JP2005237348A - ＴＧＦ−β高生産不死化ヒト由来細胞およびそれを用いたスクリーニング方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 本発明は、ＴＧＦ−β高生産不死化ヒト由来細胞およびそれを用いたスクリーニング方法を提供する事を目的とする。
【解決手段】 ヒト由来細胞を不死化することにより、ＴＧＦ−β高産生不死化細胞株を取得し、本細胞とケラチノサイト細胞を被験物質の存在下に共培養して、ケラチノサイト細胞の増殖を観察することによりケラチノサイト細胞増殖促進剤をスクリーニングする、もしくは、ＴＧＦ−βの産生レベルを検出することによりＴＧＦ−β産生抑制剤をスクリーニングする。もしくは本細胞を被験物質の存在下に培養し、ＴＧＦ−βの産生レベルを検出することによりＴＧＦ−β産生抑制剤をスクリーニングする。
【選択図】 図１

Description

本発明は、ＴＧＦ−β産生抑制作用物質のスクリーニングに利用可能なＴＧＦ−β高生産不死化ヒト由来細胞および本細胞を用いたＴＧＦ−β産生抑制作用物質のスクリーニング方法に関する。

ＴＧＦ−β（transforming growth factor−β）は細胞増殖促進作用または阻害作用、種々の細胞機能の促進作用または阻害作用、細胞外マトリックスの産生促進作用等、多くの活性を有するサイトカインであり、血管内皮細胞、肝細胞などの上皮細胞、毛乳頭細胞等さまざまな組織、細胞で産生されることが知られている。ＴＧＦ−βは種々の細胞で細胞外マトリックス産生促進作用を示すことから、糸球体腎炎、腎硬化症、肝線維症、肝硬変、肺線維症、骨髄線維症、関節リウマチ、増殖性硝子体網膜症等を引き起こす主原因と考えられ、ＴＧＦ−βの産生を抑制することにより、これら疾病の治療が可能になるものと考えられる。これまでにヒト由来細胞が産生するＴＧＦ−βの産生抑制効果を示すものとしては、網膜色素上皮細胞におけるインターフェロン（特許文献１参照）、腎臓のメサンギウム細胞におけるマクロライド化合物（特許文献２参照）、肝または肺由来細胞におけるメシル酸カモスタット等の各種化合物（特許文献３、式(I)など参照）が知られている。

また、ＴＧＦ−βはケラチノサイトの増殖や機能を抑制してアポトーシスを誘導することから脱毛にも深く関わっており、ＴＧＦ−βの産生抑制による育毛効果が期待できる。しかし、これまでＴＧＦ−β産生抑制により育毛効果を示す物質は知られていない。

ＴＧＦ−βは潜在型として生産、分泌され、プラスミンやトロンボスポンジン等によって活性化されてはじめてその機能を発揮する。よって、産生した潜在型ＴＧＦ−βの活性化に対する阻害作用を有する化合物や、ＴＧＦ−βの拮抗物質にはＴＧＦ−βの作用を抑制する効果が期待できる。例えば育毛分野ではＴＧＦ−βの活性化抑制効果を有する化合物であるｔ−フラバノンを育毛成分として含有する育毛剤が市販されている。

更に、プラスミノーゲンアクチベーター阻害因子−１（ＰＡＩ−１）産生能を有する細胞をＴＧＦ−β２および被験物質の存在下で培養し、ＰＡＩ−１を測定することによるＴＧＦ−β２作用物質、例えばアンタゴニストの評価方法が開発されている（特許文献４参照）。特許文献４に開示の評価方法はＴＧＦ−β２を外部より添加して作用性を評価する方法であることから、この評価系により細胞自身が産生するＴＧＦ−β量を変化させる物質をスクリーニングすることは出来ない。

また、生体より分離した培養細胞は、初代培養の際には元の生体内での性質を保持していたとしても、継代を重ねるに従って元来の性質を失う場合が多いことが知られており、例えば培養毛乳頭細胞の男性ホルモンレセプターのｍＲＮＡ発現量は継代培養により減少していくことが知られている。このように発現量の低下した細胞では外部から男性ホルモンを与えても生体内で認められるような男性ホルモンに対する応答は認められない。ケラチノサイトの強力な増殖抑制因子であるＴＧＦ−βは男性ホルモンによって産生亢進する。よってＴＧＦ−β産生抑制効果を有する物質の評価には継代培養された細胞は不適であり、また一方ではスクリーニングのために初代培養の細胞を大量に確保することは困難であることから、ＴＧＦ−βの産生抑制効果を有する物質の安定評価系の確立はなされていなかった。

更に不死化ヒト毛乳頭細胞及びそれを用いた育毛剤評価法が開発されているが（特許文献５参照）、この特許文献５に記載されているＳＶ４０ウイルスＬａｒｇｅＴ抗原遺伝子を用いた不死化方法は、ヒト由来細胞に対しては既にヒト冠状動脈血管内皮細胞を用いた不死化細胞株を確立方法（特許文献６参照）が報告されており、また毛乳頭細胞ではラット・ヒゲ由来毛乳頭細胞を用いた同法による不死化株の作出に成功しており、この特許文献５の公開以前から知られていた方法であることは明らかである。

更にＲＴ−ＰＣＲによる発現解析の結果から、取得した不死化毛乳頭細胞は不死化前のヒト毛乳頭細胞と実質的に同じＴＧＦ−β生産性を有することが示されており、不死化することでＴＧＦ−β高産生細胞株を取得することが可能とは考え難かった。
特開平１０−１１４６７６号公報 特開２００３−１３７７９１号公報 特開平８−３３３２４９号公報 特開２０００−３４２２９６号公報 特開平１１−８９５６５号公報 特開平９−１７３０６０号公報

本発明の目的は、ＴＧＦ−β高生産不死化ヒト由来細胞およびそれを用いたスクリーニング方法を提供することにある。

本発明者らは、鋭意研究の結果、ヒト由来細胞を不死化することにより継代可能な不死化細胞株を取得し、取得した不死化細胞株の中から安定してＴＧＦ−βを高生産する細胞株を評価、取得した。更に、取得したＴＧＦ−β高生産細胞株を用いてＴＧＦ−βの産生を抑制する物質のスクリーニング方法を確立することで本発明を完成するに至った。ＴＧＦ−β高生産細胞株を用いたＴＧＦ−β産生抑制物質のスクリーニング方法としては、取得したＴＧＦ−β高生産細胞株に被験物質を作用させ、生産されるＴＧＦ−β量をＥＬＩＳＡ等の方法により測定してＴＧＦ−β産生抑制物質を取得する方法が提供できる。更に、ＴＧＦ−β高生産細胞株と他のＴＧＦ−βシグナルを受け取る細胞株、例えばＴＧＦ−β高生産不死化毛乳頭細胞とケラチノサイトなどを同一の空間内で共培養し、生産されるＴＧＦ−β量をＥＬＩＳＡ等の方法により測定し、また一方でＴＧＦ−βシグナルを受け取る細胞の細胞増殖度を測定して、ＴＧＦ−β産生抑制とＴＧＦ−βシグナルを受け取る細胞の細胞増殖とを関連付けてＴＧＦ−β生産抑制物質を評価取得する方法が提供できる。

すなわち、本発明にかかる不死化ヒト由来細胞は、不死化前のヒト由来細胞に比べて高いＴＧＦ−β産生能を有することを特徴とするものである。また、この高ＴＧＦ−β産生能を有する不死化ヒト由来細胞のＴＧＦ−β産生レベルは200pg/mL/2×10⁵細胞以上（すなわち、細胞2×10⁵個あたりの産生量が200pg/mL以上）であることが好ましい。

本発明にかかるケラチノサイト細胞増殖促進剤のスクリーニング方法は、上記構成の不死化ヒト由来細胞とケラチノサイト細胞を被験物質の存在下に共培養し、ケラチノサイト細胞の増殖を観察する工程を有することを特徴とするものである。また、本発明にかかるＴＧＦ−β産生抑制剤のスクリーニング方法は、上記構成の不死化ヒト由来細胞とケラチノサイト細胞を被験物質の存在下に共培養し、ＴＧＦ−βの産生レベルを検出する工程を有することを特徴とするものである。更に、本発明にかかるＴＧＦ−β産生抑制剤のスクリーニング方法は、上記構成の不死化ヒト由来細胞を被験物質の存在下に培養し、ＴＧＦ−βの産生レベルを検出する工程を有することを特徴とするものである。

上記のヒト由来細胞としては毛乳頭細胞が好ましい。

不死化前の毛乳頭細胞のＴＧＦ−β産生量は、１００ｐｇ／ｍｌ／２×１０⁵細胞以下であり、このレベルは測定のばらつきが１００ｐｇ／ｍｌ以下であることを考慮すると、ＴＧＦ−β産生抑制効果を正確に判定することは不可能であった。よって、ＴＧＦ−β産生抑制効果を正確に判定するためには２００ｐｇ／ｍｌ／２×１０⁵細胞以上のＴＧＦ−βを産生する細胞が必要と考えられ、本発明に基づいた方法によりこのＴＧＦ−β産生レベルを上回る不死化毛乳頭細胞株を取得することが可能となる。

本発明によれば、ＴＧＦ−β産生抑制作用物質のスクリーニングに利用可能なＴＧＦ−β高生産不死化ヒト由来細胞を作出することが可能であり、本細胞を用いてＴＧＦ−β産生抑制作用物質をスクリーニングすること、更にはケラチノサイト細胞を被験物質の存在下に共培養し、ケラチノサイト細胞の増殖を観察することでケラチノサイト細胞増殖促進剤をスクリーニングする事が可能となった。

以下本発明を詳細に説明する。本発明は、ヒト由来細胞を不死化することにより継代可能な不死化細胞株を取得し、取得した不死化細胞株の中から安定してＴＧＦ−βを高生産する細胞株を評価、取得することに成功したことに基づいてなされたものである。このＴＧＦ−βを高生産する細胞株は不死化前よりもＴＧＦ−βを高い生産するものである。そして、このＴＧＦ−β高生産細胞株に被験物質を作用させ、生産されるＴＧＦ−β量をＥＬＩＳＡ等の方法により測定することで、ＴＧＦ−β産生抑制物質を取得するための被験物質をスクリーニングすることができる。

更にはＴＧＦ−β高生産細胞株と他のＴＧＦ−βシグナルを受け取る細胞株を同一の空間内で共培養し、生産されるＴＧＦ−β量をＥＬＩＳＡ等の方法により測定し、また一方でＴＧＦ−βシグナルを受け取る細胞の細胞増殖度を測定して、ＴＧＦ−β産生抑制とＴＧＦ−βシグナルを受け取る細胞の細胞増殖とを関連付けてＴＧＦ−β生産抑制物質を評価、取得することができる。この方法に用いられるＴＧＦ−βシグナルを受け取る細胞としてはＴＧＦ−β受容体を有する細胞であれば良く、例えばケラチノサイト、血管内皮細胞、肝細胞などの上皮細胞などを挙げることが出来る。これらの中では、ケラチノサイトが好ましい。

本発明のＴＧＦ−β高産生不死化細胞の取得に用いられるヒト由来細胞としては、ＴＧＦ−βの生産が知られている細胞であれば良く、例えば毛乳頭細胞、メサンギウム細胞、網膜色素上皮細胞、線維芽細胞などを挙げることが出来る。これらの中では、毛乳頭細胞が好ましい。これらのヒト由来細胞は、例えば外科手術、美容整形外科手術により取得した組織から初代培養して調製することもできるが、市販の細胞を購入したり、細胞銀行（国立医薬品衛生研究所）から入手することもできる。

上記のようにして得たヒト由来細胞の不死化には、複製起点を欠失させたＳＶ４０ウイルスのＬａｒｇｅ Ｔ抗原遺伝子が挿入されたプラスミドやウイルス等のベクターを用いることができる。例えば、複製開始点を欠失させたＳＶ４０ウイルスＤＮＡをｐＢＲ３２２にクローニングしたプラスミドＤＮＡはGluzmanらの文献（Proc.Natl.Acad.sci.USA, Vol.77, 3898-3902(1980)に記載されている。

また、複製起点を欠失させたＳＶ４０ウイルスのＬａｒｇｅ Ｔ抗原遺伝子が挿入されたアデノウイルスベクター（Doren ら、J. Virol. Vol.50, 606-614 (1984)）やＳＶ４０ウイルスのＬａｒｇｅ Ｔ抗原遺伝子が挿入されたレトロウイルスベクター（Cepkoら、Cell, Vol.37, 1053-1062(1984);Bartekら、Proc.Natl.Acad.sci.USA, Vol.88, 3520-3524(1991)）を不死化細胞の作製に用いる事もできる。さらに、温度感受性のＳＶ４０ウイルスのＬａｒｇｅ Ｔ抗原遺伝子を使用することも可能である（Chouら、Proc.Natl.Acad.sci.USA, Vol.75, 1854-1858(1978)）。

不死化細胞は、温度感受性ポリオーマウイルスＬａｒｇｅ Ｔ抗原遺伝子（Rassoulzadegan ら、Proc. Nat. Acad. Sci. USA, Vol.80, 4354-4358 (1983)）、ヒトパピローマウイルスのＥ６とＥ７遺伝子（Mungerら、J. Virol. Vol.63, 4417-4421 (1989)）、テロメラーゼ遺伝子（Farwellら、Am. J.Pathology, Vol.156, 1537-1547(2000)）が挿入されたプラスミドやウイルス等のベクターを細胞に導入しても取得できる。

ウイルスベクターを細胞に導入する場合はウイルスを細胞に感染させることによって細胞に導入する事ができる。

プラスミドＤＮＡの細胞への導入方法としては、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法等が挙げられるが、再現性、細胞へのダメージの少なさから、リポフェクション法が好ましい。

例えば、男性型脱毛由来ヒト毛乳頭細胞に複製開始点を欠失させたＳＶ４０ウイルスＤＮＡをｐＢＲ３２２にクローニングしたプラスミドＤＮＡを細胞に導入する場合は、ヒト毛乳頭細胞がコンフルエントの３０〜８０％になるまで培養し、リポフェクション法によりプラスミドＤＮＡを導入し、通常通り培養を継続する。１０³〜１０⁴の細胞にプラスミドＤＮＡを導入すると、１０個程度の増殖型コロニーの出現が期待できる。増殖型コロニーが出現したら、グラスリングを用いてクローニングを行い、不死化細胞クローンを取得することができる。

不死化をしていない男性型脱毛由来ヒト毛乳頭細胞に男性ホルモン受容体を一過性発現し、ヒトケラチノサイトの共培養で合成アンドロゲンＲ１８８１を添加すると、ＴＧＦ−β１産生量が上昇することが報告されている（J. Investig. Dermatol. Symp. Proc.,Vo.8, 69-71, (2003)）。そこで、不死化をしていない男性型脱毛由来ヒト毛乳頭細胞に男性ホルモン受容体を一過性発現し、ヒトケラチノサイトの共培養で無血清培地に合成アンドロゲンＲ１８８１を添加して培養を開始し、４日後の培養上清中のＴＧＦ−β１濃度を測定したところその濃度は７０ｐｇ／ｍＬであった。一方、同様の条件で不死化後の男性型脱毛由来ヒト毛乳頭細胞を用いた場合、培養上清中のＴＧＦ−β１濃度は６００ｐｇ／ｍＬと高いＴＧＦ−β１産生を示した。この時、ヒトケラチノサイトの細胞数は、不死化をしていない男性型脱毛由来ヒト毛乳頭細胞との共培養の場合、３．１×１０⁴であったが、不死化男性型脱毛由来ヒト毛乳頭細胞との共培養の場合、２．４×１０⁴であった。さらに、不死化後の男性型脱毛由来ヒト毛乳頭細胞は、単独培養で合成アンドロゲンＲ１８８１の非存在下でも７００ｐｇ／ｍＬ〜１１００ｐｇ／ｍＬのＴＧＦ−β１産生が認められた。本発明のヒト男性型脱毛由来不死化毛乳頭細胞は不死化処理されていないヒト男性型脱毛由来毛乳頭細胞と比較して、ＴＧＦ−β１産生が著しく高いことが示された。本発明は、ＴＧＦ−β高生産細胞株を用いたＴＧＦ−β産生抑制物質のスクリーニング方法を提供する。この方法においては、取得したＴＧＦ−β高生産細胞株に被験物質を作用させ、生産されるＴＧＦ−β量をＥＬＩＳＡ等の方法により測定してＴＧＦ−β産生抑制物質のアッセイを行う。また本発明は、ＴＧＦ−β高生産細胞株と他のＴＧＦ−βシグナルを受け取る細胞株を共培養し、生産されるＴＧＦ−β量を測定し、また一方でＴＧＦ−βシグナルを受け取る細胞の細胞増殖度を測定して、ＴＧＦ−β産生抑制とＴＧＦ−βシグナルを受け取る細胞の細胞増殖とを関連付けてＴＧＦ−β生産抑制物質を評価取得する方法を提供する。

ＴＧＦ−βの産生量の測定方法は、ＴＧＦ−βの産生量や発現量が測定できる方法である限り特に限定されず、例えばＥＬＩＳＡ、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ、ＴＧＦ−β遺伝子のＲＮＡのＮｏｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ、レポータージーンアッセイ等を例示することができる。これらの中でも、ＥＬＩＳＡは市販のキットを用いて行うことができ、簡便かつ定量的であるので点から、選択するのに好ましいアッセイ法である。

細胞増殖評価法は細胞数を評価できる方法である限り特に限定されず、例えば、細胞を血球計算版でカウントする方法、ＭＴＴアッセイ法、アラマーブルーアッセイ法、各種のＤＮＡ定量法を用いることができる。

以下に、実施例および比較例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。

（実施例１）毛乳頭細胞の不死化方法
美容整形外科手術の副産物として得られた男性型脱毛の頭皮より毛乳頭細胞を単離し、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM；日水製薬）に牛胎児血清（jrh Biociences）を終濃度１０％になるように添加し、さらに終濃度５０Ｕ／ｍＬのペニシリンＧと５０μｇ／ｍＬの硫酸ストレプトマイシンを加えた培地（以下増殖用培地と称す）を用いて３７℃にて５％ＣＯ₂存在下で培養した（J. Investig. Dermatol. Symp. Proc.,Vo.8, 69-71, (2003)）。毛乳頭細胞を６ well plate（Costar）に５×１０⁵cells/wellで播種し、ＳＶ４０のｏｒｉを欠失したプラスミドSV-ori-8-16（JCRB）を毛乳頭細胞に導入した。細胞導入の条件は、FuGene6（Roche）を用いて添付されたマニュアルに従って、１ｍＬ無血清ＤＭＥＭ培地に交換後、１μｇ／wellのSV-ori-8-16と３μＬ／wellのFuGene6を添加し、５時間処理した後、増殖用培地に戻した。導入して約２０日後にＳＶ４０のプラスミドを導入した細胞からやや小さめの増殖の早い細胞からなる増殖型コロニーが９個出現し、グラスリングを用いてクローニングを行った。最終的に、DP2-SV40-No.1、DP2-SV40-No.2、 DP2-SV40-No.5、 DP2-SV40-No.6、 DP2-SV40-No.7、 DP2-SV40-No.8、DP2-SV40-No.9の７個の不死化細胞を確立した。SV-ori-8-16を導入していない毛乳頭細胞は、継代１０代程度で増殖が止まったが、不死化毛乳頭細胞は１０代以降も増殖を続けた。不死化前の毛乳頭細胞の倍化時間は2週間程度であったが、不死化毛乳頭細胞の倍化時間は１．５日から３日と増殖速度が速くなっていた。

（実施例２）不死化株間におけるＴＧＦ−β産生量の比較
不死化毛乳頭細胞を単独培養した場合の、培養上清中のＴＧＦ−β1濃度を調べるため、不死化毛乳頭細胞を６well plateに５×１０⁵cells/wellで播種し３．５ｍＬ増殖培地で４日培養後、３．５ｍＬ無血清−ＤＭＥＭ培地交換し、２日後に培養上清を回収した。培養上清のＴＧＦ−β1濃度は、ＥＬＩＳＡキット（R&D Systems）を用いて添付のマニュアルの方法に従って測定した。

結果を図１に示す。取得したDP2-SV40-No.1、DP2-SV40-No.2、 DP2-SV40-No.5、 DP2-SV40-No.6、 DP2-SV40-No.7、 DP2-SV40-No.8の細胞培養上清は不死化前の毛乳頭細胞に比べて７００ｐｇ／ｍＬ〜１１００ｐｇ／ｍＬと高いＴＧＦ−β１産生が認められた。一方、DP2-SV40-No.9の細胞培養上清は１５０ｐｇ／ｍＬのＴＧＦ−β１産生が認められた。細胞培養上清に含まれるＴＧＦ−β１産生量は１００ｐｇ／ｍＬ以下のバラツキが認められることから、ＴＧＦ−β１産生抑制効果を評価する場合、２００ｐｇ／ｍＬ以上のＴＧＦ−β１を産生する細胞が望ましいと考えられる。よって、安定して２００ｐｇ／ｍＬ以上の高いＴＧＦ−β１産生レベルを示すDP2-SV40-No.1、DP2-SV40-No.2、DP2-SV40-No.5、DP2-SV40-No.6、DP2-SV40-No.7、DP2-SV40-No.8はＴＧＦ−β１産生抑制効果の評価、スクリーニングに適するものと考えられた。

（実施例３及び比較例１）不死化処理していない毛乳頭細胞におけるＴＧＦ−β産生量との比較
不死化毛乳頭細胞または、不死化していない毛乳頭細胞とヒトケラチノサイトとの共培養時のＴＧＦ−β１産生量を比較した。

ヒトケラチノサイトはヒトの皮膚から単離し、インスリン（５μｇ／ｍＬ）、ヒドロコルチゾン（０．４μｇ／ｍＬ）、エタノールアミン（０．１ｍＭ）、ホスホエタノールアミン（０．１ｍＭ）、０．１ｍＭ Ｃａ²⁺、牛下垂体抽出物（30 μg protein/ml ;Clonetics）を添加したＭＣＤＢ１５３培地（以下ＫＧＭと称す）で培養した。

不死化毛乳頭細胞または、不死化していない毛乳頭細胞を６well plate（Costar）にそれぞれ、１．７×１０⁵cells/well、５×１０⁵cells/wellで播種し、播種後１日目に、Fugene６を用いてwellあたり１μｇのアンドロゲン受容体遺伝子発現プラスミドを導入した。播種後２日目に、不死化毛乳頭細胞または、不死化していない毛乳頭細胞の培地を１０％活性炭・デキストラン処理牛胎児血清（HyClone社）-DMEMに交換した。また、ヒトケラチノサイト細胞をトランスウエルプレート（６ｗｅｌｌプレート,Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ−ＣＯＬ、２４ｍｍ Ｄｉａｍｅｔｅｒ、０．４μ Ｐｏｒｅ Ｓｉｚｅ、Ｓｔｅｒｉｌｅ、３４９１、Ｃｏａｓｔｅｒ）に５．０×１０⁴cells/wellで播種した。翌日、不死化毛乳頭細胞または、不死化していない毛乳頭細胞とヒトケラチノサイト細胞の共培養を開始した。培地は、増殖因子と牛下垂体抽出物を添加していないＫＧＭ培地に合成アンドロゲンＲ１８８１（１０^-9Ｍ；Ｓｉｇｍａ）を添加した培地に交換した。４日後に、培養上清を回収し、ヒトケラチノサイト細胞数を測定した。培養上清のＴＧＦ−β１濃度を図２に示す。

不死化していない毛乳頭細胞（DP2）の場合は、７０ｐｇ／ｍＬであったが、不死化した毛乳頭細胞（DP2−SV40-No.8）を用いた場合は、６５０ｐｇ／ｍＬと高いＴＧＦ−β１産生を示した。

図３はヒトケラチノサイト細胞数を示す。高いＴＧＦ−β１産生を示した不死化毛乳頭細胞（DP2−SV40-No.8）との共培養ではヒトケラチノサイト細胞数は、２．４×１０⁴であったが、低いＴＧＦ−β１産生を示した不死化をしていない男性型脱毛由来ヒト毛乳頭細胞（DP2）では、３．１×１０⁴であった。

（実施例４）不死化毛乳頭細胞株における配列番号１記載ペプチドのＴＧＦ−β１産生抑制効果
取得した不死化毛乳頭細胞株（DP2-SV40-No.8）を６wellプレートに５×１０⁵cells/wellで播種し、３．５ｍＬ増殖培地で１日培養後、終濃度３０μＭの配列番号２記載のペプチドを含む３．５ｍＬ無血清-ＤＭＥＭ培地に交換し、更に５日間培養した後に培養上清を回収した。培養上清のＴＧＦ−β1濃度は、ＥＬＩＳＡキット（R&D Systems）を用いて添付のマニュアルの方法に従って測定した。結果を図４に示す。配列番号１記載のペプチドは顕著なＴＧＦ−β１産生阻害効果を示した。

（比較例２）
終濃度３０μＭの配列番号２記載のペプチドを含まないこと以外は実施例４記載の方法と同様に実施した。結果を図４に示す。

（実施例５）
取得した不死化毛乳頭細胞株（DP2-SV40-No.8）を６wellプレートに５×１０⁵cells/wellで播種し、３．５ｍＬ増殖培地で１日培養した。また、ケラチノサイト細胞を６wellプレートに５×１０⁴cells/wellで播種し、３．５ｍＬ増殖培地で１日培養した。培養後、終濃度３０μＭの配列番号２〜７記載のペプチドから選ばれる１種を含む３．５ｍＬ無血清−ＤＭＥＭ培地で両細胞を更に５日間共培養した後に培養上清を回収した。培養上清のＴＧＦ−β1濃度は、ＥＬＩＳＡキット（R&D Systems）を用いて添付のマニュアルの方法に従って測定した。配列番号１〜６記載の各ペプチドのＴＧＦ−β産生抑制効果を図５に示す。また、共培養後のケラチノサイト細胞の増殖を細胞数をカウントすることにより算出した。結果を図６に示す。

（比較例３）
終濃度３０μＭの配列番号１〜６記載のペプチドを含まないこと以外は実施例５記載の方法と同様に実施した。結果を図５、図６、図７および図８に示す。

（実施例６）
配列番号１〜６記載のペプチドの代わりに配列番号７〜１１記載のペプチドから選ばれる１種を含む無血清−ＤＭＥＭ培地で共培養した以外は実施例５記載の方法と同様に実施した。結果を図７および図８に示す。

なお、配列番号１〜１１のアミノ酸配列を有するペプチドは定法により合成した。

確立した不死化毛乳頭細胞DP2-SV40-No.1、DP2-SV40-No.2、DP2-SV40-No.5、DP2-SV40-No.6、DP2-SV40-No.7、DP2-SV40-No.8、DP2-SV40-No.9の培養上清のTGF-β1濃度を示すグラフである。 不死化毛乳頭細胞DP2-SV40-No.8または、不死化していない毛乳頭細胞DP2とヒトケラチノサイト（KC）の共培養時の培養上清のTGF-β1濃度を示すグラフである。 不死化毛乳頭細胞DP2-SV40-No.8または、不死化していない毛乳頭細胞DP2とヒトケラチノサイト（KC）の共培養時の培養上清のKC数を示すグラフである。 不死化毛乳頭細胞における配列番号１記載のアミノ酸配列を有するペプチドのＴＧＦ−β１産生抑制効果を示す図である。 不死化毛乳頭細胞とケラチノサイト細胞との共培養下における配列番号１〜６記載のアミノ酸配列を有するペプチドのＴＧＦ−β１産生抑制効果を示す図である。 不死化毛乳頭細胞とケラチノサイト細胞との共培養下における配列番号１〜６記載のアミノ酸配列を有するペプチドのケラチノサイト細胞増殖促進効果を示す図である。 不死化毛乳頭細胞とケラチノサイト細胞との共培養下における配列番号１、７〜１１記載のアミノ酸配列を有するペプチドのＴＧＦ−β１産生抑制効果を示す図である。 不死化毛乳頭細胞とケラチノサイト細胞との共培養下における配列番号１、７〜１１記載のアミノ酸配列を有するペプチドのケラチノサイト細胞増殖促進効果を示す図である。

Claims (6)

1. 不死化前のヒト由来細胞に比べて高いＴＧＦ−β産生能を有することを特徴とする不死化ヒト由来細胞。
2. ＴＧＦ−β産生レベルが200pg/mL/2×10⁵細胞以上であることを特徴とする請求項１記載の不死化ヒト由来細胞。
3. ヒト由来細胞が毛乳頭細胞である請求項１または２に記載の不死化ヒト由来細胞。
4. 請求項１〜３のいずれかに記載の不死化ヒト由来細胞とケラチノサイト細胞を被験物質の存在下に共培養し、ケラチノサイト細胞の増殖を観察することを特徴とするケラチノサイト細胞増殖促進剤のスクリーニング方法。
5. 請求項１〜３のいずれかに記載の不死化ヒト由来細胞とケラチノサイト細胞を被験物質の存在下に共培養し、ＴＧＦ−βの産生レベルを検出することを特徴とするＴＧＦ−β産生抑制剤のスクリーニング方法。
6. 請求項１〜３のいずれかに記載の不死化ヒト由来細胞を被験物質の存在下に培養し、ＴＧＦ−βの産生レベルを検出することを特徴とするＴＧＦ−β産生抑制剤のスクリーニング方法。

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