JP2005181316A - 細胞運動性アッセイ - Google Patents

Abstract

【課題】 細胞運動性アッセイ、特に細胞の走化性を検討するために有用な細胞移動アッセイを実施するための方法を提供する。
【解決手段】 標的細胞群（外部刺激に対する細胞の運動性応答の関数として形成される）が、光学的分別溶液の添加によってその後光学的に分別され、及びそれによって標的細胞群が電気光学的読み取り装置に対して大なり小なり検出可能となる、外部刺激に対する細胞の運動性応答を定量するための電気光学的方法を開示する。前記方法は走化性アッセイを実施するために使用できる。そのような及び他の目的のために、前記方法は、ハイスループットロボットオートメーションを用いて実施することができる。
【選択図】なし

Description

一般に、本発明は細胞運動性アッセイ、特に細胞の走化性を検討するために有用な細胞移動アッセイに関する。

可溶性因子に対する走化性又は化学運動性（ケモキネシス）応答として、あるいは細胞表面又は細胞外マトリックス関連成分に対する走触性（ｈａｐｔｏｔａｃｔｉｃ）応答によって支配される現象としての細胞運動は、胚発生、健常成体生物の維持、及び癌を含む多くの病的状態の進行における主要な細胞プロセスの１つである。

細胞アッセイは細胞の運動性を検討するために広く実施されており、細胞機能及び細胞行動を損傷しうる化合物を特定するために化合物を予備スクリーニングする上で特に有用である。抗癌剤発見への試みは、例えば、潜在的及び有望な薬剤候補物質を予備スクリーニングする及び／又は発見するための走化性に基づく細胞運動性アッセイを多くの場合含む。

慣例的な走化性アッセイ手順は周知である。例えば、１つの手順に従えば、接着細胞を同多孔質半透明ポリカーボネート膜の１つの表面に付着させ、あらかじめ選択した化学誘引物質の濃度勾配を含む溶液中に置く。常にではないが、多くの場合、その化学誘引物質は検討の対象である。前記細胞は、膜の細孔を通って一方の表面からもう一方の表面へ、化学誘引物質の低濃度又は高濃度の方へ、あるいは低濃度又は高濃度から離れるように、徐々に移動する。細胞は膜のそれぞれの側で移動細胞群と非移動細胞群を形成する。次に細胞を手動で膜の一方の表面から擦り取り、他方の表面に残存する細胞を蛍光化合物で標識して、走査型蛍光光度計で「計数」する。

この手順や同様の手順は低流量の単一試料走化性アッセイ（例えば小規模な学術研究のため）には適するが、はるかに高い流量を求めるときには（例えば大規模な工業用薬剤発見作業のため）、いくつかの同時アッセイを実施する（例えばいくつかの別個のアッセイチャンバーを備えた多区画容器を使用すること）必要性が特に急務となる。しかし、単一試料アッセイに関わる物理的工程のいくつかの局面を（典型的には）より小さな試料サイズで同時に実施するとき、それらの工程はより困難となる。

特に、単一走化性アッセイでは非移動細胞を取り除く工程は比較的容易且つ効率的に実施することができる。しかし、例えば９６穴マルチウエルアレイ内に接種された９６の走化性試料について同じ工程を実施することは困難であり、人為的誤りを起こしやすい。細胞を手動で擦り取るにはより多くの時間と努力と注意及びより高いレベルの技術的スキルが要求される。多くの場合、各々のチャンバーを個別に手動で擦り取らねばならず、各々の場合にチャンバー間での交差汚染及び／又は不注意な膜破壊を生じやすい。

最近、１９９７年２月１１日にＲ．Ｔｃｈａｏに発行された米国特許第５，６０１，９９７号明細書は１つの代替策を示唆している。

Ｔｃｈａｏの特許は、あつらえ構築された（ｃｕｓｔｏｍ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）マルチウエルアレイをそのアッセイ試料プラットフォームとして使用する走化性方法を開示している。このマルチウエルアレイは、多くの同等の現在使用可能なアレイと異なり、「放射線不透明膜」を組み込んでいる。放射線不透明膜は、「多数の実質的に垂直な細孔を有する」と開示されており、アッセイの経過中に使用される電磁放射線のある種の規定波長の「少なくとも１つ」を「実質的に透過しない」。標識細胞の蛍光読み取りのために光走査装置を使用するとき、放射線不透明膜は光の通過を遮断し、それ故、意図されるとき、走査装置による膜の離れた反対側表面の細胞の蛍光活性化及び検出の両方を阻止する。

Ｔｃｈａｏの特許は、蛍光走査に先立つ手動での細胞除去を必要としない走化性アッセイを実施するためのアプローチを提供する。それには関わりなく、代替アプローチ、特にあつらえ設計された「放射線不透明膜」の使用を必要としないアプローチの必要性が依然として存在する。

前記の必要性や他の長年にわたる要求に応えて、本発明は、一般に、外部刺激に対する細胞の運動性応答を定量するための電気光学的方法を提供し、その方法では、標的細胞群（前記応答の関数として形成される）が光学的分別溶液の添加によって後に光学的に分別され、それによって標的細胞群は電気光学的読み取り装置に対して大なり小なり検出可能となる。

前記方法は、「一般的（ｇｅｎｅｒｉｃ）」トランスウエルプラットフォームを含む、比較的広い範囲のアッセイプラットフォーム（例えば９６穴マルチウエルアアレイ）を使用して実施することができる。前記方法はまた、開始から完了まで、使用するアッセイプラットフォームを実質上物理的に分解せず、また直接手動細胞除去に実質的に干渉することなく、実施できる。前記方法は、これらや他の要素の故に、ハイスループットロボットオートメーションに良好に適する。

前記方法は、特に、多孔質膜（例えばトラックエッチングした同多孔質ポリカーボネート膜）に細胞（例えば接着性腫瘍誘導細胞）を付着させること；前記多孔質膜からの前記細胞の一部の移動を促進すること（例えばあらかじめ選択した化学誘引物質の濃度勾配を作製し、細胞をその中に入れることによって）；移動又は非移動細胞部分のいずれかに光学的分別溶液を加えて、前記処理部分を電気光学的読み取り装置（例えば走査型蛍光光度計）によって大なり小なり検出可能にすること；次に前記電気光学的読み取り装置を使用して移動及び／又は非移動細胞群のいずれかを「計数すること」（直接又は間接的に）の工程を含む。

前記に照らして、標的細胞群（外部刺激に対する細胞応答の関数として形成される）が光学的分別溶液の添加によって後に光学的に分別される、外部刺激に対する細胞の運動性応答を定量するための電気光学的方法を提供することが本発明の主たる目的である。

従来の電気光学的読み取り装置と一般的な走化性トランスウエルアッセイプラットフォーム（例えば特別あつらえの光遮断膜を用いないもの）を使用して実施できる走化性アッセイを実施するための方法を提供することが本発明のもう１つの目的である。

従来の電気光学的読み取り装置と一般的な走化性トランスウエルアッセイプラットフォームを使用して実施でき、ロボットオートメーションに良好に適する、走化性アッセイを実施するための方法を提供することが本発明のもう１つの目的である。

あらかじめ選択した本発明の方法の実現様式を実施するのに適した、あらかじめ選択した適合性成分のキットを提供することが本発明のもう１つの目的である。

本発明の方法を実施する比較的広い範囲の様式に有用な光減衰溶液を提供することが本発明のもう１つの目的である。

これらや他の目的は、付属の図面を合わせて考慮して、本発明の現在の実施態様の一部に従った本明細書中の本発明の詳細な説明に照らしてさらに理解することができる。

本発明は、さもなければ識別できない移動細胞群と非移動細胞群を光学的に分別し、その後電気光学的読み取り装置を使用して生じた分別光学特性を検出することによって移動細胞群と非移動細胞群の定量を可能にする。その方法を含む基本的工程を図１ａ、１ｂ、１ｃ及び１ｄに図式的に示す。

前記方法は、図１ａに示すように、「出発表面」１６_Ｓと「行き先表面」１６_Ｄを有する多孔質膜１６を提供することから始まる。

細胞Ｃの個体群を、図１ｂに示すように、多孔質膜の出発表面１６_Ｓに付着させ、前記多孔質膜１６を通過する前記出発表面１６_Ｓから前記行き先表面１６_Ｄへの前記細胞の一部の移動を促進するための条件を確立する。この工程の最後に、細胞Ｃのもとの個体群は、多孔質膜１６によってまだ「光学的に識別不能な」移動細胞群ＭＣと非移動細胞群ＮＭＣに分けられる。

前記方法は、図１ｃに示すように、出発表面に残存する細胞の部分（すなわち前記の非移動細胞群ＮＭＣ）又は行き先表面に移動した細胞の部分（すなわち前記移動細胞群ＭＣ）のいずれかに「光学的分別溶液」を加えて、あらかじめ選択した電気光学的読み取り装置によって前記処理部分を大なり小なり検出可能にすることによって継続される。この工程の最後に、移動細胞群ＭＣと非移動細胞群ＮＭＣは「光学的に分別」される。

前記方法は、図１ｄに示すように、前記あらかじめ選択した電気光学的読み取り装置を使用して、出発表面１６_Ｓに残存する細胞Ｃ又は行き先表面１６_Ｄに移動した細胞Ｃ（光走査「Ａ」又は「Ｂ」参照）又は移動細胞群と非移動細胞群の両方（光走査「Ａ」及び「Ｂ」参照）のいずれかの光学的分別特性を読み取ることで終了する。

本発明の実施の鍵である、光学的分別溶液を添加する工程は変化させうる。それには関わりなく、４つの一般的な実施様式が特定できる。

最初の一般的実施様式では、光学的分別溶液は、非移動細胞ＮＭＣに帰せられる光信号を「低減する」ように設計される。そのような溶液を使用する工程は、例えば、細胞移動を実施する前に、最初に及び非選択的にすべての細胞を蛍光化合物で標識し、次に前記光学的分別溶液（適切に作製された）を非移動細胞ＮＭＣに添加することにより、前記蛍光を選択的に不活性化、マスキング、消光又はさもなければ低減することから開始する。

第二の一般的実施様式では、光学的分別溶液を、移動細胞ＭＣに帰せられる光信号を「低減する」ように設計する。そのような溶液を使用する工程は、例えば、細胞移動を実施する前に、最初に及び非選択的にすべての細胞を蛍光化合物で標識し、次に前記光学的分別溶液（適切に作製された）を移動細胞ＭＣに添加することにより、前記蛍光を選択的に不活性化、マスキング、消光又はさもなければ低減することから開始する。

第三の一般的実施様式では、光学的分別溶液を、非移動細胞ＮＭＣの光学的検出能を「増強する」ように設計する。そのような溶液を使用する工程は、例えば、光学的に未分別の細胞個体群からの細胞の移動を促進し、次に非移動細胞ＮＭＣを前記光学的分別溶液で選択的に処理することによってそれらを増強することから開始する。そのような機能のために作製された光学的分別溶液は、例えば、蛍光化合物をその成分の１つとして含有しうる。

最後に、第四の一般的実施様式では、光学的分別溶液を、移動細胞ＭＣの光学的検出能を「増強する」ように設計する。そのような溶液を使用する工程は、例えば、光学的に未分別の細胞個体群からの細胞の移動を促進し、次に移動細胞ＭＣを前記光学的分別溶液で選択的に処理することによってそれらを増強することから開始する。

膜の出発表面からその行き先表面への細胞移動を促進する工程は、多くの標準的で周知の走化性プロトコールの１つを含みうるが、他のケモキネシス機構を含む他のプロトコールも含みうる。

走化性は一般に、特定化学物質濃度勾配に応答した運動細胞又は生物の指令された運動を含む。本発明において、これは、より高い濃度の方向（すなわち正の走化性）又はより低い濃度の方向（すなわち負の走化性）のいずれかに向かって起こりうる。

走化性に基づくアッセイにおいて典型的に検討される細胞は、白血球（例えば単球及びリンパ球）、腫瘍細胞、及び原核及び真核微生物を含むがこれらに限定されない、いわゆる「接着」細胞（すなわち適切な基質に結合した場合に単層培養として生存し、増殖する細胞）である。腫瘍細胞は、例えば、乳房、肺及び結腸直腸組織の生検、ならびに造血細胞から誘導することができ、及び上皮由来（例えば癌腫）でありえ、又は結合組織において生じうるか（例えば肉腫）、又はメラニン形成細胞（例えば黒色腫）及びリンパ系細胞（例えばリンパ球）などの特殊な細胞から生じうる。

典型的走化性アッセイでは、前記多孔質膜によって基本的に「分けられた」、溶液内の濃度勾配を形成する際に所定の「化学誘引物質」を使用する。その多孔質膜に付着した接着細胞は、前記化学誘引物質への誘引又は忌避の力に依存して一方の表面から他方へと移動する。最終的に、最初は比較的急であった勾配が、平衡状態（すなわち多孔質膜の両側に等濃度の化学誘引物質が存在する点）に達し（経時的な化学誘引物質の拡散によって）、その時点で刺激細胞の移動が停止する。より典型的には、しかしながら、細胞移動は、採用する特定プロトコールに依存し、それによって規定される時点で、平衡に達する前に終了する。

ひとたび移動が完了すれば、移動細胞ＭＣ又は非移動細胞のいずれかに対して分別の特異性を与える又は促進することができる機構がいくつかあり、様々である。例えば、光学的分別溶液の粘度を、少なくとも標的細胞の光学的分別特性を光学的に読み取るために適切な期間、多孔質膜を通してのその流動、ならびにその固体成分の懸濁又は担持固体成分を阻止するようにあつらえることができる。あるいは、光学的分別溶液の光学機能性成分を、多孔質膜の細孔の通過を妨げる又は制限するのに適した寸法を有する物理的に大きな固体又は粒状物から選択する又はそれらを構成することができる。

特異性はまた、化学的機構によって与えることもできる。例えば、多孔質膜の一方の側だけで、実質的にすべての水性（典型的には親水性）化学誘引物質溶液を有機疎水性光減衰溶液に置き換えることなどにより、光学的分別工程の間に（すなわち細胞移動の終了後に）多孔質膜の反対側の溶液を実質的に非混和性にするように変更又は修正する。あるいは、移動細胞ＭＣ又は非移動細胞ＮＭＣのいずれかを特異的に標的する、選択的非光学的前処理（例えば結合部位の付加）を利用して、光学的分別溶液の光学機能性成分に対して一方を反応性又は応答性にし、他方を反応性又は応答性でないようにすることができる。

認識されるように、光学的分別工程の「選択性」は、細胞移動の直後の単一光学的分別溶液の添加を含みうるか、又は消費された化学誘引物質溶液の吸引及び細胞の洗浄と前処理などの付加的な一連の工程を含みうる。その単一段階の分別工程がロボットオートメーションによく適するので、前者が好ましい。後者は、その多段階分別工程が光学的分別溶液の構成と実施により大きな柔軟性を与えるので好ましい。

走化性試験のために本発明を実施するための操作条件は以下のとおりである：温度はほぼヒトの体温（すなわち３７℃）とする；使用する溶液はすべて水性であり、細胞の生存度と運動性を促進するように適合させた成分（ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｃｙ）、濃度及びｐＨを有する；検討する細胞は接着細胞である；及び圧は正常環境圧である。そのような状況下で現行の走化性プロトコールにおいて細胞移動に割り当てられる典型的な期間（化学誘引物質濃度勾配の作製から始まる）は、約４から６時間である。

光学的分別溶液の形状は、本発明の方法の適用及び個々の実施様式に依存して異なる。光学的分別溶液は、例えば、選択的光減衰（例えばマスキング、消光及び吸収）、選択的光増強（例えば蛍光標識、及び染料、着色剤又は発光化合物による染色）、又は選択的溶解（すなわち非選択的光増強と組み合わせた移動又は非移動細胞群のいずれかの部分的又は完全な抹消又は除去）に基づいて機能することができる。選択的光減衰は、直接標的細胞に対して実施するか（例えばキレート化膜結合蛍光化合物を消光することによって）又は前記細胞群を養う（ｈｏｓｔｉｎｇ）、内包する又は近接する媒質溶液の光学特性を変化させることによって間接的に実施する（例えば標的細胞群から、標的細胞群内で又は標的細胞群へと伝わる光を遮蔽又は吸収するために光吸収物質を前記媒質溶液に添加することによって）ことができる。

光学的分別溶液は、水性又は有機溶液、あるいは乳濁液、懸濁液又は分散でありえ、典型的には少なくとも１つの主要光学機能性化合物、相、粒子又は他の同様の成分をその中に含む。主要光学機能性成分は光学的分別を可能にするように選択される。主要光学機能性成分は本発明の選択性の原因となりうるが、その成分を担持する溶液の残りの成分の機能によって選択性を与えることもできる。

好ましい光学的分別溶液においては、主要光学機能性成分は、広いスペクトル（好ましくは、いわゆる「黒体」）の光吸収が可能な粒子、例えばカーボンブラックである。カーボンブラック及びカーボンブラック組成物は、Ｃａｂｏｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）、Ｄｅｇｕｓｓａ Ｈｕｌｓ ＡＧ（Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｅ．Ｉ．ｄｕ Ｐｏｎｔ ｄｅ Ｎｅｍｏｕｒｓ，Ｉｎｃ．（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，Ｄｅｌａｗａｒｅ）及びＣｏｌｕｍｂｉａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍａｒｉｅｔｔａ，Ｇｅｏｒｇｉａ）などの製造者から、様々なグレードと粒径で、購入することができる。

カーボンブラックの粒径が多孔質膜の表示孔径よりも小さい場合は、光学的分別溶液は、好ましくは比較的高い粘度、すなわち光学的読み取りの期間中多孔質膜を通過するその流動を最小化する又は無視しうる程度にするのに十分な粘度を有するべきである。あるいは、溶液の粘度を設計する際により広い範囲が許容されるようにカーボンブラックの集塊を含む大きな粒子を使用することができる。そのような大きな粒子は高度の「マスキング」機能性を与えないことがあるが、それにもかかわらず、散乱光を吸収することができ、それ故望ましくない光学的バックグラウンドシグナルの減衰に寄与しうる。

光減衰溶液の主要光学機能性成分は、選択した電気光学的読み取り装置の光感受性範囲内の光だけを吸収する必要があるが、市販の読み取り装置は光感受性に関してそれらの中で差があるだけでなく、多くの読み取り装置自体が多くの異なる光範囲に調節できることは認識される。カーボンブラックの使用は、それ故、その広い吸光率が種々の電気光学的読み取り装置を用いた多くの異なるアッセイのための使用を可能にするので、特に本発明の「キット」実施態様において、他のより狭い吸効率成分に比べて好ましい。

カルセイン標識走化性アッセイにおける使用に適する、光減衰溶液の１つの特定実施態様は、グリセロール中のカーボンブラックの水溶液であり、その水溶液中のカーボンブラックの濃度は少なくとも約０．０５％（重量／容積）であり、グリセロールの濃度は約５％から約７５％（重量／容積）の範囲内である。大部分の走化性及びケモキネシス分析に関して、そのような水性光減衰溶液はカーボンブラックとグリセロール成分だけから成り、減衰はカーボンブラック成分によって制御され、選択性はグリセロール成分によって制御される。他の成分（界面活性剤、殺菌剤、防腐剤等）の添加は、絶対的に排除されるわけではないが、もし添加する場合は、そのような成分が、例えば細胞生存度、細胞運動性及び蛍光に及ぼす個々の影響に照らして考慮すべきである。

本発明のアッセイは、少なくとも、第一区域と第二区域（例えば多孔質膜によって「分けられた」容器の上部区域と下部区域）の中間位置に置かれた多孔質膜を少なくとも含むプラットフォーム上で実施する。構造上は多孔質膜によって分けられているが、第一区画と第二区画は顕微鏡レベルでは「連続している」、すなわち多孔質膜の細孔を通して連続している。そのような連続性は、例えば、第一区画と第二区画の間での化学誘引物質の濃度勾配の作製、ならびに前記濃度勾配に応答した多孔質膜の一方の表面（すなわち「出発」表面）から他方（すなわち「行き先」表面）への細胞の移動を可能にする。細胞は基本的に膜の細孔を通って「爬行する（ｃｒａｗｌ）」。

本発明の方法の実施は多孔質膜の選択に関して限定されないが、細胞移動を促進する多孔質構造を有する膜を選択することによって利点が得られる。多孔質膜の特に有用な種類は、いわゆる「同多孔質」膜である。現在より一般的に市販されている膜形状である、蛇行性細孔網を有する膜と異なり、「同多孔質」膜の細孔は、側方又はチャネル交差偏位をほとんど伴わずに一方の表面からもう一方へと膜を横切る別個のチャネルである（毛管参照）。

特に適切な同多孔質膜は、明瞭な試料観察を可能にする滑らかなガラス様表面を有し、アッセイの過程で使用されるいかなる染色液、染料あるいは蛍光又は発光化合物に対しても非反応性のものである。

適切な同多孔質膜は、多くの販売元を通して入手できる。例えば、孔径０．０５、０．１、０．２２、０．４、０．６、０．８、１．２、２、３、５、８、１０及び１２ミクロンの同多孔質ポリカーボネート膜は、「Ｉｓｏｐｏｒｅ」の商標名でＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓより入手しうる。同多孔質膜の他の入手先は、ｔｈｅ Ｗｈａｔｍａｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ（例えばポリカーボネートトラックエッチング膜の「Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅ」及び「Ｃｙｃｌｏｐｏｒｅ」ライン）及びｔｈｅ Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｃｏｍｐａｎｙ ｏｆ Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ（例えばポリエチレンテレフタレートベースのトラックエッチング膜の「ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ」ライン）を含むが、これらに限定されない。

本発明の利点は光透過性又は半透明多孔質膜を使用するときにより一層明白であるが、いわゆる「黒」膜（例えばｔｈｅ Ｂｅｃｋｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｃｏｍｐａｎｙから入手可能な「Ｆｌｕｏｒｏｂｌｏｋ」膜）も使用できる。（１９９５年２月３日にＲ．Ｔｃｈａｏに発行された米国特許第５，６０１，９９７号明細書も参照のこと）。そのような膜は、既に望ましくないバックグラウンドシグナルノイズを阻止するように設計されているが、それでも黒膜細孔を通して光漏出が起こりうる。本発明の方法の使用は、例えばそのような光漏出の検出能又は発生を取り除く又は低減することによって光走査データを改善することができる。

同多孔質膜は、例えば既知の「トラックエッチング」法によって形成することができる。そのような方法は一般に、固体膜に粒子又はエネルギーによる衝撃を加えて、膜を通過した損傷物質の軌道（トラック）を形成することを含む。次のその膜を、損傷トラックを選択的に食刻（エッチング）する化学物質に供して、膜を貫通する穴を創造する。貫通穴の直径は、エッチング剤が膜上に存在する時間によって制御できる。このようにして、すべてが所望最大孔径に等しいか又はそれより小さい孔を有する膜が提供されうる。トラックエッチング膜を形成するための工程の例は、１９６７年２月７日にＰ．Ｂ．Ｐｒｉｃｅらに発行された米国特許第３，３０３，０８５号明細書；１９７２年５月９日にＲ．Ｗ．Ｃａｐｕｔｉらに発行された米国特許第３，６６２，１７８号明細書；１９７３年１月３０日にＲ．Ｌ．Ｆｌｅｉｓｃｈｅｒらに発行された米国特許第３，７１３，９２１号明細書；１９７４年４月９日にＲ．Ｌ．Ｆｌｅｉｓｃｈｅｒらに発行された米国特許第３，８０２，９７２号明細書；及び１９７４年１２月３日にＣ．Ｐ．Ｂｅａｎに発行された米国特許第３，８５２，１３４号明細書に開示されている。

前記多孔質膜を組み込み、本発明の方法を実施するのに適した典型的プラットフォームは、図３及び４に示すように、入れ子式液体容器１２及び１４の対３２を含む。頭部と底部の液体容器１２及び１４は、適切に組み合わせるか又は対合させる（すなわち「入れ子にする」）とき、その間の多孔質膜１６で上部区域２２と下部区域２４が形成されるように構成されている。本発明の方法を実施するとき、多孔質膜１６の「出発」表面は、典型的には（常にではないが）上部区域２４に面し、「行き先」表面は下部区域２４に面する。

本発明の実施は入れ子式液体容器３２の構造形状に関して限定されず、その大きさ、寸法、構造及び形状は実質的に変化させうる。しかし、そのすべての実施態様において、前記容器は、選択した電気光学的読み取り装置から多孔質膜の少なくとも１つの表面への光の伝送を可能にするように構成されうる。それ故、例えば、選択した電気光学的読み取り装置が「底部読み取り」式である場合は、底部液体容器１４の底部壁（すなわち床部分）は適切且つ実質的に光透過性でなければならない。

所望する場合は、頭部及び底部液体容器１２及び１４のいずれか又は両方の壁を付加的な光学機能性、例えば側方光反射及び散乱を最小化する被覆又は光吸収側壁の提供、あるいは組み込み光学要素（例えば凹面又は凸面レンズ、照準器、拡散板、偏光子、フィルタ又は回折器）としての底部液体容器の底壁の形状を提供するように構成することができる。

図３及び４に例示するように、頭部と底部の液体容器１２及び１４を「入れ子にする」方法も変化させうる。例えば、図３では、頭部液体容器１２は、底部液体容器１４の直径を越えてのび、それによって頭部液体容器１２を底部液体容器１４の中につるした状態にする環状フランジ又は縁又はヘリ１３を利用して、底部液体容器１４の中に入れ子されており、基本的に底部液体容器の床の上方で浮いた状態になっている。これに対し、図４では、頭部液体容器１２は、前記容器１２を直接底部液体容器１４の床上に位置づけることを可能にする複数の支柱又は脚１５を備える。

多孔質膜１６は、図３及び４では頭部液体容器１２の構成成分として組み込まれて示されているが、そのような組込みは必ずしもすべての場合に本発明の基本的必要条件であるわけではない。一部の適用では、本発明の方法は、多孔質膜が頭部液体容器又は底部液体容器のいずれかに組み込まれているか、又はどちらにも組み込まれていない入れ子式液体容器を使用して実施できる。後者に関しては、多孔質膜は、例えば入れ子式液体容器プラットフォームの製造の間だけ、あるいは実施者が本発明の方法を実施する間又はその直前だけ、頭部及び底部液体容器の上部区域と下部区域の間にはさまれる、最初は独立又は別個の成分として提供することができる。

本発明は一対の入れ子式液体容器を使用して実施できるが、本発明の主要な利点は自動ロボット操作に適合させやすいことである。それ故、好ましい実施様式では、マルチウエルアレイを使用する。

マルチウエルアレイ３０の代表的な例を図５に示す。図に示すように、マルチウエルアレイ３０はいくつかの入れ子対の液体容器を含む。より特定するとマルチウエルアレイは上方プレート３４と下方プレート３６を含み、上方プレートは複数の頭部液体容器２２ａ、２２ｂ及び２２ｃを含み、下方プレートは対応する複数の底部液体容器２４ａ、２４ｂ及び２４ｃを含み、及び多孔質膜１６は頭部容器と底部容器の間に配置されている。代替実施態様（図示せず）では、複数の個別（すなわち別々の）頭部液体容器（図３及び４に例示するような）が、下方プレート上に固定して配置された底部液体容器のアレイ内に入れ子される。

例えば２つのプレート３４と３６をかみ合わせてアッセイを開始した後、底部液体容器２４ａ、２４ｂ及び２４ｃに入った液体へのアクセスを提供するために、頭部液体容器２２ａ、２２ｂ及び２２ｃの外側であるが、まだそれぞれ底部液体容器２４ａ、２４ｂ及び２４ｃの範囲内にある領域で、対応する複数の開口部３８ａ、３８ｂ及び３８ｃが上方プレートを通して提供される。そのような開口部を有するマルチウエルアレイ３０は、例えば底部読み取り式電気光学的読み取り装置による移動細胞群の検出能を選択的に高めるために、本発明に従って、光増強液を底部液体容器に添加するとき、特に好ましい。そのような液体アクセス開口部がなければ、そのような工程を可能にするためにはプレート３４と３６の解体分離が必要であると考えられ、それは、不可能ではないが、時間がかかり、破壊の潜在的可能性がある。

マルチウエルアレイの製造、構造及び有用な代替実施態様に関するさらなる詳細は、例えば以下の特許文献などの広く入手可能な公表学術文献に見出されるか又はそれらから推論することができる：１９９４年４月１２日にＲ．Ｈ．Ｇｏｏｄｗｉｎ，Ｊｒ．に発行された米国特許第５，３０２，５１５号明細書；１９９１年７月２２日にＤ．Ｒｏｏｔらに発行された米国特許第５，６５０，３２３号明細書；１９９１年９月１０日にＲ．Ｍａｎｎｓに発行された米国特許第５，０４７，２１５号明細書；１９９１年７月３０日にＪ．Ｃ．Ｗａｎｎｌａｎｄに発行された米国特許第５，０３５，８６６号明細書；１９９１年６月２５日にＧ．Ｌｙｍａｎらに発行された米国特許第５，０２６，６４９号明細書；及び１９９１年４月１３日にＭ．Ｊ．Ｓａｒｒａｓｉｎに発行された米国特許第５，００９，７８０号明細書。

細胞学的トランスウエルアッセイのために特に設計された市販のマルチウエルアレイにおける入れ子式液体容器（すなわち「穴（ウエル）」）の数は、最も一般的には６、２４、９６及び３８４である。本発明の実施においては、２４穴及び９６穴アレイが現在のところ好ましい。

細胞群において対象とする光学特性を検出することができる電気光学的読み取り装置は実質的に異なりうる。それに関わりなく、本発明に従えば、そのような装置はすべて、少なくとも光伝送器４２と光受容体４４を含む。光伝送器５２は、直接又は非線形光路に沿って標的細胞群に向かう所定波長範囲内の光を伝送する。細胞に衝突したとき、選択実施様式に依存して、光は細胞に反射して離れるか、あるいは蛍光、発光又は他の光学検出可能な光転換を引き起こすか又はそれらを導く。いずれの場合も、細胞から離れて伝わる光は光受容体４４に衝突する。光受容体４４はその目的のために適切に位置づけられており、前記の光を電子データへと変換するための手段を備える。

電気光学的読み取り装置はまた、光が標的細胞、光伝送器５２及び光受容体４４の間を伝わるときに横切る光路を規定する付加的な光学成分も含む。そのような付加的な光学成分は、レンズ、照準器、回折器、偏光子、リターダ、フィルタ、プリズム及び反射板を含みうる。これらや同様の光学成分の設置は、電気光学的読み取り装置が、例えば、「底部読み取り式」、「頭部読み取り式」又はその両方であるかどうかを決定する。

電気光学的読み取り装置はまた、あらかじめ選択したアッセイプラットフォーム（例えば９６穴マルチウエルアレイ）を受け入れて保持し、光走査の実施の前及び後に前記アッセイプラットフォームを電気光学的読み取り装置の内部の操作位置に出し入れするように移動させることができる自動試料トレイをさらに含みうる。

電子制御システム（又はその副成分）は、電気光学的読み取り装置に組み込むか及び／又は周辺機器として連結することができる。そのような電子制御システムの一部の機能は、電気光学的読み取り装置の他の成分（例えば光受容体、光伝送器及び試料トレイ）の操作を制御すること及び調整すること；及び電子データ（例えば光受容体４４によって作成された電子データ）を記録すること、獲得すること及び／又は処理することを含む。電子制御システムは、例えば、ＣＰＵ、情報ディスプレイ、入力装置、出力装置、電子記憶、ケーブル、インストールされたソフトウエア、データ保存装置、プリント回路基板、プリント配線基板、周辺機器インタフェースカード等を含むことができる。

好ましい電気光学的読み取り装置は、自動マルチウエルプレート対応分光蛍光光度計である。市販されている変異形のそのようなマルチウエルプレート読み取り装置は、以下のものを含むが、これらに限定されない：Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ９４５４７から入手可能な「Ｆｌｕｏｒｏｍａｒｋ」商標の読み取り装置（２５０−２９０ｎｍの波長範囲を有する頭部及び底部読み取り装置）；ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ，Ｏｆｆｅｎｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙから入手可能な「ＮＯＶＯｓｔａｒ」商標の読み取り装置（２５０−７４０ｎｍの波長範囲を有する底部読み取り装置）；Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ ０２４５１より入手可能な「Ｆｌｕｏｒｏｓｃａｎ Ａｓｃｅｎｔ」商標の読み取り装置（３２０−８００ｎｍの波長範囲を有する頭部及び底部読み取り装置）；ＭｉｒａＢｉｏ，Ｉｎｃ．，Ａｌａｍｅｄａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ９４５０２より入手可能な「Ｈｉｔａｃｈｉ ＦＭＢＩＯ ＩＩ Ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｃｅ」商標の読み取り装置（５０−７００ｎｍの波長範囲を有する底部読み取り装置）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ９４０８９より入手可能な「ＦＬＩＰＲ」商標の読み取り装置（４８８−５１４ｎｍの波長範囲を有する底部読み取り装置）；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ ０８８５４より入手可能な「ＦｌｕｏｒＩｍａｇｅｒ」商標の読み取り装置（４３０−６３５ｎｍの波長範囲を有する底部読み取り装置）；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ ０２４８１より入手可能な「Ｆｌｕｏｒｏｃｏｕｎｔ」商標の読み取り装置（２６０−６７０ｎｍの波長範囲を有する頭部及び底部読み取り装置）；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ９４４０４より入手可能な「Ｃｙｔｏｆｌｕｏｒ」商標の読み取り装置（３２０−７００ｎｍの波長範囲を有する頭部及び底部読み取り装置）；及びＴｅｃａｎ Ｇｒｏｕｐ，Ｌｔｄ．，Ｍａｅｎｎｅｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄより入手可能な「Ｐｏｌａｒｉｏｎ」商標の読み取り装置（２３０−７００ｎｍの波長範囲を有する頭部読み取り装置）。

蛍光及び発光に基づく電気光学的読み取り装置に代るものとして、例えば、標的群内の細胞を自動的に顕微鏡計数することができる装置も利用又は構築しうる。これに関して、特定標的細胞群の光学的に分別された細胞から反射された光は、適切に装備された顕微鏡を通して「機械観察された（ｍａｃｈｉｎｅ−ｖｉｅｗｅｄ）」前記細胞の画像を提供する。そのような読み取り装置にインストールされた又はそのような装置のための画像処理ソフトウエアが、次に、既知の画像解析アルゴリズムを用いて細胞を「計数する」。そのようなシステムの特定実施態様では、光学分別細胞は、例えばＯｌｙｍｐｕｓ ＢＨ−２顕微鏡に搭載されたＦｕｊｉ Ｆｉｎｅｐｉｘ ｓ１ Ｐｒｏデジタルカメラを用いて画像化され、Ｏｐｔｉｍａｓバージョン６．１ソフトウエアを用いて計数される。

ある種の細胞学的適用のための本発明の方法の使用を、一部にはその成分の一部を標準化することによって、容易にするために、本発明は、前記適用の実施に適するあらかじめ選択された適合性成分を含むキットを提供する。前記キットは、デザインによって、あらかじめ選択された本発明の方法の実施様式を対象とするが、あらかじめ選択された適合性成分を含むことは、使用の容易さ、結果の一貫性及び比較的低い使用者コストを促進する。

１つの実施態様では、走化性アッセイキットは、一部の規定された蛍光ベースの走化性適用の実施のために特に設計されており、ある移動細胞群を同時に定量するために底部読み取り式電気光学的読み取り装置を使用する。そのようなキットは、共通の包装内に納められた以下の成分を含む：各々の対が、入れ子にしたとき、半透明の同多孔質膜によって分けられた上流区域と下流区域を有する、入れ子式又は入れ子可能な液体容器の対を含むマルチウエルアレイ；及びカーボンブラックとグリセロールを含む水性光減衰溶液。

前記キットの規定走化性アッセイ適用は、前記キットの「共通包装」に貼付又は添付されたラベル及び／又は指示書において提供されうる。前記ラベル又は指示書上で又はそれによって提供できる他の付加的な情報は、規定の底部読み取り式電気光学的読み取り装置及び一部の規定装置（及び／又は環境）の設定及び／又はそのためのパラメータの一覧を含む。

光減衰溶液は、中でも特に、キットの同多孔質膜の特性、特にその厚さ、平均孔径及び孔の頻度に合わせて特異的に構成される。光減衰溶液は、それ故、少なくともその添加に続くマルチウエルアレイの電気光学的「走査」に必要な期間、同多孔質膜を通して実質的に流動することができないように構成される。そのような機能のために、光減衰溶液中のカーボンブラックの濃度は少なくとも約０．０５％（重量／容積）であり、グリセロールの濃度は約５％から約７５％（重量／容積）の範囲内である。

もう１つの実施態様では、走化性アッセイキットは、例えば、異なる所定照射バンド幅の放射線への暴露時に所定蛍光バンド幅の放射線を放射する化合物、例えばカルセイン、カルセイン前駆体又はカルセイン誘導体を含む細胞標識溶液をさらに含みうる。他の成分を走化性アッセイキットに含めることもできる。しかし、マルチウエルアレイ及び光減衰溶液と同様に、細胞標識溶液及び他の成分も、少なくとも、前記規定走化性アッセイ適用の少なくとも１つの実施のために含まれる他のすべての成分と妥当な程度の適合性で作製されるべきである。

特定実施態様を参照して本発明を説明したが、本発明はここで開示する及び／又は図面に示す特定構造及び様式のいずれかに限定されず、特許請求の範囲内のいかなる修正及び等価物も包含することは了解される。

１つの表面１６_Ｓからもう１つの表面１６_Ｄへの、多孔質膜１６を横切る細胞Ｃの走化性移動を促進し、分別し、及び定量するための方法を図式的に示す図である。 １つの表面１６_Ｓからもう１つの表面１６_Ｄへの、多孔質膜１６を横切る細胞Ｃの走化性移動を促進し、分別し、及び定量するための方法を図式的に示す図である。 １つの表面１６_Ｓからもう１つの表面１６_Ｄへの、多孔質膜１６を横切る細胞Ｃの走化性移動を促進し、分別し、及び定量するための方法を図式的に示す図である。 １つの表面１６_Ｓからもう１つの表面１６_Ｄへの、多孔質膜１６を横切る細胞Ｃの走化性移動を促進し、分別し、及び定量するための方法を図式的に示す図である。 図１ａに示す方法を比較上より詳しく図式的に示す図である。 図１ｂに示す方法を比較上より詳しく図式的に示す図である。 図１ｃに示す方法を比較上より詳しく図式的に示す図である。 図１ｄに示す方法を比較上より詳しく図式的に示す図である。 図３は、本発明の１つの実施態様に従って構築された、図１ａから図１ｄに示す方法を実施するために有用な一対の入れ子式液体容器１２と１４を図式的に示す図である。 図４は、本発明の別の実施態様に従って構築された、図１ａから図１ｄに示す方法を実施するために有用な一対の入れ子式液体容器１２と１４を図式的に示す図である。 図５は、本発明の１つの実施態様に従って構築された、図１ａから図１ｄに示す方法を実施するために有用なマルチウエルアレイ３０を図式的に示す図である。

符号の説明

Ａ、Ｂ 光走査
Ｃ 細胞
１２、２２ａ、２２ｂ、２２ｃ 頭部液体容器
１３ 環状フランジ又は縁又はヘリ
１４、２４ａ、２４ｂ、２４ｃ 底部液体容器
１４_Ｂ 底部壁
１５ 支柱又は脚
１６ 多孔質膜
１６_Ｄ 行き先表面
１６_Ｓ 出発表面
１８ 細孔
２２ 上部区域
２４ 下部区域
３０ マルチウエルアレイ
３２ 入れ子式液体容器の対
３４ 上方プレート
３６ 下方プレート
３８ａ、３８ｂ、３８ｃ 開口部
４２ 光伝送器
４４ 光受容体

Claims (17)

1. （ａ）「出発表面（ｓｔａｒｔｉｎｇ ｓｕｒｆａｃｅ）」と「行き先表面（ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ ｓｕｒｆａｃｅ）」を有する多孔質膜を提供すること；
   （ｂ）前記多孔質膜の出発表面に細胞を付着させ、前記多孔質膜を通る前記出発表面から前記行き先表面への前記細胞の一部の移動を促進すること；
   （ｃ）前記出発表面に残存する細胞の部分又は前記行き先表面に移動した細胞の部分のいずれかに光学的分別溶液を加えて、前記処理部分を電気光学的読み取り装置によって大なり小なり検出可能にすること；及び
   （ｄ）前記電気光学的読み取り装置を使用して、前記出発表面に残存する又は前記行き先表面に移動した又はその両方の前記細胞の光学特性を読み取ること
   の工程をこの順序で含む、細胞の光学特性を検出することができる電気光学的読み取り装置を使用して細胞を分析するための方法。
2. 前記多孔質膜の出発表面上の工程（ｂ）にある細胞を、異なる所定暴露バンド幅の放射線への暴露時に所定蛍光バンド幅の放射線を放射する化合物で標識する、請求項１に記載の方法。
3. 前記化合物がカルセイン、カルセイン前駆体又はカルセイン誘導体である、請求項２に記載の方法。
4. 少なくとも前記所定蛍光バンド幅内の光を吸収することができる着色剤を含み、及び少なくとも工程（ｃ）及び（ｄ）の間前記多孔質膜を通って実質的に流動することができない、前記光学的分別溶液を、前記非移動細胞と前記出発表面に適用することによって、前記出発表面に残存する細胞の部分をより検出しにくくする、請求項２に記載の方法。
5. 前記光学的分別溶液がグリセロール中の前記着色剤の懸濁液を含み、及び前記着色剤がカーボンブラックである、請求項４に記載の方法。
6. 工程（ｄ）の電気光学的読み取り装置を、前記所定暴露バンド幅の照射による前記細胞の移動部分の暴露後の前記所定蛍光バンド幅内の放射を検出するために利用し、前記暴露が前記細胞の移動部分への入射前に前記多孔質膜を通過しない、請求項５に記載の方法。
7. 前記多孔質膜が同多孔質ポリカーボネート膜である、請求項１に記載の方法。
8. 前記多孔質膜が入れ子になった頭部液体容器と底部液体容器の間に存在し、前記入れ子式液体容器が前記多孔質膜によって上部区域と下部区域に分けられている、請求項１に記載の方法。
9. 前記方法を、前記入れ子式液体容器のアレイを含むマルチウエルアレイを使用して実施する、請求項８に記載の方法。
10. 前記マルチウエルアレイが２４個の前記入れ子式液体容器を含む、請求項９に記載の方法。
11. 前記多孔質膜を通る前記出発表面から前記行き先表面への前記細胞の一部の工程（ｂ）での移動が、化学誘引物質含有溶液を前記下部区域内に入れることによって促進される、請求項８に記載の方法。
12. 少なくとも前記所定蛍光バンド幅内の光を吸収することができる着色剤を含み、及び少なくとも工程（ｃ）及び（ｄ）の間前記多孔質膜を通って実質的に流動することができない、前記光学的分別溶液を、前記上部区域に添加することによって、前記出発表面に残存する細胞の部分を電気光学的読み取り装置によってより検出しにくくする、請求項１１に記載の方法。
13. 実質的に約１％のカーボンブラックと５０％グリセロールから成る水性マスキング溶液。
14. 共通の包装内に納められた、
    各々の対が、入れ子にしたとき、半透明の同多孔質膜によって分けられた上部区域と下部区域を有する、入れ子式又は入れ子可能な液体容器の対を含むマルチウエルアレイ；及び
    カーボンブラックとグリセロールを含む水溶液
    を含む、細胞を分析するのに適した走化性アッセイキット。
15. カーボンブラックの濃度が少なくとも約０．０５％（重量／容積）であり、グリセロールの濃度が約５％から約７５％（重量／容積）の範囲内である、請求項１４に記載の走化性アッセイキット。
16. 異なる所定暴露バンド幅の放射線に暴露したとき所定蛍光バンド幅の放射線を放射する化合物を含む細胞標識溶液
    をさらに含む、請求項１４に記載の走化性アッセイキット。
17. 前記化合物がカルセイン、カルセイン前駆体又はカルセイン誘導体である、請求項１６に記載の走化性アッセイキット。

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