JP2005306757A - 抗インターロイキン２１受容体（ｉｌ−２１ｒ）抗体および本抗体を産生するハイブリドーマ - Google Patents
抗インターロイキン２１受容体（ｉｌ−２１ｒ）抗体および本抗体を産生するハイブリドーマ Download PDFInfo
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Abstract
【課題】未変性のインターロイキン21受容体（IL-21R）のみを特異的に認識する抗インターロイキン21受容体（IL-21R）モノクローナル抗体を提供する。
【課題解決手段】
ヒトインターロイキン21受容体（IL-21R）の細胞外ドメインを抗原として、マウス脾細胞を免疫感作して得られた細胞、とミエローマ細胞とを融合してハイブリドーマを得、該ハイブリドーマをさらにスクリーングすることにより、未変性のインターロイキン21受容体（IL-21R）のみを特異的に認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンを得、このハイブリドーマクローンを培養して上記特性を有する抗インターロイキン21受容体（IL-21R）モノクローナル抗体を得る。
【課題解決手段】
ヒトインターロイキン21受容体（IL-21R）の細胞外ドメインを抗原として、マウス脾細胞を免疫感作して得られた細胞、とミエローマ細胞とを融合してハイブリドーマを得、該ハイブリドーマをさらにスクリーングすることにより、未変性のインターロイキン21受容体（IL-21R）のみを特異的に認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンを得、このハイブリドーマクローンを培養して上記特性を有する抗インターロイキン21受容体（IL-21R）モノクローナル抗体を得る。
Description
本発明は、未変性のインターロイキン21受容体(IL-21R)のみを特異的に認識する抗インターロイキン21受容体(IL-21R)モノクローナル抗体及びその産生ハイブリドーマに関する。
インターロイキンは白血球間の情報伝達を媒介するタンパク質性因子であり，現在までにインターロイキン28まで報告されている．その機能は細胞増殖，分化，活性化など多岐にわたっている。その中で2003年にクローニングされた新規なサイトカインであるヒトインターロイキン21(IL-21) は、免疫系活性化サイトカインとして機能する。その受容体としてはヒトインターロイキン21(IL-21)に固有のヒトIL-21受容体(IL-21R)があり、ヒトIL-21とヒトIL-21受容体(IL-21R)とヒト共通γ鎖（γc）と三者複合体を形成することで細胞内シグナル伝達を行なう。
従来の抗ヒトインターロイキン21受容体(IL-21R) モノクローナル抗体は、変性状態のインターロイキン21受容体も未変性の生理的活性を保っている状態のインターロイキン21受容体もともに認識してしまう。そのため、免疫沈降法等を用いてヒトIL-21受容体(IL-21R)との相互作用をする未知の因子を同定しようとした場合、変性したインターロイキン21受容体にも抗体が結合してしまい、それによって多くの蛋白質因子が非特異的に変性したインターロイキン21受容体に結合し、生理活性を有するインターロイキン21受容体に特異的に結合する蛋白質因子を同定できない。そのためヒトIL-21受容体(IL-21R)を介した免疫活性化の調節機構が研究できず、ヒトIL-21受容体(IL-21R)との相互作用をする未知の因子の同定が困難な状況にある。未変性のインターロイキン21受容体(IL-21R)のみを認識し、変性したインターロイキン21受容体(IL-21R)を認識しない抗体があれば、本問題は解決すると期待されていた。
本発明の課題は、生理活性を有する未変性のインターロイキン21受容体(IL-21R)のみを認識し、変性したインターロイキン21受容体(IL-21R)を認識しない、モノクローナル抗体を提供することにあり、また、このため、該抗体を容易にかつ多量に生産しうるハイブリドーマを提供しようとするものである。
そこで、本発明者等は、鋭意研究の結果、ヒトインターロイキン21受容体(IL-21R)を抗原として、マウス脾細胞を免疫感作して得られた細胞とミエローマ細胞とを融合してヒトインターロイキン21受容体(IL-21R)抗体を産生するハイブリドーマクローンを得、このハイブリドーマクローンをさらにスクリーニングすることにより、生理活性を有する未変性のインターロイキン21受容体(IL-21R)のみを認識し、変性したインターロイキン21受容体(IL-21R)を認識しない抗インターロイキン21受容体(IL-21R)モノクローナル抗体を高率に産生するとともに、かつ増殖性に優れたクローンを見いだし本発明を完成させるに至ったものである。
すなわち、本発明は以下（１）及び（２）に係るものである。
（１） ヒトインターロイキン21受容体(IL-21R)を抗原とし、ハイブリドーマ法により得られた、未変性のインターロイキン21受容体(IL-21R)のみを認識し、変性したインターロイキン21受容体(IL-21R)を認識しない抗インターロイキン21受容体(IL-21R)モノクローナル抗体。
（２） ヒトインターロイキン21受容体(IL-21R)を抗原として、マウス脾細胞を免疫感作して得られた細胞とミエローマ細胞とを融合して得られたものであって、請求項１に記載の抗インターロイキン21受容体(IL-21R)モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
（１） ヒトインターロイキン21受容体(IL-21R)を抗原とし、ハイブリドーマ法により得られた、未変性のインターロイキン21受容体(IL-21R)のみを認識し、変性したインターロイキン21受容体(IL-21R)を認識しない抗インターロイキン21受容体(IL-21R)モノクローナル抗体。
（２） ヒトインターロイキン21受容体(IL-21R)を抗原として、マウス脾細胞を免疫感作して得られた細胞とミエローマ細胞とを融合して得られたものであって、請求項１に記載の抗インターロイキン21受容体(IL-21R)モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
以上説明したように、本発明の抗インターロイキン21受容体（IL-21R）モノクローナル抗体は、インターロイキン21受容体（IL-21R）の細胞内局在、細胞のガン化の阻害、IL-21R結合タンパク質の同定・精製等、極めて広い範囲の用途に適用可能なものである。また、本発明のハイブリドーマは、上記モノクローナル抗体を効率よく生産可能なものであり、本発明は、細胞、遺伝子操作技術等において極めて有用なものである。
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
本発明の抗インターロイキン21受容体(IL-21R)モノクローナル抗体は、ヒトインターロイキン21受容体(IL-21R)を抗原とし、ハイブリドーマ法により得られる。以下に、この製法についてさらに具体的に説明する。
使用する抗原は、ヒトインターロイキン21受容体(IL-21R)の細胞外ドメインを大腸菌に発現させ、分離精製することにより得られる。
抗体産生細胞の調製は、マウスに上記抗原を腹腔内注入して免役し、マウスから常法により脾臓細胞を採取する。
本発明の抗インターロイキン21受容体(IL-21R)モノクローナル抗体は、ヒトインターロイキン21受容体(IL-21R)を抗原とし、ハイブリドーマ法により得られる。以下に、この製法についてさらに具体的に説明する。
使用する抗原は、ヒトインターロイキン21受容体(IL-21R)の細胞外ドメインを大腸菌に発現させ、分離精製することにより得られる。
抗体産生細胞の調製は、マウスに上記抗原を腹腔内注入して免役し、マウスから常法により脾臓細胞を採取する。
次いで上記免疫感作されたマウスの脾細胞とミエローマ細胞をポリエチレングリコールにより細胞融合させ、常法により、HAT培地でハイブリドーマを選別し、さらに限界希釈法により得たハイブリドーマの各クローンの培養上澄みを、上記抗原を使用した酵素免疫測定法（ELISA）により測定し陽性のハイブリドーマクローンを得る。 さらに得られたクローンについて、インターロイキン21受容体(IL-21R)に特異的に陽性反応を示すハイブリドーマクローンを得る。
次に、本発明においては、上記ハイブリドーマクローンの中から、未変性のインターロイキン21受容体(IL-21R)のみを認識し、変性したインターロイキン21受容体(IL-21R)を認識しない抗体を産生するクローンを選択する工程を伴う。
次に、本発明においては、上記ハイブリドーマクローンの中から、未変性のインターロイキン21受容体(IL-21R)のみを認識し、変性したインターロイキン21受容体(IL-21R)を認識しない抗体を産生するクローンを選択する工程を伴う。
これには、未変性のインターロイキン21受容体(IL-21R)と、変性処理したインターロイキン21受容体(IL-21R)を用意し、これら受容体と上記ハイブリドーマクローンが各々産生する培養上澄等の抗体含有試料と接触させ、該抗体含有試料のうち、未変性のインターロイキン21受容体(IL-21R)と反応し、変性したインターロイキン21受容体(IL-21R)とは反応しない抗体含有試料を産生したクローンを選択することにより行う。
この手段として、具体的には、例えば、以下の手段が挙げられる。
この手段として、具体的には、例えば、以下の手段が挙げられる。
ELISAを行なうにあたり、抗原であるインターロイキン21受容体(IL-21R)をリン酸バッファー中で６０度１５分熱処理し、変性させたインターロイキン21受容体(IL-21R)を用意する。この変性インターロイキン21受容体(IL-21R)と未変性インターロイキン21受容体(IL-21R)を９６ウェルマイクロプレートに固定する。固定後、BSAでブロッキングし、この未変性のインターロイキン21受容体(IL-21R)と変性インターロイキン21受容体(IL-21R)に上記ハイブリドーマクローンの各培養上清を反応させ（室温、90分間）、洗浄後にさらにアルカリフォスファターゼ標識抗マウスIgG+IgM抗体を添加して室温で60分間反応させ、次いでp-ニトロフェニルリン酸を基質とした発色系で検出する。ここで、熱変性を施していない抗原には発色があるが、熱変性を施した抗原には発色がないクローンを選択する。選択されたクローンは、未変性のインターロイキン21受容体(IL-21R)のみを認識し、変性したインターロイキン21受容体(IL-21R)を認識しない抗体を産生するクローンである。
この後、抗体産生能力及び増殖性が良好なクローンをさらにスクリーニングし、本発明の抗インターロイキン21受容体(IL-21R)モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを得る。
上記ハイブリドーマから得られた本発明の抗IL-21Rモノクローナル抗体は、未変性のインターロイキン21受容体(IL-21R)のみを認識し、変性したインターロイキン21受容体(IL-21R)を認識しない。
本発明の抗IL-21Rモノクローナル抗体は上記用途のほかにも様々な用途に使用できる。これらについて以下に例示する。
（ａ）インターロイキン21受容体（IL-21R）結合蛋白質の同定・精製
本発明の抗インターロイキン21受容体（IL-21R）モノクローナル抗体を用いて、カラムを作成することにより、インターロイキン21受容体（IL-21R）結合蛋白質の同定・精製を行うことができる。
（ａ）インターロイキン21受容体（IL-21R）結合蛋白質の同定・精製
本発明の抗インターロイキン21受容体（IL-21R）モノクローナル抗体を用いて、カラムを作成することにより、インターロイキン21受容体（IL-21R）結合蛋白質の同定・精製を行うことができる。
（ｂ）抗インターロイキン21受容体（IL-21R）モノクローナル抗体によるガン化の阻害
本発明の抗インターロイキン21受容体（IL-21R）モノクローナル抗体を培養ガン細胞の培養液に注入することにより、ガン化の阻害を行ない、ガン化の決定因子の同定を行なう。
本発明の抗インターロイキン21受容体（IL-21R）モノクローナル抗体を培養ガン細胞の培養液に注入することにより、ガン化の阻害を行ない、ガン化の決定因子の同定を行なう。
（ｃ）本発明の抗インターロイキン21受容体（IL-21R）モノクローナル抗体の改変による他の種類のインターロイキン受容体に対する抗体の作成
本発明の抗インターロイキン21受容体（IL-21R）モノクローナル抗体の遺伝子を単離し、抗原決定部位の遺伝配列を決定し、その部分に変異を導入することにより、抗体の抗原特異性を改変しインターロイキン21受容体（IL-21R）以外の新規インターロイキンの発見を行なう。
本発明の抗インターロイキン21受容体（IL-21R）モノクローナル抗体の遺伝子を単離し、抗原決定部位の遺伝配列を決定し、その部分に変異を導入することにより、抗体の抗原特異性を改変しインターロイキン21受容体（IL-21R）以外の新規インターロイキンの発見を行なう。
実施例：
(1)抗原の調製
ヒトインターロイキン21受容体（IL-21R）のN端側の222アミノ酸残基配列に相当する遺伝子をヒト遺伝子ｃDNAライブラリーからPCRにより増幅し、大腸菌発現ベクター：ｐUTEに制限酵素：NcoI-SacIIを用いて挿入した。その、遺伝子の塩基配列及び対応するタンパク質のアミノ酸配列を配列表の配列番号１に示す。
(1)抗原の調製
ヒトインターロイキン21受容体（IL-21R）のN端側の222アミノ酸残基配列に相当する遺伝子をヒト遺伝子ｃDNAライブラリーからPCRにより増幅し、大腸菌発現ベクター：ｐUTEに制限酵素：NcoI-SacIIを用いて挿入した。その、遺伝子の塩基配列及び対応するタンパク質のアミノ酸配列を配列表の配列番号１に示す。
得られたベクターで大腸菌BL21(DE3)を形質転換し、前培養の後、本培養を５００ｍL振とうフラスコに２００ｍLのLB培地が入っているもので行なった。終濃度1ｍMになるようIPTGを添加しヒトインターロイキン21受容体の発現を誘導した。菌体を回収後、リン酸バッファーで懸濁し、超音波により菌体を破砕し、4℃で遠心後、沈殿を回収した。得られた沈殿を６M 塩酸グアニジンを含む５０ｍMTris-HCl（ｐH8.0）で可溶化し、His結合カラムを用いて精製した。透析により変性剤を除去し、ゲル濾過クロマトグラフィーにより最終精製を行なった。
(2)細胞融合及びクローニング
８週齡雌マウスに、先に調製した抗原を腹腔内注射して、免疫感作を行った。75日間免疫感作の後、脾細胞を取り出した。2 x 108個の脾細胞と2 x 107個の8-アザグアニン耐性マウスミエローマ細胞であるP3U1 (P3-X63-Ag8-U1)とを混合し、遠心後の沈査に50%ポリエチレングリコール（平均分子量4000）を添加し、２分間穏やかに反応させることにより細胞融合を行った。得られたハイブリドーマ含有液を96ウェルマイクロカルチャープレートに植え込み、HAT培地を用いて２週間培養を行った。増殖の認められたウェルの培養上清を採取して酵素免疫測定法(ELISA)によりスクリーニングを行い、抗原として用いたヒトインターロイキン21受容体（IL-21R）に陽性を示したウェルの細胞についてクローニングを行った。ELISA陽性ウェル中の細胞を96ウェルマイクロカルチャープレートに平均１ウェル当り0.1-1個を植え込んだ。培養開始後２週間でコロニーの形成が認められ、こうして得られたコロニーについて上記と同様にスクリーニング及びクローニングを行ない、所期の反応性を示す抗体を産生しているハイブリドーマ（クローン）を得た。
８週齡雌マウスに、先に調製した抗原を腹腔内注射して、免疫感作を行った。75日間免疫感作の後、脾細胞を取り出した。2 x 108個の脾細胞と2 x 107個の8-アザグアニン耐性マウスミエローマ細胞であるP3U1 (P3-X63-Ag8-U1)とを混合し、遠心後の沈査に50%ポリエチレングリコール（平均分子量4000）を添加し、２分間穏やかに反応させることにより細胞融合を行った。得られたハイブリドーマ含有液を96ウェルマイクロカルチャープレートに植え込み、HAT培地を用いて２週間培養を行った。増殖の認められたウェルの培養上清を採取して酵素免疫測定法(ELISA)によりスクリーニングを行い、抗原として用いたヒトインターロイキン21受容体（IL-21R）に陽性を示したウェルの細胞についてクローニングを行った。ELISA陽性ウェル中の細胞を96ウェルマイクロカルチャープレートに平均１ウェル当り0.1-1個を植え込んだ。培養開始後２週間でコロニーの形成が認められ、こうして得られたコロニーについて上記と同様にスクリーニング及びクローニングを行ない、所期の反応性を示す抗体を産生しているハイブリドーマ（クローン）を得た。
(3)スクリーニング
上記（２）で得たハイブリドーマのうち、未変性のインターロイキン21受容体(IL-21R)のみを認識し、変性したインターロイキン21受容体(IL-21R)を認識しない抗インターロイキン21受容体（IL-21R）抗体を産生する所期のクローンを得るためのスクリーニングは、ELISA法を利用して行った。抗原であるインターロイキン21受容体(IL-21R)をリン酸バッファー中で６０度１５分熱処理し、変性させたインターロイキン21受容体(IL-21R)を用意する。この変性インターロイキン21受容体(IL-21R)と未変性インターロイキン21受容体(IL-21R)を９６ウェルマイクロプレートに固定する。固定後、BSAでブロッキングし、この未変性のインターロイキン21受容体(IL-21R)と変性インターロイキン21受容体(IL-21R)に上記ハイブリドーマクローンの各培養上清を反応させ（室温、90分間）、洗浄後にさらにアルカリフォスファターゼ標識抗マウスIgG+IgM抗体を添加して室温で60分間反応させ、次いでp-ニトロフェニルリン酸を基質とした発色系で検出する。ここで、熱変性を施していない抗原には発色があるが、熱変性を施した抗原には発色がないクローンを選択する。
上記（２）で得たハイブリドーマのうち、未変性のインターロイキン21受容体(IL-21R)のみを認識し、変性したインターロイキン21受容体(IL-21R)を認識しない抗インターロイキン21受容体（IL-21R）抗体を産生する所期のクローンを得るためのスクリーニングは、ELISA法を利用して行った。抗原であるインターロイキン21受容体(IL-21R)をリン酸バッファー中で６０度１５分熱処理し、変性させたインターロイキン21受容体(IL-21R)を用意する。この変性インターロイキン21受容体(IL-21R)と未変性インターロイキン21受容体(IL-21R)を９６ウェルマイクロプレートに固定する。固定後、BSAでブロッキングし、この未変性のインターロイキン21受容体(IL-21R)と変性インターロイキン21受容体(IL-21R)に上記ハイブリドーマクローンの各培養上清を反応させ（室温、90分間）、洗浄後にさらにアルカリフォスファターゼ標識抗マウスIgG+IgM抗体を添加して室温で60分間反応させ、次いでp-ニトロフェニルリン酸を基質とした発色系で検出する。ここで、熱変性を施していない抗原には発色があるが、熱変性を施した抗原には発色がないクローンを選択する。
(4)抗インターロイキン21受容体（IL-21R）抗体産生ハイブリドーマの作製及び当該抗インターロイキン21受容体（IL-21R）抗体の取得
上記（２）により、抗インターロイキン21受容体（IL-21R）抗体の産生能を有するハイブリドーマを10クローン樹立することができたが、さらに、上記（３）のスクリーニングを行うことにより、上記インターロイキン21受容体に対して陽性の抗インターロイキン21受容体（IL-21R）抗体産生ハイブリドーマは３クローン樹立された。このうちハイブリドーマ増殖性及び抗体産生能におけるバランスの面から最も優れていると考えられるクローンに係るハイブリドーマを血清無添加培地中もしくはプリスタン投与マウスの腹腔内において増殖させその培養上清もしくは腹水を回収した。これらを硫安塩析後、2-メルカプトピリジン・カラムクロマトグラフィーにより精製回収し、本発明の抗インターロイキン21受容体（IL-21R）モノクローナル抗体を得た。上記最終的に得られたハイブリドーマクローンは受託番号FERM P-19754として、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託されている。
上記（２）により、抗インターロイキン21受容体（IL-21R）抗体の産生能を有するハイブリドーマを10クローン樹立することができたが、さらに、上記（３）のスクリーニングを行うことにより、上記インターロイキン21受容体に対して陽性の抗インターロイキン21受容体（IL-21R）抗体産生ハイブリドーマは３クローン樹立された。このうちハイブリドーマ増殖性及び抗体産生能におけるバランスの面から最も優れていると考えられるクローンに係るハイブリドーマを血清無添加培地中もしくはプリスタン投与マウスの腹腔内において増殖させその培養上清もしくは腹水を回収した。これらを硫安塩析後、2-メルカプトピリジン・カラムクロマトグラフィーにより精製回収し、本発明の抗インターロイキン21受容体（IL-21R）モノクローナル抗体を得た。上記最終的に得られたハイブリドーマクローンは受託番号FERM P-19754として、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託されている。
（５）抗インターロイキン21受容体（IL-21R）モノクローナル抗体の特性
（ａ）抗インターロイキン21受容体（IL-21R）モノクローナル抗体の基質特異性抗インターロイキン21受容体（IL-21R）モノクローナル抗体の基質特異性は、ELISA法を利用して決定した。抗原であるインターロイキン21受容体(IL-21R)をリン酸バッファー中で６０度１５分熱処理し、変性させたインターロイキン21受容体(IL-21R)を用意する。この変性インターロイキン21受容体(IL-21R)と未変性インターロイキン21受容体(IL-21R)および陰性コントロールとしてHeLa細胞の細胞質画分を９６ウェルマイクロプレートにそれぞれ（1μg/mlの濃度で50μl）固定する。固定後、BSAでブロッキングし、この未変性のインターロイキン21受容体(IL-21R)と変性インターロイキン21受容体(IL-21R)に上記ハイブリドーマクローンの各培養上清を反応させ（室温、90分間）、洗浄後にさらにアルカリフォスファターゼ標識抗マウスIgG+IgM抗体を添加して室温で60分間反応させ、次いでp-ニトロフェニルリン酸を基質とした発色系で検出する。結果を第１図に示す。図示されるように、本抗インターロイキン21受容体（IL-21R）モノクローナル抗体は未変性のインターロイキン21受容体(IL-21R)のみを認識し、変性したインターロイキン21受容体(IL-21R)及びその他の蛋白質を認識しないことが判明した。
（ａ）抗インターロイキン21受容体（IL-21R）モノクローナル抗体の基質特異性抗インターロイキン21受容体（IL-21R）モノクローナル抗体の基質特異性は、ELISA法を利用して決定した。抗原であるインターロイキン21受容体(IL-21R)をリン酸バッファー中で６０度１５分熱処理し、変性させたインターロイキン21受容体(IL-21R)を用意する。この変性インターロイキン21受容体(IL-21R)と未変性インターロイキン21受容体(IL-21R)および陰性コントロールとしてHeLa細胞の細胞質画分を９６ウェルマイクロプレートにそれぞれ（1μg/mlの濃度で50μl）固定する。固定後、BSAでブロッキングし、この未変性のインターロイキン21受容体(IL-21R)と変性インターロイキン21受容体(IL-21R)に上記ハイブリドーマクローンの各培養上清を反応させ（室温、90分間）、洗浄後にさらにアルカリフォスファターゼ標識抗マウスIgG+IgM抗体を添加して室温で60分間反応させ、次いでp-ニトロフェニルリン酸を基質とした発色系で検出する。結果を第１図に示す。図示されるように、本抗インターロイキン21受容体（IL-21R）モノクローナル抗体は未変性のインターロイキン21受容体(IL-21R)のみを認識し、変性したインターロイキン21受容体(IL-21R)及びその他の蛋白質を認識しないことが判明した。
Claims (2)
- ヒトインターロイキン21受容体(IL-21R)を抗原とし、ハイブリドーマ法により得られた、未変性のインターロイキン21受容体(IL-21R)のみを特異的に認識する、抗インターロイキン21受容体(IL-21R)モノクローナル抗体。
- ヒトインターロイキン21受容体(IL-21R)を抗原として、マウス脾細胞を免疫感作して得られた細胞とミエローマ細胞とを融合して得られたものであって、請求項１に記載の抗インターロイキン21受容体(IL-21R）モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
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