JP2005172532A - 測定装置及び測定方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】血液を検体とし、血球分離可能部を有し、血液中の特定成分について、診療の現場で迅速、簡便、安価に精度良く測定ができる試験用具に対して、反応制御、検出、演算によって正確に適時測定結果を提供可能な小型の測定装置及びそれを用いる測定方法を提供する。
【解決手段】血液中の特定成分に作用する酵素を含有する試験片と血球分離可能部が毛細管で連結された試験用具を収納してなる測定装置に反応制御、検出、演算を行わせることによって迅速、簡便、安価に精度良く測定行う。
【選択図】 図１
【解決手段】血液中の特定成分に作用する酵素を含有する試験片と血球分離可能部が毛細管で連結された試験用具を収納してなる測定装置に反応制御、検出、演算を行わせることによって迅速、簡便、安価に精度良く測定行う。
【選択図】 図１
Description
本発明は、血球分離可能な血液滴下部を有し、血液中の特定成分について、診療の現場で迅速、簡便、安価に精度良く測定ができる測定装置及び測定方法に関する。さらに、具体的には血液中の糖化アルブミンを、迅速、簡便、安価に精度良く測定できる測定装置及び測定方法に関する。
従来、血液中の成分を測定する場合、遠心分離等により、血漿、血清成分とした後、大型の自動分析装置を用いて測定する方法がよく用いられている。しかし、検体数が少ない中小病院、診療所のような施設では、自動分析装置の設置、利用は困難であり、測定にあたっては外部の検査施設への外注と言う形が多く取られていた。
診療の現場で使用できる試験片を用いた方法も普及してきているが、読み取りが目視で個人差が生じる、反応が室温下で一定に制御できないなどの問題があった。本発明者らが確認したところ、反応時間が長くなると試薬或いは検体が反応中に蒸発してしまう、また酵素反応を用いて蛋白質等の巨大分子を検出しようとした場合、室温では呈色に時間がかかる、或いはほとんど呈色しないといった問題が観察された。
従って、診療の現場で複雑な操作を必要とせず、迅速に信頼度の高い値が得られ、しかも小型で設置場所を選ばない測定装置が望まれていた。
診療の現場で使用できる試験片を用いた方法も普及してきているが、読み取りが目視で個人差が生じる、反応が室温下で一定に制御できないなどの問題があった。本発明者らが確認したところ、反応時間が長くなると試薬或いは検体が反応中に蒸発してしまう、また酵素反応を用いて蛋白質等の巨大分子を検出しようとした場合、室温では呈色に時間がかかる、或いはほとんど呈色しないといった問題が観察された。
従って、診療の現場で複雑な操作を必要とせず、迅速に信頼度の高い値が得られ、しかも小型で設置場所を選ばない測定装置が望まれていた。
本発明は、血液を検体とし、血球分離可能部を有し、血液中の特定成分について、診療の現場で迅速、簡便、安価に精度良く測定ができる試験用具を用いて、反応制御、検出、演算によって正確に適時測定結果を提供可能な小型の測定装置及びそれを用いる測定方法を提供することにある。
血球を分離する方法として、遠心分離操作以外では、血球分離膜を用いる方法がある。一般的な血球分離膜は、加圧あるいは減圧など外部から何らかの力を加えないと血漿が膜を通過しない。本発明者らの検討によると、膜に全血を載せただけでは全く血漿成分が得られないことが分かった。吸引装置を用いるなどすれば膜を通過するのは明らかであるが、これは装置の大型化、複雑化を招き、診療の現場で簡便に扱える装置にすることは困難である。
更に本発明者らは、酵素／試薬を保持した試験片により、血漿中の特定成分を検出でき、試験片上の酵素反応を加熱冷却により制御することにより、血液中の低分子だけでなく高分子成分に対しても容易に酵素反応をなしえることを見出した。
また、更に試験片上をカバーすることにより検体や試薬の蒸発、吸湿を防ぐこと、試験片の反応物は反射光の測定により簡便に行えることを見出し、これらの知見に基づいて本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下の構成を有する。
（１）血液中の特定成分を測定可能な試験片と血球分離可能部が毛細管で連結された試験用具を収納してなる測定装置であって、試験片上の反応を温度制御する温度制御部、試験片上の反応物を検出する検出部及び検出結果にもとづき特定成分の濃度を計算する演算部を有することを特徴とする測定装置。
（２）試験片が、血液中の特定成分と反応する酵素を含むことを特徴とする上記（１）に記載の測定装置。
（３）温度制御部は、試験片上の反応の温度を試験片毎に独立して制御することを特徴とする上記（１）又は（２）に記載の測定装置。
（４）検出部が前記試験片毎に独立した検出部であることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれかに記載の測定装置。
（５）試験片の上面に透明のカバーが配置され、かつ、試験片上の反応物を検出する検出部がカバー側に配置されていることを特徴とする上記（１）〜（４）のいずれかに記載の測定装置。
（６）試験用具が遮蔽された空間に収納されていることを特徴とする上記（１）〜（５）のいずれかに記載の測定装置。
（７）検出部は光源および光源から照射された光の反射光を検出する手段とからなることを特徴とする上記（１）〜（６）のいずれかに記載の測定装置。
（８）血液中の特定成分の濃度の計算を行う演算部が、下記のステップを行う上記（１）〜（７）のいずれかに記載の測定装置。
１）反応物の反射光強度を検出するステップ
２）検出した反射光強度を血液中の成分の濃度に対して関連付けるステップ
３）得られた濃度から求めたい成分の割合を計算するステップ
（９）前記特定成分が糖化アルブミンである上記（１）〜（８）のいずれかに記載の測定装置。
（１０）以下の工程を含む血液中の特定成分の測定方法。
１）血液中の特定成分を測定可能な試験片と血球分離可能部が毛細管で連結された試験用具に血液を滴下して、測定用具を測定装置内に収納し、温度制御された条件で反応物を試験用具上に形成する工程
２）反応物を試験片個々に配置した検出部で検出する工程
３）検出した反応物を血液中の成分の濃度に対して関連付け、計算する工程
更に本発明者らは、酵素／試薬を保持した試験片により、血漿中の特定成分を検出でき、試験片上の酵素反応を加熱冷却により制御することにより、血液中の低分子だけでなく高分子成分に対しても容易に酵素反応をなしえることを見出した。
また、更に試験片上をカバーすることにより検体や試薬の蒸発、吸湿を防ぐこと、試験片の反応物は反射光の測定により簡便に行えることを見出し、これらの知見に基づいて本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下の構成を有する。
（１）血液中の特定成分を測定可能な試験片と血球分離可能部が毛細管で連結された試験用具を収納してなる測定装置であって、試験片上の反応を温度制御する温度制御部、試験片上の反応物を検出する検出部及び検出結果にもとづき特定成分の濃度を計算する演算部を有することを特徴とする測定装置。
（２）試験片が、血液中の特定成分と反応する酵素を含むことを特徴とする上記（１）に記載の測定装置。
（３）温度制御部は、試験片上の反応の温度を試験片毎に独立して制御することを特徴とする上記（１）又は（２）に記載の測定装置。
（４）検出部が前記試験片毎に独立した検出部であることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれかに記載の測定装置。
（５）試験片の上面に透明のカバーが配置され、かつ、試験片上の反応物を検出する検出部がカバー側に配置されていることを特徴とする上記（１）〜（４）のいずれかに記載の測定装置。
（６）試験用具が遮蔽された空間に収納されていることを特徴とする上記（１）〜（５）のいずれかに記載の測定装置。
（７）検出部は光源および光源から照射された光の反射光を検出する手段とからなることを特徴とする上記（１）〜（６）のいずれかに記載の測定装置。
（８）血液中の特定成分の濃度の計算を行う演算部が、下記のステップを行う上記（１）〜（７）のいずれかに記載の測定装置。
１）反応物の反射光強度を検出するステップ
２）検出した反射光強度を血液中の成分の濃度に対して関連付けるステップ
３）得られた濃度から求めたい成分の割合を計算するステップ
（９）前記特定成分が糖化アルブミンである上記（１）〜（８）のいずれかに記載の測定装置。
（１０）以下の工程を含む血液中の特定成分の測定方法。
１）血液中の特定成分を測定可能な試験片と血球分離可能部が毛細管で連結された試験用具に血液を滴下して、測定用具を測定装置内に収納し、温度制御された条件で反応物を試験用具上に形成する工程
２）反応物を試験片個々に配置した検出部で検出する工程
３）検出した反応物を血液中の成分の濃度に対して関連付け、計算する工程
本発明の測定装置及び測定方法を用いることにより、診療の現場で、全血を滴下部に滴下するだけで簡便に血漿を分離することができ、血漿中の特定成分、特に糖化アルブミンを迅速、簡便、安価に精度良く測定することが可能になる。
以下、この発明の構成及び好ましい形態について更に詳しく説明する。
＜試験用具の構成材料＞
本発明に用いることができる血球分離可能部としては、血球分離膜を用いることができる。血球分離膜の材質は、特に限定されないが、例えばセルロース、ポリエーテルスルホン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ナイロン、ポリスルホン、ポリアミドなどのポリマー素材やガラス繊維などが挙げられる。簡便には一般に市販されているポリエチレン製膜やポリスルホン製膜などが使用可能である。血液が血球分離膜を通過することで、血液から血球が分離されることになる。
＜試験用具の構成材料＞
本発明に用いることができる血球分離可能部としては、血球分離膜を用いることができる。血球分離膜の材質は、特に限定されないが、例えばセルロース、ポリエーテルスルホン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ナイロン、ポリスルホン、ポリアミドなどのポリマー素材やガラス繊維などが挙げられる。簡便には一般に市販されているポリエチレン製膜やポリスルホン製膜などが使用可能である。血液が血球分離膜を通過することで、血液から血球が分離されることになる。
本発明に使用しうる試験片としては、シート状の物であればどの様な試験片を用いても良いが、例えば紙、不織布、セルロース誘導体，ガラスファイバー等を主成分とする濾紙状体等を用いることができる。また、その性質としては、吸水性を有し、試薬、酵素類を保持できる物であれば何れの物を用いても良い。試験片の厚みとしては、０．１ｍｍから２ｍｍ程度であれば良く、０．２ｍｍ〜１ｍｍ程度がより好ましい。試験片の面積としては、１試料を測定するためには０．０１ｃｍ２〜２ｃｍ２程度の面積があれば良く、０．０５ｃｍ２〜１ｃｍ２がより好ましい。
また、支持体の材料としては、公知のものでもよいが、具体的には、
ポリスチレン，ポリエステル，ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロースなどの高分子プラスチックを主成分とするフィルム，シート、板状成形品等が好ましく、光学的には反応測定時に支持体を反射層として用いるため、光非透過性のもの、例えば白色ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）等が望ましい。
ポリスチレン，ポリエステル，ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロースなどの高分子プラスチックを主成分とするフィルム，シート、板状成形品等が好ましく、光学的には反応測定時に支持体を反射層として用いるため、光非透過性のもの、例えば白色ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）等が望ましい。
また、カバーの材料も公知のものでもよいが、具体的には、ポリエステル，酢酸セルロース，ポリカーボネート，ポリエチレンテレフタレート、ポリスチレンなどを主成分とするフィルム又はシート状の物が好ましく、光学的には測定用の照射光に対して妨害の少ない光透過性の物が好ましい。例えば透明ＰＥＴフィルムなどが好適に用いられる。
＜試験片の作製及び用いる試薬＞
試験片へ試薬及び酵素類を保持させるには、必要な組成から成る液状の試薬を作成し、その液に試験片を、例えば、室温好ましくは冷蔵にて、０．１分〜１日、好ましくは１分から８時間程度浸し、乾燥させればよい。
乾燥方法は、常圧あるいは減圧条件で、温度は、例えば４℃〜６０℃程度で１分〜２日程度行えばよいが、好ましくは、酵素類が失活しにくい４℃〜３０程度が好ましい。更に好ましくは、１３〜１７℃の低温、１０％以下の低湿度の冷風を当てることにより、より効率よく安全に試験紙を製造することができ好ましい。
試験片へ試薬及び酵素類を保持させるには、必要な組成から成る液状の試薬を作成し、その液に試験片を、例えば、室温好ましくは冷蔵にて、０．１分〜１日、好ましくは１分から８時間程度浸し、乾燥させればよい。
乾燥方法は、常圧あるいは減圧条件で、温度は、例えば４℃〜６０℃程度で１分〜２日程度行えばよいが、好ましくは、酵素類が失活しにくい４℃〜３０程度が好ましい。更に好ましくは、１３〜１７℃の低温、１０％以下の低湿度の冷風を当てることにより、より効率よく安全に試験紙を製造することができ好ましい。
本発明に用いることができるプロテアーゼはアルブミンに作用して糖化アミノ酸若しくは糖化アミノ酸を含むペプチドを切り出すプロテアーゼであればいかなるプロテアーゼを用いても良い。また、酵素は目的とする活性が発現すれば精製物であっても非精製物であっても良い。
本発明に使用し得るプロテアーゼの好ましい例としては、例えば、トリプシン(Tripsin)、キモトリプシン(Chymotripsin)等の動物由来のプロテアーゼ、パパイン(Papain)、ブロメライン(Bromelain)等の植物由来のプロテアーゼ及び微生物由来のプロテアーゼ等が挙げられる。
プロテアーゼの活性測定法は、カゼインフォリン法を用いた。活性の定義は、１分間、３７℃において１μｇのチロシンに相当する発色を１Ｕとした。
また、本発明におけるプロテアーゼの使用に関しては、プロテアーゼを単独で使用することはもちろんであるが、他のエンドプロテアーゼ、または他のエキソプロテアーゼを同時に使用しても良い。
また、本発明におけるプロテアーゼの使用に関しては、プロテアーゼを単独で使用することはもちろんであるが、他のエンドプロテアーゼ、または他のエキソプロテアーゼを同時に使用しても良い。
本発明に使用しうる糖化アミノ酸に作用する酵素としては、糖化アミノ酸のケトアミン構造を認識して作用するデヒドロゲナーゼ、キナーゼ、オキシダーゼ等があげられるが、もっとも安価に大量に入手できるオキシダーゼが好ましい。
プロテアーゼ及び糖化アミノ酸に作用する酵素を含む試薬を試験片に保持させる場合のこれらの酵素を含む試薬液中の各酵素の濃度はそれぞれ１２５Ｕ／ｍｌ以上、０．２５ｍＵ以上の濃度が好ましい。試験片に試薬を保持させるには、前記濃度の試薬１ｍｌに５ｃｍ×５ｃｍの試験片を浸す程度で良く、この場合全ての試薬が吸収されたとすると試験片１ｃｍ２あたりのプロテアーゼ含有量は５Ｕ／ｍｌ以上、糖化アミノ酸に作用する酵素の量は１０ｍＵ以上となる。また、プロテアーゼの濃度は、試験片１ｃｍ２あたりのプロテアーゼ含有量が５Ｕ／ｍｌ以上であればいくらでも良いが、バッククラウンドの上昇やコストを考えると、試験片１ｃｍ２あたり１０ＫＵ以下が好ましい。
プロテアーゼ及び糖化アミノ酸に作用する酵素を含む液状試薬のｐＨは、使用する酵素の至適ｐＨを考慮し、反応が効率よく進行するようにｐＨを選択すればよい。
また、プロテアーゼ及び糖化アミノ酸に作用する酵素を含有する試験片には、反応を色に変える発色系の試薬を同時に保持させておくと検出がしやすい。
タンパク質発色試薬としては公知のタンパク質を測定する方法を用いた試薬であれば如何なるタンパク質発色試薬を用いても良いが、例えばタンパク質がアルブミンの場合にはブロモクレゾールグリーン（ＢＣＧ）、ブロモクレゾールパープル（ＢＣＰ）、ブロモフェノールブルー、等のアルブミン特異的な色素を用いるかアルブミン抗体を用いた発色試薬を用いればよい。
＜試験用具の作製＞
本発明の血液中の特定成分を測定可能な試験片、及び該試験片と毛細管で連結した血球分離可能部を有することを特徴とする試験用具としては、例えば血球分離可能な検体滴下部、該滴下部から一定量の試料を吸引しうる毛細管と通気孔、血液中の特定成分と反応する試薬類を含有する試験片、試験片からの試薬類の蒸発を防止し、かつ光学検出の妨害をしない透明なカバー、更に光学反射層を試験片下部に配置し光学測定の効率を上げる構成とした試験用具が好ましい。
本発明の血液中の特定成分を測定可能な試験片、及び該試験片と毛細管で連結した血球分離可能部を有することを特徴とする試験用具としては、例えば血球分離可能な検体滴下部、該滴下部から一定量の試料を吸引しうる毛細管と通気孔、血液中の特定成分と反応する試薬類を含有する試験片、試験片からの試薬類の蒸発を防止し、かつ光学検出の妨害をしない透明なカバー、更に光学反射層を試験片下部に配置し光学測定の効率を上げる構成とした試験用具が好ましい。
試験用具への毛細管の形成は公知の方法で行えば良いが、例えば厚さ０．０１ｍｍ〜１ｍｍ、幅０．５ｍｍ〜１０ｃｍ、長さ１ｍｍ〜１０ｃｍ程度のフィルムを３枚使用し、１枚のフィルムに１本の幅０．０１ｍｍ〜１ｃｍの溝を形成し、上下から溝の無いフィルムで挟むことにより毛細管を形成する方法などがある。フィルムは公知技術により張り合わせることができ、簡便には光学測定を妨害しない両面テープなどで容易に貼り合わせる事ができる。この時、上部のフィルムに直径０．０５ｍｍ〜８ｃｍの血液滴下孔、直径０．０５ｍｍ〜５ｍｍの円形の通気孔を開け、上部のフィルムと中部のフィルムの間には、血液滴下孔に対応する位置に血球分離膜を配置し、また、毛細管の溝の途中に試験片が配置される構造が望ましい。
より具体的な構成の１例を図２に示す。５は上部フィルムからなるカバー材であり、６は中部フィルムからなる中板、７は、下部のフィルムからなる支持体を兼ねた光学反射板である。カバー材５には、血液滴下孔１２が１箇所、試験片１と同数の通気孔３が設けられている。中板６には試験片の数に対応した溝が血液滴下孔に対応する位置から放射状に例えばこの例では４本形成されている。１は試験片であり、毛細管上で、血液滴下孔と通気孔との間の経路に位置している。中板６の溝、カバー材５、支持体を兼ねた光学反射板によって毛細管４を形成している。８はペルチェ素子で、９はこれを用いた温度制御装置である。１０は検出部である。
このように構成された試験用具において、血液の特定成分が試験片上で酵素と反応し検出されるまでの作用を説明する。測定対象である血液が血液滴下孔１２から血球分離膜２に滴下されると、毛細管の吸引力により、血液はその真下に配置された血球分離膜２を通過し、ここで血球が分離除去され、残りの成分だけが毛細管４の流れ方向に配置されている試験片１へと導かれる。そして、血液成分が試験片１に到達すると、そこで試験片上の酵素と反応し、反応物を生成する。反応生成物は、各試験片の上部に設けられた光学測定器により、測定が行われる。
上部フィルムには、毛細管の先端に対応する位置に通気孔３が設けられているため、試験片への液体の流れに先行して毛細管から通気が行われる。そして、この通気孔を試験片から所定の位置に配置することにより、試験片へ分配される液量を制御することが可能となる。すなわち、試験片から通気孔までの距離が短くすれば分配量は少なく、反対に試験片からの距離を遠くすれば分配量を多くすることができる。
試験片の上面には、試験片からの試薬類の蒸発を防止するためにカバー５を設けることが望ましい。また、そのカバーは、試験片上の反応物を光学測定する際に、測定の妨害をしないよう透明なカバーであることが望ましい。例えば透明ＰＥＴフィルムなどが好適に用いられる。
試験片と検体の組み合わせについて説明する。図２の構成は、主に１検体の血液について複数種類の試験片を用いて複数成分の測定が可能である。例えば、１つの血液に対して糖化アルブミンと反応する酵素を含む試験片、アルブミンと反応する試薬を含む試験片、糖化アミノ酸を含む試験片の３種類を試験用具にセットし、これらの３つを同時に測定し、測定結果から血液中の糖化アルブミンの割合を算出することができる。また、他の構成としては、例えば、血液分離可能部を複数設け、それぞれについて１成分、あるいは複数成分の測定をすることもできる。
＜検出手段＞
反応の検出は試薬の発色した試験片に対して光をあて、その反射光を検出することが最も簡便であるが、これ以外の方法を用いても良い。例えば照射する光源としてはＵＶランプやハロゲンランプ、タングステンランプ、発光ダイオード（ＬＥＤ）、レーザーなども使用することができるが、小型測定装置に組み込みやすく熱の発生も少ないＬＥＤの使用が好ましい。
光の照射角度は何れでも良いが、反射光の検出は検出面に対して４５°あるいは垂直が好ましい。検出はフォトダイオードや市販の積分球等を用いれば簡便に行う事ができる。
反応の検出は試薬の発色した試験片に対して光をあて、その反射光を検出することが最も簡便であるが、これ以外の方法を用いても良い。例えば照射する光源としてはＵＶランプやハロゲンランプ、タングステンランプ、発光ダイオード（ＬＥＤ）、レーザーなども使用することができるが、小型測定装置に組み込みやすく熱の発生も少ないＬＥＤの使用が好ましい。
光の照射角度は何れでも良いが、反射光の検出は検出面に対して４５°あるいは垂直が好ましい。検出はフォトダイオードや市販の積分球等を用いれば簡便に行う事ができる。
複数の試験片を検出する場合は、試験片を動かして１組の検出部で検出することも、検出部を試験片の数だけ準備することもいずれも可能である。ただし、最適波長が異なる場合や測定位置の制御などの観点から、また、本発明のような小型の測定装置の場合は、試験片ごとの独立した検出部を配置したほうが望ましい。
なお、光学検出は、試験片の上部にカバーを配置し、そのカバー側から行うこともできるが、試験片の下から行うこともできる。この場合、試験片の下には、光透過性のフィルターが支持体を兼ねて配置され、試験片の上には、光反射板がカバーを兼ねて配置される。後述する温度制御装置を設ける場合は、カバーの上部に設けることが望ましい。
更に、光学測定の効率を上げるために、試験片下部に光学反射層を配置した構成が好ましい。光学反射層としては、光非透過性のもの、例えば白色ＰＥＴ等が望ましい。
検出された反射光は、濃度が既知の糖化タンパク質の感度と比較することにより、糖化タンパク質濃度に換算すれば良い。一般的には、試験紙のロットにより感度は一定であるから、ロット毎に濃度が既知の糖化タンパク質濃度における感度をあらかじめ測定しておき、これらをもとに換算できるようにしておけば良い。
<温度制御手段＞
本発明の測定装置を用いて測定を行うには、試験用具の血液適下部に検体を滴下し、吸引された検体と試薬との反応による試験片の発色を光学的に測定すればよい。試験片は通常乾燥しているが、検体の水分により試薬成分が溶解し反応が自動的に進行する。
試験片を用いる反応の温度は通常室温であるが、酵素、特に高分子を基質とする酵素の場合は保温あるいは加熱機能を持たせ一定温度で反応を行わせると反応性、再現性が良くなる。
本発明の測定装置を用いて測定を行うには、試験用具の血液適下部に検体を滴下し、吸引された検体と試薬との反応による試験片の発色を光学的に測定すればよい。試験片は通常乾燥しているが、検体の水分により試薬成分が溶解し反応が自動的に進行する。
試験片を用いる反応の温度は通常室温であるが、酵素、特に高分子を基質とする酵素の場合は保温あるいは加熱機能を持たせ一定温度で反応を行わせると反応性、再現性が良くなる。
例えば、フィルターの下部には、温度制御装置を設けることができる。試験片上の反応は主に酵素反応であるから、温度管理を適切に行うことでより効率的に反応が進行し、精度の良い測定が可能となる。特に、複数の試験片が試験用具内に配置され、各試験片の反応温度が異なる場合には、試験片毎に独立した温度制御を行うことが望ましい。そのような温度制御手段としては、公知の加熱、または冷却装置を使うことができるが、精度が良く小型の温度制御装置としてはペルチェ素子を使うことが望ましい。
本発明の測定装置において、試験用具を収納する空間は反応部及び検出部となるため、外部からの光の乱反射の影響や温度あるいは湿度の変化の影響を避け、より精度の高い測定を行うため遮蔽されていることが望ましい。例えば、測定装置が、内側を黒く塗装した金属製のボックスにおいて、外部に表示部及び入力部を、また、内部に検出部、反応部及び制御部を配置することができる。これにより、試験用具の出し入れ時以外は収納された試験用具周辺の温度や湿度が管理され、外部からの光からも遮断されることになり好ましい。
本発明で言うところの小型とは、手動で容易に持ち運ぶことが可能な大きさという意味である。従って、縦横高さがそれぞれ２０ｃｍ以下が望ましく、より具体的には縦２０ｃｍ、横１５ｃｍ、高さ１０ｃｍ以下が好ましい。重量は３ｋｇ以下、より好ましくは１ｋｇ以下である。
本発明の測定に供しうる試料としては、測定対象物質が血清中に存在する場合、たとえば糖化アルブミン等を測定する場合には、全血、血清、血漿を用いることができるが、診療現場で迅速に測定する目的から、全血を用いることが好ましい。
＜測定装置＞
図１は、本発明の測定装置の概略構成を示すブロック図である。
図１において、１８０は試験用具で、測定装置の検出部１６０に収納されて測定がなされる。１８は血球分離可能部で、毛細管１５で試験片２０と連結する。試験片２０は試薬及び酵素を含有し、血液中の特定成分と反応して反応物を生成するのに必要な試薬が含浸される。例えば糖化アルブミンを測定する場合にはプロテアーゼ、ケトアミンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、４−アミノアンチピリン，Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン・ナトリウム（ＴＯＯＳ）等が含浸されている。
図１は、本発明の測定装置の概略構成を示すブロック図である。
図１において、１８０は試験用具で、測定装置の検出部１６０に収納されて測定がなされる。１８は血球分離可能部で、毛細管１５で試験片２０と連結する。試験片２０は試薬及び酵素を含有し、血液中の特定成分と反応して反応物を生成するのに必要な試薬が含浸される。例えば糖化アルブミンを測定する場合にはプロテアーゼ、ケトアミンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、４−アミノアンチピリン，Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン・ナトリウム（ＴＯＯＳ）等が含浸されている。
血液は血球分離可能部１８に滴下され、毛細管１５を移動して試験片２０に到達する。ここで試薬と反応し反応物が生成される。そしてこの生成物の反射光は試験片上部のカバー２５側から測定される。３０は発光素子で、反応生成物によって所定の光を照射する。例えば糖化アルブミンの場合では約５７０ｎｍの波長の光を照射する。４０は受光素子で、発光素子３０より照射され、試験片２０で反射された光の反射光強度を検出している。この反射光強度により試験片２０における反応生成物の変化を検出することができる。
５０はＡ／Ｄ変換器で、受光素子４０より出力される、反射光強度に応じた検出信号（アナログ信号）をデジタル信号に変換している。１７０はこの装置全体の動作を制御する制御部で、例えばマイクロプロセッサ等を含み、制御プログラム等を記憶するプログラム部１００，測定データ等を記憶するデータ記憶部６０、また温度センサー１５０により検知された温度により加熱冷却部に指示を出す温度制御部を備えている。また、１１０は制御プログラムが測定やデータ記憶のタイミングの指示を出すのに必要な時計部である。
１３０は入力部で、例えば、電源のオン／オフを指示するキー、測定データの出力を指示するキー等を備えている。９０は、例えば、液晶等の表示部、１４０は装置全体に電力を供給するための電源部である。
次に、本発明の実施例を詳しく述べるが、本発明はこれにより何ら限定されるものではない。
５０はＡ／Ｄ変換器で、受光素子４０より出力される、反射光強度に応じた検出信号（アナログ信号）をデジタル信号に変換している。１７０はこの装置全体の動作を制御する制御部で、例えばマイクロプロセッサ等を含み、制御プログラム等を記憶するプログラム部１００，測定データ等を記憶するデータ記憶部６０、また温度センサー１５０により検知された温度により加熱冷却部に指示を出す温度制御部を備えている。また、１１０は制御プログラムが測定やデータ記憶のタイミングの指示を出すのに必要な時計部である。
１３０は入力部で、例えば、電源のオン／オフを指示するキー、測定データの出力を指示するキー等を備えている。９０は、例えば、液晶等の表示部、１４０は装置全体に電力を供給するための電源部である。
次に、本発明の実施例を詳しく述べるが、本発明はこれにより何ら限定されるものではない。
＜糖化アルブミン測定試薬試験片の作製＞
糖化アルブミン測定試薬試験片は、厚さ０．４ｍｍ、５０ｍｍ×５０ｍｍのろ紙（ワットマン社製クロマトグラフィ用ろ紙）を、下記組成のうち酵素濃度を変化させた試薬に室温にて５分間浸し、その後、３７℃２０分間風乾し、糖化アルブミン測定試薬試験片を作製した。乾燥後、室温にて２時間処理した後、乾燥剤と共に遮光密閉し、使用時まで冷蔵保存した。
５０ｍＭ トリス緩衝液 ｐＨ７．５
２０００Ｕ／ｍｌ プロテアーゼタイプＸＸVII（シグマ社製）
４ｍＭ ４−アミノアンチピリン（4-ＡＡ；同仁化学研究所社製）
２ｍＭ N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3- スルホプロピル)-m-トルイジン
(ＴＯＯＳ；同人化学研究所社製)
４０００ｍＵ／ｍｌ ケトアミンオキシダーゼ (旭化成社製)
４Ｕ／ｍｌ パーオキシダーゼ（ロシュ社製）
糖化アルブミン測定試薬試験片は、厚さ０．４ｍｍ、５０ｍｍ×５０ｍｍのろ紙（ワットマン社製クロマトグラフィ用ろ紙）を、下記組成のうち酵素濃度を変化させた試薬に室温にて５分間浸し、その後、３７℃２０分間風乾し、糖化アルブミン測定試薬試験片を作製した。乾燥後、室温にて２時間処理した後、乾燥剤と共に遮光密閉し、使用時まで冷蔵保存した。
５０ｍＭ トリス緩衝液 ｐＨ７．５
２０００Ｕ／ｍｌ プロテアーゼタイプＸＸVII（シグマ社製）
４ｍＭ ４−アミノアンチピリン（4-ＡＡ；同仁化学研究所社製）
２ｍＭ N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3- スルホプロピル)-m-トルイジン
(ＴＯＯＳ；同人化学研究所社製)
４０００ｍＵ／ｍｌ ケトアミンオキシダーゼ (旭化成社製)
４Ｕ／ｍｌ パーオキシダーゼ（ロシュ社製）
＜糖化アミノ酸測定試薬試験片の作製＞
糖化アミノ酸測定試薬試験片は、下記組成の試薬を用い、上記糖化アルブミン検出試薬試験片の作製と同じ方法で作製し、保存した。
５０ｍＭ トリス緩衝液 ｐＨ７．５
４ｍＭ ４−アミノアンチピリン（4-ＡＡ；同仁化学研究所社製）
２ｍＭ N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3- スルホプロピル)-m-トルイジン
(ＴＯＯＳ；同人化学研究所社製)
４０００ｍＵ／ｍｌ ケトアミンオキシダーゼ (旭化成社製)
４Ｕ／ｍｌ パーオキシダーゼ（ロシュ社製）
糖化アミノ酸測定試薬試験片は、下記組成の試薬を用い、上記糖化アルブミン検出試薬試験片の作製と同じ方法で作製し、保存した。
５０ｍＭ トリス緩衝液 ｐＨ７．５
４ｍＭ ４−アミノアンチピリン（4-ＡＡ；同仁化学研究所社製）
２ｍＭ N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3- スルホプロピル)-m-トルイジン
(ＴＯＯＳ；同人化学研究所社製)
４０００ｍＵ／ｍｌ ケトアミンオキシダーゼ (旭化成社製)
４Ｕ／ｍｌ パーオキシダーゼ（ロシュ社製）
＜アルブミン測定試薬試験片の作製＞
アルブミン測定試薬試験片は下記組成の試薬を用い、糖化アルブミン測定試薬試験片の作製と同じ方法で作製し、保存した。
５０ｍＭ クエン酸緩衝液 ｐＨ４．０
１％ Ｂｒｉｊ ３５（和光純薬社製）
０．０３％ ブロモクレゾールグリーン（和光純薬社製）
アルブミン測定試薬試験片は下記組成の試薬を用い、糖化アルブミン測定試薬試験片の作製と同じ方法で作製し、保存した。
５０ｍＭ クエン酸緩衝液 ｐＨ４．０
１％ Ｂｒｉｊ ３５（和光純薬社製）
０．０３％ ブロモクレゾールグリーン（和光純薬社製）
＜試験用具の作製＞
図２を用いて試験用具の構成を説明する。実施例１で作製した各試験片１を直径４ｍｍの大きさで4枚切り出した。血球分離膜２には、ポリスルホンからなるフィルターを用い、直径１０ｍｍの大きさで1枚切り出した。試験用具は３枚のフィルムが重ねられた状態で構成されている。
上部のフィルムはカバー材５であり、中部のフィルムは中板６、下部のフィルムは支持体を兼ねた光学反射板７である。カバー材５は、厚さ０．２ｍｍの透明ＰＥＴフィルム（３０ｍｍ×４０ｍｍ）であり、直径８ｍｍの血液滴下孔１２が１箇所、試験片１と同数の直径１ｍｍの通気孔３が設けられている。カバー材の下には中板６が配置されている、中板は厚さ０．４ｍｍのＰＥＴフィルム（３０ｍｍ×４０ｍｍ）であり、試験片の数に対応した幅１ｍｍの溝が血液滴下孔に対応する位置から放射状に４本形成されている。更に、試験片と血球分離膜に対応する位置に円形の保持部（図示せず）が設けられている。試験片の位置は毛細管上にあり、血液滴下孔と通気孔との間の経路になるように配置した。
さらに、中板６の下部には、支持体及び光学反射板７が配置されている。これは、厚さ０．６ｍｍの白色ＰＥＴフィルム（３０ｍｍ×４０ｍｍ）からなり、透明フィルムのカバー材５とともに中板を挟み込む形で毛細管４を形成している。なお、これら３枚のフィルムは両面テープで接着されている。
また、試験用具の下部にはペルチェ素子８からなる温度制御装置９が設けられ、各試験片をそれぞれ所望の温度に制御可能である。
図２を用いて試験用具の構成を説明する。実施例１で作製した各試験片１を直径４ｍｍの大きさで4枚切り出した。血球分離膜２には、ポリスルホンからなるフィルターを用い、直径１０ｍｍの大きさで1枚切り出した。試験用具は３枚のフィルムが重ねられた状態で構成されている。
上部のフィルムはカバー材５であり、中部のフィルムは中板６、下部のフィルムは支持体を兼ねた光学反射板７である。カバー材５は、厚さ０．２ｍｍの透明ＰＥＴフィルム（３０ｍｍ×４０ｍｍ）であり、直径８ｍｍの血液滴下孔１２が１箇所、試験片１と同数の直径１ｍｍの通気孔３が設けられている。カバー材の下には中板６が配置されている、中板は厚さ０．４ｍｍのＰＥＴフィルム（３０ｍｍ×４０ｍｍ）であり、試験片の数に対応した幅１ｍｍの溝が血液滴下孔に対応する位置から放射状に４本形成されている。更に、試験片と血球分離膜に対応する位置に円形の保持部（図示せず）が設けられている。試験片の位置は毛細管上にあり、血液滴下孔と通気孔との間の経路になるように配置した。
さらに、中板６の下部には、支持体及び光学反射板７が配置されている。これは、厚さ０．６ｍｍの白色ＰＥＴフィルム（３０ｍｍ×４０ｍｍ）からなり、透明フィルムのカバー材５とともに中板を挟み込む形で毛細管４を形成している。なお、これら３枚のフィルムは両面テープで接着されている。
また、試験用具の下部にはペルチェ素子８からなる温度制御装置９が設けられ、各試験片をそれぞれ所望の温度に制御可能である。
＜糖化アルブミンの測定＞
健常者５検体、糖尿病患者５検体の全血検体を用いて糖化アルブミン割合の測定を行った。糖化アルブミン濃度、糖化アミノ酸濃度及びアルブミン濃度は、ルシカＧＡ用のキャリブレーター（旭化成社製）を別途測定して換算した。検出部１０には発光ダイオードを用いたデジタルファイバーセンサー１１（キーエンス社製）を用い、検体滴下後の反射光を１０分間測定し、記録した。
前記検体について、糖化アルブミン濃度、糖化アミノ酸濃度及びアルブミン濃度をそれぞれ求め、それらの値から糖化アルブミンの割合を計算した。結果を表１の左欄に示す。
これから、血球分離膜により全血中の血球等の不要物質が除かれるため、本発明の試験用具を用いて全血検体から直接、糖化アルブミンを測定可能であることがわかる。
さらに、同じ全血検体を遠心分離後、ルシカＧＡ試薬（旭化成製）を用いて自動分析装置で測定した結果（表１の右欄）ともよく一致しており、本発明の測定装置を用いて正確に測定が可能であることが明らかである。
健常者５検体、糖尿病患者５検体の全血検体を用いて糖化アルブミン割合の測定を行った。糖化アルブミン濃度、糖化アミノ酸濃度及びアルブミン濃度は、ルシカＧＡ用のキャリブレーター（旭化成社製）を別途測定して換算した。検出部１０には発光ダイオードを用いたデジタルファイバーセンサー１１（キーエンス社製）を用い、検体滴下後の反射光を１０分間測定し、記録した。
前記検体について、糖化アルブミン濃度、糖化アミノ酸濃度及びアルブミン濃度をそれぞれ求め、それらの値から糖化アルブミンの割合を計算した。結果を表１の左欄に示す。
これから、血球分離膜により全血中の血球等の不要物質が除かれるため、本発明の試験用具を用いて全血検体から直接、糖化アルブミンを測定可能であることがわかる。
さらに、同じ全血検体を遠心分離後、ルシカＧＡ試薬（旭化成製）を用いて自動分析装置で測定した結果（表１の右欄）ともよく一致しており、本発明の測定装置を用いて正確に測定が可能であることが明らかである。
＜試薬の蒸発に対する透明フィルムカバーの影響＞
血球分離膜を用いずに、試験片の上面がカバーされた通常型と、試験片の上面に直径３ｍｍの穴を開けた開放型の２種類の試験用具を実施例２の手順で作製した。
サンプルには、ルシカＧＡ用キャリブレータＨ（旭化成社製）を用い、化学天秤中、室温にて、８μＬを毛細管に直接吸わせて試験片に吸収させた。吸収させた瞬間を０秒とし、以後６００秒まで３０秒毎に重量を測定し、０秒時の重量からの残存重量％を計算した。結果を図２に示す。これから明らかなように、カバー無しの試験片では、１０分間に４０％も蒸発が進むのに対し、カバー有りの試験片では、１０％しか蒸発しなかった。
従って、試験片の上面をカバーすることにより、測定中の試薬の蒸発を３０％減少させることができ、より正確な測定が可能となることが明らかとなった。
血球分離膜を用いずに、試験片の上面がカバーされた通常型と、試験片の上面に直径３ｍｍの穴を開けた開放型の２種類の試験用具を実施例２の手順で作製した。
サンプルには、ルシカＧＡ用キャリブレータＨ（旭化成社製）を用い、化学天秤中、室温にて、８μＬを毛細管に直接吸わせて試験片に吸収させた。吸収させた瞬間を０秒とし、以後６００秒まで３０秒毎に重量を測定し、０秒時の重量からの残存重量％を計算した。結果を図２に示す。これから明らかなように、カバー無しの試験片では、１０分間に４０％も蒸発が進むのに対し、カバー有りの試験片では、１０％しか蒸発しなかった。
従って、試験片の上面をカバーすることにより、測定中の試薬の蒸発を３０％減少させることができ、より正確な測定が可能となることが明らかとなった。
＜測定温度の影響＞
検体にはルシカＧＡ用のキャリブレーター（旭化成社製）を用い、反応温度を３０℃、４０℃、４５℃、５０℃に設定し、反射率の経時変化を測定した。結果を図３に示す。これから明らかなように、測定時温度３０℃〜４５℃までは、温度の上昇と共に試験片上の反応速度が加速しており、温度制御による安定した測定が可能となることが明らかとなった。
検体にはルシカＧＡ用のキャリブレーター（旭化成社製）を用い、反応温度を３０℃、４０℃、４５℃、５０℃に設定し、反射率の経時変化を測定した。結果を図３に示す。これから明らかなように、測定時温度３０℃〜４５℃までは、温度の上昇と共に試験片上の反応速度が加速しており、温度制御による安定した測定が可能となることが明らかとなった。
本発明は診療現場で迅速、簡便、安価に精度良く血液検体の測定が可能であり、臨床診断の分野で好適に利用できる。
１ 試験片
２ 血球分離膜
３ 通気孔
４ 毛細管
５ カバー材
６ 中板
７ 支持体を兼ねた光学反射板
８ ペルチェ素子
９ 温度制御部
１０ 検出部
１１ センサー
１２ 血液滴下孔
１５ 毛細管
１８ 血球分離可能部
２０ 試験片
３０ 発光素子
４０ 受光素子
５０ Ａ／Ｄ変換部
６０ データ記憶部
７０ 演算部
８０ 表示制御部
９０ 表示部
１００ プログラム
１１０ 時計部
１２０ 温度制御部
１３０ 入力部
１４０ 電源部
１５０ 加熱冷却部 温度センサー
１６０ 検出部
１７０ 制御部
１８０ 試験用具
２ 血球分離膜
３ 通気孔
４ 毛細管
５ カバー材
６ 中板
７ 支持体を兼ねた光学反射板
８ ペルチェ素子
９ 温度制御部
１０ 検出部
１１ センサー
１２ 血液滴下孔
１５ 毛細管
１８ 血球分離可能部
２０ 試験片
３０ 発光素子
４０ 受光素子
５０ Ａ／Ｄ変換部
６０ データ記憶部
７０ 演算部
８０ 表示制御部
９０ 表示部
１００ プログラム
１１０ 時計部
１２０ 温度制御部
１３０ 入力部
１４０ 電源部
１５０ 加熱冷却部 温度センサー
１６０ 検出部
１７０ 制御部
１８０ 試験用具
Claims (10)
- 血液中の特定成分を測定可能な試験片と血球分離可能部が毛細管で連結された試験用具を収納してなる測定装置であって、試験片上の反応を温度制御する温度制御部、試験片上の反応物を検出する検出部及び検出結果にもとづき特定成分の濃度を計算する演算部を有することを特徴とする測定装置。
- 試験片が、血液中の特定成分と反応する酵素を含むことを特徴とする請求項１に記載の測定装置。
- 温度制御部は、試験片上の反応の温度を試験片毎に独立して制御することを特徴とする請求項１又は２に記載の測定装置。
- 検出部が前記試験片毎に独立した検出部であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の測定装置。
- 試験片の上面に透明のカバーが配置され、かつ、試験片上の反応物を検出する検出部がカバー側に配置されていることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の測定装置。
- 試験用具が遮蔽された空間に収納されていることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の測定装置。
- 検出部は光源および光源から照射された光の反射光を検出する手段とからなることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の測定装置。
- 血液中の特定成分の濃度の計算を行う演算部が、下記のステップを行う請求項１〜７のいずれかに記載の測定装置。
（１）反応物の反射光強度を検出するステップ
（２）検出した反射光強度を血液中の成分の濃度に対して関連付けるステップ
（３）得られた濃度から求めたい成分の割合を計算するステップ - 前記特定成分が糖化アルブミンである請求項１〜８のいずれかに記載の測定装置。
- 以下の工程を含む血液中の特定成分の測定方法。
（１）血液中の特定成分を測定可能な試験片と血球分離可能部が毛細管で連結された試験用具に血液を滴下して、測定用具を測定装置内に収納し、温度制御された条件で反応物を試験用具上に形成する工程
（２）反応物を試験片個々に配置した検出部で検出する工程
（３）検出した反応物を血液中の成分の濃度に対して関連付け、計算する工程
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