒｆ：９０／１０のCH2Cl2／CH3OHで０．５９、ＵＶ（２５４／３６６）で観察
HPLC：HP 1100 HPLCクロマトグラフ、Waters・５ｘ１００ｍｍのNovaPac HR C18カラム、０．０５０ｍＬ注入、０．７５ｍＬ／分、３６０ｎｍ検出、Ａ＝水（０．１％HFBA）およびＢ＝MeCN（０．１％HFBA）、勾配：１０％Ｂ・２分、１０−８０％Ｂ・１８分超、８０−１００％Ｂ・２分超、１００％Ｂ・２分、保持時間１６．９分。
【００６３】
Ｃ．グルコースインジケーターを持つＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドヒドロゲルの製造
Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド（４０重量％）およびＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（０．８重量％）のエチレングリコール中溶液を調製した。９，１０−ビス［Ｎ−［２−（５，５−ジメチルボリナン−２−イル）ベンジル］−Ｎ−［３−（メタクリルアミド）プロピルアミノ］メチルアントラセン（１７．８ｍｇ、２ｘ１０−５モル）および４０μＬの過硫酸アンモニウム水溶液（５重量％）を、１ｍＬのエチレングリコール単量体溶液と合わせた。得られた溶液を、窒素でパージされたグローブボックスの中に入れた。この単量体配合物に、重合を加速するためにＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミンの水溶液（８０μＬ、５重量％）を加えた。得られた配合物を、顕微鏡スライドおよび１００ミクロンのステンレス鋼製スペーサーから組み立てられた型の中に注ぎ入れた。窒素雰囲気中に８時間保持しておいた後、その型をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）（PBS１０ｍＭ、ｐＨ＝７．４）の中に入れ、それら顕微鏡スライドを分離し、そしてそのヒドロゲルを取り除いた。このヒドロゲルを、１ｍＭのラウリル硫酸ナトリウム塩および１ｍＭのEDTAナトリウム塩を含んでいる１００ｍＬのPBSで３日間洗浄した；この溶液は毎日替え、続いてDMF／PBS（容量で１０／９０、３ｘ１００ｍＬ）で、最後にPBS（ｐＨ＝７．４、３ｘ１００ｍＬ）で洗浄した。得られたヒドロゲル重合体を、０．２重量％のナトリウムアジドおよび１ｍＭのEDTAを含んでいるPBS（PBS１０ｍＭ、ｐＨ＝７．４）の中に貯蔵した。
【００６４】
ＩＩ．グルコース、ラクテートおよびアセトアセテートによる蛍光の変調
この実施例で製造されたインジケーター化合物（２つの認識要素を含む）の蛍光のグルコース、ラクテートおよびアセトアセテートによる変調を測定した。図４は、色々な量のナトリウム−Ｌ−ラクテート、リチウムアセトアセテートまたはα−Ｄ−グルコースを含んでいる、０．２％のNaN3および１ｍＭのEDTAを有する１０ｍＭのPBS（ｐＨ＝７．４）中におけるこの実施例のグルコース認識分子を含んでいるヒドロゲルの正規化蛍光発光（４２７ｎｍにおけるＩ／Ｉ0）を示す。データは、Shimadzu RF-5301スペクトル蛍光計を使用し、温度制御試料ホルダーを用いて低感度、３７℃において、３６５ｎｍにおいて励起（スリット＝３ｎｍ）および発光４２７ｎｍ（スリット＝３ｎｍ）を用いて記録した。３ｍＬの所望溶液が入っているキュベットを測定前に３７℃において１５分間平衡化させた。各ヒドロゲルは４つの独立した試料中で測定した。誤差バーは各データ点について四重値（quadruplicate values）による標準偏差である。グルコース認識分子を含むヒドロゲルは前に説明したように製造された。これらヒドロゲルをガラススライドの上に載せ、そしてPMMAキュベット中のポリエステルメッシュで入射光に対して４５°の角度でカバーした。ナトリウム Ｌ−ラクテート［Aldrich］１、５、１０および２０ｍＭ、リチウムアセトアセテート［Aldrich］５、１０および２０ｍＭおよびα−Ｄ−グルコース１、２、４、５、１０および２０ｍＭの、０．２％のNaN3および１ｍＭのEDTAを含んでいるｐＨ７．４の１０ｍＭのPBS中における溶液を調製した。上記共重合体の蛍光はグルコース存在によって影響されたが、ラクテートまたはアセトアセテートの存在によっては影響されなかった。
【００６５】
実施例５
ビス−ボロネート認識および近接消光信号発生を利用するラクテートに対するグルコースの選択性
Ａ．Ｎ−（２，２−ジエトキシエチル）−４−ブロモ−１，８−ナフタルイミド
４−ブロモ−１，８−ナフタル酸無水物（１０．０ｇ、３６．１ミリモル）およびアミノアセトアルデヒドジエチルアセタール（４．８１ｇ、５．２６ｍＬ、３６．１ミリモル、１当量）の４５ｍＬのEtOH中懸濁液を４５℃において３日間攪拌した。この時点で、得られた懸濁液を濾過し、EtOHで洗浄し、その残分を乾燥して１３．３ｇ（９４％）の淡褐色の固体生成物をもたらした。
TLC：Merckシリカゲル６０プレート、Ｒｆ：９８／２のCH2Cl2／CH3OHで０．１７、ＵＶ（２５４／３６６）で観察
HPLC：HP 1100 HPLCクロマトグラフ、Waters・５ｘ１００ｍｍのNovaPac HR C18カラム、０．０５０ｍＬ注入、０．７５ｍＬ／分、１．５ｍＬ注入ループ、３６０ｎｍ検出、Ａ＝水（０．１％HFBA）およびＢ＝MeCN（０．１％HFBA）、勾配：１０％Ｂ・２分、１０−８０％Ｂ・１８分超、８０−１００％Ｂ・２分超、１００％Ｂ・２分、保持時間２４．２分。
【００６６】
Ｂ．Ｎ−（２，２−ジエトキシエチル）−４−ブチルアミノ−１，８−ナフタルイミド
Ｎ−（２，２−ジエトキシエチル）−４−ブロモ−１，８−ナフタルイミド（０．７９７ｇ、２．０３ミリモル）およびｎ−ブチルアミン（１．４８ｇ、２．００ｍＬ、２０．２ミリモル、９．９６当量）の８ｍＬのNMP中溶液を４５℃で６６時間加熱した。この時点で、得られた懸濁液を２５℃まで放冷し、続いて濾過した。その残分を５０ｍＬのエーテルを用いて溶解させ、そして３ｘ５０ｍＬの水で抽出した。その有機抽出物を無水のNa2SO4上で乾燥し、濾過し、そして濃縮して粗製黄色粉末をもたらした。この粗製物質をシリカゲルクロマトグラフィー（２５ｇのグラビティー等級ゲル、０−１％のCH3OH／CH2Cl2）で精製して０．６３９ｇ（８２％）の黄色粉末をもたらした。
TLC：Merckシリカゲル６０プレート、Ｒｆ：９５／５のCH2Cl2／CH3OHで０．１７、ＵＶ（２５４／３６６）で観察
HPLC：HP 1100 HPLCクロマトグラフ、Waters・５ｘ１００ｍｍのNovaPac HR C18カラム、０．０５０ｍＬ注入、０．７５ｍＬ／分、１．５ｍＬ注入ループ、４５０ｎｍ検出、Ａ＝水（０．１％HFBA）およびＢ＝MeCN（０．１％HFBA）、勾配：１０％Ｂ・２分、１０−８０％Ｂ・１８分超、８０−１００％Ｂ・２分超、１００％Ｂ・２分、保持時間２３．５分。
【００６７】
Ｃ．Ｎ−（２−オキソエチル）−４−ブチルアミノ−１，８−ナフタルイミド
Ｎ−（２，２−ジエトキシエチル）−４−ブチルアミノ−１，８−ナフタルイミド（０．６２２ｇ、１．６２ミリモル）およびｐ−トルエンスルホン酸一水和物（０．０１０ｇ、０．０５３ミリモル、０．０３２当量）の２５ｍＬのアセトン中溶液を２５℃で１８時間攪拌した。この時点で、この溶液を濃縮し、その残分をシリカゲルクロマトグラフィー（２５ｇのグラビティー等級ゲル、０−１％のCH3OH／CH2Cl2）で精製して０．４７０ｇ（９４％）の橙色固体をもたらした。
TLC：Merckシリカゲル６０プレート、Ｒｆ：９５／５のCH2Cl2／CH3OHで０．６１、ＵＶ（２５４／３６６）で観察
1H NMR（４００MHZ、CDCl3）；δ１．０３（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ）、１．５３（ｍ，２Ｈ）、１．７８（ｍ，２Ｈ）、３．３８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ）、５．０２（ｓ，２Ｈ）、６．６４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．６Ｈｚ）、７．５２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．４，８．３Ｈｚ）、８．０８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１Ｈｚ，８．５Ｈｚ）、８．３８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．３Ｈｚ）、８．６４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．０，７．３Ｈｚ）、９．７５（ｓ，１Ｈ）
HPLC：HP 1100 HPLCクロマトグラフ、Waters・５ｘ１００ｍｍのNovaPac HR C18カラム、０．０５０ｍＬ注入、０．７５ｍＬ／分、１．５ｍＬ注入ループ、４５０ｎｍ検出、Ａ＝水（０．１％HFBA）およびＢ＝MeCN（０．１％HFBA）、勾配：１０％Ｂ・２分、１０−８０％Ｂ・１８分超、８０−１００％Ｂ・２分超、１００％Ｂ・２分、保持時間１９．６分。
【００６８】
Ｄ．Ｎ−（４−ジメチルアミノベンジル）−１，６−ジアミノヘキサン
４−ジメチルアミノベンズアルデヒド（１．００ｇ、６．７０ミリモル）、Na2SO4（６．７０ｇ、４７．２ミリモル、７．０４当量）および１，６−ジアミノヘキサン（３．８９ｇ、３３．５ミリモル、５．００当量）の２０ｍＬの無水EtOH中懸濁液を、暗所において、窒素ガス雰囲気下で、２５℃において１８時間攪拌した。この時点で、この溶液を濾過し、その濾液にNaBH4（１．７３ｇ、４５．８ミリモル、６．８４当量）を加えた。この懸濁液を２５℃において５時間攪拌した。この時点で、この反応混合物を濃縮し、その残分を５０ｍＬの水に溶解し、そして３ｘ５０ｍＬのエーテルで抽出した。その合わせた有機抽出物を２ｘ５０ｍＬの水で洗浄した。その合わせた水性抽出物を２ｘ５０ｍＬのエーテルで抽出した。その合わせた有機抽出物をNa2SO4上で乾燥し、濾過し、そして濃縮して１．３５ｇ（８１％）の粘稠な油状物をもたらした。
TLC：Merckシリカゲル６０プレート、Ｒｆ：８０／１５／５のCH2Cl2／CH3OH／iPrNH2で０．５８、ニンヒドリン染色、ＵＶ（２５４／３６６）で観察
HPLC：HP 1100 HPLCクロマトグラフ、Waters・５ｘ１００ｍｍのNovaPac HR C18カラム、０．０５０ｍＬ注入、０．７５ｍＬ／分、１．５ｍＬ注入ループ、２８０ｎｍ検出、Ａ＝水（０．１％HFBA）およびＢ＝MeCN（０．１％HFBA）、勾配：１０％Ｂ・２分、１０−８０％Ｂ・１８分超、８０−１００％Ｂ・２分超、１００％Ｂ・２分、保持時間１３．３分。
【００６９】
Ｅ．Ｎ−２−［５−（Ｎ−４−ジメチルアミノベンジル）アミノヘキシル］アミノエチル）−４−ブチルアミノ−１，８−ナフタルイミド
Ｎ−（２−オキソエチル）−４−ブチルアミノ−１，８−ナフタルイミド（０．３４６ｇ、１．１１ミリモル）の２５ｍＬの無水MeOH中懸濁液に、Ｎ−（４−ジメチルアミノベンジル）−１，６−ジアミノヘキサン（０．５５４ｇ、２．２２ミリモル、２．００当量）および酢酸（０．０６７ｇ、１．１ミリモル、１．０当量）の２０ｍＬの無水MeOH中溶液を加えた。この混合物にNaCNBH3（０．０７０ｇ、１．１ミリモル、１．０当量）の５ｍＬの無水MeOH中溶液を加えた。この反応混合物を２５℃において１５時間攪拌した。この時点で、そのMeOHを回転蒸発により除去し、その残分を３０ｍＬの水に溶解した。この溶液を１Ｎ HClでｐＨ２に調整し、次いで２５℃において１時間攪拌した。この時点で、この溶液を１Ｎ NaOHでｐＨ１２に調整し、続いて３ｘ５０ｍＬのCH2Cl2で抽出した。その合わせた有機抽出物を３ｘ５０ｍＬの水で洗浄し、無水のNa2SO4上で乾燥し、濾過し、そして濃縮して粗製の褐色の油状物をもたらした。この粗製物質をシリカゲルクロマトグラフィー（３５ｇのフラッシュ等級ゲル、０−５０％のCH3OH／CH2Cl2、次いで４５／５０／５のCH3OH／CH2Cl2／iPrNH2）で精製して０．１９０ｇ（３２％）のジアミン生成物をもたらした。
FAB MS：C33H45N5O2の計算値・[M]+５４４；実測値・[M]+５４４
TLC：Merckシリカゲル６０プレート、Ｒｆ：８０／２０のCH2Cl2／CH3OHで０．４２、ニンヒドリン染色およびＵＶ（２５４／３６６）で観察
HPLC：HP 1100 HPLCクロマトグラフ、Waters・５ｘ１００ｍｍのNovaPac HR C18カラム、０．０５０ｍＬ注入、０．７５ｍＬ／分、１．５ｍＬ注入ループ、４５０ｎｍ検出、Ａ＝水（０．１％HFBA）およびＢ＝MeCN（０．１％HFBA）、勾配：１０％Ｂ・２分、１０−８０％Ｂ・１８分超、８０−１００％Ｂ・２分超、１００％Ｂ・２分、保持時間１７．６分。
【００７０】
Ｆ．Ｎ−２−［５−（Ｎ−４−ジメチルアミノベンジル）−５−［２−（５，５−ジメチルボリナン−２−イル）ベンジル］アミノヘキシル］−［２−（５，５−ジメチルボリナン−２−イル）ベンジル］アミノエチル−４−ブチルアミノ−１，８−ナフタルイミド
Ｎ−２−［５−（Ｎ−４−ジメチルアミノベンジル）アミノヘキシル］アミノエチル）−４−ブチルアミノ−１，８−ナフタルイミド（０．１５０ｇ、０．２７６ミリモル）およびDIEA（０．３５５ｇ、０．４７８ｍＬ、２．８１ミリモル、１０．０当量）の５ｍＬのCHCl3中溶液に、（２−ブロモメチルフェニル）ボロン酸ネオペンチルエステル（０．３９０ｇ、１．３８ミリモル、５．００当量）の２ｍＬのCHCl3中溶液を加えた。この溶液を続いて２５℃において２７時間攪拌した。この時点で、この混合物を濃縮し、その残分をアルミナカラムクロマトグラフィー（１００ｇの活性中性アルミナ、１−５％のCH3OH／CH2Cl2）で精製して０．０２４ｇ（１９％）の粘稠な褐色の油状物をもたらした。
FAB MS（グリセロールマトリックス）：C53H67B2N5O8の計算値・[M]+９２４（ボロン酸のビスネオペンチルエステルの代わりにビスグリセロール付加物）；実測値・[M]+９２４
TLC：Merck中性アルミナプレート、Ｒｆ：８０／２０のCH2Cl2／CH3OHで０．６２、ＵＶ（２５４／３６６）で観察
HPLC：HP 1100 HPLCクロマトグラフ、Waters・５ｘ１００ｍｍのNovaPac HR C18カラム、０．０５０ｍＬ注入、０．７５ｍＬ／分、１．５ｍＬ注入ループ、４５０ｎｍ検出、Ａ＝水（０．１％HFBA）およびＢ＝MeCN（０．１％HFBA）、勾配：１０％Ｂ・２分、１０−８０％Ｂ・１８分超、８０−１００％Ｂ・２分超、１００％Ｂ・２分、保持時間２０．７分。
【００７１】
Ｇ．Ｎ−２−［５−（Ｎ−４−ジメチルアミノベンジル）−５−［２−（ボロノ）ベンジル］アミノヘキシル］−［２−（ボロノ）ベンジル］アミノエチル−４−ブチルアミノ−１，８−ナフタルイミド（nBuF−ヘキサ−Ｑ ビス−ボロネート）
グルコースの研究で使用される遊離のビスボロン酸生成物は、MeOH／PBS緩衝系中へのＮ−２−［５−（Ｎ−４−ジメチルアミノベンジル）−５−［２−（５，５−ジメチルボリナン−２−イル）ベンジル］アミノヘキシル］−［２−（５，５−ジメチルボリナン−２−イル）ベンジル］アミノエチル−４−ブチルアミノ−１，８−ナフタルイミドの溶解の結果として生ずる。
【００７２】
Ｈ．グルコースおよびラクテートによる蛍光の変調
この実施例で製造されたインジケーター化合物（２つの認識要素を含む）の蛍光のグルコースおよびラクテートによる変調を測定した。図５は、ａ）０−２０ｍＭのグルコース；ｂ）０−２０ｍＭのラクテートを含んでいる７０／３０のMeOH／PBS中におけるインジケーター化合物の０．０１５ｍＭ溶液の正規化蛍光発光（５３５ｎｍにおけるＩ／Ｉ0）を示す。スペクトルはShimadzu RF-5301スペクトル蛍光計を使用し、４５０ｎｍにおいて励起；励起スリット１．５ｎｍ；発光スリット１．５ｎｍ；周囲温度を用いて記録された。誤差バーは各データ点について三重値（triplicate values）による標準偏差である。インジケーターの蛍光はグルコースの存在によって影響されたが、ラクテートの存在によっては実質的に影響されなかった。
【００７３】
実施例６
Ｎ−［３−（メタクリルアミド）プロピル］−３，４−ジヒドロキシ−９，１０−ジオキソ−２−アントラセンスルホンアミド（アリザリンレッドＳ単量体）およびα，α’−ビス［Ｎ−［２−（５，５−ジメチルボリナン−２−イル）ベンジル］−Ｎ−［３−（メタクリルアミド）プロピルアミノ］−１，４−キシレン（ビスボロン酸単量体）を含むアクリルアミドゲルに及ぼすグルコースまたはラクテートの影響
Ａ．３，４−ジヒドロキシ−９，１０−ジオキソ−２−アントラセンスルホニルクロリド
３，４−ジヒドロキシ−９，１０−ジオキソ−２−アントラセンスルホン酸ナトリウム塩（１．４ｇ、３．９ミリモル）を３０ｍＬのクロロスルホン酸と合わせ、そして９０℃に昇温して５時間加熱し、その後にその溶液を０℃まで冷却し、そして１００ｇの氷の中に注ぎ入れた。氷が溶けた後、その溶液をCH2Cl2（３ｘ１００ｍＬ）で抽出し、塩化メチレン抽出物を合わせ、Na2SO4で乾燥し、そして蒸発させて０．８７ｇの固体を生成させた（収率６６％）。
【００７４】
Ｂ．Ｎ−［３−（メタクリルアミド）プロピル］−３，４−ジヒドロキシ−９，１０−ジオキソ−２−アントラセンスルホンアミド：
３，４−ジヒドロキシ−９，１０−ジオキソ−２−アントラセンスルホニルクロリド（９６ｍｇ、０．２８ミリモル）およびＮ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド塩酸塩（１０８ｍｇ、０．６ミリモル）を２０ｍＬのCH2Cl2と合わせた。この懸濁液にEt3N（３０３ｍｇ、３ミリモル）を加えた。この混合物を室温で２４時間攪拌し、濾過し、そして溶媒を蒸発させた。得られた固体を、溶離剤としてCH2Cl2／MeOH（９０／１０）を用いるSiO2（１０ｇ）上でのカラムクロマトグラフィーに付した。生成物は赤色固体（８０ｍｇ、収率６４％）として得られた。
FAB MS：C21H20N2O7Sの計算値・Ｍ+４４５；実測値・Ｍ+４４５
HPLC：HP 1100 HPLCクロマトグラフ、Waters・５ｘ１００ｍｍのNovaPac HR C18カラム、０．１００ｍＬ注入、０．７５ｍＬ／分、２ｍＬ注入ループ、３７０ｎｍ検出、Ａ＝水（０．１％HFBA）およびＢ＝MeCN（０．１％HFBA）、勾配：１０％Ｂ・２分、１０−８０％Ｂ・１８分超、８０−１００％Ｂ・２分超、１００％Ｂ・２分、保持時間１７．６７分。
【００７５】
Ｃ．α，α’−ビス［３−（メタクリルアミド）プロピルアミノ］−１，４−キシレン
Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド塩酸塩（３．００ｇ、１６．８ミリモル、２．２１当量）、DIEA（６．５ｇ、８．８ｍＬ、５０ミリモル、６．６当量）、テレフタルジカルボキサアルデヒド（１．０２ｇ、７．６０ミリモル）およびNa2SO4（１０．７ｇ、７５．３ミリモル、９．９１当量）の７５ｍＬの無水MeOH中溶液を、暗所で２５℃において１８時間攪拌した。この時点で、さらなるNa2SO4（１０．７ｇ、７５．３ミリモル、９．９１当量）を加え、そして攪拌を６時間以上続けた。この時点で、この溶液を濾過し、その濾液にNaBH4（１．７３ｇ、４５．７ミリモル、６．０１当量）を一部ずつ分けて加え、続いて２５℃において２１時間攪拌した。この懸濁液をセライトを通して濾過し、その濾液を濃縮した。その残分を１００ｍＬのCH2Cl2に溶解し、そして１ｘ２５ｍＬの飽和NaHCO3水溶液で洗浄した。その有機抽出物を無水Na2SO4上で乾燥し、濾過し、そして濃縮して粘稠な油をもたらした。この生成物そのまま次に続けた。
【００７６】
HPLC：HP 1100 HPLCクロマトグラフ、Vydac 201TP・１０ｘ２５０ｍｍカラム、０．１００ｍＬ注入、２．００ｍＬ／分、２６０ｎｍ検出、Ａ＝水（０．１％HFBA）およびＢ＝MeCN（０．１％HFBA）、勾配：１０％Ｂ・２分、１０−８０％Ｂ・１８分超、８０−１００％Ｂ・２分超、１００％Ｂ・２分、保持時間１５．８分。
【００７７】
Ｄ．α，α’−ビス［Ｎ−［２−（５，５−ジメチルボリナン−２−イル）ベンジル］−Ｎ−［３−（メタクリルアミド）プロピルアミノ］−１，４−キシレン
α，α’−ビス［３−（メタクリルアミド）プロピルアミノ］−１，４−キシレン（２．９４ｇ、７．６１ミリモル）、DIEA（２．９７ｇ、４．００ｍＬ、２３．０ミリモル、３．０２当量）、（２−ブロモメチルフェニル）ボロン酸ネオペンチルエステル（６．５０ｇ、２３．０ミリモル、３．０２当量）およびBHT（禁止剤として５ｍｇ）の７５ｍＬのCH2Cl2中における２５℃の溶液を暗所で２８時間攪拌した。この時点で、この混合物を１ｘ２５ｍＬの飽和NaHCO3水溶液で洗浄した。その有機抽出物を無水Na2SO4上で乾燥し、濾過し、そして濃縮した。その残分に２００ｍＬのエーテルを加え、その懸濁液を１８時間攪拌した。この懸濁液を濾過し、その残分をCH2Cl2に溶解し、濾過し、そしてその濾液を濃縮した。その固体残分に１５０ｍＬのエーテルを加え、その懸濁液を１８時間攪拌した。この時点で、この懸濁液を濾過して１．９８ｇ（３３％）のふわふわしたピンク色の粉末をもたらした。
FAB MS：C46H64B2N4O6の計算値・[Ｍ]+７９０；実測値・[Ｍ；１]+７９１
HPLC：HP 1100 HPLCクロマトグラフ、Waters・５ｘ１００ｍｍのNovaPak HR C18カラム、０．０５０ｍＬ注入、０．７５ｍＬ／分、２８０ｎｍ検出、Ａ＝水（０．１％HFBA）およびＢ＝MeCN（０．１％HFBA）、勾配：１０％Ｂ・２分、１０−８０％Ｂ・１８分超、８０−１００％Ｂ・２分超、１００％Ｂ・２分、保持時間１３．４分。
【００７８】
Ｅ．Ｎ−［３−（メタクリルアミド）プロピル］−３，４−ジヒドロキシ−９，１０−ジオキソ−２−アントラセンスルホンアミド（アリザリンレッドＳ単量体）およびα，α’−ビス［Ｎ−［２−（５，５−ジメチルボリナン−２−イル）ベンジル］−Ｎ−［３−（メタクリルアミド）プロピルアミノ］−１，４−キシレンを含むアクリルアミドゲルの製造
３０重量％のアクリルアミドおよび０．８重量％のＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドを含むエチレングリコール溶液を調製した。Ｎ−［３−（メタクリルアミド）プロピル］−３，４−ジヒドロキシ−９，１０−ジオキソ−２−アントラセンスルホンアミド（１．５ｍｇ、３．３８ｘ１０-6モル）およびα，α’−ビス［Ｎ−［２−（５，５−ジメチルボリナン−２−イル）ベンジル］−Ｎ−［３−（メタクリルアミド）プロピルアミノ］−１，４−キシレン（２８ｍｇ、３．５４ｘ１０-5モル）を、８００μＬのエチレングリコール単量体溶液および４０μＬの過硫酸アンモニウム５重量％水溶液と合わせた。この配合物を、窒素でパージされたグローブボックスの中にガラス製顕微鏡スライドおよび１００ミクロンのステンレス鋼製スペーサーから組み立てられた型と共に入れた。重合を加速するためにＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミンの水溶液（４０μＬ、５重量％）を加え、そして最終配合物をガラス製型の中に注ぎ入れた。その型を窒素雰囲気下で１６時間放置し、その後その配合物をPBS（ｐＨ＝７．４）の中に浸漬し、そしてそのガラススライドを分離してヒドロゲル重合体を薄膜の形で与えた。この得られたヒドロゲル薄膜を、１ｍＭのラウリル硫酸ナトリウム塩を含んでいる１００ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水で３日間洗浄した；この溶液は毎日替え、続いてMeOH／PBS（容量で２０／８０、３ｘ１００ｍＬ）で、最後にPBS（ｐＨ＝７．４、３ｘ１００ｍＬ）で洗浄した。ヒドロゲル重合体を、０．２重量％のナトリウムアジドおよび１ｍＭのEDTAナトリウム塩を含んでいるPBS（PBS１０ｍＭ、ｐＨ＝７．４）の中に貯蔵した。
【００７９】
Ｆ．グルコースおよびラクテートによる吸光度の変調
この実施例で製造されたインジケーターヒドロゲル（２つの認識要素を含む）の吸光度のグルコースおよびラクテートによる変調を測定した。上記アクリルアミドゲルを実施例４で説明したものと同じ方法でPMMAセルにはめ込んだ。所望の量のグルコースまたは乳酸ナトリウムを含んでいる、ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を水浴中で３７℃に加熱し、そしてゲルを含んでいる上記のPMMAセルの中に入れ、その後にそのPMMAセルを３７℃で１５分間平衡化させた。各グルコースまたはラクテート濃度の吸光度測定を３回行った。各測定で、ブランクとして６５０ｎｍでの吸光度を用い、Ａ（６５０ｎｍ）をＡ（４５０ｎｍ）およびＡ（５３０ｎｍ）の全ての値から差し引いた。
【００８０】
図６は、４ｍＭのアリザリンレッドＳ単量体および４４ｍＭのビスボロン酸単量体を含んでいる、グルコース有りおよびグルコース無しのアクリルアミドゲル（３０％）の吸光スペクトルを示す。図７は、４ｍＭのアリザリンレッドＳ単量体および４４ｍＭのビスボロン酸単量体を含んでいるアクリルアミドゲル（３０％）の吸光度に及ぼすグルコースの影響を示す。図８は、４ｍＭのアリザリンレッドＳ単量体および４４ｍＭのビスボロン酸単量体を含んでいるアクリルアミドゲル（３０％）の吸光度に及ぼす乳酸ナトリウムの影響を示す。インジケーターの吸光度はグルコースの存在によって影響されたが、ラクテートの存在によっては実質的に影響されなかった。
【００８１】
Ｇ．グルコースおよびラクテートによる蛍光の変調
この実施例６に実質的に従って合成した（但し、１．９ｍｇのＮ−［３−（メタクリルアミド）プロピル］−３，４−ジヒドロキシ−９，１０−ジオキソ−２−アントラセンスルホンアミドおよび３５ｍｇのα，α’−ビス［Ｎ−［２−（５，５−ジメチルボリナン−２−イル）ベンジル］−Ｎ−［３−（メタクリルアミド）プロピルアミノ］−１，４−キシレンが用いられた）アクリルアミドゲルの蛍光の変調を測定した。
【００８２】
実験は、可変温度付属装置を備えたShimadzu RF-5301 PCスペクトル蛍光計（励起、於４７０ｎｍ；スリット３／１０ｎｍ；高感度）で行われた。アクリルアミドゲルを、PMMA蛍光セル中に４５°の角度で接着されている１枚のガラススライドに取り付けた。そのセルを２．５ｍＬのPBS（ｐＨ＝７．４）で満たし、そして３７℃に加熱した。グルコース（１００ｍＭおよび５００ｍＭ）のPBS（ｐＨ＝７．４）中原液を調製し、そして水浴中で３７℃に加熱した。加熱グルコース原液のアリコートをPMMAセルに周期的に加え、その間５５０ｎｍにおける蛍光強度を時間の関数としてモニターした（２分毎に１回測定）。PMMAセル中のグルコース濃度は、YSIモデル２３００STATと、さらにはグルコース分析器を用いて測定した。図９に示される結果は、グルコースの添加はインジケーターヒドロゲルの蛍光強度を低下させることを示している。同じ影響が図１０でも見られ、それは同タイプのゲルの蛍光スペクトルに及ぼすグルコースの影響を示している。
【００８３】
その影響は次の理由のために起こると考えられる。アリザリンレッドＳ（レポーター分子）のメタクリルアミド単量体はビシナルジオール官能基および単量体官能基を含んでいる（以下の構造を参照されたい）。水溶液中および有機溶媒中では、アリザリンレッドＳ単量体およびビス−ボロネート認識要素単量体（以下の構造を参照されたい）は、互いに可逆反応をしてボロネートエステルを形成することができる。この可逆反応において形成されるボロネートエステル分子は蛍光性であり、一方アリザリンレッドＳ単量体は、それ自身では、水溶液中およびMeOHのような有機溶媒中で蛍光発光を事実上示さない。かくして、アリザリンレッドＳは、グルコース認識要素に結合すると、例えば吸光度および蛍光の量子収率のようなその光学的性質を変える。
【００８４】
【化１１】
単量体官能価を有するアリザリンレッドＳおよび単量体官能価を有するグルコース認識要素の溶液は、ヒドロゲル単量体および架橋剤と共に製造することができる。この混合物の共重合は、色々な小サイズおよび中サイズの分子へと拡散できるヒドロゲル物質を生成させ；かくして検体の検出および定量をすることが可能である。例えばグルコースのような検体はヒドロゲルマトリックスの内部に拡散し、そして認識要素に予め結合されているレポーター分子を置換する。このことはヒドロゲル膜の光学的性質に変化を引き起こす；それが今や認識要素に結合していないより多くの数のレポーター分子を含んでいるからである。
【００８６】
この実施例で製造されたインジケーター化合物（２つの認識要素を含む）の蛍光のグルコースおよびラクテートによる変調も測定した。この実験は、可変温度付属装置を備えるShimadzu RF-5301 PCスペクトル蛍光計（励起、於４７０ｎｍ；スリット５／１０ｎｍ；低感度）で行われた。アクリルアミドゲルを、PMMA蛍光セル中に４５°の角度で接着されている１枚のガラススライドに取り付けた。そのセルを２．５ｍＬのPBS（ｐＨ＝７．４）で満たし、そして水浴中で３７℃に加熱した。PBS（ｐＨ＝７．４）中のナトリウムラクテート（１００ｍＭ）原液を調製し、そして水浴中で３７℃に加熱した。PBS（ｐＨ＝７．４）中のグルコース（１００ｍＭおよび５００ｍＭ）の原液を調製し、そして水浴中で３７℃に加熱した。加熱ラクテート原液のアリコートをPMMAセルに周期的に加え、その間５５０ｎｍにおける蛍光強度をラクテート濃度が８ｍＭに達するまで時間の関数としてモニターした（２分毎に１回測定）。次いで、加熱グルコース原液のアリコートをPMMAセルに周期的に加え、その間５５０ｎｍにおける蛍光強度を時間の関数としてモニターした（２分毎に１回測定）。PMMAセル中のグルコース濃度は、YSIモデル２３００STATと、さらにはグルコース分析器を用いて測定した。図１１に示される結果は、ラクテートの添加はインジケーターヒドロゲルの蛍光強度に有意の影響を及ぼさず、そしてその後のグルコースの添加がインジケーターヒドロゲルの蛍光強度を低下させたことを示している。
【００８７】
実施例７
ビス−ボロネート−アントラセンの単一メタクリルアミド単量体
【００８８】
【化１２】
Ａ．９−クロロメチル−１０−［［２−（２−ヒドロキシエトキシ）エチルアミノ］メチル］アントラセン塩酸塩
９，１０−ビス（クロロメチル）アントラセン（５．１８ｇ、１８．８ミリモル、３．９９当量）の２００ｍＬのNMP中懸濁液に、２−（２−アミノエトキシ）エタノール（０．４９５ｇ、０．４７５ｍＬ、４．７１ミリモル）を加えた。この混合物を暗所で１７時間攪拌した。この時点で、この反応混合物を真空下において５０℃で〜５０ｍＬになるまで濃縮した。その残分をシリカゲルクロマトグラフィー（１５０ｇのグラビティー等級シリカゲル、０−１０％のCH3OH／CH2Cl2）で精製して０．４２５ｇ（２８％）の黄色／橙色の固体をもたらした。
TLC：Merckシリカゲル６０プレート、Ｒｆ：７０／３０のCH2Cl2／CH3OHで０．７２、ＵＶ（２５４／３６６）、ニンヒドリン染色で確認
HPLC：HP 1100 HPLCクロマトグラフ、Vydac 201TP・１０ｘ２５０ｍｍカラム、０．１００ｍＬ注入、２ｍＬ／分、３７０ｎｍ検出、Ａ＝水（０．１％HFBA）およびＢ＝MeCN（０．１％HFBA）、勾配：１０％Ｂ・２分、１０−８０％Ｂ・１８分超、８０−１００％Ｂ・２分超、１００％Ｂ・２分、保持時間１６．１分。
【００９０】
【化１３】
Ｂ．９−［［２−（２−ヒドロキシエトキシ）エチルアミノ］メチル］−１０−［［（３−メタクリルアミド）プロピルアミノ］メチル］アントラセン
Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド塩酸塩（３．０８ｇ、１７．２ミリモル、４．２当量）、DIEA（５．１９ｇ、７．００ｍＬ、４０．１ミリモル、９．８当量）およびBHT（〜３ｍｇ）の１２５ｍＬのCHCl3中における２３℃の懸濁液に、９−クロロメチル−１０−［［２−（２−ヒドロキシエトキシ）エチルアミノ］メチル］アントラセン塩酸塩（１．５６ｇ、４．１０ミリモル）の２５ｍＬのCHCl3中溶液を滴下した。この混合物を次に暗所で９２時間攪拌した。この時点で、この反応混合物を濾過し、そして２ｘ４０ｍＬのNaHCO3（飽和水溶液）で洗浄した。その有機抽出物を無水Na2SO4上で乾燥し、濾過し、そして濃縮して粘着性の橙色固体をもたらし、これをアルミナクロマトグラフィー（５０ｇの活性中性アルミナ、０−５％のCH3OH／CH2Cl2）で精製して０．３６４ｇ（２０％）の橙色の固体をもたらした。
TLC：Merckシリカゲル６０プレート、Ｒｆ：７０／３０のCH2Cl2／CH3OHで０．１６、ＵＶ（２５４／３６６）、ニンヒドリン染色で確認
HPLC：HP 1100 HPLCクロマトグラフ、Vydac 201TP・１０ｘ２５０ｍｍカラム、０．１００ｍＬ注入、２ｍＬ／分、３７０ｎｍ検出、Ａ＝水（０．１％HFBA）およびＢ＝MeCN（０．１％HFBA）、勾配：１０％Ｂ・２分、１０−８０％Ｂ・１８分超、８０−１００％Ｂ・２分超、１００％Ｂ・２分、保持時間１６．８５分。
【００９２】
【化１４】
Ｃ．９−［Ｎ−［２−（５，５−ジメチルボリナン−２−イル）ベンジル］−Ｎ−［３−（メタクリルアミド）プロピルアミノ］メチル］−１０−［Ｎ−［２−（５，５−ジメチルボリナン−２−イル）ベンジル］−Ｎ−［２−（２−ヒドロキシエトキシ）エチルアミノ］メチル］アントラセン（単一メタクリルアミド単量体）
９−［［２−（２−ヒドロキシエトキシ）エチルアミノ］メチル］−１０−［［（３−メタクリルアミド）プロピルアミノ］メチル］アントラセン（０．３４３ｇ、０．７６３ミリモル）、DIEA（０．９６５ｇ、１．３０ｍＬ、９．８当量）および（２−ブロモメチルフェニル）ボロン酸ネオペンチルエステル（１．０９ｇ、３．８５ミリモル、５．０当量）の２０ｍＬのCHCl3中における２３℃の溶液を暗所で２５時間攪拌した。この時点で、この反応混合物を初めに回転蒸発により、次いで真空ポンプを用いて濃縮してDIEAを除去した。その残分をアルミナクロマトグラフィー（４０ｇの活性中性アルミナ、０−１０％のCH3OH／CH2Cl2）で精製して０．２９９ｇ（４６％）の黄橙色固体をもたらした。この化合物は、これを前に述べた適切な単量体と共重合させ、脱保護して、グルコースを検出するために使用することができる。
FAB MS：C51H65B2N3O7の計算値・[Ｍ]+８５４；実測値・[Ｍ+1]+８５５
TLC：Merck塩基性アルミナプレート、Ｒｆ：９５／５のCH2Cl2／CH3OHで０．３５、ＵＶ（２５４／３６６）で観察
HPLC：HP 1100 HPLCクロマトグラフ、Vydac 201TP・１０ｘ２５０ｍｍカラム、０．１００ｍＬ注入、２ｍＬ／分、３７０ｎｍ検出、Ａ＝水（０．１％HFBA）およびＢ＝MeCN（０．１％HFBA）、勾配：１０％Ｂ・２分、１０−８０％Ｂ・１８分超、８０−１００％Ｂ・２分超、１００％Ｂ・２分、保持時間１９．７分。
【００９４】
実施例８
ビス−ボロネート−アントラセンの二元メタクリレート単量体
【００９５】
【化１５】
Ａ．９，１０−ビス［Ｎ−［２−（５，５−ジメチルボリナン−２−イル）ベンジル］−Ｎ−［２−（２−メタクロイルオキシエトキシ）エチルアミノ］メチル］アントラセン
９，１０−ビス［Ｎ−［２−（５，５−ジメチルボリナン−２−イル）ベンジル］−Ｎ−［２−（２−ヒドロキシエトキシ）エチルアミノ］メチル］アントラセン（０．１００ｇ、０．１２０ミリモル；実施例２を参照されたい）、メタクリル酸（０．１１２ｇ、０．１１０ｍＬ、１．３０ミリモル、１０．８当量）、DCC（０．３１６ｇ、１．５３ミリモル、１２．８当量）およびＮ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（０．０１４ｇ、０．１１ミリモル、０．９２当量）の５ｍＬのCH2Cl2中溶液を０℃において１時間、次いで２３℃において２２時間攪拌した。この時点で、この反応混合物を濾過し、そして回転蒸発により濃縮した。その残分をアルミナカラムクロマトグラフィー（３０ｇの活性中性アルミナ、０−２％のCH3OH／CH2Cl2）で精製して０．０３０ｇ（２６％）の黄色の固体をもたらした。この化合物は、これを前に説明した適切な単量体と共重合させ、脱保護して、グルコースを検出するために使用することができる。
FAB MS：C56H70B2N2O10の計算値・[Ｍ]+９５３；実測値・[Ｍ]+９５１
TLC：Merck塩基性アルミナプレート、Ｒｆ：９５／５のCH2Cl2／CH3OHで０．６７、ＵＶ（２５４／３６６）で観察
HPLC：HP 1100 HPLCクロマトグラフ、Waters・５ｘ１００ｍｍのNovaPak HR C18カラム、０．１００ｍＬ注入、０．７５ｍＬ／分、２ｍＬ注入ループ、３７０ｎｍ検出、Ａ＝水（０．１％HFBA）およびＢ＝MeCN（０．１％HFBA）、勾配：１０％Ｂ・２分、１０−８０％Ｂ・１８分超、８０−１００％Ｂ・２分超、１００％Ｂ・２分、保持時間１９．６分。
【００９７】
実施例９
二元５−アミノペンチルビス−ボロネート−アントラセン
【００９８】
【化１６】
Ａ．９，１０−ビス［［５−（ｔ−BOC）−アミノペンチルアミノ］メチル］アントラセン
９，１０−ビス（クロロメチル）アントラセン（０．２８ｇ、１ミリモル）、DIEA（７．０ｍＬ、４０ミリモル）、モノ−ｔ−ブトキシカルボニル １，５−ジアミノペンタン（３．７５ｇ、１０ミリモル）および５０ｍＬのCHCl3の懸濁液を、暗所において４５℃で２日間攪拌した。この溶液を飽和H2O／NaHCO3で洗浄し、その有機相を乾燥し（Na2SO4）、そしてその溶媒を蒸発させた。その残分をアルミナクロマトグラフィー（４０ｇの活性中性アルミナ、９５／５容量％のCH2Cl2／MeOH）で精製して０．５５ｇの粘稠な油状物をもたらした。この物質をそのまま次の工程に用いた。
【０１００】
【化１７】
Ｂ． ９，１０−ビス［Ｎ−［２−（５，５−ジメチルボリナン−２−イル）ベンジル］−Ｎ−［５−（ｔ−BOC）−アミノペンチルアミノ］メチル］アントラセン
９，１０−ビス［［５−（ｔ−BOC）−アミノペンチルアミノ］メチル］アントラセン（０．３ｇ、０．４９ミリモル）、DIEA（０．３５ｍＬ、２ミリモル）および（２−ブロモメチルフェニル）ボロン酸ネオペンチルエステル（０．５６６ｇ、２．０ミリモル）の２０ｍＬのCH2Cl2中溶液を暗所において２５℃で２日間攪拌した。この時点で、この反応混合物を真空中で濃縮し、その残分をアルミナクロマトグラフィー（６０ｇの活性中性アルミナ、９８／２容量％のCH2Cl2／MeOH）で精製して０．４０１ｇ（２０％）の黄色の油状物をもたらした。この物質をそのまま次の工程に用いた。
【０１０２】
【化１８】
Ｃ．９，１０−ビス［Ｎ−（２−ボロノベンジル）−Ｎ−［５−アミノペンチルアミノ］メチル］アントラセン・トリフルオロ酢酸塩
９，１０−ビス［Ｎ−［２−（５，５−ジメチルボリナン−２−イル）ベンジル］−Ｎ−［５−（ｔ−BOC）−アミノペンチルアミノ］メチル］アントラセン（０．４ｇ、０．３９ミリモル）を２０ｍＬのCH2Cl2／TFA（８０／２０容量％）に溶解した。この溶液を１２時間攪拌し、その溶媒を蒸発させ、その残分を１０ｍＬのエーテルで洗浄した。合計３７３ｍｇの固体が得られた（収率７２％）。生成物はRP-HPLCで〜８０％純度であった。この化合物は、これを前に説明した適切な単量体と共重合させ、脱保護して、グルコースを検出するために用いることができる。
【０１０４】
HPLC：HP 1100 HPLCクロマトグラフ、Waters・５ｘ１００ｍｍのNovaPak HR C18カラム、０．０５０ｍＬ注入、０．７５ｍＬ／分、３６０ｎｍ検出、Ａ＝水（０．１％HFBA）およびＢ＝MeCN（０．１％HFBA）、勾配：１０％Ｂ・２分、１０−８０％Ｂ・１８分超、８０−１００％Ｂ・２分超、１００％Ｂ・２分、保持時間１６．０分。
【０１０５】
実施例１０
【０１０６】
【化１９】
Ａ．Ｎ−２−（tert−ブトキシカルボニル）アミノエチル−４−ブロモナフタレン−１，８−ジカルボキシミド
Ｎ−ｔ−Boc−エチレンジアミン（Fluka社、１．６ｇ、１０ミリモル）および４−ブロモ−１，８−ナフタル酸無水物（Aldrich社、２．７７ｇ、１０ミリモル）を６０ｍＬの無水エタノールと合わせ、この懸濁液を６０℃で２０時間攪拌し、室温まで冷却し、そして濾過した。得られた固体を３０ｍＬの冷EtOHで洗浄し、そして真空下で乾燥した。収量３．８４ｇ（９１％）。NMR（CDCl3）：δ１．２８（９Ｈ，ｓ）；３．５２（２Ｈ，ｔ）；４．３５（２Ｈ，ｔ）；４．９２（１Ｈ，ｓ）；７．８４（１Ｈ，ｔ）；８．０４（１Ｈ，ｄ）；８．４２（１Ｈ，ｄ）；８．５８（１Ｈ，ｄ）；８．６７（１Ｈ，ｄ）。
【０１０８】
【化２０】
Ｂ．Ｎ−２−（tert−ブトキシカルボニル）アミノエチル−４−（Ｎ’−メチルアミノエチルアミノ）ナフタレン−１，８−ジカルボキシミド
Ｎ−メチルエチレンジアミン（１．４８ｇ、２０ミリモル）を２ｍＬの１−メチル−２−ピロリジノン（NMP）と合わせ、続いてＮ−２−（tert−ブトキシカルボニル）アミノエチル−４−ブロモナフタレン−１，８−ジカルボキシミド（０．３５ｇ、０．８４５ミリモル）を添加した。この結果得られた溶液を４５℃で４０時間攪拌し、その後NMPおよびＮ−メチルエチレンジアミンを真空下で蒸発させた。得られた残分をカラムクロマトグラフィー（２０ｇのシリカゲル、初めCH2Cl2／MeOH（９０／１０）、次いでCH2Cl2／MeOH／Et3N（７５／２０／５））に付した。黄色の固体が得られた（０．３１１ｇ、収率８９％）。純度をRP-HPLCでチェックした。
【０１１０】
【化２１】
Ｃ．Ｎ−アミノエチル−４−（Ｎ’−アミノエチレン−Ｎ”−［２−（ボロノ）ベンジル］メチルアミノ）ナフタレン−１，８−ジカルボキシミド・トリフルオロ酢酸塩：
Ｎ−２−（tert−ブトキシカルボニル）アミノエチル−４−（Ｎ’−メチルアミノエチルアミノ）ナフタレン−１，８−ジカルボキシミド（０．３ｇ、０．７３ミリモル）、２−ブロモメチルフェニルボロン酸ピナコールエステル（０．６ｇ、２ミリモル）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−Ｎ−エチルアミン（１．３ｇ、８ミリモル）および１０ｍＬのCH2Cl2を合わせた。この溶液を２０時間攪拌し、続いて２ｇのPS-Trisamine樹脂（Argonaut Technologies社、３．３８ミリモル／ｇ）を加えた。この反応混合物および樹脂を１０時間かき混ぜ、その後その樹脂を濾過によって取り出し、そしてCH2Cl2（２ｘ２０ｍＬ）で洗浄した。合わせたCH2Cl2溶液を蒸発させ、そして真空下で乾燥した。この結果得られた橙色の残分に、２０容量％のTFAおよび５容量％のトリイソプロピルシランを含む塩化メチレン溶液を加えた。この結果得られた溶液を室温で１０時間攪拌し、その後その溶媒を蒸発させ、その残分をエーテルと共に摩砕して黄色の固体をもたらした。この固体を濾過し、そして真空中で乾燥した（収量５８０ｍｇ）。この物質の純度をRP-HPLCでチェックした。この固体をそのまま次の工程で用いた。
【０１１２】
【化２２】
Ｄ．Ｎ−（３−ボロノ−５−ニトロベンズアミド）エチル−４−（Ｎ’−アミノエチレン−Ｎ”−［２−（ボロノ）ベンジル］メチルアミノ）ナフタレン−１，８−ジカルボキシミド：
Ｎ−アミノエチル−４−（Ｎ’−アミノエチレン−Ｎ”−［２−（ボロノ）ベンジル］メチルアミノ）ナフタレン−１，８−ジカルボキシミド・トリフルオロ酢酸塩（０．２２５ｇ、０．４ミリモル）、３−カルボキシ−５−ニトロフェニルボロン酸（０．０８５ｇ、０．４ミリモル）、ジフェニルホスホリルアジド（０．１３ｍＬ、０．６ミリモル）および２ｍＬの無水DMFを合わせた。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−Ｎ−エチルアミン（０．７ｍＬ、４ミリモル）を加え、その溶液を２０時間攪拌した。その反応混合物にエーテル（１０ｍＬ）を加え、その不溶性残分を分離し、そして５ｍＬのCH2Cl2と共に音波処理して橙色の固体をもたらし、その固体を濾過し、そして真空下で乾燥した（３８ｍｇ、収率１５％）。この固体の純度はRP-HPLCでチェックした。NMR（dmso-d6/D20、９０／１０）：δ２．３２（３Ｈ，ｓ）；２．８２（２Ｈ，ｔ）；３．５８（２Ｈ，ｔ）；３．６５（２Ｈ，ｔ）；３．７０（２Ｈ，ｓ）；６．６５（１Ｈ，ｄ）；７．０−７．３（４Ｈ，ｍ）；７．６８（１Ｈ，ｔ）；８．１８（１Ｈ，ｄ）；８．４２（１Ｈ，ｄ）；８．４７（１Ｈ，ｄ）；８．１−８．３５（３Ｈ，ｍ）。
【０１１４】
Ｅ．Ｎ−（３−ボロノ−５−ニトロベンズアミド）エチル−４−（Ｎ’−アミノエチレン−Ｎ”−［２−（ボロノ）ベンジル］メチルアミノ）ナフタレン−１，８−ジカルボキシミドのグルコースとの相互作用についての蛍光でモニターする試験
この実験は、MeOH／リン酸緩衝生理食塩水（PBS、１０ｍＬ、ｐＨ＝７．４）中で行われた。Ｎ−（３−ボロノ−５−ニトロベンズアミド）エチル−４−（Ｎ’−アミノエチレン−Ｎ”−［２−（ボロノ）ベンジル］メチルアミノ）ナフタレン−１，８−ジカルボキシミドのMeOH／PBS（５０／５０容量％）中における濃度は１５ｍＭであった。グルコース濃度は０ｍＭから５０ｍＭまで変えられ、またＬ−ナトリウムラクテート濃度を０ｍＭから７ｍＭまで変えた。実験はShimadzu RF-5301 PCスペクトル蛍光計で行った：励起波長は４３０ｎｍに設定し、発光は４８０−６５０ｎｍの範囲、スリット幅３／１．５ｎｍ、高感度PMTでモニターした。
【０１１５】
結果は図１２および１３に示されるが、それらは、この試料のインジケーターの蛍光はグルコースの存在によって影響されたが、ラクテートの存在によっては影響されなかったことを示している。
【図面の簡単な説明】
【０１１６】
【図１】実施例１に記載されるインジケーターの正規化された蛍光発光（４２０ｎｍにおけるＩ／Ｉ0）を図示する。
【図２】実施例２に記載されるインジケーターの正規化された蛍光発光（４２８ｎｍにおけるＩ／Ｉ0）を図示する。
【図３】実施例３に記載されるインジケーターの正規化された蛍光発光（４２８ｎｍにおけるＩ／Ｉ0）を図示する。
【図４】実施例４に記載されるインジケーターの正規化された蛍光発光（４２７ｎｍにおけるＩ／Ｉ0）を図示する。
【図５】実施例５に記載されるインジケーターの正規化された蛍光発光（５４０ｎｍにおけるＩ／Ｉ0）を図示する。
【図６】実施例６に記載されるインジケーターの吸光スペクトルを図示する。
【図７】実施例６に記載されるインジケーターの吸光度の比（４５０ｎｍ／５３０ｎｍ）を図示する。
【図８】実施例６に記載されるインジケーターの吸光度の比（４５０ｎｍ／５３０ｎｍ）を図示する。
【図９】実施例６に記載されるインジケーターの正規化された蛍光発光（Ｉ／Ｉ0、於５５０ｎｍ）を図示する。
【図１０】実施例６に記載されるインジケーターの、グルコースの非存在下および１００ｍＭのグルコースの存在下における吸光スペクトルを図示する。
【図１１】実施例６に記載されるインジケーターのグルコースおよびラクテートの存在下における正規化された蛍光発光（Ｉ／Ｉ0、於５５０ｎｍ）を図示する。
【図１２】実施例１０に記載される、グルコースに曝露されたインジケーターの正規化された蛍光発光（Ｉ／Ｉ0、於５２５ｎｍ）を図示する。
【図１２】実施例１０に記載される、ラクテートに曝露されたインジケーターの正規化された蛍光発光（Ｉ／Ｉ0、於５３０ｎｍ）を図示する。
Claims (34)
- アルファ−ヒドロキシ酸またはベータ−ジケトンも含んでいることができる試料中のグルコースの存在または濃度を検出する方法であって：
ａ）少なくとも２種のグルコース認識要素を有する化合物に試料を曝露する工程にして、上記化合物とグルコースとの相互作用がその化合物とアルファ−ヒドロキシ酸またはベータ−ジケトンとの相互作用よりも安定になるように、該グルコース認識要素が配向されており、ここで該化合物は、この化合物が該試料中のグルコースに曝露されると濃度依存性様式で変化する検出可能な特質を有する検出可能部分も含んでいるそのような工程；および
ｂ）該検出可能特質のいずれかの変化も測定し、それによって該試料中のグルコースの存在または濃度を決定する工程にして、この場合アルファ−ヒドロキシ酸またはベータ−ジケトンの存在は該決定を実質的に妨害しないそのような工程
を含む上記の方法。 - 化合物が次の構造：
―Ｒ1およびＲ2は同一または異なるものであって、次の：ｉ）水素、ｉｉ）Ｒ8部分のpKaおよび加水分解安定性を変える置換基、ｉｉｉ）検出可能部分、またはｉｖ）検出可能部分を場合によって含んでいる固体支持体または高分子マトリックスに結合することが可能な結合基から選ばれ；
―Ｒ3は水素、または場合によって検出可能部分を含んでいる固体支持体または高分子マトリックスに結合することが可能な結合基であり；
―Ｒ4およびＲ5は同一または異なるものであって、次の：ｉ）水素、ｉｉ）Ｒ8部分のpKaおよび加水分解安定性を変える置換基、ｉｉｉ）検出可能部分、またはｉｖ）検出可能部分を場合によって含んでいる固体支持体または高分子マトリックスに結合することが可能な結合基から選ばれ；
―各Ｚは独立に炭素または窒素であり；
―Ｒ6およびＲ7は同一または異なるものであって、ｉ）ゼロ〜１０個の隣接するまたは分枝した炭素および／またはヘテロ原子を有する結合基、またはｉｉ）検出可能部分を場合によって含んでいる固体支持体または高分子マトリックスに結合することが可能な結合基であり；
―Ｒは、次の：ｉ）炭素、酸素、窒素、硫黄およびリンより成る群から選ばれる１〜１０個の隣接する原子を含んでいる脂肪族および／または芳香族スペーサー、ｉｉ）検出可能部分、またはｉｉｉ）検出可能部分を場合によって含んでいる固体支持体または高分子マトリックスに結合することが可能な結合基から選ばれ；
―各Ｒ8は同一または異なるものであって、グルコース中に存在するビシナルジオール基と相互作用することが可能な部分であり；そして
―Ｒ9およびＲ10は同一または異なるものであって、ｉ）水素、ｉｉ）検出可能部分、ｉｉｉ）ａ）検出可能部分を場合によって含んでいる固体支持体または高分子マトリックスに結合することが可能な結合基であるか、および／またはｂ）前記化合物の物理的性質を変えることができる官能基を含む基である。 - Ｒ8がボロン酸、ボロン酸イオン、亜ヒ酸、亜ヒ酸イオン、テルル酸、テルル酸イオン、ゲルマニウム酸、ゲルマニウム酸イオンおよびそれらの組み合わせより成る群から選ばれる、請求項２に記載の方法。
- 各Ｒ8がボロン酸基である、請求項３に記載の方法。
- 化合物が、一方から他方へとエネルギー輸送することが可能な少なくとも２つの検出可能部分を含み、そして該エネルギー輸送が試料中におけるグルコースの存在によって変調される、請求項２に記載の方法。
- Ｒ、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ9またはＲ10の内の少なくとも１個が発蛍光団部分を含み、さらにそれら基の少なくとも１個が消光部分を含み、そして該発蛍光団は化合物が試料中のグルコースと相互作用するときに消光されるか、または消光解除されるかのいずれかである、請求項２に記載の方法。
- 化合物が発蛍光団を含み、そして該発蛍光団の蛍光が該化合物とグルコースとの相互作用によって変調される、請求項２に記載の方法。
- 試料が生理的液体である、請求項１に記載の方法。
- 生理的液体が、血液、血漿、血清、間質液、髄液、尿、唾液、眼内液、リンパ液、涙液、汗および生理的緩衝液より成る群から選ばれる、請求項８に記載の方法。
- 化合物が溶解状態の試料に曝露される、請求項１に記載の方法。
- 化合物が固体支持体の上または内部に固定化されている、請求項１に記載の方法。
- 固体支持体が高分子マトリックスである、請求項１１に記載の方法。
- 化合物が移植可能ディバイスに関連するものであり、そして工程ａ）が生体内で行われる、請求項１に記載の方法。
- Ｒがアントラセン残基であり；Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4およびＲ5が水素であり；Ｒ6およびＲ7がジメチルアミン残基であり；各Ｒ8がボロン酸基であり；Ｒ9およびＲ10が脂肪族カルボン酸残基であり；そして各Ｚが炭素である、請求項２に記載の方法。
- Ｒ9およびＲ10がプロピオン酸残基である、請求項１４に記載の方法。
- Ｒがヘキサメチレン残基であり；Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4およびＲ5が水素であり；Ｒ6およびＲ7がジメチルアミン残基であり；各Ｒ8がボロン酸基であり；Ｒ9がナフタルイミド残基であり；Ｒ10がジメチルアミノベンジル残基であり；そして各Ｚが炭素である、請求項２に記載の方法。
- Ｒがアントラセン残基であり；Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4およびＲ5が水素であり；Ｒ6およびＲ7がジメチルアミン残基であり；各Ｒ8がボロン酸基であり；Ｒ9およびＲ10が同一または異なるものであって、メタクリルアミドアルキル残基、メタクロイルオキシエトキシアルキル残基、ヒドロキシエトキシアルキル残基およびアミノアルキル残基より成る群から選ばれ；そして各Ｚが炭素である、請求項２に記載の方法。
- 化合物が：
９−［Ｎ−（２−ボロノベンジル）−Ｎ−［２−（２−メタクロイルオキシエトキシ）エチルアミノ］メチル］−１０−［Ｎ−（２−ボロノベンジル）−Ｎ−［２−（２−ヒドロキシエトキシ）エチルアミノ］メチル］アントラセン；
９，１０−ビス［Ｎ−（２−ボロノベンジル）−Ｎ−［３−（プロパノイル）アミノ］メチル］アントラセン；
９，１０−ビス［Ｎ−（２−ボロノベンジル）−Ｎ−［３−（メタクリルアミド）プロピルアミノ］メチルアントラセン；
９−［Ｎ−（２−ボロノベンジル）−Ｎ−［３−（メタクリルアミド）プロピルアミノ］メチル］−１０−［Ｎ−（２−ボロノベンジル）−Ｎ−［２−（２−ヒドロキシエトキシ）エチルアミノ］メチル］アントラセン；
９，１０−ビス［Ｎ−（２−ボロノベンジル）−Ｎ−［２−（２−メタクロイルオキシエトキシ）エチルアミノ］メチルアントラセン；および
９，１０−ビス［Ｎ−（２−ボロノベンジル）−Ｎ−［５−アミノペンチルアミノ］メチル］アントラセン
並びにそれらの塩より成る群から選ばれる、請求項２に記載の方法。 - 次の構造：
―Ｒ1およびＲ2は同一または異なるものであって、次の：ｉ）水素、ｉｉ）Ｒ8部分のpKaおよび加水分解安定性を変える置換基、ｉｉｉ）検出可能部分、またはｉｖ）検出可能部分を場合によって含んでいる固体支持体または高分子マトリックスに結合することが可能な結合基から選ばれ；
―Ｒ3は水素、または検出可能部分を場合によって含んでいる固体支持体または高分子マトリックスに結合することが可能な結合基であり；
―Ｒ4およびＲ5は同一または異なるものであって、次の：ｉ）水素、ｉｉ）Ｒ8部分のpKaおよび加水分解安定性を変える置換基、ｉｉｉ）検出可能部分、またはｉｖ）検出可能部分を場合によって含んでいる固体支持体または高分子マトリックスに結合することが可能な結合基から選ばれ；
―各Ｚは独立に炭素または窒素であり；
―Ｒ6およびＲ7は同一または異なるものであって、ｉ）ゼロ〜１０個の隣接するまたは分枝した炭素および／またはヘテロ原子を有する結合基、またはｉｉ）検出可能部分を場合によって含んでいる固体支持体または高分子マトリックスに結合することが可能な結合基であり；
―Ｒは、次の：ｉ）炭素、酸素、窒素、硫黄およびリンより成る群から選ばれる１〜１０個の隣接する原子を含んでいる脂肪族および／または芳香族スペーサー、ｉｉ）検出可能部分、またはｉｉｉ）検出可能部分を場合によって含んでいる固体支持体または高分子マトリックスに結合することが可能な結合基から選ばれ；
―各Ｒ8は同一または異なるものであって、保護されていないときにグルコース中に存在するビシナルジオール基と相互作用することが可能である、場合によって保護されている部分であり；そして
―Ｒ9およびＲ10は同一または異なるものであって、ｉ）水素、ｉｉ）検出可能部分、ｉｉｉ）ａ）検出可能部分を場合によって含んでいる固体支持体または高分子マトリックスに結合することが可能な結合基であるか、および／またはｂ）前記化合物の物理的性質を変えることができる官能基を含む基である。 - Ｒ8が、次の全てが場合によって保護されているボロン酸、ボロン酸イオン、亜ヒ酸、亜ヒ酸イオン、テルル酸、テルル酸イオン、ゲルマニウム酸、ゲルマニウム酸イオンおよびそれらの組み合わせより成る群から選ばれる、請求項１９に記載の化合物。
- 各Ｒ8が場合によって保護されているボロン酸基である、請求項２０に記載の化合物。
- 化合物が発蛍光団を含み、そして該発蛍光団の蛍光が該化合物とグルコースとの相互作用によって変調される、請求項１９に記載の化合物。
- Ｒがアントラセン残基であり；Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4およびＲ5が水素であり；Ｒ6およびＲ7がジメチルアミン残基であり；各Ｒ8が場合によって保護されているボロン酸基であり；Ｒ9およびＲ10が脂肪族カルボン酸残基であり；そして各Ｚが炭素である、請求項１９に記載の化合物。
- Ｒ9およびＲ10がプロピオン酸残基である、請求項２３に記載の化合物。
- Ｒがアントラセン残基であり；Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4およびＲ5が水素であり；Ｒ6およびＲ7がジメチルアミン残基であり；各Ｒ8が場合によって保護されているボロン酸基であり；Ｒ9およびＲ10が同一または異なるものであって、メタクリルアミドアルキル残基、メタクロイルオキシエトキシアルキル残基、ヒドロキシエトキシアルキル残基およびアミノアルキル残基より成る群から選ばれ；そして各Ｚが炭素である、請求項１９に記載の化合物。
- 化合物が：
９−［Ｎ−［２−（５，５−ジメチルボリナン−２−イル）ベンジル］−Ｎ−［２−（２−メタクロイルオキシエトキシ）エチルアミノ］メチル］−１０−［Ｎ−［２−（５，５−ジメチルボリナン−２−イル）ベンジル］−Ｎ−［２−（２−ヒドロキシエトキシ）エチルアミノ］メチル］アントラセン；
９−［Ｎ−（２−ボロノベンジル）−Ｎ−［２−（２−メタクロイルオキシエトキシ）エチルアミノ］メチル］−１０−［Ｎ−（２−ボロノベンジル）−Ｎ−［２−（２−ヒドロキシエトキシ）エチルアミノ］メチル］アントラセン；
９，１０−ビス［Ｎ−（２−ボロノベンジル）−Ｎ−［３−（プロパノイル）アミノ］メチル］アントラセン；
９，１０−ビス［Ｎ−［２−（５，５−ジメチルボリナン−２−イル）ベンジル）−Ｎ−［３−（メタクリルアミド）プロピルアミノ］メチルアントラセン；
９，１０−ビス［Ｎ−（２−ボロノベンジル）−Ｎ−［３−（メタクリルアミド）プロピルアミノ］メチルアントラセン；
９−［Ｎ−［２−（５，５−ジメチルボリナン−２−イル）ベンジル］−Ｎ−［３−（メタクリルアミド）プロピルアミノ］メチル］−１０−［Ｎ−［２−（５，５−ジメチルボリナン−２−イル）ベンジル］−Ｎ−［２−（２−ヒドロキシエトキシ）エチルアミノ］メチル］アントラセン；
９−［Ｎ−（２−ボロノベンジル）−Ｎ−［３−（メタクリルアミド）プロピルアミノ］メチル］−１０−［Ｎ−（２−ボロノベンジル）−Ｎ−［２−（２−ヒドロキシエトキシ）エチルアミノ］メチル］アントラセン；
９，１０−ビス［Ｎ−［２−（５，５−ジメチルボリナン−２−イル）ベンジル］−Ｎ−［２−（２−メタクロイルオキシエトキシ）エチルアミノ］メチルアントラセン；
９，１０−ビス［Ｎ−（２−ボロノベンジル）−Ｎ−［２−（２−メタクロイルオキシエトキシ）エチルアミノ］メチルアントラセン；および
９，１０−ビス［Ｎ−（２−ボロノベンジル）−Ｎ−［５−アミノペンチルアミノ］メチル］アントラセン
並びにそれらの塩より成る群から選ばれる、請求項１９に記載の化合物。 - アルファ−ヒドロキシ酸またはベータ−ジケトンも含んでいることができる試料中のグルコースの存在または濃度を検出する検出システムであって、次の構造：
―Ｒ1およびＲ2は同一または異なるものであって、次の：ｉ）水素、ｉｉ）Ｒ8部分のpKaおよび加水分解安定性を変える置換基、ｉｉｉ）検出可能部分、またはｉｖ）検出可能部分を場合によって含んでいる固体支持体または高分子マトリックスに結合することが可能な結合基から選ばれ；
―Ｒ3は水素、または検出可能部分を場合によって含んでいる固体支持体または高分子マトリックスに結合することが可能な結合基であり；
―Ｒ4およびＲ5は同一または異なるものであって、次の：ｉ）水素、ｉｉ）Ｒ8部分のpKaおよび加水分解安定性を変える置換基、ｉｉｉ）検出可能部分、またはｉｖ）検出可能部分を場合によって含んでいる固体支持体または高分子マトリックスに結合することが可能な結合基から選ばれ；
―各Ｚは独立に炭素または窒素であり；
―Ｒ6およびＲ7は同一または異なるものであって、ｉ）ゼロ〜１０個の隣接するまたは分枝した炭素および／またはヘテロ原子を有する結合基、またはｉｉ）検出可能部分を場合によって含んでいる固体支持体または高分子マトリックスに結合することが可能な結合基であり；
―Ｒは、次の：ｉ）炭素、酸素、窒素、硫黄およびリンより成る群から選ばれる１〜１０個の隣接する原子を含んでいる脂肪族および／または芳香族スペーサー、ｉｉ）検出可能部分、またはｉｉｉ）検出可能部分を場合によって含んでいる固体支持体または高分子マトリックスに結合することが可能な結合基から選ばれ；
―各Ｒ8は同一または異なるものであって、保護されていないときにグルコース中に存在するビシナルジオール基と相互作用することが可能である、場合によって保護されている部分であり；そして
―Ｒ9およびＲ10は同一または異なるものであって、ｉ）水素、ｉｉ）検出可能部分、ｉｉｉ）ａ）検出可能部分を場合によって含んでいる固体支持体または高分子マトリックスに結合することが可能な結合基であるか、および／またはｂ）前記化合物の物理的性質を変えることができる官能基を含む基である。 - Ｒ8が、次の全てが場合によって保護されているボロン酸、ボロン酸イオン、亜ヒ酸、亜ヒ酸イオン、テルル酸、テルル酸イオン、ゲルマニウム酸、ゲルマニウム酸イオンおよびそれらの組み合わせより成る群から選ばれる、請求項２７に記載の検出システム。
- 各Ｒ8が場合によって保護されているボロン酸基である、請求項２８に記載の検出システム。
- 化合物が発蛍光団を含み、そして該発蛍光団の蛍光が該化合物とグルコースとの相互作用によって変調される、請求項２７に記載の検出システム。
- Ｒがアントラセン残基であり；Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4およびＲ5が水素であり；Ｒ6およびＲ7がジメチルアミン残基であり；各Ｒ8が場合によって保護されているボロン酸基であり；Ｒ9およびＲ10が脂肪族カルボン酸残基であり；そして各Ｚが炭素である、請求項２７に記載の検出システム。
- Ｒ9およびＲ10がプロピオン酸残基である、請求項３１に記載の検出システム。
- Ｒがアントラセン残基であり；Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4およびＲ5が水素であり；Ｒ6およびＲ7がジメチルアミン残基であり；各Ｒ8がボロン酸基であり；Ｒ9およびＲ10が同一または異なるものであって、メタクリルアミドアルキル残基、メタクロイルオキシエトキシアルキル残基、ヒドロキシエトキシアルキル残基およびアミノアルキル残基より成る群から選ばれ；そして各Ｚが炭素である、請求項２７に記載の検出システム。
- 化合物が：
９−［Ｎ−［２−（５，５−ジメチルボリナン−２−イル）ベンジル］−Ｎ−［２−（２−メタクロイルオキシエトキシ）エチルアミノ］メチル］−１０−［Ｎ−［２−（５，５−ジメチルボリナン−２−イル）ベンジル］−Ｎ−［２−（２−ヒドロキシエトキシ）エチルアミノ］メチル］アントラセン；
９−［Ｎ−（２−ボロノベンジル）−Ｎ−［２−（２−メタクロイルオキシエトキシ）エチルアミノ］メチル］−１０−［Ｎ−（２−ボロノベンジル）−Ｎ−［２−（２−ヒドロキシエトキシ）エチルアミノ］メチル］アントラセン；
９，１０−ビス［Ｎ−（２−ボロノベンジル）−Ｎ−［３−（プロパノイル）アミノ］メチル］アントラセン；
９，１０−ビス［Ｎ−［２−（５，５−ジメチルボリナン−２−イル）ベンジル）−Ｎ−［３−（メタクリルアミド）プロピルアミノ］メチルアントラセン；
９，１０−ビス［Ｎ−（２−ボロノベンジル）−Ｎ−［３−（メタクリルアミド）プロピルアミノ］メチルアントラセン；
９−［Ｎ−［２−（５，５−ジメチルボリナン−２−イル）ベンジル］−Ｎ−［３−（メタクリルアミド）プロピルアミノ］メチル］−１０−［Ｎ−［２−（５，５−ジメチルボリナン−２−イル）ベンジル］−Ｎ−［２−（２−ヒドロキシエトキシ）エチルアミノ］メチル］アントラセン；
９−［Ｎ−（２−ボロノベンジル）−Ｎ−［３−（メタクリルアミド）プロピルアミノ］メチル］−１０−［Ｎ−（２−ボロノベンジル）−Ｎ−［２−（２−ヒドロキシエトキシ）エチルアミノ］メチル］アントラセン；
９，１０−ビス［Ｎ−［２−（５，５−ジメチルボリナン−２−イル）ベンジル］−Ｎ−［２−（２−メタクロイルオキシエトキシ）エチルアミノ］メチルアントラセン；
９，１０−ビス［Ｎ−（２−ボロノベンジル）−Ｎ−［２−（２−メタクロイルオキシエトキシ）エチルアミノ］メチルアントラセン；および
９，１０−ビス［Ｎ−（２−ボロノベンジル）−Ｎ−［５−アミノペンチルアミノ］メチル］アントラセン
並びにそれらの塩より成る群から選ばれる、請求項２７に記載の検出システム。
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