JP2005321253A - キャピラリビーズアレイのプローブビーズの位置検出方法 - Google Patents

Abstract

【課題】プローブビーズに結合しているプローブの種類を正確に同定することができる方法を提供し、キャピラリビーズアレイを用いる生化学的又は免疫学的検査の結果の信頼性を大幅に向上させる。
【解決手段】蛍光標識された標的となる生体分子を含む溶液をキャピラリ内に導入し、該生体分子を捕捉したプローブビーズの蛍光スポットを含む蛍光画像を取得する。全てのビーズを蛍光染色するための蛍光物質を含む溶液をキャピラリ内に導入し、全てのプローブビーズの蛍光スポットを含む蛍光画像を取得する。該生体分子を捕捉したプローブビーズの蛍光スポットを含む蛍光画像と、全てのプローブビーズの蛍光スポットを含む蛍光画像を重ね合わせることにより、該生体分子を捕捉したプローブビーズの位置並びに順序を正確に知る。
【選択図】 図３

Description

本発明は粒状ビーズの位置検出方法に係り、特に軟質樹脂などに形成したキャピラリにビーズを配列したキャピラリビーズアレイのビーズの位置検出方法に関する。

軟質樹脂などに形成したキャピラリに、生体分子検出用のプローブを結合させたプローブビーズを配列したキャピラリビーズアレイにおいて、ビーズの位置確認に関する従来技術として下記特許文献１が挙げられる。特許文献１では、キャピラリ内に配列されたプローブビーズの位置確認方法として、プローブビーズの一定個数毎に、プローブビーズと色又はサイズの異なるマーカービーズを配置する方法が開示されている。このときマーカービーズにはプローブが結合していてもしていなくてもよい。マーカービーズの位置を目印としてプローブビーズの順番、すなわちビーズに結合しているプローブの種類を知ることができる。本方法は、主に光学顕微鏡などを用いてビーズの位置を目視にて確認する際に有効な方法である。

一方、キャピラリビーズアレイでは、生体分子の高感度検出方法として蛍光検出法を適用することが可能である。蛍光検出法を適用する場合、蛍光標識された標的となる生体分子を含む試料溶液をキャピラリビーズアレイに導入する。該生体分子は、該生体分子と親和性を有するプローブを結合したプローブビーズに捕捉される。蛍光標識された標的となる生体分子を捕捉したプローブビーズだけが蛍光を発する。従って、蛍光読取装置にてキャピラリビーズアレイのプローブビーズの蛍光検出を行うと、蛍光標識された生体分子を捕捉したビーズのみが検出される。蛍光を発しないプローブビーズは検出されないため、これらのプローブビーズの位置並びに個数を正確に知ることは非常に困難である。これは、蛍光を発するプローブビーズの順番、すなわちプローブビーズに結合しているプローブの種類も正確に知ることができないということを意味する。

このように、キャピラリビーズアレイに蛍光検出法を適用する場合、特許文献１に開示されたビーズの位置確認方法だけでは、プローブビーズの順番、すなわちプローブの種類を確認するのが非常に困難であった。そこで、キャピラリビーズアレイにおいて蛍光読取装置により全てのビーズの位置を検出し、プローブビーズの順番、すなわちプローブの種類を正確に同定することができる方法が必要であった。

特開２０００−３４６８４２号公報

上記、特許文献１に記載のキャピラリビーズアレイでは、プローブビーズを蛍光標識した標的となる生体分子と反応させた場合、蛍光を発するプローブビーズと蛍光を発しないプローブビーズが混在する状態になる。ここで蛍光読取装置によりキャピラリビーズアレイの蛍光検出を行うと、蛍光標識された標的の生体分子を捕捉し蛍光を発するプローブビーズは検出されるが、蛍光標識された標的の生体分子を捕捉していないプローブビーズは蛍光を発しないため検出されない。このため、蛍光を発しないプローブビーズの位置並びに個数を正確に知ることは非常に困難である。従って、蛍光を発するプローブビーズの順序も正確に知ることができないため、蛍光標識された標的となる生体分子を捕捉したプローブの種類も正確に知ることができない。キャピラリビーズアレイにおいてプローブビーズの順序、すなわちプローブビーズに結合したプローブの種類を正確に知ることは、キャピラリビーズアレイを用いる生化学的又は免疫学的検査の結果の信頼性に直結する。

そこで、本発明は、キャピラリビーズアレイにおいて蛍光読取装置を用いて全てのビーズの位置を簡便かつ正確に検出することにより、プローブビーズの順序、すなわちプローブビーズに結合しているプローブの種類を正確に同定することができる方法を提供し、キャピラリビーズアレイを用いる生化学的又は免疫学的検査の結果の信頼性を大幅に向上させることを目的とする。

本発明者は、鋭意研究した結果、キャピラリ内に多数のプローブビーズを配列した後、全てのプローブビーズを蛍光標識し、蛍光読取装置により全てのプローブビーズの蛍光を検出し、キャピラリビーズアレイの全てのプローブビーズの位置及び順序を正確に知ることによって上記課題が解決されることを見出し、本発明に到達した。

即ち、本発明は蛍光読取装置によりキャピラリビーズアレイの全てのプローブビーズの位置及び順序を検出する方法の発明であり、キャピラリ内に配列された全てのプローブビーズを蛍光標識するか、逆にキャピラリ内に配列された全てのプローブビーズ以外の部分を蛍光標識することを特徴とする、キャピラリビーズアレイのプローブビーズの位置検出方法である。

本発明によれば、多数のプローブビーズが配列されたキャピラリビーズアレイにおいて、蛍光読取装置により全てのビーズの位置を検出するとともに、標的となる生体分子を捕捉したプローブビーズの順序、すなわち標的となる生体分子を捕捉したプローブの種類を正確に同定することができる。従って、キャピラリビーズアレイを用いる生化学的又は免疫学的検査の正確性を大幅に向上させることが可能となる。

本発明において、ビーズとはプラスチックやガラス等からなり、粒径が数μｍから数十μｍの球状物である。具体例としてポリスチレンビーズ、ポリプロピレンビーズ、磁気ビーズなどがあり、フローサイトメーターを利用してその蛍光発色等を読み取ることが可能である。

本発明では、第１の手法として、全てのプローブビーズを蛍光標識する目的で、キャピラリ内に蛍光物質、例えば核酸結合色素を含む溶液を導入する。第２の手法として、全てのプローブビーズ以外の部分を蛍光標識する目的で、キャピラリ内に高濃度の蛍光物質を含む溶液を導入する。

該蛍光物質は有機化合物でも無機化合物でもよい。第１の手法では、キャピラリ内に導入された該蛍光物質は、プローブビーズの表面及び／又は内部に結合する。ここでいう結合とは、物理吸着、疎溶媒性相互作用による引力、静電引力、共有結合、水素結合などを指す。プローブビーズの表面及び／又は内部にはペプチド、蛋白質、核酸などのプローブが結合している。従って、ペプチド、蛋白質、核酸などのプローブに特異的に結合する性質を持つ蛍光物質を選択することにより、プローブが結合している全てのプローブビーズを蛍光標識することが可能である。具体例として、表面及び／又は内部に核酸が結合しているプローブビーズをキャピラリ内に配列する場合、核酸に結合する性質を持つ有機色素（例えばＳＹＴＯ（商標名））を使用すると、プローブビーズに結合している核酸を蛍光標識することができるので、結果的に全てのプローブビーズを蛍光標識することができる。キャピラリ内に、表面及び／又は内部にプローブが結合しているビーズとともに、表面及び／又は内部にプローブが結合していないダミービーズがある場合、キャピラリ内に導入する蛍光物質の溶液の濃度を十分に濃くすることにより、ダミービーズの表面及び／又は内部に蛍光物質を物理吸着させることができる。従って、ダミービーズもプローブビーズと同様に蛍光標識することができる。結果的にキャピラリ内の全てのビーズを蛍光標識することができる。

第２の手法では、キャピラリ内に導入された高濃度の蛍光物質は、プローブビーズ以外の部分に残留し、プローブビーズ部分を白抜きとすることで、結果的にキャピラリ内の全てのビーズの位置及び順序を検出することができる。第２の手法は第１の手法と逆の着想であるが、両手法とも全てのビーズの位置及び順序を検出することに有効である。

本発明では、蛍光読取装置を利用して、全てのプローブビーズの位置及び順序を正確に知ることにより、標的となる生体分子を捕捉しているプローブビーズの位置及び順序を正確に知ることができる。まず、軟質樹脂などに形成されたキャピラリ内にプローブビーズを配列する。配列するビーズの数には特に制限はないが、通常数十個から数百個のビーズが配列される。

プローブビーズの表面及び／又は内部にはそれぞれ異なるプローブが結合している。この時点ではこれらのプローブビーズの表面及び／又は内部には蛍光物質が存在しない。ここで、該プローブビーズが配列されたキャピラリを蛍光読取装置により蛍光検出して蛍光画像を得る。蛍光読取時にはある特定の蛍光波長（第１の蛍光波長）を検出する。この時点ではこれらのプローブビーズは蛍光を発しないため、プローブビーズの蛍光スポットは検出されない。

次に、キャピラリの入り口から、蛍光標識した標的となる生体分子を含む溶液を導入し、標的となる生体分子をプローブビーズの表面及び／又は内部に結合しているプローブと反応させる。ここで、標的となる生体分子を蛍光標識するために使用する蛍光物質（第１の蛍光物質）は、第１の蛍光波長の蛍光を発するものとする。キャピラリ内で十分に反応を行った後、溶液をキャピラリの出口から排出する。必要ならば、引き続きキャピラリの入り口から洗浄液を導入し、キャピラリ及びプローブビーズを洗浄し、その後洗浄液をキャピラリの出口から排出する。このとき、全てのプローブビーズのうち、蛍光標識した標的の生体分子を捕捉する性質を持つプローブを結合しているプローブビーズの表面及び／又は内部には、蛍光標識した標的の生体分子が捕捉される。プローブビーズが配列されたキャピラリを蛍光読取装置により蛍光検出して蛍光画像を得る。蛍光読取時には第１の蛍光波長にて検出する。

蛍光標識した標的となる生体分子を捕捉しているプローブビーズの蛍光スポットだけが検出される。その他のプローブビーズの蛍光スポットは検出されない。従って、このとき得られた蛍光画像だけでは、キャピラリ内に配列されているプローブビーズの総数、並びに蛍光を発しているプローブビーズの順序を正確に知ることは非常に困難である。これは、蛍光標識された標的の生体分子を捕捉しているプローブの種類も正確に知ることができないということを意味する。

以下、第１の手法について説明する。引き続き、蛍光標識された標的となる生体分子を含む溶液を除去したキャピラリの入り口から、全てのプローブビーズを蛍光標識するための核酸結合色素（第２の蛍光物質）を含む溶液を導入する。十分に反応を行った後、キャピラリの出口から溶液を排出する。プローブビーズが配列されたキャピラリを蛍光読取装置により蛍光検出し、蛍光画像を取得する。蛍光読取時には第２の蛍光物質が発する蛍光波長（第２の蛍光波長）を検出する。このとき、全てのプローブビーズの表面及び／又は内部には第２の蛍光物質が結合しているため、全てのプローブビーズの蛍光スポットが検出される。全てのプローブビーズの蛍光スポットを含む蛍光画像と、先に得られた標的である生体分子を捕捉しているプローブビーズの蛍光スポットだけを含む蛍光画像を重ね合わせて解析する。全てのプローブビーズの蛍光スポットを含む蛍光画像を利用することにより、蛍光標識された生体分子を捕捉しているプローブビーズのキャピラリ内での正確な位置及び順序を知ることが可能となる。従って、標的となる生体分子を捕捉しているプローブの種類を正確に同定することが可能となる。

以下、第２の手法について説明する。引き続き、蛍光標識された標的となる生体分子を含む溶液を除去したキャピラリの入り口から、全てのプローブビーズ以外の部分を蛍光標識するための高濃度の蛍光物質（第２の蛍光物質）を含む溶液を導入する。プローブビーズが配列されたキャピラリを蛍光読取装置により蛍光検出し、蛍光画像を取得する。蛍光読取時には第２の蛍光物質が発する蛍光波長（第２の蛍光波長）を検出する。このとき、全てのプローブビーズ以外の部分は高濃度の蛍光物質で染色されているため、全てのプローブビーズは白抜きの蛍光スポットとして検出される。全てのプローブビーズの白抜きの蛍光スポットを含む蛍光画像と、先に得られた標的である生体分子を捕捉しているプローブビーズの蛍光スポットだけを含む蛍光画像を重ね合わせて解析する。全てのプローブビーズの白抜きの蛍光スポットを含む蛍光画像を利用することにより、蛍光標識された生体分子を捕捉しているプローブビーズのキャピラリ内での正確な位置及び順序を知ることが可能となる。従って、標的となる生体分子を捕捉しているプローブの種類を正確に同定することが可能となる。

図１〜３は、キャピラリビーズアレイにおいて全てのビーズの位置検出を行う本発明の実施の形態を示す模式図である。

図１（ａ）、（ｂ）に本発明を実施しない場合の反応前のビーズ配列と蛍光発色を示す。軟質樹脂などに形成されたキャピラリ１０１にプローブビーズ１０２を配列する。配列するビーズの数には特に制限はないが、説明を簡単にするため、本図面では合計１０個のプローブビーズを一次元状に配列した例を示す。１０個のプローブビーズにはそれぞれ異なるプローブが結合している。また、この時点ではこれらのプローブビーズ１０２は蛍光を発しない。（図１（ａ））

プローブビーズ１０２が配列されたキャピラリ１０１を蛍光読取装置により蛍光検出した結果として得られる画像を示す。蛍光読取時にはある特定の蛍光波長（第１の蛍光波長）を検出する。この時点ではこれらのプローブビーズ１０２は蛍光を発しないため、プローブビーズ１０２の蛍光画像は検出されない。（図１（ｂ））

図２（ａ）、（ｂ）に本発明を実施しない場合の、反応後のビーズ配列と蛍光発色を示す。キャピラリの入り口１０３から、蛍光標識した標的となる生体分子を含む溶液を導入し、標的となる生体分子をプローブビーズ１０２に結合しているプローブと反応させる。ここで、標的となる生体分子を蛍光標識するために使用する蛍光物質（第１の蛍光物質）は、第１の蛍光波長の蛍光を発するものとする。キャピラリ内で十分に反応を行った後、溶液をキャピラリの出口１０４から排出する。必要ならば、引き続きキャピラリの入り口１０３から洗浄液を導入し、キャピラリの内部及びプローブビーズ１０２を洗浄し、その後洗浄液をキャピラリの出口１０４から排出する。説明のため、１０個のプローブビーズのうちプローブビーズ１０５、同１０６、並びに同１０７に結合したプローブが、蛍光標識した標的の生体分子を捕捉するものとする。（図２（ａ））

プローブビーズが配列されたキャピラリを蛍光読取装置により蛍光検出したときに得られる画像を示す。蛍光読取時には第１の蛍光波長にて検出する。プローブビーズ１０５、同１０６、並びに同１０７に対応する蛍光スポット１０８、同１０９、並びに同１１０が検出される。その他のプローブビーズの蛍光は検出されない。従って、本図面に示す蛍光画像だけでは、キャピラリ内に配列されているプローブビーズの総数、並びに蛍光を発しているプローブビーズの順序を正確に知ることは非常に困難である。これは、蛍光標識された標的の生体分子を捕捉しているプローブの種類も正確に知ることができないということを意味する。（図２（ｂ））

図３（ａ）、（ｂ）に本発明を実施した場合のビーズ配列と蛍光発色を示す。蛍光標識された標的の生体分子を含む溶液を除去したキャピラリの入り口１１１から、全てのプローブビーズを蛍光標識するための核酸結合物質（第２の蛍光物質）を含む溶液を導入する。十分に反応を行った後、溶液をキャピラリの出口１１２から排出する。全てのプローブビーズ１１３が蛍光標識される。（図３（ａ））

プローブビーズが配列されたキャピラリを蛍光読取装置により蛍光検出したときに得られる画像を示す。読取時には第２の蛍光物質が発する蛍光波長（第２の蛍光波長）を検出する。このとき、全てのプローブビーズの表面及び／又は内部には第２の蛍光物質が吸着及び/又は結合しているため、全てのプローブビーズの蛍光スポット１１４が検出される。プローブビーズの位置並びに順序を検出する目的では、第２の蛍光波長は第１の蛍光波長と一致していても差し支えない。但し、第２の蛍光波長と第１の蛍光波長が異なるように蛍光波長を選択した場合、全てのプローブビーズに第２の蛍光物質を結合した後でも、第１の蛍光波長による蛍光読取を行うことができる。すなわち、図３（ｂ）に示す蛍光画像を取得した後に、図２（ｂ）に示す蛍光画像を取得することができる。

図２（ｂ）に示す蛍光画像と図３（ｂ）に示す蛍光画像を重ね合わせて解析する。図２（ｂ）にて蛍光検出されたプローブビーズ１０８、同１０９並びに同１１０について、図３（ｂ）に示す蛍光画像を利用することにより、キャピラリ内での正確な順序を知ることが可能となる。従って、標的となる生体分子を捕捉しているプローブの種類を正確に同定することが可能となる。

以下、比較例と実施例を示して本発明を説明する。
[比較例]
マレイミドコートビーズでのハイブリダイゼーションを行った。ビーズの名称及び特性は表１の通りである。

図４に結果画像（図４(a)）とビーズ配列（図４(b)）を示す。図４の結果より、図４(a)は蛍光標識された標的となるＤＮＡを含むサンプルとの反応が終了した後の画像であり、中央付近の３個のビーズだけが反応しており、蛍光を発する。その他のビーズは蛍光を発しないため、位置確認が困難である。

［実施例１］
サンプルとの反応後に、核酸結合色素（ＳＹＴＯ６１（商標名））の溶液を流してビーズの染色を行った。

図５に結果画像（図５(a)、図５(b)）とビーズ配列（図５(c)）を示す。図５(a)は蛍光標識された標的となるＤＮＡを含むサンプルとの反応実験が終了した後の画像であり、中央付近の３つのビーズだけが反応している。これに対して、図５(b)はサンプルとの反応実験が終了した後、さらにＳＹＴＯ６１を流し、最後に洗浄液で洗浄した後の画像である。図５の結果より、全てのビーズがＳＹＴＯ６１で染色され、蛍光を発することが分かり、図５(a)と図５(b)の２つの画像を対比することで、反応したビーズの種類を特定することが可能となった。

［実施例２］
蛍光標識された標的となるＤＮＡを含むサンプルとの反応後に、キャピラリに高濃度の蛍光色素溶液を流してビーズの染色を行った。図６に結果画像(図６(a)、図６(b))とビーズ配列(図６(c))を示す。図６(a)は蛍光標識された標的となるＤＮＡを含むサンプルとの反応実験が終了した後の画像であり、中央付近の１つのビーズだけが反応している。これに対して、図６(b)はサンプルとの反応実験が終了した後、キャピラリに高濃度の蛍光色素溶液を流した後の画像である。高濃度の蛍光色素溶液を流すと、溶液が強い蛍光を発するため、ビーズが白抜きに映っている。図６の結果より、全てのビーズが白抜きに映ることが分かり、図６(a)と図６(b)を対比することで、反応したビーズの種類を特定することが可能となった。

本発明のように、全てのビーズの位置及び順序を特定することにより、キャピラリビーズアレイの実用性を向上させることができる。また、本発明では、従来用いられている蛍光読取装置をそのまま用いることができることからも、キャピラリビーズアレイの実用性を向上させることができる。

これにより、キャピラリビーズアレイを用いる生化学的又は免疫学的検査の結果の信頼性を大幅に向上させることが可能となった。

本発明を実施しない場合の反応前のビーズ配列（図１(a)）と蛍光発色（図１(b)）を示す。 本発明を実施しない場合の、反応後のビーズ配列（図２(a)）と蛍光発色（図２(b)）を示す。 本発明を実施した場合のビーズ配列（図３(a)）と蛍光発色（図３(b)）を示す。 本発明を行わなかった場合の、結果画像（図４(a)）とビーズ配列（図４(b)）を示す。 サンプルとの反応後に、核酸結合色素の溶液を流してビーズの染色を行った場合の、結果画像（図５(a)、図５(b)）とビーズ配列（図５(c)）を示す。 キャピラリに高濃度の蛍光色素溶液を流してビーズの染色を行った場合の、結果画像（図６(a)、図６(b)）とビーズ配列（図６(c)）を示す。

符号の説明

１０１・・・キャピラリ、１０２・・・プローブビーズ、１０３・・・キャピラリの入り口、１０４・・・キャピラリの出口、１０５〜１０７・・・蛍光標識された目的の生体分子を表面及び／又は内部に捕捉しているプローブビーズ、１０８〜１１０・・・蛍光標識された目的の生体分子を表面及び／又は内部に捕捉しているプローブビーズの蛍光スポット、１１１・・・キャピラリの入り口、１１２・・・キャピラリの出口、１１３・・・全てのプローブビーズを蛍光標識するための蛍光物質により蛍光標識されたプローブビーズ、１１４・・・全てのプローブビーズを蛍光標識するための蛍光物質により蛍光標識されたプローブビーズの蛍光スポット。

Claims (6)

1. 標的となる生体分子を捕捉する性質を持つプローブを表面及び／又は内部に結合したプローブビーズを基板上に形成したキャピラリに多数個配列したキャピラリビーズアレイにおいて、キャピラリ中にプローブに特異的に結合する性質を持つ蛍光色素を含む溶液を通過させ、蛍光発色の部分をビーズの位置と判断することにより、キャピラリ中に配列した全てのビーズの位置を蛍光読取装置により検出する工程を含むことを特徴とする、キャピラリビーズアレイのプローブビーズの位置検出方法。
2. 標的となる生体分子を捕捉する性質を持つプローブを表面及び／又は内部に結合したプローブビーズを基板上に形成したキャピラリに多数個配列したキャピラリビーズアレイにおいて、キャピラリ中に高濃度の蛍光色素を含む溶液を通過させ、蛍光発色の無い部分をビーズの位置と判断することにより、キャピラリ中に配列した全てのビーズの位置を蛍光読取装置により検出する工程を含むことを特徴とする、キャピラリビーズアレイのプローブビーズの位置検出方法。
3. 請求項１において、蛍光標識された標的となる生体分子を含む溶液をキャピラリ内に導入し、該生体分子を捕捉する性質を持つプローブを表面及び／又は内部に結合したプローブビーズに該生体分子を捕捉し、蛍光読取装置により、キャピラリビーズアレイのキャピラリ内に配列された多数個のプローブビーズのうち、その表面及び／又は内部に結合したプローブを介して標的となる生体分子を捕捉しているプローブビーズの蛍光スポットのみを含む蛍光画像を得、該蛍光画像と全てのプローブビーズの蛍光スポットを含む蛍光画像を比較し、キャピラリビーズアレイ中の標的となる生体分子を捕捉しているプローブビーズの位置及び順序を知ることを特徴とする、キャピラリビーズアレイのプローブビーズの位置検出方法。
4. 請求項２において、蛍光標識された標的となる生体分子を含む溶液をキャピラリ内に導入し、該生体分子を捕捉する性質を持つプローブを表面及び／又は内部に結合したプローブビーズに該生体分子を捕捉し、蛍光読取装置により、キャピラリビーズアレイのキャピラリ内に配列された多数個のプローブビーズのうち、その表面及び／又は内部に結合したプローブを介して標的となる生体分子を捕捉しているプローブビーズの蛍光スポットのみを含む蛍光画像を得、該蛍光画像と蛍光発色の無い全てのプローブビーズのスポットを含む蛍光画像を比較し、キャピラリビーズアレイ中の標的となる生体分子を捕捉しているプローブビーズの位置及び順序を知ることを特徴とする、キャピラリビーズアレイのプローブビーズの位置検出方法。
5. 請求項１乃至４のいずれかにおいて、全てのビーズの位置を蛍光読取装置により検出する工程が、蛍光標識された標的となる生体分子を含む溶液をキャピラリ内に導入し、該生体分子を捕捉する性質を持つプローブを表面及び／又は内部に結合したプローブビーズに該生体分子を捕捉し、蛍光読取装置により、キャピラリビーズアレイのキャピラリ内に配列された多数個のプローブビーズのうち、その表面及び／又は内部に結合したプローブを介して標的となる生体分子を捕捉しているプローブビーズの蛍光スポットのみを含む蛍光画像を得る工程の後であることを特徴とする、キャピラリビーズアレイのプローブビーズの位置検出方法。
6. 請求項１乃至５のいずれかにおいて、２つの蛍光画像の比較が２つの画像を重ね合わせることを特徴とする、キャピラリビーズアレイのプローブビーズの位置検出方法。

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