JP2005024642A - レーザ走査型共焦点顕微鏡装置 - Google Patents
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Abstract
【課題】本発明は、標本に光ビームを走査し、標本からの反射光や蛍光を光電変換し、三次元標本画像を生成するレーザ走査型共焦点顕微鏡装置に関し、特に水平同期信号に同期して標本面を１ライン走査する毎に、標本の光軸方向への位置を連続的に変化させ、標本画像を取得するレーザ走査型共焦点顕微鏡装置を提供するものである。
【解決手段】本発明は、光源１からレーザ光を走査機構２、対物レンズ３を通して標本に照射し、その反射光、又は蛍光をピンホール４を通して検出し、光電変換手段５により電気信号に変換して画像データを形成するレーザ走査型共焦点顕微鏡であり、走査条件取得手段８に設定した走査条件に基づいて標本のリファレンス画像を作成し、当該リファレンス画像から例えば輝度の高い部分をＹ−Ｚ画像として表示し、注目部位の指定を行った後、Ｚ位置移動コースデータ及びＺ位置移動速度データを作成し、当該データに従って標本画像を高速、かつ位置精度よく取得する構成である。
【選択図】 図１
【解決手段】本発明は、光源１からレーザ光を走査機構２、対物レンズ３を通して標本に照射し、その反射光、又は蛍光をピンホール４を通して検出し、光電変換手段５により電気信号に変換して画像データを形成するレーザ走査型共焦点顕微鏡であり、走査条件取得手段８に設定した走査条件に基づいて標本のリファレンス画像を作成し、当該リファレンス画像から例えば輝度の高い部分をＹ−Ｚ画像として表示し、注目部位の指定を行った後、Ｚ位置移動コースデータ及びＺ位置移動速度データを作成し、当該データに従って標本画像を高速、かつ位置精度よく取得する構成である。
【選択図】 図１
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、標本に光ビームを走査し、標本からの反射光や蛍光を光電変換し、三次元標本画像を生成するレーザ走査型共焦点顕微鏡装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
レーザ走査型顕微鏡は、レーザー光をガルバノメータスキャナ等を用いて水平方向、及び垂直方向に偏光させ、標本に対して二次元走査を行い、標本からの反射光若しくは蛍光を対物レンズを含む光学系を通して光検出器により検出し、ＣＲＴディスプレイ等に標本の３次元画像を表示するものである。
【０００３】
さらに、共焦型のレーザ走査型顕微鏡は、光検出器の手前にピンホールを設け、標本上の対物レンズの焦点と、ピンホールにおける受光側の焦点とが共焦点を形成するように光学系（共焦点光学系）が形成されている。このような構成によれば、標本上の対物レンズの焦点からの反射光、若しくは蛍光以外の光はピンホールにより排除し、標本の光軸方向への分解能を向上することができる。
【０００４】
この特長を活かし、対物レンズと標本との光軸方向の相対位置を変化させながら標本に対して二次元走査を行い、各相対位置における標本の二次元画像を積み重ねることで、標本の三次元画像を作成することが可能である。そして、この処理を一定時間間隔で繰り返すことにより、例えば神経細胞等の成長過程を三次元画像で立体的に観察することができる。
【０００５】
例えば、特許文献１には二次元スキャンユニットによって光源からの光を平面走査し、対物レンズ駆動部を駆動して光軸方向に対物レンズと試料の距離を制御して三次元画像を作成する発明が開示されている。
【０００６】
【特許文献１】特開平１０−１６１０３４号公報（段落番号００１７〜００７０、図１〜図６）
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記従来の方法では、三次元の標本画像の作成に多大な時間を要し、更に標本に対してレーザ照射が繰り返される為、標本のダメージも大きくなる。
【０００８】
一方、水平方向に１ライン走査をする毎に、標本と対物レンズの光軸方向の相対位置を変化させレーザ照射を行う方法も提案されている。しかし、この方法では１ラインの走査毎に走査を停止し、ステージ若しくは対物レンズの移動を行う必要があり、ステージ若しくは対物レンズが安定するまで次のラインの走査を待機することになり、三次元画像の取得に時間を要する。
【０００９】
そこで、本発明は標本に対する走査を行う際、標本の光軸方向への位置を連続的に変化させ、標本画像を取得することにより、光軸方向の注目部位の標本画像を高速に取得し、標本に与えるダメージを極力抑えることを可能にするレーザ走査型共焦点顕微鏡装置を提供するものである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
上記課題は請求項１記載の発明によれば、レーザ光源と、該レーザ光源から発した光ビームを標本に集光する対物レンズと、前記標本に対して前記光ビームを二次元走査するための走査機構と、前記標本からの反射光、蛍光、又は透過光を電気信号に変換する光電変換手段と、前記走査機構の水平同期信号を検出する水平同期信号検出手段と、前記走査機構の垂直同期信号を検出する垂直同期信号検出手段と、前記対物レンズと前記標本との光軸方向の相対位置を可変するＺ位置制御機構と、前記標本に対して二次元走査を行い、前記標本の参照画像を取得する参照画像取得手段と、光軸方向に前記参照画像の輝度の高い注目部位を指定するＺ位置指定手段と、前記Ｚ位置指定手段により指定した前記注目部位のデータに基づいてＺ位置移動コースデータ及びＺ位置移動速度データを作成する作成手段と、該Ｚ位置移動コースデータ及びＺ位置移動速度データに基づいて前記Ｚ位置制御機構を連続的に動作させ、標本画像を取得する標本画像取得手段とを有するレーザ走査型共焦点顕微鏡装置を提供することによって達成できる。
【００１１】
ここで、本発明の装置に使用する顕微鏡は、レーザ走査型共焦点顕微鏡であり、レーザ光源から発した光ビームを標本に集光し、光検出器の手前に設けられたピンホールによって標本の光軸方向への分解能を向上する構成である。また、標本に対する二次元走査の際、Ｚ位置移動コースデータ及びＺ位置移動速度データに従ってＺ位置制御機構を駆動し、標本をＺ方向に連続的に移動させる構成である。
【００１２】
したがって、三次元の標本画像を作成する際、対物レンズと標本間を連続して相対移動させることができ、標本走査を短時間で行い、標本に与えるダメージを極力小さく抑えることができる。
また、Ｚ位置指定手段による注目部位の指定は、例えばマウス等のポインティングデバイスを用いて行い、当該注目部位間を直線補間、スプライン補間等によって補間し、上記Ｚ位置移動コースデータを作成し、更にＺ位置移動速度データを作成するものである。
【００１３】
請求項２の記載は、請求項１の記載において、前記Ｚ位置指定手段は、例えば使用する対物レンズの開口数と倍率から求めたＺ方向の光学分解能を基に、前記注目部位の入力可能範囲を明示的に表示する構成である。
このように構成することにより、マウス等を使用して注目部位の指定を行う際、指定可能範囲を視覚的に確認しながら行うことができ、光軸方向の光学分解能を考慮したＺ位置移動コースデータの作成が可能となる。
【００１４】
請求項３の記載は、請求項１の記載において、前記Ｚ位置指定手段は、前記垂直同期信号検出手段により垂直同期信号が検出されると、前記Ｚ位置移動コースデータを一定間隔で光軸方向に上下させ、前記Ｚ位置移動速度データと前記Ｚ位置移動コースデータを基に、前記Ｚ位置制御機構を制御する構成である。
【００１５】
このように構成することにより、自動的に光軸方向に一定の幅を持った標本画像の走査が可能となる。
上記課題は請求項４記載の発明によれば、レーザ光源と、該レーザ光源から発した光ビームを標本に集光する対物レンズと、前記標本に対して前記光ビームを二次元走査するための走査機構と、前記標本からの反射光、蛍光、又は透過光を電気信号に変換する光電変換手段と、前記走査機構の水平同期信号を検出する水平同期信号検出手段と、前記走査機構の垂直同期信号を検出する垂直同期信号検出手段と、前記対物レンズと前記標本との光軸方向の相対位置を可変するＺ位置制御機構とを有するレーザ走査型共焦点顕微鏡装置の制御方法であって、前記標本に対して二次元走査を行い、前記標本の参照画像を取得する参照画像取得処理と、光軸方向に前記参照画像の輝度の高い注目部位を指定するＺ位置指定処理と、該Ｚ位置指定処理により指定した前記注目部位のデータに基づいてＺ位置移動コースデータ及びＺ位置移動速度データを作成する処理と、前記Ｚ位置移動コースデータ及びＺ位置移動速度データに従って前記Ｚ位置制御機構を連続的に動作させ、標本画像を取得する処理とを行うレーザ走査型共焦点顕微鏡装置の制御方法を提供することによって達成できる。
【００１６】
本発明は方法の発明であり、このように構成することによっても対物レンズと標本間を連続して相対移動させることができ、標本走査を短時間で行うことができ、標本へのダメージも最小限に抑えることができる。
上記課題は請求項５記載の発明によれば、レーザ光源と、該レーザ光源から発した光ビームを標本に集光する対物レンズと、前記標本に対して前記光ビームを二次元走査するための走査機構と、前記標本からの反射光、蛍光、又は透過光を電気信号に変換する光電変換手段と、前記走査機構の水平同期信号を検出する水平同期信号検出手段と、前記走査機構の垂直同期信号を検出する垂直同期信号検出手段と、前記対物レンズと前記標本との光軸方向の相対位置を可変するＺ位置制御機構とを有するレーザ走査型共焦点顕微鏡装置に使用されるプログラムであって、前記標本に対して二次元走査を行い、前記標本の参照画像を取得する参照画像取得機能と、光軸方向に前記参照画像の輝度の高い注目部位を指定するＺ位置指定機能と、該Ｚ位置指定機能により指定した前記注目部位のデータに基づいてＺ位置移動コースデータ及びＺ位置移動速度データを作成する機能と、前記Ｚ位置移動コースデータ及びＺ位置移動速度データに従って前記Ｚ位置制御機構を連続的に動作させ、標本画像を取得する機能とを備えたコンピュータが実行可能なプログラムを提供することによって達成できる。
【００１７】
本発明はレーザ走査型共焦点顕微鏡装置に使用するプログラムの発明であり、このようにプログラムを使用し、レーザ走査型共焦点顕微鏡を制御することによって、対物レンズと標本間を連続して相対移動させることができ、標本走査を短時間で行うことができ、標本へのダメージも最小限に抑えることができる。
【００１８】
【発明の実施形態】
＜第１の実施形態＞
以下、本発明の第１の実施形態について図を用いて説明する。
図１は本例で使用するレーザ走査型共焦点顕微鏡装置のシステム構成図である。同図において、光源１から照射される光ビームは、ガルバノミラー等で構成される走査機構２を通して水平方向、垂直方向に偏光され、更に対物レンズ３を通り、ステージ１４上の標本に照射される。
【００１９】
標本面で反射した反射光、又は標本内に透過された光照射に基づいて標本からの蛍光は、再び対物レンズ３、走査機構２を通り、ピンホール４に到達する。ピンホール４は標本の焦点以外からの光を排除し、焦点からの反射光、又は蛍光のみを通過させる。さらに、ピンホール４を通過した光は光電変換手段５に入射し、電気信号に変換し、アナログ／デジタル変換器（Ａ／Ｄ変換器）６によってデジタルデータに変換される。
【００２０】
Ａ／Ｄ変換器６でデジタルデータに変換されたデータは、パーソナルコンピュータ（ＰＣ）に入力し、標本画像の作成が行われる。ここで、パーソナルコンピュータ（ＰＣ）は、ＣＰＵ７、走査条件取得手段８、記憶媒体９、Ｚ位置（光軸位置）指定手段１０で構成され、ＣＰＵ７は上記記憶媒体９に登録された制御プログラムに従って処理を行う。尚、ＣＰＵ７はＣＲＴディスプレイ等の不図示の表示装置に接続され、上記デジタルデータに基づいて作成された標本画像等を表示する。
【００２１】
Ｚ位置指定手段１０は、ＣＰＵ７の制御に従って標本の注目部位を指定する際使用され、Ｚ位置指定手段１０によって指定された注目部位のデータは後述するＺ位置移動コースデータの作成、及びＺ位置移動速度データの作成に使用される。
【００２２】
また、記憶媒体９には制御プログラムが登録され、上記走査条件取得手段８で取得した走査条件、Ｚ位置指定手段１０で指定した注目部位のデータ、及びＺ位置移動コースデータやＺ位置移動速度データ等を記憶する。
また、水平同期信号検出手段１１、及び垂直同期信号検出手段１２はＣＰＵ７に接続され、ガルバノミラーの駆動信号に基づいて水平同期信号、及び垂直同期信号を検出する。
【００２３】
さらに、Ｚ位置制御機構１３はＣＰＵ７から出力される制御信号によって駆動し、ステージ１４を上下に移動し、標本への光ビームの照射位置を制御する。尚、上記Ｚ位置制御機構１３は、顕微鏡に内蔵される準焦部駆動モータを使用する機構であってもよく、又圧電素子を用いた機構としてもよく、更に光学素子のみを動作させる機構としてもよい。
【００２４】
次に、本例の処理動作について説明する。
先ず、本例の全体処理動作を図２に示すフローチャートを用いて説明する。先ず、標本の光軸方向の注目部位を指定するために必要となるリファレンス画像（参照画像）を取得する（ステップ（以下、Ｓで示す）１）。この処理は、標本に対してレーザ光を走査し、順次二次元画像を取得し、この二次元画像を積み重ねて三次元のリファレンス画像（参照画像）を得る処理である。
【００２５】
次に、上記処理によって取得したリファレンス画像を基に、前述のＺ位置指定手段１０により標本の光軸方向の注目部位を指定し、Ｚ位置制御機構１３を制御するためのＺ位置移動コースデータ、Ｚ位置移動速度データを設定する（Ｓ２）。設定された各データは、記憶媒体９内の制御プログラムに登録される。
【００２６】
次に、上記処理によって登録したＺ位置移動コースデータ、及びＺ位置移動速度データに従い、標本の光軸方向の位置を制御し、標本画像を取得する（Ｓ３）。
以下、上記各処理（Ｓ１〜Ｓ３）について、具体的に説明する。
【００２７】
先ず、リファレンス画像取得処理（前述の処理（Ｓ１））について、図３に示すフローチャートに従って説明する。
この処理は、前述のようにリファレンス画像の取得処理であり、先ずリファレンス画像の取得条件を設定する（Ｓ１１）。図４はリファレンス画像の取得条件を説明する図であり、標本を三次元画像（Ｘ、Ｙ、Ｚの各軸が互いに直交する三次元画像）で示す。本例において、取得条件は同図に示す標本の光軸方向の画像取り込み開始位置（同図に示すａ）、標本の光軸方向の画像取り込み終了位置（同図に示すｂ）、及び画像取り込み開始位置から画像取り込み終了位置までの相対距離をｎステップに分割した時の１ステップ分の光軸方向の距離（インターバル）（同図に示すｃ）である。
【００２８】
尚、上記取得条件は、不図示のマウスやキーボードを使用して行われ、例えば画像取り込み開始位置（ａ）が設定されると、リファレンス画像を取得する際のＺ位置の初期値として登録される。そして、この登録によって、Ｚ位置制御機構１３はステージ１４を光軸方向に移動し、標本を画像取り込み開始位置にセットする。
【００２９】
次に、画像取り込み開始位置における標本の平面画像を取得する（Ｓ１２）。この処理は、光源１からレーザ光の照射を行い、光電変換手段５で検出する光量データに従って図４に示すａ１の平面画像を取得する。
次に、上記処理によって設定したインターバル分、光軸方向の位置を画像取り込み終了位置側へ移動する（Ｓ１３）。そして、現在のＺ位置と上記処理（Ｓ１１）によって設定した画像取り込み終了位置とを比較し、現在のＺ位置が画像取り込み終了位置より大きい場合（現在のＺ位置＞画像取り込み終了位置）、次の処理に移行する（Ｓ１４）。しかし、最初の処理では、平面画像ａ１に対する画像取り込みを行った直後であり、最初のこの判断（Ｓ１４）はＮＯ（ノー）である。
【００３０】
したがって、次の標本の平面画像の取り込み処理に戻り（Ｓ１２）、以後光軸方向にインターバル分順次加算を行い、平面画像の取り込み処理を繰り返し（Ｓ１２〜Ｓ１４）、平面画像ａ２、ａ３、・・・を順次ＣＰＵ７に取り込む。そして、取得した各Ｚ位置における標本の平面画像を積み重ね、標本の光軸方向への三次元画像を構築する。
【００３１】
その後、現在のＺ位置が画像取り込み終了位置を越えると（Ｓ１４がＹＥＳ（イエス））、上記標本の三次元画像をリファレンス画像として登録し（Ｓ１５）、リファレンス画像の取得処理を終了する。
次に、上記処理によって取得したリファレンス画像を使用して、Ｚ位置移動コースの設定処理を説明する（図２のフローチャート（Ｓ２）の処理）。
【００３２】
図５はこの処理を説明するフローチャートである。先ず、取得したリファレンス画像（図６（ａ）参照）を構成するｎ枚の標本像を基に、光軸方向の同一画素の輝度値を加算し、１枚の標本の平面画像を作成する（Ｓ２１）。以下、この画像をＸ−Ｙエクステンド画像という。尚、図６（ｂ）は、リファレンス画像から光軸方向の輝度値を加算し、輝度値の高い部分を示すＸ−Ｙエクステンド画像の例である。
【００３３】
次に、水平方向をＹ軸、垂直方向をＺ軸としたＹ−Ｚ画像を作成する（Ｓ２２）。この処理も上記と同様、リファレンス画像からＸ軸方向の輝度値を加算し、標本内の輝度の高い部分を抽出して、同図（ｃ）に示すＹ−Ｚ画像を取得する。次に、注目部位指定のための画面を表示装置に表示する（Ｓ２３）。すなわち、この処理によって、例えば図７に示す表示を行う。尚、同図（ａ）は、前述のリファレンス画像を示し、ｎ枚の標本像を積み重ねて作成した標本の三次元画像である。また、同図（ｂ）は上記Ｘ−Ｙエクステンド画像を示し、同図（ｃ）はＹ−Ｚ画像を示す。尚、同図（ｄ）については後述する。
【００３４】
次に、上記表示状態において、マウス等の入力デバイスを操作し、Ｙ−Ｚ画像上に注目部位を指定する（Ｓ２４）。すなわち、Ｙ−Ｚ画像上にＺ位置指定インジケータ１５を設定する。
次に、Ｚ位置移動コースデータ、及びＺ位置移動速度データを作成する（Ｓ２５）。この処理は、図７に示す画面上のセットボタン１６を押下することによって実行され、上記Ｚ位置指定インジケータ１５で指定された各ポイント間をスプライン補完、若しくは多項式近似補完し、Ｚ位置移動コースを同図（ｄ）に示す如く表示する。このＺ位置移動コースは、標本像の垂直方向のライン数分の標本の光軸方向の座標配列である。
【００３５】
例えば、図８に示す設定を行った場合、各Ｚ位置指定インジケータ間をライン数分のポイントでスプライン補完、若しくは多項式近似補完したＺ位置移動コースが生成される。尚、上記スプライン補完は各ポイント間をスプライン曲線で結ぶ補完方法であり、多項式近似補間は各ポイント間を多項式で近似する補完方法であり、上記以外にも複数のポイントを直線で結ぶ直線補間等を使用することができる。
【００３６】
上記処理によって、以下のようなＺ位置移動コースデータが生成される。例として、Ｙ方向５１２画素の画像を取得した場合（Ｚｐｏｓｉｔｉｏｎ［０］〜Ｚｐｏｓｉｔｉｏｎ［５１１］）を以下に示す。
Ｚｐｏｓｉｔｉｏｎ［０］＝１μｍ
Ｚｐｏｓｉｔｉｏｎ［１］＝２μｍ
Ｚｐｏｓｉｔｉｏｎ［２］＝２，２μｍ
Ｚｐｏｓｉｔｉｏｎ［３］＝３μｍ
・・・
Ｚｐｏｓｉｔｉｏｎ［５１１］＝５６０μｍ
尚、上記Ｚ位置移動コースデータは、前述の制御プログラム（記憶媒体９）に登録される。
【００３７】
次に、１ライン目の光軸方向の座標（Ｚｐｏｓｉｔｉｏｎ［０］）から２ライン目の光軸方向の座標（Ｚｐｏｓｉｔｉｏｎ［１］）へ前述のＺ位置制御機構１３が移動する際の速度を以下の式により算出する。但し、Ｔは１ライン走査完了時の水平同期信号から次のライン走査完了時の水平同期信号までの時間とする。
【００３８】
Ｚｓｐｅｅｄ［０］＝（Ｚｐｏｓｉｔｉｏｎ［１］‐Ｚｐｏｓｉｔｉｏｎ［０］）÷Ｔ［μｍ／ｓｅｃ］
同様に、２ライン目の光軸方向の座標（Ｚｐｏｓｉｔｉｏｎ［１］）から３ライン目の光軸方向の座標（Ｚｐｏｓｉｔｉｏｎ［２］）へ前記Ｚ位置制御機構が移動する際の速度を算出する。
Ｚｓｐｅｅｄ［１］＝（Ｚｐｏｓｏｔｉｏｎ［２］‐Ｚｐｏｓｉｔｉｏｎ［１］）÷Ｔ
上記計算をすべての光軸方向の座標（Ｚｐｏｓｉｔｉｏｎ［０］〜Ｚｐｏｓｉｔｉｏｎ［５１１］）に対して行うことで、各ライン間のＺ位置制御機構１３の移動速度を格納した配列（Ｚｓｐｅｅｄ［０］〜Ｚｓｐｅｅｄ［５１０］）を作成し、前記Ｚ位置移動速度データとして前述の制御プログラム（記憶媒体９）に登録する。
【００３９】
次に、上記処理によって生成したＺ位置移動コースデータ、及びＺ位置移動速度データを使用して、実際の画像取り込み処理を行う（図２のフローチャート（Ｓ３）の処理）。
図９はこの処理を説明するフローチャートである。先ず、上記制御プログラムに登録されたＺ位置移動コースデータの中から最初のデータを読み出し、この値を光軸方向の画像取り込み開始位置とする（Ｓ３１）。したがって、Ｚ位置制御機構１３は前述のステージ１４を光軸方向の取り込み開始位置に移動し、標本を画像取り込み開始位置にセットする（Ｓ３２）。
【００４０】
次に、標本面を水平方向へ１ライン走査し、画像データを取得する（Ｓ３３）。そして、水平同期信号が検出されたか判断し（Ｓ３４）、水平同期信号が検出されない場合（Ｓ３４がＮＯ）、エラー処理を行う（Ｓ３５）。
一方、水平同期信号が検出されると（Ｓ３４がＹＥＳ）、制御プログラムに登録された全てのＺ位置移動速度データを取得したか判断する（Ｓ３６）。すなわち、この場合全ての画像取り込み処理が完了した場合であり、本例の最初の処理では画像取り込み処理を開始した時点であり（Ｓ３６がＮＯ）、制御プログラムに登録された次のＺ位置移動コースデータ、及びＺ位置移動速度データを読み出し、Ｚ位置制御機構１３を連続的に移動しつつ、画像取り込み処理を継続する（Ｓ３７、Ｓ３３〜Ｓ３６）。
【００４１】
その後、全ての画像取り込み処理が完了すると（Ｓ３６がＹＥＳ）、Ｚ位置制御機構１３の駆動を停止し（Ｓ３８）、処理を終了する。すなわち、上記処理によって、ＣＰＵ７は制御プログラムに登録されたＺ位置移動コースデータとＺ位置移動速度データを順次読み出し、Ｚ位置制御機構１３を連続的に移動しながら標本の走査を行う。
【００４２】
したがって、本例によれば上記処理中、Ｚ位置制御機構１３の駆動が停止されることがなく、移動速度を変化させながら連続的に光軸方向の標本画像を取得することができ、標本の３次元画像の作成を短時間で行うことができる。
また、神経細胞等の標本を観察するため、繰り返しレーザ光を照射しても標本に与えるダメージを極めて少なく抑えることができる。
【００４３】
さらに、観察者自らが指定した注目部位に対する標本画像を得ることができ、観察者が知りたい標本からの情報を的確に得ることができる。
＜第２の実施形態＞
次に、本発明の第２の実施形態について説明する。
【００４４】
上記第１の実施形態では、図７（（図７（ｃ））に示すＹ−Ｚ画像に対して、観察者がＺ位置の指定を行うため、例えばライン間における光軸方向の座標の相対距離が大きく変位する可能性がある。この場合、水平方向１ライン走査中、Ｚ位置制御機構１３の光軸方向の位置が大きく変化するため、１ラインの走査開始時の焦点位置と１ラインの走査終了時の焦点位置が大きくずれる。
【００４５】
そこで、本例においては、注目部位を指定する際、現在使用している対物レンズの開口数、倍率、ピンホールの直径から標本の光軸方向の光学分解能（焦点深度）を算出し、指定可能な範囲を設定する。そして、観察者が、前述の第１の実施形態で記述した方法と同様、Ｙ−Ｚ画像上に表示されるＺ位置指定インジケータ１５をマウス等の入力デバイスにより操作し、標本に対する光軸方向の注目部位を指定する際、現在のＺ指定位置から上方、及び下方へ設定可能な次のＺ指定位置の設定範囲を示す。
【００４６】
図１０（図１０（ｃ））は、この状態を示す図である。観察者は同図に示す表示状態（Ｚ指定位置の設定範囲１５ａ、１５ｂ、１５ｃ、・・・）を確認し、Ｚ位置指定インジケータ１５の指定可能範囲を視覚的に確認しながら指定することができる。このように構成することにより、視覚的な指示に従い、観察者はＺ位置を指定することができ、水平方向１ライン内における走査開始時の焦点位置と走査終了時の焦点位置の光学的な位置の差異を排除することができる。
【００４７】
したがって、上記方法で作成したＺ位置移動コースデータとＺ位置移動速度データに従って走査を行えば、水平方向１ライン中の焦点位置を変化させずに標本の光軸方向の注目部位を中心とする三次元画像を高速に取得することができる。＜第３の実施形態＞
次に、本発明の第３の実施形態について説明する。
【００４８】
本例は光軸方向に一定の幅をもたせ、三次元画像の取り込み処理を行うものである。以下、具体的に説明する。
前述の第１の実施形態において説明したように、先ずリファレンス画像の取得処理を行い（図２示す処理（Ｓ１））、取得したリファレンス画像に対してＹ−Ｚ画像を抽出し注目部位の指定処理を行い、セットボタン１６を押下し、Ｚ位置指定インジケータ１５で指定された各ポイント間をスプライン補完、若しくは多項式近似補完し、Ｚ位置移動コースを表示する。
【００４９】
図１１は本例における表示画面の例であり、前述の図７に加えて取り込み範囲テキストボックス１７、及びインターバルテキストボックス１８、セットボタン１９が表示される。この取り込み範囲テキストボックス１７に、例えば、“５”をセットした場合、最大＋５ステップ、最小−５ステップの設定が行われ、図１１（ｄ）に示すように上記Ｚ位置移動コース２０に対して光軸方向上下にオフセットしたＺ位置移動コース２０ａ、２０ｂが表示される。
【００５０】
尚、インターバルテキストボックス１８に対しては、例えば“０，１”のセットが行われ、インターバルテキストボックス１８には当該数値が表示されている。
上記のように、例えば取り込み範囲を±５ステップ、インターバルを０．１μｍとした場合、制御プログラムに登録されるオフセット配列は以下のようになる。
Ｚｏｆｆｓｅｔ［０］＝−５×０．１μｍ＝−０．５μｍ
Ｚｏｆｆｓｅｔ［１］＝−４×０．１μｍ＝−０．４μｍ
Ｚｏｆｆｓｅｔ［２］＝−３×０．１μｍ＝−０．３μｍ
Ｚｏｆｆｓｅｔ［３］＝−２×０．１μｍ＝−０．２μｍ
Ｚｏｆｆｓｅｔ［４］＝−１×０．１μｍ＝−０．１μｍ
Ｚｏｆｆｓｅｔ［５］＝ ０×０．１μｍ＝０．０μｍ
Ｚｏｆｆｓｅｔ［６］＝ １×０．１μｍ ＝ ０．１μｍ
Ｚｏｆｆｓｅｔ［７］＝ ２×０．１μｍ ＝ ０．２μｍ
Ｚｏｆｆｓｅｔ［８］＝ ３×０．１μｍ ＝ ０．３μｍ
Ｚｏｆｆｓｅｔ［９］＝ ４×０．１μｍ ＝ ０．４μｍ
Ｚｏｆｆｓｅｔ［１０］＝ ５×０．１μｍ ＝ ０．５μｍ
この場合、同図（ｄ）に表示されるＺ位置移動コースは、基本となるＺ位置移動コース２０に対して光軸方向に−５ステップオフセットした値（Ｚｏｆｆｓｅｔ［０］＝−０．５μｍ）が上方に表示され（同図に示す２０ａ）、更に基本となる位置移動コース２０に対して光軸方向に＋５ステップオフセットした値（Ｚｏｆｆｓｅｔ［１０］＋０．５μｍ）が下方に表示される（同図に示す２０ｂ）。
【００５１】
次に、図１２に示すフローチャートに従って、本例の画像取り込み処理を説明する。先ず、前述の制御プログラムに登録された最初のオフセット値（Ｚｏｆｆｓｅｔ［０］）を読み出す（ステップ（以下、ＳＴＰで示す）３１）。そして、上記Ｚ位置移動コース設定処理において、制御プログラムに登録されたＺ位置移動コースデータから最初のＺ位置移動コースデータを読み出す（ＳＴＰ３２）。そして、Ｚ位置移動コースデータに読み出したオフセット値を加算し（ＳＴＰ３３）、Ｚ位置制御機構１３を移動し（ＳＴＰ３４）、標本面を１ライン走査し画像を取得する（ＳＴＰ３５）。
【００５２】
次に、水平同期信号検出手段１１が水平同期信号を検出したか判断し（ＳＴＰ３６）、前述と同様、水平同期信号が検出されなければ（ＳＴＰ３６がＮＯ）、前述と同様エラー処理を行う（ＳＴＰ３７）。
一方、水平同期信号が検出されると（ＳＴＰ３６がＹＥＳ）、Ｚ位置移動速度データを全て取得したか判断し（ＳＴＰ３８）、最初の処理では全ての画像取り込み処理が完了しておらず（ＳＴＰ３８がＮＯ）、Ｚ位置データに前述のオフセット値を加算し（ＳＴＰ３９）、Ｚ位置移動コースデータ、及びＺ位置移動速度データを取得し（ＳＴＰ４０）、標本面を１ライン走査し画像を取得する（ＳＴＰ３５）。以下、上記処理を繰り返し、標本画像を抽出する（ＳＴＰ３５〜ＳＴＰ４０）。
【００５３】
次に、前述の制御プログラムに登録されている全てのＺ位置移動速度データを全て取得したと判断する時（ＳＴＰ３８がＹＥＳ）、次に垂直同時信号検出手段１２により垂直同期信号が検出されたかどうかを判断する（ＳＴＰ４１）。ここで、垂直同期信号が検出されなければ（ＳＴＰ４１がＮＯ）、エラー処理を行うが（ＳＴＰ３７）、垂直同時信号が検出される場合（ＳＴＰ４１がＹＥＳ）、Ｚ位置制御機構１３の駆動を停止する（ＳＴＰ４２）。そして、全てのオフセット値を取得したか判断し、全ての取得処理が終わっている場合、処理を終了する（ＳＴＰ４３がＹＥＳ）。
【００５４】
しかしながら、本例では前述のように±５ステップのオフセット値が設定されており（ＳＴＰ４３がＮＯ）、オフセット配列から次のオフセット値、例えば（Ｚｏｆｆｓｅｔ［１］）を読み出し（ＳＴＰ３１）、同様の処理を繰り返す（ＳＴＰ３１〜ＳＴＰ４３）。
【００５５】
以上の処理によって、垂直同期信号を検出すると、順次オフセット値を読み出し、前記Ｚ位置移動コースデータを一定間隔で光軸方向に上下させ、Ｚ位置制御機構１３を制御し標本画像を取得することができる。したがって、本例によれば光軸方向に厚みを加えた標本の三次元画像を高速に取得することができる。
【００５６】
尚、前述の第１乃至第３の実施形態の説明では、ＸＹ走査を一定速度で行い、Ｚ方向への連続移動の移動速度を可変する構成としたが、Ｚ方向への連続移動を一定速度で行い、ＸＹ走査の速度を可変とする制御を行う構成としてもよい。 また、上記実施形態の説明では、ピンホールに入射する光として、反射光、又は蛍光として説明したが、標本を透過した透過光であってもよい。
【００５７】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明によれば、標本の光軸方向の相対位置を連続的に制御しながら、光軸方向の注目部位の標本画像を取得するため、標本へのレーザ照射によるダメージを抑えつつ、高速に標本画像を取得することができる。
【００５８】
さらに、垂直同期信号に同期して、標本の光軸方向へオフセットすることにより、光軸方向に厚みを持った三次元画像を取得することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施形態を説明するレーザ走査型共焦点顕微鏡装置の構成図である。
【図２】基本的処理を説明するフローチャートである。
【図３】リファレンス画像取得処理を説明するフローチャートである。
【図４】リファレンス画像の取得条件を説明する図である。
【図５】リファレンス画像を使用したＺ位置移動コース設定処理を説明するフローチャートである。
【図６】（ａ）は、リファレンス画像を示し、（ｂ）はＸ−Ｙエクステンド画像を示し、（ｃ）はＹ−Ｚ画像を示す
【図７】（ａ）は、前述のリファレンス画像を示し、（ｂ）はＸ−Ｙエクステンド画像を示し、（ｃ）はＹ−Ｚ画像を示し、（ｄ）はＺ位置移動コースを示す。
【図８】注目部位の設定例を説明する図である。
【図９】第１の実施形態の処理を説明するフローチャートである。
【図１０】第２の実施形態を説明する図であり、（ａ）は、前述のリファレンス画像を示し、（ｂ）はＸ−Ｙエクステンド画像を示し、（ｃ）はＹ−Ｚ画像を示し、（ｄ）はＺ位置移動コースを示す。
【図１１】第２の実施形態を説明する図であり、（ａ）は、前述のリファレンス画像を示し、（ｂ）はＸ−Ｙエクステンド画像を示し、（ｃ）はＹ−Ｚ画像を示し、（ｄ）はＺ位置移動コースを示す。
【図１２】第３の実施形態を説明するフローチャートである。
【符号の説明】
１ 光源
２ 走査機構
３ 対物レンズ
４ ピンホール
５ 光電変換手段
６ アナログ／デジタル変換器
７ ＣＰＵ
８ 走査条件取得手段
９ 記録媒体
１０ Ｚ位置指定手段
１１ 水平同期信号検出手段
１２ 垂直同時信号検出手段
１３ Ｚ位置制御機構
１４ ステージ
１６ セットボタン
１７ テキストボックス
１８ インターバルテキストボックス
１９ セットボタン
２０ Ｚ位置移動コース
２０ａ、２０ｂ オフセット時のＺ位置移動コース
【発明の属する技術分野】
本発明は、標本に光ビームを走査し、標本からの反射光や蛍光を光電変換し、三次元標本画像を生成するレーザ走査型共焦点顕微鏡装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
レーザ走査型顕微鏡は、レーザー光をガルバノメータスキャナ等を用いて水平方向、及び垂直方向に偏光させ、標本に対して二次元走査を行い、標本からの反射光若しくは蛍光を対物レンズを含む光学系を通して光検出器により検出し、ＣＲＴディスプレイ等に標本の３次元画像を表示するものである。
【０００３】
さらに、共焦型のレーザ走査型顕微鏡は、光検出器の手前にピンホールを設け、標本上の対物レンズの焦点と、ピンホールにおける受光側の焦点とが共焦点を形成するように光学系（共焦点光学系）が形成されている。このような構成によれば、標本上の対物レンズの焦点からの反射光、若しくは蛍光以外の光はピンホールにより排除し、標本の光軸方向への分解能を向上することができる。
【０００４】
この特長を活かし、対物レンズと標本との光軸方向の相対位置を変化させながら標本に対して二次元走査を行い、各相対位置における標本の二次元画像を積み重ねることで、標本の三次元画像を作成することが可能である。そして、この処理を一定時間間隔で繰り返すことにより、例えば神経細胞等の成長過程を三次元画像で立体的に観察することができる。
【０００５】
例えば、特許文献１には二次元スキャンユニットによって光源からの光を平面走査し、対物レンズ駆動部を駆動して光軸方向に対物レンズと試料の距離を制御して三次元画像を作成する発明が開示されている。
【０００６】
【特許文献１】特開平１０−１６１０３４号公報（段落番号００１７〜００７０、図１〜図６）
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記従来の方法では、三次元の標本画像の作成に多大な時間を要し、更に標本に対してレーザ照射が繰り返される為、標本のダメージも大きくなる。
【０００８】
一方、水平方向に１ライン走査をする毎に、標本と対物レンズの光軸方向の相対位置を変化させレーザ照射を行う方法も提案されている。しかし、この方法では１ラインの走査毎に走査を停止し、ステージ若しくは対物レンズの移動を行う必要があり、ステージ若しくは対物レンズが安定するまで次のラインの走査を待機することになり、三次元画像の取得に時間を要する。
【０００９】
そこで、本発明は標本に対する走査を行う際、標本の光軸方向への位置を連続的に変化させ、標本画像を取得することにより、光軸方向の注目部位の標本画像を高速に取得し、標本に与えるダメージを極力抑えることを可能にするレーザ走査型共焦点顕微鏡装置を提供するものである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
上記課題は請求項１記載の発明によれば、レーザ光源と、該レーザ光源から発した光ビームを標本に集光する対物レンズと、前記標本に対して前記光ビームを二次元走査するための走査機構と、前記標本からの反射光、蛍光、又は透過光を電気信号に変換する光電変換手段と、前記走査機構の水平同期信号を検出する水平同期信号検出手段と、前記走査機構の垂直同期信号を検出する垂直同期信号検出手段と、前記対物レンズと前記標本との光軸方向の相対位置を可変するＺ位置制御機構と、前記標本に対して二次元走査を行い、前記標本の参照画像を取得する参照画像取得手段と、光軸方向に前記参照画像の輝度の高い注目部位を指定するＺ位置指定手段と、前記Ｚ位置指定手段により指定した前記注目部位のデータに基づいてＺ位置移動コースデータ及びＺ位置移動速度データを作成する作成手段と、該Ｚ位置移動コースデータ及びＺ位置移動速度データに基づいて前記Ｚ位置制御機構を連続的に動作させ、標本画像を取得する標本画像取得手段とを有するレーザ走査型共焦点顕微鏡装置を提供することによって達成できる。
【００１１】
ここで、本発明の装置に使用する顕微鏡は、レーザ走査型共焦点顕微鏡であり、レーザ光源から発した光ビームを標本に集光し、光検出器の手前に設けられたピンホールによって標本の光軸方向への分解能を向上する構成である。また、標本に対する二次元走査の際、Ｚ位置移動コースデータ及びＺ位置移動速度データに従ってＺ位置制御機構を駆動し、標本をＺ方向に連続的に移動させる構成である。
【００１２】
したがって、三次元の標本画像を作成する際、対物レンズと標本間を連続して相対移動させることができ、標本走査を短時間で行い、標本に与えるダメージを極力小さく抑えることができる。
また、Ｚ位置指定手段による注目部位の指定は、例えばマウス等のポインティングデバイスを用いて行い、当該注目部位間を直線補間、スプライン補間等によって補間し、上記Ｚ位置移動コースデータを作成し、更にＺ位置移動速度データを作成するものである。
【００１３】
請求項２の記載は、請求項１の記載において、前記Ｚ位置指定手段は、例えば使用する対物レンズの開口数と倍率から求めたＺ方向の光学分解能を基に、前記注目部位の入力可能範囲を明示的に表示する構成である。
このように構成することにより、マウス等を使用して注目部位の指定を行う際、指定可能範囲を視覚的に確認しながら行うことができ、光軸方向の光学分解能を考慮したＺ位置移動コースデータの作成が可能となる。
【００１４】
請求項３の記載は、請求項１の記載において、前記Ｚ位置指定手段は、前記垂直同期信号検出手段により垂直同期信号が検出されると、前記Ｚ位置移動コースデータを一定間隔で光軸方向に上下させ、前記Ｚ位置移動速度データと前記Ｚ位置移動コースデータを基に、前記Ｚ位置制御機構を制御する構成である。
【００１５】
このように構成することにより、自動的に光軸方向に一定の幅を持った標本画像の走査が可能となる。
上記課題は請求項４記載の発明によれば、レーザ光源と、該レーザ光源から発した光ビームを標本に集光する対物レンズと、前記標本に対して前記光ビームを二次元走査するための走査機構と、前記標本からの反射光、蛍光、又は透過光を電気信号に変換する光電変換手段と、前記走査機構の水平同期信号を検出する水平同期信号検出手段と、前記走査機構の垂直同期信号を検出する垂直同期信号検出手段と、前記対物レンズと前記標本との光軸方向の相対位置を可変するＺ位置制御機構とを有するレーザ走査型共焦点顕微鏡装置の制御方法であって、前記標本に対して二次元走査を行い、前記標本の参照画像を取得する参照画像取得処理と、光軸方向に前記参照画像の輝度の高い注目部位を指定するＺ位置指定処理と、該Ｚ位置指定処理により指定した前記注目部位のデータに基づいてＺ位置移動コースデータ及びＺ位置移動速度データを作成する処理と、前記Ｚ位置移動コースデータ及びＺ位置移動速度データに従って前記Ｚ位置制御機構を連続的に動作させ、標本画像を取得する処理とを行うレーザ走査型共焦点顕微鏡装置の制御方法を提供することによって達成できる。
【００１６】
本発明は方法の発明であり、このように構成することによっても対物レンズと標本間を連続して相対移動させることができ、標本走査を短時間で行うことができ、標本へのダメージも最小限に抑えることができる。
上記課題は請求項５記載の発明によれば、レーザ光源と、該レーザ光源から発した光ビームを標本に集光する対物レンズと、前記標本に対して前記光ビームを二次元走査するための走査機構と、前記標本からの反射光、蛍光、又は透過光を電気信号に変換する光電変換手段と、前記走査機構の水平同期信号を検出する水平同期信号検出手段と、前記走査機構の垂直同期信号を検出する垂直同期信号検出手段と、前記対物レンズと前記標本との光軸方向の相対位置を可変するＺ位置制御機構とを有するレーザ走査型共焦点顕微鏡装置に使用されるプログラムであって、前記標本に対して二次元走査を行い、前記標本の参照画像を取得する参照画像取得機能と、光軸方向に前記参照画像の輝度の高い注目部位を指定するＺ位置指定機能と、該Ｚ位置指定機能により指定した前記注目部位のデータに基づいてＺ位置移動コースデータ及びＺ位置移動速度データを作成する機能と、前記Ｚ位置移動コースデータ及びＺ位置移動速度データに従って前記Ｚ位置制御機構を連続的に動作させ、標本画像を取得する機能とを備えたコンピュータが実行可能なプログラムを提供することによって達成できる。
【００１７】
本発明はレーザ走査型共焦点顕微鏡装置に使用するプログラムの発明であり、このようにプログラムを使用し、レーザ走査型共焦点顕微鏡を制御することによって、対物レンズと標本間を連続して相対移動させることができ、標本走査を短時間で行うことができ、標本へのダメージも最小限に抑えることができる。
【００１８】
【発明の実施形態】
＜第１の実施形態＞
以下、本発明の第１の実施形態について図を用いて説明する。
図１は本例で使用するレーザ走査型共焦点顕微鏡装置のシステム構成図である。同図において、光源１から照射される光ビームは、ガルバノミラー等で構成される走査機構２を通して水平方向、垂直方向に偏光され、更に対物レンズ３を通り、ステージ１４上の標本に照射される。
【００１９】
標本面で反射した反射光、又は標本内に透過された光照射に基づいて標本からの蛍光は、再び対物レンズ３、走査機構２を通り、ピンホール４に到達する。ピンホール４は標本の焦点以外からの光を排除し、焦点からの反射光、又は蛍光のみを通過させる。さらに、ピンホール４を通過した光は光電変換手段５に入射し、電気信号に変換し、アナログ／デジタル変換器（Ａ／Ｄ変換器）６によってデジタルデータに変換される。
【００２０】
Ａ／Ｄ変換器６でデジタルデータに変換されたデータは、パーソナルコンピュータ（ＰＣ）に入力し、標本画像の作成が行われる。ここで、パーソナルコンピュータ（ＰＣ）は、ＣＰＵ７、走査条件取得手段８、記憶媒体９、Ｚ位置（光軸位置）指定手段１０で構成され、ＣＰＵ７は上記記憶媒体９に登録された制御プログラムに従って処理を行う。尚、ＣＰＵ７はＣＲＴディスプレイ等の不図示の表示装置に接続され、上記デジタルデータに基づいて作成された標本画像等を表示する。
【００２１】
Ｚ位置指定手段１０は、ＣＰＵ７の制御に従って標本の注目部位を指定する際使用され、Ｚ位置指定手段１０によって指定された注目部位のデータは後述するＺ位置移動コースデータの作成、及びＺ位置移動速度データの作成に使用される。
【００２２】
また、記憶媒体９には制御プログラムが登録され、上記走査条件取得手段８で取得した走査条件、Ｚ位置指定手段１０で指定した注目部位のデータ、及びＺ位置移動コースデータやＺ位置移動速度データ等を記憶する。
また、水平同期信号検出手段１１、及び垂直同期信号検出手段１２はＣＰＵ７に接続され、ガルバノミラーの駆動信号に基づいて水平同期信号、及び垂直同期信号を検出する。
【００２３】
さらに、Ｚ位置制御機構１３はＣＰＵ７から出力される制御信号によって駆動し、ステージ１４を上下に移動し、標本への光ビームの照射位置を制御する。尚、上記Ｚ位置制御機構１３は、顕微鏡に内蔵される準焦部駆動モータを使用する機構であってもよく、又圧電素子を用いた機構としてもよく、更に光学素子のみを動作させる機構としてもよい。
【００２４】
次に、本例の処理動作について説明する。
先ず、本例の全体処理動作を図２に示すフローチャートを用いて説明する。先ず、標本の光軸方向の注目部位を指定するために必要となるリファレンス画像（参照画像）を取得する（ステップ（以下、Ｓで示す）１）。この処理は、標本に対してレーザ光を走査し、順次二次元画像を取得し、この二次元画像を積み重ねて三次元のリファレンス画像（参照画像）を得る処理である。
【００２５】
次に、上記処理によって取得したリファレンス画像を基に、前述のＺ位置指定手段１０により標本の光軸方向の注目部位を指定し、Ｚ位置制御機構１３を制御するためのＺ位置移動コースデータ、Ｚ位置移動速度データを設定する（Ｓ２）。設定された各データは、記憶媒体９内の制御プログラムに登録される。
【００２６】
次に、上記処理によって登録したＺ位置移動コースデータ、及びＺ位置移動速度データに従い、標本の光軸方向の位置を制御し、標本画像を取得する（Ｓ３）。
以下、上記各処理（Ｓ１〜Ｓ３）について、具体的に説明する。
【００２７】
先ず、リファレンス画像取得処理（前述の処理（Ｓ１））について、図３に示すフローチャートに従って説明する。
この処理は、前述のようにリファレンス画像の取得処理であり、先ずリファレンス画像の取得条件を設定する（Ｓ１１）。図４はリファレンス画像の取得条件を説明する図であり、標本を三次元画像（Ｘ、Ｙ、Ｚの各軸が互いに直交する三次元画像）で示す。本例において、取得条件は同図に示す標本の光軸方向の画像取り込み開始位置（同図に示すａ）、標本の光軸方向の画像取り込み終了位置（同図に示すｂ）、及び画像取り込み開始位置から画像取り込み終了位置までの相対距離をｎステップに分割した時の１ステップ分の光軸方向の距離（インターバル）（同図に示すｃ）である。
【００２８】
尚、上記取得条件は、不図示のマウスやキーボードを使用して行われ、例えば画像取り込み開始位置（ａ）が設定されると、リファレンス画像を取得する際のＺ位置の初期値として登録される。そして、この登録によって、Ｚ位置制御機構１３はステージ１４を光軸方向に移動し、標本を画像取り込み開始位置にセットする。
【００２９】
次に、画像取り込み開始位置における標本の平面画像を取得する（Ｓ１２）。この処理は、光源１からレーザ光の照射を行い、光電変換手段５で検出する光量データに従って図４に示すａ１の平面画像を取得する。
次に、上記処理によって設定したインターバル分、光軸方向の位置を画像取り込み終了位置側へ移動する（Ｓ１３）。そして、現在のＺ位置と上記処理（Ｓ１１）によって設定した画像取り込み終了位置とを比較し、現在のＺ位置が画像取り込み終了位置より大きい場合（現在のＺ位置＞画像取り込み終了位置）、次の処理に移行する（Ｓ１４）。しかし、最初の処理では、平面画像ａ１に対する画像取り込みを行った直後であり、最初のこの判断（Ｓ１４）はＮＯ（ノー）である。
【００３０】
したがって、次の標本の平面画像の取り込み処理に戻り（Ｓ１２）、以後光軸方向にインターバル分順次加算を行い、平面画像の取り込み処理を繰り返し（Ｓ１２〜Ｓ１４）、平面画像ａ２、ａ３、・・・を順次ＣＰＵ７に取り込む。そして、取得した各Ｚ位置における標本の平面画像を積み重ね、標本の光軸方向への三次元画像を構築する。
【００３１】
その後、現在のＺ位置が画像取り込み終了位置を越えると（Ｓ１４がＹＥＳ（イエス））、上記標本の三次元画像をリファレンス画像として登録し（Ｓ１５）、リファレンス画像の取得処理を終了する。
次に、上記処理によって取得したリファレンス画像を使用して、Ｚ位置移動コースの設定処理を説明する（図２のフローチャート（Ｓ２）の処理）。
【００３２】
図５はこの処理を説明するフローチャートである。先ず、取得したリファレンス画像（図６（ａ）参照）を構成するｎ枚の標本像を基に、光軸方向の同一画素の輝度値を加算し、１枚の標本の平面画像を作成する（Ｓ２１）。以下、この画像をＸ−Ｙエクステンド画像という。尚、図６（ｂ）は、リファレンス画像から光軸方向の輝度値を加算し、輝度値の高い部分を示すＸ−Ｙエクステンド画像の例である。
【００３３】
次に、水平方向をＹ軸、垂直方向をＺ軸としたＹ−Ｚ画像を作成する（Ｓ２２）。この処理も上記と同様、リファレンス画像からＸ軸方向の輝度値を加算し、標本内の輝度の高い部分を抽出して、同図（ｃ）に示すＹ−Ｚ画像を取得する。次に、注目部位指定のための画面を表示装置に表示する（Ｓ２３）。すなわち、この処理によって、例えば図７に示す表示を行う。尚、同図（ａ）は、前述のリファレンス画像を示し、ｎ枚の標本像を積み重ねて作成した標本の三次元画像である。また、同図（ｂ）は上記Ｘ−Ｙエクステンド画像を示し、同図（ｃ）はＹ−Ｚ画像を示す。尚、同図（ｄ）については後述する。
【００３４】
次に、上記表示状態において、マウス等の入力デバイスを操作し、Ｙ−Ｚ画像上に注目部位を指定する（Ｓ２４）。すなわち、Ｙ−Ｚ画像上にＺ位置指定インジケータ１５を設定する。
次に、Ｚ位置移動コースデータ、及びＺ位置移動速度データを作成する（Ｓ２５）。この処理は、図７に示す画面上のセットボタン１６を押下することによって実行され、上記Ｚ位置指定インジケータ１５で指定された各ポイント間をスプライン補完、若しくは多項式近似補完し、Ｚ位置移動コースを同図（ｄ）に示す如く表示する。このＺ位置移動コースは、標本像の垂直方向のライン数分の標本の光軸方向の座標配列である。
【００３５】
例えば、図８に示す設定を行った場合、各Ｚ位置指定インジケータ間をライン数分のポイントでスプライン補完、若しくは多項式近似補完したＺ位置移動コースが生成される。尚、上記スプライン補完は各ポイント間をスプライン曲線で結ぶ補完方法であり、多項式近似補間は各ポイント間を多項式で近似する補完方法であり、上記以外にも複数のポイントを直線で結ぶ直線補間等を使用することができる。
【００３６】
上記処理によって、以下のようなＺ位置移動コースデータが生成される。例として、Ｙ方向５１２画素の画像を取得した場合（Ｚｐｏｓｉｔｉｏｎ［０］〜Ｚｐｏｓｉｔｉｏｎ［５１１］）を以下に示す。
Ｚｐｏｓｉｔｉｏｎ［０］＝１μｍ
Ｚｐｏｓｉｔｉｏｎ［１］＝２μｍ
Ｚｐｏｓｉｔｉｏｎ［２］＝２，２μｍ
Ｚｐｏｓｉｔｉｏｎ［３］＝３μｍ
・・・
Ｚｐｏｓｉｔｉｏｎ［５１１］＝５６０μｍ
尚、上記Ｚ位置移動コースデータは、前述の制御プログラム（記憶媒体９）に登録される。
【００３７】
次に、１ライン目の光軸方向の座標（Ｚｐｏｓｉｔｉｏｎ［０］）から２ライン目の光軸方向の座標（Ｚｐｏｓｉｔｉｏｎ［１］）へ前述のＺ位置制御機構１３が移動する際の速度を以下の式により算出する。但し、Ｔは１ライン走査完了時の水平同期信号から次のライン走査完了時の水平同期信号までの時間とする。
【００３８】
Ｚｓｐｅｅｄ［０］＝（Ｚｐｏｓｉｔｉｏｎ［１］‐Ｚｐｏｓｉｔｉｏｎ［０］）÷Ｔ［μｍ／ｓｅｃ］
同様に、２ライン目の光軸方向の座標（Ｚｐｏｓｉｔｉｏｎ［１］）から３ライン目の光軸方向の座標（Ｚｐｏｓｉｔｉｏｎ［２］）へ前記Ｚ位置制御機構が移動する際の速度を算出する。
Ｚｓｐｅｅｄ［１］＝（Ｚｐｏｓｏｔｉｏｎ［２］‐Ｚｐｏｓｉｔｉｏｎ［１］）÷Ｔ
上記計算をすべての光軸方向の座標（Ｚｐｏｓｉｔｉｏｎ［０］〜Ｚｐｏｓｉｔｉｏｎ［５１１］）に対して行うことで、各ライン間のＺ位置制御機構１３の移動速度を格納した配列（Ｚｓｐｅｅｄ［０］〜Ｚｓｐｅｅｄ［５１０］）を作成し、前記Ｚ位置移動速度データとして前述の制御プログラム（記憶媒体９）に登録する。
【００３９】
次に、上記処理によって生成したＺ位置移動コースデータ、及びＺ位置移動速度データを使用して、実際の画像取り込み処理を行う（図２のフローチャート（Ｓ３）の処理）。
図９はこの処理を説明するフローチャートである。先ず、上記制御プログラムに登録されたＺ位置移動コースデータの中から最初のデータを読み出し、この値を光軸方向の画像取り込み開始位置とする（Ｓ３１）。したがって、Ｚ位置制御機構１３は前述のステージ１４を光軸方向の取り込み開始位置に移動し、標本を画像取り込み開始位置にセットする（Ｓ３２）。
【００４０】
次に、標本面を水平方向へ１ライン走査し、画像データを取得する（Ｓ３３）。そして、水平同期信号が検出されたか判断し（Ｓ３４）、水平同期信号が検出されない場合（Ｓ３４がＮＯ）、エラー処理を行う（Ｓ３５）。
一方、水平同期信号が検出されると（Ｓ３４がＹＥＳ）、制御プログラムに登録された全てのＺ位置移動速度データを取得したか判断する（Ｓ３６）。すなわち、この場合全ての画像取り込み処理が完了した場合であり、本例の最初の処理では画像取り込み処理を開始した時点であり（Ｓ３６がＮＯ）、制御プログラムに登録された次のＺ位置移動コースデータ、及びＺ位置移動速度データを読み出し、Ｚ位置制御機構１３を連続的に移動しつつ、画像取り込み処理を継続する（Ｓ３７、Ｓ３３〜Ｓ３６）。
【００４１】
その後、全ての画像取り込み処理が完了すると（Ｓ３６がＹＥＳ）、Ｚ位置制御機構１３の駆動を停止し（Ｓ３８）、処理を終了する。すなわち、上記処理によって、ＣＰＵ７は制御プログラムに登録されたＺ位置移動コースデータとＺ位置移動速度データを順次読み出し、Ｚ位置制御機構１３を連続的に移動しながら標本の走査を行う。
【００４２】
したがって、本例によれば上記処理中、Ｚ位置制御機構１３の駆動が停止されることがなく、移動速度を変化させながら連続的に光軸方向の標本画像を取得することができ、標本の３次元画像の作成を短時間で行うことができる。
また、神経細胞等の標本を観察するため、繰り返しレーザ光を照射しても標本に与えるダメージを極めて少なく抑えることができる。
【００４３】
さらに、観察者自らが指定した注目部位に対する標本画像を得ることができ、観察者が知りたい標本からの情報を的確に得ることができる。
＜第２の実施形態＞
次に、本発明の第２の実施形態について説明する。
【００４４】
上記第１の実施形態では、図７（（図７（ｃ））に示すＹ−Ｚ画像に対して、観察者がＺ位置の指定を行うため、例えばライン間における光軸方向の座標の相対距離が大きく変位する可能性がある。この場合、水平方向１ライン走査中、Ｚ位置制御機構１３の光軸方向の位置が大きく変化するため、１ラインの走査開始時の焦点位置と１ラインの走査終了時の焦点位置が大きくずれる。
【００４５】
そこで、本例においては、注目部位を指定する際、現在使用している対物レンズの開口数、倍率、ピンホールの直径から標本の光軸方向の光学分解能（焦点深度）を算出し、指定可能な範囲を設定する。そして、観察者が、前述の第１の実施形態で記述した方法と同様、Ｙ−Ｚ画像上に表示されるＺ位置指定インジケータ１５をマウス等の入力デバイスにより操作し、標本に対する光軸方向の注目部位を指定する際、現在のＺ指定位置から上方、及び下方へ設定可能な次のＺ指定位置の設定範囲を示す。
【００４６】
図１０（図１０（ｃ））は、この状態を示す図である。観察者は同図に示す表示状態（Ｚ指定位置の設定範囲１５ａ、１５ｂ、１５ｃ、・・・）を確認し、Ｚ位置指定インジケータ１５の指定可能範囲を視覚的に確認しながら指定することができる。このように構成することにより、視覚的な指示に従い、観察者はＺ位置を指定することができ、水平方向１ライン内における走査開始時の焦点位置と走査終了時の焦点位置の光学的な位置の差異を排除することができる。
【００４７】
したがって、上記方法で作成したＺ位置移動コースデータとＺ位置移動速度データに従って走査を行えば、水平方向１ライン中の焦点位置を変化させずに標本の光軸方向の注目部位を中心とする三次元画像を高速に取得することができる。＜第３の実施形態＞
次に、本発明の第３の実施形態について説明する。
【００４８】
本例は光軸方向に一定の幅をもたせ、三次元画像の取り込み処理を行うものである。以下、具体的に説明する。
前述の第１の実施形態において説明したように、先ずリファレンス画像の取得処理を行い（図２示す処理（Ｓ１））、取得したリファレンス画像に対してＹ−Ｚ画像を抽出し注目部位の指定処理を行い、セットボタン１６を押下し、Ｚ位置指定インジケータ１５で指定された各ポイント間をスプライン補完、若しくは多項式近似補完し、Ｚ位置移動コースを表示する。
【００４９】
図１１は本例における表示画面の例であり、前述の図７に加えて取り込み範囲テキストボックス１７、及びインターバルテキストボックス１８、セットボタン１９が表示される。この取り込み範囲テキストボックス１７に、例えば、“５”をセットした場合、最大＋５ステップ、最小−５ステップの設定が行われ、図１１（ｄ）に示すように上記Ｚ位置移動コース２０に対して光軸方向上下にオフセットしたＺ位置移動コース２０ａ、２０ｂが表示される。
【００５０】
尚、インターバルテキストボックス１８に対しては、例えば“０，１”のセットが行われ、インターバルテキストボックス１８には当該数値が表示されている。
上記のように、例えば取り込み範囲を±５ステップ、インターバルを０．１μｍとした場合、制御プログラムに登録されるオフセット配列は以下のようになる。
Ｚｏｆｆｓｅｔ［０］＝−５×０．１μｍ＝−０．５μｍ
Ｚｏｆｆｓｅｔ［１］＝−４×０．１μｍ＝−０．４μｍ
Ｚｏｆｆｓｅｔ［２］＝−３×０．１μｍ＝−０．３μｍ
Ｚｏｆｆｓｅｔ［３］＝−２×０．１μｍ＝−０．２μｍ
Ｚｏｆｆｓｅｔ［４］＝−１×０．１μｍ＝−０．１μｍ
Ｚｏｆｆｓｅｔ［５］＝ ０×０．１μｍ＝０．０μｍ
Ｚｏｆｆｓｅｔ［６］＝ １×０．１μｍ ＝ ０．１μｍ
Ｚｏｆｆｓｅｔ［７］＝ ２×０．１μｍ ＝ ０．２μｍ
Ｚｏｆｆｓｅｔ［８］＝ ３×０．１μｍ ＝ ０．３μｍ
Ｚｏｆｆｓｅｔ［９］＝ ４×０．１μｍ ＝ ０．４μｍ
Ｚｏｆｆｓｅｔ［１０］＝ ５×０．１μｍ ＝ ０．５μｍ
この場合、同図（ｄ）に表示されるＺ位置移動コースは、基本となるＺ位置移動コース２０に対して光軸方向に−５ステップオフセットした値（Ｚｏｆｆｓｅｔ［０］＝−０．５μｍ）が上方に表示され（同図に示す２０ａ）、更に基本となる位置移動コース２０に対して光軸方向に＋５ステップオフセットした値（Ｚｏｆｆｓｅｔ［１０］＋０．５μｍ）が下方に表示される（同図に示す２０ｂ）。
【００５１】
次に、図１２に示すフローチャートに従って、本例の画像取り込み処理を説明する。先ず、前述の制御プログラムに登録された最初のオフセット値（Ｚｏｆｆｓｅｔ［０］）を読み出す（ステップ（以下、ＳＴＰで示す）３１）。そして、上記Ｚ位置移動コース設定処理において、制御プログラムに登録されたＺ位置移動コースデータから最初のＺ位置移動コースデータを読み出す（ＳＴＰ３２）。そして、Ｚ位置移動コースデータに読み出したオフセット値を加算し（ＳＴＰ３３）、Ｚ位置制御機構１３を移動し（ＳＴＰ３４）、標本面を１ライン走査し画像を取得する（ＳＴＰ３５）。
【００５２】
次に、水平同期信号検出手段１１が水平同期信号を検出したか判断し（ＳＴＰ３６）、前述と同様、水平同期信号が検出されなければ（ＳＴＰ３６がＮＯ）、前述と同様エラー処理を行う（ＳＴＰ３７）。
一方、水平同期信号が検出されると（ＳＴＰ３６がＹＥＳ）、Ｚ位置移動速度データを全て取得したか判断し（ＳＴＰ３８）、最初の処理では全ての画像取り込み処理が完了しておらず（ＳＴＰ３８がＮＯ）、Ｚ位置データに前述のオフセット値を加算し（ＳＴＰ３９）、Ｚ位置移動コースデータ、及びＺ位置移動速度データを取得し（ＳＴＰ４０）、標本面を１ライン走査し画像を取得する（ＳＴＰ３５）。以下、上記処理を繰り返し、標本画像を抽出する（ＳＴＰ３５〜ＳＴＰ４０）。
【００５３】
次に、前述の制御プログラムに登録されている全てのＺ位置移動速度データを全て取得したと判断する時（ＳＴＰ３８がＹＥＳ）、次に垂直同時信号検出手段１２により垂直同期信号が検出されたかどうかを判断する（ＳＴＰ４１）。ここで、垂直同期信号が検出されなければ（ＳＴＰ４１がＮＯ）、エラー処理を行うが（ＳＴＰ３７）、垂直同時信号が検出される場合（ＳＴＰ４１がＹＥＳ）、Ｚ位置制御機構１３の駆動を停止する（ＳＴＰ４２）。そして、全てのオフセット値を取得したか判断し、全ての取得処理が終わっている場合、処理を終了する（ＳＴＰ４３がＹＥＳ）。
【００５４】
しかしながら、本例では前述のように±５ステップのオフセット値が設定されており（ＳＴＰ４３がＮＯ）、オフセット配列から次のオフセット値、例えば（Ｚｏｆｆｓｅｔ［１］）を読み出し（ＳＴＰ３１）、同様の処理を繰り返す（ＳＴＰ３１〜ＳＴＰ４３）。
【００５５】
以上の処理によって、垂直同期信号を検出すると、順次オフセット値を読み出し、前記Ｚ位置移動コースデータを一定間隔で光軸方向に上下させ、Ｚ位置制御機構１３を制御し標本画像を取得することができる。したがって、本例によれば光軸方向に厚みを加えた標本の三次元画像を高速に取得することができる。
【００５６】
尚、前述の第１乃至第３の実施形態の説明では、ＸＹ走査を一定速度で行い、Ｚ方向への連続移動の移動速度を可変する構成としたが、Ｚ方向への連続移動を一定速度で行い、ＸＹ走査の速度を可変とする制御を行う構成としてもよい。 また、上記実施形態の説明では、ピンホールに入射する光として、反射光、又は蛍光として説明したが、標本を透過した透過光であってもよい。
【００５７】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明によれば、標本の光軸方向の相対位置を連続的に制御しながら、光軸方向の注目部位の標本画像を取得するため、標本へのレーザ照射によるダメージを抑えつつ、高速に標本画像を取得することができる。
【００５８】
さらに、垂直同期信号に同期して、標本の光軸方向へオフセットすることにより、光軸方向に厚みを持った三次元画像を取得することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施形態を説明するレーザ走査型共焦点顕微鏡装置の構成図である。
【図２】基本的処理を説明するフローチャートである。
【図３】リファレンス画像取得処理を説明するフローチャートである。
【図４】リファレンス画像の取得条件を説明する図である。
【図５】リファレンス画像を使用したＺ位置移動コース設定処理を説明するフローチャートである。
【図６】（ａ）は、リファレンス画像を示し、（ｂ）はＸ−Ｙエクステンド画像を示し、（ｃ）はＹ−Ｚ画像を示す
【図７】（ａ）は、前述のリファレンス画像を示し、（ｂ）はＸ−Ｙエクステンド画像を示し、（ｃ）はＹ−Ｚ画像を示し、（ｄ）はＺ位置移動コースを示す。
【図８】注目部位の設定例を説明する図である。
【図９】第１の実施形態の処理を説明するフローチャートである。
【図１０】第２の実施形態を説明する図であり、（ａ）は、前述のリファレンス画像を示し、（ｂ）はＸ−Ｙエクステンド画像を示し、（ｃ）はＹ−Ｚ画像を示し、（ｄ）はＺ位置移動コースを示す。
【図１１】第２の実施形態を説明する図であり、（ａ）は、前述のリファレンス画像を示し、（ｂ）はＸ−Ｙエクステンド画像を示し、（ｃ）はＹ−Ｚ画像を示し、（ｄ）はＺ位置移動コースを示す。
【図１２】第３の実施形態を説明するフローチャートである。
【符号の説明】
１ 光源
２ 走査機構
３ 対物レンズ
４ ピンホール
５ 光電変換手段
６ アナログ／デジタル変換器
７ ＣＰＵ
８ 走査条件取得手段
９ 記録媒体
１０ Ｚ位置指定手段
１１ 水平同期信号検出手段
１２ 垂直同時信号検出手段
１３ Ｚ位置制御機構
１４ ステージ
１６ セットボタン
１７ テキストボックス
１８ インターバルテキストボックス
１９ セットボタン
２０ Ｚ位置移動コース
２０ａ、２０ｂ オフセット時のＺ位置移動コース
Claims (5)
- レーザ光源と、
該レーザ光源から発した光ビームを標本に集光する対物レンズと、
前記標本に対して前記光ビームを二次元走査するための走査機構と、
前記標本からの反射光、蛍光、又は透過光を電気信号に変換する光電変換手段と、
前記走査機構の水平同期信号を検出する水平同期信号検出手段と、
前記走査機構の垂直同期信号を検出する垂直同期信号検出手段と、
前記対物レンズと前記標本との光軸方向の相対位置を可変するＺ位置制御機構と、
前記標本に対して二次元走査を行い、前記標本の参照画像を取得する参照画像取得手段と、
光軸方向に前記参照画像の輝度の高い注目部位を指定するＺ位置指定手段と、
前記Ｚ位置指定手段により指定した前記注目部位のデータに基づいてＺ位置移動コースデータ及びＺ位置移動速度データを作成する作成手段と、
該Ｚ位置移動コースデータ及びＺ位置移動速度データに基づいて前記Ｚ位置制御機構を連続的に動作させ、標本画像を取得する標本画像取得手段と、を有することを特徴とするレーザ走査型共焦点顕微鏡装置。 - 前記Ｚ位置指定手段は、使用する対物レンズの開口数と倍率から求めたＺ方向の光学分解能を基に、前記注目部位の入力可能範囲を明示的に表示することを特徴とする請求項１に記載のレーザ走査型共焦点顕微鏡装置。
- 前記Ｚ位置指定手段は、前記垂直同期信号検出手段により垂直同期信号が検出されると、前記Ｚ位置移動コースデータを一定間隔で光軸方向に上下させ、前記Ｚ位置移動コースデータと前記Ｚ位置移動速度データを基に、前記Ｚ位置制御機構を制御することを特徴とする請求項１記載のレーザ走査型共焦点顕微鏡装置。
- レーザ光源と、該レーザ光源から発した光ビームを標本に集光する対物レンズと、前記標本に対して前記光ビームを二次元走査するための走査機構と、前記標本からの反射光、蛍光、又は透過光を電気信号に変換する光電変換手段と、前記走査機構の水平同期信号を検出する水平同期信号検出手段と、前記走査機構の垂直同期信号を検出する垂直同期信号検出手段と、前記対物レンズと前記標本との光軸方向の相対位置を可変するＺ位置制御機構とを有するレーザ走査型共焦点顕微鏡装置の制御方法であって、
前記標本に対して二次元走査を行い、前記標本の参照画像を取得する参照画像取得処理と、
光軸方向に前記参照画像の輝度の高い注目部位を指定するＺ位置指定処理と、該Ｚ位置指定処理により指定した前記注目部位のデータに基づいてＺ位置移動コースデータ及びＺ位置移動速度データを作成する処理と、
前記Ｚ位置移動コースデータ及びＺ位置移動速度データに従って前記Ｚ位置制御機構を連続的に動作させ、標本画像を取得する処理と、を行うことを特徴とするレーザ走査型共焦点顕微鏡装置の制御方法。 - レーザ光源と、該レーザ光源から発した光ビームを標本に集光する対物レンズと、前記標本に対して前記光ビームを二次元走査するための走査機構と、前記標本からの反射光、蛍光、又は透過光を電気信号に変換する光電変換手段と、前記走査機構の水平同期信号を検出する水平同期信号検出手段と、前記走査機構の垂直同期信号を検出する垂直同期信号検出手段と、前記対物レンズと前記標本との光軸方向の相対位置を可変するＺ位置制御機構とを有するレーザ走査型共焦点顕微鏡装置に使用されるプログラムであって、
前記標本に対して二次元走査を行い、前記標本の参照画像を取得する参照画像取得機能と、
光軸方向に前記参照画像の輝度の高い注目部位を指定するＺ位置指定機能と、該Ｚ位置指定機能により指定した前記注目部位のデータに基づいてＺ位置移動コースデータ及びＺ位置移動速度データを作成する機能と、
前記Ｚ位置移動コースデータ及びＺ位置移動速度データに従って前記Ｚ位置制御機構を連続的に動作させ、標本画像を取得する機能と、を備えたコンピュータが実行可能なプログラム。
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