JP2005229927A

JP2005229927A - 分離心筋梗塞モデルを応用した心筋再生方法

Info

Publication number: JP2005229927A
Application number: JP2004044096A
Authority: JP
Inventors: Hiroshi Nakamura; 浩士中村; Masunori Matsuzaki; 益徳松崎
Original assignee: Yamaguchi Technology Licensing Organization Ltd
Current assignee: Yamaguchi Technology Licensing Organization Ltd
Priority date: 2004-02-20
Filing date: 2004-02-20
Publication date: 2005-09-02

Abstract

【課題】本発明は、GFP 等の標識物質で標識した動物を用いた、広範囲心筋梗塞モデルの心筋再生実験への応用が課題である。
【解決手段】標識したマウスの腹腔内に非標識の心臓を移植し、同時に心筋梗塞を作製する事により、骨髄を始めとする生体環境をそのまま利用して心筋再生を観察できる手技を開発した。その方法は、GFP 等で標識したマウスの腹腔内に同系の GFP（陰性）の心臓を異所性移植し、同時に冠動脈を結紮し、広範囲分離心筋梗塞モデルを作成するものである。非標識心臓である移植心臓に出来た心筋梗塞部位では、骨髄からの幹細胞が心筋に再生して、GFP 陽性の標識された心筋細胞（群）として識別できる。
【選択図】図２

Description

本発明は、GFP（ Green Fluorescent Protein ）等の標識物質で標識した動物を用いた、新規な心筋梗塞病態モデル動物に係わり、特に、心不全状態を分離でき、広範囲心筋梗塞病態モデルを作成可能な広範囲心筋梗塞病態モデル動物及びその作成方法並びに心筋再生方法に関する。

日本人の食生活やライフスタイルの欧米化に伴い、動脈硬化を主因とする心筋梗塞や心筋症などの心臓病の増加は大きな社会問題である。一般的に、心筋梗塞等の心臓疾患の成因やメカニズムの解析、或いは疾患に対する薬物作用の確認を目的にする薬効スクリーニング試験は、健常動物ではなく、一定の病態状態にある疾患モデル動物を用いて行われている。

従来は、心筋細胞は再生不可能な細胞として、神経や脳細胞と共に位置付けられていた。しかし最近の急速な実験医学の進歩により、心筋や神経細胞も再生する事実が動物やヒトに於いて次々に示され、今までの薬剤や外科的治療によるものとは違う新しい再生治療への可能性が心筋細胞においても提示されている。

再生細胞の起源は骨髄中の幹細胞であり、再生実験においてはまず、元からあった細胞か、幹細胞から分化したものかを明確に区別する必要がある。細胞をGFP（ Green Fluorescent Protein ）等の標識物質で標識する技術により可能であり、再生医学における実験に広く用いられている（特許文献１，特許文献２）。

心臓病の動物モデルに関しては、ラット、マウス、モルモット、ハムスター等の動物を使用し、冠動脈結紮手術を施して心筋梗塞病態モデル動物とする方法が用いられてきた（特許文献３）。しかし、このような従来技術では、動物の心臓に酸素や栄養素を直接供給している冠動脈を結紮するため、左前下降枝中部を結紮した場合でも、手術侵襲が強すぎて手術中、手術後を併せて30〜50%の動物が心不全を起こして死んでしまうという問題がある。即ち、冠動脈結紮による心臓のポンプ機能の低下（この場合、心筋梗塞になる）により、次第に肺や腎臓などの主要臓器の血流低下も引き起こし、多臓器不全（心不全）に移行していく。

また、心不全を併発する従来の心筋症モデル動物（特許文献４）を用いた解析では、他の臓器の心不全による影響も考えなければならず、心臓自体の解析が非常に大きな困難を伴うという問題がある。

このように従来の心臓病モデルでは、続発する心不全による全身多臓器の障害が著しく、かつ死亡率も高い為、安定した実験結果を得にくいという問題がある。

従来より心筋再生を目的とした再生医学の実験では、GFP もしくは LacZで標識したマウスから骨髄を取り出して、他のGFP(-) のマウスに注入してその動態や変化を観察するという手法が主流である（図１）。この手法では骨髄を ex vivo で取り出し、更に in vitro で操作するため煩雑な上に時間も掛かる。その上、骨髄細胞や移入する動物（放射線処理）にも侵襲が強い。然るに結果的にも十分に再生を果たし得ないため、定量的判定が困難である。

健常動物の心臓を摘出し、摘出した心臓の左冠動脈中枢部に結紮手術を施し、結紮手術を施した心臓を別の健常動物の腹部に異所性移植し、異所性心臓移植を施した動物を広範囲心筋梗塞病態モデル動物とした広範囲心筋梗塞病態モデル動物及びその作成方法並びにそのモデル動物を用いて行う薬物のスクリーニング方法に関する特許が公開されている（特許文献５）。
特表２００１−５１７０９０特開２００３−７０３７７特開２００２−２９１３７３特開平８−２８９６９８特開２００２−２０９４７３

前記の事情に鑑み、本発明は、広範囲心筋梗塞病態モデルを作成可能な広範囲心筋梗塞病態モデル動物及びその作成方法並びに心筋再生実験を効率良く行うことができる方法の改良を課題としている。

従来より心筋再生を目的とした再生医学の実験では、GFP等で標識したマウスから骨髄を取り出して、他の非標識のマウスに注入してその動態や変化を観察するという手法が主流である（図１）。この手法では骨髄を ex vivo で取り出し、更に in vitro で操作するため煩雑な上に時間も掛かる。その上、骨髄細胞や移入する動物（放射線処理）にも侵襲が強い。然るに結果的にも十分に再生を果たし得ないため、定性・定量的判定は困難である。

そこで我々は、“広範囲心筋梗塞病態モデル動物及びその作成方法並びにそのモデル動物を用いて行う薬物のスクリーニング方法（特開２００２−２０９４７３）”を応用し、以下の方法を考案した。標識したマウスの腹腔内に非標識の心臓を異所性移植し、同時に心筋梗塞を作製する事により、骨髄を始めとする生体環境を温存して心筋再生を観察できる手技を開発した（図２）。心筋の再生は移植心臓中にできた心筋梗塞部位に起こり、骨髄からの幹細胞が心筋に再生すれば、GFP 陰性の心臓組織内に GFP 陽性の標識された心筋細胞（群）として容易に識別することができる。

しかもこの方法を用いれば、従来の方法より簡易かつ多量に心筋再生を得る事が可能である。すなわち、紫外線照射下ならば肉眼的にも再生部位が同定可能であり、定量評価も簡易である（図３Ａ）。さらに蛍光顕微鏡を用いれば、再生心筋の微細構造の観察も容易である（図３Ｂ）。

移植心の中に観察されるGFP 陽性細胞が、本当に心筋細胞であることの証明をした。分化した GFP 陽性細胞が、同時に心筋の収縮タンパク質であるミオシンも発現していることが、ミオシン特異的染色により認められた（図４）。よって、観察されたGFP 陽性細胞は心筋細胞に分化していることが確認できる。

さらにマウスに薬剤投与を行えば、各種薬剤による再生に対する効果も簡便に比較検討することができる。よって本モデルは、再生医学領域における既存の実験系を超えた新しい実験系として、今後、広い応用が見込まれる。

本発明によれば、標識したマウスの腹腔内に非標識の心臓を移植し、同時に心筋梗塞を作製する事により、骨髄を始めとする生体環境をそのまま利用して心筋再生を観察できる手技を用い、GFP等で標識したマウスの腹腔内に同系の GFP（陰性）の心臓を移植し、同時に冠動脈を結紮し、骨髄からの幹細胞が心筋に再生し、GFP 陰性の心臓組織内に GFP 陽性の標識された心筋細胞（群）として識別でき、その産業上の利用価値は極めて大きい。

発明を実施するための最良の形態を、実施例にもとづき図面を参照して説明する。

ＧＦＰで標識したマウスの腹腔内に非標識の心臓を移植し、同時に心筋梗塞を作成し広範囲分離心筋梗塞モデルを作成する。

手術後は通常の環境でマウスを６０日間飼育する。この時期に薬剤の投与も可能である。

マウスより移植心臓を取り出し、ルミネーターで再生部位や面積の計測も可能である（図３Ａ）。また、蛍光顕微鏡により微細構造の解析も可能である（図３Ｂ）。

心筋細胞に分化しているか否かの確認には、GFP とミオシンタンパクの二重染色を行う。両方とも染色されれば新しく分化した心筋細胞と同定される（図４）。

GFP などで全身の細胞を標識したマウスより骨髄を取り出し、この骨髄より造血幹細胞を取り出す。一方で、未標識のマウスを放射線で処理し、骨髄を含む末梢血全体を殺しておく。そのマウスにGFP等で標識された細胞を移入する。次にこのマウスに心筋梗塞を作成すると、梗塞部周辺に造血幹細胞より再生分化した心筋細胞がGFP陽性として検出できるという、心筋再生医学における従来の実験方法を示す図である。 GFP 等で標識したマウスの腹腔内に同系の GFP 陰性の心臓を移植し、同時に冠動脈を結紮し、骨髄からの幹細胞による心筋の再生により、GFP 陰性の心臓組織内に GFP 陽性の標識された心筋細胞（群）として識別できることを示した図である。移植心内で分化したと見られる、一塊となったＧＦＰ陽性細胞（手術後６０日目）を示す図である。（Ａ）は紫外線照射下での観察、（Ｂ）は蛍光顕微鏡による観察である（×２００倍）。図２で分化したＧＦＰ陽性細胞が、心筋の収縮蛋白であるミオシンでも染色可能であり、よってこのＧＦＰ陽性細胞は心筋細胞に分化していることを証明する図である。

Claims

標識物質で骨髄を含む全身を標識した健常動物の腹腔内に、標識物質により標識されていない同系の心臓を異所性に移植し、同時にこの非標識移植心臓の冠動脈を結紮して心筋梗塞を作製し、標識骨髄や末梢血からの細胞遊走や心筋再生の過程を、従来モデルより定性・定量的に観察することが可能なことを特徴とする再生医学用モデル動物。
標識物質がGFP（ Green Fluorescent Protein ）であることを特徴とする請求項１記載の広範囲心筋梗塞病態モデル動物。
標識物質がLacZ、DiI、RFP、BFP、YFP、etc.のいずれか一つであることを特徴とする請求項１記載の広範囲心筋梗塞病態モデル動物。
広範囲心筋梗塞病態モデル動物がマウスである、請求項１から３のいずれかに記載の広範囲心筋梗塞病態モデル動物。
広範囲心筋梗塞病態モデル動物がラット、モルモット、ハムスター、ブタ、イヌ、サル、ニワトリ等である、請求項１から３のいずれかに記載の広範囲心筋梗塞病態モデル動物。
標識物質で標識した健常動物の腹腔内に、標識物質により標識されていない同系の心臓を移植し、同時にこの非標識移植心臓の冠動脈を結紮してその直後もしくは数ヶ月に渡る長期間までの心筋再生の観察が可能であることを特徴とする広範囲心筋梗塞病態モデル動物の作成方法。
請求項１から５のいずれかに記載の広範囲心筋梗塞病態モデル動物を用いて行う、心筋再生の方法。