JP2005062115A - キャピラリー電気泳動を用いた化学発光検出装置およびこの化学発光検出装置を用いた分析方法 - Google Patents

Abstract

【課題】複数試料を同時検出できるとともに、装置を小型化できる化学発光検出装置およびこの化学発光検出装置を用いた分析精度のよい分析方法を提供することを目的としている。
【解決手段】
一方、本発明にかかる分析方法は、検出セル内にその一端が臨むキャピラリーを３本以上備え、各キャピラリーの長さが異なる化学発光検出装置を用い、少なくとも２種類の既知濃度の試料溶液を個別に化学発光検出装置のキャピラリーに導入するとともに、残りのキャピラリーに未知濃度の試料溶液を導入し、同時に電気泳動させて各キャピラリーの先端での化学発光を検出することを特徴としている。
【選択図】 図１

Description

本発明は、キャピラリー電気泳動を用いた化学発光検出装置およびこの化学発光検出装置を用いた分析方法に関する。

近年、キャピラリー電気泳動は、溶液試料の分析に極めて高い分離性能を示す測定方法として注目を集めている。
ところで、キャピラリー電気泳動を用いて試料成分を検出する方法としては、吸光検出法、あるいは、レーザー励起蛍光検出法が通常用いられている。

また、レーザー励起蛍光検出法を用いた化学発光検出装置においては、複数のキャピラリーを用いて複数試料を同時検出するようなものが既に提案されている（たとえば、特許文献１等参照）。

特開２００１−１２４７３６号公報

しかしながら、レーザー励起蛍光検出法を用いて複数試料を同時検出できるようにする場合、各キャピラリーに個別にレーザー光を照射し、各キャピラリー毎に設けられた蛍光検出センサによって蛍光を検出しなければならない。したがって、装置が大掛かりなものになってしまう。また、レーザー光源から照射された光を分光して各キャピラリーにレーザー光を照射すれば、レーザー光源は１つにできるが、レーザー光源を１つにできたとしても、いずれにしても各キャピラリー毎に蛍光検出センサを配置する必要であり、装置の大型化を免れることができない。
一方、吸光検出法を用いる場合も上記レーザー励起蛍光検出法と同様の問題がある。

本発明は、上記事情に鑑みて、複数試料を同時検出できるとともに、装置を小型化できる化学発光検出装置およびこの化学発光検出装置を用いた分析精度のよい分析方法を提供することを目的としている。

そこで、本発明の発明者らは、上記目的を達成するために、本発明の発明者らが、かねてより研究を行っており、吸光検出法やレーザー励起蛍光検出法に比べ検出精度が高い化学発光検出法を用いて上記問題点が解消できないかと考え、鋭意検討を重ねた結果、本発明を完成するに到った。

すなわち、本発明にかかる化学発光検出装置は、検出セルと、この検出セル内にその一端が臨むキャピラリーと、検出セル内の化学発光試薬と、キャピラリー先端から検出セル内に流入する試料溶液との反応による発光を検出する発光検出センサとを備えるキャピラリー電気泳動を用いた化学発光検出装置において、その一端が同一検出セル内に臨む複数のキャピラリーを備えていることを特徴としている。

一方、本発明にかかる分析方法は、キャピラリーを３本以上備え、各キャピラリーの長さが異なる請求項１に記載の化学発光検出装置の少なくとも２種類の既知濃度の試料溶液を個別にキャピラリーに導入するとともに、残りのキャピラリーに未知濃度の試料溶液を導入し、同時に電気泳動させて各キャピラリーの先端での化学発光を検出することを特徴としている。

本発明において、キャピラリーとしては、特に限定されないが、たとえば、溶融シリカチューブやガラスチューブ等にアクリルアミドコーティングしたもの等が挙げられる。
複数のキャピラリーは、その長さがそれぞれ異なっていても構わない。また、キャピラリーは、３本以上備えていることが好ましい。

検出セルは、化学発光試薬を連続的に交換可能な化学発光試薬の給排口を備えているようにしても構わない。

本発明において化学発光試薬としては、試料に対して光反応するものであれば特に限定されないが、たとえば、ルミノール系化学発光試薬、過シュウ酸エステル系化学発光試薬、ルテニウム錯体系化学発光試薬、１，１０−フェナントロリン系化学発光試薬等が挙げられる。
因みに、ルミノール系化学発光試薬を用いれば、たとえば、触媒活性を示す金属イオン、金属錯体、ヘムタンパク質、イソルミノールイソチアナート（ＩＬＩＴＣ）で標識可能なアミノ基を有する化合物（アミノ酸、ペプチド等）などの検出を行うことができる。

１，１０−フェナントロリン系化学発光試薬を用いれば、たとえば、遷移金属イオンの検出を行うことができる。
ルテニウム錯体系化学発光試薬を用いれば、たとえば、金属イオンの検出を行うことができる。

過シュウ酸エステル系化学発光試薬を用いれば、たとえば、蛍光物質を含有したリポソーム、そのリポソームで標識したタンパク質、各種蛍光標識で標識したアミノ酸、タンパク質、糖類、核酸、環境ホルモンなどの検出を行うことができる。
因みに、過シュウ酸エステル系化学発光試薬を用いた場合の発光のメカニズムは、以下の式に示したようになる。

本発明において、発光検出センサとしては、特に限定されないが、たとえば、高感度な光電子倍増管が好適に用いられる。

本発明にかかる検出装置は、以上のように構成されているので、複数試料を同時検出できるとともに、装置を小型化できる。
特に、請求項４の検出装置のようにすれば、検出セル内の化学発光試薬が常に新しいものと入れ替わる。したがって、連続分析が容易で再現性が高くなる。

一方、本発明にかかる分析方法によれば、検量線を求めるための既知濃度試料と、未知濃度試料とがほとんど時間差なく同条件で検出できるため、検量線のずれが少なく未知試料の濃度を正確に分析することができる。

以下に、本発明を、その実施の形態をあらわす図面を参照しつつ詳しく説明する。
図１は、本発明にかかる化学発光検出装置の１つの実施の形態をあらわしている。

図１に示すように、この化学発光検出装置（以下、「検出装置」とのみ記す）Ａは、フロー式であって、３本のキャピラリー１１〜１３と、検出セル２ａと、２本の白金電極３１，３２と、化学発光試薬供給路４と、化学発光試薬排出路５と、発光検出装置６ａと、給電装置７と、泳動緩衝液セル８とを備えている。
検出セル２ａには、化学発光試薬供給路４が接続された化学発光試薬供給口２１と、化学発光試薬排出路５が接続された化学発光試薬排出口２２とが設けられている。

化学発光試薬供給路４は、たとえば、四フッ化エチレン樹脂等のチューブで形成されていて、シリンジポンプ４１等の供給手段から供給された化学発光試薬を検出セル２ａ内に供給するようになっている。
化学発光試薬排出路５は、四フッ化エチレン樹脂等のチューブで形成されていて、検出セル２ａ内に供給された化学発光試薬を排出するようになっているとともに、その途中で内部に一方の白金電極３１が臨んでいる。

すなわち、検出セル２ａに化学発光試薬供給路を介して化学発光試薬が供給され、この供給された量と同じ量の化学発光試薬および反応物が化学発光試薬排出路５から排出され、化学発光試薬が常に新しいものと入れ替わるようになっている。
３本のキャピラリー１１〜１３は、溶融シリカ等で形成されていて、その長さが異なっているとともに、それぞれ化学発光試薬供給路４内を通りその先端が検出セル２ａ内に臨み、他端が泳動緩衝液セル８内に臨むようになっている。

給電装置７は、２本の白金電極３１，３２間に所定の電圧を印加できるようになっている。
なお、図１中、９はブラックボックスである。

そして、この検出装置Ａは、たとえば、以下のようにして、未知濃度の試料の濃度を測定することができる。
すなわち、泳動緩衝液セル８に泳動緩衝液を入れるとともに、化学発光試薬供給路４、検出セル２ａおよび化学発光試薬排出路５内に化学発光試薬を充満させたのち、落差法によって、３本のキャピラリー１１〜１３のうち、２本のキャピラリー１１，１２に異なる既知濃度の試料を注入し、残りの１本のキャピラリー１３に未知濃度の試料を注入する。

そして、キャピラリー１１〜１３の後端部を泳動緩衝液セル８中の泳動緩衝液８１に浸漬した状態で、給電装置７によって２本の白金電極３１，３２間に所定の電圧を印加して各キャピラリー中の試料成分を電気泳動によって検出セル２ａ側に泳動させて、泳動してきた試料成分と検出セル２ａ中の化学発光試薬が反応して生じる化学発光を発光検センサ６ａで検出する。

以上のように、この検出装置Ａは、キャピラリー１１〜１３の長さが異なるため、同じ試料成分でも、検出セル２ａに達する時間がキャピラリー１１〜１３の長さに応じてずれる。したがって、２つの既知試料と、未知試料の試料成分がそれぞれ明確に分離されたピークとなって検出される。
そして、検出された２つの既知濃度試料の検出データを元に検量線を求め、この検量線と、未知濃度試料の検出データを比較し、未知濃度試料の濃度を求めることができる。

すなわち、従来のように、既知濃度試料と、未知濃度試料とを個別に測定する方式では、測定時の試料溶液の入れ替え等により、各測定時間のずれが大きいため、どうしても検量線のずれが生じ、検出精度に少し問題があるが、上記検出装置Ａによれば、検量線を引くための既知濃度試料データと、濃度を求めようとする未知濃度試料のデータとを略同一条件で得ることができ、正確の濃度測定を行うことができる。

また、検出セル２ａが小さいため、１つの発光検出センサですべての成分の発光反応を検出できるので、検出装置Ａ全体を小型化することができる。
さらに、上記検出装置Ａの場合、検出セル２ａ内の化学発光試薬が常に新しいものと入れ替わっているので、反応精度が常に良好な状態に保たれるという利点を備えている。

図２は、本発明にかかる化学発光検出装置の他の実施の形態をあわしている。
図２に示すように、この化学発光検出装置（以下、「検出装置」とのみ記す）Ｂは、検出セル２ｂがバッチ式になっているとともに３本のキャピラリー１４〜１６の長さが同じになっている以外は、上記の検出装置Ａと同様になっている。

そして、この検出装置Ｂは、たとえば、以下のようにして３種類の異なる試料成分を検出することができる。
すなわち、３本のキャピラリー１４〜１６に、ｐＨを変更したり、界面活性剤の添加割合や粘度を変えたり、キャピラリーの内壁を処理するなどして分離モードを異ならせた状態で試料溶液を、それぞれのキャピラリー１４〜１６に１種ずつ注入し、キャピラリー１４〜１６の後端部を検出装置Ａと同様に泳動緩衝液セル８中の泳動緩衝液８１に浸漬した状態で、給電装置７によって２本の白金電極３１，３２間に所定の電圧を印加して各キャピラリー１４〜１６中の試料成分を電気泳動によって検出セル２ａ側に泳動させて、キャピラリー１４〜１６の先端か検出セル２ｂ内に流出した試料成分と検出セル２ｂ中の化学発光試薬が反応して生じる化学発光を発光検出センサ６ｂで検出するようになっている。なお、図２中、６１は石英ガラス、６２は検出窓である。

この方法によれば、３つのキャピラリー１４〜１６に分離モードが異なる試料溶液が注入されているので、同時に検出を開始しても、時間がずれて検出セル２ｂに達する。したがって、各試料溶液の成分がうまく分離されて検出できる。
また、検出セル２ｂがバッチ式であるので、フロー式に比べ、キャピラリー後端での試料の分散が少なく鋭いピークの検出データを得ることができる。

本発明にかかる検出装置は、上記の実施の形態に限定されない。たとえば、上記の実施の形態では、キャピラリーがいずれも３本であったが、４本以上でも構わない。また、上記の実施の形態では、３本のキャピラリーが同一方向から検出セル内に挿入されているが、多方向から個別に挿入するようにしても構わない。

内径５０μｍ、外径１５０μｍで、長さが６０ｃｍ，７０ｃｍ、８０ｃｍの３本の溶融シリカキャピラリー１１〜１３を備えた図１に示すような化学発光検出装置Ａを用意した。
そして、化学発光試薬としての１、１０フェナントロリンを０．４ｍＭｏｌ、ＣＴＡＢを０．８ｍＭｏｌ，過酸化水素を５０ｍＭｏｌ含む、塩化ナトリウム−水酸化ナトリウム水溶液（ｐＨ１２．０）を検出セル２ａに充填するとともに、泳動緩衝液８１としてＮＨ₂Ｃ（ＣＨ₂ＯＨ）₃を２０ｍＭｏｌ含むＨ₃ＢＯ₃溶液（ｐＨ９．０）を緩衝液セル８に満たした。

そして、落差法（高さ３０ｃｍ、１５秒）によって各キャピラリー１１〜１３にＣｕ²⁺を１．０×１０^-5モル含む試料溶液をそれぞれ注入したのち、化学発光試薬をシリンジポンプから０．４ｍｌ／ｈの速度で定量的に検出セルに供給しながら、電極間に１５ｋＶの電圧を印加して発光検出センサで検出を行ったところ、図３に示すようなエレクトロフェログラムが得られた。

このエレクトロフェログラムから、キャピラリー１１（１２，１３）毎に鋭利なピークが得られることが判る。すなわち、６０ｃｍの長さのキャピラリー１１の試料成分の発光反応がまず起こり、続いて７０ｃｍの長さのキャピラリー１２の試料成分の発光反応、８０ｃｍの長さのキャピラリー１３の試料成分の発光反応が個別に起こることがわかった。

つぎに、６０ｃｍのキャピラリー１１にＣｕ²⁺を１．０×１０^-6モル含む硫酸銅水溶液、７０ｃｍのキャピラリー１２にＣｕ²⁺を１．０×１０^-8モル含む硫酸銅水溶液、８０ｃｍのキャピラリー１３にＣｕ²⁺を１．０×１０^-7モル含む硫酸銅水道水溶液をそれぞれ注入した以外は、上記と同様にして検出を行ったところ、図３と同様の時間軸で３つのピークを備える図４に示すようなエレクトロフェログラムが得られた。
得られたエレクトロフェログラムから１．０×１０^-6モル含む硫酸銅水溶液およびＣｕ²⁺を１．０×１０^-8モル含む硫酸銅水溶液のＣｕ²⁺濃度と、発光強さとの関係をプロットし、図５に破線で示す検量線Ｌ１を得た。

そして、Ｃｕ²⁺を１．０×１０^-7モル含む硫酸銅水道水溶液の発光強さを検量線Ｌ１に当てはめたところ、Ｃｕ²⁺濃度が８．８×１０^-8モルと判定された。
また、７０ｃｍのキャピラリー１本のみを備えた以外は、上記検出装置と同様の検出装置を用意し、Ｃｕ²⁺を１．０×１０^-8モル含む硫酸銅水溶液、Ｃｕ²⁺を１．０×１０^-7モル含む硫酸銅水溶液、Ｃｕ²⁺を１．０×１０^-6モル含む試料溶液、Ｃｕ²⁺を１．０×１０^-5モル含む硫酸銅水溶液、Ｃｕ²⁺を１．０×１０^-4モル含む硫酸銅水溶液、Ｃｕ²⁺を１．０×１０^-3モル含む硫酸銅水溶液のそれぞれについて個別に発光強さを調べ、濃度と発光強さとの関係をプロットしたところ、図５に実線で示す検量線Ｌ２が得られた。

この検量線Ｌ２にＣｕ²⁺を１．０×１０^-7モル含む硫酸銅水道水溶液の発光強さを結果を当てはめたところ、Ｃｕ²⁺濃度が１．７×１０^-8モルと判定された。
上記実施例１から、本発明の方法によれば、略同一条件で検量線用の既知濃度試料溶液と、未知濃度試料溶液をほとんど時間差なく略同一条件で検出することができるので、検量線のずれがなく、正確に未知試料の濃度を測定できることがわかる。

内径５０μｍ、外径１５０μｍで、長さが５０ｃｍの３本のキャピラリーと、内容量７ｍｌの検出セルを備えた図２示すようなバッチ式の検出装置Ｂを用意した。
□そして、この検出装置Ｂの検出セル２ｂ内に化学発光試薬として１．４ｍＭのＴＤＰＯ（ビス［２−（３，６，９−トリオキサデカニルオキシカルボニル）−４−ニトロフェニル］オキサレート）と２００ｍＭの過酸化水素とを含むアセトニトリルを充填するとともに、緩衝液セルに緩衝溶液として１０ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ８．０）を満たした。

つぎに、アセトニトリルを５０Ｖ／Ｖ％およびＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を２ｍＭ含んでいる１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）中に、ダンシル化フェノール（以下、「Ｐｈｅ」と記す）、ダンシル化２−クロロフェノール（以下、「２−ＣＰ」と記す）、ダンシル化４−クロロフェノール（以下、「４−ＣＰ」と記す）が混合された分離モードＭＥＫＣ（ミセル導電クロマトグラフィー）の試料溶液１を落差法（３０ｃｍ、１５秒）で１本のキャピラリーのみに注入したのち、電極間に１５ｋＶの電圧を印加して発光検出センサで検出を行ったところ、図６（ａ）に示すようなエレクトロフェログラムが得られた。

図６（ａ）からＰｈｅ、２−ＣＰ、４−ＣＰがうまく分離泳動してそれぞれの成分に対応して３つのピークが得られることがわかる。

また、試料溶液１に代えて１００ｍＭトリスほう酸緩衝液（ｐＨ７．０）中にダンシル化グリシン（以下、「Ｄｎｓ−Ｇｌｙ」と記す）、ダンシル化トリプトファン（以下、「Ｄｎｓ−Ｔｒｙ」と記す）、ダンシル化リシン（以下、「Ｄｎｓ−Ｌｙｓ」と記す）が混合された分離モードＣＺＥ（キャピラリー等電点電気泳動）の試料溶液２を１本のキャピラリーに注入した以外は、上記試料溶液１と同様にして電極間に１５ｋＶの電圧を印加して発光検出センサで検出を行ったところ、図６（ｂ）に示すようなエレクトロフェログラムが得られた。

図６（ｂ）からＤｎｓ−Ｇｌｙ、Ｄｎｓ−Ｔｒｙ、Ｄｎｓ−Ｌｙｓがうまく分離泳動してそれぞれの成分に対応して３つのピークが得られることがわかる。
さらに、試料溶液１に代えてＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース）を０．１重量％、および、ＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラアセテート）を１ｍＭ含むのと１００ｍＭトリスほう酸緩衝液（ｐＨ８．４）中にＦＩＴＣ（蛍光性イソチオシアネート）によって標識化されたリボヌクレアーゼＡ（以下、「Ｒｉｂｏ」と記す）、リゾチーム（以下、「Ｌｙｓｏ」と記す）およびチトクロームＣ（以下、「Ｃｙｔｏ」と記す）が混合された分離モードＣＧＥ（キャピラリーゲル電気泳動）の試料溶液３を１本のキャピラリーに注入した以外は、上記試料溶液１と同様にして電極間に１５ｋＶの電圧を印加して発光検出センサで検出を行ったところ、図６（ｃ）に示すようなエレクトロフェログラムが得られた。

図６（ｃ）からＲｉｂｏ、Ｌｙｓｏ、Ｃｙｔｏがうまく分離泳動してそれぞれの成分に対応して３つのピークが得られることがわかる。
つぎに、３本のキャピラリーに上記試料溶液１、２、３を１つずつ落差法（３０ｃｍ、１５秒）注入し、電極間に１５ｋＶの電圧を印加して同時に検出を行ったところ、図７に示すようなエレクトロフェログラムが得られた。
そして、得られた図７のエレクトロフェログラムから、キャピラリーの長さが同じでも分離モードを代えれば、同時に複数の試料溶液中の成分を分離検出できることがわかる。

本発明にかかる化学発光検出装置の１つの実施の形態をあらわす概略図である。 本発明にかかる化学発光検出装置の他の実施の形態をあらわす要部概略図である。 実施例１の同一濃度の試料を３本のキャピラリーを用いて同時に測定した場合のエレクトロフェログラムである。 実施例の異なる濃度の試料を３本のキャピラリーを用いて同時に測定した場合のエレクトロフェログラムである。 図４のエレクトロフェログラムより求めた検量線および、従来の方法で求めた検量線をあらわす図である。 ３つの試料を個別に測定した場合のエレクトロフェログラムである。 図６の３つの試料を３本のキャピラリーを用いて同時に測定した場合のエレクトロフェログラムである。

符号の説明

Ａ，Ｂ 化学発光検出装置
１１〜１６ キャピラリー
２ａ，２ｂ 検出セル
６ａ，６ｂ 発光検出センサ

Claims (5)

1. 検出セルと、この検出セル内にその一端が臨むキャピラリーと、検出セル内の化学発光試薬と、キャピラリー先端から検出セル内に流入する試料溶液との反応による発光を検出する発光検出センサとを備えるキャピラリー電気泳動を用いた化学発光検出装置において、その一端が同一検出セル内に臨む複数のキャピラリーを備えていることを特徴とする化学発光検出装置。
2. キャピラリーの長さがそれぞれ異なる請求項１に記載の化学発光検出装置。
3. キャピラリーを３本以上備えている請求項１または請求項２に記載の化学発光検出装置。
4. 検出セルが化学発光試薬を連続的に交換可能な化学発光試薬の給排口を備えている請求項１〜請求項３のいずれかに記載の化学発光検出装置。
5. キャピラリーを３本以上備え、各キャピラリーの長さが異なる請求項１に記載の化学発光検出装置の少なくとも２種類の既知濃度の試料溶液を個別にキャピラリーに導入するとともに、残りのキャピラリーに未知濃度の試料溶液を導入し、同時に電気泳動させて各キャピラリーの先端での化学発光を検出することを特徴とする分析方法。