JP2005062178A - 酸素感知粒子のマイクロカプセル化 - Google Patents
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Abstract
【課題】 親水性の環境でシグナルを減少させず、より多用途で応答性のよい酸素感知粒子を提供すること。
【解決手段】 本発明は、コアおよびコアを取り囲む疎水性コーティング材料を含む複合物に関する。コアは少なくとも1種の酸素感知粒子を含む。本発明はまた、前記のマイクロカプセル化された酸素感知粒子を用いて、試料中の酸素を検出およびモニターする方法にも関する。
【選択図】 図1a
【解決手段】 本発明は、コアおよびコアを取り囲む疎水性コーティング材料を含む複合物に関する。コアは少なくとも1種の酸素感知粒子を含む。本発明はまた、前記のマイクロカプセル化された酸素感知粒子を用いて、試料中の酸素を検出およびモニターする方法にも関する。
【選択図】 図1a
Description
本発明は、コアおよび該コアを取り囲む疎水性コーティング材料を含む複合物に関する。コアは少なくとも1種の酸素感知粒子を含む。本発明はまた、マイクロカプセル化酸素感知粒子を用いる、試料中の酸素の検出方法およびモニター方法にも関する。
蛍光染料を用いる細胞内のDNAの測定、細胞の代謝の測定、あるいは、細胞の直接計測のような細胞成長をモニターする慣用の方法は、侵襲性で、破壊的であり、再現性のない値となり得る。これらの終点分析は労働集約的であり、異なる試料が各測定時に必要とされるので、試料の条件としては高価となる。したがって、終点分析は、大量に処理する方法において、経時的に細胞成長をモニターすることには有用ではない。
細胞培養の経過に対する別の手法は、酸素センサーの使用を伴う。これらの装置は、細胞培養における細胞成長をモニターする効果的な方法を提供する。酸素センサーは細胞代謝を直接測定し、それが細胞成長の間接的な目安を与える。固体蛍光系酸素センサーは非常に感度がよく、選択性が高く、また価格が手ごろである。酸素センサーは、細胞培養における細胞成長の、非侵襲性のリアルタイム測定を提供することができる。
典型的には、酸素センサーは、照射により強い発光を示す蛍光染料結晶に基づいている。蛍光染料結晶の発光性は酸素により効果的に消光され得る。これが周囲の酸素分圧に直接関連する発光シグナルの変化をもたらす。有機ルテニウム(II)錯体は、大きい量子収量の発光、高い選択性、優れた光安定性、および比較的長い寿命のために、汎用的な酸素感知染料である。しかし、親水性環境では、これらの酸素感知粒子の応答は、完全に消失しないとしても、大幅に低下する。
親水性環境で感度が低下するというこの問題を克服するために、酸素感知粒子は疎水性ポリマー流体中に分散され、次に、マイクロタイターウェルの底のような平らな表面(「スラブ」)上に硬化される。しかし、この種のスラブ形状は、酸素の変化にあまり応答しない。さらに、この種のスラブ形状は、ヒドロゲルのような3次元の細胞培養の環境での使用には向いていない。
このように、親水性の環境でシグナルを減少させず、より多用途で応答性のよい酸素感知粒子が求められている。
本発明は、コアおよび該コアを取り囲む疎水性コーティング材料を含む複合物に関する。コアは少なくとも1種の酸素感知粒子を含む。本発明はまた、マイクロカプセル化酸素感知粒子を用いる、試料中の酸素の検出方法およびモニター方法にも関する。
本発明は、コアおよび該コアを取り囲む疎水性コーティング材料を含み、試料中の酸素を検出およびモニターするための複合物に関する。コアは少なくとも1種の酸素感知粒子を含む。コアは少なくとも1種の酸素感知粒子を含むが、コアはまた、2種以上の酸素感知粒子を含んでもよい。これらの酸素感知粒子は、疎水性コーティング材料によりマイクロカプセル化され、それによりマイクロカプセル化酸素感知粒子(MOSP)を形成する。
本明細書で使用されるとき、「酸素感知粒子」は、酸素の存在下または不在下で検出可能なシグナルを発する、または発生させる化学的要素である。本明細書で使用されるとき、「粒子」、「顆粒」および「結晶」という用語は、交換可能なものとして用いられる。本発明の一実施形態では、コアを構成する前記の少なくとも1種の粒子は発光性である。典型的には、これに限定はされないが、分光光度計のような装置を介して、あるいは介さずに、発光性酸素感知粒子から発生した、または発したシグナルを検出することができる。
酸素の存在は、電子が基底状態に戻る速度を変える。その結果、発光団のその一時的な活性を観測することにより酸素濃度を求めることが可能である。平均減衰時間(t)と酸素濃度[O2]との間の関係はまた、Stern−Volmerの式:
[O2]=(t0/t−1)・1/KSV
により表され(理想的な場合)、ここで、KSVはStern−Volmer定数であり、t0は酸素がない場合の発光減衰時間である。
[O2]=(t0/t−1)・1/KSV
により表され(理想的な場合)、ここで、KSVはStern−Volmer定数であり、t0は酸素がない場合の発光減衰時間である。
本発明の別の実施形態では、発光性酸素感知粒子から発せられる光のシグナルは、酸素の存在下で減少させられる。したがって、本発明の特定の一実施形態では、例えば細胞培養で通常見出される濃度(一般的に0.4%)の酸素に曝すことによって、発光性酸素感知複合物からの光のシグナルが消失させられ得る。本明細書で使用されるとき、「阻害量の酸素」は、検出可能な酸素がまったく存在しない場合に生じるシグナルに比べて、検出可能なシグナルを減少させる酸素レベルである。検出可能なシグナルの減少は、部分的、あるいは全部であり得る。
当技術分野において理解されているように、「発光性粒子」は、その粒子へのエネルギーの適用によって、光エネルギーを発することができる粒子である。本明細書で使用されるとき、「発光」には、これらに限定されないが、蛍光、時間分解蛍光、蛍光寿命、光ルミネセンス、燐光、化学ルミネセンス、生物ルミネセンス、エレクトロルミネセンス、放射線ルミネセンス、摩擦ルミネセンス、熱ルミネセンスおよび光誘導ルミネセンスが含まれる。
発光性酸素感知粒子の例には、これらに限定はされないが、トリス−4,7−ジフェニル−1,10−フェナントロリンルテニウム(II)の塩、トリス−2,2’−ビピリジル−ルテニウム(II)の塩、トリス−1,7−ジフェニル−1,10−フェナントロリンルテニウム(II)の塩、および9,10−ジフェニルアントラセンが含まれる。発光性粒子はまた、白金(II)オクタエチルポルフィリン錯体、パラジウム(II)オクタエチルポルフィリン錯体、パラジウム−メソ−テトラ(4−カルボキシフェニル)ポルフィン、パラジウム−メソ−テトラ(4−カルボキシフェニル)ポルフィリンデンドリマーおよびパラジウム−メソ−テトラ(4−カルボキシフェニル)テトラベンゾポルフィリンデンドリマーを含むことができる。
トリス−4,7−ジフェニル−1,10−フェナントロリンルテニウム(II)の塩の例には、これらに限定はされないが、トリス−4,7−ジフェニル−1,10−フェナントロリンルテニウム(II)ジクロライドペンタハイドレート、トリス−4,7−ジフェニル−1,10−フェナントロリンルテニウム(III)トリクロライド、トリス−4,7−ジフェニル−1,10−フェナントロリンルテニウム(II)ジパークロレートおよびトリス−4,7−ジフェニル−1,10−フェナントロリンルテニウムヘキサフルオロホスフェートが含まれる。
トリス−2,2’−ビピリジル−ルテニウム(II)の塩の例には、これに限定はされないが、トリス−2,2’−ビピリジル−ルテニウム(II)クロライドヘキサハイドレートが含まれる。
トリス−1,7−ジフェニル−1,10−フェナントロリンルテニウム(II)の塩には、これに限定はされないが、トリス−1,7−ジフェニル−1,10−フェナントロリンルテニウム(II)ジクロライドが含まれる。
本発明の複合物では、酸素感知粒子のコアは、そのコアを取り囲む疎水性コーティング材料でコートされる。疎水性コーティング材料により、マイクロカプセル化された酸素感知粒子(MOSP)が作り出される。疎水性コーティング材料は、酸素感知粒子により発生されるシグナル、または発せられるシグナルを妨げる可能性のある親水性環境から、酸素感知粒子を保護しようとするものである。疎水性コーティング材料はまた、本発明の複合物のコアにある酸素感知粒子が依然として酸素を検出することができるように、酸素透過性または半透過性でもあるべきである。したがって、酸素透過性または半透過性である疎水性コーティング材料は何れも、本明細書に記載される本発明の意図される範囲内に十分に入る。
本明細書で使用されるとき、「疎水性コーティング材料」は、親水性環境に容易には溶解しない種類の要素である。本発明の状況では、親水性物質がコーティング材料に入り込むことができず、かつ、酸素感知粒子に到達できないように、コーティングによって、酸素感知顆粒または粒子が取り囲まれ、カプセル化されるべきである。
本発明の一実施形態では、疎水性コーティング材料は、ポリマーまたはデンドリマーである。「ポリマー」および「デンドリマー」という用語は、当業者がこれらの用語を理解するように使用される。疎水性コーティングのポリマーの例には、これらに限定はされないが、官能基化ポリジメチルシロキサン、シリコーンゴム、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)、ポリスチレン、および鉱油が含まれる。具体的なコーティング材料の例には、これらに限定はされないが、2液型白金硬化性ビニル官能基化ポリジメチルシロキサン、ヒドリド官能基化ポリジメチルシロキサン、アルコキシル官能基化ポリジメチルシロキサンおよびアセトキシル官能基化ポリジメチルシロキサンが含まれる。
具体的には、官能基化ポリジメチルシロキサンには、これらに限定はされないが、ビニル官能基化ポリジメチルシロキサン、ヒドリド官能基化ポリジメチルシロキサン、アルコキシル官能基化ポリジメチルシロキサンおよびアセトキシル官能基化ポリジメチルシロキサンが含まれる。
別の実施形態では、MOSPのコアは担体分子をさらに含む。一実施形態では、担体分子は、酸素感知粒子と混合される分子である。この実施形態では、担体および酸素感知粒子を単に混合することができ、そして、この顆粒状混合物に疎水性コーティング材料を添加することができる。別の実施形態では、担体および酸素感知粒子は互いに接着するであろう。この実施形態では、酸素感知粒子の担体への接着は、これらに限定されないが、吸着、共有結合、非共有結合、イオン結合、水素結合、極性力、および金属結合を含む、如何なる手段にもよることができる。担体分子の例には、これらに限定されないが、シリカおよびポリスチレンが含まれる。
さらに、本発明の複合物で使用される担体分子自体を変性することができる。変性には、これらに限定はされないが、例えばシリカ粒子担体の表面に共有結合される長鎖炭化水素を結合すること、または接着することが含まれる。長鎖炭化水素は、担体をより疎水性にするのに十分な数の炭素を含み得る。例えば、C18はシリカ粒子と共によく機能する。シリカ粒子上に共有結合されるC18を有するシリカ粒子は、鉱油でさらにコートされ得る。この鉱油は、酸素濃度に対する速い応答と高い感度とを示している。疎水性の長鎖炭化水素に共有結合したシリカ粒子は市販されている。
本発明のさらに別の実施形態では、1種または複数の追加のコーティングを適用し、MOSPをカプセル化することができる(カプセル化MOSP)。本明細書で使用されるとき、「MOSP」は、MOSPに加えて、カプセル化MOSPを意味するように使用される。コーティングの追加の層は、コアの酸素感知粒子の周りに同心のコーティングを形成するであろう。追加の層のコーティング材料は、それらが酸素透過性であれば、性質は疎水性または親水性であり得る。さらに、これらの追加の層は、順に、酸素感知コア粒子をカプセル化している最初の疎水性コーティング材料をカプセル化するべきである。
さらに別の実施形態では、本発明の複合物はマトリックスをさらに含むことができる。本明細書で使用されるとき、「マトリックス」は、固体または半固体の構造であって、マトリックス上またはその中にMOSPを組み入れることができる。固体のマトリックスの例には、これらに限定はされないが、ガラス、ナイロン、プラスチック、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリメタクリレート、ポリ塩化ビニルおよびラテックスが含まれる。
半固体のヒドロゲルマトリックスの例には、これらに限定はされないが、アガロース、イオン架橋したアルギネート、変性アルギネート(非特許文献1に記載されるもの、この文献は参照として本明細書に組み込まれる)、セルロース、デキストラン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルデキストラン、コラーゲン、マトリゲル(matrigel)、ヒアルロン酸、変性ヒアルロン酸、ポリアクリルイミド、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリビニルアルコール(PVA)およびポリメチルメタクリレート(PMMA)、ならびにこれらの組合せが含まれる。本明細書で使用されるとき、「ヒドロゲル」は、水と、溶解、分散、および/または架橋したポリマーとから構成される半固体の複合物を指す。
また、ヒドロゲルマトリックスは、さらに処理されていることも、処理されていないこともあり得る。ヒドロゲルマトリックスのさらなる処理の例には、これらに限定はされないが、凍結乾燥、乾燥、溶脱、遠心分離または紡糸(spinning)が含まれる。ヒドロゲルマトリックスの他の製造または変性方法は、2002年9月30日に出願された特許文献1に開示されており、この特許は、ここで参照として組み込まれる。
本発明の別の実施形態では、細胞培養および組織工学のための、いわゆる3次元マトリックス(3Dマトリックス)内、またはその上にMOSPを配置することができる。例えば、MOSPを、マトリックスの合成段階でマトリックス内に配置することができる。さらに、MOSPをヒドロゲル溶液に添加または分散させてもよく、次に、それを架橋して凍結乾燥し、細胞培養のためのMOSPを含む3Dマトリックスが作られる。あるいはまた、MOSPを、単独で、あるいは、マトリックスで培養される細胞と共に、マトリックス内、またはその上に接種してもよい。マトリックス上で培養することができる細胞の種類には、これらに限定はされないが、動物、植物、菌類、細菌および酵母菌の細胞が含まれる。動物の細胞には、これに限定はされないが、昆虫、哺乳類の細胞が含まれる。哺乳類の細胞の例には、これらに限定はされないが、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ラット、マウス、アレチネズミ、モルモット、ヒトおよびヒト以外の霊長類が含まれる。
3Dマトリックスの合成段階の間に、例えば、MOSPをマトリックスに適するポリマーの溶液に分散させることができる。次に、ポリマー溶液は、3Dマトリックスに変えられ、MOSPがその中に埋め込まれる。さらに、ポリマーに応じて、単に溶液、例えばアガロース溶液を冷却することにより、アルギネートのイオン架橋により、アルギネートおよびヒアルロン酸のようなポリイオン分子を含む溶液のpHを変えることにより、または、例えばアルギネートもしくはヒアルロン酸溶液のような別のポリマー分子の共有結合による架橋により、PVAのためのような溶液の凍結−融解により、または、溶剤/非溶剤処理のような他の相分離事象により、3Dマトリックスの変換を達成することができる。これらの半固体の3Dマトリックスを、さらに凍結乾燥し、連続気泡(open pore)の3Dマトリックスを作り出すことができる。マトリックスの追加の変性には、これに限定はされないが、ヒドロゲルマトリックスのポリマーを繊維にすることが含まれ、該繊維を、3次元構造に、あるいは3次元構造上に容易に組み立てることが可能なようにする。
生物作用(bioaffecting)分子を適当なポリマー溶液に添加することにより、その分子でマトリックス自体をまた変性することができる。本明細書で使用されるとき、「生物作用分子」は、培養細胞に影響を与える分子である。例えば、生物作用分子は、マトリックスへの培養細胞の細胞付着性を促進することができる。一例として、細胞付着性を促進する生物作用分子には、これらに限定はされないが、コラーゲン、フィブロネクチン、およびラミニンのような細胞外マトリックス(ECM)分子が含まれるであろう。生物作用分子の他の例には、これらに限定はされないが、細胞運動、細胞成長、細胞分裂、および/または細胞分化に影響を与えることができる、小分子の有機物、ペプチド、化学走性分子または細胞シグナル分子が含まれる。生物作用分子と共に、もしくはそれなしで、マトリックス内に、もしくはマトリックス上に、MOSPを組み入れることができ、これによって、MOSPが、細胞成長、細胞分裂、あるいは細胞分化などの状態のためのモニターとして役立つであろう。
実際、マトリックス内、またはマトリックス上にMOSPを配置することにより、マトリックス内で培養される細胞に近接してMOSPが置かれて、該MOSPが、リアルタイムで細胞の呼吸状態をモニターするのに役立ち得るようになる。細胞の成長に影響しないマトリックス上に、細胞を接種して成長させることができる。3Dマトリックスに埋め込まれたMOSPの発光特性を、リアルタイムで光学的に、モニターし、測定し、または検出することができる。例えば、MOSPの蛍光強度の変化を、例えば、共焦点顕微鏡のような顕微鏡またはELISAプレートリーダーによりモニターすることができる。
したがって、本発明のMOSPは、これらに限定はされないが、細胞培養、アポトーシスアッセイ、細胞分裂アッセイおよび細胞成長アッセイを含む、様々な状況における酸素の利用、生成または消費をモニターするのに有用である。本明細書に記載されるMOSPの他の使用には、特許文献2および特許文献3、特許文献4および特許文献5(これらはすべて、それらの全体をここで参照として組み込まれる)に記載されるアッセイが含まれる。
さらなる使用には、これに限定はされないが、バイオセンサー付きスクリーニングアッセイの一部分として酸素センサーを使用することが含まれる。実際、本発明のMOSPを、本明細書に記載されるように、マトリックス内に点在させて、細胞代謝をベースとするバイオセンサーを提供することができる。MOSPを含む3Dマトリックスを、例えば、薬剤または毒素のスクリーニングをするために使用することができるであろう。したがって、本発明の一実施形態では、3Dマトリックス上、またはその中のMOSPは、特定の刺激、例えば、薬剤、毒素、ウイルス、細菌細胞または他の細胞もしくは化合物に応じた細胞の酸素消費をモニターするために使用されるであろう。例えば、如何なる刺激の付加もない、本発明のマトリックス上の細胞培養は、本発明のMOSPにより生じる蛍光の量により測定されるような、酸素利用特性の基準を確定するであろう。酸素利用特性が特定の刺激に応じて変化することであったならば、酸素利用特性の変化は細胞代謝の変化を示すであろう。酸素利用特性の変化には、検出可能量の増加または減少が含まれるであろう。このバイオセンサー付きアッセイを、生物テロ薬剤または化学テロ薬剤のような未知の薬剤、あるいは新しい、もしくは変性された創薬化合物(modified drug discovery compounds)を試験するために使用できるであろう。該バイオセンサーによって、いずれのタイプのアッセイにおいて、高処理量のアッセイが使用できるであろう。
マトリックスを、例えば、ガラスもしくはプラスチック製のスライド、培養皿もしくは培養瓶の上に、またはアレイの一部分として、配置することができるであろう。したがって、本発明は、2種以上の化合物または刺激を同時に試験するために使用され得るアレイを意図する。例えば、本発明のアレイは、1種または複数の異なる種類の3Dマトリックスを含み得る。創薬の用途では、例えば、アレイは、異なる多様な細胞型に適すると思われるいくつかのマトリックスを含み得る。このような状況では、1種類の薬剤、化合物、毒素などを、アレイで培養される種々の細胞型に適用することができる。次いで、使用者は、酸素利用特性をモニターして、その刺激に対してどの細胞型が作用を受けやすいかを決めるであろう。同様に、マトリックス上、もしくはその中に同じ細胞型を配置し、そして、異なる化学薬品、化合物、毒素、または刺激を同時にその細胞に適用して、どの刺激がその細胞に影響を及ぼしたかを決めることができるように、アレイは同種のマトリックスからなってもよい。細胞型の遺伝子の相違が、酸素利用速度の違いを与える状況、例えば肝細胞において、このアレイは有用であろう。したがって、該アレイを用いて、例えば肝細胞のどの遺伝子構成が特定の刺激に多少とも影響を受けやすいかを、酸素利用特性によって明らかにされるような代謝に基づいて決めることができるであろう。
したがって、本発明は、MOSPにより生じるシグナルの強度を少なくとも1つの時点で測定することを含む、試料中の酸素を検出する方法を提供する。一実施形態では、発生するシグナルは、複数の時点で、すなわち2つ以上の時点で測定され得る。酸素消費または生成をモニターする方法として、複数の時点で得られる測定値を、互いに比較するか、あるいは基準測定値と比較することができる。例えば、酸素は、使用者がモニターしたいと思う特定の化学反応で発生され得る。同様に、使用者は、例えば特定の刺激に応じての、様々な時点での培養細胞の酸素消費をモニターしたいと思うであろう。
本明細書で使用されるとき、試料は様々な環境中に存在し得るか、あるいは様々な環境から得られ得る。試料は環境の一部分であっても、あるいは環境全体であってもよい。環境には、これらに限定はされないが、細胞培養の環境のような水性もしくは液体の環境、水(水の純度の検出用)、濃縮空気試料、あるいは化学反応が含まれ、これらに対してMOSPは直接添加される。さらなる環境には、これらに限定はされないが、細胞培養3Dマトリックス、動物の体液、湖、川、海、公営の上水道などが含まれる。環境は、in vivo、in vitroあるいはin situであってもよい。
本明細書で使用されるとき、「動物」という用語は、脊椎動物を意味するように使用される。一実施形態では、脊椎動物は哺乳動物である。別の実施形態では、哺乳動物は、ヒトまたはヒトでない霊長類である。本明細書では、「被験者」、「患者」および「動物」という用語は、交換可能なものとして使用される。さらに、本明細書で使用されるとき、「体液」には、これらに限定されないが、血液、血漿、血清、唾液、脳脊髄液、滑液、尿、胆汁および糞便が含まれる。
本発明はまた、疎水性コーティングも酸素感知粒子も容易には溶解しない液体に、酸素感知粒子および疎水性コーティング材料を分散させること、該混合物を攪拌すること、次いで該混合物から液体を除去すること、および、得られた粉末を乾燥させることを含む、MOSPの製造方法を提供する。一実施形態では、担体分子もまた、本発明のMOSP製造方法に組み入れることができる。
図1は、酸素濃度変化に対するルテニウム染料吸着シリカゲル粒子の酸素応答を示す図である。図1aでは、ビーズの懸濁液を、ピペットで96ウェルプレートのウェルに移した。100μlの水を各ウェルに加え、蛍光を測定した。次に、0.2MのNa2SO3水溶液100μlを各ウェルに加え、蛍光を経時的に測定した。亜硫酸ナトリウムが酸素と反応して硫酸ナトリウムを生成し、このために局所的酸素濃度が減少させられ、増加した蛍光強度をもたらした。データは、鉱油でビーズをコーティングすることにより、ルテニウム染料吸着シリカゲル粒子の酸素の応答性が保持されたことを示している。図1bは、共有結合される炭化水素鎖で被覆されたシリカゲル粒子を酸素感知ルテニウム染料で含浸させて、追加の鉱油処理なしに酸素に応答する粒子を作り出すことができることを示している。これらの粒子の応答は、シリコーンゴムでコートされた粒子より速い。鉱油コートシリカはまた、シリコーンゴムでコートされた粒子より素早く応答することに注意されたい。
図2はシリコーンゴムカプセル化酸素感知粒子の顕微鏡写真である。
図3は、本発明のMOSPの酸素変化に対する応答性を示している。図3aは、共有結合したアルギネートヒドロゲルに埋め込まれたMOSPを示し、そして亜硫酸ナトリウムの存在下その蛍光の劇的な変化を示している。図3bは、凍結乾燥されたヒドロゲルはまた、非常に類似した蛍光の変化を示すが、ヒドロゲル系マトリックスより一層速い速度論を示している。図3cは、亜硫酸の添加に対するMOSPのほぼ即時の応答を示しており、この蛍光の変化は、標準的なPDMSポリマーマトリックスで実施された場合、数時間かかるであろう。したがって、速度論は、ヒドロゲルおよび凍結乾燥ヒドロゲルに埋め込むことにより著しく増大する。
図4は、フィブロネクチンで細胞成長を支持するために変性された3D土台(scaffold)内に埋め込まれたマイクロカプセル化酸素感知粒子を示す。細胞成長を支持することを予め示した10%血清含有培地で、MC3T3骨芽細胞を培養した。細胞の成長および細胞の維持(休止)をモニターすることができ、かつ、蛍光の読み取りに伴い、毒素物質(例えば、アジ化ナトリウム)を添加することにより細胞代謝の変化を迅速に検出できることを、この図は示している。図4aは、蛍光により測定されるような、MC3T3細胞の成長速度を示している。図4bでは、細胞代謝の知られている阻害剤を、0時間から約192時間後にMC3T3培養液に添加した。その後の蛍光の減少は、本発明の複合物が細胞代謝をモニターするのに有用であることを示している。
図5は、本発明の複合物を含む可能なアレイの例を示している。酸素感知能力を有し、かつ、何らかの相違がある細胞(異なる腫瘍の型、異なる遺伝子構成、異なる毒素に対する感受性)を含む土台のアレイを、複数の薬剤または薬剤候補物をスクリーニングするために使用することができ、あるいはまた、同じ薬剤または薬剤候補物に対するスクリーニングする異なる細胞の型の応答に使用してもよい。
本明細書に示した実施例は例示のためだけのものであり、本明細書に記載される要旨の範囲を制限しようとするものではない。
担体(ポリスチレンビーズ)上の酸素感知粒子の調製
パート1−酸素感知ビーズの調製
ポリスチレンビーズ上のルテニウム染料結晶、ルテニウム(II)−トリス−(4,7−ジフェニル−1,10−フェナントロリン)ジパークロレート(Ru(PDD)3)(染料)を、以下のようにして調製した。
パート1−酸素感知ビーズの調製
ポリスチレンビーズ上のルテニウム染料結晶、ルテニウム(II)−トリス−(4,7−ジフェニル−1,10−フェナントロリン)ジパークロレート(Ru(PDD)3)(染料)を、以下のようにして調製した。
直径が105〜125μmのポリスチレンビーズ(Polyscience)26.8mgを秤量し、350μlのメタノールに懸濁させた。18.06mgのs−(4,7−ジフェニル−1,10−フェナントロリン)ルテニウム(II)ジパークロレートを秤量し、1mlのメタノールに加えて18mg/ml(原料A)とし、メタノールで1:5(原料B)および1:25(原料C)に希釈した。100μlのビーズ懸濁液を同じ容積の原料A、BまたはCと混合して、それぞれ9mg/ml、1.8mg/ml、および0.4mg/mlの染料の最終濃度をもたらした。懸濁液を50℃に保ち時々混合した。次に、マイクロ遠心機により、ビーズをメタノールで1〜2回洗浄し、次に水で2回洗浄した。
パート2−ビーズによる酸素消失の検出
酸素に対する応答を試験するために、ビーズ懸濁液をピペットで96ウェルプレートのウェルに移した。100μlの水を各ウェルに加え、蛍光を測定した。次に、0.2MのNa2SO3水溶液100μlを各ウェルに加え、蛍光を経時的に測定した。亜硫酸ナトリウムが酸素と反応して硫酸ナトリウムを生成し、このために、局所的酸素濃度が減少させられ、その結果、増加した蛍光強度をもたらした。
酸素に対する応答を試験するために、ビーズ懸濁液をピペットで96ウェルプレートのウェルに移した。100μlの水を各ウェルに加え、蛍光を測定した。次に、0.2MのNa2SO3水溶液100μlを各ウェルに加え、蛍光を経時的に測定した。亜硫酸ナトリウムが酸素と反応して硫酸ナトリウムを生成し、このために、局所的酸素濃度が減少させられ、その結果、増加した蛍光強度をもたらした。
全部で3種の濃度の染料結晶を有する全ビーズは、経時的に蛍光シグナルの穏やかな増加を示した。しかし、9mg/mlの染料結晶を有する原料Aは、最も大きな応答を示した。
パート3−アガロースマトリックス内の酸素感知粒子の観察
センサービーズを、新しい96ウェルプレートのアガロース中にさらに埋め込んだ。最初に、50%の懸濁液とするために、ビーズ懸濁液を遠心脱水して、水を除去した。5μlの懸濁液を96ウェルプレートの各ウェルに加えた。熱い、または暖かい0.8%のアガロース溶液をPBSで調製し、150μlの溶液をウェルに加え、ビーズと混合してビーズを溶液に懸濁させた。アガロース溶液が冷めたとき、ビーズの写真を、488nmの励起波長と赤色検出器を使用するNikonの共焦点顕微鏡で取った。蛍光をうまくサンプリングするために、顕微鏡をz軸によって焦点に合わせた。
センサービーズを、新しい96ウェルプレートのアガロース中にさらに埋め込んだ。最初に、50%の懸濁液とするために、ビーズ懸濁液を遠心脱水して、水を除去した。5μlの懸濁液を96ウェルプレートの各ウェルに加えた。熱い、または暖かい0.8%のアガロース溶液をPBSで調製し、150μlの溶液をウェルに加え、ビーズと混合してビーズを溶液に懸濁させた。アガロース溶液が冷めたとき、ビーズの写真を、488nmの励起波長と赤色検出器を使用するNikonの共焦点顕微鏡で取った。蛍光をうまくサンプリングするために、顕微鏡をz軸によって焦点に合わせた。
シリカゲルビーズ上の酸素感知粒子の調製
パート1−染料吸着シリカゲルビーズ
特許文献2および特許文献3(これらは参照としてここに組み込まれる)にさらに記載されるように、約400μlの水の中で染料結晶(17mg)をシリカゲルと混合することにより、Ru(PDD)3をシリカゲル粒子上に吸着させた。一連の希釈を、染料吸着シリカゲルビーズ懸濁液を水と混合することにより1:2および1:5で行った。
パート1−染料吸着シリカゲルビーズ
特許文献2および特許文献3(これらは参照としてここに組み込まれる)にさらに記載されるように、約400μlの水の中で染料結晶(17mg)をシリカゲルと混合することにより、Ru(PDD)3をシリカゲル粒子上に吸着させた。一連の希釈を、染料吸着シリカゲルビーズ懸濁液を水と混合することにより1:2および1:5で行った。
パート2−ビーズによる酸素消失の検出
0.2Mの亜硫酸ナトリウム100μlを加えてウェルの酸素濃度を低下させた。蛍光強度の変化を観察した。BMG蛍光測定器の下、すべてのウェルは強い蛍光シグナルを有した(37℃)。
0.2Mの亜硫酸ナトリウム100μlを加えてウェルの酸素濃度を低下させた。蛍光強度の変化を観察した。BMG蛍光測定器の下、すべてのウェルは強い蛍光シグナルを有した(37℃)。
パート3−Ru(PDD)3シリカゲル粒子およびポリスチレン粒子の比較
Ru(PDD)3を吸着させたシリカゲル粒子およびポリスチレン粒子100μlを96ウェルプレートのウェルに加えた。172Nikon共焦点顕微鏡の下、ビーズを連続的に観察した。シリカビーズはポリスチレンビーズよりも、より明るい蛍光を示した。
Ru(PDD)3を吸着させたシリカゲル粒子およびポリスチレン粒子100μlを96ウェルプレートのウェルに加えた。172Nikon共焦点顕微鏡の下、ビーズを連続的に観察した。シリカビーズはポリスチレンビーズよりも、より明るい蛍光を示した。
シリコーンゴム中に埋め込まれた染料吸着シリカビーズの調製
実施例2で調製された染料吸着シリカゲルビーズ(27.5mg)を、25mlの丸底フラスコに加えた。50mlのビーカーに、塩化メチレン中のシリコーンからなる混合原料を調製した。この混合されたシリコーン原料を、2部のGE1893B熱硬化性シリコーンと、2部のGE1893A熱硬化性シリコーン(ポリジメチルシロキサン(PDMS))とから調製した。ヒュームフード(fume hood)において、7mlの塩化メチレンをビーカーに加えて、濃度110mg/mlのシリコーン混合物を得た。
実施例2で調製された染料吸着シリカゲルビーズ(27.5mg)を、25mlの丸底フラスコに加えた。50mlのビーカーに、塩化メチレン中のシリコーンからなる混合原料を調製した。この混合されたシリコーン原料を、2部のGE1893B熱硬化性シリコーンと、2部のGE1893A熱硬化性シリコーン(ポリジメチルシロキサン(PDMS))とから調製した。ヒュームフード(fume hood)において、7mlの塩化メチレンをビーカーに加えて、濃度110mg/mlのシリコーン混合物を得た。
5.5mgのシリコーンを含む50μlのシリコーン混合物を、染料吸着シリカゲルビーズと混合した。混合物をロータリーエバポレーターにかけて乾燥させた。別の200μlのシリコーンと塩化メチレンの混合物を加え、該混合物を70℃で約1時間蒸発させて乾燥させ、室温に移した。染料吸着シリカゲルビーズは、シリコーンゴムの薄層に埋め込まれた。
埋め込まれたビーズは、亜硫酸ナトリウムの添加および低下した酸素圧に応じて蛍光の強い増加を示した。蛍光強度の著しい増加は、約10分以内に起こり、時間経過にわたって続いた。対照的に、シリコーンに埋め込まれていない染料吸着ビーズは、初期の蛍光強度は、埋め込まれたビーズのものに匹敵したが、酸素濃度変化に対する応答、すなわち蛍光強度の増加を示さなかった。これらの結果は、シリコーンゴムが、酸素濃度変化に対する染料吸着ビーズの応答を助けたことを示している。
シリコーンゴムに埋め込まれた染料吸着ポリスチレンビーズの調製
実施例1の染料吸着ポリスチレンビーズの原料Aを200μlの水に懸濁させた。懸濁液を2つのマイクロ遠心チューブに加え(各100μl)、高速真空にかけて乾燥させた。乾燥させたビーズの一方のチューブを、100μlの水で再懸濁させ、その25μlを底の平らな96ウェルプレートの各ウェルに加えた。乾燥させたビーズのもう一方のチューブを、100μlのLoctite Special RTVシリコーン(Loctite Corporation)に再懸濁させ、その25μlを底の平らな96ウェルプレートの各ウェルに加えた。
実施例1の染料吸着ポリスチレンビーズの原料Aを200μlの水に懸濁させた。懸濁液を2つのマイクロ遠心チューブに加え(各100μl)、高速真空にかけて乾燥させた。乾燥させたビーズの一方のチューブを、100μlの水で再懸濁させ、その25μlを底の平らな96ウェルプレートの各ウェルに加えた。乾燥させたビーズのもう一方のチューブを、100μlのLoctite Special RTVシリコーン(Loctite Corporation)に再懸濁させ、その25μlを底の平らな96ウェルプレートの各ウェルに加えた。
37℃、湿度90%、および組織培養インキュベーターで、BMG蛍光測定器の下、蛍光をシリコーンゴムの重合前および重合後に観察した。100μlの水を各ウェルに加え、時間0において蛍光を測定した。ウェルの最終濃度が約0.1Mとなるように、0.2Mの亜硫酸ナトリウム100μlを加えた。蛍光強度を経時的に測定した。
シリコーン埋め込みポリスチレンビーズは、亜硫酸ナトリウムの添加と低下した酸素圧に応じて、亜硫酸塩を加えなかったシリコーン埋め込みポリスチレンビーズと比べて、蛍光強度の非常に僅かな増加を示した。対照的に、埋め込まれなかった染料吸着ポリスチレンビーズは蛍光強度の増加をまったく示さなかったが、蛍光強度の減少を示した。
シリコーンゴムは、染料吸着ポリスチレンビーズの酸素濃度変化に対する応答にとって不可欠であった。この実施例はシリコーンゴム、あるいはむしろ疎水性コーティングの必要性を例示している。
染料吸着C18シリカビーズの調製
C18炭化水素鎖が共有結合したBaker Bond(商標)シリカ(J.T.Baker,Inc.、Phillisburg、NJ)0.61gを、25mlの丸底フラスコに加えた。Ru(PDD)3(GFS Chemical,Inc.、Powel、OH)(0.61g)を、25mlの丸底フラスコに加えた。Ru(PDD)35.6mgと塩化メチレン10mlとをフラスコに加え、一晩室温で放置した。Ru(PDD)3染料は、塩化メチレン中の変性シルカゲルビーズに含浸させた。次に、混合物をロータリーエバポレーターで乾燥させてオレンジ色の粉末ビーズを得た。ビーズをマイクロ遠心チューブに配置し、5μlの10%TritonX−100および200μlの水で濡らした。
C18炭化水素鎖が共有結合したBaker Bond(商標)シリカ(J.T.Baker,Inc.、Phillisburg、NJ)0.61gを、25mlの丸底フラスコに加えた。Ru(PDD)3(GFS Chemical,Inc.、Powel、OH)(0.61g)を、25mlの丸底フラスコに加えた。Ru(PDD)35.6mgと塩化メチレン10mlとをフラスコに加え、一晩室温で放置した。Ru(PDD)3染料は、塩化メチレン中の変性シルカゲルビーズに含浸させた。次に、混合物をロータリーエバポレーターで乾燥させてオレンジ色の粉末ビーズを得た。ビーズをマイクロ遠心チューブに配置し、5μlの10%TritonX−100および200μlの水で濡らした。
ビーズを含む溶液を、1:5で希釈して、100μlの水を含む96ウェルプレートのウェルに入れた。亜硫酸塩0.1ml(0.2M)を加え、染料吸着無コートシリカビーズと比較して、蛍光の変化についてビーズを観察した。C18が共有結合したシリカビーズは、亜硫酸塩添加の10分以内に穏やかなシグナルの増加を示し、かつ、染料吸着無コートシリカ粒子より長期間に渡って、より強い応答を示した。一方、亜硫酸塩の代わりに水を添加することによって、蛍光強度は僅かに減少した。したがって、C18が共有結合したシリカビーズは酸素感知粒子としてそれら自体有用であった。
染料の応答に対する鉱油の影響
軽油(100μl)を、実施例2で調製された染料吸着シリカゲルビーズ、あるいは実施例5で調製された染料吸着C18共有結合シリカゲルビーズのいずれかを少量含む96ウェルプレートのウェルに加えた。比較として、シリコーンゴム(PDMS)(100μl)も、染料吸着シリカゲルビーズ、あるいは染料吸着C18共有結合シリカゲルビーズのいずれかを少量含むウェルに加えた。
軽油(100μl)を、実施例2で調製された染料吸着シリカゲルビーズ、あるいは実施例5で調製された染料吸着C18共有結合シリカゲルビーズのいずれかを少量含む96ウェルプレートのウェルに加えた。比較として、シリコーンゴム(PDMS)(100μl)も、染料吸着シリカゲルビーズ、あるいは染料吸着C18共有結合シリカゲルビーズのいずれかを少量含むウェルに加えた。
次に、100μlの0.1M亜硫酸ナトリウムまたは水を各ウェルに加え、時間0において蛍光を測定し、さらに経時的に測定した。鉱油でカプセル化された粒子は、PDMSで被覆されたものよりも、速い応答と、著しく増加した強度を示した。C18でコートされていない染料吸着シリカゲルビーズでさえ、酸素濃度変化に対して速い応答を示した(データは示していない)。顕微鏡下で観察すると、ビーズと結びついた鉱油の薄い層が残っていた。
酸素感知粒子のカプセル化
十字型の磁気攪拌棒を備えた100mlのガラスビーカーに、アセトン(J.T.Baker、HPLCグレード)を50ml、シリカ担体分子に予め接着させられた酸素感知粒子(トリス(4,7−ジフェニル−1,10−フェナントロリン)ルテニウムジクロライドペンタハイドレート)を1.0gm、1000ppmの白金触媒(Gelest、カタログ番号38−2501)および50ppmのポリビニルメチルシロキサン(UCT、P6925−KG)抑制剤を含むBASF Masil SF−201ポリマーを1.0gm加えた。ビーカーの内容物を激しく攪拌しながら、0.2mlのBASF Masil XL−1架橋剤を注射器で一度にビーカーに入れた。次に、ビーカーをアルミニウム箔で覆い、雰囲気温度で1時間攪拌した。次に、磁気攪拌子をビーカーから回収し、アセトンの大部分をピペットで取り除いた。得られたオレンジ色の「濡れた」残留物をビーカーに入れたまま乾燥するまでヒュームフードに置いた。こうして、オレンジ色〜黄色のさらさらした粉末(MOSP)を得た。さらさらした粉末(MOS)の重さは1.75gmであった。
十字型の磁気攪拌棒を備えた100mlのガラスビーカーに、アセトン(J.T.Baker、HPLCグレード)を50ml、シリカ担体分子に予め接着させられた酸素感知粒子(トリス(4,7−ジフェニル−1,10−フェナントロリン)ルテニウムジクロライドペンタハイドレート)を1.0gm、1000ppmの白金触媒(Gelest、カタログ番号38−2501)および50ppmのポリビニルメチルシロキサン(UCT、P6925−KG)抑制剤を含むBASF Masil SF−201ポリマーを1.0gm加えた。ビーカーの内容物を激しく攪拌しながら、0.2mlのBASF Masil XL−1架橋剤を注射器で一度にビーカーに入れた。次に、ビーカーをアルミニウム箔で覆い、雰囲気温度で1時間攪拌した。次に、磁気攪拌子をビーカーから回収し、アセトンの大部分をピペットで取り除いた。得られたオレンジ色の「濡れた」残留物をビーカーに入れたまま乾燥するまでヒュームフードに置いた。こうして、オレンジ色〜黄色のさらさらした粉末(MOSP)を得た。さらさらした粉末(MOS)の重さは1.75gmであった。
MOSPとカプセル化されていない酸素感知粒子との比較
寒天(熱水中1.5%)(グレードA)を作製し、MOSPをホスト材料とした。Becton,Dickinson and CompanyによるMGIT(Mycobacterial Growth Indicator Tube)のCOCプラスチック製チューブ(Becton,Dickinson and Company、Franklin Lakes、USA)に、0.01gmのMOSP(実施例7)またはカプセル化されていない酸素感知粒子(トリス(4,7−ジフェニル−1,10−フェナントロリン)ルテニウムジクロライドペンタハイドレート)を加え、次に高温の寒天溶液を4滴(約0.05ml)加えた。冷却によって、各チューブでゲルが形成され、同時にMOSまたはカプセル化されていない酸素感知粒子はゲルに取り込まれた。すべてのチューブをHungateキャップで封をした。次に、真空ポンプに連結した注射針を通してチューブを真空にした。次に、各チューブにおいて発生したシグナルを、類似の研究のQCやR&D用に使用されるリーダー(Firefox)で測定した。真空でのシグナル測定完了後、キャップを開いて真空のチューブを開放し、大気の存在下で再び発生したシグナルの強度を測定した。表1は、MOSPのチューブのダイナミックレンジが、カプセル化されていない酸素感知粒子を含むチューブのものより10から20倍良いことを示している。
寒天(熱水中1.5%)(グレードA)を作製し、MOSPをホスト材料とした。Becton,Dickinson and CompanyによるMGIT(Mycobacterial Growth Indicator Tube)のCOCプラスチック製チューブ(Becton,Dickinson and Company、Franklin Lakes、USA)に、0.01gmのMOSP(実施例7)またはカプセル化されていない酸素感知粒子(トリス(4,7−ジフェニル−1,10−フェナントロリン)ルテニウムジクロライドペンタハイドレート)を加え、次に高温の寒天溶液を4滴(約0.05ml)加えた。冷却によって、各チューブでゲルが形成され、同時にMOSまたはカプセル化されていない酸素感知粒子はゲルに取り込まれた。すべてのチューブをHungateキャップで封をした。次に、真空ポンプに連結した注射針を通してチューブを真空にした。次に、各チューブにおいて発生したシグナルを、類似の研究のQCやR&D用に使用されるリーダー(Firefox)で測定した。真空でのシグナル測定完了後、キャップを開いて真空のチューブを開放し、大気の存在下で再び発生したシグナルの強度を測定した。表1は、MOSPのチューブのダイナミックレンジが、カプセル化されていない酸素感知粒子を含むチューブのものより10から20倍良いことを示している。
鉱油でコートされた酸素感知粒子の作製
染料吸着シリカゲルを2つのマイクロ遠心チューブの各々に加えた。鉱油(200μl)を一方のチューブに入れ、水(200μl)を他方に加えた。チューブをボルテックスにかけてマイクロ遠心にかけた。上澄みを取り除き、チューブを再び遠心脱水して残りの液体を取り除いた。ビーズを250μlの水に懸濁させ、蛍光の変化を測定するために、100μlずつ96ウェルプレートの各ウェルに分取した。
染料吸着シリカゲルを2つのマイクロ遠心チューブの各々に加えた。鉱油(200μl)を一方のチューブに入れ、水(200μl)を他方に加えた。チューブをボルテックスにかけてマイクロ遠心にかけた。上澄みを取り除き、チューブを再び遠心脱水して残りの液体を取り除いた。ビーズを250μlの水に懸濁させ、蛍光の変化を測定するために、100μlずつ96ウェルプレートの各ウェルに分取した。
100μlの水または0.5M亜硫酸ナトリウムのいずれかを、各ウェルに加えて応答を観察した。図1に示されるように、鉱油でコートされた染料吸着シリカビーズは、亜硫酸塩の添加と酸素濃度の減少に対する有意な応答を示したが、水でコートされた染料吸着シリカビーズは、亜硫酸塩の添加で強度低下を示し、これは酸素濃度の検出には役立たなかった。
アガロース土台での酸素感知粒子の試験
実施例9で調製されたビーズをまた、250μlの1%高温アガロース/PBS溶液にそれぞれ加えた。該アガロース/PBS懸濁液(100μl)を96ウェルプレートの平らな底のウェルに加えた。アガロースが冷めた後、経時的に蛍光を測定するために、100μlの水または0.5M亜硫酸ナトリウムを各ウェルに加えた。
実施例9で調製されたビーズをまた、250μlの1%高温アガロース/PBS溶液にそれぞれ加えた。該アガロース/PBS懸濁液(100μl)を96ウェルプレートの平らな底のウェルに加えた。アガロースが冷めた後、経時的に蛍光を測定するために、100μlの水または0.5M亜硫酸ナトリウムを各ウェルに加えた。
図3に示されるように、最初の5分にわたるシグナルの低下にもかかわらず、鉱油でコートされた染料吸着シリカビーズは、亜硫酸塩の添加と酸素濃度の減少に対する顕著な応答を示し、そして、このように酸素濃度の変化に対して非常に応答性がよいが、水でコートされた染料吸着シリカビーズは、亜硫酸塩の添加で強度低下を示し、これは酸素濃度の検出には役立たなかった。全体的な応答時間は、アガロースがないウェルのものより遅かった。
シリコーンでコートされた剥き出しの(naked)染料粒子の作製
剥き出しの染料結晶粒子(シリカゲルビーズまたはポリスチレンビーズのような担体ビーズに吸着あるいは如何なる形態の結合もしていない)を含むシリコーンゴムの球体を、シリコーンと、水のようなシリコーンの非溶剤との中で染料粒子に超音波をかけることにより調製した。超音波により水中にシリコーンのエマルジョンが作り出され、ここで球体は重合し、個々の染料結晶をカプセル化した。1個の染料結晶粒子は、シリコーンゴムの薄い層でコートされ、直径約50μmであった。コートされた染料は細胞培養土台内に埋め込むのに有用であった。
剥き出しの染料結晶粒子(シリカゲルビーズまたはポリスチレンビーズのような担体ビーズに吸着あるいは如何なる形態の結合もしていない)を含むシリコーンゴムの球体を、シリコーンと、水のようなシリコーンの非溶剤との中で染料粒子に超音波をかけることにより調製した。超音波により水中にシリコーンのエマルジョンが作り出され、ここで球体は重合し、個々の染料結晶をカプセル化した。1個の染料結晶粒子は、シリコーンゴムの薄い層でコートされ、直径約50μmであった。コートされた染料は細胞培養土台内に埋め込むのに有用であった。
細胞培養のための酸素感知粒子を含有する土台の作製
鉱油でコートされた染料吸着シリカ粒子懸濁液を、水と1:1で混合した。希釈された懸濁液(50μl)を、0.1MのMES緩衝液(pH6.0)にアルギネートをゆっくりと溶解させることにより得られた2%(w/v)アルギネート(MVGアルギネート、ProNova、ノルウェー)溶液2mlに加えた。適量のヒドロキシルベンゾチアゾール(HoBt、H−2006、Sigma)およびアジピン酸二水和物(AAD、MW 174)を、架橋させるために加えた。1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC、MW 191.7、Pierce)を素早く加えてポリスチレン皿での架橋反応を開始させた。架橋反応は2時間続く。酸素感知粒子は、架橋されたヒドロゲル内によく分散された。5mm×1mmの円板をいくつか得るためにヒドロゲルを切断して、洗浄し、凍結乾燥し、乾燥させて、細胞培養のための土台を得た。
鉱油でコートされた染料吸着シリカ粒子懸濁液を、水と1:1で混合した。希釈された懸濁液(50μl)を、0.1MのMES緩衝液(pH6.0)にアルギネートをゆっくりと溶解させることにより得られた2%(w/v)アルギネート(MVGアルギネート、ProNova、ノルウェー)溶液2mlに加えた。適量のヒドロキシルベンゾチアゾール(HoBt、H−2006、Sigma)およびアジピン酸二水和物(AAD、MW 174)を、架橋させるために加えた。1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC、MW 191.7、Pierce)を素早く加えてポリスチレン皿での架橋反応を開始させた。架橋反応は2時間続く。酸素感知粒子は、架橋されたヒドロゲル内によく分散された。5mm×1mmの円板をいくつか得るためにヒドロゲルを切断して、洗浄し、凍結乾燥し、乾燥させて、細胞培養のための土台を得た。
土台を、100μg/mlのコラーゲンI溶液でさらにコートし、PBSと水で洗い、再び凍結乾燥した。得られた土台は、100,000細胞/土台でMC3T3細胞を接種され、10%の血清含有培地で2日間培養された。細胞は染色され、共焦点顕微鏡下で観察された。
センサー粒子を有するECM変性土台の調製
実施例12の場合のように、コラーゲンI溶液の代わりに、土台を、ラミニン、フィブロネクチン、コラーゲンIV、およびコラーゲンIをそれぞれ含む、100μg/mlのECM溶液に浸漬した。同じステップを経て変性された土台を得て、MC3T3細胞を接種した。200mMの亜硫酸塩をまた、共焦点顕微鏡下で16時間に渡って観察された酸素感知粒子を消光させるために加えた。
実施例12の場合のように、コラーゲンI溶液の代わりに、土台を、ラミニン、フィブロネクチン、コラーゲンIV、およびコラーゲンIをそれぞれ含む、100μg/mlのECM溶液に浸漬した。同じステップを経て変性された土台を得て、MC3T3細胞を接種した。200mMの亜硫酸塩をまた、共焦点顕微鏡下で16時間に渡って観察された酸素感知粒子を消光させるために加えた。
Claims (10)
- a)少なくとも1種の酸素感知粒子を含むコア、および
b)前記コアを取り囲む疎水性コーティング材料、
を含むことを特徴とする、試料の酸素検出および酸素モニター用複合物。 - 前記の少なくとも1種の酸素感知粒子は発光性で、トリス−4,7−ジフェニル−1,10−フェナントロリンルテニウム(II)の塩、トリス−2,2’−ビピリジル−ルテニウム(II)の塩、トリス−1,7−ジフェニル−1,10−フェナントロリンルテニウム(II)の塩、9,10−ジフェニルアントラセン、白金(II)オクタエチルポルフィリン錯体およびパラジウム(II)オクタエチルポルフィリン錯体、パラジウム−メソ−テトラ(4−カルボキシフェニル)ポルフィン、パラジウム−メソ−テトラ(4−カルボキシフェニル)ポルフィリンデンドリマーおよびパラジウム−メソ−テトラ(4−カルボキシフェニル)テトラベンゾポルフィリンデンドリマーからなる群から選択され、さらに、前記トリス−4,7−ジフェニル−1,10−フェナントロリンルテニウム(II)の塩は、トリス−4,7−ジフェニル−1,10−フェナントロリンルテニウム(II)ジクロライドペンタハイドレート、トリス−4,7−ジフェニル−1,10−フェナントロリンルテニウム(III)トリクロライド、トリス−4,7−ジフェニル−1,10−フェナントロリンルテニウム(II)ジパークロレートおよびトリス−4,7−ジフェニル−1,10−フェナントロリンルテニウムヘキサフルオロホスフェートからなる群から選択されることを特徴とする請求項1に記載の複合物。
- 前記疎水性コーティング材料は、官能基化ポリジメチルシロキサン、シリコーンゴム、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)、ポリスチレン、および鉱油からなる群から選択されるポリマーを含み、さらに、前記官能基化ポリジメチルシロキサンは、ビニル官能基化ポリジメチルシロキサン、ヒドリド官能基化ポリジメチルシロキサン、アルコキシ官能基化ポリジメチルシロキサンおよびアセトキシル官能基化ポリジメチルシロキサンからなる群から選択されることを特徴とする請求項1に記載の複合物。
- 3次元のヒドロゲルマトリックスをさらに含み、前記ヒドロゲルが、イオン架橋したアガロース、イオン架橋したアルギネート、変性アルギネート、ヒアルロン酸、変性ヒアルロン酸、ポリアクリルイミド、ポリエチレングルコース(PEG)、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリメチルメタクリレート(PMMA)、コラーゲンおよびこれらの組合せからなる群から選択されることを特徴とする請求項1に記載の複合物。
- 少なくとも1つの時点で試料の酸素含量を検出する方法であって、請求項1に記載の複合物を含むことを特徴とする方法。
- 前記の少なくとも1つの時点は、第1および第2の時点を含み、かつ、第1および第2の時点で検出したレベルを比較することをさらに含むことを特徴とする請求項5に記載の方法。
- a)前記酸素感知粒子が溶解しない液体に、前記酸素感知粒子を分散させること、
b)前記疎水性コーティング材料を前記液体に分散させること、
c)前記酸素感知材料および前記疎水性コーティング材料を含む前記液体を攪拌すること、
d)前記攪拌の後、前記液体を除去すること、並びに、
e)前記液体の除去後に、得られた粉末を乾燥させること
を含むことを特徴とする請求項1に記載の複合物の製造方法。 - 少なくとも1つの時点で試料の酸素含量を検出する方法であって、請求項4に記載の複合物を含むことを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の複合物を含む複合物の細胞代謝効果をスクリーニングする方法。
- 請求項4に記載の複合物を含む複合物の細胞代謝効果をスクリーニングする方法。
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