JP2005035907A

JP2005035907A - Anti-periodontal disease medicine

Info

Publication number: JP2005035907A
Application number: JP2003198817A
Authority: JP
Inventors: Yutaka Iwata; 豊岩田; Nobuhiko Kosugi; 信彦小杉; Hibiki Matsushita; 響松下
Original assignee: Nonogawa Shoji Ltd
Current assignee: Nonogawa Shoji Ltd
Priority date: 2003-07-18
Filing date: 2003-07-18
Publication date: 2005-02-10

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide an anti-periodontal disease medicine which inhibits the activity of a trypsin-like protease produced by Porphyromonas gingivalis, further inhibits the activities of the trypsin-like protease and a collagenase produced by the bacterium, and can effectively prevent and treat the periodontal disease. <P>SOLUTION: This anti-periodontal disease medicine contains a Brasenia schreberi J. F. Gmel. extract having an action for inhibiting the activity of a trypsin-like protease produced by Porphyromonas gingivali as an active ingredient. The anti-periodontal disease medicine contains a Brasenia schreberi J. F. Gmel. extract having an action for inhibiting the activities of a trypsin-like protease and a collagenase produced by Porphyromonas gingivali as an active ingredient. <P>COPYRIGHT: (C)2005,JPO&NCIPI

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ジュンサイ抽出物を有効成分として含有する抗歯周病剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】歯周病は、歯周組織の炎症に始まり、歯周ポケット形成、歯周溝液貯留、歯肉退縮等を生じ、末期には歯槽骨が吸収されて歯牙の脱落をきたす、う蝕と並ぶ口腔内の二大疾患である。近年の研究で歯周病は、歯肉縁下プラークに棲息する歯周病細菌の感染によって発症、進行することが明らかにされている。
【０００３】歯肉縁下プラークに棲息する数百種を超える細菌の中で、歯周病の大部分を占める成人型歯周病の最有力原因菌はポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）である。本菌は非糖分解性の嫌気性桿菌で多量のプロテアーゼを産生して歯周溝貯留液中に放出する。従来は、ポルフィロモナス・ジンジバリスの産生するコラゲナーゼが、コラーゲンを主構成成分とする歯周組織の破壊要因と考えられ、歯周病の予防及び治療のために当該コラゲナーゼを阻害する研究が精力的に進められてきた。
【０００４】例えば、松葉、丁子、ローズマリー、烏薬、櫻皮、厚朴、辛夷、及び何首鳥よりなる群から選択される生薬を有効成分とする、ポルフィロモナス・ジンジバリスが産生するコラゲナーゼの阻害作用を有する抗歯周病剤（特許文献１参照）、ポルフィロモナス・ジンジバリスが産生するコラゲナーゼの阻害作用を有する、五味子抽出物を有効成分として含有する抗歯周病剤（特許文献２参照）、オトギリソウ科のマンゴスチンより得られる抽出物を有効成分とする抗う蝕、歯周病剤（特許文献３参照）等が提案されている。
【０００５】最近、ポルフィロモナス・ジンジバリスの産生するプロテアーゼの研究が進む中、トリプシン様プロテアーゼがポルフィロモナス・ジンジバリスの病原因子として主要な役割を演じていることが判明した。即ち、トリプシン様プロテアーゼは、ポルフィロモナス・ジンジバリスの産生するプロテアーゼの総プロテアーゼ活性の少なくとも８５％を占め、宿主のマトリックスメタロプロテアーゼの産生促進及び活性化による歯周組織破壊の亢進、サイトカイン分解による免疫反応の阻害、好中球の機能抑制、宿主の補体機能の不全化等、ポルフィロモナス・ジンジバリスの歯周病における主要な病原作用を担っていることが明らかにされている（非特許文献１参照）。
【０００６】これらの事実は、ポルフィロモナス・ジンジバリスの病原作用を弱めて歯周病を有効に予防・治療するには、従来のように、ポルフィロモナス・ジンジバリスの産生するコラゲナーゼの活性を阻害するだけでは充分でなく、トリプシン様プロテアーゼの活性を阻害する必要があることを意味している。
【０００７】ジュンサイは、温帯から熱帯にかけて広く分布する多年生の水草で、我国では芽を椀たねや酢の物等で食する。ジュンサイ抽出物については抗酸化及び抗菌作用（特許文献４参照）、抗炎症作用（特許文献５参照）等が開示されている。しかし、ジュンサイ抽出物のトリプシン様プロテアーゼ及びコラゲナーゼの活性阻害作用、並びに歯周病の予防及び治療におけるジュンサイ抽出物の利用は全く報告されていない。
【０００８】
【特許文献１】特開２００３−８１８００号公報
【特許文献２】特開２００２−１０４９８６号公報
【特許文献３】特開２００１−２４７４６９号公報
【特許文献４】特開平１−１３８２８８号公報
【特許文献５】特開平２−２８６６２２号公報
【非特許文献１】石田甫、高田春比古等編集：「歯周病―新しい治療を求めて」、株式会社寺田国際事務所／先端医療技術研究所、２０００年８月３１日、Ｐ２３７―２４７
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、今まで未解決であったポルフィロモナス・ジンジバリスが産生するトリプシン様プロテアーゼの活性を阻害すること、さらには当該菌が産生するトリプシン様プロテアーゼ及びコラゲナーゼの活性を阻害することで、歯周病を有効に予防及び治療し得る抗歯周病剤を提供することにある。
【００１０】本発明者らは係る課題に鑑みて鋭意研究したところ、ジュンサイ抽出物がポルフィロモナス・ジンジバリスの産生するトリプシン様プロテアーゼ及びコラゲナーゼの活性阻害作用を有することを見出し、当該抽出物を有効成分として含有せしめることで歯周病を有効に予防及び治療し得ることを確認し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
【問題を解決するための手段】本発明は、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）が産生するトリプシン様プロテアーゼの活性阻害作用を有するジュンサイ抽出物を有効成分として含有する抗歯周病剤、並びに当該菌が産生するトリプシン様プロテアーゼ及びコラゲナーゼの活性阻害作用を有するジュンサイ抽出物を有効成分として含有する抗歯周病剤である。
【００１２】本発明に係るジュンサイとは、キンポウゲ目スイレン科ジュンサイ属のジュンサイ（ＢｒａｓｅｎｉａｓｃｈｒｅｂｅｒｉＪ．Ｆ．Ｇｍｅｌ．）である。ジュンサイは葉、茎、根等の何れの部位も使用できるが、特に粘質物で覆われた芽或いは若葉を用いるのが好ましい。又、必要に応じてそのままの状態、破砕物、或いは乾燥物等を適宜選択して抽出操作に付することができる。
【００１３】抽出溶媒としては、例えば、メチルアルコール、エチルアルコール、プロピルアルコール、ブチルアルコール等の低級１価アルコール類、１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の多価アルコール、アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類、アセトニトリル、酢酸エチル、酢酸ブチル等のエステル類、ヘキサン、ヘプタン等の炭化水素、エチルエーテル、テトラヒドロフラン、プロピルエーテル等のエーテル類、及び水等が挙げられる。これらの溶媒は、１種又は２種以上を適宜選択して用いることができる。当該溶媒の中でも水、エチルアルコール、或いは水とエチルアルコールの混合溶媒を用いるのがより好ましい。
【００１４】抽出は、冷浸或いは温浸等の浸漬する方法、加熱攪拌等による方法、或いはパーコレーション法等の通常の抽出方法を用いることができる。得られた抽出液は、必要に応じてろ過又は遠心分離等により固形物を除去する。又、抽出液から溶媒を留去して濃縮液或いは乾燥物とすることもできる。乾燥には、減圧乾燥、凍結乾燥、噴霧乾燥等の通常の乾燥手段を用いることができる。
【００１５】本発明に係る抗歯周病剤は、ジュンサイ抽出物を乾燥物若しくは液としてそのまま、或いはジュンサイ抽出物を水、エチルアルコール等の溶媒で適宜希釈した形態で用いることができる。又、ジュンサイ抽出物を含有せしめた歯磨、洗口液、トローチ、チューインガム、或いは飴等の食品、化粧品、医薬部外品、及び医薬品の分野で通常用いられている形態で実施することもできる。
【００１６】本発明に係る抗歯周病剤におけるジュンサイ抽出物の含有量は、適用形態、適用方法等が異なるため一概に規定できないが、乾燥物としてのジュンサイ抽出物に換算して０．０００１〜２５重量％が好ましく、特に０．００１〜１０重量％がより好ましい。
【００１７】又、発明の効果を損なわない範囲において食品、化粧品、医薬部外品、医薬品において一般的に用いられている成分を配合することができる。例えば、リン酸水素カルシウム、炭酸カルシウム、シリカ、ハイドロキシアパタイト等の研磨剤、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウロイルサルコシンナトリウム、グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油等の界面活性剤、グルコン酸クロルヘキシジン、塩化セチルピリジニウム等の殺菌剤、ステビア、サッカリン、スクラロース、アスパルテーム等の高甘味度甘味料、ショ糖、乳糖、ブドウ糖等の糖類、デンプン、デキストリン、セルロース等の多糖類、グリセリン、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール等の多価アルコール、ソルビトール、エリスリトール、マルチトール、キシリトール等の糖アルコール、ゼラチン、プルラン、シェラック、ツェイン等の糊剤、カラギーナン、キサンタンガム、セルロースガム等の増粘剤、チクル、グッタペルカ、グアヤク脂等のガムベース、ナイアシン、ビタミンＣ、ビタミンＥ等のビタミン、安息香酸塩、パラオキシ安息香酸エステル等の保存料、ウィキョウエキス、カミツレエキス、セージエキス等の生薬エキス、並びに色素、香料、エタノール等を適宜配合することができる。
【実施例】
【００１８】次に本発明を詳細に説明するために実施例を挙げるが、本発明はこれらに限定されるものではない。尚、実施例に示す％は重量％を示す。
【００１９】実施例１
ジュンサイの芽２０００ｇに水２０ｌを加え、９５℃で２時間抽出した。ろ液を減圧下で濃縮し、更に真空凍結乾燥することでジュンサイ抽出物２０ｇを得た。
【００２０】実施例２
ジュンサイの芽１０００ｇに水１０ｌを加え、９０℃で２時間抽出した。ろ液を減圧下で濃縮し、パラオキシ安息香酸メチル２ｇを加え、更に水で全量が１０００ｇとなる様に調製してジュンサイ抽出液を得た。当該抽出液は、乾燥物としてのジュンサイ抽出物を８ｇ含む。
【００２１】実施例３
ジュンサイの芽の乾燥物２００ｇにエチルアルコール１ｌを加え、常温で７日間抽出した。ろ液を減圧下で濃縮乾固してジュンサイ抽出物５ｇを得た。
【００２２】実施例４
ジュンサイの芽の乾燥物１０００ｇに５０％エチルアルコール水溶液８ｌを加え、８０℃で５時間抽出した。ろ液を減圧下で濃縮した後、噴霧乾燥してジュンサイ抽出物３５ｇを得た。
【００２３】実施例５練歯磨

＜製法＞
成分３〜１０をよく混合した後、成分１及び２を加えて練和し、脱泡後チューブに充填して練歯磨を得た。
【００２４】実施例６洗口液

＜製法＞
成分９に成分２〜８を溶解した後、成分１加えて洗口液を得た。
【００２５】実施例７トローチ

＜製法＞
成分１〜４を混合し、流動層造粒装置で造粒する。得られた顆粒に成分５を加えて打錠し、１錠１０００ｍｇのタブレットを得た。
【００２６】実施例８チューインガム

＜製法＞
加温した成分１に、成分２及び３を加えて練和する。更に成分４及び５を加えてよく練和した後、圧延してシート状にし、切断してチューインガムを得た。
【００２７】
【発明の効果】本発明の効果を実証する為、実施例１のジュンサイ抽出物のポルフィロモナス・ジンジバリスが産生するトリプシン様プロテアーゼ及びコラゲナーゼに対する活性阻害作用を測定した。
【００２８】ポルフィロモナス・ジンジバリス産生酵素液の調製
ポルフィロモナス・ジンジバリスＪＭＣ８５２５株を、牛血清を含むブレインハートインフュージョン培地１００ｍｌに接種し、３７℃で３日間嫌気培養した。培養液を遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、２０分間）し、上清に硫酸アンモニウムを飽和（８０％）させて沈殿を生じさせた。再度遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、２０分間）し、得られた沈殿物を５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５、５ｍＭ塩化カルシウム）１００ｍｌに溶解し、同緩衝液を用いて十分に透析を行った。透析内液を０．２２μｍのメンブランフィルターでろ過し、ポルフィロモナス・ジンジバリス産生酵素液とした。
【００２９】トリプシン様プロテアーゼの活性阻害試験
実施例１のジュンサイ抽出物を０．４ｍｇ／ｍｌ及び２．０ｍｇ／ｍｌ（最終測定液中で０．１ｍｇ／ｍｌ及び０．５ｍｇ／ｍｌ）含むように、それぞれ１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５、１０ｍＭ塩化カルシウム）で調製し、ジュンサイ抽出物試料液とした。基質としてα−Ｎ−ベンゾイル−Ｌ−アルギニン−４−メチルクマリル−７−アミドを１０ｍＭ含む溶液１０μｌ、ポルフィロモナス・ジンジバリス産生酵素液２４０μｌ、ジュンサイ抽出物試料液２５０μｌ、及び１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５、１０ｍＭ塩化カルシウム）５００μｌを混合し、遮光下にて３７℃で２０分間反応させた。１００ｍＭモノクロロ酢酸を含む１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．３）を１ｍｌ加えて反応を停止した後、蛍光強度（励起波長３７０ｎｍ、蛍光波長４６０ｎｍ）を測定した。対照にはジュンサイ抽出物試料液の代わりに１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５、１０ｍＭ塩化カルシウム）を用い、ブランクとしてポルフィロモナス・ジンジバリス産生酵素液の代わりに１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５、１０ｍＭ塩化カルシウム）を用いた。ジュンサイ抽出物のトリプシン様プロテアーゼの活性阻害率は、以下の式から求めた。
阻害率（％）＝（１−（Ｃ−Ｄ）／（Ａ−Ｂ））×１００
Ａ：対照の蛍光強度、Ｂ：対照ブランクの蛍光強度、Ｃ：試料の蛍光強度、Ｄ：試料ブランクの蛍光強度
【００３０】コラゲナーゼの活性阻害試験
実施例１のジュンサイ抽出物を０．４ｍｇ／ｍｌ及び２．０ｍｇ／ｍｌ（最終測定液中で０．１ｍｇ／ｍｌ及び０．５ｍｇ／ｍｌ）含むように、それぞれ５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５，２００ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化カルシウム）で調製し、ジュンサイ抽出物試料液とした。基質としてフルオレッセインイソチオシアネートで標識したＩ型コラーゲンを０．５ｍｇ／ｍｌ含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５，２００ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化カルシウム）１００μｌ、ポルフィロモナス・ジンジバリス産生酵素液５０μｌ、及びジュンサイ抽出物試料液５０μｌを混合し、遮光下にて３７℃で３時間反応させた。８０ｍＭのオルトフェナントロリン１０μｌを加えて反応を停止した後、エタノールと１７０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．５，６７０ｍＭ塩化ナトリウム）が７：３の混合液を２００μｌ加え、３０分間室温にて静置した。その後遠心分離（３，０００ｒｐｍ、１０分間）し、上清の蛍光強度（励起波長４９５ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を測定した。対照にはジュンサイ抽出物試料液の代わりに５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５，２００ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化カルシウム）を用い、ブランクとしてポルフィロモナス・ジンジバリス産生酵素液の代わりに５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５，２００ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化カルシウム）を用いた。ジュンサイ抽出物のコラゲナーゼ阻害率は、以下の式から求めた。
阻害率（％）＝（１−（Ｃ−Ｄ）／（Ａ−Ｂ））×１００
Ａ：対照の蛍光強度、Ｂ：対照ブランクの蛍光強度、Ｃ：試料の蛍光強度、Ｄ：試料ブランクの蛍光強度
【００３１】試験結果
トリプシン様プロテアーゼの活性阻害試験結果を表１に、コラゲナーゼの活性阻害試験結果を表２に示す。
【００３２】

【００３３】

【００３４】上記の結果より、本発明に係るジュンサイ抽出物は、ポルフィロモナス・ジンジバリスの産生するトリプシン様プロテアーゼとコラゲナーゼの活性を強く阻害していることがわかる。
【００３５】即ち本発明は、ポルフィロモナス・ジンジバリスの主要な病原作用を担うトリプシン様プロテアーゼ及び歯周組織を破壊するコラゲナーゼの活性を強力に阻害する、歯周病の予防及び治療に極めて有用な抗歯周病剤である。又、古来より食され安全性の高いジュンサイの抽出物を有効成分とするものであるから、歯磨、洗口液、飴、チューインガム等の様々な形態の抗歯周病剤として広く用いることができる。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to an anti-periodontal disease agent containing Junsai extract as an active ingredient.
[0002]
BACKGROUND OF THE INVENTION Periodontal disease begins with inflammation of periodontal tissues, causing periodontal pocket formation, periodontal groove fluid retention, gingival recession, etc., and the alveolar bone is absorbed at the end stage, resulting in tooth loss. It is two major diseases in the oral cavity along with caries. Recent studies have shown that periodontal disease develops and progresses due to infection with periodontal disease bacteria that inhabit subgingival plaque.
Among the hundreds of bacteria inhabiting subgingival plaque, the most prominent causative agent for adult periodontal disease, which accounts for the majority of periodontal disease, is Porphyromonas gingivalis. . This bacterium is a non-glycolytic anaerobic gonococcus that produces a large amount of protease and releases it into the periodontal sulcus. Conventionally, collagenase produced by Porphyromonas gingivalis is considered to be a factor that destroys periodontal tissue whose main component is collagen, and research to inhibit the collagenase for the prevention and treatment of periodontal disease has been active. Has been promoted.
For example, collagenase produced by Porphyromonas gingivalis, comprising as an active ingredient a herbal medicine selected from the group consisting of pine needles, clove, rosemary, glaze, husks, magnolia, spicy cucumbers, and many birds Anti-periodontitis agent having an inhibitory action (see Patent Literature 1), anti-periodontal disease agent having an inhibitory action on collagenase produced by Porphyromonas gingivalis as an active ingredient (Patent Literature 2) Reference), an anticaries, a periodontal disease agent (see Patent Document 3) and the like, which contain an extract obtained from mangosteen of the Hypericaceae family as active ingredients.
Recently, as research on proteases produced by Porphyromonas gingivalis progresses, it has been found that trypsin-like protease plays a major role as a pathogenic factor of Porphyromonas gingivalis. That is, trypsin-like protease accounts for at least 85% of the total protease activity of the protease produced by Porphyromonas gingivalis, enhances periodontal tissue destruction by promoting and activating host matrix metalloproteinase, and immunity by cytokine degradation It has been clarified that it plays a major pathogenic effect on periodontal disease of Porphyromonas gingivalis, such as inhibition of reaction, suppression of neutrophil function, and failure of host complement function (non-patent literature) 1).
These facts indicate that, in order to effectively prevent and treat periodontal disease by weakening the pathogenic action of Porphyromonas gingivalis, the activity of collagenase produced by Porphyromonas gingivalis is inhibited as in the past. It is not enough to do so, meaning that it is necessary to inhibit the activity of trypsin-like proteases.
Junsai is a perennial aquatic plant widely distributed from the temperate zone to the tropics. In Japan, it is eaten with sprouts and vinegar. As for Junsai extract, antioxidant and antibacterial action (see Patent Document 4), anti-inflammatory action (see Patent Document 5) and the like are disclosed. However, the activity of Junsai extract to inhibit trypsin-like protease and collagenase activity and the use of Junsai extract in the prevention and treatment of periodontal disease have not been reported at all.
[0008]
[Patent Document 1] JP 2003-81800 [Patent Document 2] JP 2002-104986 [Patent Document 3] JP 2001-247469 [Patent Document 4] JP 1-1138288 [Patent Document 3] Document 5: JP-A-2-286622 [Non-patent document 1] Edited by Kei Ishida, Haruhiko Takada, etc .: “Periodontal disease-seeking new treatment”, Terada International Office, Advanced Medical Technology Research Institute, 2000 August 31, pp. 237-247
[0009]
The object of the present invention is to inhibit the activity of trypsin-like protease produced by Porphyromonas gingivalis, which has been unsolved until now, and also to trypsin-like protease produced by the bacterium. It is another object of the present invention to provide an anti-periodontal agent capable of effectively preventing and treating periodontal disease by inhibiting the activity of collagenase.
The present inventors have intensively studied in view of such problems, and found that Junsai extract has the activity of inhibiting the activity of trypsin-like protease and collagenase produced by Porphyromonas gingivalis. It was confirmed that periodontal disease can be effectively prevented and treated by containing it as a component, and the present invention has been completed.
[0011]
[Means for Solving the Problem] The present invention relates to an anti-periodontal disease agent comprising, as an active ingredient, an extract of Junsai which has an activity inhibiting activity of trypsin-like protease produced by Porphyromonas gingivalis, and It is an anti-periodontal disease agent containing Junsai extract which has an activity inhibitory action on trypsin-like protease and collagenase produced by the bacterium as an active ingredient.
The Junsai according to the present invention is a Brachylia schreberi JF Gmel. Junsai can use any part of leaves, stems, roots, etc., but it is particularly preferable to use buds or young leaves covered with sticky material. Moreover, as it is, the state as it is, a crushed material, a dried material, etc. can be selected suitably, and it can attach | subject to extraction operation.
Examples of the extraction solvent include lower monohydric alcohols such as methyl alcohol, ethyl alcohol, propyl alcohol, and butyl alcohol, polyhydric alcohols such as 1,3-butylene glycol, propylene glycol, and glycerin, acetone, methyl ethyl ketone, and the like. Ketones, esters such as acetonitrile, ethyl acetate and butyl acetate, hydrocarbons such as hexane and heptane, ethers such as ethyl ether, tetrahydrofuran and propyl ether, and water. These solvents can be used by appropriately selecting one kind or two or more kinds. Among these solvents, it is more preferable to use water, ethyl alcohol, or a mixed solvent of water and ethyl alcohol.
Extraction can be performed by a normal extraction method such as a soaking method such as cold soaking or digestion, a method using heating and stirring, or a percolation method. From the obtained extract, solids are removed by filtration or centrifugation as necessary. Alternatively, the solvent can be distilled off from the extract to obtain a concentrated solution or a dried product. For drying, usual drying means such as reduced pressure drying, freeze drying, spray drying and the like can be used.
The anti-periodontal disease agent according to the present invention can be used in the form of Junsai extract as a dry product or liquid as it is, or the Junsai extract is appropriately diluted with a solvent such as water or ethyl alcohol. It can also be carried out in a form commonly used in the fields of foods such as toothpaste, mouthwash, troche, chewing gum, or candy containing Junsai extract, cosmetics, quasi-drugs, and pharmaceuticals.
[0016] The content of Junsai extract in the anti-periodontal disease agent according to the present invention cannot be defined unconditionally because the application form, application method, etc. are different, but it is 0.0001 in terms of Junsai extract as a dried product. -25% by weight is preferable, and 0.001-10% by weight is more preferable.
In addition, ingredients generally used in foods, cosmetics, quasi-drugs and pharmaceuticals can be blended within a range not impairing the effects of the invention. For example, abrasives such as calcium hydrogen phosphate, calcium carbonate, silica, hydroxyapatite, surfactants such as sodium lauryl sulfate, sodium lauroyl sarcosine, glycerin fatty acid ester, sucrose fatty acid ester, polyoxyethylene hydrogenated castor oil, gluconic acid Bactericides such as chlorhexidine and cetylpyridinium chloride, high-intensity sweeteners such as stevia, saccharin, sucralose and aspartame, sugars such as sucrose, lactose and glucose, polysaccharides such as starch, dextrin and cellulose, glycerin, propylene glycol, Polyhydric alcohols such as 1,3-butylene glycol, sugar alcohols such as sorbitol, erythritol, maltitol, xylitol, glues such as gelatin, pullulan, shellac, zein, carrageenan, Thickeners such as suntan gum and cellulose gum, gum bases such as chicle, gutta percha and guaiac fat, vitamins such as niacin, vitamin C and vitamin E, preservatives such as benzoate and paraoxybenzoate, fennel extract and chamomile extract , Herbal extracts such as sage extract, pigments, fragrances, ethanol and the like can be appropriately blended.
【Example】
Next, examples are given to describe the present invention in detail, but the present invention is not limited to these examples. In addition,% shown in an Example shows weight%.
Example 1
20 l of water was added to 2000 g of Junsai sprouts and extracted at 95 ° C. for 2 hours. The filtrate was concentrated under reduced pressure and further freeze-dried in vacuo to obtain 20 g of Junsai extract.
Example 2
10 l of water was added to 1000 g of Junsai sprouts and extracted at 90 ° C. for 2 hours. The filtrate was concentrated under reduced pressure, 2 g of methyl paraoxybenzoate was added, and the total amount was adjusted to 1000 g with water to obtain Junsai extract. The extract contains 8 g of Junsai extract as a dried product.
Example 3
1 liter of ethyl alcohol was added to 200 g of dried buds of Junsai buds and extracted at room temperature for 7 days. The filtrate was concentrated to dryness under reduced pressure to obtain 5 g of Junsai extract.
Example 4
To 1000 g of dried Jun Sprout buds, 8 l of a 50% aqueous ethyl alcohol solution was added and extracted at 80 ° C. for 5 hours. The filtrate was concentrated under reduced pressure and then spray-dried to obtain 35 g of Junsai extract.
Example 5 Toothpaste

<Production method>
After mixing components 3 to 10 well, components 1 and 2 were added and kneaded. After degassing, the tube was filled to obtain a toothpaste.
Example 6 Mouthwash

<Production method>
After components 2-8 were dissolved in component 9, component 1 was added to obtain a mouthwash.
Example 7 Lozenges

<Production method>
Ingredients 1-4 are mixed and granulated with a fluid bed granulator. Ingredient 5 was added to the obtained granules and tableted to obtain 1000 mg tablets.
Example 8 Chewing gum

<Production method>
Add ingredients 2 and 3 to warmed ingredient 1 and knead. Further, components 4 and 5 were added and kneaded well, then rolled to a sheet and cut to obtain a chewing gum.
[0027]
In order to demonstrate the effect of the present invention, the activity inhibitory action on trypsin-like protease and collagenase produced by Porphyromonas gingivalis of Junsai extract of Example 1 was measured.
Preparation of Porphyromonas gingivalis producing enzyme solution Porphyromonas gingivalis strain JMC8525 was inoculated into 100 ml of brain heart infusion medium containing bovine serum and anaerobically cultured at 37 ° C. for 3 days. The culture solution was centrifuged (15,000 rpm, 20 minutes), and ammonium sulfate was saturated (80%) in the supernatant to cause precipitation. Centrifugation again (15,000 rpm, 20 minutes), the resulting precipitate was dissolved in 100 ml of 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5, 5 mM calcium chloride), and dialyzed sufficiently using the same buffer. It was. The dialyzed solution was filtered through a 0.22 μm membrane filter to obtain a Porphyromonas gingivalis producing enzyme solution.
Inhibition test of trypsin-like protease activity: Junsai extract of Example 1 was contained so as to contain 0.4 mg / ml and 2.0 mg / ml (0.1 mg / ml and 0.5 mg / ml in the final measurement solution). These were prepared with 100 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5, 10 mM calcium chloride), respectively, and used as the Junsai extract sample solution. 10 μl of a solution containing 10 mM α-N-benzoyl-L-arginine-4-methylcoumaryl-7-amide as a substrate, 240 μl of Porphyromonas gingivalis producing enzyme solution, 250 μl of Junsai extract sample solution, and 100 mM Tris-HCl buffer ( 500 μl of pH 7.5, 10 mM calcium chloride) was mixed and reacted at 37 ° C. for 20 minutes in the dark. After 1 ml of 100 mM sodium acetate buffer solution (pH 4.3) containing 100 mM monochloroacetic acid was added to stop the reaction, fluorescence intensity (excitation wavelength: 370 nm, fluorescence wavelength: 460 nm) was measured. As a control, 100 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5, 10 mM calcium chloride) was used instead of Junsai extract sample solution, and 100 mM Tris-HCl buffer (pH 7) was used instead of Porphyromonas gingivalis producing enzyme solution as a blank. .5, 10 mM calcium chloride). The activity inhibition rate of trypsin-like protease of Junsai extract was determined from the following formula.
Inhibition rate (%) = (1− (C−D) / (A−B)) × 100
A: control fluorescence intensity, B: control blank fluorescence intensity, C: sample fluorescence intensity, D: sample blank fluorescence intensity test for inhibition of collagenase activity The Junsai extract of Example 1 was 0.4 mg / ml. And 2.0 mg / ml (0.1 mg / ml and 0.5 mg / ml in the final measurement solution) prepared with 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5, 200 mM sodium chloride, 5 mM calcium chloride), respectively. The sample liquid was Junsai extract. 100 μl of 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5, 200 mM sodium chloride, 5 mM calcium chloride) containing 0.5 mg / ml type I collagen labeled with fluorescein isothiocyanate as a substrate, 50 μl of Porphyromonas gingivalis producing enzyme solution , And 50 μl of Junsai extract sample solution were mixed and allowed to react at 37 ° C. for 3 hours in the dark. The reaction was stopped by adding 10 μl of 80 mM orthophenanthroline, and then 200 μl of a 7: 3 mixture of ethanol and 170 mM Tris-HCl buffer (pH 9.5, 670 mM sodium chloride) was added and left at room temperature for 30 minutes. . Thereafter, centrifugation (3,000 rpm, 10 minutes) was performed, and the fluorescence intensity of the supernatant (excitation wavelength: 495 nm, fluorescence wavelength: 520 nm) was measured. As a control, 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5, 200 mM sodium chloride, 5 mM calcium chloride) was used instead of Junsai extract sample solution, and 50 mM Tris-HCl was used as a blank instead of Porphyromonas gingivalis producing enzyme solution. A buffer solution (pH 7.5, 200 mM sodium chloride, 5 mM calcium chloride) was used. The collagenase inhibition rate of Junsai extract was determined from the following equation.
Inhibition rate (%) = (1− (C−D) / (A−B)) × 100
A: Control fluorescence intensity, B: Control blank fluorescence intensity, C: Sample fluorescence intensity, D: Sample blank fluorescence intensity Test results Table 1 shows the activity inhibition test results of trypsin-like protease. Collagenase activity The inhibition test results are shown in Table 2.
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From the above results, it can be seen that the extract of Junsai according to the present invention strongly inhibits the activities of trypsin-like protease and collagenase produced by Porphyromonas gingivalis.
That is, the present invention is extremely useful for the prevention and treatment of periodontal disease, which strongly inhibits the activity of trypsin-like protease responsible for the main pathogenic action of Porphyromonas gingivalis and collagenase that destroys periodontal tissue. It is an anti-periodontal agent. In addition, since it is an active ingredient that has been eaten since ancient times and is highly safe, it can be widely used as an anti-periodontal disease agent in various forms such as toothpaste, mouthwash, salmon, chewing gum, etc. .

Claims

An anti-periodontal disease agent containing, as an active ingredient, Junsai extract having an inhibitory activity on trypsin-like protease produced by Porphyromonas gingivalis.

An anti-periodontal disease agent containing, as an active ingredient, Junsai extract which has an activity inhibitory action on trypsin-like protease and collagenase produced by Porphyromonas gingivalis.

The anti-periodontal disease agent according to claim 1 or 2, wherein Junsai extract is an extract of water and / or ethyl alcohol.