JP2005225833A - メラノイジン含有のインターロイキン−１２産生促進剤及び促進方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 アレルギー反応の最終段階のヒスタミン放出を抑制する抗ヒスタミン剤等とは違って、アレルギー反応の最初の段階をブロックし、アレルギー反応を一層効果的に抑制する可能性の高いインターロイキン−１２産生促進剤又は１型ヘルパーＴ細胞活性化剤を提供すると共に抗アレルギー剤を提供する。
【解決手段】 有効成分として、アミノ酸と還元糖との反応によって得られるメラノイジンを配合することで、インターロイキン−１２産生促進剤又は１型ヘルパーＴ細胞活性化剤とする。また、免疫担当細胞を含む培養液にメラノイジンを添加し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養すると、免疫担当細胞からのインターロイキン−１２の産生が促進される。
【選択図】 なし。

Description

本発明は、メラノイジンを含有するインターロイキン−１２産生促進剤と、メラノイジンを用いたインターロイキン−１２産生の促進方法に関するものである。

生体が自己と非自己を認識する機構が免疫反応であり、この反応に関与する細胞は免役担当細胞（抗原を認識して免役応答を行うＴ細胞やＢ細胞、更には、これら細胞に抗原の提示を行うマクロファージ等がある）と呼ばれる。また、即時型アレルギー反応では、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）が深く関与している。
図１は、従来知られているところの、ＩｇＥ産生におけるヘルパーＴ細胞（Ｔｈ１／Ｔｈ２）とＢ細胞、及びサイトカインの作用（促進／阻害）についてまとめたものである。
Ｔ細胞は、胸腺（Ｔｈｙｍｕｓ）由来の細胞で、細菌等の抗原に感作されると種々のサイトカインを放出してこれに障害を与えたり、Ｔ細胞自身が標的細胞を攻撃して死滅させたりして、遅延型過敏症や同種移植反応に代表される細胞性免疫で主要な役割を担っている。また、Ｔ細胞は、Ｂ細胞の分化も調節し、これには正の調節を行うヘルパーＴ細胞と負の調節を行うサプレッサーＴ細胞とがある。また、ヘルパーＴ細胞は、産生されるサイトカインの種類の違いから、ＩＦＮ−γやインターロイキン（ＩＬと略す）２を放出する１型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ１；アレルギー疾患においては善玉となる）と、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０及びＩＬ−１３を放出する２型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ２；アレルギー疾患においては悪玉となる）とに分類される。

一方、Ｂ細胞は、骨髄（Ｂｏｎｅ）において発生分化した細胞で、その抗原受容体はＩｇＭ型の免役グロブリンである。抗原が前記抗原受容体に（特異的に）結合すると抗体産生細胞に分化し、抗体を産生する。

インターロイキン１２（ＩＬ−１２と略す）は、ＮＫ細胞刺激因子とも細胞障害性リンパ球刺激因子とも呼ばれ、主として、微生物感染を受けたマクロファージが産生するサイトカインで、互いに相同性のない分子量４０，０００（ｐ４０）と３５，０００（ｐ３５）のサブユニットとからなる。静止期のＮＫ細胞やＴ細胞からのインターフェロンγの産生を強く誘導し、ＮＫ細胞及びＴ細胞の細胞障害性を高め、ナイーブＴ細胞に作用して、Ｔｈ１ヘルパーＴ細胞への分化を選択的に促進し、細胞増殖を促すなどにより、免疫反応成立において重要な役割を果たしている。

アレルゲン（即時型アレルギー反応を起こす抗原）への曝露により産生されたＩｇＥは、肥満細胞や好塩基球の表面に存在するＩｇＥレセプターと結合し、再び侵入したアレルゲンがこのＩｇＥに結合するとＩｇＥ抗体−抗原複合体の形成によりこれらの細胞からヒスタミン等の化学伝達物質が放出され、周辺組織反応を引き起こし、即時型過敏症やアナフィラキシー症状を招く。

ところで、アレルギー疾患を治療する治療薬としては、従来から、脱顆粒による肥満細胞からのヒスタミンの遊離を抑制する種々の化学合成薬（抵ヒスタミン剤）が知られ、用いられている。
また、アレルギー体質を改善する食品として、特定の乳酸菌を含有する抗アレルギー食品（特定保健用食品）が知られ、市販されている。

更に、下記特許文献１には、我が国古来の味噌や醤油等に含まれる褐色成分のメラノイジンが、肥満細胞からのヒスタミン遊離抑制剤として有用であると提案されている。

特開平７−２３３０７７号公報

本発明者らは、食品の着色や劣化、香気成分の生成ばかりでなく、ヒトや動物の老化及びそれに伴う種々の疾患等に深く関係があるメイラード反応（褐変反応；アミノ化合物と還元糖との非酵素的反応）の機序や、メイラード反応における生成物の生理作用及びこれらの医薬もしくは食品分野等への応用に特に興味を持って研究に取り組んでいる。
本発明は、アレルギー反応の最終段階のヒスタミン（化学伝達物質）の放出を抑制する抗ヒスタミン剤とは違って、アレルギー反応の最初の段階をブロックし、アレルギー反応を一層効果的に抑制する可能性の高いインターロイキン−１２産生促進剤又は１型ヘルパーＴ細胞活性化剤を提供すると共に、また、抗アレルギー剤を提供し、更にはアレルギー体質の改善に応用可能な抗アレルギー食品（特定保健用食品）を提供することを課題とする。

上記課題を達成するために、本発明では、以下の構成をとった。
すなわち、本発明は、メラノイジンを有効成分として含むインターロイキン−１２産生促進剤である。
また、本発明は、メラノイジンを有効成分として含む１型ヘルパーＴ細胞活性化剤でもある。
また、本発明は、免疫担当細胞を含む培養液に、メラノイジンを添加して培養することを特徴とする、（免疫担当細胞からの）インターロイキン−１２産生の促進方法も提供する。

メラノイジンは、ＩＬ−１２（厳密に言えば、そのｍＲＮＡ）の生成を増加・促進する。増加したＩＬ−１２は、Ｔｈ１（アレルギー疾患においては善玉の役目）を活性化するので、活性化されたＴｈ１の働きで「Ｂ細胞の抑制→ＩｇＥ産生の抑制」が起こり、その結果として、アレルギー症状が緩和されると推定される（図１参照）。
また、アレルギー反応の最終段階のヒスタミン（化学伝達物質）の放出を抑制する抗ヒスタミン剤とは違って、アレルギー反応の最初の段階をブロックするので、アレルギー反応は一層効果的に抑制されると考えている。
更には、本発明のインターロイキン−１２産生促進剤又は１型ヘルパーＴ細胞活性化剤は、アレルギー体質を改善するための抗アレルギー食品（特定保健用食品）としても応用可能であろう。

本発明は、先に述べたように、メラノイジンを有効成分として含むインターロイキン−１２産生促進剤であり、あるいは、メラノイジンを有効成分として含む１型ヘルパーＴ細胞活性化剤である。以下、更に詳しく説明する。
本発明において、有効成分として用いるメラノイジンは、アミノ酸（各種）、アミノ酸がペプチド結合で繋がったペプチド又はポリペプチド（タンパク質を含む）と、還元糖との反応によって得られる物質（黄褐色物質）である。
ここで、アミノ酸としては、生体中に存在するいろいろな天然型アミノ酸（例えば、グリシン、アラニン、トリプトファン、アスパラギン酸、メチオニン等）のほか、ε−アミノ−Ｎ−カプロン酸等の非天然型アミノ酸を用いることができる。

一方、還元糖は、アルドースの１位、又はケトースの２位の炭素原子が置換を受けていない単糖及びオリゴ糖で、アルカリ性条件下で還元性を示すものであり、例えば、単糖では、グルコース、ガラクトース、マンノース、ソルボース、フラクトース等のヘキソース、アラビノース、キシロース、リボース等のペントース等があり、オリゴ糖では、シュクロース、マルトース、ラクトース、トレハロース等がある。

メラノイジンの使用量（投与量）は、ｉｎ ｖｉｖｏで少なくとも免役担当細胞のインターロイキン−１２産生を促進する量とする。メラノイジンの血中への吸収率や尿への排泄率等を考慮して決定すればよい。

メラノイジンを製造するには、上記アミノ酸（又はペプチドやポリペプチド）と、上記還元糖とを各々等モルずつ取り、水に溶解し、炭酸水素ナトリウム等の触媒を加え、中性ないしは弱アルカリ性に調整した後、反応を早めるために加熱する。反応後、必要に応じて、合成樹脂製の吸着剤への吸着・脱着処理、溶媒（酢酸エチル等）処理、透析などの慣用の精製技術を単独に、又は組み合わせて精製することができる。

本発明のインターロイキン−１２産生促進剤又は１型ヘルパーＴ細胞活性化剤（以下、製剤ともいう）は、アレルギー疾患の治療薬のほかに、抗アレルギー食品（特定保健用食品）や試薬としても利用できる。製剤の形態（剤形）は特に限定されない。日本薬局方等に記載された製剤の形態（注射剤、錠剤、顆粒剤、散剤、坐薬、軟膏等）の中から適宜選ぶことができる。また、投与ルートとしては、非経口投与（例えば、静脈注射、点滴、皮下注射、大腸内投与）とすることもできるが、腸管から吸収されるので、好ましくは経口投与とする。

製剤の品質を確保し、あるいは有効成分の安定性や吸収性を高めるために、種々の添加剤を加えることができる。添加剤としては、賦形剤、結合剤、崩壊剤などがある（日本医薬品添加剤協会編集、医薬品添加物辞典、薬事日報社（１９９４年））。

本発明は、先に述べたように、免疫担当細胞を含む培養液に、メラノイジンを添加して（ｉｎ ｖｉｔｒｏで）培養することで、その免疫担当細胞からインターロイキン−１２産生を促進させる方法も提供する。
ここで、用いる免疫担当細胞は、ヒトを含む動物由来の細胞であり、抗原を認識して免役応答を行うＴ細胞やＢ細胞、これら細胞に抗原の提示を行うマクロファージ等がある。動物の血液から、常法により分離することができる。また、細胞バンクに保存された細胞株を使うこともできる。

免疫担当細胞を培養する培養液（培地）は、動物の細胞培養（組織培養）に用いられる各種の基本培地（例えば、ＲＰＭＩ１６４０培地、Ｅａｇｌｅ培地、Ｄａｌｂｅｃｃｏ培地）を用いることができる。免疫担当細胞の生育を促進させるために、通常は、上記基本培地に、ウシ胎児血清又は仔ウシ血清を適量（通常、容量比で５〜２０容量％）加えて用いる。
免疫担当細胞を培養する容器は、動物細胞培養用の市販の各種のプラスチック容器（シャーレ、ローラボトル等）を適宜選んで用いることができる。また、インキュベータ（培養温度や雰囲気を自動的に調節する装置）も動物細胞培養用に市販されているので、これを用いることができる。

有効成分として用いるメラノイジンについては、先に述べたので重複を避けるために省略する。
培養液（培地）中のメラノイジンの添加濃度は、少なくとも免役担当細胞のインターロイキン−１２の産生を高める量とする。好ましくは１０ｐｐｍ以上、更に好ましくは２０ｐｐｍ〜１００ｐｐｍである。

本発明をさらに具体的に説明する。
＜メラノイジンの製造例＞
Ｄ−グルコース及びε−アミノ−Ｎ−カプロン酸を各々０．１ｍｏｌｅ、触媒としての炭酸水素ナトリウムを０．０２ｍｏｌｅ量りとり、これらを蒸留水に溶解し、ｐＨ６．８に調整後、更に蒸留水を加え、全量を１００ｍｌとした。これを、ナスフラスコ中、９５℃で、４ｈ還流した。反応後の液を分液ロートに移し、酢酸エチル各５００ｍｌで１０回抽出処理した。水溶性画分を回収し、これを透析チューブ（分子量のカットオフ値：１２，０００〜１５，０００）に入れ、蒸留水に対して１週間透析し、得られた非透析性画分（透析チューブ内液）を凍結乾燥し、これを「メラノイジン」として、以下用いた。

実施例１
実験方法の流れは、次の通り。
・Ｊ７７４．１細胞 ８０％コンフルエント
↓
・メラノイジン刺激
↓
・総ＲＮＡ抽出
↓
・ＤＮＡ除去
↓
・ＲＴ（逆転写）
↓
・ｃＤＮＡ
↓
・ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）
↓
・電気泳動

細胞としては、マウス由来のマクロファージ様細胞株のＪ７７４．１（ヒューマンサイエンス振興財団 研究資源バンクから入手）を使った。１０％（容量）仔ウシ血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地を入れたプラスチックシャーレに、上記細胞を付着させた状態で、３７℃、５％（容量）二酸化炭素の雰囲気下に培養（インキュベート）した。培地は、２日に１回、新しいものと交換した。細胞がプラスチックシャーレの底面一杯（コンフルエント）に増殖する手前の８０％コンフルエントの状態で、メラノイジンを所定濃度（無添加、３０ｐｐｍ、及び１００ｐｐｍ）となるように添加し、更に３時間インキュベートした。その後、常法により細胞を集め、細胞からＲＮＡを抽出し、その後ＤＮＡを除去した。次に、ＩＬ−１２ｐ４０サブユニット（外部環境に応じて変動するものは、ｐ３５サブユニットよりもＩＬ−１２ｐ４０サブユニットである）に特異的なプライマー対を用い、常法によりＲＴ（逆転写反応）及びＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を行ない、増幅されたＤＮＡを電気泳動で分離し、分離されたＤＮＡをエチジウムブロミド染色で検出した。なお、含量の変動の少ないβ−アクチンを陽性対照として並行して検出した。
その結果、メラノイジンで刺激した場合のＩＬ−１２ｐ４０ｍＲＮＡの発現量は、メラノイジン無刺激に比べて、メラノイジン３０ｐｐｍで１０倍、また、１００ｐｐｍで１４倍であった。メラノイジンの濃度に呼応してＩＬ−１２ｐ４０ｍＲＮＡの発現量は高まった。

実施例２
メラノイジンの添加濃度を３０ｐｐｍとし、メラノイジン添加後のインキュベート時間を１ｈ、３ｈ及び２４ｈとして、その他は上記実施例１と同様に操作した。メラノイジン添加後のインキュベート時間が３ｈのところで、ＩＬ−１２ｐ４０ｍＲＮＡの発現量はピークとなった。

ＩｇＥ産生におけるヘルパーＴ細胞（Ｔｈ１／Ｔｈ２）とＢ細胞、及びサイトカインの作用（促進／阻害）をまとめた説明図。

Claims (3)

1. メラノイジンを有効成分として含むことを特徴とするインターロイキン−１２産生促進剤。
2. メラノイジンを有効成分として含むことを特徴とする１型ヘルパーＴ細胞活性化剤。
3. 免疫担当細胞を含む培養液に、メラノイジンを添加して培養することを特徴とするインターロイキン−１２産生の促進方法。

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