JP2005065594A - METHOD FOR PREDICTING ONSET RISK OF ALZHEIMER'S DISEASE BY USING GENE POLYMORPHISM IN tau-GENE, AND NUCLEIC ACID MOLECULE USED THEREFOR - Google Patents
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Abstract
Description
発明の分野
本発明は、ヒトタウ遺伝子の変異を検出することによるアルツハイマー病の発症リスクの予測およびこれに用いるための核酸分子に関する。
The present invention relates to predicting the risk of developing Alzheimer's disease by detecting mutations in the human tau gene and to nucleic acid molecules for use in this.
背景技術
６５歳未満で発症する若年性アルツハイマー病の病因遺伝子として、アミロイド前駆体遺伝子、プレセニリン１遺伝子、およびプレセニリン２遺伝子が知られている。しかし、常染色体優性型の若年性アルツハイマー病のうち、これら病因遺伝子の変異によるものは１０〜５０％に過ぎず、また、若年性アルツハイマー病患者の約９割はこれら病因遺伝子の変異を有さず、かつ常染色体優性遺伝形式を持たないことが知られている（St. George-Hyslop P. H., Semin. Neurol. 19, 371-383, 1999；Campion D. et al., Am. J. Hum. Genet. 65, 664-670, 1999；Cruts M. et al., Hum. Mol. Genet. 7, 43-51, 1998；Forsell C. et al., Neurosci. Lett. 234, 3-6, 1997）。さらに、日本人におけるこれら病因遺伝子の変異に関し、常染色体優性型若年性アルツハイマー病患者２５家系のうちの５家系、および弧発性の若年性アルツハイマー病患者３４例のうちの１例のみにプレセニリン１遺伝子の変異が認められただけで、他の遺伝子の変異は認められなかったことが報告されている（Tanahashi H. et al., Neurosci. Lett. 207, 139-141, 1996；Kamimura K. et al., J. Neurol. Sci. 160, 76-81, 1998）。
BACKGROUND ART As the etiology genes for juvenile Alzheimer's disease that develops before the age of 65, amyloid precursor gene, presenilin 1 gene, and presenilin 2 gene are known. However, only 10-50% of autosomal dominant juvenile Alzheimer's disease is caused by mutations in these pathogenic genes, and about 90% of patients with juvenile Alzheimer's disease have mutations in these pathogenic genes. And is known to have no autosomal dominant form (St. George-Hyslop PH, Semin. Neurol. 19, 371-383, 1999; Campion D. et al., Am. J. Hum. Genet. 65, 664-670, 1999; Cruts M. et al., Hum. Mol. Genet. 7, 43-51, 1998; Forsell C. et al., Neurosci. Lett. 234, 3-6, 1997) . Furthermore, regarding mutations in these etiological genes in Japanese, presenilin 1 was present only in 5 out of 25 autosomal dominant juvenile Alzheimer's disease families and 1 out of 34 arctic juvenile Alzheimer's disease patients. It has been reported that only gene mutations were observed, but not other gene mutations (Tanahashi H. et al., Neurosci. Lett. 207, 139-141, 1996; Kamimura K. et al. al., J. Neurol. Sci. 160, 76-81, 1998).
また、アルツハイマー病のリスクファクターとして、アポリポプロテインＥ遺伝子のε４アレルが知られている。しかしながら、アルツハイマー病患者の半数以上はε４アレルを持たないことが報告されている（Farrier L.A. et al., JAMA, 278, 1349-1356, 1997）。 In addition, the ε4 allele of the apolipoprotein E gene is known as a risk factor for Alzheimer's disease. However, it has been reported that more than half of Alzheimer's disease patients do not have the ε4 allele (Farrier LA et al., JAMA, 278 , 1349-1356, 1997).
従って、若年性アルツハイマー病を高い確率で検出しうるリスクファクターが、依然として必要とされている。 Accordingly, there remains a need for risk factors that can detect juvenile Alzheimer's disease with a high probability.
一方で、タウは微小管結合タンパク質の一つであり、チューブリン重合促進因子として機能する。タウ遺伝子は、その一次転写産物の構造から、１６個のエクソン（エクソン０〜１４）を含むことが分かっている。中枢神経系では、エクソン４Ａ、エクソン６およびエクソン８は使用されず、エクソン２、エクソン３およびエクソン１０の選択的スプライシングにより、タウは６種のアイソフォームを生じる。 On the other hand, tau is one of microtubule-binding proteins and functions as a tubulin polymerization promoter. The tau gene is known to contain 16 exons (exons 0 to 14) from the structure of its primary transcript. In the central nervous system, exon 4A, exon 6 and exon 8 are not used, and alternative splicing of exon 2, exon 3 and exon 10 results in six isoforms.
タウ遺伝子の変異は、いくつかの疾患に関連することが知られている。例えば、タウの遺伝子変異により、第１７番染色体に連鎖する前頭側頭型痴呆パーキンソニズム（frontotemporal dementia with parkinsonism linked to chromosome 17）が起こることが知られている（非特許文献１：Poorkaj P. et al., Ann. Neurol. 43, 815-825, 1998；非特許文献２：Hutton M. et al., Nature 393, 702-705, 1998）。また、タウの遺伝子多型として、９種の連鎖不平衡な一塩基多型からなるＨ１およびＨ２ハプロタイプが知られているが、そのうちのＨ１が進行性核上性麻痺（progressive supranuclear palsy）の患者に多く見られると報告されている（非特許文献３：Baker M. et al., Hum. Mol. Genet. 8, 711-715, 1999）。 Mutations in the tau gene are known to be associated with several diseases. For example, it is known that frontotemporal dementia with parkinsonism linked to chromosome 17 linked to chromosome 17 occurs due to a tau gene mutation (Non-patent Document 1: Poorkaj P. et al. al., Ann. Neurol. 43, 815-825, 1998; Non-Patent Document 2: Hutton M. et al., Nature 393, 702-705, 1998). In addition, H1 and H2 haplotypes consisting of nine linkage disequilibrium single nucleotide polymorphisms are known as tau gene polymorphisms, of which H1 is a patient with progressive supranuclear palsy. (Non-patent document 3: Baker M. et al., Hum. Mol. Genet. 8, 711-715, 1999).
さらに、タウ遺伝子の変異とアルツハイマー病との相関も研究の対象となっている。アルツハイマー病は、老人斑の蓄積および神経原繊維変化（神経細胞内における繊維状封入体の蓄積）により特徴づけられる。この神経原繊維変化において蓄積される繊維状封入体は、ペアードヘリカルフィラメント（paired helical filament，ＰＨＦ）と呼ばれる特殊な繊維を含んでおり、ＰＨＦの基本骨格は過度にリン酸化されたタウにより構成されている。このことから、タウの遺伝子変異または遺伝子多型とアルツハイマー病との相関が研究の対象とされており、その成果について報告されている。 Furthermore, the correlation between tau gene mutations and Alzheimer's disease is also the subject of research. Alzheimer's disease is characterized by accumulation of senile plaques and neurofibrillary tangles (accumulation of fibrous inclusions in nerve cells). The fibrous inclusions accumulated in this neurofibrillary tangle contain special fibers called paired helical filaments (PHF), and the basic skeleton of PHF is composed of excessively phosphorylated tau. Has been. Therefore, the correlation between tau gene mutation or polymorphism and Alzheimer's disease has been the subject of research, and the results have been reported.
Lilius L.らは、タウ遺伝子のＡおよびＢハプロタイプ（これは上記のＨ１およびＨ２ハプロタイプを拡張したものであり、１１種の連鎖不平衡な一塩基多型からなる）とアルツハイマー病との関連について報告している（非特許文献４：Lilius L. et al., Neurosci. lett. 277, 29-32, 1999）。この報告では、ＡＡハプロタイプは単独ではアルツハイマー病のリスクとはならないが、アポリポプロテインＥ（ＡｐｏＥ）のε４型と相乗的に働くことによってアルツハイマー病のリスクとなると結論づけられている。 Lilius L. et al. Relate the relationship between A and B haplotypes of the tau gene (which is an extension of the H1 and H2 haplotypes described above and consists of 11 linkage disequilibrium single nucleotide polymorphisms) and Alzheimer's disease. (Non-Patent Document 4: Lilius L. et al., Neurosci. Lett. 277, 29-32, 1999). In this report, it has been concluded that AA haplotypes alone are not at risk for Alzheimer's disease, but are synergistic with the ε4 form of apolipoprotein E (ApoE) to be at risk for Alzheimer's disease.
また、Bullido M. J.らは、タウ遺伝子のＩＶＳ１１＋３４Ｇ／Ａ多型（第１１イントロンの第３４ヌクレオチドにおけるＧ／Ａ多型）とアルツハイマー病との関連について報告している（非特許文献５：Bullido M. J. et al., Neurosci. Lett. 298, 49-52, 2000）。この報告では、前記多型におけるＧアレル（ＧＧ型またはＧＡ型）は単独ではアルツハイマー病のリスクとはならないが、アポリポプロテインＥ（ＡｐｏＥ）のε４型と相乗的に働くことによってアルツハイマー病のリスクとなると結論づけられている。 Bullido MJ et al. Have reported the association between the IVS11 + 34G / A polymorphism of the tau gene (G / A polymorphism at the 34th nucleotide of the 11th intron) and Alzheimer's disease (Non-Patent Document 5: Bullido MJ et al.). al., Neurosci. Lett. 298, 49-52, 2000). In this report, the G allele (GG type or GA type) in the polymorphism alone does not pose a risk of Alzheimer's disease, but by synergistic action with the ε4 type of apolipoprotein E (ApoE), the risk of Alzheimer's disease It is concluded that
しかし、他のグループにより、ＡＡハプロタイプおよびＩＶＳ１１＋３４Ｇアレルに関する上述の結果は、コホート研究によっては再現されないことが報告されている（非特許文献６：Crawford F. et al., Neurosci. Lett. 266, 193-196, 1999；非特許文献７：Roks G. et al., Neurosci. Lett. 277, 137-139, 1999；非特許文献８：Kwon J. M. et al., Neurosci. Lett. 284, 77-80, 2000；非特許文献９：Baker M. et al., Neurosci. Lett. 285, 147-149, 2000）。 However, other groups have reported that the above results for AA haplotypes and IVS11 + 34G alleles are not reproduced by cohort studies (Non-Patent Document 6: Crawford F. et al., Neurosci. Lett. 266, 193). -196, 1999; Non-Patent Document 7: Roks G. et al., Neurosci. Lett. 277, 137-139, 1999; Non-Patent Document 8: Kwon JM et al., Neurosci. Lett. 284, 77-80, 2000; Non-Patent Document 9: Baker M. et al., Neurosci. Lett. 285, 147-149, 2000).
さらに、Conrad C.らは、タウ遺伝子の第９イントロン内に新規な遺伝子であるSaitohin遺伝子が存在することを報告し、さらには、Saitohin遺伝子中のＱ７Ｒ多型（第７アミノ酸残基におけるグルタミン／アルギニン多型）が晩期発症型アルツハイマー病と相関すると報告している（非特許文献１０：Conrad C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 7751-7756, 2002）。 Furthermore, Conrad C. et al. Reported that the Saitohin gene, which is a novel gene, exists in the 9th intron of the tau gene. Furthermore, the Q7R polymorphism in the Saitohin gene (glutamine / glutamine at the seventh amino acid residue). (Arginine polymorphism) has been reported to correlate with late-onset Alzheimer's disease (Non-patent Document 10: Conrad C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 7751-7756, 2002).
しかし、他のグループにより、上述のSaitohin遺伝子中のＱ７Ｒ多型とアルツハイマー病とは相関しないことが報告されている（非特許文献１１：Cook L. et al., Ann. Neurol. 52, 690-691, 2002；非特許文献１２：Verpillat P. et al., Ann. Neurol. 52, 829-832, 2002）。 However, other groups have reported that the above-mentioned Q7R polymorphism in the Saitohin gene does not correlate with Alzheimer's disease (Non-patent Document 11: Cook L. et al., Ann. Neurol. 52, 690- 691, 2002; Non-Patent Document 12: Verpillat P. et al., Ann. Neurol. 52, 829-832, 2002).
本発明者らは、ヒトタウ遺伝子において、第１１イントロンの第９０番目に位置するグアニン（Ｇ）残基のアデニン（Ａ）残基への変異を見出し、さらにこの変異が男性における若年性アルツハイマー病の発症リスクに関連することを見出した。本発明はこれらの知見に基づくものである。 In the human tau gene, the present inventors have found a mutation of a guanine (G) residue located at the 90th position of the 11th intron to an adenine (A) residue, and this mutation is associated with juvenile Alzheimer's disease in males. It was found to be related to risk of onset. The present invention is based on these findings.
従って、本発明は、上記の変異を有する変異型ポリヌクレオチド、該変異を検出しうる核酸分子およびプライマーペア、男性における若年性アルツハイマー病の発症リスクの予測方法、ならびに診断用キットの提供を目的とする。 Accordingly, an object of the present invention is to provide a mutant polynucleotide having the above mutation, a nucleic acid molecule and a primer pair capable of detecting the mutation, a method for predicting the risk of developing juvenile Alzheimer's disease in men, and a diagnostic kit. To do.
そして、本発明による変異型ポリヌクレオチドは、ヒトタウ遺伝子のヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドにおいて、前記遺伝子の第１１イントロンの第９０番目に位置するグアニン（Ｇ）残基のアデニン（Ａ）残基への変異を有してなるものである。 The mutant polynucleotide according to the present invention is an adenine (A) residue of a guanine (G) residue located at the 90th position of the 11th intron of the gene in a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of the human tau gene. It has a mutation to.
さらに、本発明による核酸分子は、ヒトタウ遺伝子における、第１１イントロンの第９０番目に位置するグアニン（Ｇ）残基のアデニン（Ａ）残基への変異を検出しうる核酸分子であって、本発明による変異型ポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなるものである。 Furthermore, the nucleic acid molecule according to the present invention is a nucleic acid molecule capable of detecting a mutation of a guanine (G) residue located at the 90th position of the 11th intron to an adenine (A) residue in the human tau gene, It comprises a nucleotide fragment that hybridizes to a mutated polynucleotide according to the invention or a polynucleotide complementary thereto.
さらに、本発明によるプライマーペアは、ヒトタウ遺伝子における、第１１イントロンの第９０番目に位置するグアニン（Ｇ）残基のアデニン（Ａ）残基への変異を検出しうるプライマーペアであって、本発明による変異型ポリヌクレオチドの、前記遺伝子の第１１イントロンの第９０番目に位置するヌクレオチド残基に対応するアデニン（Ａ）残基を含む領域を核酸増幅法において増幅することができるものである。 Furthermore, the primer pair according to the present invention is a primer pair capable of detecting a mutation of a guanine (G) residue located at the 90th position of the 11th intron to an adenine (A) residue in the human tau gene, The region containing the adenine (A) residue corresponding to the nucleotide residue located at the 90th position of the 11th intron of the gene of the mutant polynucleotide according to the invention can be amplified by the nucleic acid amplification method.
さらに、本発明によるアルツハイマー病の発症リスクの予測方法は、ヒトタウ遺伝子の変異を検出することにより、男性における若年性アルツハイマー病の発症のリスクを予測する方法であって、本発明による核酸分子、および／または本発明によるプライマーペアを用いて、ヒトタウ遺伝子における、第１１イントロンの第９０番目に位置するグアニン（Ｇ）残基のアデニン（Ａ）残基への変異を検出する工程を含んでなるものである。 Furthermore, the method for predicting the risk of developing Alzheimer's disease according to the present invention is a method for predicting the risk of developing juvenile Alzheimer's disease in males by detecting a mutation in the human tau gene, the nucleic acid molecule according to the present invention, and And / or a step of detecting a mutation of the guanine (G) residue located at the 90th position of the 11th intron to the adenine (A) residue in the human tau gene using the primer pair according to the present invention. It is.
さらに、本発明によるキットは、本発明による核酸分子および／または本発明によるプライマーペアを含んでなる、男性における若年性アルツハイマー病の発症のリスクを予測するためのキットである。 Furthermore, the kit according to the present invention is a kit for predicting the risk of developing juvenile Alzheimer's disease in men, comprising the nucleic acid molecule according to the present invention and / or the primer pair according to the present invention.
本発明によれば、ヒトタウ遺伝子における変異を検出することにより、男性における若年性アルツハイマー病の発症のリスクを予測することが可能となる。 According to the present invention, it is possible to predict the risk of developing juvenile Alzheimer's disease in men by detecting mutations in the human tau gene.
本発明により検出されるタウ遺伝子中の変異は、その第１１イントロン（第１１エクソンと第１２エクソンに挟まれた領域）の第９０番目に位置するグアニン（Ｇ）残基のアデニン（Ａ）残基への変異（本明細書において「ＩＶＳ１１＋９０Ｇ＞Ａ変異」という）である。 The mutation in the tau gene detected by the present invention is the residue of the adenine (A) of the guanine (G) residue located at the 90th position of the 11th intron (the region sandwiched between the 11th and 12th exons). Mutation to a group (referred to herein as “IVS11 + 90G> A mutation”).
タウ遺伝子におけるＩＶＳ１１＋９０Ｇ＞Ａ変異は、男性における若年性アルツハイマー病、すなわち６５歳未満で発症するアルツハイマー病、好ましくは６０歳未満で発症するアルツハイマー病、のリスクファクターとして使用できる。従って、男性においてＩＶＳ１１＋９０Ｇ＞Ａ変異を検出することにより、前記若年性アルツハイマー病の発症のリスクを予測することが可能となる。 The IVS11 + 90G> A mutation in the tau gene can be used as a risk factor for juvenile Alzheimer's disease in men, that is, Alzheimer's disease that develops before age 65, preferably Alzheimer's disease that occurs before age 60 years. Therefore, by detecting the IVS11 + 90G> A mutation in men, it becomes possible to predict the risk of developing the juvenile Alzheimer's disease.
変異型ポリヌクレオチド
ＩＶＳ１１＋９０Ｇ＞Ａ変異を検出するためには、この変異を有するタウ遺伝子のヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドを標的とすることができる。すなわち、このような変異型ポリヌクレオチドの存在を確認することにより、ＩＶＳ１１＋９０Ｇ＞Ａ変異を検出することができる。
In order to detect a mutated polynucleotide IVS11 + 90G> A mutation, a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of a tau gene having this mutation can be targeted. That is, IVS11 + 90G> A mutation can be detected by confirming the presence of such a mutant polynucleotide.
従って、本発明によれば、ヒトタウ遺伝子のヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドにおいて、前記遺伝子の第１１イントロンの第９０番目に位置するグアニン（Ｇ）残基のアデニン（Ａ）残基への変異を有してなるポリヌクレオチドが提供される。前記タウ遺伝子は、好ましくは配列番号３で表されるアミノ酸配列をコードするものとされ、これをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列としては、例えば、配列番号２で表されるヌクレオチド配列が挙げられる。また、前記タウ遺伝子の第１１イントロンは、好ましくは配列番号１で表わされるヌクレオチド配列を含んでなるものとされ、その場合には、上記の変異により、配列番号１に示される第９０番目のグアニン（Ｇ）残基がアデニン（Ａ）残基に置換される。前記タウ遺伝子の全エクソンを含むヒト１７番染色体genomic contigとしては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋに登録番号：ＮＴ＿０１０７４８．１２として登録されているヌクレオチド配列の第２６２５９０８〜２７５９８２８残基が挙げられる。 Therefore, according to the present invention, in the polynucleotide comprising the nucleotide sequence of the human tau gene, mutation of the guanine (G) residue located at the 90th position of the 11th intron of the gene to an adenine (A) residue A polynucleotide is provided. The tau gene preferably encodes the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, and the nucleotide sequence of cDNA encoding this includes, for example, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2. In addition, the eleventh intron of the tau gene preferably comprises the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, and in this case, the 90th guanine represented by SEQ ID NO: 1 is caused by the mutation described above. (G) A residue is substituted with an adenine (A) residue. Examples of the human chromosome 17 genomic contig including all exons of the tau gene include residues 2625908 to 2759828 of the nucleotide sequence registered in GenBank as registration number: NT — 0107748.12.
本発明による変異型ポリヌクレオチドは、一本鎖であっても、相補鎖がハイブリダイズした二本鎖であってもよい。 The mutant polynucleotide according to the present invention may be single-stranded or double-stranded with hybridized complementary strands.
本発明による変異型ポリヌクレオチドは、既述の通り、ＩＶＳ１１＋９０Ｇ＞Ａ変異を検出する際の標的として有用であるが、さらには、タウタンパク質の活性または発現量に影響を与え、これによりアルツハイマー病の発症を抑制することのできる化合物をスクリーニングするためにも有用である。 As described above, the mutated polynucleotide according to the present invention is useful as a target for detecting an IVS11 + 90G> A mutation, and further affects the activity or expression level of tau protein, thereby causing Alzheimer's disease. It is also useful for screening for compounds that can suppress the onset.
核酸分子およびこれを用いたアルツハイマー病発症予測方法
本発明による核酸分子は、タウ遺伝子におけるＩＶＳ１１＋９０Ｇ＞Ａ変異を検出しうる核酸分子である。この核酸分子は、本発明による変異型ポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなるものである。
Nucleic acid molecule and method for predicting the onset of Alzheimer's disease using the same A nucleic acid molecule according to the present invention is a nucleic acid molecule capable of detecting an IVS11 + 90G> A mutation in a tau gene. This nucleic acid molecule comprises a nucleotide fragment that hybridizes to a mutant polynucleotide according to the present invention or a polynucleotide complementary thereto.
本発明において「ハイブリダイズする」とは、本発明による核酸分子がストリンジェントな条件下で標的ヌクレオチド分子にハイブリダイズし、標的ヌクレオチド分子以外のヌクレオチド分子にはハイブリダイズしないことを意味する。ストリンジェントな条件は、本発明による核酸分子とその相補鎖との二重鎖の融解温度Ｔｍ（℃）およびハイブリダイゼーション溶液の塩濃度などに依存して決定することができ、例えば、J. Sambrook, E. F. Frisch, T. Maniatis; Molecular Cloning 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)等を参照することができる。例えば、使用する核酸分子の融解温度よりわずかに低い温度下でハイブリダイゼーションを行なうと、核酸分子を標的ヌクレオチド分子に特異的にハイブリダイズさせることができる。本発明の好ましい実施態様によれば、あるポリヌクレオチドにハイブリダイズする核酸分子は、そのポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドの全部または一部の配列を含んでなるものとされる。 In the present invention, “hybridize” means that the nucleic acid molecule according to the present invention hybridizes to the target nucleotide molecule under stringent conditions and does not hybridize to nucleotide molecules other than the target nucleotide molecule. Stringent conditions can be determined depending on the melting temperature Tm (° C.) of the duplex between the nucleic acid molecule of the present invention and its complementary strand, the salt concentration of the hybridization solution, etc., for example, J. Sambrook , EF Frisch, T. Maniatis; Molecular Cloning 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory (1989), and the like. For example, when hybridization is performed at a temperature slightly lower than the melting temperature of the nucleic acid molecule to be used, the nucleic acid molecule can be specifically hybridized to the target nucleotide molecule. According to a preferred embodiment of the present invention, a nucleic acid molecule that hybridizes to a polynucleotide comprises the sequence of all or part of a polynucleotide that is complementary to that polynucleotide.
本発明において「核酸分子」は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＰＮＡ（peptide nucleic acid）を含む意味で用いられる。本発明の好ましい実施態様によれば、核酸分子はＤＮＡである。 In the present invention, “nucleic acid molecule” is used to mean DNA, RNA, and PNA (peptide nucleic acid). According to a preferred embodiment of the invention, the nucleic acid molecule is DNA.
本発明による核酸分子のヌクレオチド配列は、当業者により適宜設計されうる。例えば、本発明による核酸分子は、イントロンにハイブリダイズする部分だけでなく、エクソンにハイブリダイズする部分をも含むことができ、あるいは、これらのどちらか一方のみにより構成されていてもよい。 The nucleotide sequence of the nucleic acid molecule according to the present invention can be appropriately designed by those skilled in the art. For example, the nucleic acid molecule according to the present invention may include not only a portion that hybridizes to an intron but also a portion that hybridizes to an exon, or may be constituted by only one of these.
本発明による核酸分子は、タウ遺伝子におけるＩＶＳ１１＋９０Ｇ＞Ａ変異の検出において、核酸プローブとして用いることができる。この目的のためには、本発明による核酸分子は、上記変異型ポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドの、前記遺伝子の第１１イントロンの第９０番目に位置するヌクレオチド残基に対応するアデニン（Ａ）残基を含む領域にハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなることが好ましい。 The nucleic acid molecule according to the present invention can be used as a nucleic acid probe in the detection of an IVS11 + 90G> A mutation in the tau gene. For this purpose, the nucleic acid molecule according to the present invention comprises an adenine (corresponding to the 90th nucleotide residue of the eleventh intron of the gene of the mutant polynucleotide or a complementary polynucleotide thereof). A) It preferably comprises a nucleotide fragment that hybridizes to the region containing the residue.
本発明による核酸分子を核酸プローブとして用いる場合、核酸分子の鎖長は１０〜１００ヌクレオチドとすることが好ましく、より好ましくは少なくとも１２ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも１５ヌクレオチド、さらに好ましくは１５〜５０ヌクレオチドとする。 When the nucleic acid molecule according to the present invention is used as a nucleic acid probe, the chain length of the nucleic acid molecule is preferably 10 to 100 nucleotides, more preferably at least 12 nucleotides, still more preferably at least 15 nucleotides, even more preferably 15 to 50 nucleotides. To do.
また、本発明による核酸分子は、タウ遺伝子におけるＩＶＳ１１＋９０Ｇ＞Ａ変異の検出において、核酸増幅用プライマーとして用いることができる。この目的のためには、本発明による核酸分子は、上記変異型ポリヌクレオチドの、前記遺伝子の第１１イントロンの第９０番目に位置するヌクレオチド残基に対応するアデニン（Ａ）残基を含む領域を核酸増幅法において増幅することができるものであることが好ましい。 In addition, the nucleic acid molecule according to the present invention can be used as a primer for nucleic acid amplification in the detection of an IVS11 + 90G> A mutation in the tau gene. For this purpose, the nucleic acid molecule according to the present invention comprises a region containing an adenine (A) residue corresponding to the 90th nucleotide residue of the eleventh intron of the gene of the above-mentioned mutant polynucleotide. It is preferably one that can be amplified in a nucleic acid amplification method.
本発明による核酸分子を核酸増幅用プライマーとして用いる場合、核酸分子の鎖長は１０〜５０ヌクレオチドとすることが好ましく、より好ましくは少なくとも１２ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも１５ヌクレオチド、さらに好ましくは１５〜３０ヌクレオチドとする。 When the nucleic acid molecule according to the present invention is used as a primer for nucleic acid amplification, the length of the nucleic acid molecule is preferably 10 to 50 nucleotides, more preferably at least 12 nucleotides, still more preferably at least 15 nucleotides, and even more preferably 15 to 30 nucleotides. Nucleotides.
本発明の他の好ましい実施態様によれば、本発明による核酸分子の鎖長は、１５〜１００ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１７ヌクレオチド、さらに好ましくは１７〜５０ヌクレオチドとする。このような鎖長を有する本発明による核酸分子は、特に夾雑物を含む核酸試料において、ＩＶＳ１１＋９０Ｇ＞Ａ変異を検出する上で好ましいものである。 According to another preferred embodiment of the invention, the nucleic acid molecule according to the invention has a chain length of 15 to 100 nucleotides, more preferably at least 17 nucleotides, even more preferably 17 to 50 nucleotides. The nucleic acid molecule according to the present invention having such a chain length is preferable for detecting an IVS11 + 90G> A mutation, particularly in a nucleic acid sample containing impurities.
核酸増幅法は通常プライマーのペアを用いて実施される。従って、本発明によれば、タウ遺伝子におけるＩＶＳ１１＋９０Ｇ＞Ａ変異を検出しうるプライマーペアが提供される。このプライマーペアは、本発明による変異型ポリヌクレオチドの、前記遺伝子の第１１イントロンの第９０番目に位置するヌクレオチド残基に対応するアデニン（Ａ）残基を含む領域を核酸増幅法において増幅しうるものである。このようなプライマーペアを構成する２本のプライマーとしては、本発明による核酸分子を用いることができる。このようなプライマーは、増幅の対象となる領域のヌクレオチド配列に基づいて当業者が適宜設計することができる。例えば、プライマーペアの一方のプライマーを、増幅対象領域のヌクレオチド配列中における５’末端部分の配列を有するものとし、他方のプライマーを、増幅対象領域の相補鎖のヌクレオチド配列中における５’末端部分の配列を有するものとすることができる。 The nucleic acid amplification method is usually performed using a pair of primers. Therefore, according to the present invention, a primer pair capable of detecting an IVS11 + 90G> A mutation in the tau gene is provided. This primer pair can amplify a region containing an adenine (A) residue corresponding to the nucleotide residue located at the 90th position of the 11th intron of the gene of the mutant polynucleotide according to the present invention by a nucleic acid amplification method. Is. As the two primers constituting such a primer pair, the nucleic acid molecule according to the present invention can be used. Such a primer can be appropriately designed by those skilled in the art based on the nucleotide sequence of the region to be amplified. For example, one primer of the primer pair has a 5 ′ terminal sequence in the nucleotide sequence of the amplification target region, and the other primer has a 5 ′ terminal sequence in the nucleotide sequence of the complementary strand of the amplification target region. It can have an array.
本発明による核酸分子または本発明によるプライマーペアを用いることにより、タウ遺伝子におけるＩＶＳ１１＋９０Ｇ＞Ａ変異を検出することができ、これにより、男性における若年性アルツハイマー病の発症リスクを予測することができる。上記の検出の結果、ＩＶＳ１１＋９０Ｇ＞Ａ変異が検出された場合には、若年性アルツハイマー病発症のリスクが高いものと判断することができる。 By using the nucleic acid molecule according to the present invention or the primer pair according to the present invention, an IVS11 + 90G> A mutation in the tau gene can be detected, thereby predicting the risk of developing juvenile Alzheimer's disease in men. As a result of the above detection, when an IVS11 + 90G> A mutation is detected, it can be determined that the risk of developing juvenile Alzheimer's disease is high.
また、ＩＶＳ１１＋９０Ｇ＞Ａ変異を有する場合の変異部位における遺伝子型としてはＧ／ＡおよびＡ／Ａが考えられる。従って、本発明の他の態様によれば、本発明による核酸分子または本発明によるプライマーペアを用いて、タウ遺伝子におけるＩＶＳ１１＋９０Ｇ＞Ａ変異部位の遺伝子型を同定する工程を含んでなる、男性における若年性アルツハイマー病の発症リスクを予測する方法が提供される。 Moreover, G / A and A / A can be considered as a genotype in a mutation site | part in the case of having an IVS11 + 90G> A mutation. Thus, according to another aspect of the present invention, the use of a nucleic acid molecule according to the present invention or a primer pair according to the present invention to identify a genotype of an IVS11 + 90G> A mutation site in a tau gene, A method for predicting the risk of developing Alzheimer's disease is provided.
具体的には、本発明による核酸分子または本発明によるプライマーペアは、タウ遺伝子におけるＩＶＳ１１＋９０Ｇ＞Ａ変異を検出するための核酸増幅法においてプライマーとして用いることができる。従って、本発明によれば、本発明による核酸分子またはプライマーペアを用いて、被検者由来の核酸試料を鋳型とする核酸増幅法を行ない、得られた増幅産物中においてＩＶＳ１１＋９０Ｇ＞Ａ変異を検出する工程を含んでなる、男性における若年性アルツハイマー病発症のリスクの予測法が提供される。 Specifically, the nucleic acid molecule according to the present invention or the primer pair according to the present invention can be used as a primer in a nucleic acid amplification method for detecting an IVS11 + 90G> A mutation in a tau gene. Therefore, according to the present invention, a nucleic acid molecule or primer pair according to the present invention is used to perform a nucleic acid amplification method using a nucleic acid sample derived from a subject as a template, and an IVS11 + 90G> A mutation is detected in the obtained amplification product. A method for predicting the risk of developing juvenile Alzheimer's disease in men is provided.
この方法による診断に当たっては、例えば、被験者から血液等の試料を採取し、得られた試料からゲノムＤＮＡ等の核酸試料を抽出し、得られた核酸試料を鋳型として、本発明による核酸分子またはプライマーペアを用いて核酸増幅法を実施し、得られた増幅産物のヌクレオチド配列を解析することにより、タウ遺伝子におけるＩＶＳ１１＋９０Ｇ＞Ａ変異を検出することができる。核酸増幅法およびこれによる変異の検出法としては、当技術分野において公知のいずれの方法を用いてもよい。例えば、核酸増幅法としてはＰＣＲ法等を用いることができる。 In diagnosis by this method, for example, a sample such as blood is collected from a subject, a nucleic acid sample such as genomic DNA is extracted from the obtained sample, and the nucleic acid molecule or primer according to the present invention is obtained using the obtained nucleic acid sample as a template. By performing a nucleic acid amplification method using the pair and analyzing the nucleotide sequence of the obtained amplification product, the IVS11 + 90G> A mutation in the tau gene can be detected. Any method known in the art may be used as the nucleic acid amplification method and the mutation detection method using the nucleic acid amplification method. For example, a PCR method or the like can be used as the nucleic acid amplification method.
核酸増幅法により得られた増幅産物のヌクレオチド配列の解析は、例えば、シークエンス用プライマーを用いるダイレクトシークエンス法等により容易に行なうことができる。このような方法は当技術分野において周知であり、例えば、市販のキットを用いて実施することができる。 Analysis of the nucleotide sequence of the amplification product obtained by the nucleic acid amplification method can be easily performed by, for example, a direct sequencing method using a sequencing primer. Such methods are well known in the art and can be performed, for example, using commercially available kits.
上記の核酸増幅法とダイレクトシークエンス法とによりＩＶＳ１１＋９０Ｇ＞Ａ変異を検出する場合には、例えば、以下の配列を有するプライマー：
T810F：5'-GCTCCCGCAAGTTTCACACTCAAC-3'（配列番号１２）；
T920：5'-GCTGGAACTGCTCCAGACTTC-3'（配列番号１３）
を用いて核酸増幅法を行ない、これらのいずれかのプライマーをシークエンスプライマーとしてダイレクトシークエンス法を行なうことができる。
In the case of detecting an IVS11 + 90G> A mutation by the nucleic acid amplification method and the direct sequencing method, for example, a primer having the following sequence:
T810F: 5′-GCTCCCGCAAGTTTCACACTCAAC-3 ′ (SEQ ID NO: 12);
T920: 5'-GCTGGAACTGCTCCAGACTTC-3 '(SEQ ID NO: 13)
A nucleic acid amplification method can be performed using a direct sequencing method using any of these primers as a sequencing primer.
また、タウ遺伝子におけるＩＶＳ１１＋９０Ｇ＞Ａ変異において、この変異により特定の制限酵素による認識配列が失われるかまたは生成する場合には、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）を利用する方法、例えば、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法を用いて上記の変異を検出することができる。このような方法は、例えば、上述の核酸増幅法において前記制限酵素認識配列を包含する領域を増幅するようなプライマーペアを用い、得られた増幅断片をこの制限酵素で消化した後、得られる断片の数およびそれらの鎖長を調べることにより実施することができる。このような方法は当技術分野において周知であり、当業者であれば、適切な制限酵素、プライマー、増幅反応条件、制限酵素反応条件等を適宜設定することができる。前記タウ遺伝子の第１１イントロンが配列番号１で表されるヌクレオチド配列を含んでなる場合には、例えば、上記T810F（配列番号１２）およびT920（配列番号１３）をプライマーとして用い、得られた増幅産物を制限酵素MboIIで消化すればよい。その結果、３５ｂｐおよび５８ｂｐの２個の断片が得られた場合には上記の変異が検出されたと判断することができる。 Further, in the case of an IVS11 + 90G> A mutation in the tau gene, when the recognition sequence by a specific restriction enzyme is lost or generated due to this mutation, a method using a restriction fragment length polymorphism (RFLP), for example, PCR-RFLP The above mutations can be detected using a method. Such a method is obtained by, for example, using a primer pair that amplifies a region including the restriction enzyme recognition sequence in the nucleic acid amplification method described above, digesting the obtained amplified fragment with this restriction enzyme, and then obtaining the fragment. Can be carried out by examining the number of and their chain lengths. Such methods are well known in the art, and those skilled in the art can appropriately set appropriate restriction enzymes, primers, amplification reaction conditions, restriction enzyme reaction conditions, and the like. When the eleventh intron of the tau gene comprises the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, for example, the amplification obtained using T810F (SEQ ID NO: 12) and T920 (SEQ ID NO: 13) as primers The product may be digested with the restriction enzyme MboII. As a result, when two fragments of 35 bp and 58 bp are obtained, it can be determined that the mutation is detected.
本発明による予測法においては、アレル特異的ＰＣＲ法を実施できるようにプライマーを設計することもできる。具体的には、一方のプライマーを変異部位に対合できるように設計し、他方のプライマーを変異部位を含まない領域に対合できるように設計することができる。このように設計されたプライマーペアを用いて核酸増幅法を実施すると、核酸試料中に前記変異にかかるいずれかのアレルが存在する場合には増幅産物が得られ、これが存在しない場合には増幅産物が得られない。従って、この場合には、増幅産物の有無を検出することにより特定のアレルの有無を判定することができる。 In the prediction method according to the present invention, primers can be designed so that an allele-specific PCR method can be performed. Specifically, one primer can be designed to be paired with a mutation site, and the other primer can be designed to be paired with a region not including the mutation site. When the nucleic acid amplification method is performed using the primer pair designed in this way, an amplification product is obtained when any allele related to the mutation is present in the nucleic acid sample, and when this is not present, the amplification product is obtained. Cannot be obtained. Therefore, in this case, the presence or absence of a specific allele can be determined by detecting the presence or absence of an amplification product.
本発明による核酸分子は、ハイブリダイゼーション法等によるタウ遺伝子におけるＩＶＳ１１＋９０Ｇ＞Ａ変異の検出にプローブとして用いることができる。従って、本発明によれば、本発明による核酸分子と被検者由来の核酸試料とのハイブリダイゼーションを行ない、次いでハイブリダイゼーション複合体の存在を検出する工程を含んでなる、男性における若年性アルツハイマー病発症のリスクの予測法が提供される。ハイブリダイゼーション複合体の存在は、タウ遺伝子におけるＩＶＳ１１＋９０Ｇ＞Ａ変異にかかるいずれかのアレルの存在を示す。このハイブリダイゼーション法を用いる方法は、上述の核酸増幅法を用いる方法により得られる増幅産物に対して適用することもできる。 The nucleic acid molecule according to the present invention can be used as a probe for detecting an IVS11 + 90G> A mutation in a tau gene by a hybridization method or the like. Thus, according to the present invention, juvenile Alzheimer's disease in men comprising the step of hybridizing a nucleic acid molecule according to the present invention with a nucleic acid sample from a subject and then detecting the presence of a hybridization complex. Methods for predicting the risk of onset are provided. The presence of the hybridization complex indicates the presence of any allele associated with the IVS11 + 90G> A mutation in the tau gene. The method using this hybridization method can also be applied to the amplification product obtained by the method using the nucleic acid amplification method described above.
この方法による診断に当たっては、例えば、被検者から血液等の試料を採取し、得られた試料からゲノムＤＮＡ等の核酸試料を抽出し、ストリンジェントな条件下、本発明による核酸分子とのハイブリダイゼーションの有無を検出することにより、タウ遺伝子におけるＩＶＳ１１＋９０Ｇ＞Ａ変異を検出することができる。核酸試料は、必要であれば制限酵素処理等を施し、ハイブリダイゼーションに適切な長さとすることもできる。ハイブリダイゼーション法とこれによる変異の検出法としては、当技術分野において公知のいずれの方法を用いてもよい。例えば、サザンハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション等の技術を用いることができ、これらの方法については、例えば、J. Sambrook, E. F. Frisch, T. Maniatis; Molecular Cloning 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)を参照することができる。 In diagnosis by this method, for example, a sample such as blood is collected from a subject, and a nucleic acid sample such as genomic DNA is extracted from the obtained sample. By detecting the presence or absence of hybridization, the IVS11 + 90G> A mutation in the tau gene can be detected. If necessary, the nucleic acid sample can be subjected to restriction enzyme treatment or the like to have a length suitable for hybridization. Any method known in the art may be used as a hybridization method and a mutation detection method using the hybridization method. For example, techniques such as Southern hybridization and colony hybridization can be used. For these methods, for example, J. Sambrook, EF Frisch, T. Maniatis; Molecular Cloning 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) You can refer to it.
タウ遺伝子におけるＩＶＳ１１＋９０Ｇ＞Ａ変異を検出する場合には、また、本発明による核酸分子をプライマーとして使用するプライマーエクステンション法を用いることもできる。プライマーエクステンション法は当業者に公知であり、その操作手順および使用するプライマーの具体的ヌクレオチド配列は、当業者であれば容易に決定することができる。本発明の好ましい実施態様によれば、上記のプライマーエクステンション法としては、ＳＮａＰｓｈｏｔＴＭ法またはＰｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法として知られる方法が用いられる。 When detecting the IVS11 + 90G> A mutation in the tau gene, a primer extension method using the nucleic acid molecule according to the present invention as a primer can also be used. The primer extension method is known to those skilled in the art, and the procedure for the procedure and the specific nucleotide sequence of the primer to be used can be easily determined by those skilled in the art. According to a preferred embodiment of the present invention, a method known as SNaPshot ™ method or Pyrosequencing method is used as the primer extension method.
ＳＮａＰｓｈｏｔＴＭ法においては、変異部位に隣接するプライマーであって、伸長反応によりその３’末端に付加するヌクレオチドが前記変異部位に相補的なものとなるプライマーが用いられる。このようなプライマーを使用し、被検者からの核酸試料を鋳型としてプライマーの伸長反応が行なわれるが、その際にｄｄＮＴＰ（ジデオキシＮＴＰ）を用いることにより、伸長反応は、上記の変異部位に対応する一個のヌクレオチドを取り込んだ時点で終了する。取り込まれたヌクレオチドは、蛍光標識等で予め標識しておくことにより容易に同定され、従って、変異部位のヌクレオチドが同定される。このような方法は当業者に公知であり、その操作手順および使用するプライマーの具体的ヌクレオチド配列は、当業者であれば容易に決定することができる。 In the SNaPshot TM method, a primer that is adjacent to a mutation site and has a nucleotide that is added to its 3 ′ end by an extension reaction is complementary to the mutation site. Using such a primer, a primer extension reaction is performed using a nucleic acid sample from a subject as a template. By using ddNTP (dideoxyNTP), the extension reaction corresponds to the above mutation site. When one nucleotide to be incorporated is completed. The incorporated nucleotide is easily identified by pre-labeling with a fluorescent label or the like, and therefore the nucleotide at the mutation site is identified. Such methods are known to those skilled in the art, and the procedures for the operation and the specific nucleotide sequences of the primers used can be easily determined by those skilled in the art.
Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法においては、被検者からの核酸試料を鋳型とするプライマーの伸長反応の際に、４種のｄＮＴＰを１種ずつ反応させる。ｄＮＴＰのいずれかが取り込まれると、等量のピロリン酸塩（ＰＰｉ）が遊離し、遊離したＰＰｉはスルフリラーゼと反応してＡＴＰを生成させ、このＡＴＰによりルシフェラーゼの反応が起こり、発光が起こる。従って、ある特定のｄＮＴＰを加えたときに発光が起こった場合には、そのｄＮＴＰに対応するヌクレオチドが取り込まれたことが明らかとなり、これにより核酸試料中の対象部位のヌクレオチドが同定される。この方法においては、ｄＮＴＰが用いられるため、ＳＮａＰｓｈｏｔＴＭ法で用いられるような多型部位に隣接するプライマーを用いる必要はなく、数塩基はなれたプライマーを用いてもよい。このような方法は当業者に公知であり、その操作手順および使用するプライマーの具体的ヌクレオチド配列は、当業者であれば容易に決定することができる。 In the pyrosequencing method, four types of dNTPs are reacted one by one during the primer extension reaction using a nucleic acid sample from a subject as a template. When any of dNTPs is incorporated, an equal amount of pyrophosphate (PPi) is liberated, and the liberated PPi reacts with sulfurylase to produce ATP, which causes luciferase reaction and luminescence. Therefore, when light emission occurs when a specific dNTP is added, it becomes clear that the nucleotide corresponding to the dNTP has been incorporated, and thereby the nucleotide of the target site in the nucleic acid sample is identified. In this method, since dNTP is used, it is not necessary to use a primer adjacent to the polymorphic site as used in the SNaPshot TM method, and a primer separated by several bases may be used. Such methods are known to those skilled in the art, and the procedures for the operation and the specific nucleotide sequences of the primers used can be easily determined by those skilled in the art.
タウ遺伝子におけるＩＶＳ１１＋９０Ｇ＞Ａ変異を検出する場合には、さらに、本発明による核酸分子をプローブおよび／またはプライマーとして使用する遺伝子型決定法（タイピング法）を用いることもできる。遺伝子型決定法は当業者に公知であり、その操作手順および使用するプローブおよび／またはプライマーの具体的ヌクレオチド配列は、当業者であれば容易に決定することができる。本発明の好ましい実施態様によれば、上記の遺伝子型決定法としては、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法として知られる方法が用いられる。 When detecting the IVS11 + 90G> A mutation in the tau gene, a genotyping method (typing method) using the nucleic acid molecule according to the present invention as a probe and / or primer can also be used. Genotyping methods are known to those skilled in the art, and the procedures for the procedures and the specific nucleotide sequences of the probes and / or primers used can be easily determined by those skilled in the art. According to a preferred embodiment of the present invention, a method known as TaqMan PCR method is used as the genotyping method.
ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法においては、ＩＶＳ１１＋９０Ｇ＞Ａ変異部位のヌクレオチドを含む領域に対して、ＧアレルおよびＡアレルのそれぞれに特異的にハイブリダイズする２種のプローブであって、それぞれ別の蛍光標識物質が５’末端に付され、その蛍光標識に対するクエンチャー（消光物質）が３’末端に付されてなるプローブ（ＴａｑＭａｎプローブ）が用いられ、これらをＰＣＲ反応液中に添加して、被検者由来の核酸試料を鋳型とするＰＣＲ反応を行なう。ＴａｑＭａｎプローブおよびＰＣＲ用のプライマーとしては、本発明による核酸分子を用いることができ、それらの具体的なヌクレオチド配列は、当業者であれば適宜決定することができる。また、２種の蛍光標識物質は、互いに識別可能な組合せであればよく、そのような蛍光標識物質の組合せはそれぞれのクエンチャーとともに当業者に公知のものを用いることができるが、好ましくはＦＡＭとＶＩＣの組合せを用いる。このＰＣＲ反応においては、まず、各アレルにＴａｑＭａｎプローブがハイブリダイズし、プライマーからの伸長反応がそのハイブリダイゼーション領域に到達した際にＴａｑＤＮＡポリメラーゼの作用によって蛍光標識物質が遊離する。遊離した蛍光標識物質はクエンチャーの作用を受けないため、蛍光を発する。従って、この方法によれば、各アレルの存在量に対応する強度の各蛍光を観察することができ、これにより、被検者の遺伝子型（Ｇ／Ｇ、Ｇ／Ａ、またはＡ／Ａ）が容易に決定される。 In the TaqMan PCR method, two types of probes that specifically hybridize to each of the G allele and the A allele with respect to the region containing the nucleotide at the IVS11 + 90G> A mutation site, A probe having a quencher (quenching substance) attached to the end and a quencher (quenching substance) attached to the 3 ′ end is used, and these are added to the PCR reaction solution to obtain the origin of the subject. PCR reaction is performed using the nucleic acid sample as a template. As TaqMan probes and primers for PCR, the nucleic acid molecules according to the present invention can be used, and their specific nucleotide sequences can be appropriately determined by those skilled in the art. The two kinds of fluorescent labeling substances may be any combination that can be distinguished from each other, and such a combination of fluorescent labeling substances can be used together with each quencher, and those known to those skilled in the art can be used. And a combination of VICs. In this PCR reaction, the TaqMan probe is first hybridized to each allele, and when the extension reaction from the primer reaches the hybridization region, the fluorescently labeled substance is released by the action of Taq DNA polymerase. Since the released fluorescent labeling substance is not affected by the quencher, it emits fluorescence. Therefore, according to this method, each fluorescence having an intensity corresponding to the abundance of each allele can be observed, whereby the genotype of the subject (G / G, G / A, or A / A) Is easily determined.
本発明による予測法において、タウ遺伝子におけるＩＶＳ１１＋９０Ｇ＞Ａ変異が検出されたと評価された男性被験者由来のサンプルは、若年性アルツハイマー病が発症する可能性が高いものと判断され、従って、そのリスクがあるものと予測される。また、本発明によれば、出生前および出生直後の診断も可能である。 In the prediction method according to the present invention, a sample derived from a male subject evaluated as having detected an IVS11 + 90G> A mutation in the tau gene is judged to have a high possibility of developing juvenile Alzheimer's disease and is therefore at risk. Expected. Further, according to the present invention, it is possible to diagnose before birth and immediately after birth.
以上のようなアルツハイマー病の発症のリスクの予測のために、必要な試薬をまとめてキットとすることができる。従って、本発明によるキットは、本発明による核酸分子および／または本発明によるプライマーペアを含んでなる。本発明によるキットはさらに、タウ遺伝子におけるＩＶＳ１１＋９０Ｇ＞Ａ変異を検出するための具体的方法に応じて、試薬類、反応容器、説明書等を含んでいてもよい。 In order to predict the risk of developing Alzheimer's disease as described above, necessary reagents can be combined into a kit. Thus, a kit according to the invention comprises a nucleic acid molecule according to the invention and / or a primer pair according to the invention. The kit according to the present invention may further contain reagents, reaction vessels, instructions, etc., depending on the specific method for detecting the IVS11 + 90G> A mutation in the tau gene.
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら制限されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
例１：タウ遺伝子中の多型の探索およびその多型とアルツハイマー病との関連
本研究では、アルツハイマー病患者８７４人（発症年齢幅：４２〜９１歳、発症年齢平均±ＳＤ：７０．０±８．８歳、日本人、性別：男性３０５人；女性５６９人）および健常対照６７８人（年齢幅：３３〜９１歳、年齢平均±ＳＤ：６７．０±１０．１歳、日本人、性別：男性２７４人；女性４０４人）を調査の対象とした。アルツハイマー病患者は、ＮＩＮＣＤＳ−ＡＤＲＤＡ診断基準に従ってアルツハイマー病と診断された患者である。健常対照は患者の配偶者であり、ＭＭＳＥ（Mini-Mental State Examination）により知的正常であることを確かめられた健常者である（スコア＞２５）。研究に先立ち、上記の患者および健常者の全員からインフォームドコンセントを書面で取得し、さらに、これらの患者および健常者から得た試料を匿名化した。
Example 1: Search for polymorphism in tau gene and its association with Alzheimer's disease In this study, 874 Alzheimer's disease patients (onset age range: 42-91 years old, onset age mean ± SD: 70.0 ±) 8.8 years old, Japanese, sex: 305 males; 569 females) and 678 healthy controls (age range: 33-91 years old, age mean ± SD: 67.0 ± 10.1 years old, Japanese, gender : 274 men; 404 women). Alzheimer's disease patients are those diagnosed with Alzheimer's disease according to the NINCDS-ADRDA diagnostic criteria. A healthy control is a spouse of a patient, and a healthy person confirmed to be intellectually normal by MMSE (Mini-Mental State Examination) (score> 25). Prior to the study, informed consent was obtained in writing from all of the above patients and healthy individuals, and samples obtained from these patients and healthy individuals were anonymized.
まず、タウ遺伝子中の多型を同定するため、２５人のアルツハイマー患者および２５人の健常対照についてタウ遺伝子の配列決定を行なったところ、次の５つの一塩基多型が見出された：ｃ．８５５Ｃ＞Ｔ（最長のタウアイソフォームのコード配列を示す配列番号２において、第８５５番に位置するヌクレオチド）；ｃ．１３２１Ｃ＞Ｔ（同第１３２１番のヌクレオチド）；ｃ．１７６１Ｇ＞Ａ（同第１７６１番のヌクレオチド）；ｃ．２１８１Ｔ＞Ｃ（同第２１８１番のヌクレオチド）；およびＩＶＳ１１＋９０Ｇ＞Ａ（第１１イントロンのヌクレオチド配列を示す配列番号１において、第９０番に位置するヌクレオチド）。これらの一塩基多型のうち、ｃ．２１８１Ｔ＞ＣおよびＩＶＳ１１＋９０Ｇ＞Ａは公共のデータベース（ＮＣＢＩ ｄｂＳＮＰおよびＩＭＳ−ＪＳＴ ＪＳＮＰ）には登録されておらず、新規な多型と考えられた。 First, to identify polymorphisms in the tau gene, tau gene sequencing was performed on 25 Alzheimer patients and 25 healthy controls, and the following five single nucleotide polymorphisms were found: c . 855C> T (the nucleotide located at position 855 in SEQ ID NO: 2 showing the coding sequence of the longest tau isoform); c. 1321C> T (nucleotide No. 1321); c. 1761G> A (nucleotide No. 1761); c. 2181T> C (the 2181th nucleotide); and IVS11 + 90G> A (the nucleotide located at the 90th in SEQ ID NO: 1 showing the nucleotide sequence of the 11th intron). Of these single nucleotide polymorphisms, c. 2181T> C and IVS11 + 90G> A were not registered in public databases (NCBI dbSNP and IMS-JST JSNP) and were considered novel polymorphisms.
なお、タウ遺伝子中における他の多型は見出されなかった。また、タウ遺伝子の第９イントロン中に存在するSaitohin遺伝子についても多型の探索を行なったが、アルツハイマー病患者１５人および健常対照１５人からの試料においては多型は検出されず、さらに、アルツハイマー病患者１３２人および健常対照１１６人からの試料においてＱ７Ｒ多型は検出されなかった。 No other polymorphism in the tau gene was found. In addition, the polymorphism of the Saitohin gene present in the 9th intron of the tau gene was also searched, but no polymorphism was detected in samples from 15 Alzheimer's disease patients and 15 healthy controls. No Q7R polymorphism was detected in samples from 132 diseased patients and 116 healthy controls.
次いで、１３４人のアルツハイマー病患者および１５８人の健常対照からの試料について、上記多型のタイピングを行なった。タイピングは、以下のプライマーおよび制限酵素を用いる制限断片長多型の検出法に従って行なった。ここで、ｃ．８５５Ｃ＞Ｔ、ｃ．１３２１Ｃ＞Ｔおよびｃ．２１８１Ｔ＞Ｃは制限酵素認識配列の変更を伴わないため、これらのタイピングには人為的に制限酵素認識配列を作出するためのプライマーを用いた。 The polymorphic typing was then performed on samples from 134 Alzheimer's disease patients and 158 healthy controls. Typing was performed according to the following detection method of restriction fragment length polymorphism using primers and restriction enzymes. Where c. 855C> T, c. 1321C> T and c. Since 2181T> C is not accompanied by a change of the restriction enzyme recognition sequence, a primer for artificially generating a restriction enzyme recognition sequence was used for these typing.
タイピングに用いたプライマーおよび制限酵素：
（１）ｃ．８５５Ｃ＞Ｔ：
T809B：5'-AGAGATCCCAGCCTCAGAGCCCCA-3'（配列番号４）；
T809A：5'-CTCCTTCTGCACGTTGGGTGTGA-3'（配列番号５）；
制限酵素：NcoI、
（２）ｃ．１３２１Ｃ＞Ｔ：
T810C：5'-CTCCTGGTAGCTCAGACCCTCTG-3'（配列番号６）；
T810D：5'-TGCCAGTTCGGGAAGTGACAGAAGATACGT-3'（配列番号７）；
制限酵素：SnaBI、
（３）ｃ．１７６１Ｇ＞Ａ：
T11U1：5'-CCACCTGCCTAACCCAGTG-3'（配列番号８）；
T828：5'-CTTCCAGGCACAGCCCTAC-3'（配列番号９）；
制限酵素：MvaI、
（４）ｃ．２１８１Ｔ＞Ｃ：
T810G：5'-ACACGTCTCCACGGCATCTCAGCCA-3'（配列番号１０）；
T810H：5'-AGGGAGGCAGACACCTCGTCAG-3'（配列番号１１）；
制限酵素：MvaI、
（５）ＩＶＳ１１＋９０Ｇ＞Ａ：
T810F：5'-GCTCCCGCAAGTTTCACACTCAAC-3'（配列番号１２）；
T920：5'-GCTGGAACTGCTCCAGACTTC-3'（配列番号１３）；
制限酵素：MboII。
Primers and restriction enzymes used for typing :
(1) c. 855C> T:
T809B: 5′-AGAGATCCCAGCCTCAGAGCCCCA-3 ′ (SEQ ID NO: 4);
T809A: 5′-CTCCTTCTGCACGTTGGGTGTGA-3 ′ (SEQ ID NO: 5);
Restriction enzyme: NcoI,
(2) c. 1321C> T:
T810C: 5′-CTCCTGGTAGCTCAGACCCTCTG-3 ′ (SEQ ID NO: 6);
T810D: 5′-TGCCAGTTCGGGAAGTGACAGAAGATACGT-3 ′ (SEQ ID NO: 7);
Restriction enzyme: SnaBI,
(3) c. 1761G> A:
T11U1: 5′-CCACCTGCCTAACCCAGTG-3 ′ (SEQ ID NO: 8);
T828: 5'-CTTCCAGGCACAGCCCTAC-3 '(SEQ ID NO: 9);
Restriction enzyme: MvaI,
(4) c. 2181T> C:
T810G: 5′-ACACGTCTCCACGGCATCTCAGCCA-3 ′ (SEQ ID NO: 10);
T810H: 5′-AGGGAGGCAGACACCTCGTCAG-3 ′ (SEQ ID NO: 11);
Restriction enzyme: MvaI,
(5) IVS11 + 90G> A:
T810F: 5′-GCTCCCGCAAGTTTCACACTCAAC-3 ′ (SEQ ID NO: 12);
T920: 5′-GCTGGAACTGCTCCAGACTTC-3 ′ (SEQ ID NO: 13);
Restriction enzyme: MboII.
その結果、ｃ．１３２１Ｃ＞ＴにおけるＴアレルの比率は、健常対照では０．４０であり、アルツハイマー病患者では０．４２であった。ｃ．８５５Ｃ＞ＴにおけるＴアレルの比率は、健常対照では０．１８であり、アルツハイマー病患者では０．１６であった。ｃ．１７６１Ｇ＞ＡにおけるＡアレルは、１例の健常対照および４例のアルツハイマー病患者でしか見られなかった。また、ｃ．２１８１Ｔ＞ＣにおけるＣアレルは、１例のアルツハイマー病患者でしか見られなかった。一方で、ＩＶＳ１１＋９０Ｇ＞Ａについてはアルツハイマー病との相関が見られた。 As a result, c. The ratio of T alleles at 1321C> T was 0.40 for healthy controls and 0.42 for Alzheimer's patients. c. The ratio of T allele at 855C> T was 0.18 in healthy controls and 0.16 in Alzheimer's disease patients. c. The A allele at 1761G> A was found only in 1 healthy control and 4 Alzheimer's disease patients. C. The C allele at 2181T> C was found only in one Alzheimer's disease patient. On the other hand, IVS11 + 90G> A was correlated with Alzheimer's disease.
従って、ＩＶＳ１１＋９０Ｇ＞Ａに関し、本研究における調査対象者全員の試料についてタイピングを行なった。また、文献（Wenham P. R. et al., Lancet 337, 1158-1159, 1991）に記載の方法に従って、アポリポプロテインＥ（ＡｐｏＥ）の遺伝子型を調べた。ＩＶＳ１１＋９０Ｇ＞Ａ多型の遺伝子型分布を、ＧＧ型に対するＡアレル（ＡＡ＋ＧＡ対ＧＧ）のχ２Ｐ値およびオッズ比（ＯＲ）とともに以下の表１〜３に示す。 Therefore, for IVS11 + 90G> A, typing was performed on the samples of all survey subjects in this study. In addition, the genotype of apolipoprotein E (ApoE) was examined according to the method described in the literature (Wenham PR et al., Lancet 337, 1158-1159, 1991). The genotype distribution of the IVS11 + 90G> A polymorphism is shown in Tables 1-3 below, along with the χ 2 P value and odds ratio (OR) of the A allele (AA + GA vs. GG) for the GG type.
発症年齢が６５歳未満（若年性アルツハイマー病）の男性患者におけるＩＶＳ１１＋９０Ａアレルの頻度は、年齢および性別を一致させた健常対照に比べて有意に高く（ＯＲ＝２．６５、９５％ＣＩ：１．３０−５．４２）、特に、発症年齢が６０歳未満の男性患者においては、その有意差がさらに顕著であった（ＯＲ＝３．４３、９５％ＣＩ：１．３１−８．９８）。 The frequency of the IVS11 + 90A allele in male patients with age of onset less than 65 years (juvenile Alzheimer's disease) is significantly higher compared to healthy controls matched for age and gender (OR = 2.65, 95% CI: 1. 30-5.42), particularly in male patients whose onset age is less than 60 years, the significant difference was even more pronounced (OR = 3.43, 95% CI: 1.31-8.98).
次いで、これらのアレルの発症年齢に対する影響を調べたところ、若年性アルツハイマー病男性患者において、ＧＧ型とＡＡ型との間で、発症年齢に有意差が認められた（ＧＧ型：５９．５±３．８歳、ＡＡ型：５５．１±３．８歳、ｔ検定Ｐ＝０．０２１）。 Next, when the influence of these alleles on the onset age was examined, a significant difference was observed in the onset age between GG type and AA type in male patients with juvenile Alzheimer's disease (GG type: 59.5 ±). 3.8 years old, AA type: 55.1 ± 3.8 years old, t-test P = 0.021).
さらに、若年性アルツハイマー病男性患者におけるＡアレルの頻度は、老年性アルツハイマー病（６５歳以上で発症）の男性患者に比べて有意に高かった（χ２Ｐ＝０．０２５）。一方で、６５歳未満の男性健常対照と６５歳以上の男性健常対照との間では、このような有意差は見られなかった（χ２Ｐ＝０．２９９）。 Furthermore, the frequency of A allele in male patients with juvenile Alzheimer's disease was significantly higher than that of male patients with senile Alzheimer's disease (onset at age 65 and older) (χ 2 P = 0.025). On the other hand, such a significant difference was not observed between male healthy controls under 65 years old and male healthy controls over 65 years old (χ 2 P = 0.299).
以上の結果から、ＩＶＳ１１＋９０Ａアレルは、男性の若年性アルツハイマー病についてのリスクファクター（危険因子）であることが明らかとなった。 From the above results, it was revealed that the IVS11 + 90A allele is a risk factor (risk factor) for male juvenile Alzheimer's disease.
また、ＡｐｏＥ遺伝子型について分析したところ、ε４アレルの有無に関するオッズ比（ＯＲ）は、全試料においては３．５３（９５％ＣＩ：２．８０−４．４３）、若年性アルツハイマー病の男性患者においては２．６３（９５％ＣＩ：１．２６−５．５０）であり、予想通りの結果となった。さらに、若年性アルツハイマー病の男性患者を、ε４アレルの有無に関して二つの群に分けた場合（ε４アレルを有する３３人の患者と、これを有さない５３人の患者）、両群の間でＩＶＳ１１＋９０Ａアレルの頻度に有意差は見られなかった（χ２＝１．１３、Ｐ＝０．２８８）。従って、ＩＶＳ１１＋９０Ｇ＞Ａの効果は、ＡｐｏＥの状態とは関連しないものと考えられる。 In addition, when analyzed for the ApoE genotype, the odds ratio (OR) for the presence or absence of the ε4 allele was 3.53 (95% CI: 2.80-4.43) in all samples, and male patients with juvenile Alzheimer's disease Was 2.63 (95% CI: 1.26-5.50), which was an expected result. In addition, when male patients with juvenile Alzheimer's disease were divided into two groups for the presence or absence of the ε4 allele (33 patients with the ε4 allele and 53 patients without it), There was no significant difference in the frequency of the IVS11 + 90A allele (χ 2 = 1.13, P = 0.288). Therefore, it is considered that the effect of IVS11 + 90G> A is not related to the state of ApoE.
以上のように、ＩＶＳ１１＋９０Ａアレルは、男性の若年性アルツハイマー病についてのリスクファクターであることが明らかとなったが、アルツハイマー病と同様にタウ蛋白の異常蓄積を伴う疾患、例えば、石灰沈着を伴うびまん性神経原繊維変化病（diffuse neurofibrillary tangles with calcification）、辺緑系神経原繊維変化痴呆（limbic neurofibrillary tangle dementia）、パーキンソン痴呆コンプレックス（Parkinson-dementia complex）等の神経原繊維変化型痴呆（dementia with neurofibrillary tangles）、および進行性核上性麻痺（progressive supranuclear palsy）、皮質基底核変性症（corticobasal degeneration）、第１７番染色体に連鎖する前頭側頭型痴呆パーキンソニズム（frontotemporal dementia with parkinsonism linked to chromosome 17）等のグリアタングル型痴呆（dementias with glial tangles）など、についてのリスクファクターとして使用できる可能性も高いものと考えられる。 As described above, the IVS11 + 90A allele has been clarified to be a risk factor for male juvenile Alzheimer's disease. Like Alzheimer's disease, a disease accompanied by abnormal accumulation of tau protein, for example, diffuse with calcification Neurofibrillary tangles (diffuse neurofibrillary tangles with calcification), limbic neurofibrillary tangle dementia, Parkinson dementia complex, etc. dementia with neurofibrillary tangles), progressive supranuclear palsy, corticobasal degeneration, frontotemporal dementia with parkinsonism linked to chromosome 17 Such as dementias with glial tangles Potential use as a risk factor for also considered high.
Claims (11)
請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなる、核酸分子。 A nucleic acid molecule capable of detecting a mutation of a guanine (G) residue located at the 90th position of the 11th intron to an adenine (A) residue in a human tau gene,
A nucleic acid molecule comprising a nucleotide fragment that hybridizes to the polynucleotide of any one of claims 1 to 3 or a polynucleotide complementary thereto.
請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドの、前記遺伝子の第１１イントロンの第９０番目に位置するヌクレオチド残基に対応するアデニン（Ａ）残基を含む領域を核酸増幅法において増幅することができる、プライマーペア。 A primer pair capable of detecting a mutation of a guanine (G) residue located at the 90th position of the 11th intron to an adenine (A) residue in the human tau gene,
A region containing an adenine (A) residue corresponding to the nucleotide residue located at the 90th position of the 11th intron of the gene of the polynucleotide according to any one of claims 1 to 3, in the nucleic acid amplification method Primer pairs that can be amplified.
請求項４〜７のいずれか一項に記載の核酸分子、および／または請求項８もしくは９に記載のプライマーペアを用いて、ヒトタウ遺伝子における、第１１イントロンの第９０番目に位置するグアニン（Ｇ）残基のアデニン（Ａ）残基への変異を検出する工程を含んでなる、方法。 A method for predicting the risk of developing juvenile Alzheimer's disease in men by detecting a mutation in the human tau gene,
Using the nucleic acid molecule according to any one of claims 4 to 7 and / or the primer pair according to claim 8 or 9, a guanine located at the 90th position of the 11th intron in the human tau gene (G ) Detecting a mutation of a residue to an adenine (A) residue.
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