JP2005170927A

JP2005170927A - 育毛剤

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Publication number: JP2005170927A
Application number: JP2004289683A
Authority: JP
Inventors: Tomoya Takahashi; 知也高橋; Yoshinori Kobayashi; 義典小林; Michio Kawamura; 道生川村; Yoshiharu Yokoo; 義春横尾; Shunichi Kamiya; 俊一神谷; Tatsuya Tamaoki; 達也玉沖
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1994-06-30
Filing date: 2004-10-01
Publication date: 2005-06-30

Abstract

【目的】本発明は、優れた育毛、発毛効果を示すとともに、安全な育毛剤を提供することを目的とする。
【構成】プロアントシアニジン、特に、エピカテキン−（４β→８）−カテキン、エピカテキン−（４β→８）−エピカテキン、カテキン−（４α→８）−カテキン、エピカテキン−（４β→６）−エピカテキン、エピカテキン−（４β→８）−エピカテキン−（４β→８）−エピカテキン、カテキン−（４α→８）−カテキン−（４α→８）−カテキン、エピカテキン−（４β→８）−エピカテキン−（４β→８）−カテキン、エピカテキン−（４β→８）−エピカテキン−（４β→６）−エピカテキンからなる群から選ばれる少なくとも1つのプロアントシアニジンを有効成分として含有する育毛剤。
【選択図】なし

Description

本発明は、プロアントシアニジンを有効成分として含有する育毛剤に関する。

タンニンは植物界に広く存在し、分子中に多数のフェノール性水酸基を有している。タンニンは、酸、アルカリあるいはタンナーゼで加水分解される加水分解型タンニンと加水分解されない縮合型タンニン等に分類され、縮合型タンニンとしては更にフラバン−３−オールを構成単位とする単純縮合型タンニン（プロアントシアニジン）と、フラバン−３−オール、コーヒー酸、チャルカンβ−オールを構成単位とする複合縮合型タンニンが知られている。

縮合型タンニンが毛髪保護作用を有することが知られている（特許文献１参照）が、これは化粧料としての毛髪表面への作用であり、育毛作用については知られていない。また、プロアントシアニジンが抗酸化剤として利用されている（特許文献２参照）が、その育毛作用は知られていない。
特公平２−３７８８４号公報特開昭６１−１６９８２号公報

本発明は、優れた育毛、発毛効果を示すとともに、安全な育毛剤を提供することを目的とする。

本発明により、優れた育毛、発毛効果を示すとともに、安全な育毛剤が提供される。

プロアントシアニジンは、式（Ｉ）

（Ｉ）
（式中、Ｒ₁またはＲ₂は同一または異なって水素または水酸基を示す。）
で示されるフラバン−３−オール誘導体を構成単位として重合した化合物群をいう。
式（Ｉ）で示されるフラバン−３−オール誘導体の具体例としては、カテキン、エピカテキン、ガロカテキン、エピガロカテキン、アフゼレチン、エピアフゼレチン等があげられ、これらの光学異性体も全てふくまれるが、エピカテキンまたはカテキンを構成単位とするプロアントシアニジンが、本発明の育毛剤としてはより好ましく用いられる。

式（Ｉ）で示されるフラバン−３−オール重合体の結合様式はどのようなものでもよいが、例えばフラバン−３−オールが２個重合した２量体は、式（II)

（II)
（式中、Ｒ₁およびＲ₂は前記と同義であり、Ｒ₃およびＲ₄は同一または異なって水素または水酸基を示す。）
で示される結合様式をとるものが、また３量体以上ではこれらの結合様式が、同一または異なって組み合わされたものがあげられる。

本発明に用いられるプロアントシアニジンは、フラバン−３−オール誘導体の２量体以上であればよいが、好ましくは２〜１０量体、より好ましくは２〜５量体、さらに好ましくは２〜３量体である。フラバン−３−オール誘導体の２量体としては例えば、エピカテキン−（４β→８）−カテキン等のエピカテキンとカテキンの結合体、エピカテキン−（４β→６）−エピカテキン、エピカテキン−（４β→８）−エピカテキン等のエピカテキンの２量体、カテキン−（４α→８）−カテキン等のカテキンの２量体等があげられ、フラバン−３−オール誘導体の３量体としては例えば、エピカテキン−（４β→８）−エピカテキン−（４β→８）−エピカテキン、エピカテキン−（４β→８）−エピカテキン−（４β→６）−エピカテキン等のエピカテキンの３量体、カテキン−（４α→８）−カテキン−（４α→８）−カテキン等のカテキンの３量体、エピカテキン−（４β→８）−エピカテキン−（４β→８）−カテキン等のエピカテキンとカテキンの混合３量体を用いることがとりわけ好ましい。

プロアントシアニジンは、ブドウ、カキ、ビンロウジュ、リンゴ、大麦、神聖草、大黄、桂皮、アズキ、キイチゴ等の各種の植物から抽出精製して得られる他、化学的合成によっても得ることができる。
植物からの抽出精製は、次のような公知の方法で行うことができる。原料である植物の果実、種子、葉、茎、根、根茎等を、適当な時期に採取した後、そのままか、通常空気乾燥等の乾燥工程を行った後、抽出原料とする。原料が植物の搾汁液や樹液の場合はそのまま抽出原料として用いることもある。

上記の乾燥した植物体からのプロアントシアニジンの抽出は、公知の方法〔ケミカルアンドファーマセウテイカルブルチン，３８巻，３２１８頁，１９９０年：同，４０巻，８８９−８９８頁，１９９２年〕を参考にして行うことができる。原料を粉砕もしくは細切した後、溶媒を用いてバッチ式もしくは連続式の抽出方法で行うことができる。抽出溶媒としては、水またはエタノール、メタノール、イソプロピルアルコール等のアルコール類、アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類、酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類等の親水性もしくは親油性の溶媒が、単独もしくは混合溶媒として用いることができる。抽出温度は通常０〜１００℃、好ましくは５〜５０℃で行う。

抽出をバッチ式で行う場合、抽出時間は１時間以上１０日間程度であり、溶媒量は乾燥原料あたり通常１〜３０倍重量、好ましくは５〜１０倍重量用いる。抽出操作は、攪拌によっても浸漬放置によってもよい。抽出操作は必要に応じて２〜３回繰り返してもよい。連続抽出法としては、還流冷却器とサイフォンを組み合わせたソクスレー抽出器を用いた方法等があげられ、溶媒量、抽出時間等は前記のバッチ式抽出法の条件と同様である。

前記の操作で得た粗抽出液から、不溶性残査を濾過もしくは遠心分離により取り除いた抽出液からのプロアントシアニジンの精製は、公知の生薬の分離精製方法であればどのようなものでもよいが、二相溶媒分配法、カラムクロマトグラフィー法、分取高速液体クロマトグラフィー法等を単独または組み合わせて用いることが好ましい。二相溶媒分配法としては、前記の抽出液から油溶性成分や色素をｎ−ヘキサン、石油エーテル等により抽出除去する方法、該抽出液からｎ−ブタノール、メチルエチルケトン等の溶媒と水との分配により、溶媒相へプロアントシアニジンを回収する方法等があげられる。カラムクロマトグラフィー法としては、担体としてアンバーライトＩＲ−１２０Ｂ、アンバーライトＩＲＡ−４０２等を用いるイオン交換カラムクロマトグラフィー法、担体として順相系シリカゲル、逆相系シリカゲル、ダイヤイオンＨＰ−２０、セパビーズＳＰ−２０７等を用いる吸着カラムクロマトグラフィー、担体としてセファデックスＬＨ−２０等を用いるゲル濾過法等があげられ、これらを単独もしくは組み合わせて反復して使用することができる。分取高速液体クロマトグラフィー法としては、オクタデシルシリカ等を用いる逆相系のカラムを用いる方法、シリカゲル、シリカゲル−ＮＨ₂等を用いる順相系のカラムを用いる方法等があげられる。

上記精製方法により、塩類等水溶性のイオン性物質、糖類、多糖類等の非イオン性物質、油分、色素等が粗抽出液から除去される結果、プロアントシアニジンを得ることができる。
プロアントシアニジンの合成法による製造方法としては、エピカテキンまたはカテキンの２量体の製造方法が、ジャーナルオブケミカルソサエティーパーキントランサクションＩ，1535〜1543頁，1983年に記載されており、これらの文献に記載の方法に準じて合成することができる。

また、プロアントシアニジンを本発明の有効成分として用いる場合、プロアントシアニジンは、一種または二種以上混合してもよい。
育毛剤の剤型はプロアントシアニジンを有効成分として配合し得る剤型であればどのようなものでもよい。適当な医薬基剤と配合して液状あるいは固体状の育毛剤として用いる。液状あるいは固体状の育毛剤型としては、ヘヤーリキッド、ヘヤートニック、ヘヤーローション等の液状剤型、軟膏、ヘヤクリーム等の固体状剤型があげられ、各々好適な基剤にプロアントシアニジンを添加した後、常法により製造することができる。本発明の育毛剤中におけるプロアントシアニジンの配合量は、単独または混合して通常0.０１〜３０重量％、好ましくは0.１〜１０重量％、とりわけ好ましくは0.５〜１０重量％である。

液体状剤型に好適な基剤としては、育毛剤に通常使用されているもの、例えば精製水、エタノール、多価アルコール類、油脂等があげられ、必要により添加剤を添加してもよい。多価アルコールとしては、グリセロール、1,３−ブチレングリコール、プロピレングリコール等があげられる。油脂類としては小麦はい芽油、椿油、ホホバ油、オリーブ油、スクワラン、サフラワー油、マカデミアナッツ油、アボガド油、大豆水添レシチン等があげられる。

添加剤としては、香料、界面活性剤、殺菌剤等があげられる。また、酸化防止剤、紫外線吸収剤、消炎剤、清涼剤、保湿剤、ビタミン類、生薬エキス等も適宜添加してもよい。
香料としては、通常化粧料等に使うものならどのような香料を用いてもよい。
界面活性剤としては、ポリオキシエチレン（６０）硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレン（８）オレイルエーテル、モノオレイン酸ポリオキシエチレン（１０）、ポリオキシエチレン（３０）グリセリルモノステアレート、モノステアリン酸ソルビタン、モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン、ショ糖脂肪酸エステル、モノラウリン酸ヘキサグリセリン、ポリオキシエチレン還元ラノリン、ＰＯＥ（２５）グリセリルピログルタミン酸イソステアリン酸ジエステル、Ｎ−アセチルグルタミンイソステアリルエステル等があげられる。

殺菌剤としては、ヒノキチオール、トリクロサン、クロルヘキシジングルコン酸塩、フェノキシエタノール、レゾルシン、イソプロピルメチルフェノール、アズレン、サリチル酸、感光素、ジンクピリチオンなどがあげられる。
酸化防止剤として、ブチルヒドロキシアニソール、没食子酸、没食子酸プロピル、エリソルビン酸などがあげられる。

紫外線吸収剤としては、ジヒドロキシベンゾフェノンなどのベンゾフェノン類、メラニン、パラアミノ安息香酸エチル、パラジメチルアミノ安息香酸２−エチルヘキシルエステル、シノキサート、パラメトキシ桂皮酸２−エチルヘキシルエステル、２−（２−ヒドロキシ−５−メチルフェニル）ベンゾトリアゾール、ウロカニン酸、金属酸化物微粒子などがあげられる。

消炎剤としては、グリチルリチン酸ジカリウム、アラントイン等があげられる。清涼剤としては、トウガラシチンキ、１−メントール等があげられる。保湿剤としては、ピロリドンカルボン酸、ヒアルロン酸ナトリウム、コンドロイチン硫酸等があげられる。ビタミン類としては、酢酸ｄｌ−α−トコフェロール、ｄｌ−α−トコフェロール、ビタミンＥ、ニコチン酸ベンジル、Ｄ−パントテニルアルコール、パントテニルエチルエーテル、ビオチン、塩酸ピリドキシン、リボフラビン等があげられる。生薬エキスとしては、センブリエキス、ニンニクエキス、ニンジンエキス、アロエエキス等があげられる。

上記の液体状剤型を噴霧剤として用いるときは、不燃化液化ガスを用いる。
固体状剤型の基剤としては、ワセリン、固形パラフィン、植物油、鉱物油、ラノリン、ろう類、マクロゴール等があげられ、必要により前記の添加剤、レシチン等の乳化剤、エタノール、イソプロピルアルコール等の低級アルコールを添加してもよい。
本発明の育毛剤の投与量は年齢、体重、症状、治療効果、投与方法、処理時間などにより異なるが、成人一人当り一回にプロアントシアニジンとして０．１〜６００mg、好ましくは１０〜３００mgの範囲で一日一回から数回、経皮投与される。

以下の、実施例、参考例および試験例により本発明の態様を具体的に説明する。なお、以下の実施例に使用するプロアントシアニジンのうち、エピカテキン−（４β→８）−エピカテキン〔化合物２〕はケミカルファーマセウチカルブルチン，４１巻，１４９１頁，１９９３年および同，３８巻，３２１８，１９９０年に記載の方法により、エピカテキン−（４β→６）−エピカテキン〔化合物４〕およびエピカテキン−（４β→８）−エピカテキン−（４β→６）−エピカテキン〔化合物８〕は、ケミカルファーマセウチカルブルチン，４０巻，８８９頁，１９９２年に記載の方法により製造した化合物を使用した。それ以外の実施例に使用したプロアントシアニジンは参考例１〜５に記載の方法により製造した。

エチルアルコール７Ｋｇ、グリセロール５００ｇ、参考例１で得た化合物１を３００ｇ、Ｎ−アセチルグルタミンイソステアリルエステルを５０ｇおよび精製水１６００ｇを均一に攪拌混合し、固形物を溶解させ溶液Ａを調製した。これとは別に１，３−ブチレングリコール５００ｇおよびＰＯＥ（２５）グリセリルピログルタミン酸イソステアリン酸ジエステル５０ｇを均一に攪拌混合し、溶液Ｂを調製した。溶液Ｂを溶液Ａに攪拌しながら加え均一にし育毛トニック（組成物１）を調製した。なお、上記の操作は全て室温で行った。

参考例１で得た化合物１を化合物２に代える以外は、実施例１と同様の方法により育毛トニック（組成物２）を調製した。

参考例１で得た化合物１を参考例２で得た化合物３に代える以外は、実施例１と同様の方法により育毛トニック（組成物３）を調製した。

参考例１で得た化合物１を化合物４に代える以外は、実施例１と同様の方法により育毛トニック（組成物４）を調製した。

参考例１で得た化合物１を参考例３で得た化合物５に代える以外は、実施例１と同様の方法により育毛トニック（組成物５）を調製した。

参考例１で得た化合物１を参考例４で得た化合物６に代える以外は、実施例１と同様の方法により育毛トニック（組成物６）を調製した。

参考例１で得た化合物１を参考例５で得た化合物７に代える以外は、実施例１と同様の方法により育毛トニック（組成物７）を調製した。

参考例１で得た化合物１を化合物８に代える以外は、実施例１と同様の方法により育毛トニック（組成物８）を調製した。

エチルアルコール７Ｋｇ、化合物２を１００ｇ、Ｎ−アセチルグルタミンイソステアリルエステル５０ｇ、ｄｌ−α−トコフェロール１０ｇ、パルミチン酸アスコビル１０ｇ、ｄ−ビオチン５ｇ、β−カロチン０．１ｇ、クエン酸１０ｇおよび精製水１７９０ｇを均一に攪拌混合し、固形物を溶解させ溶液Ａを調製した。これとは別に１，３−ブチレングリコール１ＫｇおよびＰＯＥ（２５）グリセリルピログルタミン酸イソステアリン酸ジエステル２５ｇを均一に攪拌混合し、溶液Ｂを調製した。溶液Ｂを溶液Ａに攪拌しながら加え均一にし育毛トニック（組成物９）を調製した。なお、上記の操作は全て室温で行い溶液のｐＨは水酸化ナトリウム溶液で４に調製した。

参考例１．エピカテキン−（４β→８）−カテキン〔化合物１〕の製造方法
ビンロウジュ (Areca catachu L.) の種子の乾燥粉砕物1.２５Kgを２L の５０（Ｖ／Ｖ）％アセトン〔（Ｖ／Ｖ）％は水との混合液に対する容量百分率を表す。以下の記載についても同様である。〕で２時間室温で抽出した。この粗抽出液を濾紙（アドバンテック東洋社製 No.526)で濾過して抽出液を得た。再び残さに1.５L の５０（Ｖ／Ｖ）％アセトンを加えて室温で１時間抽出をおこなった。前記の操作によって得た濾液を合わせて減圧濃縮した後、該濃縮液を１０（Ｖ／Ｖ）％メタノールで平衡化したダイヤイオンＨＰ−２０樹脂（三菱化成社製）を充填したカラム（６cmφ Ｘ４４cm：１２４３ml体積) に通塔し、１０（Ｖ／Ｖ）％メタノール2.５L で洗浄した。つぎに、2.５L の３０（Ｖ／Ｖ）％メタノールおよび1.２５L の３０（Ｖ／Ｖ）％メタノールで順次、目的物を溶出させた。得られた溶出液を減圧濃縮した後、５０（Ｖ／Ｖ）％メタノールで平衡化したセファデックスＬＨ−２０（ファルマシア社製）を充填したカラム（９cmφ Ｘ４１cm：２６０７ml体積) に通塔し、5.２L の５０（Ｖ／Ｖ）％メタノールおよび2.６L の７５（Ｖ／Ｖ）％メタノールでカラムを洗浄した。つぎに1.３L の７５（Ｖ／Ｖ）％メタノールで目的物質を溶出した後乾固して3.７５g の乾固物を得た。乾固物を脱塩水に溶解した後、分取高速液体クロマトグラフィー（ワイエムシー社製、１０cmφＸ１００cm；ＯＤＳカラム）で分離し化合物１を0.５g 得た。得られた化合物１の同定は、液体クロマトグラフィーのリテンションタイムおよび薄層シリカゲルクロマトグラフィーのＲｆ値を標品〔ジャーナルオブケミカルソサエティーケミカルコミュニケーション，７８１頁，１９８１年〕と比較することにより行った。

参考例２．カテキン−（４α→８）−カテキン〔化合物３〕の製造方法
二条大麦（Hordeum vulgare L. var. distichon alefeld)の種子のふすま（外皮粉砕物）１０Kgを７０（Ｗ／Ｗ）％アセトン〔（Ｗ／Ｗ）％は水との混合液に対する重量百分率を表す〕３０Kgを用いて４日間室温で抽出した。この粗抽出液を濾紙（アドバンテック東洋社製 No.５２６）で濾過して抽出液１8.４Kgを得た。得られた濾液から溶媒を除去したのち脱塩水に溶解した。該溶解液を水で平衡化したダイヤイオンＨＰ−２０樹脂（三菱化成社製）を充填したカラム（１０cmφ Ｘ５０cm：３９２５ml体積) に通塔し、８L の２０（Ｖ／Ｖ）％メタノールおよび８L の４０（Ｖ／Ｖ）％メタノールでカラムを順次洗浄した後、８L の６０（Ｖ／Ｖ）％メタノールで目的物を溶出させた。該溶出液を乾固した後、0.１L の２５（Ｖ／Ｖ）％メタノールに溶解してから、脱塩水で平衡化したセファデックスＬＨ−２０を充填したカラム（６cmφ Ｘ３５cm：９８９ml体積) に通塔し、２L の脱塩水および２L の５０（Ｖ／Ｖ）％メタノールでカラムを洗浄した。次に２L の７５（Ｖ／Ｖ）％メタノールで目的物を溶出させた後、乾固し0.６５ｇの乾固物を得た。乾固物を脱塩水に溶解した後、分取高速液体クロマトグラフィー（ジーエルサイエンス社製、２cmφ Ｘ２５cm Ｌ；ＯＤＳカラム）で分離し化合物３を0.２３ｇ得た。得られた化合物３の同定は、液体クロマトグラフィーのリテンションタイムおよび薄層シリカゲルクロマトグラフィーのＲｆ値を標品〔ジャーナルオブソサエティーオブフードアンアグリカルチャー，３４巻，６２頁〕と比較することにより行った。

参考例３．エピカテキン−（４β→８）−エピカテキン（４β→８）−エピカテキン〔化合物５〕の製造方法
リンゴジュース２1.６L を、水で平衡化したダイヤイオンＨＰ−２０樹脂（三菱化成社製）を充填したカラム（９cmφ Ｘ５０cm：３１７９ml体積) に通塔し、９L の脱塩水および２L のメタノールでカラムを洗浄した。次に１L のメタノールで、目的物を溶出させ、減圧で濃縮後もう一度、水で平衡化したダイヤイオンＨＰ−２０樹脂（三菱化成社製）を充填したカラム（7.２cmφ Ｘ４８cm：１９５３ml体積) に通塔し、４L の脱塩水、４L の２０（Ｖ／Ｖ）％メタノール、４L の３０（Ｖ／Ｖ）％メタノールで順次カラムを洗浄後、４L の４０（Ｖ／Ｖ）％メタノールで目的物を溶出させ6.１ｇの乾固物を得た。次に、これを５０mlの２５（Ｖ／Ｖ）％メタノールに溶解し、２５（Ｖ／Ｖ）％メタノールで平衡化したセファデックスＬＨ−２０を充填したカラム（3.４cmφ Ｘ３０cm：２７２ml体積) に通塔し、５００mlの２５（Ｖ／Ｖ）％メタノール、５００mlの５０（Ｖ／Ｖ）％メタノールで順次カラムを洗浄後、５００mlの７５（Ｖ／Ｖ）％メタノールで目的物を溶出させ1.５ｇの乾固物を得た。乾固物を脱塩水に溶解した後、分取高速液体クロマトグラフィー（ジーエルサイエンス社製、２cmφ Ｘ２５cm Ｌ；ＯＤＳカラム）で分離し、化合物５を0.１６ｇ得た。得られた化合物５の同定は、液体クロマトグラフィーのリテンションタイムおよび薄層シリカゲルクロマトグラフィーのＲｆ値を標品〔ジャーナルオブリキッドクロマトグラフィー，１５巻，６３７頁，１９９２年〕と比較することによりおこなった。

参考例４．カテキン−（４α→８）−カテキン−（４α→８）−カテキン〔化合物６〕の製造方法
二条大麦（Hordeum vulgare L. var. distichon alefeld)の皮武儀種子を通風乾燥後その１０Kgをとり、ウイレー粉砕機（Ｗ−１４０：池田理科機器製）を用いて粉砕した。これに７５（Ｖ／Ｖ）％アセトン５０L を加え、３時間攪拌しながら抽出した。この粗抽出液を濾紙（アドバンテック東洋社製 No.５２６）で濾過して濾液を得た。この濾液に６Kgの塩化ナトリウムを加え飽和させた。３０分間放置した後、分離したアセトン層を採取した。アセトン層を減圧濃縮し、１１１g の乾固物を得た。次に該乾固物をメタノール５００mlに溶解した後、メタノールで平衡化したセファデックスＬＨ−２０を充填したカラム（１２cmφ Ｘ４４cm：４９７４ml体積) に通塔し、１０L のメタノールでカラムを洗浄した後、2.５L のメタノールで目的物を溶出させた後、乾固し3.２ｇの乾固物を得た。乾固物を脱塩水に溶解した後、分取高速液体クロマトグラフィー（ジーエルサイエンス社製、２cmφ Ｘ２５cm Ｌ；ＯＤＳカラム）で分離し、化合物６を0.３１ｇ得た。化合物６の理化学的性質を以下に示す。

Fab-MS(m/z); 867.1(M+H) ⁺

参考例５．エピカテキン−（４β→８）−エピカテキン−（４β→８）−カテキン〔化合物７〕の製造方法
化合物７の製造は、ケミカルアンドファーマセウチカルブルチン，４０巻，８８９−８９８頁，１９９２年に記載の方法に従って以下のように行った。

ビンロウジュ（Areca catachu L.) の果実を採取し４分割した後、通風乾燥器で３日間４０℃で乾燥した。さらに、乾燥種子をハンマーで細かく砕いた後、ウイレー粉砕機（Ｗ−１４０：池田理科機器製）を用いて粉砕した。これらの乾燥粉砕物0.５Kgをとり、５０（Ｖ／Ｖ）％アセトン１L を用いて３時間室温で抽出した。この粗抽出液を濾紙（アドバンテック東洋社製 No.５２６）で濾過して抽出液を得た。再び残さに１L の５０（Ｖ／Ｖ）％アセトンを加えて室温で３時間抽出をおこなった。前記の操作によって得た濾液を合わせて減圧濃縮した後、脱塩蒸留水を加えて0.５L とした。これに酢酸エチル0.５L を加えて分配し酢酸エチル層を集めた。この操作を３回繰り返し、得られた酢酸エチル層を合わせて減圧濃縮した。これに0.５L の脱塩蒸留水を加えて懸濁した後、ヘキサン0.５L を加えて分配した。この操作を２回繰り返した後、水層を採取し、減圧濃縮をおこなった。得られた乾固物を２５０mlの脱塩蒸留水に溶解し、２５０mlのクロロホルム・メタノール・水（３：３：２）混合物を加えて混合攪拌したのち、３０００ｇで２０分間遠心分離を行い、水−メタノール層（下層）を集め減圧濃縮を行った。該濃縮液を水で平衡化したダイヤイオンＨＰ−２０樹脂（三菱化成社製）を充填したカラム（６cmφ Ｘ２９cm：８２０４ml体積) に通塔し、1.６L の水および1.６L の２０（Ｖ／Ｖ）％メタノールで順次洗浄した。つぎに、1.６L の４０（Ｖ／Ｖ）％メタノールおよび0.８L の６０（Ｖ／Ｖ）％メタノールで順次、目的物を溶出させた。この溶出液を減圧濃縮し8.８ｇの乾固物を得た。次に該乾固物を５０mlの脱塩水に溶解し、水で平衡化したセファデックスＬＨ−２０（ファルマシア社製）を充填したカラム（４cmφ Ｘ２９cm：８２０ml体積) に通塔し、0.６L の水、0.６L の２５（Ｖ／Ｖ）％メタノールおよび0.３L の５０（Ｖ／Ｖ）％メタノールおよび0.３L の７５（Ｖ／Ｖ）％メタノールで順次カラムを洗浄した後、0.３L の７５（Ｖ／Ｖ）％メタノールで目的物を溶出させた。これを減圧乾固し、化合物７を0.９５ｇ得た。化合物７の理化学的性質を以下に示す。

Fab-MS(m/z); 867.2(M+H) ⁺

試験例１（マウスの発毛に対する効果）
小川らの方法（ザジャーナルオブデイウマトロジー，１０巻，４５〜５４頁，１９８３年）を参考にマウスによる発毛効果の試験を行った。毛周期の休止期にある９週令のＣ３Ｈ／ＨｅＳｌｃ系雄性マウス（１群４〜５匹）の背部毛を電気バリカンで剃毛し、実施例１〜８で作成した組成物１〜８を一日一回、剃毛部に１５０μｌづつ均一に塗布した。また、対照群は実施例とプロアントシアニジンを除けば同一組成のトニックベースを塗布した。試験塗布開始後１７日目のマウス背部皮膚を採取し、写真撮影をおこなった後、画像処理装置（アンビオニクス社製；スピカII）を用いて背部皮膚全面積に対する発毛部の面積の比を求め、この比から発毛効果を判定した。結果を第３表に示した。

試験例２（ウサギ眼刺激性試験）
ニュージーランドホワイト種ウサギ（体重３〜３．５Ｋｇ、オス）を使用し、実施例１〜８で得られた本発明組成物１〜８を５％濃度になるように精製水に溶解した試験液を１００μｌずつ点眼した。使用動物を２試験群にわけグループ１は点眼５分後に流水で洗眼を行い、グループ２は点眼２４時間後に流水で洗眼を行った。対照群は精製水のみを投与した。試験開始後、１、２４、４８、７２時間および７日後に眼の観察を行ったが、角膜の混濁、虹彩の充血、結膜の発赤腫張、排出物等の眼の異常を示すような臨床所見はいずれの群にも見られなかった。

試験例３（ウサギ皮膚連続塗布試験）
ニュージーランドホワイト種ウサギ（２２週例、オス）の背部皮膚を剃毛し、実施例１〜８で得られた本発明組成物１〜８を１日１回３ケ月間連続塗布することにより、皮膚の刺激性試験を行った。ウサギは１匹あたり４試験群にわけ、約１５ｃｍ²（５ｃｍＸ３ｃｍ）の面積に２００μｌの試験液を塗布した。対照としてトニック液からプロアントシアニジンのみを除く群と無塗布群を置いた。その結果、対照区および試験区共に炎症、発赤腫張等皮膚の異常を示すような臨床所見は無かった。

試験例４（ヒト臨床試験）
（１）臨床試験方法
本発明化合物の男性型脱毛症に対する有効性を評価するために、実施例９で得た組成物９を含有するトニックを被験薬として、ボランティア３７人に投与して臨床効果を検討した。ボランティアとしては、２５才から６０才までの頭部に男性型脱毛症以外の疾患を有していない健康な男子を採用した。なお、被験薬の対照薬には、化合物２を除く以外は組成物９と同一の組成のトニックを用いた。

前記のボランティア３７人を年齢、脱毛進行度、脱毛タイプ等の背景因子に偏りがないように、被験薬投与群１９人と対照薬投与群１８人に分離した。臨床試験は、２４週間の間、毎日、朝および夜に各１回、組成物９または対照薬１．５〜２ｍｌを頭部の患部に塗布することにより行った。

（２）評価方法
臨床試験の評価は、皮膚科医診断、写真判定、毛髪の太さ、毛髪密度の４種類の方法により行った。以下に各評価方法の概略を示す。
i．皮膚科医診断
試験開始前および試験終了時に皮膚科医により、塗布部位の脱毛進行度、硬毛のはえ方、軟毛のはえ方等につき検討し、総合的に判断し４段階のランク（著効、改善、変化なし、悪化）で効果を判定した。なお、塗布部位において、炎症等の副作用が生じているか否かも検査した。
ii．写真撮影
試験開始前および試験終了時に頭部を上方および後方から写真撮影を行い、臨床所見、毛髪所見の補助資料とすると共に、当該写真から被験薬の効果を前記４段階のランクに分けて判定した。
iii．毛髪の太さ
試験開始前および試験終了時に頭部の一定部位の毛髪を採取し、毛の根本の太さの測定を行った。毛の根本の太さの変化から被験薬の効果を３段階のランク（太くなる、変化なし、細くなる）に分けて判定した。
iv．毛髪密度
iiiにおいて、毛髪を採取した部位の試験開始前および試験終了時における毛髪密度の測定を拡大写真を用いることにより行った。毛髪密度の変化から被験薬の効果を３段階のランク（増加、変化なし、減少）に分けて判定した。

（３）結果
以上の、皮膚科医診断、写真判定、毛髪の太さ、毛髪密度の結果を第４表に示した。また皮膚科医診断において被験薬の副作用は認められなかった。

第４表によれば、皮膚科医診断においてはボランティアの５７．９％が著効または改善を示し〔対照群では、３３．３％〕、写真効果においてはボランティアの５２．７％が著効または改善を示し〔対照群では。１１．１％〕、毛髪の太さにおいてはボランティアの７３．７％が毛髪が太くなり〔対照群では、３８．９％〕、毛髪密度においてはボランティアの７３．７％が毛髪密度が増加した〔対照群では３８．９％〕。
従って、４種の評価方法のいずれにおいても、本願化合物投与による治療効果が認められた。

試験例５（急性毒性）
ｄｄ系雄性マウス（体重２０±１ｇ）を１群５匹用い、試験化合物２を２０００ｍｇ／Ｋｇ皮下投与したが、死亡例は観測されなかった。
以上の試験例の結果から、本発明のプロアントシアニジンを含む育毛剤は優れた育毛、および発毛効果を示すとともに、眼や皮膚に対する刺激も無く長期間連続使用しても安全な育毛剤であることが示された。

Claims

リンゴの抽出物を有効成分として含有する育毛剤。
リンゴの抽出物が果実抽出物である請求項１記載の育毛剤。