JP2005181320A - 接着部支持体及び２以上の接着物質を持つマイクロアレイ反応チャンバ用パッチ - Google Patents

Abstract

【課題】 接着部支持体及び２以上の接着物質を持つマイクロアレイ反応チャンバ用パッチを提供する。
【解決手段】 試料注入口付きの支持部と、前記支持部に接着し、かつマイクロアレイ基板に付着しうる接着力を有する接着部とからなり、前記支持部及び接着部によって限定された反応チャンバ形成部を有するマイクロアレイの反応チャンバ用パッチにおいて、
前記接着部は、接着物質を両面に付着した接着部支持体が積層されて前記支持部に付着されており、前記接着部支持体と接着部支持体との間および前記接着部支持体と前記支持部との間を付着させる第１接着物質の接着力が、前記接着部支持体とマイクロアレイ基板との間を付着させる第２接着物質の接着力に比べて３３ｏｚ／ｉｎ（ＡＳＴＭ Ｄ３３３０方法）以上であることを特徴とする反応チャンバ用パッチである。
【選択図】 図３

Description

本発明はマイクロアレイの反応チャンバ用パッチ及びそれを使用する方法に関する。

一般的に“マイクロアレイ”とは、固体基板上にポリヌクレオチドまたは蛋白質のような重合体のグループが高密度に固定化されているものであり、前記重合体分子はそれぞれ一定の領域に固定化されている。このようなマイクロアレイは当業界で公知のものであり、例えば、特許文献１及び２に開示されている。前記マイクロアレイの例には蛋白質用マイクロアレイやポリヌクレオチドアレイが含まれる。ここに、マイクロアレイ上で反応させるための一定の条件を提供する空間を、“マイクロアレイの反応チャンバ”とすれば、従来のマイクロアレイの反応チャンバは、あらかじめ製作されているものではなく、通常反応を行う前にマイクロアレイ基板とカバーガラスまたはパッチと結合されて形成されていた。

図１を参照して、カバーガラスを使用して反応チャンバを形成させる過程の一例を説明すると、次のようになる。まず、プローブポリヌクレオチド２が固定化されているポリヌクレオチドアレイ１上に、標的ポリヌクレオチドを含む試料３を、マイクロピペット４を利用して適当量滴下し、滴下された試料滴３上にカバーガラス５を覆う。それにより、カバーガラスとマイクロアレイの基板との間の空間が反応チャンバの機能を行い、ハイブリダイゼーションを実行させることができる。
米国特許第５，４４５，９３４号明細書 米国特許第５，７４４，３０５号明細書

この方法は、カバーガラスを利用するためにコストダウンできるという長所がある。しかし、標的ポリヌクレオチドを含む試料の投入量を調節し難く、温度が高くて相対湿度が飽和されていない状態では試料が蒸発する場合があり、反応結果として得られる光学的信号を含む信号にも影響を及ぼして再現性のある結果を得難い短所がある。

また、従来のパッチを利用して反応チャンバを形成する方法もある。一般的にこのようなパッチは、基板と接着される接着部と、前記接着部が付着されている支持部とで構成されており、前記基板と接着された場合に反応チャンバを形成する空間であるチャンバ形成部が設けられている。これを、図２を用いて説明する。図２Ａは、パッチの側面断面図であり、試料注入口付きの支持部１０と、それに付着されている接着部９とで構成され、これによって反応チャンバ形成部２２が確保される。図２Ｂは、このようなパッチを基板上に付着して形成された反応チャンバに反応液を添加する場合の状態を示す平面透視図である。このような反応チャンバは、取っ手８を利用して前記パッチを基板上に付着することによって形成される。このように形成された反応チャンバで反応を行うには、試料注入口７にマイクロピペット４を利用して試料を注入するが、従来の反応チャンバでは、前記チャンバ形成部の形態が最適化されずにバブル６が発生する短所がある。また、前記パッチは１種の接着物質のみ使用するため、基板と強く接着する物質を使用することによって漏れ現象を防止できるが、反応が完了した後で脱着する場合に脱着し難く、脱着したとしても接着物質が残留する場合があった。また、支持部１０との接着力が弱くて接着部９と支持部１０とが分離される場合がある。さらに、チャンバの容量は、前記接着部の厚さをさらに厚くすることで調節できるが、１種の接着物質のみ使用するため、さらに厚くする場合に厚さを一定にすることが困難であった。

したがって、本発明の目的は、基板から容易に脱着されつつも支持部と接着部とが分離されず、かつ接着部の厚さを安定的に調節できるマイクロアレイ反応チャンバ用パッチを提供することである。

また、本発明の目的は、前記マイクロアレイパッチの使用方法を提供することである。

本発明者らは前記のような従来技術に基づいて、基板から容易に脱着できるが支持部と接着部とが分離されず、かつ接着部の厚さを安定して調節できるマイクロアレイ反応チャンバ用パッチについて研究し、接着部に接着部支持体を導入して２つ以上の接着物質を使用することで、前記問題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。

本発明のマイクロアレイの反応チャンバ用パッチ使用する場合、試料の漏れを防止でき、かつ脱着時には支持部を離脱させずに基板から容易に脱着させうる。また、反応チャンバの容量を容易に調整できる。

本発明の第一は、試料注入口付きの支持部と、前記支持部に接着し、かつマイクロアレイ基板に付着しうる接着力を有する接着部とからなり、前記支持部及び接着部によって限定された反応チャンバ形成部を有するマイクロアレイの反応チャンバ用パッチにおいて、
前記接着部は、接着物質を両面に付着した接着部支持体が積層されて前記支持部に付着されており、前記接着部支持体と接着部支持体との間および前記接着部支持体と前記支持部との間を付着させる第１接着物質の接着力が、前記接着部支持体とマイクロアレイ基板との間を付着させる第２接着物質の接着力に比べて３３ｏｚ／ｉｎ（ＡＳＴＭ Ｄ３３３０方法）以上であることを特徴とする反応チャンバ用パッチである。

本発明において、前記支持部は、接触角８０゜以上の疎水性物質で構成されることが好ましい。このような前記疎水性物質としては、疎水性プラスチックまたは疎水性処理されたシリコンがある。前記疎水性物質としては、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリジメチルシロキサン、ポリ塩化ビフェニル、疎水性に処理されたシリコンウェーハ、疎水性に処理されたＩＴＯガラス、またはそれらの組合わせなどがあるが、これらに限定されるものではない。

本発明において、前記接着部支持体は、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレン、及びポリエステルからなる群から選択される。しかし、これら例に限定されるものではない。また、前記接着部支持体は、本発明のパッチが使われる目的によって一つまたは複数を使用してもよく、その材質もそれぞれ同じでも異なってもよい。

本発明において、第１接着物質とは、前記接着部支持体と接着部支持体との間、または前記接着部支持体と前記支持部との間を付着させる接着物質をいう。前記第１接着物質は、第２接着物質に比べて３３ｏｚ／ｉｎ以上の接着力を持つものであることが好ましい。また、前記第１接着物質は、接着力が４５ｏｚ／ｉｎ以上である。

本発明において、第２接着物質とは、本発明のパッチとマイクロアレイ基板との間を付着させる接着物質である。前記第２接着物質の接着力は、望ましくは、前記第２接着物質は再接着性を持つものであって、接着力が１２ｏｚ／ｉｎないし２５ｏｚ／ｉｎである。

本発明の反応チャンバ用パッチは、試料注入口付きの支持部と、前記支持部に接着し、かつマイクロアレイ基板に付着しうる接着力を有する接着部とからなるが、前記支持部と接着部とによって形成される反応チャンバ形成部は、その形状に限定はないが、好ましくは流線型である。

本発明において、「マイクロアレイ」とは、基板上にポリヌクレオチドまたは蛋白質などの生体分子が高密度に固定化されているものであって、前記生体分子はそれぞれ一定の領域に固定化されている。マイクロアレイとしては、例えば、前記の特許文献１や２に開示されているが、本発明はこれらに限定されず、従来公知のマイクロアレイに応用できる。なお、従って、本発明の反応チャンバ用パッチは、蛋白質用マイクロアレイやポリヌクレオチドアレイにも応用できる。

前記マイクロアレイがポリヌクレオチドマイクロアレイである場合を例にとり、本発明のパッチの使用方法を説明する。

まず、本発明のパッチを、プローブポリヌクレオチドが固定化されているポリヌクレオチドアレイ基板上に付着すると、該基板上に反応チャンバが形成される。前記反応チャンバに、試料注入口から標的試料を含むハイブリダイゼーション液を注入し、一定の条件下でハイブリダイゼーション行う。ハイブリダイゼーションが終わってから洗浄液で洗浄し、十分に乾燥し、ハイブリダイゼーションの程度をスキャナによりスキャニングすれば、その結果を測定することができる。

以下、本発明の反応チャンバ用パッチの一例を図面を参照してさらに具体的に説明する。図３は、本発明のマイクロアレイ反応チャンバ用パッチの側面図である。図３に図示すように、本発明の反応チャンバ用パッチは、支持部１０とそれに付着されている接着部９とで構成されるが、前記接着部９は、第１接着物質１１が接着部支持体１２の上下面に付着されている第１接着層１３と、上面には第１接着物質１１が付着されており、下面には第２接着物質１４が付着されている第２接着層１５とで構成されている。前記接着部９は、前記第１接着層１３の上面に付着されている第１接着物質１１によって前記支持部に付着され、前記第２接着層１５の下面に付着されている第２接着物質１４によってマイクロアレイ基板上に付着することができる。また、本発明のパッチには、マイクロアレイ基板上に付着させた時に反応チャンバを形成できる反応チャンバ形成部２２が備えられている。このような反応チャンバ形成部２２は、前記接着部を一定に切り取ることによって形成される。前記接着部の厚さは、使用される前記接着部支持体の個数によって適宜選択することができる。したがって、前記接着部支持体の個数を調整することによって前記接着部の厚さを調整でき、それにより反応チャンバ形成部の容量を調整できる。なお、更に第ｎ番目の第ｎ接着層まで積層する場合には、第１接着物質の接着力が、前記接着部支持体とマイクロアレイ基板との間を付着させる第ｎ接着物質の接着力に比べて３３ｏｚ／ｉｎ（ＡＳＴＭ Ｄ３３３０方法）以上とすることが好ましく、また、第ｎ接着物質の接着力は１２ｏｚ／ｉｎないし２５ｏｚ／ｉｎであることが好ましい。この場合、第ｎ−１接着層までは、第一接着層と同じものを使用することができる。

本発明の反応チャンバ用パッチの製造方法に限定はないが、例えば、次のような過程によって製造できる。まず、図４に示すように、接着部支持体１２の上面及び下面に第１接着物質１１を付着させて第１接着層１３を形成し、他の接着部支持体１２の上面には第１接着物質１１を付着させ、下面には第２接着物質１４を付着させて第２接着層１５を形成する。次いで、それら第１接着層１３と第２接着層１５とを第１接着物質１１間の接着力を利用して接合させ、接着部を形成する。次に、図５に示すように、適当な大きさ及び形態で前記接着部の一部１７を切り取って反応チャンバ形成部２２を形成する。前記反応チャンバ形成部２２が設けられた前記接着部を試料注入口付きの支持部に接着すると、本発明のパッチが形成される。

図６及び図７は、本発明の反応チャンバ用パッチの使用方法の一例を示す図面である。図６ａは、本発明の反応チャンバ用パッチがポリヌクレオチドマイクロアレイ基板に付着された状態を示す平面図の透視図である。本発明の反応チャンバ用パッチを前記マイクロアレイ基板上に付着させることによって、反応チャンバが形成される。これに、試料注入口７を通じて反応液を注入すれば、矢印で表したように試料が前記反応チャンバに分配される。図６ｂは、図６ａの部分側面図である。

次いで、試料注入口７をテープ２０を利用して密閉し、適当なハイブリダイゼーション条件、例えば、３７℃で１６時間培養する（図７ａ）。図７ｂは、本発明のパッチが基板に付着されて形成された反応チャンバ中の試料を注入した場合を示す反応チャンバの側面の部分断面図である。前記反応チャンバは、前記パッチの接着部と基板とが前記第２接着物質によって接合されることで形成される。基板上に固定化されているプローブポリヌクレオチド１８は、試料中の標的ポリヌクレオチド１９とハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションの間、前記パッチから試料が漏れてはならないが、前記第２接着物質は、除去時に容易に脱着され、かつ基板上に残留物質を残してはならない。このような条件を満たすには、前記第２接着物質は、鋼鉄に対する接着力を基準にして、１２〜２５ｏｚ／ｉｎ（ＡＳＴＭ Ｄ３３３０方法）の接着力を持つことが望ましい。また、前記第１接着物質は、前記支持部と強く接着させて前記パッチを脱着させる際に、第２接着物質より先に離脱されてはならない。前記第１接着物質は鋼鉄に対する接着力を基準に４５ｏｚ／ｉｎ（ＡＳＴＭ Ｄ３３３０方法）の接着力を持つことが望ましい。

以下本発明を実施例を通じてさらに詳細に説明する。しかし、それら実施例は本発明を例示的に説明するためのものであって、本発明の範囲がそれら実施例に限定されるものではない。

次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は何ら本発明を制限するものではない。

（実施例１）
第１接着物質及び第２接着物質の接着力がパッチ特性に及ぶ影響
本実施例では、接着力が１００ｏｚ／ｉｎである第１接着物質が上面及び下面に付着された厚さ１２０μｍのテープ（３Ｍ社製、商品名「９４９５ＭＰ^ＴＭテープ」）を第１接着層として使用し、上面は４５ｏｚ／ｉｎの接着力を持つ第１接着物質でコーティングされており、下面は１２ｏｚ／ｉｎの接着力を持つ第２接着物質でコーティングされているテープ（３Ｍ社製、商品名「９４２５ＰＣ^ＴＭ テープ」）を第２接着層として使用した。前記２層の接着層を結合させた後、厚さ２００μｍで試料注入口付きのポリカーボネート材質の支持部に接合させてマイクロアレイ反応チャンバ用パッチを形成した。

次に、前記パッチをマイクロアレイ基板上に付着して反応チャンバを形成し、標的ポリヌクレオチドが含まれている試料を試料注入口を通じて注入し、３７℃で１６時間ハイブリダイゼーションを行った後、前記パッチを脱着した。前記ハイブリダイゼーション中の試料の漏れ率、脱着満足率及び支持部付着率を調べて記録した。３人の測定者がそれぞれ２０回反復して測定した。試料の漏れ率の基準は、漏れによる試料損失があるかどうかをスキャナ（ＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ｂ^ＴＭ，Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．）で測定し、脱着満足率は、脱着時それぞれの測定者がハイブリダイゼーション後に前記パッチを脱着した時の満足度を平均したものである。満足度の基準は、脱着が不可能なものは０とし、その他の脱着率は、脱着時の接着物質の残留有無及び脱着時パッチの変形なしに脱着されるかどうかによって表示した。すなわち、パッチの残留及び変形なしに容易に脱着されるものを１００と表示した。支持部付着率は、ハイブリダイゼーション後に脱着時、第１接着物質が支持部から全く脱着されないものを１００として測定した。その結果を表１に表す。

表１に表した値は、それぞれ２０回実験の結果を平均したものである。表１に表したように、試料漏れは、接着力が１２ｏｚ／ｉｎ以上の場合には発生しなかった。脱着満足率は、１２ｏｚ／ｉｎないし２３ｏｚ／ｉｎで最適の結果を得た。支持部との付着率は、４５ｏｚ／ｉｎ以上で満足すべき結果を得た。すなわち、試料の漏れもなく脱着満足率もよい第２接着物質の接着力は、１２ｏｚ／ｉｎ〜２３ｏｚ／ｉｎであった。支持部との付着率は、第１接着物質が４５ｏｚ／ｉｎ以上の接着力を持つ場合、前記支持体からあまり脱着されなかった。但し、前記第２接着物質及び第１接着物質の接着力の差は３３ｏｚ／ｉｎ以上でなければならない。このような条件を満たして初めて、前記接着部のマイクロアレイ基板との接着力と支持部との接着力との間に十分な差が出て満足すべき脱着満足率を得られる。

（実施例２）
実施例１の結果に基づいて接着力１２ｏｚ／ｉｎの物質がフィルムの一面に、４５ｏｚ／ｉｎの物質がフィルムの他面にそれぞれ接着されて製作されたテープ（３Ｍ社製、商品名「９４２５ＰＣ^ＴＭ テープ」）を第２接着層として使用し、厚さを調整するためにフィルムの両面に１００ｏｚ／ｉｎの接着物質が接着されて製作されたテープ（３Ｍ社製、商品名「９４９５ＭＰ^ＴＭ テープ」）を第１接着層として使用した。９４２５ＰＣ^ＴＭ １枚、９４９５ＭＰ^ＴＭ ２枚を組合わせて厚さ４００μｍの接合されたテープを得て、図８に示すように、支持部として２００μｍのポリカーボネートフィルムと接着してパッチを製作した。図９ａは、得られた接着部から１４ｍｍ×１４ｍｍ大きさの空間を切り取ってチャンバ形成部を形成した前記接着部を表したものであり、図９ｂは、試料を注入するための試料注入口７付きのポリカーボネ―ト支持部を表したものである。図９ａは、チャンバ形成部を上から見下ろしたものであって、従来のチャンバで使われた角部分を除去して流線型に設計した。

このように製作されたマイクロアレイのハイブリダイゼーションチャンバに対し試料漏れ率、脱着満足率及び支持部付着率を測定した。その結果を表２に表した。

表２に表したように、試料漏れ率０％、脱着満足率１００％及び支持部付着率１００％の満足すべき結果を得た。

前記マイクロアレイ反応チャンバを使用して、ポリヌクレオチドアレイにテストを行った。実験条件は次の通りである。

１）プローブポリヌクレオチド：配列番号１
標的ポリヌクレオチド：配列番号２，５００ｐＭ
スポットピッチ：３００μｍ、スポット直径：１６０μｍ、スポット数：５２８個
２）ハイブリダイゼーション時間及び温度：１６時間、３２℃
３）洗浄時間：Ｉ段階−６Ｘ ＳＳＣで５分、ＩＩ段階−３Ｘ ＳＳＣで５分
４）ＰＭＴ ５７３、５３２ｎｍ波長でグリーンモードで測定（Ｓｃａｎｎｅｒ ＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ｂ^ＴＭ，Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．）
スキャニングの結果、平均蛍光強度９６５５．３１を得た。

この実験の結果、本発明のパッチが、ポリヌクレオチドアレイの反応チャンバとしての機能を優秀に行えるということが示された。

本発明のマイクロアレイの反応チャンバ用パッチは、マイクロアレイを利用した分析方法において、プローブと標的物質とを反応させる段階で反応チャンバを形成させるのに好適に使われ、有用である。

従来のカバーガラスを利用してチャンバを形成する過程の一例を示す図面である。 図２Ａは、従来のチャンバ形成用パッチの側面断面図であり、図２Ｂは、従来のパッチを利用してチャンバを形成する過程の一例を示す図面である。 本発明のマイクロアレイ反応チャンバ用パッチの側面図である。 本発明のパッチの接着部を形成する過程を示す図面である。 本発明の接着部より反応チャンバ形成部を製作する過程を示す図面である。 図６ａは、本発明の反応チャンバ用パッチがポリヌクレオチドマイクロアレイ基板に付着された状態を示す平面図の透視図であり、図６ｂは、図６ａの部分側面図である。 本発明のパッチの使用方法の一例を示す図面であり、図７ａは、試料注入口７をテープ２０を利用して密閉したところ、図７ｂは本発明のパッチが基板に付着されて形成された反応チャンバ中の試料を注入した場合を示す反応チャンバの側面の部分断面図である。 本発明の実施例２で使われたパッチの接着部を示す図面である。 本発明の実施例２の接着部よりチャンバ形成部を製作する過程を示す図面である。

符号の説明

４・・・マイクロピペット、
７・・・試料注入口、
９・・・接着部、
１０・・・支持部、
１１・・・第１接着物質、
１２・・・接着部支持体、
１３・・・第１接着層、
１４・・・２接着物質、
１７・・・切り取り部、
１５・・・第２接着層、
１８・・・プローブポリヌクレオチド、
１９・・・標的ポリヌクレオチド、
２０・・・テープ、
２２・・・反応チャンバ形成部。

Claims (10)

1. 試料注入口付きの支持部と、前記支持部に接着し、かつマイクロアレイ基板に付着しうる接着力を有する接着部とからなり、前記支持部及び接着部によって限定された反応チャンバ形成部を有するマイクロアレイの反応チャンバ用パッチにおいて、
   前記接着部は、接着物質を両面に付着した接着部支持体が積層されて前記支持部に付着されており、前記接着部支持体と接着部支持体との間および前記接着部支持体と前記支持部との間を付着させる第１接着物質の接着力が、前記接着部支持体とマイクロアレイ基板との間を付着させる第２接着物質の接着力に比べて３３ｏｚ／ｉｎ（ＡＳＴＭ Ｄ３３３０方法）以上であることを特徴とする反応チャンバ用パッチ。
2. 前記支持部は、接触角８０゜以上の疎水性物質で構成されることを特徴とする請求項１に記載のパッチ。
3. 前記疎水性物質は疎水性プラスチックまたは疎水性処理されたシリコンであることを特徴とする請求項２に記載のパッチ。
4. 前記疎水性物質はポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリジメチルシロキサン、ポリ塩化ビフェニル、疎水性に処理されたシリコンウェーハ、疎水性に処理されたＩＴＯガラス、およびこれらの組合わせからなる群から選択されることを特徴とする請求項２に記載のパッチ。
5. 前記接着部支持体は、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレン及びポリエステルからなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載のパッチ。
6. 前記第１接着物質の接着力は、４５ｏｚ／ｉｎ以上であることを特徴とする請求項１に記載のパッチ。
7. 前記第２接着物質の接着力は、１２ｏｚ／ｉｎないし２５ｏｚ／ｉｎであることを特徴とする請求項１に記載のパッチ。
8. 前記チャンバ形成部は流線型である特徴とする請求項１に記載のパッチ。
9. 生体分子が固定化されたマイクロアレイ基板上に請求項１ないし８のうちいずれか１項に記載のパッチを付着させて反応チャンバを形成する段階と、
   前記反応チャンバに反応液を注入して反応を行う段階と、を含む該パッチの使用方法。
10. 前記マイクロアレイは、蛋白質用マイクロアレイまたはポリヌクレオチドアレイであることを特徴とする請求項９に記載の方法。

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