JP2005189183A - う蝕リスク検査方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 特定のアミノ酸配列を有するペプチドを抗原とし、該抗原に対する唾液中の分泌型免疫グロブリンＡの抗体価を測定するう蝕リスク検査方法に於いて、被験者から採取した唾液試験体を８倍を超える希釈を行っても十分な感度で検査が可能なう蝕リスク検査方法を提供すること。
【既決手段】 下記のアミノ酸配列を有し、且つその端末にキャリアータンパクを結合させたペプチドを抗原とし、該抗原に対するヒトの唾液中の分泌型免疫グロブリンＡの抗体価を測定することを特徴とするう蝕リスク検査方法とする。
Asn Ala Lys Ala Thr Thr Glu Ala Ala Leu Lys Gln Tyr Glu Ala Asp Leu Ala Ala
Val Lys Lys Ala Asn Ala Ala
【選択図】 なし

Description

本発明は、ヒトの唾液中に含まれる分泌型免疫グロブリンＡ（ｓＩｇＡ）の抗体価を免疫学的方法で測定することにより行うう蝕リスクの検査方法に関するものである。

ヒトの口腔内に存在するミュータンス連鎖球菌の存在とう蝕の発生との間には密接な関係があることが知られており、多くの研究が報告されている。ミュータンス連鎖球菌はヒトの唾液中に存在する菌種ではストレプトコッカス・ミュータンスとストレプトコッカス・ソブリヌス（以後それぞれS.mutans及びS.sobrinusと記す）の総称である。

ヒトの唾液中に存在するミュータンス連鎖球菌の数が多いほど将来新たなう蝕が多く生じること報告されているから、ヒトの唾液中のミュータンス連鎖球菌を簡易に定量する試みが数多く行われてきた。例えばストレプトコッカス・ミュータンスに特異的に反応するモノクロ−ナル抗体を応用して定量しようとするもの（例えば、特許文献１及び２参照。）、簡易培養キットで増殖した菌体そのものを目視により定量するもの等がある（例えば、特許文献３参照。）。しかし、ヒトの唾液中のミュータンス連鎖球菌の量を測定することでう蝕のリスクを検査することには次のような問題が存在している。先ず、ヒトの唾液中のミュータンス連鎖球菌の量が常に一定ではないということである。例えば、唾液中のミュータンス連鎖球菌の量の検査を行う直前に被験者が歯をきれいに磨いてしまうと、一時的にミュータンス連鎖球菌の量が低下するのでう蝕のリスクは低いと判断されてしまう。

また、ヒトによってミュータンス連鎖球菌の量の増加の仕方が異なっていることが解っているが、この増加の仕方の差を予め検査することが可能となればミュータンス連鎖球菌の実際の増加や量と関係無くう蝕のリスクを知ることが可能となる。そこで、ミュータンス連鎖球菌の量を直接測定する以外にう蝕のリスクを検査する方法として、特定の感染症に罹患しているか否かを判定するために用いる体内に特定の感染源に起因する抗体が含まれているかを検査する方法が注目されてきた。即ち、抗体は特定の感染源に対抗するために作られるのであるから、例えば、ヒトの唾液中にミュータンス連鎖球菌に対する抗体が多く含まれていればミュータンス連鎖球菌の量が多いのではないかという仮定が成り立つ。現に、ヒトはミュータンス連鎖球菌に感染すると、ミュータンス連鎖球菌に対する抗体を唾液中に分泌することが解っており、ヒトに死菌体としてのストレプトコッカス・ミュータンスを経口投与すると唾液中のストレプトコッカス・ミュータンスに対する免疫グロブリン抗体の抗体価が顕著に上昇するという報告もある。

近年、ミュータンス連鎖球菌の一種であるストレプトコッカス・ミュータンス菌の体表層物質の中で、分子量約１９万のPAc（Protein Antigen cerotype C）とよばれるペプチド抗原がミュータンス連鎖球菌の歯面への初期付着に関連があることがそれを抗原としたモノクローナル抗体を利用した研究から確認された。その後、本発明者の一人である泉福らの研究により、PAc（361-386）を抗原として、ミュータンス連鎖球菌の歯面への付着の防御として機能している口腔粘膜から分泌される分泌型免疫グロブリンＡ（ｓＩｇＡ）の抗体価を測定すれば、う蝕リスクの検査が正確に行えることを見出し、ミュータンス連鎖球菌に特有な下記のアミノ酸配列を有するペプチドを抗原とし、該抗原に対する唾液中の分泌型免疫グロブリンＡの抗体価を測定するう蝕リスク検査方法として提案した（特許文献４参照。）。

Asn Ala Lys Ala Thr Thr Glu Ala Ala Leu Lys Gln Tyr Glu Ala Asp Leu Ala Ala
Val Lys Lys Ala Asn Ala Ala

しかし、その後の研究により、先の発明に係る方法はう蝕リスク検査の精度が高く有用なものの、特に抗体価の測定として一般的な抗原抗体反応に基づく手法であるイムノクロマトグラフィーやイムノコンセントレーション等の多孔質膜を用いる試験の場合には以下の問題が発生した。う蝕のリスク検査に於いて被験者から採取した唾液を原液で用いることが操作の簡便性の点からは最も好ましいが、イムノクロマトグラフィー等のように多孔質膜に試験液である唾液を毛細管現象にて流す試験の場合には唾液を希釈して使用する必要がある。そのため、通常は４倍、被験者によっては８倍を超える希釈をしなければ正確なイムノクロマトの検査を行うことができないのだが、一方、８倍を超えて希釈すると抗体反応の感度の点から検査の正確性が低下してしまうという問題である。

特開平２−１７７８９８号公報 特開平１０−３６４００号公報 米国特許５３７４５３８号公報 特願２００２−２７３１２５号公報

本発明は特定のアミノ酸配列を有するペプチドを抗原とし、該抗原に対する唾液中の分泌型免疫グロブリンＡの抗体価を測定するう蝕リスク検査方法に於いて、被験者から採取した唾液試験体を８倍を超える希釈を行っても十分な感度で検査が可能なう蝕リスク検査方法を提供することを課題とする。

本発明者らは前記課題を解決するために鋭意検討した結果、特定のアミノ酸配列の端部にキャリアータンパクを結合させると検査の感度が飛躍的に向上することを見いだし本発明を完成した。

本発明に係るう蝕リスク検査方法は、特定のアミノ酸配列を有するペプチドを抗原とし、該抗原に対する唾液中の分泌型免疫グロブリンＡの抗体価を測定するう蝕リスク検査方法に於いて、被験者から採取した唾液試験体を８倍を超える希釈を行っても十分な感度で検査が可能なう蝕リスク検査方法であり、その歯科口腔衛生に貢献するところ非常に大なるものである。

即ち本発明は、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列を有し、且つその端末にキャリアータンパクを結合させたペプチドを抗原とし、該抗原に対するヒトの唾液中の分泌型免疫グロブリンＡの抗体価を測定することを特徴とするう蝕リスク検査方法である。

本発明に係るPAc(361-386)を得るためには、このようなアミノ酸配列を得ることができる手法であれば特に限定されないが、一般的にはアミノ酸シンセサイザーを用いるのが便利である。ペプチドの合成に際しては上記アミノ酸配列内には余計なアミノ酸配列を有していないことが重要である。もし、余計な配列が存在すると、本来ミュ−タンス連鎖球菌に関連しない免疫グロブリンの抗体価も測定することになり検査の精度が低下してしまう。

本発明に係るう蝕リスク検査方法に於いては、キャリアータンパクを前記ペプチドの片端、あるいは両端に結合（コンジュゲート）する。キャリアータンパクとしては一般にキャリアータンパクとして用いられているBSA（Bovine Serum Albumin），KLH(Keyhole Limpet Hemocyanin)，OVA(OVaAlbumin)等を利用可能であり、本発明で使用する特定のアミノ酸配列のペプチドのN末端またはC末端に必要であればシステインを介して結合することができる。また、ペプチドとキャリアータンパクの結合比は１：５〜５：１の範囲であれば利用可能であるが１：１であることが好ましい。

検体にはヒト唾液を用いる。実際には唾液を生理食塩水，燐酸緩衝食塩水等で任意の倍率に希釈して検査に用いられる。イムノクロマトグラフィーのように多孔質膜を用いる試験では希釈倍率は８倍以上であることが好ましい。また、検体の希釈倍率が高くても抗原抗体反応が得られた検体を有していた人は、う蝕の発症リスクが低いという判定もできる。

抗原抗体反応の定量には、ヒトの唾液が有する分泌型免疫グロブリンＡに対するヒト以外の任意の動物由来抗体を使用する。例えばウサギ，マウス，ヤギ，ニワトリ，ヒツジ由来のものが使用できる。これらの抗体には任意の物質が標識され、標識物質の量に応じた反応性から抗体価の定量を行う。定量のための標識物質には抗体の活性を妨げない物質であればどのようなものでも応用可能である。しかしながら入手や標識の容易さから、ホースラデイシュパーオキシダーゼ，アルカリフォスファターゼ等の酵素，フルオレセインイソチオシアネート等の蛍光物質，金コロイド，ラテックスビーズ等を使うと良い。

本発明に係るう蝕リスク検査方法に於いては、抗体価の測定として一般的な抗原抗体反応に基づく手法がそのまま応用できるが、唾液の希釈倍率が８倍を超えても十分な測定感度を得られるためイムノクロマトグラフィーやイムノコンセントレ−ション等の検査方法が最も好ましい。勿論、通常のELISA（ミュータンス連鎖球菌に対する抗体価測定法の一つ、酵素抗体法（Enzyme Linked immunosorbent Assay；以下ELISAと記す）を用いても十分実用的であり、更に抗原抗体反応で得られる測定値の感度向上のために一般的に用いられる技術、例えば、唾液中の分泌型免疫グロブリンＡを一旦ビオチン化抗ヒト免疫グロブリン等と反応させ定量時の測定感度を増すこともできる。本発明に係るう蝕リスク検査方法に於いては、唾液を検体とすることが重要でありヒトの血清を用いても抗体価を測定することはできない。

抗体価の測定にあたっては本発明に使用するペプチドを固体表面に固相化し、これに任意に希釈した検体を反応させれば本発明に係る特定のアミノ酸配列を用いたう蝕リスク診断を行うことができる。逆の方法も可能である。即ち、検体を任意の複数の倍率に希釈して任意の固体表面に固相化し、これに測定を妨げない物質で標識したPAc(361-386)を反応させて抗体価を評価しても良い。

以下本発明を実施例を示し具体的に説明するが、本発明は本実施例に限定されるものではない。

＜ペプチドの合成＞
PAc(361-386)のアミノ酸配列をもつペプチドをステップワイスの固相ペプチド合成法から得た。合成器には、Model 350 Multiple Peptide Synthesizer（製品名：Advanced Chemitech, Louisville社製）を使用し、カラム （30×１）を用いた逆相のHPLC（10−45％ アセトニトリル のグラジエントを0.1％TFA）にて合成ペプチドの確認を行った。最終精製度は95％以上であった。

＜キャリアータンパクの結合＞
PAc（361-386）のN末またはC末にシステイン（Cys）を導入してMBS（m-Meleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester）法によりペプチドとキャリアータンパクとを結合する。
4mgのキャリアータンパク（BSA、Sigma社製）10mMを sodium phosphate buffer (pH7.2)0.25mLで溶解する。0.7mgのMBS(Sigma社)を少量のDMF（N,N-Dimethylformamide）に溶解する。sodium phosphate buffer (pH6.0)で平衡化したカラム（SephadexG-25，アマシャムバイオサイエンス社製）でゲル濾過し、A280を測定してキャリアータンパクの画分を集める。ペプチド5mgを1ｍLの0.1M sodium borate buffer (pH9.0)に溶解しておき、これにキャリアータンパク画分を少しずつ攪拌しながら加える全て加え終わった後ｐHを7.0〜7.5に調整し、3時間室温で攪拌を続ける。PBS（Phosphate Buffer Saline）にて1晩透析後に凍結乾燥機（YAMATO社製）で凍結乾燥する。

＜実施例＞
Ａ）補足抗体を塗布した多孔質膜の調整
多孔質膜としてニトロセルロースメンブレン（商品名：SXHF、日本ミリポア社製）を用いた。この膜を5ｍｍ×40ｍｍの長方形に切りだし、膜中央部にPBSにて500μｇ／ｍＬに調整したキャリアータンパク結合後のPAc(361-386)を1μLを帯状に塗布した。これを37℃にて2時間乾燥し使用直前までデシケーター中に保管した。

Ｂ）唾液検体の調整
被験者から３分間パラフィンワックスをかむことによって得られた刺激唾液をプラスチック容器に回収し、後述する方法でミュータンス連鎖球菌数を測定した。ミュータンス連鎖球菌数の多い被験者と少ない被験者の唾液をそれぞれ8倍と16倍に＋PBS（1%界面活性剤（Tween20）及び0.5％スキムミルク含有）で希釈したものを唾液検体として使用した。

Ｃ）測定
９６穴マイクロプレートのwellに、金標識した抗ヒトIgA（商品名：BA.GAHA40，British Biocell International社製）をPBSにて5倍希釈したものを50μＬ注入した。先にＡ）にて調整した補足抗体を塗布した多孔質膜の片端にクリップで40ｍｍ×40ｍｍのろ紙を四折にして固定した。ろ紙を固定していないもう片端をwellに浸漬させ8倍希釈及び16倍希釈の検体を染み込ませて抗体反応の有無を観察した。結果を表１に示す。多孔質膜上の補足抗体を塗布した部分が赤く染まったものを「反応あり」とした。

Ｄ）ミュータンス連鎖球菌数の測定方法
唾液中のミュータンス連鎖球菌の数は、MSB（ミティスサリバリウスバシトラシン培地）を用いて以下の方法で測定した。無菌的条件で唾液をPBSで希釈し、50μLを培地に塗布し、37℃、嫌気条件下で2日間培養を行い、コロニー数の計測からミュータンス連鎖球菌量(CFU/mL)を算出した。

＜比較例＞
ペプチドにキャリアータンパクを結合させてない以外は実施例と同様の方法により唾液中のミュータンス連鎖球菌数と抗体反応との関係を調べた。結果を表１に示す。多孔質膜上の補足抗体を塗布した部分が赤く染まったものを「反応あり」とした。

Claims (1)

1. 配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列を有し、且つその端末にキャリアータンパクを結合させたペプチドを抗原とし、該抗原に対するヒトの唾液中の分泌型免疫グロブリンＡの抗体価を測定することを特徴とするう蝕リスク検査方法。