JP2004532972A - 転移ｒｎａおよびモデルメッセンジャーｒｎａに接触している機能的リボソーム複合体のｘ線結晶構造ならびにその使用方法 - Google Patents

Abstract

メッセンジャーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）またはｔＲＮＡアナログと接触している７０Ｓリボソーム複合体の構造が、５．５Åの解像度まで、Ｘ線結晶学によって分解された。ｔＲＮＡとリボソームとの間の相互作用、ならびにリボソームサブユニット内およびリボソームサブユニット間のリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）ヘリックスのパッキング配置の多くの詳細が、観察され得る。多数の接触が、３０ＳサブユニットとＰ−ｔＲＮＡアンチコドンステムループとの間でなされるが；対照的に、Ａ−ｔＲＮＡのアンチコドン領域は、かなり露出している。機能的リレーを示唆する分子相互作用の複雑なネットワークは、サブユニット界面において１６Ｓ ｒＲＮＡの最後から２番目の長いステム辺りに集中し、「スイッチ」ヘリックスを含み、そして１６Ｓ ｒＲＮＡのデコード部位および５０Ｓサブユニット由来のＲＮＡブリッジを含む。

Description

【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０００年１２月９日に出願された米国仮出願６０／２５４，６０３号、２００１年３月２２日に出願された米国仮出願６０，２７８，０１３号、および２００１年５月３０日に出願された米国仮出願６０／２９４，３９４号（これらの各々の全体にわたる開示は、全ての目的のために本明細書中でその全体が参考として援用されている）の優先権を主張する。
【０００２】
（連邦政府によって助成された研究に関する陳述）
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈによって授与された、ＧＭ−１７１２９およびＧＭ−５９１４０での政府の支持によりなされた。政府は、本発明において特定の権利を有する。
【０００３】
（マイクロフィッシュ付属物に関する参照）
適用されず。
【０００４】
（発明の分野）
本発明は、７０Ｓリボソームの結晶に関し、そしてより詳細には、Ｘ線回折解析によって得られる７０Ｓリボソームのモデル構造に関する。本発明はまた、７０Ｓリボソームモデルの構造座標を使用して、７０Ｓリボソーム上の部位に結合しそしてリボソームの機能を変える化合物をスクリーニングし、そして設計する方法に関する。
【０００５】
（発明の背景）
ＲＮＡでコードされた遺伝メッセージのタンパク質のポリペプチド鎖への翻訳は、遺伝子型を表現型にリンクさせる。これは、リボソーム（作用の構造的コアおよび基本的な機構が、生命の全ての形態間で保存される古いリボ核タンパク質粒子）によって実施される（Ｃ．Ｒ．Ｗｏｅｓｅら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．４７，６２１（１９８３）；Ｗ．Ｅ．Ｈｉｌｌら編、Ｔｈｅ Ｒｉｂｏｓｏｍｅ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ，（１９９０）））。最も小さく、そして最も研究されている例は、細菌のリボソームであり、このリボソームは、約２．５ＭＤの分子サイズを有し、そして小さな（３０Ｓ）サブユニットおよび大きな（５０Ｓ）サブユニットからなる。３０Ｓサブユニットは、１６Ｓ ｒＲＮＡ（約１５００ヌクレオチド（ｎｔ））および約２０個の異なるタンパク質から構成されるのに対して、大きなサブユニットは、２３Ｓ ｒＲＮＡ（約２９００ｎｔ）、５Ｓ ｒＲＮＡ（１２０ｎｔ）および３０を越える異なるタンパク質を含む。この構造の複雑さの程度は、生物学的な役割の程度をふまえている。
【０００６】
リボソームの基質は、ｔＲＮＡであり、このｔＲＮＡは、一般に、３ヶ所の異なる部位：Ａ、Ｐ、およびＥ（それぞれ、アミノアシル、ペプチジル、およびエグジット（ｅｘｉｔ））でリボソームに結合すると考えられる（Ｗａｔｓｏｎ １９６４；Ｒｈｅｉｎｂｅｒｇｅｒら、１９８１）。各ｔＲＮＡ結合部位は、２つのリボソームサブユニットの間に分配され、ｔＲＮＡとこのリボソームとの間で、６つ程度の異なる相互作用部位を生じる。ｔＲＮＡのアンチコドン末端は、３０Ｓサブユニットに結合し、この３０Ｓサブユニットはまた、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を保持し；３’−アクセプター、すなわちｔＲＮＡのＣＣＡ末端は、５０Ｓサブユニットと相互作用し、この５０Ｓサブユニットは、ペプチド結合形成に対する触媒部位（ペプチジルトランスフェラーゼ）（Ｍｏｎｒｏ １９６７）を含む。従って、ｔＲＮＡは、３０Ｓサブユニットと５０Ｓサブユニットとの間の界面にかかる。
【０００７】
この翻訳伸長サイクルは、３つの基本的なプロセスに依存する：（ｉ）アミノアシル−ｔＲＮＡの選択、（ｉｉ）ペプチド結合形成、および（ｉｉｉ）リボソーム内の１つの部位から次の部位へのｔＲＮＡの転移。インビボにおいて、ｔＲＮＡの選択および転移の工程は、グアノシントリホスフェート（ＧＴＰ）−依存性反応において、それぞれ伸長因子ＥＴ−ＴｕおよびＥＦ−Ｇを含み、両工程は、インビトロの適切なイオン状態下で、因子依存性様式で、リボソームによって実施され得る（Ｐｅｓｔｋａ １９６９；Ｇａｖｒｉｌｏｖａら １９７２）。従って、翻訳伸長サイクルの基礎工程のうちの全３工程は、リボソーム自体の特性、およびそのＲＮＡ成分に恐らく基づかなければならない（Ｇｒｅｅｎら １９９７）。リボソームがこれらの基礎プロセスを達成する分子機構は、その分子構造同様、多くが謎のままである。リボソーム構造の知識は、翻訳の複雑性についての直接の説明を与えないかもしれないが、より深い機構的洞察がリボソームの構造に依存することは、明らかである。
【０００８】
リボソームタンパク質およびｒＲＮＡフラグメントの構造（ｘ線結晶学および核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法によって決定される）は、リボソームの個々の成分の原子分解の詳細を提供する（Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎら １９９８；Ｍｏｏｒｅら １９９８；Ｎｉｋｏｎｏｖら １９８８；Ｓｚｅｗｃａｚｋら １９９５；Ｄａｌｌａｓら １９９７；Ｃｏｒｒｅｌｌら １９９７）。近年、大きな進歩が、クライオエレクトロン顕微鏡法によって、完全なリボソームの構造、リボソームサブユニットおよびリボソームの機能的な複雑性を決定することにおいてなされた（Ｆｒａｎｋら １９９５ａ；Ｓｔａｒｋら １９９７ａ；Ａｇｒａｗａｌらの概説 １９９９ａ）。リボソームのｘ線結晶学の２つの主な進歩が、５０Ｓサブユニットの結晶化（Ｙｏｎａｔｈら １９８０；ｖｏｎ Ｂｏｈｌｅｎら １９９１）および９Åの分解能でのそれらの結晶構造の最近の決定であった（Ｂａｎら １９９８）。なおより最近になって、５．５Åの分解能でのＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ３０Ｓリボソームサブユニットの構造（Ｃｌｅｍｏｎｓら １９９９）および５Åの分解能でのＨａｌｏａｒｃｕｌａ ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ ５０Ｓリボソームサブユニットの構造（Ｂａｎら １９９９）を記載する２つの論文が、刊行された。ｒＲＮＡ成分およびリボソームタンパク質成分の多くの詳細が、サブユニット構造において、より明確に分解されるが、７０Ｓリボソーム構造において見られるいくつかの特徴（例えば、５０Ｓサブユニットにおけるタンパク質Ｌ１および３０Ｓサブユニットのヘッドの一部）は、サブユニットマップにおいて存在しないようである。おそらく、７０Ｓリボソーム結晶中に存在しない局所的無秩序に起因する。Ｈａｌｏａｒｃｕｌａ ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ由来の５０Ｓリボソームサブユニットの２．４Å構造（Ｂａｎら ２０００）は、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来の３０Ｓリボソームサブユニットの３Å構造（Ｗｉｍｂｅｒｌｙら ２０００）であるとして、最近報告された。さらに、このサブユニットのこれらの原子分解構造においてでさえ、目に見えない構造のアスペクト（例えば、Ｌ１１、Ｗｉｍｂｅｒｌｙら、２０００を参照のこと）が、本出願人らが以下に記載する５．５Åの７０Ｓ構造において、最初に目に見えた。さらに、３０Ｓサブユニットの特定の構造（例えば、ヘッドおよびプラットホームの配向）は、単離したサブユニットと７０Ｓリボソームとの間で異なる。
【０００９】
Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ７０Ｓリボソームおよびリボソーム複合体の結晶化（Ｔｒａｋｈａｎｏｖら １９８７；Ｔｒａｋｈａｎｏｖら １９８９；Ｈａｎｓｅｎら １９９０；Ｙｕｓｕｐｏｖａら １９９１；Ｙｕｓｕｐｏｖら １９９１）は、異なる機能的状態で完全なリボソームの構造を解明するための可能性を提供した。より最近の研究において、本出願人らは、ｍＲＮＡおよびｔＲＮＡまたはｔＲＮＡアナログを含む完全なＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ７０Ｓリボソームの機能的な複合体の結晶化および７．８Åの分解能までのｘ線結晶学によるそれらの構造の分解を報告した（Ｃａｔｅら １９９９）。ｒＲＮＡの多くのスペクトル特性を同定し、そして多くの場合において、タンパク質構造の要素がまた認識可能であった。Ａ、ＰおよびＥ部位における、ｔＲＮＡとリボソームとの相互作用は、これまでに得られた最良の詳細さで見られ、翻訳の機構に新しい洞察を提供した。
【００１０】
７０Ｓリボソーム構造の構造決定におけるこれらの改善にも係わらず、分子相互作用（例えば、３０Ｓサブユニットと５０Ｓサブユニットとの間の界面における相互作用）の特定の詳細は、７０Ｓリボソームの構造決定について、先行技術において明らかに解決されていない。７０Ｓリボソームのこの構造特徴および他の構造特徴の詳細な知識は、リボソームの機能、ならびにこのリボソームの機能を変えるための新規化合物の合理的な設計に関する構造的な基礎に、より深い洞察を与える。従って、７０Ｓリボソームのより高度な分解構造に対する必要性が存在する。本発明は、７０Ｓリボソーム構造の分解を５．５Åまで広げることによって、これらの利点および他の利点を提供する。以下において記載される方法を使用して、５．５Å構造は、７０Ｓリボソーム構造の高分解構造の詳細（７０Ｓリボソームまたはそのサブユニットの構造決定に関して、先行分野で先に解決されなかった多くの特徴の決定を含む）を得るための基礎を提供する。
【００１１】
（発明の簡単な要旨）
Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ７０Ｓリボソームの３次元構造が、５．５Åの分解能で経験的に決定された。５．５Å構造を使用して、観測された５．５Åの電子密度マップに対して、３０Ｓリボソームサブユニット（Ｗｉｍｂｅｒｌｙら ２０００）および５０Ｓリボソームサブユニット（Ｂａｎら ２０００）の原子分解構造を適合することによって、先に決定されなかった７０Ｓリボソームのアスペクトの、原子分解の詳細を得た。この構造分析の基礎に基づいて、構造的な考慮および機能的な考慮から、リボソームサブユニットの会合および機能に関して重要であると考えられる、構造の一部または特定のアミノ酸残基を同定することが、現在可能である。
【００１２】
従って、第１の局面において、本発明は、７０Ｓリボソームまたはそのサブユニットに結合する分子を同定する方法に関する。別の局面において、本発明の方法に従って同定された分子を試験して、この分子が７０Ｓリボソームの機能を変えるかどうかを決定する。７０Ｓリボソームまたはそのサブユニットに結合し、そしてタンパク質の合成（すなわち、翻訳）を中断させる薬剤は、抗菌性化合物としての有用性を有する。７０Ｓリボソームまたはそのサブユニットに結合して、ｔＲＮＡ結合を変える薬剤は、種々のポリペプチドの生成のための薬剤としての有用性を有し、これらのいくつかは、変化した機能的特性を有する。
【００１３】
本発明の方法は、特定の構造を有する分子の同定および／または設計を必要とする。この方法は、以下に記載される、７０Ｓリボソームのｘ線結晶学の研究から誘導される正確な構造情報の使用に依存する。
【００１４】
なお別の局面において、本発明は、コンピューター読み取り可能なメモリー内に含まれる７０Ｓリボソームのモデル構造を含む。関連する局面において、本発明は、細菌の７０Ｓリボソームの少なくとも一部を規定する、Ｘ線結晶構造座標を含む、メモリーを含むコンピューターシステムを含み、この構造座標は、少なくとも５．５Åの分解能までＸ線を回折する細菌性７０Ｓリボソームの結晶から決定され、ユニットセルの寸法がａ＝ｂ＝５０７．２Å、ｃ＝８０３．７Åまでの、Ｉ４２２の空間群；およびメモリーを備える電気通信におけるプロセッサを有し；そしてこのプロセッサは、細菌性７０Ｓリボソームの少なくとも一部の３次元形状表記を有する分子モデルを作製する。
【００１５】
別の局面は、変更された機能的特性を有する、７０Ｓリボソーム改変体またはサブユニット改変体に関する。１つの好ましい実施形態において、この改変体は、変更されたｔＲＮＡ結合特性を有する。別の好ましい実施形態において、この改変体は、３０Ｓサブユニットと５０Ｓサブユニットとの間の結合親和性を変更する、１以上のＲＮＡまたはポリペプチド配列の変化を有する、５０Ｓサブユニットを含む。なお別の好ましい実施形態は、３０Ｓサブユニットと５０Ｓサブユニットとの間の結合親和性を変更する、１以上のＲＮＡまたはポリペプチドの配列の変化を有する、３０Ｓサブユニットを含む。特に好ましい実施形態において、この配列の変化は、３０Ｓサブユニットと５０Ｓサブユニットとの間の界面の構造を混乱させることによって結合親和性に影響を及ぼす。このような改変体のサブユニットは、構築された７０Ｓリボソームとそれらの成分である３０Ｓサブユニットおよび５０Ｓサブユニットとの間の正常なな平衡を変更することによって、リボソームの機能のドミナントネガティブインヒビターとして作用する。別の好ましい実施形態としてまた、３０Ｓ改変体または５０Ｓ改変体をコードするポリヌクレオチドが含まれ、ここで、この改変体は、３０Ｓサブユニットと５０Ｓサブユニットとの間の結合親和性を変更する。
【００１６】
本発明の別の局面は、細菌（真核生物ではない）リボソームに関して選択的な結合親和性を有する、ファルマコフォアおよび候補化合物の構造を決定する方法に関し、この方法は、原核生物のリボソームタンパク質またはリボソームＲＮＡのうちの少なくとも１つと、真核生物のリボソームタンパク質またはリボソームＲＮＡのうちのすくなくとも１つとの間の一次構造の系統学的可変領域を決定する工程；細菌性７０Ｓリボソームの３次元構造内の上記系統学的可変領域を位置付ける工程；および上記３次元構造内の系統学的可変領域を含むファルマコフォア結合部位の３次元配置を表すファルマコフォアを提供する工程を包含する。
【００１７】
別の局面において、本発明は、結合活性および／またはリボソーム機能に影響を及ぼす能力について、候補化合物を試験する方法を提供する。この方法は、７０Ｓリボソーム構造を使用して、標的部位の形状および／または荷電分布を決定する工程；上記部位に結合するように設計されたファルマコフォアを規定するために、上記部位を特徴付けする工程；上記標的部位と相互作用するように設計された形状および／または荷電分布を有する候補化合物を得る工程または合成する工程、ならびに上記化合物の１つ以上と７０Ｓリボソームを接触させる工程、を包含する。この局面において、本発明は、７０Ｓリボソームの構造座標を使用して、７０Ｓリボソームのインヒビターまたはアクチベーターを設計し、計算的に評価し、合成し、またはそうでなければ（例えば、化合物のライブラリーから）獲得し、そして使用することを含む。
【００１８】
従って、本発明は、詳細を規定するために、７０Ｓリボソーム結晶の構造座標の使用を含み、この詳細としては、７０Ｓリボソームの領域の原子の詳細（例えば、サブユニットの界面）、メッセンジャーＲＮＡの経路、ｔＲＮＡ結合部位、および開始因子または伸長因子についての結合部位（この部位は、タンパク質の翻訳のインヒビターまたはアクチベーターに対する標的部位である）を含む。
【００１９】
付録Ｉでに示される構造座標は、数学的操作によって改変され得、これには、結晶学的置換、構造座標の分割または転化、構造座標のセットに対する整数の足し算または引き算、および上記の任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２０】
本発明の好ましい実施形態の詳細は、添付の図面および以下の説明に示される。本発明の詳細が、一旦公知になると、多種のさらなる革新および変化は、当業者にとって自明となる。科学刊行物、タンパク質構造ファイル（ＰＤＢおよび／またはＭＭＤＢ識別子によって参照される）、特許、およびこの明細書中で引用される特許出願を含む全ての参考文献は、全ての目的のために、それらの全体が参考として明白に援用されている。
【００２１】
本特許は、カラーで作成された少なくとも１枚の図面を含む。カラー図面を有する本特許のコピーは、必要な料金を要求および支払うことによって、特許・商標庁によって提供される。
【００２２】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
本発明は、本明細書に開示される、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来の７０Ｓリボソームの５．５Å結晶構造の発見に基づく。
【００２３】
（定義）
全ての科学用語は、代替の意味が以下に記載されていなければ、当業者に理解されるとおりの、その通常の意味を与えられるべきである。抵触する場合は、本明細書中に記載される定義に照らし合わせるべきである。
【００２４】
本明細書中で使用される場合、用語「結合部位」または「結合ポケット」とは、特定の化合物が結合するかまたは相互作用する、タンパク質またはタンパク質／ＲＮＡ複合体またはＲＮＡの領域をいう。
【００２５】
本明細書で使用される場合、用語「界面」とは、１つ以上の分子の２つ以上のドメインが会合する点または表面をいう。
【００２６】
本明細書で使用される場合、用語「翻訳可能ＲＮＡ」とは、翻訳に必要な因子と共にインキュベートされた場合に、タンパク質の合成を誘導し得るＲＮＡをいう。
【００２７】
本明細書で使用される場合、用語「減少する（ｄｅｃｒｅａｓｅ）」とは、少なくとも１０％および好ましくは２０％〜５０％以上の減少をいう。
【００２８】
本明細書で使用される場合、用語「抗菌（性）」または「抗生（の）」とは、当業者に公知の任意の手段により測定された、細菌の増殖の統計学的に有意な減少（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）を生じることにより、その細菌の増殖を阻害する、化合物の能力をいう。
【００２９】
本明細書で使用される場合、用語「と会合する」または「と相互作用する」とは、ある化学実体、化合物、またはその部分と、別の化学実体、化合物またはその部分との間が近接している状態をいう。会合または相互作用は、非共有結合（ここで、水素結合またはｖａｎ ｄｅｒ Ｗａａｌｓ相互作用もしくは静電相互作用により並置がエネルギー的に有利である）であっても、または共有結合であってもよい。
【００３０】
本明細書中で使用される場合、用語「ファルマコフォア」とは、特定の生物学的標的構造との最適な超分子相互作用を確実にするため、および生物学的応答を誘発するかまたはブロックするために必要である、立体的特徴および電子的特徴の集合をいう。ファルマコフォアを使用して、そのファルマコフォアに存在する立体的特徴および電子的特徴の集合の全てまたは大部分を含み、そして部位に結合して生物学的応答を誘発するかまたはブロックすることが期待される、１種以上の候補化合物を設計し得る。
【００３１】
本明細書中で使用される場合、用語「構造座標」とは、結晶からＸ線を回折させることにより得られるＸ線回折パターンに対して数学的方程式から導かれた数学的座標をいう。この回折データはその結晶を含む単位格子の電子密度マップを計算するために使用され；このマップは、単位格子内の原子の位置（すなわち、構造座標）を確立するために使用される。当業者は、Ｘ線結晶学により決定された一組の構造座標が、標準誤差を含むことを理解する。本発明の目的のために、付録Ｉの構造座標に重ね合わせた場合に、骨格原子の平方自乗平均偏差が０．７５オングストローム未満である７０Ｓリボソームについての構造座標の任意の組は、同一であるとみなされるべきである。
【００３２】
句「翻訳の忠実度」とは、３ヌクレオチドコドンをそれによりコードされるアミノ酸に関連付ける遺伝コードに従って、ｍＲＮＡ分子によりコードされる配列が、アミノ酸配列に翻訳される正確さをいう。
【００３３】
句「ある残基に対応する残基」とは、例えば、配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）の付いた残基を参照することにより、明確に同定される残基、および関連するタンパク質または核酸において類似の位置を占める残基を含むことを意図する。関連するタンパク質または核酸とは、通常、参照タンパク質分子または参照核酸分子と同様の構造特性または機能的特性を有するが、参照タンパク質または核酸分子が由来する生物と異なる生物由来であるタンパク質または核酸をいう。いくつかの例では、文脈に基づいて明らかであるが、関連タンパク質または核酸は、参照タンパク質または核酸が由来する生物と同じ生物に由来するが、参照タンパク質または核酸分子と同様の構造的特徴または機能的特徴を有する改変体タンパク質分子または改変体核酸分子であり得る。
【００３４】
構造類似性は、例えば、配列類似性から推測され得、この類似性は、配列の視覚的検査および比較により、または以下のような周知のアラインメントソフトウエアプログラムを使用して当業者により決定され得る：ＣＬＵＳＴＡＬ（Ｗｉｌｂｕｒ，Ｗ．Ｊ．およびＬｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０，７２６−７３０（１９８３））またはＣＬＵＳＴＡＬＷ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．およびＧｉｂｓｏｎ，Ｔ．Ｊ．，ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ：配列の重み付け（ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ）、位置特異的ギャップペナルティーおよび重みマトリクス選択によりプログレッシブマルチプルシーケンスアラインメントの感度を改善する、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２：４６７３−４６８０（１９９４））またはＢＬＡＳＴ（登録商標）（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ，Ｇｉｓｈ Ｗら、Ｊ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｏｃｔ ５；２１５（３）：４０３−１０（１９９０））、照会がタンパク質とＤＮＡのどちらであるかに関わらず利用可能な配列データベースの全てを調査するように設計された類似性検索プログラムのセット。ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｃｌｕｓｔａｌｗ／において利用可能であり；ＢＬＡＳＴは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／において利用可能である。第１および第２のタンパク質配列または核酸配列が整列される場合に、２つの残基が同じ位置を占める場合、第１の配列内の１つの残基は、第２の配列内の１つの残基に対応する。表Ｉは、例示的な代表的アラインメントを提供し、これを使用して、異なる生物の関連タンパク質および核酸由来の残基間の対応を同定し得る。表Ｉに例示される配列アラインメントは、ＣＬＵＳＴＡＬを使用して作製された。
【００３５】
【表１】

（導入）
リボソームは、全ての生存細胞においてタンパク質合成を担う、偏在している超分子複合体である。これらは、５０を超える異なるタンパク質に加えて、大量のリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）を含む。その他の細胞ポリメラーゼと異なり、その作用機構は、基本的にＲＮＡに基づくようである（すなわち、リボザイムである）。従って、リボソーム内のｒＲＮＡおよびタンパク質の３次元構造の詳細な知識は、翻訳の分子的理解に必須である。
【００３６】
従って、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）の機能的能力についての構造的根拠を理解することは、複雑で生物学的に非常に重要な翻訳という作業のために、タンパク質の代わりに、これらの古代の小器官がＲＮＡを使用する理由を説明するために必須である。細菌および原始生物の（ａｒｃｈａｅａｌ）リボソームは、小さな（３０Ｓ）のサブユニット（１６ＳｒＲＮＡおよび約２０のタンパク質を含有する）、および大きな（５０Ｓ）サブユニット（２３ＳｒＲＮＡ、５ＳｒＲＮＡおよび３０を超えるタンパク質を含有する）から構成される。完全な７０Ｓリボソームは、３０Ｓサブユニットを５０Ｓサブユニットに分子間架橋ネットワークを介して結合することにより形成される。２つのサブユニット間に形成されるサブユニット間空隙は、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）により占められ、ｍＲＮＡコドンに対するｔＲＮＡのアンチコドン塩基対は、３０Ｓサブユニットに存在し、一方それらの３’−ＣＣＡ末端は、５０Ｓサブユニットにおけるペプチド結合形成部位であるペプチジルトランスフェラーゼ中心に到達する。
【００３７】
（７０Ｓリボソームの結晶構造座標の使用）
Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓから決定した７０Ｓリボソームの５．５オングストロームの構造は、ファルマコフォアおよび／または候補化合物（新規かまたは公知の化合物の修飾による）を理論的に設計するためのモデルとして使用され得る。結晶構造座標の使用により同定されるファルマコフォアおよび候補化合物は、細菌タンパク質合成速度を変更するために有用であるので、抗菌薬（抗生物質を含む）および防腐剤としての有用性を有する。ファルマコフォアおよび候補化合物は、当該分野で公知の任意の方法に従って決定され得、これらの方法としては、米国特許第５，８８８，７３８号（Ｈｅｎｄｒｙ）に記載の方法および米国特許第５，８５６，１１６号（Ｗｉｌｓｏｎら）に記載の方法（これら両方の開示は、あらゆる目的のためにその全体が参考として援用される）が挙げられる。
【００３８】
本明細書中に提供される構造データを、コンピュータモデリング技術と共に使用して、結晶構造データの解析により選択される７０Ｓリボソーム上の部位のモデルを開発し得る。この部位モデルは、部位表面の３次元トポグラフィー、およびｖａｎ ｄｅｒ Ｗａａｌｓ接触、静電相互作用、および水素結合の機会を含む因子を特徴付ける。次いで、コンピュータシミュレーション技術を使用して、モデル部位と相互作用するように設計される官能基（プロトン、ヒドロキシル基、アミン基、二価カチオン、芳香族官能基および脂肪族官能基、アミド基、アルコール基などを含む）に関して相互作用位置をマッピングする。候補化合物がこの部位に特異的に結合することを期待して、これらの基をファルマコフォアまたは候補化合物に設計し得る。従って、ファルマコフォア設計は、候補化合物がファルマコフォア内に入って、利用可能な化学的相互作用の型（水素結合相互作用、ｖａｎ ｄｅｒ Ｗａａｌｓ相互作用、静電相互作用、および共有結合相互作用を含むが、一般的に、かつ好ましくは、ファルマコフォアは、部位と非共有結合機構を介して相互作用する）のいずれかまたは全てを介して部位と相互作用する能力を考慮することを包含する。
【００３９】
ファルマコフォアまたは候補化合物が７０Ｓリボソームに結合する能力は、コンピュータモデリング技術を使用して実際の合成の前に解析され得る。コンピュータモデリングにより、十分な結合エネルギー（すなわち、１０^−２Ｍまたはそれ以上のオーダーの標的との解離定数に対応する結合エネルギー）で標的と結合することが示された候補のみを合成し得、そして当業者に公知の結合アッセイまたはリボソーム機能アッセイを使用して、それらの７０Ｓリボソームに結合する能力およびリボソーム機能を阻害する能力について試験し得る。従って、コンピュータ評価工程により、適切な親和性で７０Ｓリボソームに結合する見込みのない化合物の不必要な合成が回避される。
【００４０】
７０Ｓリボソームファルマコフォアまたは候補化合物は、コンピューターで評価され得、そして一連の工程により設計され得、この工程において、化学的実体およびフラグメントがスクリーニングされ、そして７０Ｓリボソーム上の個々の結合標的部位と会合する能力について選択される。当業者は、いくつかの方法のうちの１つを使用して、７０Ｓリボソームと会合する能力、より詳細には７０Ｓリボソーム上の標的部位と会合する能力について、化学実体またはフラグメントをスクリーニングし得る。このプロセスは、付録Ｉに示される、７０Ｓリボソームの座標、またはこれらの座標のサブセットに基づいて、例えば、コンピュータスクリーン上の標的部位の視覚的検査により開始され得る。次いで、選択されたフラグメントまたは化学実体は、結晶構造データの解析から規定されるとおりの７０Ｓリボソームの標的部位内に、種々の配向で位置付けられ得るか、または「ドッキングされ（ｄｏｃｋｅｄ）」得る。Ｑｕａｎｔａ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）およびＳｙｂｙｌ（Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）のようなソフトウエアを使用し、次いでＣＨＡＲＭＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）およびＡＭＢＥＲ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ａｔ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）のような標準的な分子力学力場を用いる、エネルギー最小化および分子動力学を使用してドッキングを達成し得る。
【００４１】
特殊化したコンピュータープログラムはまた、フラグメントまたは化学物質を選択するプロセスを補助し得る。これらとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＧＲＩＤ（Ｇｏｏｄｆｏｒｄ，Ｐ．Ｊ．，「Ａ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｅｎｅｒｇｅｔｉｃａｌｌｙ Ｆａｖｏｒａｂｌｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅｓ ｏｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ Ｉｍｐｏｒｔａｎｔ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２８，ｐｐ．８４９−８５７（１９８５））；ＧＲＩＤは、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）から入手可能である；ＭＣＳＳ（Ｍｉｒａｎｋｅｒ，Ａ．およびＭ．Ｋａｒｐｌｕｓ，「Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ Ｍａｐｓ ｏｆ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅｓ：Ａ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｃｏｐｙ Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ Ｓｅａｒｃｈ Ｍｅｔｈｏｄ」、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１１，ｐｐ．２９−３４（１９９１））；ＭＣＳＳは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から入手可能である；ＡＵＴＯＤＯＣＫ（Ｇｏｏｄｓｅｌｌ，Ｄ．Ｓ．およびＡ．Ｊ．Ｏｌｓｅｎ，「Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｄｏｃｋｉｎｇ ｏｆ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ Ｓｉｍｕｌａｔｅｄ Ａｎｎｅａｌｉｎｇ」、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，８，ｐｐ．１９５−２０２（１９９０））；ＡＵＴＯＤＯＣＫは、Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）から入手可能である；ＤＯＣＫ（Ｋｕｎｔｓ，Ｉ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．「Ａ Ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ−Ｌｉｇａｎｄ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，「Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６１，ｐｐ．２６９−２８８（１９８２））；ＤＯＣＫは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）から入手可能である；ＣＥＲＩＵＳ ＩＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から入手可能である）；ならびにＦｌｅｘｘ（Ｒａｒｅｔ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６１，ｐｐ．４７０−４８９（１９９６））。
【００４２】
適切な化学物質またはフラグメントを選択後、これらは単一の化合物に集められ得る。集合は、コンピュータースクリーンに提示される７０Ｓリボソーム構造またはその部分に対して、フラグメントの三次元画像上で、フラグメントの互いの関係を目視検査することによって進められ得る。目視検査の後に、ソフトフェア（例えば、上記のＱｕａｎｔａプログラムまたはＳｙｂｙｌプログラム）を用いてマニュアルモデルを構築し得る。
【００４３】
ソフトフェアプログラムはまた、個々の化学物質またはフラグメントを接続する際に、当業者を補助するために使用され得る。これらとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＣＡＶＥＡＴ（Ｂａｒｔｌｅｔｔ，Ｐ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．「ＣＡＶＥＡＴ：Ａ Ｐｒｏｇｒａｍ ｔｏ Ｆａｃｉｌｉｔａｔｅ ｔｈｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｂｌｅｍｓ」、Ｓｐｅｃｉａｌ Ｐｕｂｌ，Ｒｏｙａｌ Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，７８，ｐｐ．１８２−１９６（１９８９））；ＣＡＶＥＡＴは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ）から入手可能である；３Ｄ Ｄａｔａｂａｓｅ ｓｙｓｔｅｍｓ（例えば、ＭＡＣＣＳ−３Ｄ（ＭＤＬ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ，（Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）））；この領域はＭａｒｔｉｎ，Ｙ．Ｃ．，「３Ｄ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｓｅａｒｃｈｉｎｇ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ」、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３５：２１４５−２１５４（１９９２））において総覧される；およびＨＯＯＫ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．，（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から入手可能である）。
【００４４】
個々のフラグメントまたは化学物質から候補ファルマコフォア（ｐｈａｒｍａｃｏｐｈｏｒｅ）または候補化合物を構築する代わりに、これらは、７０Ｓ標的部位の構造（必要に応じて、標的部位に結合する補因子あるいは既知のアクチベーターまたはインヒビターからの情報を含む）を用いて初めから（ｄｅ ｎｏｖｏ）で設計され得る。デノボ（Ｄｅ ｎｏｖｏ）設計は、以下を含むが、これらに限定されないプログラムに含まれ得る：ＬＵＤＩ（Ｂｏｈｍ，Ｈ．Ｊ．，「Ｔｈｅ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｐｒｏｇｒａｍ ＬＵＤＩ：Ａ Ｎｅｗ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｅ Ｎｏｖｏ Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ａｉｄ．Ｍｏｌｅｃ．Ｄｅｓｉｇｎ，６，ｐｐ．６１−７８（１９９２））；ＬＵＤＩは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から入手可能である；ＬＥＧＥＮＤ（Ｎｉｓｈｉｂａｔａ，Ｙ．，およびＩｔａｉ，Ａ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４７，ｐ．８９８５（１９９１）；ＬＥＧＥＮＤは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から入手可能である；ならびにＬｅａｐＦｒｏｇ（Ｔｒｉｐｏｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手可能である）。
【００４５】
公知のリボソームリガンドの機能効果はまた、本明細書に記載される分子モデリグおよび設計技術の使用によって変更され得る。これは、細菌の７０Ｓリボソームモデル構造に対して既知のリボソームリガンドの構造をドッキングすること、そして７０Ｓリボソームとの結合相互作用を最適化するために、リガンドの形状および電荷の分布を改変することによって実行され得る。この改変された構造は、合成しても化合物のライブラリーから獲得してもよく、そしてその結合親和性および／またはリボソーム機能に対する効果について試験され得る。もちろん、７０Ｓリボソームまたはリボソームのサブユニットとリガンドとの間の複合体の結晶構造が既知の場合、この複合体と本発明の７０Ｓリボソーム構造との間の比較は、リガンド結合の際に生じる、リボソーム構造の変更についての更なる情報を得るために実行され得る。この情報は、最適化リガンドの設計に使用され得る。リボソーム機能を妨害する抗生物質は、特に、ドッキング、共結晶化および本発明の最適化用途に十分に適する。抗生物質のこれらの型の列挙は、ＳｐａｈｎおよびＰｒｅｓｃｏｔｔ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，７４：４２３−４３９（１９９６）において見い出され得、これは、その全体が全て目的のために参考として援用される。
【００４６】
さらなる分子モデリング技術がまた、本発明に従って使用され得る。例えば、Ｃｏｈｅｎ，Ｎ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３３，ｐｐ．８８３−８９４（１９９０）；Ｎａｖｉａ，Ｍ．Ａ．およびＭｕｒｃｋｏ，Ｍ．Ａ．，「Ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ」、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８，ｐｐ．６９６−７００（１９９７）；ならびにＡｆｓｈａｒ，ｅｔ ａｌ．「Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ｂａｓｅｄ ａｎｄ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ Ｎｅｗ ＲＮＡ−Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｒｕｇｓ」、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０，ｐｐ．５９−６３（１９９９）を参照のこと。
【００４７】
上記の方法または当業者に公知の他の方法のいずれかに従うファルマコフォアおよび候補化合物の設計、または選択に従って、７０Ｓリボソームに結合する、ファルマコフォアの定義内に入る候補化合物の有効性は、計算評価を用いて試験および最適化され得る。候補化合物は最適化され得、その結果、例えば、その結合状態において、好ましくは、標的部位との反発静電相互作用がない。これらの反発静電相互作用としては、反発する電荷−電荷相互作用、双極子−双極子相互作用および電荷−双極子相互作用が挙げられる。候補化合物が７０Ｓリボソームに結合された場合、候補化合物と７０Ｓリボソームとの間の静電相互作用の全合計は、結合エンタルピーに対して中性または有利な寄与を生じることが望ましい。
【００４８】
特定のコンピューターソフトフェアは、化合物の変形エネルギーおよび静電相互作用を評価するために、当該分野で利用され得る。このような使用のために設計されたプログラムの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｇａｕｓｓｉａｎ ９２，ｒｅｖｉｓｉｏｎ Ｃ（Ｆｒｉｓｃｈ，Ｍ．Ｊ．，Ｇａｕｓｓｉａｎ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ （１９９２））；ＡＭＢＥＲ，ｖｅｒｓｉｏｎ ４．０（Ｋｏｌｌｍａｎ，Ｐ．Ａ．，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ａｔ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，（１９９４））；ＱＵＡＮＴＡ／ＣＨＡＲＭＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ．（１９９４））；およびＩｎｓｉｇｈｔ Ｉｌ／Ｄｉｓｃｏｖｅｒ（Ｂｉｏｓｙｍ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９４））。これらのプログラムは、例えば、Ｓｉｌｉｃｏｎ Ｇｒａｐｈｉｃｓワークステーション，Ｉｎｄｉｇｏ，０２−Ｒ１００００またはＩＢＭ ＲＩＳＣ／６０００ワークステーションモデル５５０を用いて実行され得る。上記の機能を実行するために、他のハードウェアおよびソフトウェアの組合せが使用され得、そしてこれは当業者に公知である。
【００４９】
一旦、ファルマコフォアまたは候補化合物が、上記のように、至適に選択または設計されると、置換は、その結合特性を改良するかまたは改変するために、その原子または側鎖の一部においてなされ得る。一般に、その置換基において保存的な最初の置換は、元の基とほぼ同じサイズ、形状、疎水性および電荷を有する。コンホメーションを変更するが当該分野で公知の要素は、置換する際に避けられる。置換された候補物は、上記と同様の方法を用いて、７０Ｓリボソームへの適応の有効性について分析され得る。
【００５０】
一旦、候補化合物が、上記の方法のいずれかを用いて同定されると、これは生物学的活性についてスクリーニングされ得る。当業者に公知の多くのリボソーム機能アッセイのうちの任意の１つが、使用され得る。これらとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：細菌増殖の阻害、メッセンジャーＲＮＡをテンプレートとして用いるインビトロタンパク質合成の阻害、テンプレートとしてポリＵを用いるインビトロタンパク質合成の伸長段階の阻害、ＥＦ−Ｇによって媒介されるＧＴＰ加水分解の阻害；ＥＦ−Ｇにより媒介されるＧＴＰ加水分解の活性化。
【００５１】
７０Ｓリボソームとの候補化合物の相互作用はまた、当業者に公知であるようなフィルター結合アッセイを含む直接結合アッセイを用いて評価され得る。結合アッセイは、公知のリボソーム結合化合物（例えば、抗生物質）の結合を競合的に阻害する候補化合物を評価するために改変され得る。これらおよび他のアッセイは、国際公報ＷＯ ００／６９３９１に記載されており、その全体の開示が全て目的のために参考として援用される。
【００５２】
（スクリーニングのための化合物ライブラリ）
本発明の方法に従って同定されたインヒビターおよび／またはアクチベーターは、多くの供給源から入手可能な化合物のライブラリから提供され得るか、または当該分野で公知のコンビナトリアルケミストリーアプローチによって誘導され得る。このようなライブラリには、以下が含まれるが、これらに限定されない：入手可能なＣｈｅｍｉｃａｌ Ｄｉｒｅｃｔｏｒ、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅおよび天然産物の収集物。本発明の１つの実施形態において、既知または推測された構造を有する化合物のライブラリは、本発明の７０Ｓリボソーム構造にドッキングされ得る。
【００５３】
以下の実施例は、本発明がより十分に理解され得るように記載される。これらの実施例は、説明の目的のみであり、いかなる様式においても、本発明を限定するように解釈されるべきではない。
【００５４】
（実施例１−７０Ｓリボソームの結晶化および構造解析）
７０Ｓリボソームの機能的複合体の三次元構造を、Ｘ線結晶学を用いて５．５オングストローム分解能で決定した。結晶を、実質的にＣａｔｅ ｅｔ ａｌ．，１９９９により記載されるように調製した。結晶調製ならびに電子密度マップの計算およびマップのフィッティングを、以下のように進めた。
【００５５】
Ｐ部位およびＥ部位に結合された合成ｍＲＮＡアナログとｔＲＮＡ^Ｍｅｔ _ｆとの複合体における、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ７０Ｓリボソームの結晶を、（Ｃａｔｅ ｅｔ ａｌ．１９９９）に記載されるように成長させた。リボソームは、Ｇｏｇｉａ，Ｚ，Ｙｕｓｕｐｏｖ，Ｍ，ｅｔ．ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（ＵＳＳＲ）２０，５１９（１９８６）に記載されるようにＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＨＢ８溶解物から調製した。改変されたＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列を有する３６−ｎｔファージＴ４遺伝子３２のｍＲＮＡフラグメント（配列番号５０）および他の２つの改変体ｍＲＮＡ（配列番号５１および５２）を、化学的に合成した（Ｄｈａｒｍａｇｏｎ）。ｔＲＮＡ_ｆ ^ＭｅｔおよびｔＲＮＡ^ＬｙｓをＥ．ｃｏｌｉ（Ｓｕｂｒｉｄｅｎ）から単離した。ｔＲＮＡ^Ｐｈｅ（１９ヌクレオチド、ＡＳＬ^Ｐｈｅ）のアンチコドンの幹ループ（ＡＳＬ）を、ｔ７ポリメラーゼを用いるインビトロ転写により合成した。ＲＮＡを変性ゲルで精製し、溶出し、そして使用する前にエタノールで沈殿させた。Ｐ部位リボソーム複合体を形成するために、短縮遺伝子３２ｍＲＮＡおよびＡＳＬ^ＰｈｅまたはｔＲＮＡ_ｆ ^Ｍｅｔを、２０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１００ｍＭ ＫＣｌ、および２０ｍＭ ｔｒｉｃ ＨＣｌ（ｐＨ７．４）を含有する溶液中で、リボソーム結晶化の前に３７℃で３０分間、インキュベートした（Ｙｕｓｕｐｏｖ，Ｍ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｄｏｋｌ．Ａｋａｄ．Ｎａｕｋ．（ＵＳＳＲ）２９２，１２７１（１９８７）；Ｙｕｓｕｐｏｖａ，Ｇ．Ｚｈ，およびＹｕｓｕｐｏｖ，Ｍ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，未発表データ。全てのリガンドは、結晶化の前に、複合体を形成するために、リボソームの濃度より化学量論的に１．１〜１．５倍過剰に存在する。Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ７０Ｓリボソーム複合体の結晶を、懸滴および凝結滴における蒸気拡散法によって成長させた。結晶は、０．５ｍｍ×０．５ｍｍ×０．２５の最大寸法に成長した。重原子誘導体を、１〜５日間、重原子化合物を含む溶液中に結晶を浸漬することによって調製した。Ｐ部位にＡＳＬおよびＡ部位にｔＲＮＡを有するリボソーム複合体を得るために、Ｐ部位複合体（リボソーム−ｍＲＮＡ−ＡＳＬ^Ｐｈｅ）の結晶を、室温で４８時間にわたって、ｔＲＮＡ^Ｌｙｓ（２μＭ、Ｓｉｇｍａ）を含有する溶液に浸漬した。Ｐ部位においてｔＲＮＡ^Ｍｅｔを有する結晶は、Ｐ部位においてＡＳＬを有する結晶と比較して、高分解能で回析した。予想したように、異なる結晶から得られたＸ線回析の質において、変化があった。５．０オングストローム分解能の回析データは、データ収集の間の、結晶への放射線損傷を最小化する凍結結晶技術を用いて、ｔＲＮＡ_ｆ ^ＭｅｔＰ部位結晶から得ることができた。回析データのシグナル対ノイズ特性は、空気からのバックグラウンド散乱を最小化するために、ビームストップを結晶の近くに動かすことによって最適化した。
【００５６】
ａ＝ｂ＝５０７．２Åおよびｃ＝８０３．７Åの格子寸法を有する空間群Ｉ４２２の結晶を成長させた。データは５Åの分解能で収集した。構造因子の振幅をＡｄｖａｎｃｅｄ Ｌｉｇｈｔ Ｓｏｕｒｃｅ（ＡＬＳ）で測定した（実質的には、（Ｃａｔｅ ｅｔ ａｌ．１９９９）に記載される）。電子顕微鏡から導かれたモデルから得られた分子置換を用いて位相決定を開始し、２５オングストロームまでの位相を与えた。これらの位相を、重金属クラスターを用いて１２オングストロームに拡張させた。Ｐ部位におけるアンチコドン幹ループｔＲＮＡアナログ（「ＡＳＬ］）（Ｃａｔｅ ｅｔ ａｌ．１９９９）を含む結晶から実験的に決定した構造因子位相を、Ｐ部位においてｔＲＮＡ^Ｍｅｔ _ｆを含む結晶から測定した回析データの構造因子位相決定のための開始位置として使用した。イリジウムヘキサミンを用いる、さらなるＭＡＤ位相決定を、７．５オングストロームに対するデータについての位相を得るために実行し、そして溶媒フリッピングを用いる位相拡張は、現行の５．５オングストロームの電子密度マップを生じた。５．５Åへの位相拡張を、ＣＮＳにおいて密度改変および溶媒フリッピングによって実行した（Ｂｒｕｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９８）。位相の質を、結合したＰ ｔＲＮＡの電子密度によって確認し、ここで、既知の構造の内部標準を提供した（図１）。Ａ部位に結合したｔＲＮＡを含むか、または含まない結晶化した７０Ｓ複合体を使用して、７Åのフーリエの偏差マップを得て、Ａ部位ｔＲＮＡの位置を提供した。表ＩＩは、結晶学的統計およびスケーリングをまとめる。
【００５７】
（表ＩＩ．結晶学的統計およびスケーリング）
【００５８】
【表２】

ここで、Ｆ_ＰＨおよびＦ_Ｐは、それぞれ、ＡＳＬ含有リボソーム結晶およびＰ部位ｔＲＮＡ含有リボソーム結晶からの構造因子振幅である。
^‡χ^２、分析、２０〜７．５Åは、Ｓｃａｌｅｐａｃｋ（Ｏｔｗｉｎｏｓｋｉ １９９３）から選んだ。
^＊＊平均確実度、または位相誤差の平均コサインは、ＡＳＬ含有結晶から測定された実験的位相から計算した（Ｃａｔｅ ｅｔ ａｌ．１９９９）。
^＃以前に報告されたＭＡＤ位相決定実験（Ｃａｔｅ ｅｔ ａｌ．１９９９）から選んだデータセット。
【００５９】
５．５Åで、ＲＮＡ骨格は、高い信頼で追跡され得、既知の構造のタンパク質は、電子密度に容易にフィッティングされ得る。三次元モデルレンダリングを、ＲＩＢＢＯＮＳ（Ｍ．Ｃａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２７７Ｂ，４９３−５０５（１９９７））、ＲＩＢＢＯＮＳおよびＯ（Ｊｏｎｅｓ，Ｔ．Ａ．，Ｚｏｕ，Ｊ．Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，ＡＣＴＡ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ａ ４７，１１０（１９９１））を用いる電子密度マップならびにＸＲＮＡを用いる二次構造ダイアグラムを使用して作製した。電子密度マップの最終的な解説は、高分解能のサブユニット構造の有効性によって非常に容易になったとはいえ（Ｂａｎ ｅｔ ａｌ．２０００；Ｓｃｈｌｕｅｎｚｅｎ ｅｔ ａｌ．２０００；Ｗｉｍｂｅｒｌｙ ｅｔ ａｌ．２０００）、本発明者らのマップの質は、生物学的および系統発生的な制約によって誘導されるが、高分解能構造情報から独立して、１６Ｓ ｒＲＮＡ鎖（全体ｒｍｓｄ＝５．７Å）の妥当な初期適合（ｆｉｔ）を可能にするのに十分であった。
【００６０】
３０Ｓリボゾームサブユニットの３Å構造は、以下の方法に従って本発明者らが作成した７０Ｓ ５．５Å分解能マップ上にドッキングされる（ｄｏｃｋｅｄ）。本発明者らの５．５Å分解能構造から分かるリン酸の位置を用いて、Ｗｉｍｂｅｒｌｙら（２０００）により決定された３０Ｓ構造内に含まれる１６Ｓ ｒＲＮＡのリン酸をアライメントする。これは、最初に目視によりフィットを用い、これを、引き続いて、通常の最小二乗法フィッティング（ｆｉｔｔｉｎｇ）アルゴリズムを用いてリファインした。このようなドッキング（ｄｏｃｋｉｎｇ）およびフィッティングは、ＳＧＩ Ｏ２またはＯｃｔａｎｅ型の機器で実行する、ＭＩＤＡＳ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ）を使用して実行され得る。
【００６１】
ドッキングのリファインメント（ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ）を、初期アライメントを得るために、剛体として３０Ｓ構造を用いることにより実行した。このことは、３０Ｓ構造を逐次的により小さな成分へと分解することの連続反復に従い、最終的には、偽原子（ｐｓｅｕｄｏａｔｏｍ）として１６Ｓ ｒＲＮＡ中の各リン酸を用いて、３０Ｓサブユニットの高分解能構造と本発明者らの５．５Å７０Ｓ構造との間の最も正確なフィットを得る。
【００６２】
Ｗｉｍｂｅｒｌｙの３０Ｓ構造座標は、ＰＤＢ（ＰＤＢ ｉｄ １ＦＪＦおよび１ＦＪＧ；ＭＭＤＢ ｉｄ １４３２１および１４３２２）から得た。この３０Ｓ構造は、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓから決定されたので、本発明者らの５．５Åに対する高分解能３０Ｓ構造についての初期フィットは、定性的に良好であった。１６Ｓ ｒＲＮＡの骨格を本発明者らの電子密度マップにフィッティングした後、３０Ｓサブユニットの高分解能構造が現れた（Ｗｉｍｂｅｒｙら、２０００；Ｓｃｈｌｕｅｎｚｅｎら、２０００）。本発明者らのモデルは、Ｓｃｈｌｕｅｎｚｅｎらの構造よりも、Ｗｉｍｂｅｒｌｙらの構造とより密接に一致した（全体のｒ．ｍ．ｓ．ｄ．＝６．９Å）。
【００６３】
小サブユニットタンパク質は、初めに、剛体として、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ３０Ｓサブユニット構造由来の別個のタンパク質についての座標を用いて、ドッキングされた（Ｗｉｍｂｅｒｌｙら、２０００）。Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ大サブユニットタンパク質の殆どの構造は、未知であり；従って、最も関連した生物由来のタンパク質の構造を、任意の余分な残基を削除した後、モデリングした。
【００６４】
Ｈａｌｏａｒｃｕｌａ ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ ５０Ｓサブユニット構造（２３Ｓ ｒＲＮＡおよび５Ｓ ｒＲＮＡを含む）（Ｂａｎら、２０００）が利用できることによって、細菌構造と古細菌構造との間で保存される領域における本発明者らの電子密度の５０Ｓサブユニット部分のフィッティングが容易になり；古細菌構造の大フラグメントの初期剛体ドッキングの後に、本発明者らのマップに対するより小さなフラグメントおよび個別のリン酸の詳細なフィッティングを行った。ドッキングに用いられる代表的な構造としては、ＰＤＢ ｉｄ １ＦＦＺ；ＭＭＤＢ ｉｄ １４０６０（ピューロマイシンを伴う）、ＰＤＢ ｉｄ １ＦＧ０；ＭＭＤＢ ｉｄ １４０６１（１３ｂｐミニへリックスピューロマイシン化合物を伴う）、およびＰＢＤ ｉｄ ＦＦＫ；ＭＭＤＢ ｉｄ １４１６４（５０Ｓ単独）が挙げられる。
【００６５】
高分解能５０Ｓサブユニット構造と本発明者らの７０Ｓモデル構造の５０Ｓ部分との間の更なるリファインメント（以下に記載されるのと同じ方法に従って実行される）が、必要とされた。なぜならば、３０Ｓサブユニットを含まないで結晶化される場合、５０Ｓサブユニットの間に高次構造の差異が存在するからであるが、このことは、Ｈａｌｏａｒｃｕｌａ ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ由来の２３Ｓ ｒＲＮＡの構造と、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来の２３Ｓ ｒＲＮＡの構造との間の系統発生的差異にもまた起因している。一次構造および二次構造の保存された領域が、一般的に観察され、５０Ｓ構造と７０Ｓ構造との間で十分にフィッティングが行われた。明らかな差異（特に、これらの２つの構造の系統発生的に異なった領域において生じる差異）を有する領域において、Ｈａｌｏａｒｃｕｌａ構造を、７０Ｓ Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ構造に対してモデリングした。異なるリボゾーム構造の間の系統発生的差異を有する領域は、周知であり、そして、例えば、ｗｗｗ．ＲＮＡ．ｉｃｍｂ．ｕｔｅｘａｓ．ｅｄｕにある、Ｒｏｂｉｎ Ｇｕｔｅｌｌにより維持されているウェブサイトに、収集されている。
【００６６】
Ｂａｎら（２０００）により決定された５０Ｓ構造におけるいくつかの領域は、視覚化できないほど十分に不規則であったが、７０Ｓ ５．５Åマップにおいて可視化し得た。５０Ｓサブユニット内に含まれるｒＲＮＡの公知の二次構造面は、５．５Å電子密度マップに容易にフィットした。５Ｓ一次構造は、ＨａｌｏａｒｃｕｌａとＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓとの間で６０％保存され、それ故、この領域は、容易にフィットした。５Ｓ構造の残りの４０％を、Ｅ．ｃｏｌｉから解析した５Ｓのフラグメント（ＰＤＢ ｉｄ ３５４Ｄ；ＭＭＤＢ ｉｄ ６７４１）に対してモデリングし、そしてこれを用いて、ループＥ領域（ＨａｌｏａｒｃｕｌａとＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓとの間の最も有意な差異を含む）をモデリングした。
【００６７】
７０Ｓリボゾームの５．５Åモデルについての原子座標は、付録Ｉとして本明細書中に添付されるＰＤＢファイルに含まれる。この構成は、以下と同定される：ファイルＡは、３０Ｓリボゾームサブユニット、ならびに関連するｔＲＮＡ分子およびｍＲＮＡ分子についての原子座標を含み；ファイルＢは、５０Ｓサブユニットについての座標を含み；ファイルＣは、７０ＳサブユニットにドッキングしたＩＦ３ Ｃ末端ドメインについての座標を含み；ファイルＤは、７０ＳサブユニットにドッキングしたＩＦ３ Ｎ末端ドメインについての座標を含み；ファイルＥは、Ｍｋ２７（３０Ｓサブユニットにおいてモデリングした２７ヌクレオチドの合成ｍＲＮＡ）についての座標を含み；ファイルＦは、Ｍｖ３６（３０Ｓサブユニットにおける３６ヌクレオチドの合成ｍＲＮＡ）についての座標を含み；そしてファイルＧは、Ｍｆ３６（３０Ｓサブユニットにおける３６ヌクレオチドの合成ｍＲＮＡ）についての座標を含む。これらの座標は、ＲＣＳＢに登録されており、ファイルのデータベースＩＤは、表ＶＩ（付録Ｉを参照のこと）に示される。登録された座標は、例えば、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖでアクセスし得る。
【００６８】
（７０ｓリボゾームの全体構造）
図２Ａは、３０Ｓサブユニットの溶媒面からの「標準的図」で７０Ｓリボゾームの構造を示し、そのヘッド（Ｈ）特徴、ボディ（Ｂ）特徴、プラットホーム（Ｐ）特徴およびネック（Ｎ）特徴、およびそれらの対応する１６Ｓ ｒＲＮＡ（シアン）成分およびタンパク質（青）成分を示す。右下の突き出た部分は、３０Ｓサブユニットの「スパー（ｓｐｕｒ）」であり、１６Ｓ ｒＲＮＡのへリックス６により形成され、これは、結晶を、最近報告された３０Ｓサブユニット構造（Ｃａｒｔｅｒら、２０００）における別のサブユニットのＰ部位と接触させる。この図において、ヘッドにおけるタンパク質Ｓ２、Ｓ３、Ｓ９、Ｓ１０およびＳ１４の位置；プラットホームにおけるタンパク質Ｓ６、Ｓ１１およびＳ１８の位置；およびボディにおけるタンパク質Ｓ４、Ｓ５、Ｓ８およびＳ１６の位置が見られる。バックグラウンドにおいて、５０Ｓサブユニットの一部は、その２３Ｓ ｒＲＮＡ（グレイ）、５Ｓ ｒＲＮＡ（頂部；青）および５０Ｓサブユニットタンパク質（マゼンタ）を有する、「クラウン（ｃｒｏｗｎ）」図（ｖｉｅｗ）で見える。タンパク質Ｌ９は、左に見られ得、５０Ｓサブユニットそのものの面を５０Åよりも超えて延びている。左上で、Ｌ１およびその２３Ｓ ｒＲＮＡ結合部位は、３０Ｓサブユニットのプロフィールの外側に突き出ており、そしてタンパク質Ｌ１１およびそのＲＮＡならびにＬ７ダイマーの１つは、右上のストーク（ｓｔａｌｋ）を構成する。
【００６９】
右手側（図２Ｂ）から、Ａ部位ｔＲＮＡのアンチコドン末端（金）は、サブユニット界面キャビティ（ｉｎｔｅｒｆａｃｅ ｃａｖｉｔｙ）の末端の近くに見られ、これは、伸長因子のＥＦ−ＴｕおよびＥＦ−Ｇがリボゾームと相互作用する漏斗型の開口を通して見られる。伸長因子のＧドメインと相互作用するリボゾーム構造の１つは、２３Ｓ ｒＲＮＡのサルシン−リシン（ｓａｒｃｉｎ−ｒｉｃｉｎ）ループ（ＳＲＬ）であり、これは、Ａ−ｔＲＮＡとタンパク質Ｌ１４との間に見られる。タンパク質Ｓ９、Ｓ１２、Ｓ１３、Ｓ１９、Ｓ２０、Ｌ３，Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７、Ｌ１１、Ｌ１３、Ｌ１４、Ｌ１９、Ｌ２２、Ｌ２５およびＬ３０、ならびにタンパク質Ｌ２１およびＬ３２の位置（その構造は未知である）、および電子密度標識ＬＵ、ＬＶ、およびＬＸの位置（本発明者らは、まだ未同定の大サブユニットリボゾームタンパク質（これは３つの割り当てられていない既知のタンパク質Ｌ３１、Ｌ３５およびＬ３６を含み得る）として割り当てる）もまた右手図で明白である。５Ｓ ｒＲＮＡ（５Ｓ）は、２つのその結合タンパク質（Ｌ５およびＬ２５）と一緒に、５０Ｓサブユニットの頂部で見られる。
【００７０】
５０Ｓサブユニットの後からの図（図２Ｃ）は、さらなる５０Ｓサブユニットのタンパク質Ｌ４、Ｌ１５、Ｌ１６、Ｌ２１、Ｌ２４、Ｌ２７、Ｌ２８、Ｌ２９、Ｌ３２、Ｌ３３、Ｌ３４の位置、第３の５Ｓ ｒＲＮＡ結合タンパク質Ｌ１８の位置、および未同定のタンパク質ＬＷおよびＬＹの位置を示す。ポリペプチド出口チャネル（ＥＣ）の開口は、５０Ｓサブユニットの裏面の底部にあり、これは、２３Ｓ ｒＲＮＡのドメインＩおよびＩＩＩの要素に加えて、タンパク質Ｌ２２、Ｌ２４およびＬ２９により囲まれている。
【００７１】
左手図（図２Ｄ）において、界面での２つのサブユニットの緊密な接近は、さらにより明確である。３０Ｓサブユニットのプラットホーム（タンパク質Ｓ１１、Ｓ６およびＳ１５のまわり）は、タンパク質Ｌ２付近の５０Ｓサブユニットに、ＲＮＡ−ＲＮＡ相互作用およびＲＮＡ−タンパク質相互作用（タンパク質Ｓ１５およびＬ２が関与する）を主に通して接触する。Ｅ部位ｔＲＮＡ（赤）は、界面のキャビティの側面（Ｌ１およびそのＲＮＡ結合部位による図から部分的に遮蔽される）の近くで見られ得、これは、リボゾームからのその出口のための経路をブロックするようである。平面図（図２Ｅ）において、界面キャビティにおける３つのｔＲＮＡの全て（Ａ、金；Ｐ、オレンジ；Ｅ、赤）の配向は、より明確に見られ得る。２３Ｓ ｒＲＮＡにおけるＡ−部位フィンガー（ＡＳＦ）と３０ＳサブユニットのヘッドにおけるＳ１３（ブリッジＢ１ａ）との間の接触は、明白であり、タンパク質Ｌ５とＳ１３との間の緊密な接近（ブリッジＢ１ｂ）のように、これらの電子密度は、融合して、単一のタンパク質−タンパク質サブユニット間ブリッジを形成する（以下を参照のこと）。
【００７２】
界面から見ると（図２Ｆ、２Ｇ）、より少ないタンパク質が、３０Ｓサブユニットおよび５０Ｓサブユニット上に見られ、そしてこれらは、周縁部に主に位置付けられ、リボゾームＲＮＡの表面を露出したままにする。これらの３つのｔＲＮＡは、３０Ｓサブユニット上で、ヘッドと、ボディと、プラットホームとの間のＲＮＡリッチグルーブにおいて結合した、これらのアンチコドン末端と並置される。残りの３つのｔＲＮＡの全て（これらのＤステム（ｓｔｅｍ）、エルボー（ｅｌｂｏｗ）およびアクセプターアーム（ａｃｃｅｐｔｏｒ ａｒｍ）を含む）は、５０Ｓサブユニットと相互作用する。ＡおよびＰのｔＲＮＡのアクセプターアームは、ペプチジルトランスフェラーゼキャビティへと下向きに示すが、Ｅ−ｔＲＮＡアクセプターアームは、Ｌ１リッジ（ｒｉｄｇｅ）の次の別々のクレフト（ｃｌｅｆｔ）へと向けられる。このｔＲＮＡ結合部位に隣接するものは、界面接触表面のように、ｒＲＮＡにより支配される。
【００７３】
（ｒＲＮＡの二次構造および三次構造）
リボゾームＲＮＡの構造は、２０年を超える本発明者らの調査の目的である。これらの二次構造（図３Ａ、３Ｂ）は、初めに、配列比較分析によって確立され（Ｗｏｅｓｅら、１９８０；Ｎｏｌｌｅｒら、１９８１ａ）、ここで、分子内塩基対合は、対合した塩基の系統発生的共変動の存在により実証され、現在、８０００を越える異なる生物およびオルガネラ由来の１６Ｓ様ｒＲＮＡ配列、および１０００を超える２３Ｓ様ｒＲＮＡ配列（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｎａ．ｉｃｍｂ．ｕｔｅｘａｓ．ｅｄｕ／）により支持されている。６０を超える系統発生的に予測された１６Ｓ ｒＲＮＡのへリックス要素が、この構造内に見られる。１６Ｓ ｒＲＮＡの個別のへリックス要素は、ｔＲＮＡの構造において初めに観察されたように、隣接するへリックスと同軸状にスタックし、合計２０のより長い、外見上連続したへリックスアームを形成する。
【００７４】
１６Ｓ ｒＲＮＡの二次構造は、４つの認識可能なドメイン（５’ドメイン、中央ドメイン、３’メジャードメインおよび３’マイナードメインと呼ばれる）に分類される（図３Ａ；Ｗｏｅｓｅら、１９８０；Ｇｕｔｅｌｌ、１９９４）。１６Ｓ ｒＲＮＡの三次元折り畳み（フォールド）の一般的な意味は、化学フットプリンティング（Ｎｏｌｌｅｒら、１９９０）およびクロスリンキング（Ｍｕｅｌｌｅｒら、１９９５）、ならびに免疫電子顕微鏡（Ｓｔｏｆｆｅｒ−Ｍｅｉｌｅｃｋｅら）のような生物物理学的アプローチ、および中性子散乱法（Ｃａｐｅｌら、１９８７）に基いて、初期のモデリング研究から生じた（Ｓｔｅｒｎ １９８８ａ；Ｂｒｉｍａｃｏｍｂｅら、１９８８）。異なる研究機関により推論されたモデル間で、詳細には、差異が存在したが、５’ドメインが、３０Ｓサブユニットのボディ、プラットホームの中央ドメイン、およびこの粒子のヘッドの３’メジャードメインに位置付けられるという、一般的な意見の一致があった（Ｎｏｌｌｅｒら、１９８１ａ）。単離されたリボゾームサブユニットの構造（Ｗｉｍｂｅｒｌｙら、２０００；Ｓｃｈｌｕｅｎｚｅｎら、２０００）において観察されるように、１６Ｓ ｒＲＮＡの二次構造ドメイン（図３Ａ）は、ほぼ構造的自主性がある三次元ドメインに実際に対応する（図３Ｃ）。５’ドメインは、ボディ、プラットホームの中央ドメイン（長い同軸性の６２０ステムによりボディの溶媒面に係留される）、３’メジャードメイン（サブユニットのヘッドおよびネック）、３’−マイナードメイン（最後から２番目のステムおよび隣接する３’−末端へリックス）を構成する。この構成は、即座に、これらのドメインが、タンパク質合成の間に互いに対して移動するように設計されていることを示唆する。特に、ヘッドと残りのサブユニットとの間の非常に最小限の相互作用は、転座の間のヘッドの提唱される移動と一致する（Ｓｅｒｄｙｕｋら、１９９２；Ｆｒａｎｋら、２０００）。これらの４つのドメインは、ｍＲＮＡとｔＲＮＡとのその機能的相互作用の部位の次の、サブユニットの幾何学的中心付近を覆い、このことは、さらに、ドメイン間の移動と生物学的機能の連関を示唆する。
【００７５】
２３Ｓ ｒＲＮＡの配列比較分析（Ｎｏｌｌｅｒら、１９８１ｂ；Ｇｕｔｅｌｌら、１９９３）から予想された、１３０を超える個別のへリックスが、そのＸ線結晶構造において見られ、これらは４０の同軸アームを形成する。Ｅ．ｃｏｌｉ二次構造（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｎａ．ｉｃｍｂ．ｕｔｅｘａｓ．ｅｄｕ／）に対して、２３Ｓ ｒＲＮＡの位置６５０の周りに挿入された予想されたＴｈｅｒｍｕｓ特異的へリックスについて、電子密度は見られなかった。２３Ｓ ｒＲＮＡおよび５Ｓ ｒＲＮＡは、共に、７つの二次構造ドメインを形成する（図３Ｂ）。３０Ｓサブユニットの設計と対照的に、２３Ｓ ｒＲＮＡのドメインは、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉの５０Ｓサブユニットについて初めに述べられたように（Ｂａｎら、２０００）、お互いに広範に絡み合い、５０Ｓサブユニットのボディを形成する、単一の大きな半球状のドメインを作成する（図３Ｄ）。ボディを突出する多数の分子ストークから、ドメインＩＩ、ドメインＩＶ、ドメインＶ、ドメインＶＩ由来のＲＮＡ要素が構成され、これらのいくつかは、伸長した同軸へリックスアームであり、そして、その他のものは、へリックスステムによりサブユニットのボディに繋がれたマッシュルーム様球状ＲＮＡドメインである。このストークのいくつかは、３０Ｓサブユニットとのブリッジを形成し、一方、他のものは、ｔＲＮＡおよび伸長因子と相互作用する；ストークは、５０Ｓサブユニットの動的要素であるようである。これらは、以下で議論するように、種々の機能的相互作用と関連する運動を受ける。
【００７６】
（７０Ｓリボソームと単離されたサブユニットのコンホメーション間の差異）
７０Ｓリボソームにおける１６Ｓ ｒＲＮＡのコンホメーションとＷｉｍｂｅｒｌｙら（Ｗｉｍｂｅｒｌｙら、２０００）によって報告された３０Ｓサブユニット構造のコンホメーションとの比較は、ｒｍｓｄ差異の不均一性分布を示す（図４Ａ、Ｂ）。リン原子の位置の平方自乗平均偏差を、以下のように、それぞれ、１６Ｓ ｒＲＮＡおよび２３Ｓ ｒＲＮＡの最小二乗近似を行った後に算出した。最初に、距離マトリクスを、各ＲＮＡの座標セットについて、独立して算出した。次いで、分子内距離の値が２つの比較分子の間でわずかに変動する２１４個の原子のセットを使用して、プログラムＭＩＤＡＳ（Ｔ．Ｅ．Ｆｅｒｒｉｎ，Ｃ．Ｃ．Ｈｕａｎｇ，Ｌ．Ｅ．Ｊａｒｖｉｓ，Ｒ．Ｌａｎｇｒｉｄｇｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｇｒａｐｈｉｃｓ ６，１３〜２７（１９８８））を使用する最小自乗フィットによって全体の分子をスーパーインポーズした。最も高いｒｍｓｄ値（＞１０Å）が、ボディーの左下のスパー（ｓｐｕｒ）領域（ＳＰ）について観察され；この差異は、結晶の接触によって説明され得る。ここで、スパーヘリックスは、Ｗｉｍｂｅｒｌｙらの構造において対称な関連サブユニットのＰ位に結合する。他の主要なコンホメーション差異（３．５Åと１０Åとの間のｒｍｓｄ）は、わずかな領域に局在化され、これらの領域としては、最後から二番目のステム（ＰＳ）、プラットホームの頂部およびサブユニットのヘッドが挙げられる。これら全ての特徴は、以下のように、５０Ｓサブユニットと相互作用し、このことにより、観察された差異が、サブユニットの会合の際に生じるコンホメーションの変化を含み得ることを示唆する。
【００７７】
Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ７０ＳリボソームおよびＨ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ ５０Ｓサブユニット（Ｂａｎら、２０００）における２３Ｓ ｒＲＮＡのコンホメーション間の差異が、図４Ｃおよび図４Ｄにまとめられている。５０Ｓ構造（黄色）において不規則化された（ｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ）２３Ｓ ｒＲＮＡの特徴は、いくつかの突出したストークエレメントを含み、これらのエレメントとしては、Ｌ１ ＲＮＡおよびＬ１１ ＲＮＡ、Ａ部位フィンガーおよび１９１５ステム−ループが挙げられる。これらのエレメントは、３０Ｓサブユニットとの相互作用および７０Ｓリボソーム複合体におけるｔＲＮＡとの相互作用によっておそらく安定化される。Ｔｈｅｒｍｕｓリボソームの本来の熱安定性は、低い程度の不規則性に寄与する。
【００７８】
Ｈａｌｏａｒｃｕｌａ ５０Ｓサブユニットの多数のさらなるコンホメーション差異が、見出される（図４Ｃ、Ｄ）。いくつかの差異は、細菌ＲＮＡおよび古細菌（ａｒｃｈａｅａｌ）ＲＮＡの対応する領域間の予測される系統学的構造変化によって説明される。ＲＮＡヘリックスおよび細菌構造に特有の他の特徴（図４Ｃ、Ｄ；シアン）、逆に、古細菌構造（白色）において固有に存在するものの例が存在する。これらの系統学的に変化する特徴は、サブユニットの底面および後面に位置づけられ、サブユニット界面および機能部位から離れている。
【００７９】
（ドメインＩＩＩのタンパク質Ｌ９および先端ステム）
主要なコンホメーション差異が、２３Ｓ ｒＲＮＡのドメインＩＩＩの先端ステム領域において見出され、この領域は、細菌ＲＮＡの１４９５位（図４Ｃ）および番号付けした古細菌の１５９７位に中心がある。Ｔｈｅｒｍｕｓリボソームにおいて、このヘリックス（ヘリックス５８）は、サブユニットの低位端（左に示し、ここで、タンパク質Ｌ２と相互作用する）に沿って折り畳む；Ｈａｌｏａｒｃｕｌａ ５０Ｓ構造においては、完全に異なる経路をとり（図４Ｅ）、１４７８位（Ｈａｌｏａｒｃｕｌａ ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉヌクレオチド１５８１）の周囲で急激に分岐して、サブユニットの界面にて、対向する方向に（右上方向および右方向に）折り畳み、先端ループを２３Ｓ ｒＲＮＡのヘリックス３４の次に配置する（これは、Ｔｈｅｒｍｕｓ７０Ｓリボソームにおける対応するループの位置から５０Åより遠く離れている）。
【００８０】
このコンホメーション差異が、系統学的変化に起因し得ないと考えられる理由がある。第一に、Ｔｈｅｒｍｕｓ構造内で相互作用する、１４９５ループの塩基およびＬ２のアミノ酸は保存され、そして、Ｈａｌｏａｒｃｕｌａ内で同一である。このことは、１４９５ループが、細菌リボソームおよび古細菌リボゾームにおいて完全に異なる相互作用をするという考えに一致する。このことは、ヘリックス５８が２つの構造のうちの１つに再配置されることを示唆する。ヘリックスが５０Ｓサブユニットおよび７０Ｓリボゾームにおいて異なるコンホメーションを有する、別の可能性は、Ｅ．ｃｏｌｉ ５０Ｓサブユニットのタンパク質Ｌ９からの直接的ヒドロキシル基プロービング（ｐｒｏｂｉｎｇ）の結果によって除外されるようである（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら、２０００）。これらの結果は、ヘリックス１０および７９の近傍、およびへリックス５４の１５８０位での内部ループ近傍にヘリックス５８のループを配置する（それらの全ては、Ｔｈｅｒｍｕｓ ７０Ｓ構造においてヘリックス５８の近傍にある）が、Ｈａｌｏａｒｃｕｌａ ５０Ｓ構造においてヘリックス５８の位置から離れる。同様の説明は、ヘリックス５８が古細菌５０Ｓサブユニット結晶構造内に再配置されることである。
【００８１】
これらの同じプロービング実験は、タンパク質Ｌ９（このタンパク質のリンカーヘリックスおよびＣ末端ドメインは、溶媒中で、５０Ｓサブユニットの左手側から離れて突出している）が、Ｔｈｅｒｍｕｓ構造中にそれ自体再配置させることを示唆する。較正研究（Ｊｏｓｅｐｈら、２０００）に従って、２３Ｓ ｒＲＮＡのヌクレオチド１６５、１４９５、１５８０、および２２２０における、Ｌ９の１０１位からの強力なヒドロキシル基の切断は、これらの標的の２５Åの範囲内に置き；代わりに、これらのヌクレオチド（これらは、サブユニットの左手側で一緒にクラスター形成する）は、Ｌ９の１０１位から７０Å〜８０Å離れている。この距離において、ヒドロキシル基の切断は、実質的に検出不可能である。本発明者らは、Ｌ９のＣ末端ドメインが、通常は、５０Ｓサブユニットの左手側のヘリックス１０、５４および７９の間に形成されたポケットの近傍に位置付けなければならず、しかも、結晶化条件下で、これは、隣接リボソームの１６Ｓ ｒＲＮＡ（図４Ｆ）と接触した結晶を形成するように再配置すると推測する。
【００８２】
（サブユニット間ブリッジの構造）
サブユニット間の接触は、最初に、Ｆｒａｎｋおよび共同研究者（Ｆｒａｎｋら、１９９５ａ）によるクリオＥＭ研究において、別個のブリッジとして可視化された。５．５Ａにおいて、サブユニット間接触に関与する、全ての分子成分が同定され得、これらは、２つのさらなるタンパク質含有ブリッジを含んだ。初期化学プロービング（Ｍｅｒｒｙｍａｎら、１９９９ａ；Ｍｅｒｒｙｍａｎら、１９９９ｂ）および改変−干渉（Ｈｅｒｒら、１９７９）研究から推測されるように、大部分のブリッジ接触は、図５Ａに要約されるように、ｒＲＮＡに関与する。図５Ｂは、この界面から観察される、それぞれの３０Ｓサブユニット結合部位のＡ−ｔＲＮＡ、Ｐ−ｔＲＮＡ、およびＥ−ｔＲＮＡのアンチコドンステム−ループとの３０Ｓブリッジ接触を示す。ＲＮＡ−ＲＮＡ対ＲＮＡ−タンパク質またはタンパク質−タンパク質の接触の分布は著しく；ＲＮＡ−ＲＮＡ接触（赤色）は、プラットホームおよび最後から二番目のステムの中心に位置し、ｔＲＮＡ結合部位に直接隣接している。対照的に、タンパク質（黄色）を含む接触は、末端に位置しており、機能的部位からより離れている。５０Ｓサブユニット側（図５Ｃ）では、ＲＮＡ−ＲＮＡ接触は、再び中心にあり、これは、ペプチジルトランスフェラーゼおよびＥ部位を界面キャビティから分離する界面壁の前面を横切る三角パッチを形成する。興味深いことに、ＲＮＡ−ＲＮＡ相互作用は、ドメインＩＩ（これは、大部分のブリッジＢ４を作製する）のヘリックス３４からの小さいＲＮＡ−ＲＮＡ接触を除いて、２３Ｓ ｒＲＮＡのドメインＩＶからのＲＮＡエレメントを排他的に含む（Ｃｕｌｖｅｒら、１９９９）。ブリッジ接触に関与する２３Ｓ ｒＲＮＡの唯一の他の部分は、ヘリックス３８（Ａ部位フィンガー）の先端であり、これは、ＲＮＡタンパク質ブリッジＢ１ａを形成する。５０Ｓサブユニットからの残りのブリッジ相互作用は、タンパク質Ｌ２、Ｌ５、Ｌ１４およびＬ１９によって作製される。
【００８３】
１２のサブユニット間ブリッジ（図５Ｂ、Ｃ）を形成する分子接触が、表ＩＩＩにまとめられている。複数の接触が、多数のブリッジについての電子密度マップにおいて観察され得、合計で３０より多い個別の相互作用を与える。ＲＮＡ−ＲＮＡ接触は、グルーブ−副溝相互作用によって支配されるが、主溝、ループおよび骨格接触もまた見出される。架橋タンパク質は、実質的に、認識のための全ての型のＲＮＡ特徴（主溝、副溝、骨格およびループエレメントを含む）を使用する。
【００８４】
ブリッジＢ１ａおよびＢ１ｂは、３０Ｓサブユニットのヘッドを５０Ｓサブユニットの頂部に結合する（これは、界面の直接上を交差し、そしてＡ−ｔＲＮＡおよびＰ−ｔＲＮＡ（図２Ｅ）に平行である）。Ｂ１ａ（これは、「Ａ部位フィンガー」と呼ばれる（Ｆｒａｎｋら、１９９５ａ））は、Ｈａｌｏａｒｃｕｌａ ５０Ｓサブユニット構造（Ｂａｎら、２０００）において、ほぼ不規則である。これは、５０Ｓサブユニットの中心突出の右側から３０Ｓサブユニットのヘッドの中央まで到達する、長いヘリックスＲＮＡアーム（２３Ｓ ｒＲＮＡのヘリックス３８）からなり、ここで、その頂端の８９０ループは、タンパク質Ｓ１３の９２位周囲の保存的塩基配列と接触する。ブリッジＢ１ｂは、サブユニット間の単独のタンパク質−タンパク質接触である。２３Ｓ ｒＲＮＡのヘリックス８４は、Ｐ−ｔＲＮＡの上の３０Ｓサブユニットのヘッドの方に部分的に到達し；残りの距離は、タンパク質Ｌ５によって架橋され、このブリッジは、Ｌ５の残基１３４〜１５３（Ｈａｌｏａｒｃｕｌａ ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉの１０９〜１２７位）によって形成される２０アミノ酸ループからのＳ１３のＮ末端テイルと接触し、これもまた、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ ５０Ｓ構造において不規則である。
【００８５】
ブリッジＢ２ａ、Ｂ３、Ｂ５およびＢ６（図５Ｂ、５Ｃ）の全ては、５０Ｓサブユニットと１６Ｓ ｒＲＮＡの最後から二番目のステム（ヘリックス４４）との間の相互作用および３０Ｓサブユニット界面の優位な構造成分を含む。図５Ｄは、これらの４つのブリッジを形成するＲＮＡエレメントの再配置を示している。頂部において、ブリッジＢ２ａは、２３Ｓ ｒＲＮＡのヘリックス６９の１９１４ループによって作製され、別の特徴は、Ｈａｌｏａｒｃｕｌａ ５０Ｓサブユニット構造において不規則である。これは、最初の一連の３つの連続した副溝−副溝相互作用における架橋実験（Ｍｉｔｃｈｅｌｌら、１９９２）から予測されるように、１４０８位周囲の１６Ｓ ｒＲＮＡのデコード部位と接触する。次のもの（Ｂ３）において、２３Ｓ ｒＲＮＡのヘリックス７１は、１４１８位周囲の、２つの連続した非正準Ａ−Ｇ対にて、最後から二番目のステムと接触する。ちょうどＢ３の下で、主溝接触は、２３Ｓ ｒＲＮＡのヘリックス６４の副溝によって作製され、続いて、ヘリックス６２との接触によって形成される第三の副溝−副溝相互作用（Ｂ６）によって作製される。ブリッジＢ６での最後から二番目のステムとのさらなる接触が、タンパク質Ｌ１９（図５Ｅ）によってなされる。Ｌ１４（これは、分子間β−シートを形成することによってＬ１９と相互作用する）は、１６Ｓ ｒＲＮＡのヘリックス１４の３４５ループの主溝側と接触して、ブリッジＢ８（図５Ｅ）を形成する。
【００８６】
２３ ｒＲＮＡのヘリックス６８および７１は、長く巨大な非正準同軸性アームを形成し、このアームは、５０Ｓサブユニットの界面壁の頂部に水平方向に沿って位置しており、前に言及したＢ３（図５Ｃ）に加えて、ブリッジＢ２ｂおよびＢ７ａの５０Ｓ成分を含有する。図５Ｆは、Ｂ２ｂおよびＢ７ａを形成する相互作用の複雑なセットがプラットホームの頂部から観察されることを示している。ブリッジＢ７ａについての電子密度により、Ａ７０２（これは、７０Ｓリボソームにおけるジエチルピロカルボネート修飾から強力に保護されている（Ｍｅｒｒｙｍａｎら、１９９９ｂ））が、２３Ｓ ｒＲＮＡのヘリックス６８のマイナーグルーブと「Ａ−マイナー」接触する（Ｂａｎら、２０００）ことを示唆する。これら２つの残存するタンパク質−ＲＮＡブリッジが、図５Ｇに示される。タンパク質Ｌ２は、ヘリックス２３および２４において１６Ｓ ｒＲＮＡ（Ｂ７ｂ）と２つの別個の接触を行い；Ｌ２はまた、タンパク質Ｓ６（図示せず）と非常に接近し、そして翻訳の間に、このタンパク質との過渡的な接触を行う。ブリッジＢ４は、以前に示したように（Ｃｕｌｖｅｒら、１９９９）、主に、２３Ｓ ｒＲＮＡのヘリックス３４のタンパク質Ｓ１５と７１５ループとの間の相互作用であり；７１５ループはまた、１６Ｓ ｒＲＮＡ（図５）のヘリックス２０との適度なＲＮＡ−ＲＮＡ接触を行う。
【００８７】
（表ＩＩＩ．サブユニット間ブリッジ）
【００８８】
【表３】

ブリッジは、図５Ｂおよび図５Ｃに示されるように、Ｂ１ａ、Ｂ１ｂなどと番号付けされる。ｒＲＮＡ接触は、３０Ｓサブユニットについて、１６Ｓ ｒＲＮＡに対してであり、そして５０Ｓサブユニットについて、２３Ｓ ｒＲＮＡに対してであり、図３Ａおよび図３Ｂに示されるように番号付けされた、近位ヘリックス（Ｈ４４など）の番号によって列挙される。ｒＲＮＡヌクレオチド番号は、Ｅ．ｃｏｌｉの番号付けに従う。分子接触は、以下のような括弧においてスコア付けされる：Ｍ、主溝；ｍ、マイナーグルーブ；Ｌ、ループ；Ｂ、骨格；Ｌｍは、ループのマイナーグルーブ側を参照し、ＬＢは、ループ骨格などを参照する）
（ｔＲＮＡ−リボソーム相互作用）
リボソームがその基質（ｔＲＮＡ）とどのように相互作用するかは、翻訳機構を理解するために最も重要である。コドンとアンチコドンとの間の塩基対合を介する、ｍＲＮＡとのそれらの周知の相互作用に加えて、ｔＲＮＡはまた、それ自体がリボソームと相互作用する。これらの相互作用は、ｔＲＮＡのリボソームとの結合を安定化するのを補助のみならず、アミノアシル−ｔＲＮＡ選択の精度を高める識別機構のような機能的プロセスに直接的に関与し、これは、修正した翻訳リーディングフレーム、リボソーム内部へのｔＲＮＡの転位移動、およびペプチド結合形成の触媒作用を維持する。従って、ｔＲＮＡとリボソームとの間の分子接触の知見は、これらのプロセスのための機構を解明するための構造的フレームワークを提供する。多数の初期研究によって予測されるように（Ｇｒｅｅｎら、１９９７に総説される）、ｔＲＮＡは、主に、リボソーム内のｒＲＮＡエレメントに取り囲まれており、このほとんどが、フットプリンティング、架橋および直接的ヒドロキシル基プロービング研究において同定された（Ｍｏａｚｅｄら、１９８６ｂ；Ｄｏｒｉｎｇら、１９９４；Ｍｏａｚｅｄら、１９８９ａ）。驚くべきことではないが、本発明者らは、リボソームが３つ全てのｔＲＮＡと、それらの構造の一般に保存的な部分にて接触し、その結果、全てのｔＲＮＡが正確に同じ様式で結合され得ることを見出した。
【００８９】
図６Ａは、それぞれのコドンに結合したＡ−ｔＲＮＡおよびＰ−ｔＲＮＡの電子密度を示し、図６Ｂは、７０Ｓリボソーム結晶において位置付けられるＡ−ｔＲＮＡ、Ｐ−ｔＲＮＡおよびＥ−ｔＲＮＡならびにｍＲＮＡの全体的な相対的ジオメトリーを示す。リボソームとのこれらの特異的接触は、これらがハイブリッド結合状態ではなく、むしろ「古典的」である（Ａ／Ａ、Ｐ／ＰおよびＥ／Ｅ）ことを示す（Ｍｏａｚｅｄら、１９８９ｂ）。３つ全てのｔＲＮＡは、類似の様式で２つのリボソームサブユニット間で共有され；それらのアンチコドンステム−ループは、３０Ｓサブユニットによって結合されており、そして残りのｔＲＮＡ−Ｄステムと接触し、エルボーおよびアクセプターアームが、５０Ｓサブユニットによって作製される。Ａ−ｔＲＮＡおよびＰ−ｔＲＮＡの面は、２６°の内角を形成し、Ｐ−ｔＲＮＡおよびＥ−ｔＲＮＡの面は、４６°の内角を形成する。Ａ−ｔＲＮＡおよびＰ−ｔＲＮＡのアンチコドンステム−ループの骨格間の最も近いアプローチは、約１０Åであり、驚くべきことに、この距離は、これら２つのｔＲＮＡがｍＲＮＡの隣接したコドンを読み取るという事実を考慮すると、非常に離れている。
【００９０】
２つのコドンの同時読み取りを、ＡコドンとＰコドンとの間の約４５°のｍＲＮＡ骨格におけるねじれによって達成する（図６Ｂ）。Ａ−ｔＲＮＡおよびＰ−ｔＲＮＡの骨格は、アクセプターステム（ａｃｃｅｐｔｏｒ ｓｔｅｍ）で最も近く、互いの５Å以内に近づく。エルボー（ｅｌｂｏｗ）において、Ａ−ｔＲＮＡの塩基Ｄ１６およびＰ−ｔＲＮＡの塩基Ｕ４７は、実際には、互いのＨ結合距離内にあるが、本発明者らは、このような相互作用が起こるという先行技術での証拠を知らない。Ａ−ｔＲＮＡおよびＰ−ｔＲＮＡのＣＣＡテイルは、予期されたように、５０Ｓサブユニットのペプチジルトランスフェラーゼ部位の３’末端で収束する。Ｐ−ｔＲＮＡおよびＥ−ｔＲＮＡのアンチコドンステム骨格の最も近い近接は、約６Åであり、Ａ−ｔＲＮＡおよびＰ−ｔＲＮＡについて見出される近接よりも有意に近い。しかし、Ｅ−ｔＲＮＡのエルボーおよびアクセプターアームは、回転して、Ｐ−ｔＲＮＡから著しく離れ、その結果、それらの個々の３’末端はほぼ５０Å離れる。３つのｔＲＮＡの対応位置間の距離は、トランスロケーションの間におけるｔＲＮＡの移動の大きさの尺度である。従って、ｔＲＮＡのアンチコドン末端は、３０ＳのＡ部位とＰ部位との間で約２８Å移動し、そしてＰ部位とＥ部位との間で２０Å移動する。ｔＲＮＡの面の回転が理由で、エルボーは、ＡからＰへ、ＰからＥへと移行するので、４０Åおよび５５Åのより広い距離を通して移動する。
【００９１】
以前に観察されたように、Ｐ−ｔＲＮＡのアンチコドンステム−ループ（ＡＳＬ）およびＰコドンは、３０Ｓサブユニットとの６セットの相互作用（ａ〜ｆ）によって位置付けられる（Ｃａｔｅら、１９９９）。これらの相互作用に関連する構造的特徴を、図６Ｃおよび６Ｄに示し、そして表ＩＶにまとめる。現在の解像度では、実際の原子の相互作用は解析されていない。しかし、公知のＲＮＡ立体化学を、ドッキングさせた（ｄｏｃｋｅｄ）高解像度構造と合わせると、例えば、ＲＮＡとの相互作用が糖−リン酸骨格または塩基を含むのか否かを強く束縛し、そして多くの場合において、関与する可能性が最も高い化学基の予測を可能にする。
【００９２】
【表４】

^１ａ．ｃ．、アンチコドン；ａｃｃ、アクセプター；Ｄ、ジヒドロウラシル；Ｔ、チミジン；ＲＮＡ接触は、以下によって示される：ｂｋ、骨格；ｂｓ、塩基；ｂｐ、塩基対。結果が結論に至らなかった場合には、記載を省略している。ｔＲＮＡ位置は、酵母のｔＲＮＡ^Ｐｈｅに従って番号付けられ、ｒＲＮＡ位置は、Ｅ．ｃｏｌｉに従って番号付けられる。
【００９３】
アンチコドンステム−ループの結合様式およびその接触は、３０Ｓ Ｐ部位に対するヘリックス６の結合について以前に観察されていたものと非常に類似する（Ｃａｒｔｅｒら、２０００）。６つすべての３０Ｓ Ｐ部位での相互作用は、１６Ｓ ｒＲＮＡとの直接的な接触を含み、このうちの２つ（ａおよびｄ）は、それぞれ、タンパク質Ｓ１３およびＳ９の伸長Ｃ末端テイルとの相互作用によって支持される。Ｓ１３の幾分系統発生的に変動するリジンリッチテイルは、Ｐ−ｔＲＮＡのホスフェート３６と相互作用する。対照的に、Ｓ９のテイルは正確に保存されており、そしてそのＣ末端アルギニン（これは、Ｐ−ｔＲＮＡのアンチコドンにおけるホスフェート３５と相互作用するようである）は、普遍的に保存されている。これらの同じホスフェートは、３０Ｓ Ｐ部位への結合のために重要であることが、ホスホロチオエート干渉実験において同定されている（Ｓｃｈｎｉｔｚｅｒら、１９９７）。リボソーム機能にｒＲＮＡを関連付けた最初の実験の１つは、１６Ｓ ｒＲＮＡ中の限定数のグアニンのケトキサール（ｋｅｔｈｏｘａｌ）改変が、３０ＳサブユニットへのＰ−ｔＲＮＡ結合の損失を引き起こしたという実証であった（Ｎｏｌｌｅｒら、１９７２）。Ｐ部位のｍＲＮＡ−ｔＲＮＡ複合体と相互作用する５つの１６Ｓ ｒＲＮＡ塩基（Ｇ９２６、２ｍＧ９６６、Ｇ１３３８、Ｇ１３３９およびＣ１４００）のうち、少なくとも４つはグアニンであり、この初期の知見を説明している。さらに、５つすべての塩基は、化学的フットプリンティングおよび改変干渉実験に基づいて、Ｐ部位と相互作用するとして同定された（Ｍｏａｚｅｄら、１９８６ｂ；Ａｈｓｅｎら、１９９５；Ｍｏａｚｅｄら、１９９０）。
【００９４】
さらに、相互作用のセットは、Ｐ部位のコドン−アンチコドン対形成を安定化するようである：ｔＲＮＡの３４位のアンチコドン骨格と相互作用する塩基Ｇ９６６、およびＰコドンの１位の骨格と相互作用するヌクレオチドＵ１４９８の骨格は、コドンおよびアンチコドンを一緒に締め付ける（ｃｌａｍｐ）ようである。Ｃ１４００は、ｔＲＮＡの塩基３４でのスタッキングによって、揺らぐ塩基対を安定化するようであり、これは、光化学架橋研究から、約２０年前にＯｆｅｎｇａｎｄおよび共同研究者らによって予測された配置である（Ｐｒｉｎｃｅら、１９８２）。重ねて、ｔＲＮＡフットプリンティング実験によって同定された多くの塩基（Ｍｏａｚｅｄら、１９８６ｂ；Ｍｏａｚｅｄら、１９９０）は、ｔＲＮＡと相互作用をなすことが見出されている；しかし、「クラスＩＩＩ」塩基を含むいくつか（Ｍｏａｚｅｄら、１９８７）は、間接的に（おそらく、ｔＲＮＡに誘導されるコンフォメーション変化によって）保護されている。２つのタンパク質（Ｓ９およびＳ１３）は、両方とも、それらの伸長した塩基性Ｃ末端テイルを介してＰ−ｔＲＮＡと相互作用し、それらは、それらがＲＮＡ−ＲＮＡ相互作用を支持する精巧なポリアミンとして機能することを示唆する様式で、アンチコドンステム−ループと相互作用する。
【００９５】
ブリッジＢ２ａを形成する２３Ｓ ｒＲＮＡのヘリックス６９の副溝は、Ｐ−ｔＲＮＡのＤステムの副溝と相互作用し（図６Ｅ；相互作用ｇ）、Ａ部位へと伸長して、このＡ部位において、その保存されたループは、Ａ−ｔＲＮＡのＤステムのほぼ同じ造作物と相互作用し（図６Ｋ；相互作用ｆ）、そして最後から２番目のステムの頂部とのＢ２ａブリッジ接触を形成する（図５Ｄ）。この相互作用の複合セットは、３０Ｓサブユニットによるヘリックス６９の１９１５ループ中の塩基の部分的保護（これは、ｔＲＮＡの結合に際して完成となる）を示した化学的フットプリンティング結果を説明する（Ｍｏａｚｅｄら、１９８９ａ）。そのエルボーにおいて、タンパク質Ｌ５のβヘアピンループ（５４〜６６位）は、Ｃ５６の副溝面でＰ−ｔＲＮＡのＴループと相互作用する（図６Ｅ；ｈ）。Ｐ−ｔＲＮＡのＣＣＡテイルは、基質アナログと複合体形成された古細菌（ａｒｃｈａｅａｌ）５０Ｓサブユニットに関する近年の高解像度構造において観察された（Ｎｉｓｓｅｎら、２０００）、２３Ｓ ｒＲＮＡ Ｐループとの予期されたＣ７４−Ｇ２２５２塩基対形成を可能にするように位置付けられる（Ｓａｍａｈａら、１９９５）。さらに、アクセプター末端は、アクセプターステムと２３Ｓ ｒＲＮＡ Ｐループのステムとの間の骨格−骨格接触（図６Ｅ；ｉ）、およびＣＣＡテイルとヌクレオチドＡ２６０２とＵ２５８５との間の相互作用によって位置付けられ、この両方が、大サブユニットのペプチジルトランスフェラーゼ機能に関与している（Ｍｏａｚｅｄら、１９８９ａ；Ｂａｒｔａ １９８４）。
【００９６】
近年、Ｈａｌｏａｒｃｕｌａ ５０Ｓサブユニットの原子解像構造が、化合物ＣＣｄＡｐ−ピューロマイシン（これは、ペプチジルトランスフェラーゼ反応の遷移状態アナログであると考えられる（Ｗｅｌｃｈ １９９５））との複合体において解析された（Ｎｉｓｓｅｎら、２０００）。この構造は、リボソームによるペプチド結合形成の触媒についての機構の提唱へと促した（Ｎｉｓｓｅｎら、２０００）。本発明者らは、７０Ｓリボソーム構造上において、ＣＣｄＡｐ−ピューロマイシンを含む５０Ｓサブユニット構造のペプチジルトランスフェラーゼ領域をドッキングさせた。これは、２３Ｓ ｒＲＮＡの周辺のエレメントを重ね合わせることによって導き出された。５．５Åの解像度で切り捨てられた電子密度マップを、脱アシル化ｔＲＮＡが本発明者らの構造においてＰ部位に結合するという事実を考慮に入れるために、ピューロマイシン部分を取り除いた後のＨａｌｏａｒｃｕｌａの５０Ｓサブユニット複合体について算出した。５．５Åの解像度において、Ｐ部位ｔＲＮＡの３’−ＣＣＡ末端付近におけるｒＲＮＡ骨格の大半のコンフォメーションは、２つの構造の間において、ほとんど識別可能な差異を示さない。わずかな明らかな差異は、Ｐループ、および２４５１位、２５０６位、２５８５位および２６０２位（これらは、協調的な様式で移動し得る）またはそれらの付近に位置付けられる。７０Ｓリボソーム複合体では、２３Ｓ ｒＲＮＡの付近の造作物と比較して、Ｐ−ｔＲＮＡの３’−ＣＣＡ末端の位置が、（おそらくアシル基の不在に起因して）遷移状態アナログの対応部分の位置とは異なるようである。Ｐ−ｔＲＮＡのＣＣＡ末端は、２つの構造において、結合ポケットと相対的に垂直移動を示す（図６Ｆ）。
【００９７】
２つの可能なモデルは、実験的な７０Ｓ電子密度マップ（図６Ｆ）と５０Ｓ構造から算出された５．５Åのマップ（図６Ｇ）との間で示された差異を説明し得る。１つのモデルでは、ＣＣＡ末端は、結合ポケットにおいてわずかに引き上げられ、これは、Ａ７６とＡ２４５１鎖との間の実験的マップにおいて示された密度ギャップ（ここでは、算出されたマップにおいては連続的な密度が示される）を説明する。第二のモデルは、ポケットにおけるＣ７４およびＣ７５のより深い配置を含み、これには、Ａ７６のＵ２５８５方向への回転が付随する。第二のモデルはまた、上記の密度ギャップと一致するが、７０Ｓリボソームの実験的電子密度においてＵ２５８５に隣接して出現する新たな密度をも説明する（図６Ｆ）。化学的保護実験により、Ｕ２５８５が、５０Ｓ Ｐ部位へのアシル化ｔＲＮＡまたは脱アシル化ｔＲＮＡのいずれかの結合によって強力に保護されるが、Ａ７６を欠失するｔＲＮＡと結合する場合には、脱保護されることが示されている（Ｍｏａｚｅｄら、１９８９ａ）。興味深いことに、Ｕ２５８５付近へのＡ７６の配置は、５０Ｓサブユニット構造から決定されたモデルのＣＣＡ末端の大きな再配置に関与するが、Ａ７６のリボース位置は、結合ポケットにおいてほとんど全くシフトしない可能性がある。
【００９８】
３０ＳサブユニットにおいてＡ−ｔＲＮＡアンチコドンループを取り囲むのは、化学的フットプリンティング研究によってＡ部位特異的な特徴としてもともと同定された、３つの普遍的に保存された塩基（Ｇ５３０、Ａ１４９２およびＡ１４９３）であり（Ｍｏａｚｅｄら、１９８６ｂ；Ｍｏａｚｅｄら、１９９０）、そして変異研究および生化学的研究によって、Ａ部位の結合に影響を及ぼすことが示されている（Ｐｏｗｅｒｓら、１９９０；Ｙｏｓｈｉｚａｗａら、１９９９）。３つすべての塩基は、３０Ｓ Ａ部位におけるコドン−アンチコドン相互作用の部位付近に位置付けられる（図６Ｈ、Ｉ；ａ、ｄ）。塩基Ａ１４９２および１４９３のｔＲＮＡに保護されたＮ１位置は、コドン−アンチコドン塩基対から離れて示され、そして３０ＳサブユニットＡ部位が空である場合に、１６Ｓ ｒＲＮＡ骨格によってそれらから分離される（Ｗｉｍｂｅｒｌｙら、２０００）。このことは、Ａ−ｔＲＮＡの不在下における７０Ｓリボソームの電子密度と一致する。アミノグリコシド抗生物質パロモマイシンの存在下において、ヌクレオチド１４９２および１４９３のコンフォメーションは、再配置することが見出されており（Ｃａｒｔｅｒら、２０００）、それらがまた、３０Ｓ Ａ部位へのｔＲＮＡの結合に応答して再配置され得るという可能性を高めている。７０Ｓリボソームに結合したＡ部位ｔＲＮＡの７Åフーリエ差分マップにおいて（図６Ｊ）、負の電子密度のパッチが、塩基１４９２〜１４９３の位置に見出される。これは、Ｃａｒｔｅｒら（Ｃａｒｔｅｒら、２０００）により示唆されたように、これらが、Ａ部位のコドン−アンチコドンヘリックスの副溝における第一塩基対および第二塩基対と相互作用するように再配置するという可能性に対する支持を与える。Ｇ５３０のＮ１位置はまた、Ａ−ｔＲＮＡ結合に際して保護され（Ｍｏａｚｅｄら、１９８６ｂ；Ｍｏａｚｅｄら、１９９０）、そしてこの塩基の変異は、優性の致死表現型およびＡ−ｔＲＮＡ結合の欠損を与える（Ｐｏｗｅｒｓら、１９９０）。Ｇ５３０はまた、第二塩基対および第三塩基対付近のコドン−アンチコドンヘリックスの副溝に位置付けられる。隆起した塩基Ｃ１０５４（ＵＧＡナンセンス変異を抑制することが示されている変異（Ｍｕｒｇｏｌａら、１９８８））は、Ａ−ｔＲＮＡアンチコドンループの頂端に向かって突出する（図６Ｉ；ｂ）。
【００９９】
タンパク質Ｓ１３のリジン１２０およびホスフェート９５５は両方とも、４１位の周りのｔＲＮＡ骨格と相互作用するに十分に近い（図６Ｈ、Ｉ；ｃ）。５０位の周りの普遍的なＰＮＳＡ配列を保有する、Ｓ１２の保存された突出部（ｌｏｂｅ）は、５３０ループとデコード部位の１４９２〜１４９３鎖との間の空間中に突出し（図６Ｈ；ｅ）、３０ＳサブユニットＡ部位の基底（ｆｌｏｏｒ）を完成させる。ヌクレオチド１４９２および１４９３における最後から２番目のステムの頂部ならびに９１０〜９１２位のスイッチヘリックス（Ｌｏｄｍｅｌｌら、１９９７）に向かい合う、基底の右手側における変異は、拘束性（高度に正確）な表現型を与える（Ｋｕｒｌａｎｄら、１９９０に概説されている）。これらの変異は、５３０ループと１４９２〜３鎖との間の空間を拡大する効果を有し得、ｔＲＮＡ−ｍＲＮＡ複合体と３０Ｓ Ａ部位との間の相互作用を緩める。
【０１００】
Ａ−ｔＲＮＡのエルボーは、そのＤループおよびＴループ（図６Ｋ；ｇ）のブリッジＢ１ａ（Ａ部位フィンガー；Ｈ３８）およびタンパク質Ｌ１６（Ｎｏｌｌｅｒら、１９９２）と相互作用する。タンパク質Ｌ１１、およびＡ−ｔＲＮＡと直接的には相互作用しないが２３Ｓ ｒＲＮＡの１０６７位（Ｈ４３；Ｒｙａｎら、１９９１）付近にあるその付随したＲＮＡは、そのＴループに近接し、そしてそれを、ｔＲＮＡまたは２３Ｓ ｒＲＮＡのいずれかの中程度の移動のみで、一過的に接触させ得る。タンパク質Ｌ１６からの電子密度または未だに同定されていないｒタンパク質は、部分的に、Ａ−ｔＲＮＡエルボーの位置を占め（図６Ｌ）、そしてそのため、おそらく「収容（ａｃｃｏｍｍｏｄａｔｉｏｎ）」工程の部分として、Ａ−ｔＲＮＡ結合に際して移動しなければならない（Ｐａｐｅら、１９９９）。２３Ｓ ｒＲＮＡのヘリックス８９は、Ａ−ｔＲＮＡのアクセプターアームとほぼ平行に走り、その頂部において、Ｔステムと副溝相互作用（ｈ）を作製し、そしてその底部において、非正準ヘリックス伸長（ｊ）の主溝にわたって存在するＣＣＡテイルの骨格と接触する。ＣＣＡテイルはまた、保存された１９４２ループ（これは、アクセプターステム（ｉ）の末端で、主溝中に差し込まれる）との接触によって、および、５０Ｓ結晶構造において観察された（Ｎｉｓｓｅｎら、２０００）、２３Ｓ ｒＲＮＡのＣ７５とＧ２５５３との間で以前に予期されていた塩基対（６３）によって、位置付けられる。
【０１０１】
Ｅ−ｔＲＮＡアンチコドンステム−ループは、３０Ｓサブユニットのヘッドとプラットホームとの間（ここでこれは、分子相互作用の高密度系によって取り囲まれる（図６Ｍ））に挟まれる。このことは、Ｅ−ｔＲＮＡの比較的弱い結合（Ｌｉｌｌら、１９８６）およびＥ−ｔＲＮＡ結合に起因し得る１６Ｓ ｒＲＮＡ中における塩基保護の明らかな不在（Ｍｏａｚｅｄら、１９８６ｂ；Ｍｏａｚｅｄら、１９９０）に照らして、幾分予想外であった。１６Ｓ ｒＲＮＡのヘリックス２８および２９は、その６９０ループおよび７９０ループと同様に、ＲＮＡ接触ａ〜ｅに寄与する（図６Ｎ）。タンパク質Ｓ７のＣ末端αヘリックスは、アンチコドンステムの骨格に対して充填するが、Ｓ７ βヘアピンは、Ｅ−ｔＲＮＡアンチコドンのワトソン−クリック面に位置付けられる（ｆ）。通常のコドン−アンチコドン相互作用は存在しないが、Ｅ−ｔＲＮＡアンチコドンの第二塩基とｍＲＮＡとの間には接触が存在し得る。Ｓ７に関してあり得る役割は、３０Ｓ Ｅ部位においてコドン−アンチコドン相互作用を破壊することであり得る。近年の研究によって、Ｓ７のβヘアピンまたはＣ末端ヘリックスのいずれかの欠失は、ＥＦ−Ｇ−依存性トランスロケーションの有効性および正確性に影響することが示されている（Ｋ．Ｆｒｅｄｒｉｃｋ、非公開）。
【０１０２】
タンパク質Ｌ１および２３Ｓ ｒＲＮＡ上のその結合領域（Ｈ７６〜７７）は、Ｅ−ｔＲＮＡのエルボーと相互作用する（接触ｇ〜ｉ）。Ｅ−ｔＲＮＡに保護された塩基Ｇ２１１２およびＧ２１１６は、ｔＲＮＡエルボーの頂部で三次（ｔｅｒｔｉａｒｙ）Ｇ１９〜Ｃ５６塩基対においてスタッキングし得る。アクセプターステムは、２３Ｓ ｒＲＮＡのヘリックス６８との副溝相互作用を作製する。この相互作用は、ＥＦ−Ｇ−依存性トランスロケーションに必須であることがＪｏｓｅｐｈおよび共同研究者らによって示された（Ｆｅｉｎｂｅｒｇら、２００１）リボース７１との骨格接触を含む。さらに、保存されたＡ１８５３は、２〜７１塩基対とのＡ−副（ｍｉｎｏｒ）相互作用を作製し得る。ＣＣＡテイルは、ペプチジルトランスフェラーゼ間隙（ｃｌｅｆｔ）から離れた５０Ｓサブユニットの深いポケットに埋められ、２３Ｓ ｒＲＮＡおよびタンパク質Ｌ３３のヘリックス１１、７４および７５、ならびにＥ−ｔＲＮＡ保護されたＣ２３９４との接触を作製する（Ｍｏａｚｅｄら、１９８９ａ）。
【０１０３】
（翻訳の機構への関連）
複雑なリボソームの構造は、分子レベルでのタンパク質合成の機構を理解するための基礎を提供する。分子機構として、リボソームは、その機能を可能にする可動部分を有さなければならない（Ｓｐｉｒｉｎ １９６９）。タンパク質合成のトランスロケーション工程は、ｔＲＮＡがＡ部位からＰ部位からＥ部位へと移動するので、ｔＲＮＡによる２０Å以上の移動を、必然的に必要とする。このような移動が、リボソームの対応する構造的な転移に合致しないことは、あり得ないようである（Ｗｉｌｓｏｎら、１９９８）。ｔＲＮＡが３０Ｓサブユニットおよび５０Ｓサブユニットとは独立して２工程で移動する、ハイブリッド状態モデルは、トランスロケーションの機構が３０Ｓサブユニットおよび５０Ｓサブユニット、またはこれら２つのサブユニットの特定の構造ドメインもしくは下部構造の相対的な移動を含み得るという意味を含む（Ｍｏａｚｅｄら、１９８９ｂ）。
【０１０４】
図７Ａは、７０Ｓリボソーム結晶中に位置する場合の、Ａ−ｔＲＮＡ、Ｐ−ｔＲＮＡおよびＥ−ｔＲＮＡ、ならびにｍＲＮＡの、全体の相対的ジオメトリを示す。リボソームとのこれらの特異的な接触は、これらがハイブリッド結合状態よりむしろそれらの「古典的な」状態（Ａ／Ａ、Ｐ／Ｐ、およびＥ／Ｅ）にあることを示す（Ｍｏａｚｅｄら、１９８９ｂ）。Ａ−ｔＲＮＡおよびＰ−ｔＲＮＡの平面は、２６°の内角（ｉｎｃｌｕｄｅｄ ａｎｇｌｅ）を形成し、そしてＰ−ｔＲＮＡおよびＥ−ｔＲＮＡの平面は、４６°の角度を形成する。隣接するＡコドンおよびＰコドンの同時の読み取りは、ＡコドンとＰコドンとの間の約４５°のｍＲＮＡ骨格におけるねじれによって、達成される（図７Ａ）。これら３つのｔＲＮＡの対応する位置間の距離は、トランスロケーションの間のｔＲＮＡの移動の程度の尺度である。従って、ｔＲＮＡのアンチコドン末端は、３０ＳのＡ部位とＰ部位との間で約２８Å移動し、そしてＰ部位とＥ部位との間で２０Å移動する。ｔＲＮＡの平面の回転に起因して、エルボは、ＡからＰからＥへと移行するにつれて、４０Åおよび５５Åのより大きな距離を通って移動する。
【０１０５】
本発明者らの、ハイブリッド状態モデル（Ｍｏａｚｅｄら、１９８９ｂ）の現在の理解を、図７Ｂに概略的に示す。過去十年間にわたるいくつかの実験室からの実験的証拠は、最小のモデルに対するいくらかの改変を導入した。第１に、上述の結晶学的証拠は、この機構における３０Ｓ Ｅ部位の関与を必要とする。第２に、ＥＦ−Ｔｕの放出に続く「収容」工程についての証拠（Ｐａｐｅら、１９９９）は、入ってくるアミノアシル−ｔＲＮＡのプルーフリーディングが、この工程の間に起こり得る可能性を提起する；恐らく、この収容プロセスは、ペプチジルトランスフェラーゼ活性の調節を包含し得、同種のアミノアシル−ｔＲＮＡのみを、ペプチド結合形成に関与させる。第３に、いくつかの方面の証拠（Ｇｒｅｅｎら、１９９８；Ｍ．ＲｏｄｎｉｎａおよびＳ．Ｊｏｓｅｐｈ，未発行）は、Ａ／Ａ状態からＡ／Ｐ状態、およびＰ／Ｐ状態からＰ／Ｅ状態への移動が、ペプチド結合形成を伴って、協調的にではなく連続的に起こることを、納得のいくように実証した。従って、ペプチジル−ｔＲＮＡがＡ／Ａ状態を占める別の状態が導入された（図７Ｂ）。
【０１０６】
ハイブリッド状態モデルの本質的な特徴（ｔＲＮＡが、２つのリボソームサブユニット（まず、５０Ｓサブユニットにおいて、次いで、（ｍＲＮＡの移動に関連する）３０Ｓサブユニットにおいて）とは独立して移動すること）を支持する広範な証拠が、現在までに蓄積された。Ａ／Ｐ状態およびＰ／Ｅ状態の直接的な構造の観察は、クリオＥＭ再構築において、直接的に観察された（Ａｇｒａｗａｌら、２０００）。Ａ／Ｔ状態（ここで、入ってくるアミノアシル−ｔＲＮＡは、依然としてＥＦ−Ｔｕに結合している）もまた、クリオＥＭ研究によって観察された（Ｓｔａｒｋら、１９９７ａ）。
【０１０７】
図７Ｃは、ハイブリッド状態のトランスロケーションサイクルの三次元解釈を示す。ここで、古典的な状態のｔＲＮＡの配向（Ａ／Ａ、Ｐ／ＰおよびＥ／Ｅ）は、本発明者らが結晶学的に直接観察した配向によって表される。Ａ／Ｐハイブリッド状態およびＰ／Ｅハイブリッド状態のｔＲＮＡの位置を、古典的な状態のｔＲＮＡで開始してモデリングし、これらのアンチコドン末端の位置を固定し、そしてこれらを剛体として回転させて、５０Ｓサブユニットのそれぞれのアクセプター末端にドッキングさせた。得られたモデルは、クリオＥＭによって実験的に観察された低分解能構造（Ａｇｒａｗａｌら、２０００）に近く類似する。Ａ／Ｔ ｔＲＮＡを、以下の２工程でモデリングした：第１に、ＥＦ−Ｇの構造（Ｃｚｗｏｒｋｏｗｓｋｉら、１９９４）を、フットプリンティングからの制限を使用して、７０Ｓリボソーム構造にドッキングさせ、そしてヒドロキシル基のプロービングを方向付けた。第２に、ＥＦ−Ｔｕ−ｔＲＮＡ−ＧＴＰの三成分複合体の構造（Ｎｉｓｓｅｎら、１９９５）を、それらの相同なＧドメインを利用して、ＥＦ−Ｇにドッキングさせた。この結果は再度、クリオＥＭによって決定された三成分複合体の位置（Ｓｔａｒｋら、１９９７ａ）とよく一致する。印象的な観察は、Ａ／Ｔ状態からＡ／Ａ状態になる際にアミノアシル−ｔＲＮＡのアクセプター末端が移動する距離が、７０Åのオーダー（およそｔＲＮＡ自身の全体的な寸法）であることである。
【０１０８】
ここまでは、移動に関する証拠の大部分は、主として、３０Ｓサブユニットに向いていた。中性子散乱実験（ここで、リボソームの回転運動の半径の変化が、トランスロケーション状態の前後間で観察された）は、小さなサブユニットのヘッドの運動を示唆した（Ｓｅｒｄｙｕｋら、１９９２）。１６Ｓ ｒＲＮＡの「切換えヘリックス」（ヘリックス２７）において変異を保有するリボソームのクリオＥＭの比較は、ラム形態と制限形態との間の、３０Ｓサブユニットのヘッド、ショルダー、プラットホーム、および最後から２番目のステムにおけるコンホメーションの差異を示す（Ｇａｂａｓｈｖｉｌｉら、２０００）。７０Ｓリボソームにおける１６Ｓ ｒＲＮＡのコンホメーションの、別の３０Ｓサブユニット（図３Ａ、Ｂ）のコンホメーションとの比較は、再度、小さなサブユニットのヘッド領域、プラットホーム領域、および最後から２番目のステム領域の移動度を示唆する差異を示す。最近のクリオＥＭ研究（Ａｇｒａｗａｌら、１９９９ｂ；Ｆｒａｎｋら、２０００）は、ＥＦＧ−ＧＴＰの結合の際の、３０Ｓサブユニット全体の約６°の回転を示す。
【０１０９】
ｔＲＮＡトランスロケーションがサブユニット界面における相対運動を包含し得るという、ハイブリッド状態の示唆は、生化学的および遺伝的実験による、ｔＲＮＡ−リボソーム相互作用に関与するヌクレオチドの多くが、サブユニット会合に関与するヌクレオチドに隣接するという観察によって、強化された（Ｍｅｒｒｙｍａｎら、１９９９ａ、ｂ）。結晶構造は、ｔＲＮＡ結合部位が界面の接触に近く接近しているという直接的な証拠を提供し、そしてさらに、ブリッジのいくつかが、ｔＲＮＡと直接相互作用することを示す。さらに、これらのｔＲＮＡ−ブリッジ相互作用のいくつかは、動的であるという証拠が存在する。
【０１１０】
７０Ｓの三次元リボソーム構造の知識は、ｔＲＮＡ移動の機構のための重要な手掛かりを提供する。トランスロケーションの機構が、３０Ｓサブユニットと５０Ｓサブユニットとの相対的な移動、またはこれら２つのサブユニットの特定の構造ドメインもしくは下部構造を包含するという、ハイブリッド状態モデルの観念（Ｍｏａｚｅｄら、１９８９ｂ）は、生化学的実験および遺伝的実験による、ｔＲＮＡ−リボソーム相互作用に関与するヌクレオチドの多くが、サブユニット会合に関与するヌクレオチドに隣接するという観察（Ｍｅｒｒｙｍａｎら、１９９９ａ；Ｍｅｒｒｙｍａｎら、１９９９ｂ）によって、強化される。実際に、結晶構造は、ｔＲＮＡが、サブユニット間のブリッジ（これらの少なくともいくつかは、リボソームの動的エレメントであると考えられる）に直接接触することを示す。例えば、高分解能の５０Ｓサブユニット構造において無秩序化される構造的エレメントのうちでも、ブリッジＢ１ａ、Ｂ１ｂおよびＢ２ａである。無秩序化は、少なくとも結晶において一般的な条件下で、独立した運動が可能であり、それでリボソーム動力学に関与する候補である、リボソームの特定の分子特徴を同定するという点で、有益である。図８は、界面の２つの反対の側から見た、サブユニット界面においてＡ−ｔＲＮＡおよびＰ−ｔＲＮＡを直接囲む特徴を示す。これら２つのｔＲＮＡは、頂部においてブリッジＢ１ｂとＢ１ｂとの間に挟まれており、そして底部においてＢ２ａに挟まれている。これらのブリッジの３つ全てに関するサブユニット間の接触は、５０Ｓ結晶構造において無秩序化しており（Ｂａｎら、２０００）、３つ全ての動的エレメントを示唆している。３０Ｓの側において（図８Ｂ）、ｔＲＮＡは、ヘッドと、最後から２番目のステムおよびプラットホームの頂部との間に挟まれており、これらの全ては、遊離３０Ｓサブユニットと７０Ｓリボソームとの間のコンホメーションの差異を示し（Ｙｕｓｕｐｏｖら、２００１）、再度、これらが翻訳の間に移動し得ることを示唆する。さらに、これらの潜在的に動的なエレメントの全てが、サブユニット界面を介して互いに相互作用するという事実は、これらのそれぞれの運動が調和している可能性を示す。従って、ブリッジＢ１ａおよびＢ１ｂの運動は、ヘッドの回転に結び付けられ、そしてブリッジＢ２ａの運動は、最後から２番目のステムおよびプラットホームの運動に結び付けられる。実際に、Ｅ．ｃｏｌｉリボソームのトランスロケーションの前後の状態の、低分解能のクリオＥＭ画像（Ａｇｒａｗａｌら、１９９９ｂ）は、このような調和した運動と一致する。
【０１１１】
トランスロケーションの機構に対する潜在的に重要な手掛かりは、ＦｅｉｎｂｅｒｇおよびＪｏｓｅｐｈ（Ｆｅｉｎｂｅｒｇら、２００１）によるｔＲＮＡ改変妨害研究から生じる。彼らの研究は、Ｐ−ｔＲＮＡの７１位における単一の２’−Ｏ−メチル基の導入が、ＥＦ−Ｇ依存性トランスロケーションを廃止することを示す。興味深いことに、リボソームとｔＲＮＡの７１位との間の単一の相互作用は、５０Ｓ Ｅ部位において起こり、このことは、メチル基の影響がＰ／Ｅ状態に対してでなければならないことを示す。この知見は、ＥＦ−Ｇ依存性トランスロケーションのためのハイブリッド状態形成の重要性を示した速度論的分析と一致する（Ｓｅｍｅｎｋｏｖら、２０００）。リボースの７１位のメチル化がトランスロケーションを阻害する機構は、間接的であるはずである。なぜなら、ＥＦ−Ｇの最も近い接近は、ＥＦ−Ｇの最も近い接近は、約７０Å離れており、そしてその触媒中心は、１００Åよりも離れているからである。１つの可能性は、この影響が、２３Ｓ ｒＲＮＡを介して媒介されることである。リボースの７１位は、２３Ｓ ｒＲＮＡのヘリックス６８に接触し、これは、５０Ｓサブユニットのサブユニット界面の表面の頂部を水平に横切って位置する、ドメインＩＶのラテラルアームの左端の遠くにあるからである（図８Ａ）。このラテラルアームは、この界面を横切るカノニカルヘリックスおよび非カノニカルヘリックスの、連続的に同軸状に積み重ねられた系である。その遠い右側の端部は、ＡループのステムとのＡ−マイナー相互作用を起こす、ヘアピン型ループで終結する。
【０１１２】
Ａループの基部における一本鎖ループは、次に、サルシン／リシンループの副溝と相互作用し、これは、ＥＦ−ＧのＧＴＰａｓｅ機能に直接的に関与した（Ｈａｕｓｎｅｒら、１９８７）。さらに、ヘリックス６９（これは、Ａ−ｔＲＮＡおよびＰ−ｔＲＮＡの両方と、それぞれのＤステムにおいて直接接触する）は、ドメインＩＶのラテラルアームの中央の、保存された非カノニカルヘリックスに接続される（図８Ａ）。これらの構造的手掛かりは、トランスロケーションの機構におけるリボソームＲＮＡの特異的エレメントの関与について、推定上の場合を提供する。
【０１１３】
５０Ｓサブユニット構造において無秩序化された構造的エレメントのうちでも、ブリッジＢ１ａ、Ｂ１ｂ、およびＢ２ａである。この無秩序化は、少なくとも結晶において一般的な条件下においては、独立した運動が可能であり、そしてリボソームの動力学に関与する候補である、リボソームの特定の分子特徴を同定する点で、有益である。Ｂ１ａおよびＢ１ｂは、５０Ｓサブユニットの中心隆起を、３０Ｓサブユニットのヘッドに接続し（図２Ｅ、５Ｂ、５Ｃ；表ＩＩＩ）、これは、上で議論されるように、リボソームの動力学に繰返し関与した、独立した構造ドメインである。２つのブリッジについての５０Ｓの接触は、ヘリックス３８の８９０ループ、およびタンパク質Ｌ５の１３４〜１５３ループであり、これらの両方は、５０Ｓサブユニット電子密度マップ（Ｂａｎら、２０００）において無秩序化しており、従って、可撓性である。ブリッジＢ１ａおよびＢ１ｂは、それぞれＡ−ｔＲＮＡおよびＰ−ｔＲＮＡの保存されたエルボ領域に接触し、これは、トランスロケーションの間に、最も大きな移動（約４０〜５０Å）を起こす。２３Ｓ ｒＲＮＡの、その８８２位／８９８位における保存された内部ループの周りの、ヘリックス３８は、Ａ−ｔＲＮＡのＤループおよびＴループと相互作用し、そしてタンパク質Ｌ５は、残基８０を中心とする保存されたβ−ヘアピンを介して、Ｐ−ｔＲＮＡのＴループと相互作用する。興味深いことに、Ｂ１ａおよびＢ１ｂはまた、上述のクリオＥＭ研究において観察された、ＥＦ−Ｇ依存性のサブユニット間回転によって、最も強く影響を受けるブリッジである（Ｆｒａｎｋら、２０００）。これらの接合部の近くで、５０Ｓサブユニットのボディを用いて、これら２つのブリッジは、５Ｓ ｒＲＮＡによってまたがれ、これは、何らかの様式で、これらの移動の調節を補助し得る。
【０１１４】
可撓性ブリッジエレメントの最も興味をそそるものは、中心に位置するＢ２ａであり、これは、２３Ｓ ｒＲＮＡのヘリックス６９の、普遍的に保存された１９１５ループと、１６Ｓ ｒＲＮＡの最後から２番目のステム（ヘリックス４４）の頂部との、デコード部位（コドン−アンチコドン相互作用が起こる位置）の基部における相互作用によって、形成される。ヘリックス６９ステム−ループはまた、Ａ−ｔＲＮＡおよびＰ−ｔＲＮＡと接触し、そのループは、１６Ｓ ｒＲＮＡの最後から２番目のステムおよびＡ−ｔＲＮＡのＤステムの副溝と同時に相互作用し、一方で、そのステムの副溝は、隣接するＰ−ｔＲＮＡのＤステムの副溝表面と接触する。５０Ｓサブユニット構造におけるヘリックス６９の無秩序化は、任意の直接的なスタッキング、または５０Ｓサブユニットとの他のパッキング相互作用の非存在、ならびに２３Ｓ ｒＲＮＡの残りの部分との、一本鎖ループのみによる接続、および２３Ｓ ｒＲＮＡのドメインＩＶの保存されたラテラルアーム（これは次に、ブリッジＢ２ｂ、Ｂ３およびＢ７ａを実施する；図５Ｃ）との接続によって、説明され得る。
【０１１５】
ラテラルアームの連続的な同軸状スタッキングは、ワトソン−クリックヘリックス６８および７１（ブリッジＢ２ｂおよび１３３）を、ヘリックス６９のすぐ下で、ヘリックス６９に対して直接的に平行に分離する、高度に保存された領域におけるヘリカルターンのほぼ全体を占める非カノニカルヘリックスを含む。界面におけるこの十字形の中心領域においては、ｔＲＮＡの運動が、ブリッジＢ２ａ、Ｂ２ｂおよびＢ３における界面接触の摂動に、および潜在的に、ラテラルアームの非カノニカルヘリックスセグメントのコンホメーション再配置に、どのように結び付けられ得るかを見ることは、困難ではない。トランスロケーション後状態において、方向付けられたヒドロキシルラジカルプロービングは、ヘリックス６９を、伸長因子ＥＦ−Ｇの機能的に動的なドメインＩＶの頂部の近くに位置付け（Ｗｉｌｓｏｎら、１９９８）、これは、ｔＲＮＡを模倣すると考えられ、そしてＥＦ−Ｇによって触媒されるｔＲＮＡの運動の機構に関与した（Ｎｉｓｓｅｎら、１９９５）。
【０１１６】
ヘリックス６９の１９１５ループと、Ａ部位ｔＲＮＡのＤステムの副溝との相互作用は、Ｈｉｒｓｃｈサプレッサ（Ｈｉｒｓｃｈ、１９７１）の作用の機構に関する可能な説明を示唆する。この機構は、最も困難なｔＲＮＡナンセンスサプレッサ変異の１つであり、トリプトファンｔＲＮＡのＤステムの２４位における、Ａ〜Ｇの変異からなる。Ａ２４は、Ｕ１１と塩基対合し、このＵ１１は、ほとんど常にピリミジンであり、この０２位は、Ｄステムの副溝に突出しており、ここで、これは１９１５ループの接触範囲内である。従って、Ｇ２４−Ｕ１１のウォッブル対の作製は、ピリミジン０２のアクセス可能性を、副溝の側から隠し得る。Ｄａｈｌｂｅｒｇおよび共同研究者らは、Ｃ１９１４の近くからＵへの変異が、ナンセンスサプレッサ表現型を与えることを発見した（Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒら、１９９５）。従って、この予測されないブリッジＢ２ａ−ｔＲＮＡの相互作用は、翻訳忠実度において重要な役割を果たし得る。
【０１１７】
リボソームの機能に関連する他のブリッジは、１６Ｓ ｒＲＮＡの最後から２番目のステム（ヘリックス４４）、スイッチヘリックス（ヘリックス２７）およびプラットホーム（ヘリックス２３および２４）を含む。これらの３つの特徴は、６つのクラスＩＩＩ部位のうちの５つを含み、それらの興味深い挙動は、初期の化学探索実験において同定された（Ｍｏａｚｅｄら、１９８７）。これらの塩基は、ｔＲＮＡ、５０Ｓサブユニットまたは特定の抗生物質によって全て独立して保護される。３つ全ての種のリガンドが独立してこれらの塩基を保護し得るという観察は、それらの保護が、塩基とリガンドとの間の直接接触よりもむしろリガンド誘導性のコンフォメーション変化によって引き起こされるはずであるという結論を導いた。実際に、構造的結果は、これらの塩基のいずれもが、５０Ｓサブユニット、ｔＲＮＡまたは抗生物質と直接接触しないことを示す（Ｃａｒｔｅｒら、２０００；Ｆｏｕｒａｒｙら、１９９６）。３つのクラスＩＩＩ部位（Ａ９０９、Ａ１４１３、Ｇ１４８７）は、スイッチヘリックスの内部ループと、最後から２番目のステムの副溝との間の接触表面に見出され、ここで、Ａ９０９は、非カノニカルＡ１４１３−Ｇ１４８７塩基対とのＡ−マイナー相互作用を生じる（Ｗｉｍｂｅｒｌｙら、２０００）。
【０１１８】
空の３０Ｓサブユニットにおける３つ全てのプリン塩基のＮ１位の反応性は、ｔＲＮＡ、５０Ｓサブユニットあるいはストレプトマイシンまたはネオマイシン関連抗生物質との相互作用が、このヘリックス内塩基−トリプレット相互作用の形成を誘導することを示す。サブユニット会合による保護は、ブリッジ相互作用Ｂ２ａおよびＢ３（これは、１４１３−１４８７対に直接隣接する）およびＢ２ｃ（スイッチヘリックスの９００ループを含む）によって説明され得る。ｔＲＮＡおよび抗生物質による保護は、最後から２番目のステムの頂部でのデコード部位へのＡ−ｔＲＮＡおよびＰ−ｔＲＮＡならびに薬物の結合と一致する。７９０ループにおける２つのクラスＩＩＩ塩基は、Ｐ−部位コドン−アンチコドン相互作用に続く、第１４９７位−第１４９８位でのデコード部位における１６Ｓ ｒＲＮＡ骨格とのそれらの相互作用によって保護される。これらの相互作用は、隣接ブリッジＢ２ｂにおける５０Ｓサブユニットとの１６Ｓ ｒＲＮＡのヘリックス２４の接触による、そしてＰ−ｔＲＮＡアンチコドンステムループにおける第７９０位−第７９１位とヌクレオチド３８−３９との間の骨格−骨格相互作用によるｔＲＮＡ結合の結果としての、サブユニット会合の際に安定化されるようである。第６のクラスＩＩＩ塩基は、サブユニットのネック（ヘリックス２８）にある、Ａ１３９４であり、ここで、水素結合が、Ａ１３９４のＮ１位とデコード部位ヌクレオチドＡ１５００の２’−ヒドロキシルとの間で形成される（Ｗｉｍｂｅｒｌｙら、２０００）。クラスＩＩＩのコンフォメーション変化の全体的な結果は、ｍＲＮＡが結合し、そしてＡ部位およびＰ部位のコドン−アンチコドン相互作用が生じるチャネル中の、デコード部位の塩基の全体的な密接化であるようであり、これは、ストレプトマイシンおよびアミノグリコシド抗生物質の誤コード化効果を説明するのを補助し得る。
【０１１９】
クラスＩＩＩコンフォメーション変化において具体化される１６Ｓ ｒＲＮＡの分子内移動は、２３Ｓ ｒＲＮＡの少なくとも１つの移動性エレメント、保存された１９１５ステム−ループ（ヘリックス６９）、およびドメインＩＶのラテラルアームの中間部の潜在的に移動性の非カノニカルヘリックスに関連され得、これらは、ブリッジＢ２ａ、Ｂ２ｂ、Ｂ２ｃおよびＢ３によって隣接される。ちょうど議論したように、これらの４つ全てのブリッジは、１６Ｓ ｒＲＮＡにおける５０Ｓ誘導性のコンフォメーション変化に関係し、これらの変化は、クラスＩＩＩ保護によって明らかにされる。３０Ｓサブユニットのデコード部位におけるｔＲＮＡとｍＲＮＡとの相互作用によって１６Ｓ ｒＲＮＡにおいてもまた誘導される、これらの同じコンフォメーション変化が、ブリッジ相互作用の同じセットを介して、２３Ｓ ｒＲＮＡのこの界面領域のコンフォーメーションに相反的に影響し得ることは、驚くことではない。これは、翻訳の機構についての興味深い示唆を有し得る。なぜなら、ドメインＩＶのラテラルアームは、２３Ｓ ｒＲＮＡの２６００ステム−ループ（ヘリックス９３）およびＡループ（ヘリックス９２）に対して直接密集し、これらの両方は、ペプチジルトランスフェラーゼ中心における相互作用に直接関与するからである（Ｎｉｓｓｅｎら、２０００；Ｍｏａｚｅｄら、１９８９ａ；Ｋｉｍら、１９９９；Ｍｏａｚｅｄら、１９９８）。さらに、ヘリックス９２の塩基での２５６３−４ループは、伸長因子ＥＦ−ＴｕおよびＥＦ−Ｇの活性に直接関与する、ヘリックス９５（サルシン−リシンループ）の塩基と直接相互作用する。最後に、ブリッジＢ７ａに隣接する、ドメインＩＶのラテラルアームの最も左側の末端は、ＥＦ−Ｇ依存性転位に重要であることが示された、Ｅ−ｔＲＮＡのアクセプター側と相互作用する（Ｆｅｉｎｂｅｒｇ，Ｊ．Ｓ．およびＪｏｓｅｐｈ，Ｓ．私信）。ここで、ｍＲＮＡおよびｔＲＮＡと複合体化したリボソームの完全な構造の知見は、翻訳の機構についてのこれらおよび他の特定の分子モデルを試験するための可能性を提供する。
【０１２０】
（実施例２−リボソームの導入を介するメッセンジャーＲＮＡの経路）
リボソーム中のｍＲＮＡの経路を、Ｘ線結晶学によって、初めてマップした。結合されたｔＲＮＡと、モデルｍＲＮＡフラグメントを含むかまたはｍＲＮＡを全く含まない、７０Ｓリボソーム複合体の結晶からの回析データ（Ｂｅｌｉｔｓｉｎａら、１９８１）を使用して、本発明者らは、結合されたｍＲＮＡのフーリエ差分マップを計算した。上記の７０Ｓ複合体中のそれらの各ｍＲＮＡに結合されたＡ部位およびＰ部位のコドンの位置と一緒に、本発明者らは、７Åの解像度で、リボソームを介するｍＲＮＡの完全な経路を記載し得た。ｍＲＮＡは、３０Ｓサブユニットのネック周辺を取り巻くチャネルを通って通り抜け、これは、以前のモデル（Ｆｒａｎｋら、１９９５ｂ；Ｓｈａｔｓｋｙら、１９９１）の一般的特徴を確認する。Ａ部位およびＰ部位に隣接するｍＲＮＡのシャインダルガノ領域および下流領域のリボソーム中の位置は、ｍＲＮＡの翻訳開始、フレームシフトおよび他の機能的相互作用に対する示唆を有する。予測されないことに、遺伝子３２のｍＲＮＡに基づくモデルｍＲＮＡは、高電子密度塊を形成し、これは、おそらく、ｍＲＮＡの分子内塩基対形成による小さいヘアピンループの形成から生じ、これは、Ａ部位に対するｔＲＮＡのアンチコドンループの結合を模倣するようである。最後に、結晶の４回回転軸の周辺のリボソームの配置は、１つのリボソームから次のリボソームへのｍＲＮＡの直接的な通り抜けを可能にし、これは、リボソームがどのようにポリソームに密集し、共有されるｍＲＮＡおよびｔＲＮＡを効率的に使用し得るかを示唆する。
【０１２１】
（実験）
（モデルｍＲＮＡ構築物）
モデルｍＲＮＡは、最初、ファージＴ４遺伝子３２ｍＲＮＡに基づいた。３つ全てのｍＲＮＡについて（図９）、シャインダルガノ対形成を増加して、１６Ｓ ｒＲＮＡとの８つの潜在的な塩基対を可能にし、そしてＧＧＣ配列を５’末端に付加して、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによる転写を容易にした。これらの研究において使用したｍＲＮＡサンプルを、固相合成（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ）によって作製し、そして結晶化における使用の前にゲル精製した。
【０１２２】
（結晶化、データ収集およびモデルの当てはめ）
Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ７０Ｓリボソームを調製し、そして精製したＥ．ｃｏｌｉイニシエーターｔＲＮＡ（Ｓｕｂｒｉｄｅｎ，Ｒｏｌｌｉｎｇｂａｙ，ＷＡ）およびＭＫ２７（配列番号５２）、ＭＦ３６（配列番号５１）またはＭＶ３６（配列番号５０）ｍＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）と共に、またはｍＲＮＡを伴わずに、以前に報告された同じ条件（Ｃａｔｅら、１９９９；Ｙｕｓｕｐｏｖら、２００１）を使用して、共結晶化した。回析データを、以前に記載されたように（Ｃａｔｅら、１９９９）、シンクロトロン放射を使用して収集し、そしてＳｃａｌｅｐａｃｋおよびＤｅｎｚｏ（Ｏｔｗｉｎｏｗｓｋｉ、１９９３）を使用して処理した。フーリエ差分マップを、測定されたネイティブ振幅（表Ｖ）およびＣＣＰ４スートのプログラム（１９９４）を使用して以前に計算された構造因子の位相（Ｃａｔｅら、１９９９；Ｙｕｓｕｐｏｖら、２００１）から計算した。ｍＲＮＡモデルを、Ｏ（Ｊｏｎｅｓら、１９９７）を使用して当てはめ、そして分子構造図を、Ｒｉｂｂｏｎｓ（Ｃａｒｓｏｎ、１９９７）を使用して与えた。
【０１２３】
（表Ｖ：結晶学的データ^ａ）
【０１２４】
【表５】

^ａリボソーム複合体の結晶を、モデルｍＲＮＡ ＭＫ２７、ＭＦ３６およびＭＶ３６（図１）を使用して、「方法」に記載されるように調製した。全てのデータを、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌａｗｒｅｎｃｅ Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙにて、ビーム線５．０．２にて収集した。
【０１２５】
^＊Ｒ_ｓｙｍ＝Σ｜Ｉ−＜Ｉ＞Ｉ｜ΣＩ。
【０１２６】
（結果）
モデルｍＲＮＡ ＭＦ３６は、ファージＴ４遺伝子３２ｍＲＮＡに基づいたが（図９）、そのシャインダルガノ配列の対形成の能力を、１６Ｓ ｒＲＮＡの３’テールに対してその相補性を伸長することによって、８塩基対にまで増加させた。ＭＶ３６（配列番号５０）およびＭＫ２７（配列番号５２）ｍＲＮＡについて、異なるコード領域および下流領域をまた導入した（図９）。Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ７０Ｓリボソーム、ｍＲＮＡフラグメント、および全長ｔＲＮＡまたはリボソームＰ部位に結合するアンチコドンステムループ（ＡＳＬ）のいずれかを含む複合体を、記載されるように（Ｃａｔｅら、１９９９；Ｙｕｓｕｐｏｖら、２００１）、共結晶化した。７０ＳリボソームおよびイニシエーターｔＲＮＡを含むが、ｍＲＮＡを欠く同様の共結晶（Ｂｅｌｉｔｓｉｎａら、１９８１）を、同じ条件下で調製した。データを、シンクロトロン放射を使用して収集し、そして以前に導かれた構造因子の位相（Ｃａｔｅら、１９９９；Ｙｕｓｕｐｏｖら、２００１）を使用して、フーリエ差分マップを計算した（表Ｖ）。
【０１２７】
図１０Ａは、２つの型のリボソーム構築物を含む結晶から収集したデータを使用して、ＭＫ２７ ｍＲＮＡフラグメント（配列番号５２）について計算した、７Åのフーリエ差分マップを示す。一方の構築物において、７０Ｓリボソームは、ＭＫ２７ ｍＲＮＡ（配列番号５２）およびイニシエーターｔＲＮＡと結合し；他方の構築物は、同じであったが、ｍＲＮＡは排除された。ｍＲＮＡ ２７マーおよび１６Ｓ ｒＲＮＡの３’末端についての偽原子モデル、ならびに、ＡコドンおよびＰコドンについて以前に決定されたモデル（Ｙｕｓｕｐｏｖら、２００１）を、この差分マップに重ねて示す。ＡコドンおよびＰコドンの位置は、このｍＲＮＡモデルの中心部分のレジスターに対する密接なチェックを提供し、一方、この差分マップの解像度は、それ自体で、約＋／−１ヌクレオチドの精度でｍＲＮＡの残りの当てはめを可能にする。
【０１２８】
電子密度の明確な円柱が、ｍＲＮＡの５’末端に観察され、その大きさは、予測された８塩基対のシャインダルガノヘリックスと良好に一致する。電子密度における約４ヌクレオチドのギャップが、Ｐコドンおよびその５’隣接ヌクレオチド（ｍＲＮＡ位置、−１〜＋３）の位置で観察される。これは、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ３０Ｓサブユニットについての高解像度構造において見出されたような（Ｗｉｍｂｅｒｌｙら、２０００）、ｍＲＮＡの非存在下で１６Ｓ ｒＲＮＡの３’テールの折り畳み戻りによって説明され得；リボソームのＰコドン位置への１６Ｓ ｒＲＮＡのテールの結合は、ｍＲＮＡ差分マップからのＰコドンの差し引きを生じる。さらなる小さいギャップが、ｍＲＮＡの−４位に見出され、これは、局所的な乱れに起因し得る。Ａコドンの位置は、Ａ−ｔＲＮＡがこれらの複合体中に存在しなくとも、Ａ−ｔＲＮＡの存在下で見出される位置に近い。その３’末端において、ＭＫ２７（配列番号５２）の差分密度は、このｍＲＡＮモデルの３’末端の予測された位置（＋１２位）と良好に一致して終結する。
【０１２９】
ＭＫ３６ ｍＲＮＡ（配列番号５０）の差分マップは、その３’テールおよびＡコドン領域を除いて、ＭＫ２７ ｍＲＮＡ（配列番号５２）のそれと類似し、ここでは、Ａ−ｔＲＮＡによって通常占められる位置と重複する密度の円柱（Ｃａｔｅら、１９９９；Ｏｇｌｅら、２００１；Ｙｕｓｕｐｏｖら、２００１）が、現れる（図１０Ｂ）。この予測されなかった特徴は、遺伝子３２ ｍＲＮＡ中の相補的配列の分子内塩基対形成（ＭＦ３６ ｍＲＮＡ（配列番号５１）の＋４位〜＋７位および＋１２位〜＋１５位（図９））によって説明され得る。この特徴は、ＭＫ−２７（配列番号５２）の差分マップ（図１０Ａ）には存在せず、ここでは、自己相補的配列は、ポリ（Ａ）に置換されている。テトラループ含有ヘリックス（１３）からモデル化された４つの塩基対ステムは、過剰差分密度中に収容され得る（図１０Ｂ）。この様式でモデル化されると、ＭＦ３６ ｍＲＮＡ（配列番号５１）の３’末端は、電子密度の最も強い部分の末端の近くで終結する（図１０Ｂ）。より弱い密度は、さらに約６ヌクレオチド伸長することが観察され得、これは、ＭＦ３６ ｍＲＮＡ（配列番号５１）の折り畳まれていない形態もまた存在することを示唆するが、これは、低い占有度である。この弱い密度は、約＋１７位まで延び、これは、そのｍＲＮＡ鎖の直ぐ３’側の末端（ヌクレオチド＋１８〜＋２１）が、折り畳まれていないｍＲＮＡ配座にて乱れていることを示す。ｍＲＮＡヘアピン特徴は、図１０Ｃに示されるように、Ａ−部位ｔＲＮＡのアンチコドンステムループ（ＡＳＬ）（Ｃａｔｅら、１９９９；Ｙｕｓｕｐｏｖら、２００１）の位置を占有する。これらの２つの構造の顕著な一致は、そのｍＲＮＡヘアピンが、Ａ−部位ＡＳＬを模倣するように設計され得、これがおそらく、遺伝子３２ ｍＲＮＡの翻訳の開始において役割を果たすことを示唆する。
【０１３０】
図１１Ａは、サブユニット境界から観察されるような、７０Ｓリボソームの完全３０Ｓリボソームサブユニットの状況下のｍＲＮＡの経路を示す。ｍＲＮＡは、上流および下流のトンネルを通過して、境界に接近し、ここで、約８ヌクレオチド（−１〜＋７）のみ（ＡコドンとＰコドンとの間の接合部を中心とする）が、露出される。リボソームが環状メッセージ上で翻訳を開始し得ることが、Ｂｒｅｔｓｃｈｅｒによって示されているので（Ｂｒｅｔｓｃｈｅｒ、１９６８）、翻訳開始中の３０ＳサブユニットへのｍＲＮＡの結合は、一方または両方のトンネル（これらは、非共有結合的に閉じている）を開けることを必要とし、これは、上流のリーダーの長さに依存する。ヘッドとボディとの間の接触点は、潜在的な「ラッチ」として記載され、この閉鎖が、前進性を保証し、方向性を提供し、そして解離を妨げる、形状を提供する（Ｓｃｈｌｕｅｎｚｅｎら、２０００）。ｍＲＮＡとのリボソーム接触の境界（−１５〜＋１６）は、Ｓｔｅｉｔｚ（Ｓｔｅｉｔｚ、１９６９）によって予測された境界（−１６〜＋１６）の実験誤差内である。メッセージを取り囲む１６Ｓ ｒＲＮＡの構造の特徴は、部位特異的架橋結果（Ｂｈａｎｇｕら、１９９４；ＢｈａｎｇｕおよびＷｏｌｌｅｎｚｉｅｎ、１９９２；Ｂｒｉｍａｃｏｍｂｅ、１９９５；Ｄｏｋｕｄｏｖｓｋａｙａら、１９９３；Ｄｏｎｔｓｏｖａら、１９９２；Ｇｒｅｕｅｒら、１９９９；Ｊｕｚｕｍｉｅｎｅら、１９９５；Ｒｉｎｋｅ−Ａｐｐｅｌら、１９９３；Ｒｉｎｋｅ−Ａｐｐｅｌら、１９９４；Ｓｅｒｇｉｅｖら、１９９７）の１つ（１６Ｓ ｒＲＮＡ １３６０位とｍＲＮＡ −１位〜８位との間の６０Å）以外の全てと、良好に一致する（８〜２８ÅのＰ−Ｐ距離）。
【０１３１】
ｍＲＮＡの５’末端は、プラットホームの後ろで始まり（図１１Ｂ）、ここでこのｍＲＮＡは、ヘッドとプラットホームとの間の溝に入り、サブユニットのネックの周りに巻きつき、そしてこのヘッドとショルダーとの間の反対側から出る。ｍＲＮＡのリボソーム結合部分は、約３０のヌクレオチドを含み、約−１５位から＋１５位まで伸び、このネックの周りで最も密に巻かれた領域は、約−３位から＋１０位まで伸び、ＡコドンとＰコドンとの間の接合部で中心に集まる。ｍＲＮＡの直接隣接する分子環境は、その結合部位の末端、上流のシャイン−ダルガーノ相互作用の上流の周辺、および＋１２位周辺の下流領域中、ならびにＡコドン中（ここでＡコドンはリボソームタンパク質に近接している）を除いて、主に１６Ｓ ｒＲＮＡ（配列番号４５）を含む（図１１Ａ）。
【０１３２】
（上流の相互作用）
シャイン−ダルガーノへリックスは、サブユニットのプラットホームの後ろとヘッドとの間の大きな間隙中に嵌る（図１２Ａ）。溶媒側面図において、このシャイン−ダルガーノ間隙は、下のへリックス２０、左側の、７２３隆起ループ、およびタンパク質Ｓ１１（配列番号３４）およびタンパク質Ｓ１８（配列番号４１）、ならびに右側のネックへリックス（へリックス２８）およびネックへリックス３７により形成される。タンパク質Ｓ１８（配列番号４１）（これは塩基性側鎖および芳香族側鎖に富む）のＮ末端は、ｍＲＮＡの５’末端（−１５位）において、シャイン−ダルガーノへリックスの主溝に指向される。シャイン−ダルガーノへリックスの上流末端の下の外部密度は、Ｓ１８（配列番号４１）のＮ末端の１５アミノ酸に由来し得、これらのアミノ酸は、３０Ｓサブユニットの高分解構造において無秩序であった（Ｗｉｍｂｅｒｌｙら、２０００）。Ｓ１１（配列番号３４）（これはＡｒｇ ５４を含む）のＮ末端テイルおよびループの両方は、シャイン−ダルガーノへリックスと特異的に相互作用するのに十分に接近している。このシャイン−ダルガーノへリックスの下流末端において、タンパク質Ｓ１１（配列番号３４）のＣ末端テイルは、−４位〜−６位の周りのｍＲＮＡの骨格と相互作用する。
【０１３３】
シャイン−ダルガーノへリックスのすぐ下流において、ｍＲＮＡの５’リーダー（−１位〜−４位）は、このサブユニットのヘッドとプラットホームとの間の短いトンネルを通って界面側まで通過し、この界面側で、この５’リーダーは、タンパク質Ｓ７（配列番号３０）のβヘアピンの先端、６９０ループの尖部、７９０ループの副溝側、１５０５位の周りのへリックス４５の塩基、およびへリックス２８の９２５領域により取り囲まれる。ｍＲＮＡのこの領域は、Ｅコドン（−１位〜−３位）を含み、この界面へのこのＥコドンの完全な接近は、このトンネルにおけるこのＥコドンの位置により妨げられる。
【０１３４】
（ＰコドンおよびＡコドン）
−１位の周りのｍＲＮＡにおける鋭いターンの後ろに、ＰコドンおよびＡコドンが、Ａ−ｔＲＮＡアンチコドンおよびＰ−ｔＲＮＡアンチコドンの同時対形成を可能にする、その隣接するコドンの間の約４５°のねじれを有する間隙の界面の中央において、このＰコドンおよびＡコドンのそれぞれのｔＲＮＡに対して示される。これら２つのコドンは、１６Ｓ ｒＲＮＡ（配列番号４５）の最後から二番目のステムの軸の上で中心に集まり、ここでこれらのコドンは、１６Ｓ ｒＲＮＡ（配列番号４５）の１４００鎖および１５００鎖により形成される非正準ヘリックス構造（しばしば、デコード部位と称される）の主溝を占める（図１２Ｂ）。上記のように、Ｐコドンは、１６Ｓ ｒＲＮＡ（配列番号４５）の折り畳まれたテイルについて記載された経路と非常に類似した経路に従い、これは、３０Ｓサブユニットの高分解結晶構造におけるｍＲＮＡのこの領域を模倣するようである（Ｗｉｍｂｅｒｌｙら、２０００）。
【０１３５】
従って、リボソームとＰコドンとの間の相互作用のいくつかの細部は、３０Ｓ構造から推測され得る。興味深いことに、Ｇ９２６のＮ１位（これはＰ−ｔＲＮＡ結合によりケトキサール（ｋｅｔｈｏｘａｌ）から保護される）は、ｍＲＮＡの非存在下においてでさえ（Ｍｏａｚｅｄら、１９９０；Ｍｏａｚｅｄら、１９８６ｂ）、Ｐコドンのヌクレオチド＋１のホスフェートと相互作用するように位置する。観察されたｔＲＮＡ依存性の保護は、ｔＲＮＡ結合に応答したｍＲＮＡ鎖（または、ｍＲＮＡの非存在下において、１６Ｓテイル）の再配置に起因し得る。なぜなら、ｍＲＮＡの骨格は、このｍＲＮＡの−１位付近で、１６Ｓ ｒＲＮＡの３’テイルの経路から分岐し始めるからである。改変−干渉研究によっても、３０Ｓ Ｐ部位に対するｔＲＮＡ^ＰｈｅのｍＲＮＡ依存性結合におけるＧ９２６の重要性が示された（ｖｏｎ ＡｈｓｅｎおよびＮｏｌｌｅｒ、１９９５）；３’テイルはＰｈｅコドンを含まないので、この結果は、９２６相互作用により安定化される、１６Ｓ ｒＲＮＡテイルによる見かけのｍＲＮＡの模倣が、３０Ｓ Ｐ部位の活性なコンフォメーションの誘発において重要であり得ることを示唆し、そして開始ｔＲＮＡが、翻訳開始の間にｍＲＮＡの３０Ｓサブユニットに独立して結合し得るという事実を説明するのに役立つ（Ｇｕａｌｅｒｚｉら、１９７７）。
【０１３６】
１６Ｓ ｒＲＮＡの１５００鎖は、ｍＲＮＡ鎖に対して直角に横切り、ここでヌクレオチド１４９８は、Ｐコドンのヌクレオチド＋１のすぐ下に存在する（図１２Ｂ）。高分解構造（Ｗｉｍｂｅｒｌｙら、２０００）において、ヌクレオチド１４９８のホスフェートは、リボース＋１に密集し、そしてその塩基（Ｅ．ｃｏｌｉにおけるｍ ^３Ｕ １４９８）は、リボース＋２に密集する。これらの相互作用は、Ａ７９０のＮ６アミノ基および広範に保存されたＧ７９１のＮ１と、ヌクレオチド１４９８の非架橋ホスフェート酸素との相互作用により明らかに安定化される。Ａ７９０とＧ７９１の両方は、以前に「クラスＩＩＩ」塩基として同定されており（Ｍｏａｚｅｄら、１９８７）、これらのＮ１位における化学的プローブによる攻撃からの保護は、１６Ｓ ｒＲＮＡ（配列番号４５）におけるコンフォメーションの変化から生じると予想された。なぜなら、同じ保護が、Ｐ−ｔＲＮＡ、５０Ｓサブユニットまたは特定の抗生物質により得られたからである。これらのクラスＩＩＩ保護は、現在、Ｐ−ｒＲＮＡまたは他のリガンドの結合に応答する、最後から二番目のステムへ向かう７９０ステムループ（へリックス２４）の移動（この移動は同時に、７９０ループの骨格とＰ−ｔＲＮＡのアンチコドンステムの底部との相互作用、およびＰコドンに対するヌクレオチド１４９８の密集を生じる）により説明され得る。このような移動は、３０Ｓサブユニットのプラットホームが５０Ｓサブユニットに結合する場合（クリオＥＭ研究において観察される）、この３０Ｓサブユニットのプラットホームの反時計回りの回転と一致する（Ｌａｔａら、１９９６）。
【０１３７】
ＰコドンとＡコドンとの間の接合部において、ｍＲＮＡは、ヌクレオチド１４０１のホスフェート（これはこの経路内に直接存在する）によって、そのＡ−ＲＮＡ様軌道の継続をブロックされる（図１２Ｂ）。このことは、ｍＲＮＡを再指向し、ＡコドンとＰコドンとの間のｍＲＮＡ中の観察されたねじれを生じる。
【０１３８】
Ａ部位において、塩基のＧ５３０、Ａ１４９２およびＡ１４９３は、Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎおよび共同研究者らにより最近示されたように、Ａ部位のｔＲＮＡ選択に可能な識別メカニズムにおいて、Ａ部位コドン−アンチコドンへリックスの副溝と密接に相互作用する（Ｏｇｌｅら、２００１）。さらなる相互作用は、４８〜５１位の保存されたＰＮＳＡ配列（これはリボース＋５および＋６の下に直接存在する）の周りのタンパク質Ｓ１２（配列番号３５）のβヘアピンループにより生じる（Ｏｇｌｅら、２００１）。このＳ１２（配列番号３５）の部分は、制限的な（非常に正確な）表現型を与える変異の大部分を含む。
【０１３９】
（下流の相互作用）
Ａコドンのすぐ下流で、ｍＲＮＡは、サブユニットのヘッドとショルダーとの間の第２のトンネル（直径約２０Å）を通過して、クリオＥＭ再構築において最初に観察された、３０Ｓサブユニットの溶媒側に至る（Ｆｒａｎｋら、１９９５ｂ）。ｍＲＮＡの周りにおけるこのトンネルの終結は、最初に、ｍＲＮＡの移動の前進性および方向性を保証することが示唆された（Ｓｃｈｌｕｅｎｚｅｎら、２０００）。界面側から、このｍＲＮＡ（約＋７〜＋１０位）は、ＲＮＡの層を通過し、ここでこのｍＲＮＡは、上のへリックス３４、右側のヌクレオチド１３９７（へリックス２８）におけるネックの塩基、下の５’ヘアピンループ（１６Ｓ ｒＲＮＡ（配列番号４５）のヌクレオチド１６）、および左側の５３０ループにより取り囲まれる（図１３Ａ）。ＲＮＡ層において、塩基のＣ１３９７およびＵ１１９６（Ｗｉｍｂｅｒｌｙら、２０００）は、それぞれ、＋７位および＋９位の周りでｍＲＮＡに向かって方向付けられ、そしてＡコドンからすぐ下流にｍＲＮＡを位置決めするのを助け得る。
【０１４０】
最後に、ｍＲＮＡ（約＋１１〜＋１５位）は、タンパク質の層を通過して、サブユニットの後ろの溶媒に至る。溶媒側から見ると（図１３Ｂ）、このｍＲＮＡは、上のタンパク質Ｓ３（配列番号２６）、右側のＳ４（配列番号２７）および左下のＳ５（配列番号２８）により取り囲まれる。これら３つのタンパク質は、塩基側鎖（Ｓ３（配列番号２６）由来のＡｒｇ１３１、Ａｒｇ１３２、Ｌｙｓ１３５およびＡｒｇ１６４、Ｓ４由来のＡｒｇ４７、Ａｒｇ４９およびＡｒｇ５０、ならびにＳ５（配列番号２８）由来のＡｒｇ１５およびＡｒｇ２４を含む）の高密度のアレイを下流のトンネルに突出させ、これらは、その骨格ホスフェートとの相互作用を介してｍＲＮＡの下流領域を位置決めするようである。
【０１４１】
（ｍＲＮＡへリックス、シュードノット（ｐｓｅｕｄｏｋｎｏｔ）およびフレームシフト）
全てのｍＲＮＡ鎖は、ヘアピンおよび他の分子内塩基対形成構造を形成する能力を有するが、コドンは、一本鎖形態で読みとられなければならない。従って、リボソームは、現在のところ未知のある機構によって、ｍＲＮＡの二次構造を解き得る。ｍＲＮＡヘアピンは、図１３Ｂに示される視点から、３０Ｓサブユニットの後ろのリボソーム表面に接近する。ＲＮＡへリックスは、狭い下流トンネルを通過するには大きすぎるため、ｍＲＮＡ構造の巻き戻しは、＋１３位〜＋１５位の周りで、トンネルの入口かまたは入口付近において生じるようである。λ ｃｒｏ ｍＲＮＡの下流（＋１１〜＋１７、＋２５〜＋３１）のヘアピンの巻き戻しは、開始ｔＲＮＡの結合に依存して、下流トンネルを通るそのスレッディングから生じ得る（Ｂａｌａｋｉｎら、１９９０）。
【０１４２】
ｍＲＮＡヘリカーゼに可能な機構の基礎は、タンパク質Ｓ４（配列番号２７）およびＳ５（配列番号２８）が３０Ｓサブユニットのボディに組み込まれているのに対し、Ｓ３（配列番号２６）がヘッドの一部であるという事実により示唆される。入りヘリックスの一方の鎖がＳ４（配列番号２７）および／またはＳ５（配列番号２８）に結合し、他方の鎖がＳ３（配列番号２６）に結合する場合、転位の間に生じると考えられるヘッドの回転運動（Ａｇｒａｗａｌら、１９９９ｂ）は、一度に約３つの塩基対（すなわち、１コドン）の速度で、へリックスの物理的破壊を生じ得、同時にリボソームを通してｍＲＮＡを前進させる。
【０１４３】
興味深いことに、下流のトンネルの入口点の付近のｍＲＮＡと面するタンパク質Ｓ５（配列番号２８）の部分は、二本鎖ＲＮＡ結合ドメイン（ｄｓＲＢＤ）と同じ三次元折り畳みを有する（Ｂｒｕｎｇｅｒら、１９９８）。しかし、このｄｓＲＢＤコンセンサスに対するその比較的低い配列相同性は、少なくともＸｅｎｏｐｕｓ Ｘｌｒｂｐａタンパク質およびｄｓＲＮＡを含む複合体について観察された様式において、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）へのその強力な結合に対する支持を提供しない（Ｂｒｕｎｇｅｒら、１９９８）。
【０１４４】
翻訳を混乱させることが示された１つのタイプの構造は、ｍＲＮＡシュードノットである。特定の下流のシュードノットは、「シフト性（ｓｈｉｆｔｙ）」配列がデコード部位に位置する場合、翻訳リーディングフレームを−１シフト促進する（多くのウイルスによる翻訳調節のために利用される機構）という知見が、最も十分に裏付けられる（Ａｌａｍら、１９９９；Ｂｒｉｅｒｌｅｙら、１９８９）。このシュードノットに最適な位置は、＋１１位と＋１５位との間にあり、これは、提案されたｍＲＮＡヘリカーゼの位置でｍＲＮＡが下流のトンネル（＋１３〜＋１５）に入る領域と密接に対応する。フレームシフト事象についての簡単な説明は、このシュードノットの構造がヘリカーゼの形状とそれほど一致せず、下流のトンネルへのｍＲＮＡの侵入をブロックするということである。ＥＦ−Ｇ触媒型転位の際、ｍＲＮＡの順方向の移動が遅らされ、ｍＲＮＡの跳ね返りおよび−１リーディングフレームへの有利なずれを生じる。
【０１４５】
（結晶格子におけるｒｎＲＮＡの経路）
本発明者らの結晶において、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ７０Ｓリボソームは、Ｉ４２２正方空間群に密集し（Ｃａｔｅら、１９９９）、ここで隣接するリボソームは、４重軸の周りで中心に集まるテトラマーの層において対称的に構築される。図１４は、この結晶格子における４重軸の周りのリボソームの配置を示す。この配置の目立った特徴は、この配置が、１つの７０Ｓモノマー中のｍＲＮＡの３’末端と隣接する７０ＳモノマーのｍＲＮＡの５’末端とを隣接して配置することであり、原則的に、テトラマー中の４つ全てのリボソームを通る単一の連続したｍＲＮＡのスレッディングの指向を可能にする。
【０１４６】
結晶の密集は、リボソームがインビボで、ポリソーム中で互いに相互作用する様式の１つを示し得る。興味深い結果は、１つのリボソームのＥ部位がその隣接するリボソームのＡ部位に直接隣接していることであり、その結果、１つのリボソームから出てくるｔＲＮＡは、そのシンセターゼによる供給の後、隣のリボソームに入るように直ちに配置される。従って、事実上、所定のｔＲＮＡは、ポリソームを通してその固有のコドンに従う。
【０１４７】
（結論）
本発明者らの７つの異なるマップは、リボソームを通るｍＲＮＡの経路を明確に示し、そしてこのｍＲＮＡの長さに沿った各々の位置を取りまくリボソームの分子の特徴を同定する。Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ７０Ｓリボソームを通る、ｍＲＮＡにより取られる経路は、全ての細菌リボソームおよび古細菌（ａｒｃｈａｅａｌ）リボソームに一般化され得るようであり、これらはｍＲＮＡ結合チャネルを構築する構造の特徴の全てを共有する。実際に、真核生物リボソームには存在しないシャイン−ダルガーノ相互作用を除いて、本発明者らは、ｍＲＮＡが全てのリボソーム中の非常に類似した経路に従うと予測する。主な答えのない疑問は、タンパク質合成の転位工程の間に、ｍＲＮＡの移動がｔＲＮＡの移動とどのように結びつき、弱いコドン−アンチコドン相互作用の破壊および翻訳リーディングフレームの損失を防止するかということである。可能性のある答えは、ｍＲＮＡと接触するリボソームの特徴のいくつかがそれ自体移動性であること、およびこのリボソームが、転位の間、このリボソームの移動とｔＲＮＡの移動とを同調させることである。上記の可能な例は、３０Ｓサブユニットのヘッドである。別の自明な候補は、最後から２番目のステムを小サブユニットのヘッドと連結する非正準へリックスである、デコード部位自体である。
【０１４８】
ＡコドンおよびＰコドンは、１６Ｓ ｒＲＮＡ（配列番号４５）の普遍的に保存された１４００鎖および１５００鎖から形成される、この異常なヘリックスの主要な溝を通って貫く（図１２Ｂ）。デコード部位のヘリックスは、橋Ｂ２ａを介して、上記されるようなｔＲＮＡ移動およびサブユニット間シグナル伝達において役割を果たすことが提唱されているドメインＩＶのラテラルアーム中の２３Ｓ ｒＲＮＡ（配列番号２３）の普遍的に保存された１９３５鎖および１９６５鎖によって形成される、別の規範的ではないヘリックスに順々に連結される。面白いことに、２つの規範的ではないヘリックスの間の連結は、２３Ｓ ｒＲＮＡ（配列番号２３）のヘリックス６９によって生成され、これは、ヘアピンループを介して１６Ｓ ｒＲＮＡ（配列番号４５）のデコード部位と相互作用するだけではなく、Ａ−ｔＲＮＡおよびＰ−ｔＲＮＡ両方のＤステムと同時に相互作用する（図１２Ｃ）。このことは、ｍＲＮＡ転位とｔＲＮＡ転位とを関連付けるための可能な構造的基礎を示唆する。
【０１４９】
（実施例３−翻訳開始因子３と３０Ｓリボソームサブユニットとの相互作用を決定するためのリボソーム構造の使用）
本実施例において、本発明者らは、リボソーム標的部位を同定および特徴付けるために、リボソームについての生化学的フットプリントおよび構造的情報をどのように使用して、リボソーム構造上の機能的に有意な分子のドッキングを容易にするのかを示す。本実施例は、翻訳開始因子３（ＩＦ３）のドッキングを記載するが、結果を、リボソームによって結合され得る任意の分子に対して一般化し得る。このドッキングから誘導される情報を使用して、リボソームとリガンド（例えば、ＩＦ３）との間の相互作用を破壊するための１つ以上の標的部位を同定し得る。リボソーム標的部位構造の同定および特徴付けは、ドッキングした構造によって特徴付けられて、その部位の３次元形状および電荷分布についての情報を提供し、当業者がその標的部位を占め得る他の分子を設計することを可能にする。リガンドの結合が適切なリボソーム機能に必要な場合、リボソーム−リガンド結合相互作用を破壊または阻止するように設計された分子は、タンパク質翻訳を阻害し得る。このような分子は、抗生物質、防腐剤、およびリボソーム機能の生化学的メカニズムをさらに規定する因子として、有用性を有する。
【０１５０】
本実施例において、本発明者らは、ヒドロキシルラジカルフットプリンティングおよびＦｅ（ＩＩ）誘導体化ＩＦ３による指向性プローブ化をどのように使用して３０Ｓリボソームサブユニット中の１６Ｓ ｒＲＮＡ（配列番号４５）およびｔＲＮＡ^Ｍｅｔ _ｆに対するＩＦ３（配列番号５３および５４）の相互作用をマッピングするのかを示す。本発明者らの結果は、プラットホームインターフェイスでのＣドメイン、およびＥ部位でのＮドメインを有する開始ｔＲＮＡの逆側上にＩＦ３（配列番号５３および５４）の２つのドメインを配置する。Ｃドメインは、２３Ｓ ｒＲＮＡ（配列番号２３）のヘリックス６９の位置と一致し、これは、サブユニット結合をブロックするＩＦ３（配列番号５３および５４）の能力を説明する。Ｎドメインは、タンパク質Ｓ７（配列番号３０）およびＳ１１（配列番号３４）に隣接し、そしてＥ部位のｔＲＮＡ結合を干渉し得る。本発明者らのモデルは、ＩＦ３が開始ｔＲＮＡ選択に間接的に影響することを示唆する。
【０１５１】
（序論）
開始中、リボソームは、メッセンジャーＲＮＡの翻訳のために正確なリーディングフレームを選択しなければならない。このメッセージの３連のコドン開始シグナルは、開始ｔＲＮＡのアンチコドンと塩基対形成するように３０ＳサブユニットのＰ部位にて同定および整列されなければならない。大サブユニットが結合し得そしてタンパク質合成が始まり得る前に、小リボソームサブユニットと、Ｐ部位における開始ｔＲＮＡとｍＲＮＡとの間で、複合体が形成される（ＧｕａｌｅｒｚｉおよびＰｏｎ、１９９０；Ｇｕａｌｅｒｚｉら、２０００）。原核生物細胞および真核生物細胞の両方が、この経路における中間体を形成するために、複数のタンパク質因子を必要とするが、関連する因子および形成される中間体において有意な差異が存在する。開始は、翻訳の律速段階であり、そして翻訳の調節が最も頻繁に生じる段階である（Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇら、２０００）。
【０１５２】
ＧＴＰ補因子に加えて、３つのタンパク質因子ＩＦ１、ＩＦ２およびＩＦ３は、細菌中での好適な開始に必要とされる（ＧｕａｌｅｒｚｉおよびＰｏｎ、１９９０）。ＧＴＰａｓｅであるＩＦ２は、開始ｔＲＮＡが３０ＳサブユニットのＰ部位へ結合することを刺激する（Ｃａｎｏｎａｃｏら、１９８６）。化学的フットプリンティング研究は、ＩＦ１が、３０ＳサブユニットのＡ部位に結合したｔＲＮＡによって保護されるヌクレオチドを保護することを示した。このことは、ＩＦ１が、開始中にＡ部位へのｔＲＮＡの結合をブロックするという仮説を導く（Ｍｏａｚｅｄら、１９９５）。３０Ｓサブユニットに結合したＩＦ１の、最近の結晶構造は、ＩＦ１が３０Ｓ Ａ部位を占めることを示す（Ｃａｒｔｅｒら、２００１）。
【０１５３】
いくつかの活性が、開始中のＩＦ３に起因した。３０Ｓサブユニットに優先的に結合することによって、ＩＦ３は７０Ｓリボソームを解離して、これらを開始について利用可能にする（ＳｕｂｒａｍａｎｉａｎおよびＤａｖｉｓ、１９７０；Ｇｒｕｎｂｅｒｇ−Ｍａｎａｇｏら、１９７５）。ＩＦ３はまた、インビボおよびインビトロの両方で開始ｔＲＮＡ選択の正確さを増加させる（Ｒｉｓｕｌｅｏら、１９７６；Ｈａｒｔｚら、１９８９；Ｓｕｓｓｍａｎら、１９９６；Ｍｅｉｎｎｅｌら、１９９９；Ｓａｃｅｒｄｏｔら、１９９９）。近年、サブユニットの再循環におけるＩＦ３の役割が提唱された。なぜなら、ＩＦ３は、終止後複合体からの脱アシル化されたｔＲＮＡの解離を増強することが観察されたからである（Ｋａｒｉｍｉら、１９９９）。ＩＦ３がこれらの機能を達成するメカニズムは、十分には理解されていない。
【０１５４】
ＩＦ３は、２ドメインの２０ｋＤタンパク質であり、このＮ末端ドメイン構造およびＣ末端ドメイン構造が、Ｘ線結晶学およびＮＭＲの両方によって決定された（Ｂｉｏｕら、１９９５；Ｇａｒｃｉａら、１９９５ａ；Ｇａｒｃｉａら、１９９５ｂ）。このＮドメインは、α／β折り畳みを有し、そして塩基性残基および芳香性残基に富む、伸長したαヘリックスエレメントによって、Ｃドメインに連結される。このリンカーヘリックスは、結晶構造およびＮＭＲ構造の両方において（異なる程度ではあるが）部分的に乱れている。ＮＭＲによるインタクトな全長タンパク質の動力学研究は、リンカーが溶液中で可撓性であるという概念を支持する（Ｍｏｒｅａｕら、１９９７）。ＩＦ３のＣドメインは、２つのαヘリックスによって支持される４鎖βシートからなる古典的なＲＮＡ結合ドメインに折り畳まれる。
【０１５５】
ＩＦ３の、３０Ｓサブユニットとの相互作用部位は、多くのアプローチを使用して研究され、時々相反する結果を得た。免疫電子顕微鏡は、３０Ｓサブユニットの開裂にてＩＦ３を位置付けた（ＳｔｏｅｆｆｌｅｒおよびＳｔｏｅｆｆｌｅｒ−Ｍｅｉｌｉｃｋｅ、１９８４）。ＩＦ３は、３０Ｓサブユニットの広範な領域にわたって分布するタンパク質のセットである小サブユニットＳ７（配列番号３０）、Ｓ１１（配列番号３４）、Ｓ１２（配列番号３５）、Ｓ１３（配列番号３６）、Ｓ１８（配列番号４１）、Ｓ１９（配列番号４２）およびＳ２１（配列番号ＸＸ）に架橋された（Ｃｏｏｐｅｒｍａｎら、１９７７；ＭａｃＫｅｅｎら、１９８０；Ｃｏｏｐｅｒｍａｎら、１９８１；Ｂｏｉｌｅａｕら、１９８３）。ＩＦ３はまた、３０Ｓサブユニットの中央ドメインおよび３’マイナードメインにおいて、それぞれ、１６Ｓ ｒＲＮＡ（配列番号４５）のヘリックス２６および４５に架橋された（Ｅｈｒｅｓｍａｎｎら、１９８６）。ケソザール（ｋｅｔｈｏｘａｌ）、ＤＭＳおよびＣＭＣＴを使用する化学的フットプリントは、１６Ｓ ｒＲＮＡの中央ドメインのヘリックス２３および２４に見出された（Ｍｕｒａｌｉｋｒｉｓｈｎａら、１９８９；Ｍｏａｚｅｄら、１９９５）。ＮＭＲ研究は、ＩＦ３が残基１４９５〜１５４２を含む１６Ｓ ｒＲＮＡの３’末端のフラグメントと相互作用することを示した（Ｗｉｃｋｓｔｒｏｍら、１９８６）。凍結電子顕微鏡（クリオＥＭ（ｃｒｙｏ−ＥＭ））再構築は、小サブユニットのインターフェイス面にてＩＦ３のＣ末端ドメインを位置付けた（ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎら、１９９９）。対照的に、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）３０Ｓサブユニットの結晶に浸漬されたＩＦ３のＣドメインの、最近の結晶学的分析によって、３０Ｓサブユニットの逆面上のＣ末端ドメインについての結合部位が明らかになった（Ｐｉｏｌｅｔｔｉら、２００１）。
【０１５６】
ここで、本発明者らは、ヒドロキシルラジカルフットプリンティングおよび指向性ヒドロキシルラジカルプローブ化の組み合わせを使用して、１６Ｓ ｒＲＮＡ（配列番号４５）に関して、３０Ｓリボソームサブユニット上のＩＦ３（配列番号５３および５４）結合部位を位置付けるための独立したアプローチを記載する。指向性プローブ化を、ＩＦ３の表面上の異なる１４の位置につながれたＦｅ（ＩＩ）から実施した。１６Ｓ ｒＲＮＡおよび開始ｔＲＮＡの指向性切断の部位は、フットプリンティングデータと一緒に、３０Ｓサブユニットの結晶学的に決定された構造における、ＩＦ３のＮドメインおよびＣドメインの位置をモデリングするために十分な制約を提供した（Ｓｃｈｌｕｅｎｚｅｎら、２０００；Ｗｉｍｂｅｒｌｙら、２０００；Ｙｕｓｕｐｏｖら、２００１）。本発明者らの知見は、ＩＦ３のサブユニット解離活性を説明し、そしてその他の生物学的役割に対する手がかりを提供する。
【０１５７】
（実験手順）
（ＩＦ３の変異誘導体の調製）
ＩＦ３をコードする遺伝子を、都合よいクローニングのための制限部位を含み、かつまた効率的な過剰発現を促進するために、ＩＦ３の規範的でなく独特なＡＵＵ開始コドンをＡＵＧに変化させたプライマーを使用するＰＣＲによって、ＭＲＥ６００ゲノムＤＮＡより増幅した。ＰＣＲ産物を、ｐＥＴ−２４ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）にサブクローニングし、迅速な精製のためのＣ末端Ｈｉｓ６タグを含む組換えＩＦ３を得た。プローブ化実験におけるコントロールとして使用するためのＩＦ３のシステインを含まない改変体を、部位特異的変異誘発（Ｋｕｎｋｅｌら、１９８７）によって生成した。ここで、位置６５で唯一存在する天然のシステイン残基を、アラニンに変異させた。この変異は、種々の種由来のＩＦ３の系統学的アラインメントに許容された置換である。単一のシステイン残基を、ＩＦ３の表面上の１５個の異なる位置（Ｒ１１、Ｑ２２、Ｅ４４、Ａ４９、Ｅ７６、Ｋ７９、Ｓ８０、Ｓ８１、Ｋ９７、Ｅ１０４、Ｋ１２３、Ｍ１３５、Ｑ１３８、Ｍ１４２およびＱ１８０）での部位特異的変異誘発によって導入した。この部位は、全体的には保存されておらずそしてＩＦ３タンパク質の表面上に位置する。１ｍＭ ＩＰＴＧの添加３時間にわたって過剰発現するように対数増殖期（ｍｉｄ−ｌｏｇ）の細胞を誘導することによって、野生型構築物および変異体構築物を、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に過剰発現させた。
【０１５８】
細胞を、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５）を含有する緩衝液中に再懸濁し、そしてリゾチームの存在下で凍結融解によって溶解した。細胞溶解物を、ＪＡ−２０ローター中で１０，０００ｒｐｍにて１５分間遠心分離し、そして上清を、再懸濁緩衝液で予め平衡化したＮｉ−ＮＴＡアガロース樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）に移した。次いで、１Ｍ ＮａＣｌ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、１０％グリセロール、および６ｍＭ β−ＭＥを含有する高塩濃度（ｈｉｇｈ−ｓａｌｔ）の緩衝液で，この樹脂を徹底的に洗浄した。次いで、ＩＦ３を、５００ｍＭイミダゾールで溶出し、そして１２２ｍＭ ＮＨ_４Ｃｌ、８０ｍＭ Ｋ^＋カコジル酸、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ＤＴＴ（ｐＨ７．２）を含有する貯蔵緩衝液を３回交換して透析した。タンパク質濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイによって推定した。精製したタンパク質を、瞬時に凍結し、そして−８０℃にてアリコートで貯蔵した。この様式で精製したＩＦ３誘導体を、クーマシーブルー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥによって９５％を超える純度と判定した。
【０１５９】
（ｍＲＮＡおよびｔＲＮＡ）
以下の配列：５’−ＧＧＣＡＡＧＧＡＧＧＵＡＡＡＡＡＵＧＵＵＵＡＡＡＣＧＵＡＡＡＵＣＵＡＣＵ−３’（配列番号５５）を有する、合成３６ヌクレオチドＴ４遺伝子３２ｍＲＮＡ誘導体を、Ｄｈａｒｍａｃｏｎより購入した。Ｅ．ｃｏｌｉ ｔＲＮＡＭｅｃｆを、Ｓｉｇｍａより購入した。ｍＲＮＡおよびｔＲＮＡを、それぞれ１８％および１０％のポリアクリルアミド変性ゲルにて精製した。ｔＲＮＡを、仔ウシ腸アルカリホスファターゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で処理し、続いて、［^３２Ｐ］−γ−ＡＴＰ（ＩＣＮ）で５’末端標識した。ｔＲＮＡを、再度ゲル精製し、そして１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２および７５ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５）を含有する緩衝液中にて、５５℃で３分間再生し、続いて、室温までゆっくりと冷却した。
【０１６０】
（開始複合体形成）
３０Ｓサブユニットに結合したＩＦ３の複合体を、記載される（Ｍｏａｚｅｄら、１９９５）ように調製した。典型的には、０．４μＭの濃度の３０Ｓサブユニット（Ｍｏａｚｅｄら（１９８６ａ）に記載されるように調製した）を、１２２ｍＭ ＮＨ_４Ｃｌ、８０ｍＭ Ｋ^＋カコジル酸、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、および１ｍＭ ＤＴＴを含有する緩衝液（ｐＨ７．２）中にて、４２℃で１５分間加熱活性化した。精製したＩＦ３を、最終濃度４μＭまで添加し、そして３７℃で５分間、その後、室温で３０分間インキュベートした。
【０１６１】
（ＩＦ３のケソザールおよび溶液Ｆｅ（ＩＩ）−ＥＦＴＡフットプリンティング）
３０Ｓサブユニットに結合したＩＦ３の複合体を、以下のようにケソザールでプローブした。４０ｐｍｏｌの３０Ｓサブユニットを、１００μＬの反応容量中で１０倍モル濃度過剰のＩＦ３とともにインキュベートした。３０Ｓサブユニット単独のコントロールサンプルを、ＩＦ３を含むサンプルと同じく処理した。ケソザール改変を、記載される（Ｍｏａｚｅｄら（１９８６ａ）ように実施し、ここで、３７ｍｇ／ｍＬのケソザール４μＬを、各サンプルに添加し、そして３７℃で８分間インキュベートした。次いで、サンプルを、２５ｍＭホウ酸カリウムに調整し、そしてエタノールで沈殿させた。ヒドロキシルラジカルフットプリンティング実験を、各反応物に添加したプローブ化試薬の最終濃度が以下であることを除いて、記載される（ＰｏｗｅｒｓおよびＮｏｌｌｅｒ、１９９５）ように実施した：１ｍＭ Ｆｅ（ＮＨ_４）（ＳＯ_４）_２−６Ｈ_２Ｏ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭアスコルビン酸および０．０５％Ｈ_２Ｏ_２。反応物を、氷上で１０分間インキュベートし、等量の７．６ｍｇ／ｍＬチオ尿素でクエンチし、そしてエタノールで沈殿させた。ケソザールおよびヒドロキシラジカルフットプリンティング実験の両方において、ｒＲＮＡを抽出し、そして改変からの保護部位を、記載される（Ｓｔｅｒｍら、１９８８ｂ）ように、プライマー伸長によって同定した。
【０１６２】
（Ｆｅ（ＩＩ）−ＢＡＢＥ−誘導体化ＩＦ３の調製）
Ｆｅ（ＩＩ）−ＢＡＢＥとＩＦ３のシステイン含有変異体との結合体化を、実質的に記載される（ＣｕｌｖｅｒおよびＮｏｌｌｅｒ、２０００）ように実施した。２〜６ｎｍｏｌのＩＦ３誘導体各々を、１２２ｍＭ ＮＨ_４Ｃｌ、８０ｍＭ Ｋ^＋カコジル酸、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ＤＴＴを含有する緩衝液（ｐＨ７．２）１００μＬ中にて、１００ｎｍｏｌ Ｆｅ（ＩＩ）−ＢＡＢＥとともに３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション緩衝液での複数回の洗浄を用いて、遊離Ｆｅ（ＩＩ）−ＢＡＢＥを、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ−１０微量濃縮器で誘導体化タンパク質から分離した。モック改変反応もまた、コントロールとしてのシステインを含まないＩＦ３で実施した。
【０１６３】
（指向性ヒドロキシルラジカルプローブ化）
Ｆｅ（ＩＩ）結合体化ＩＦ３を含むＩＦ３−３０Ｓ複合体を、上記のように形成した。遊離した、過剰のＩＦ３を、ｍｉｃｒｏｃｏｎ−１００微量濃縮器にてこの複合体を遠心分離することによって除去し、そしてさらなる５００μｌの緩衝液を通してスピンすることによって洗浄した。単離したＩＦ３−３０Ｓ複合体を、１００μｌにして、０．０２５％ Ｈ_２Ｏ_２および５ｍＭアスコルビン酸でのヒドロキシルラジカル形成を開始することによってプローブした。反応物を、氷上で１０分間インキュベートし、そして２０ｍＭチオ尿素でクエンチした。１６Ｓ ｒＲＮＡを抽出し、そして記載される（Ｓｔｅｒｎら、１９８８ｂ）ようにプライマー伸長によって分析した。切断強度を、記載される（Ｊｏｓｅｐｈら、１９９７）ように、コントロール配列決定バンドに対する各バンドの強度に従って、強い、中程度または弱いと示した。
【０１６４】
開始ｔＲＮＡの指向性プローブ化について、１０ｐｍｏｌの加熱活性化した３０Ｓサブユニットを、２０ｐｍｏｌ ｍＲＮＡ、１ｐｍｏｌ ５’末端標識した開始ｔＲＮＡおよびＦｅ（ＩＩ）誘導体化ＩＦ３とともに、２５μｌ中にて３７℃で１０分間同時インキュベートし、続いて、室温で３０分間インキュベートした。結合していないｍＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびＩＦ３を、ｍｉｃｒｏｃｏｎ−１００中でスピンすることによって除去した。複合体を、２５μｌ容量にして、上記のようにプローブした。反応物をエタノール沈殿し、そして１５％の変性ＰＡＧＥで電気泳動した。
【０１６５】
（結果）
（ヒドロキシラジカルフットプリンティング）
本発明者らは、組換え野生型ＩＦ３の３０Ｓサブユニットへの結合を、１６Ｓ ｒＲＮＡ（配列番号４５）上のその以前に決定されたケソキサール（ｋｅｔｈｏｘａｌ）フットプリント（Ｍｏａｚｅｄら、１９９５）を再現することによって試験した。図１５のレーン３〜５（左パネル）は、精製された組換えＩＦ３が、ケソキサールによるＮ１／Ｎ２における改変から、ヌクレオチドＧ７００およびＧ７０３を保護することを示す。組換えＩＦ３はまた、沈降分析により、密接連結（ｔｉｇｈｔ−ｃｏｕｐｌｅ）７０Ｓリボソームをサブユニットに解離し得た（データは、示さない）。
【０１６６】
ＩＦ３結合部位をさらに規定するために、本発明者らは、結合したＩＦ３の存在下で、遊離Ｆｅ（ＩＩ）−ＥＤＴＡを用いて溶液中で生成させたヒドロキシラジカルからの１６Ｓ ｒＲＮＡ（配列番号４５）の糖−リン酸骨格の保護をモニターした。ヒドロキシラジカル攻撃に対するＲＮＡ骨格の感受性が二次構造から独立しているので、これらのデータは、ＲＮＡの不対塩基部分を特異的に改変する化学プローブからの保護と相補的である。保護を、プライマー伸長によってモニターし、オートラジオグラフィーの視覚的検査によって分類した（図１６Ａおよび１６Ｂ）。
【０１６７】
保護されたヌクレオチドは、１６Ｓ ｒＲＮＡの中心ドメインのヘリックス２３およびヘリックス２４（これらは、上記のように、サブユニット界面に位置する）にクラスター化される。ヘリックス２３において、ヌクレオチド６８５〜６８８および６９３〜７０３は、保護される（図１６Ｂ）；さらに、広範囲なフットプリントが、ヘリックス２４において、７７４位〜７７６位、７８３位〜７９３位、７９９位〜８０２位、および８０７位〜８１０位に観測された（図１６Ａ）。これらのヌクレオチドは、塩基Ｇ７００、Ｕ７０１、Ｇ７０３、Ｇ７９１、およびＵ７９３を取り囲み、これらは、ＩＦ３によってケソキサールおよびＣＭＣＴによる攻撃から保護される（Ｍｕｒａｌｉｋｒｉｓｈｎａら、１９８９；Ｍｏａｚｅｄら、１９９５）。ヘリックス２４における保護されたヌクレオチドは、３’方向でゆらぎ（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ）、これは、ＩＦ３がこれらの位置でＲＮＡヘリックスの副溝と相互作用することを示唆する。ＩＦ１およびＩＦ２もまた３０Ｓ複合体に存在する場合、７７５位の周りのヌクレオチドのいくらかがより強力に保護されるようであることを除いて、ＩＦ３依存保護パターンが変化せず、これは、ＩＦ３の結合が、他の開始因子の存在または非存在下で同様であることを示す（図１６Ａ）。
【０１６８】
（ＩＦ３−３０Ｓ複合体の直接的なヒドロキシラジカルプロービング実験）
システインを含まないＩＦ３改変体および単一システインを含有するＩＦ３改変体を過剰発現し、精製し、そしてＦｅ（ＩＩ）ＢＡＢＥ誘導体化した後、本発明者らは、これらの誘導体化されたタンパク質が正常に３０Ｓサブユニットに結合する能力およびリボソームの解離を促進する能力を試験した。図１５は、タンパク質の全てが、Ｆｅ−Ｃ７９構築物を除いて、ヌクレオチドＧ７００およびＧ７０３をケソキサール改変から保護し得たことを示す。同様に、Ｆｅ−Ｃ７９以外の全てが、沈降分析によって判断されるように、リボソームをサブユニットに解離し得た（データは示さない）。従って、Ｆｅ−Ｃ７９を、引き続くプロービング実験から排除した。Ｆｅ（ＩＩ）−ＢＡＢＥを用いたＩＦ３の誘導体化の位置を図１７Ａに示す。
【０１６９】
Ｆｅ（ＩＩ）−ＩＦ３−３０Ｓ複合体の直接的なヒドロキシラジカルプロービングを、実験手順に記載されるように、実行し、そして評点付けした。フットプリントがプラットホームの６９０および７９０のステムループに密に局在化するが、試験される１５個の位置のうちの６個につながれるＦｅ（ＩＩ）から生成されるヒドロキシラジカルは、１６Ｓ ｒＲＮＡの４つのドメインのちの３つを切断する（図１７Ｂおよび１７Ｃ）。切断標的が二次構造において広範に分布するものの、これらは、プラットホームのエレメント、最後から２番目のステム、および３０Ｓサブユニットのヘッドを含む、裂溝（ｃｌｅｆｔ）を整列させる領域に局在化される。
【０１７０】
ヒドロキシルラジカルがＩＦ３のＣ末端ハーフにつながれたＦｅ（ＩＩ）から生成する場合、最も強い切断は、７９０ループおよびサブユニット界面の最後から２番目のステムの頂部において生じる。第１に９７位（Ｃ−ドメインのβ鎖）そしてより少ない程度に１３５位（β鎖２およびα−ヘリックス２を接続するループ）につながれたＦｅ（ＩＩ）から生成するヒドロキシラジカルは、６９０およち７９０のループならびに９２５領域、１２２８領域、１３３８領域、および１４００領域にヌクレオチドにおいて、１６Ｓ ｒＲＮＡを切断する。１６Ｓ ｒＲＮＡのこれらの特徴は、Ｐ部位を取り囲む（Ｍｏａｚｅｄら、１９９０；Ｙｕｓｕｐｏｖら、２００１；上記を参照のこと）。これら２つのプロービング位置はまた、デコード部位近くの最後から２番目のステムの頂部のヌクレオチドを切断する。Ｃ−ドメインのヘリックス１の開始部にある１０４位につながれるＦｅ（ＩＩ）は、最後から２番目のステムの残基１４８２〜１４８７を弱く切断する（図１７Ｂおよび１７Ｃ）。
【０１７１】
６９０および７９０のステムループはまた、ヘリカルリンカーにおける７６位および８０位につながれるＦｅ（ＩＩ）によって切断される。これらの２つのプロービング部位からの切断のパターンは、ほとんど同一であり、ヌクレオチド６９９〜７０５において最も強いヒットを生じる（図１７Ｂ）。Ｎ−ドメインの球状部分において、位置１１につながれたプローブのみが、６９０ループの頂端において１６Ｓ ｒＲＮＡを切断した（図１７Ｂ）。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＩＦ３のＮ−ドメインの結晶構造において、Ｅ．ｃｏｌｉの１１位に対応する残基は、Ｎ−ドメインとＣ−ドメインとの間のリンカー領域に平行な伸長ループにある。従って、この残基は、ＩＦ３のＮ末端にあるが、実際に、Ｃ−ドメインに向けられる（図１７Ａ）。２２位、４４位、４９位および６５位のプローブは、１６Ｓ ｒＲＮＡを切断しない。
【０１７２】
（３０Ｓ Ｐ部位に結合される開始ｔＲＮＡの直接的ヒドロキシラジカルプロービング）
Ｐ部位結合開始ｔＲＮＡに関してＩＦ３の方向を束縛するために、ｔＲＮＡ骨格の切断は、^３２Ｐ末端標識開始ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、およびＦｅ（ＩＩ）−ＩＦ３を含む３０Ｓサブユニット複合体の直接的なプロービングによって試験された。３つのつながれたＦｅ（ＩＩ）−ＩＦ３プローブは、特徴的に異なる位置において、３０ＳサブユニットＰ部位に結合した開始ｔＲＮＡの骨格を切断する（図１８）。１３５位のプローブは、それぞれ、アンチコドンステムとＤステムと開始ｔＲＮＡのアンチコドンの間の接合部のヌクレオチド２６〜２９および３５〜３７を切断する。７６位および８０位のプローブは、Ｄループのヌクレオチド３〜５および１３〜２４において、ｔＲＮＡ^Ｍｅｔ _ｆを切断する。Ｃ−ドメインプローブ（１３５）およびリンカープローブ（７６および８０）は、ｔＲＮＡの対向面においてヌクレオチドを切断し、これは、ＩＦ３の２つのドメインがｔＲＮＡの対向する側に位置することを示す。
【０１７３】
（ＩＦ３−３０Ｓサブユニット相互作用のモデリング）
本発明者らは、３０Ｓサブユニットの３次元構造の状況において、指向されたヒドロキシプロービングおよびフットプリンティングからの生化学的制約を最大限に満足するためのＩＦ３の位置および配向をモデル化した。プロービングおよびフットプリンティング実験を全長ＩＦ３を用いて行ったが、Ｎ−ドメインおよびＣ−ドメインの構造が別々に解かれるので、ＩＦ３の各ドメインを個々にモデル化した。
【０１７４】
Ｆｅ−ＢＡＢＥ誘導体化ＩＦ３を使用する最も強い切断は、７９０ループの頂部および最後から２番目のステムの頂部におけるＦｅ−Ｃ９７に由来し、これは、明かに、Ｃ−ドメインが、１６Ｓ ｒＲＮＡのこの領域に対してそして３０Ｓサブユニットの界面側に対して近いことを示す。従って、本発明者らは、１６Ｓ ｒＲＮＡ上でのＩＦ３のヒドロキシラジカルフットプリントを効果的に覆う、３０Ｓサブユニットのプラットホームの界面表面に直接結合したＣ−ドメインをモデル化した（図１９）。この解釈は、リボソームの最近の結晶構造の解析によって支持される（Ｗｉｍｂｅｒｌｙら、２０００；Ｙｕｓｕｐｏｖら、２００１；上記を参照のこと）。これらは、１６Ｓ ｒＲＮＡ上の小さなサブユニットタンパク質のヒドロキシラジカルフットプリントの圧倒的大部分（Ｐｏｗｅｒｓら、１９９５）が、コンフォメーションの変化によって誘導される間接的な保護よりもむしろ、直接的なタンパク質−ｒＲＮＡ相互作用を反映することを示す。
【０１７５】
Ｆｅ−Ｃ９７プローブおよびＦｅ−Ｃ１３５プローブが、中程度〜弱い程度の強度で３０Ｓサブユニットのヘッドのヌクレオチドを切断するので、本発明者らは、Ｃ−ドメインにおいてこれらの残基を、３０Ｓ Ａ部位の方向でヘッドに向かって裂溝を面するように配向させた（図１９Ｃ）。ＩＦ３のＣ−ドメインの配向および位置は、さらに、５．５Ａリボソーム構造に存在するＰ部位結合ｔＲＮＡとの立体的衝突を避けることによって制約される。この配向において、Ｃ−ドメインのα−ヘリックスは、１６Ｓ ｒＲＮＡヘリックス２４の副溝と相互作用する。ａ−ヘリックス１におけるリシン−１１０からロイシンへの変異は、ＩＦ３の３０Ｓサブユニットへの結合を実質的に消滅させ、これは本発明者らの配置と一致する（Ｄｅ Ｂｅｌｌｉｓら、１９９２）。
【０１７６】
Ｃ−ドメインのこの配向の結果として、Ｃ−ドメインの残基Ｍ１３５が、Ｐ部位結合ｔＲＮＡのアンチコドンループに面する。これは、Ｆｅ−Ｃ１３５による開始ｔＲＮＡコドンの観測された切断と一致する。ＩＦ３のＣ−ドメインのこの配向が切断データとの一致を最大にするが、それにもかかわらず、３’メジャードメインにおけるプロービング位置のうちのいくつかとそれらの標的との間の距離は、以下に議論されるように、それらの切断強度から推測される距離よりも遠い。
【０１７７】
ＩＦ３のＮ末端ハーフは、塩基性残基および芳香族残基がリッチな高度に保存されるリンカー領域を含む。この因子のこのハーフからの切断データが、リンカー領域からのヒットによって実証されているので、ＩＦ３のＮ末端ハーフをドッキングする際の本発明者らの第１工程は、リンカーを位置付けることであった。リンカー領域のプローブは、６９０ステムおよび７９０ステムの中程度および下の部分を切断するので、これを、プラットホームのこの領域にわたるようにモデル化した（図１９Ｃ）。
【０１７８】
Ｎ−ドメインの球状部分の配置は、そのドメイン由来の大部分のプローブが１６Ｓ ｒＲＮＡを切断しないので、あまり確かではない。リンカーの位置によって大きく制約される図１９Ｃに示される位置は、１１位から得られた切断、１６Ｓ ｒＲＮＡを切断した孤立したＮ末端プロービング部位と一致する。この配置は、リボソームタンパク質Ｓ７（配列番号３０）とＳ１１（配列番号３４）との間（これらの両方ともが、ＩＦ３に架橋されている（ＭａｃＫｅｅｎら、１９８０；Ｂｏｉｌｅａｕら、１９８３）に、Ｎ−ドメインの球状部分を押し込める（ｗｅｄｇｅ）。タンパク質リッチ環境におけるＮ−ドメインの配置は、これがモデル化の制約として明確には使用されなかったものの、２２位、４４位、４９位、および６５位におけるＮ末端プローブからのヒットの非存在を説明する。
【０１７９】
ＩＦ１が開始の間、３０ＳサブユニットのＡ部位に重なるが、本発明者らのモデルにおいて、ＩＦ３のＮ−ドメインおよびＣ−ドメインは、開始ｔＲＮＡの対向面にあり（図２０Ａおよび２０Ｂ）、Ｅ部位にＮドメインを配置する。この配置についてのさらなる支持は、ＩＦ３のリンカー領域における７６位につながれたＦｅ（ＩＩ）由来の開始ｔＲＮＡのＤループの切断に由来する（図２０Ｂ）。溶液散乱研究は、本発明者らの知見と一致して、ＩＦ３の２つのドメインが互いに相互作用しないこと示し（Ｋｙｃｉａら、１９９５）、これはまた、ＩＦ３についての拡大されたコンフォメーションを支持する。クリオＥＭ研究（ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎら、１９９９）において観測されるように、これらが相互作用する場合、ＩＦ３においてまたは３０Ｓサブユニットにおいて生じ得るコンフォメーション変化によって本発明者らのモデルがどのように影響するかを述べることができないことを注意する。
【０１８０】
（考察）
本発明者らのモデルにおいて、ＩＦ３のＣドメインが、広範な生化学的研究および生物物理学的研究によって支持される配置の、プラットホームの界面表面におけるヘリックス２３、ヘリックス２４、およびヘリックス４５と相互作用する。免疫電子顕微鏡は、ＩＦ３を３０Ｓサブユニットの界面表面上に限定した（ＳｔｏｆｆｌｅｒおよびＳｔｏｆｆｌｅｒ−Ｍｅｉｌｉｃｋｅ、１９８４）。ヌクレオチドＧ７００、Ｕ７０１、Ｇ７０３、Ｇ７９１、およびＵ７９３（これらは、小さなサブユニットの界面に位置付けられる）は、ケソキサールおよびＣＭＣＴ改変から保護される（ＭｕｒａｌｉｋｒｉｓｈｎａおよびＷｉｃｋｓｔｒｏｍ、１９８９；Ｍｏａｚｅｄら、１９９５）。さらに、Ｇ７９１のＡへの変異は、３０Ｓサブユニットに対するＩＦ３の結合親和性を１０倍減少させる（Ｔａｐｐｒｉｃｈら、１９８９）。ヘリックス４５とＩＦ３との間の架橋はまた、本発明者らのモデルにおけるヘリックス４５とＣドメインとの間の接触と一致する（Ｅｈｒｅｓｍａｎｎら、１９８６）。別の研究において、３０ＳサブユニットへのＩＦ３の結合は、Ｕ７９３（ヘリックス２４内）とＧ１５１７（ヘリックス４５内）との間の分子内架橋を妨害した（Ｓｈａｐｋｉｎａら、２０００）。３０ＳサブユニットをともなうＩＦ３の最近のクリオＥＭ研究は、プラットホームの界面側のＣドメインと同じ寸法の電子密度を同定した（ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎら、１９９９）。さらに、Ｃ−ドメインのみを含むＩＦ３の欠失変異体は、全長ＩＦ３のヒドロキシラジカルフットプリントと同一の、ヘリックス２３およびヘリックス２４上のヒドロキシラジカルフットプリントを生成する（Ａ．Ｄ．およびＨＥＮ、未公開の結果）。
【０１８１】
Ｃ−ドメインの本発明者らの位置付けが２７ÅのクリオＥＭ研究（ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎら、１９９９）と一致するが、Ｎ−ドメインの位置付けは、異なる。クリオＥＭ研究において、陽性差異密度（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｄｅｎｓｉｔｙ）の３つの領域および陰性差異密度の１つの領域を同定した。Ｎ−ドメインを、プラットホームから３０Ｓサブユニットの頚部にわたる陽性差異密度にあてはめ、一方、残りの差異密度は、ＩＦ３結合において生じたコンフォメーション変化に起因させた。本発明者らのデータは、プラットホームと連続する陽性密度の非割り当て領域におけるＮ−ドメインの位置により密接に当てはまる。次いで、本発明者らは、陽性差異密度および陰性差異密度の残りのローブを、３０ＳサブユニットのヘッドがＰ部位に対するＡ部位の方向から旋回する３０Ｓサブユニットのコンフォメーションの変化に帰せた。この動きは、いくつかのヌクレオチドをＣ−ドメインに近いヘッドにおいて切断し、これは、観察された切断の強度とＦｅ−Ｃ９７の位置およびＦｅ−Ｃ３５の位置からのプローブ−標的距離との間の矛盾を調和するのに役立つ。
【０１８２】
ＩＦ３についての本発明者らのモデルがクリオＥＭデータと一致するが、ＩＦ３のＣ−ドメインについての本発明者らの立場は、ＩＦ３のＣ−ドメインを浸された（ｓｏａｋｅｄ）３０Ｓサブユニットの最近報告された結晶の分析とは実質的に異なる（Ｐｉｏｌｅｔｔｉら、２００１）。Ｐｉｏｌｅｔｔｉらは、３０Ｓサブユニットの対向する面にＣ−ドメインを配置し、ヘリックス２３およびヘリックス２６の溶媒面と相互作用させる。本発明者らのフットプリンティングのデータも本発明者らの直接的なプロービングデータも、Ｃ−ドメインのこの配置と調和し得ない。この矛盾は、プラットホームの界面（本発明者らは提案するこれが、Ｃ−ドメインの結合部位である）が、Ｔｔｈ ３０Ｓ結晶内の結晶の接触と一致する（Ｓｃｈｌｕｅｎｚｅｎら、２０００；Ｗｉｍｂｅｒｌｙら、２０００）という事実によって説明され得る。実際、これは、隣接３０Ｓサブユニットのボディからの「スパー（ｓｐｕｒ）」ヘリックスが、Ｐ部位に結合する同じ領域であり、ｔＲＮＡアンチコドンステム−ループを模倣する（Ｃａｒｔｅｒら、２０００）。従って、本発明者らは、ＩＦ３のＣ−ドメインが、結晶パッキングを破壊することなしに本発明者らが提案した位置に結合し得ないことを予期する。非特異的な結合についてのＩＦ３の文書化された傾向（ＳａｂｏｌおよびＯｃｈｏａ、１９７４；Ｗｉｃｋｓｔｒｏｍ、１９８１）、およびＩＦ３が３０Ｓサブユニットの界面において相互作用するという豊富な生化学的および生物物理学的証拠を考慮すると、結晶研究において観測されたものは、２次結合部位を表すことがあり得る。
【０１８３】
本発明者らのモデルは、翻訳開始におけるＩＦ３の解離活性についての説明を提供する。ＩＦ３によって保護されるヌクレオチドと７０Ｓリボソームの形成時に保護されるヌクレオチドとの間に有意な重なりが存在する（Ｍｅｒｒｙｍａｎｎら、１９９９）。ＩＦ３の質量が５０Ｓサブユニットの質量の２％未満であるが、サブユニット間ブリッジＢ２ｂ、Ｂ２ｃ、およびＢ７ａを含む広範な範囲に対する５０Ｓサブユニットの接近を妨げ（Ｃａｔｅら、１９９９；Ｙｕｓｕｐｏｖら、２００１；上記を参照のこと）、これは、ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎら（１９９９）およびＧｕａｌｅｒｚｉら（２０００）による提案と一致する。ＩＦ３のＣ−ドメインの位置は、２３Ｓ ｒＲＮＡ（配列番号２３）のヘリックス６９のＣ−ドメイン（ブリッジＢ２ｂの主要な大きなサブユニット）と一致する（Ｙｕｓｕｐｏｖら、２００１；上記を参照のこと）（図２０）。従って、ＩＦ３は、この２３Ｓ ｒＲＮＡヘリックスを模倣することによって、サブユニットの会合を妨げ得る。単離されたＣ−ドメイン自体がサブユニット解離を促進し得ること（Ｇａｒｃｉａら、１９９５ｂ）およびヘリックス６９の接触部位のフットプリントが、このスキームを支持する。この機構は、Ｐｉｏｌｅｔｔｉらの機構とは対照的であり、彼らは、サブユニット間接触に関与する１６Ｓ ｒＲＮＡ領域におけるいかなる構造的変化も報告していないという事実にも関わらず、ＩＦ３がサブユニット相互作用に間接的に影響することを提案する（Ｐｉｏｌｅｔｔｉら、２００１）。
【０１８４】
本発明者らのモデルはまた、ＩＦ３が開始ｔＲＮＡ選択を促進し得る可能性のある方法を強要する（Ｒｉｓｕｌｅｏら、１９７６；Ｈａｒｔｚら、１９８９）。開始ｔＲＮＡの主要な差次的特徴は、Ｍａｎｇｒｏｏら、１９９５に概説されるように、アンチコドンループに隣接した、一連の３つの保存されたＧ−Ｃ塩基対（ヌクレオチド２９〜３１および３９〜４１）であることが示されている。本発明者らのモデルに従って、ＩＦ３は、ｔＲＮＡのこの特徴には及ばず、このことは、ｔＲＮＡ識別を促進にする際でのそれらの役割が間接的であることを示唆する。開始ｔＲＮＡに結合した７０Ｓリボソームの共結晶構造において、３０ＳサブユニットのヘッドにおけるヌクレオチドＧ１３３８およびヌクレオチドＡ１３３９は、開始ｔＲＮＡのまさにこの領域のアンチコドンステムの副溝面と並置している（Ｙｕｓｕｐｏｖら、２００１；上記を参照のこと）。可能性のある機構は、クリオＥＭ（ｃｒｙｏ−ＥＭ）研究から推定されるプラットホームに対するヘッドの推定ＩＦ３依存性の傾き（ｔｉｌｔｉｎｇ）が、１６Ｓ ｒＲＮＡのこれら２つの塩基をｔＲＮＡＭ”ｆのアンチコドンステムの副溝と緊密に接触させるように動くというものである（これらは、ｔＲＮＡ同一性の立体的なチェックを実施し得る）。このようなスキームは、副溝認識を含む、アミノアシル−ｔＲＮＡ識別についてＯｇｌｅおよび共同研究者らによって提唱された機構に類似する（Ｏｇｌｅら、２００１）。
【０１８５】
いくつかの研究によって、開始因子が存在する場合、ｍＲＮＡが３０Ｓサブユニット上に再配置されることが示唆されている（Ｃａｎｏｎａｃｏら、１９８９；Ｌａ Ｔｅａｎａら、１９９５）。興味深いことに、１６Ｓ ｒＲＮＡの３’末端の位置は、単離された３０Ｓサブユニットの結晶構造と７０Ｓ リボソームの結晶構造との間で異なり、Ｐ部位 ｔＲＮＡおよびｍＲＮＡが結合する（Ｃａｒｔｅｒら、２０００；Ｗｉｍｂｅｒｌｙら、２０００；Ｙｕｓｕｐｏｖら、２００１；上記を参照のこと）。ＩＦ３と１６Ｓ ｒＲＮＡの３’末端ステムループとの相互作用は、３０Ｓ結晶構造において観察されたように、Ｐ部位およびＥ部位から離れた１６Ｓ ｒＲＮＡの３’末端の移動を促進し得、これはｍＲＮＡのシャイン・ダルガルノ配列の結合を可能にする。
【０１８６】
最後に、ＩＦ３のＮドメインの位置とＥ−ｔＲＮＡのＮドメインの位置との間に立体的な衝突が存在する。従って、ＩＦ３のさらなる役割は、開始の間の３０Ｓ Ｅ部位からｔＲＮＡを排除することであり得る。ＩＦ３は、ＩＦ２に架橋され（Ｂｏｉｌｅａｕら、１９８３）、そしてＩＦ２もまた開始ｔＲＮＡの選択を促進するので、ＩＦ３のＮドメインが、５０Ｓサブユニットに連結する前にＩＦ２と相互作用し得る可能性はある。リボソームとそのリガンドについての完璧な構造情報の利用可能性によって、開始の間のＩＦ３活性の機構についてこれらの案および他の案を直接試験することがここで可能となる。
【０１８７】
（実施例４−７０Ｓリボソームに対する標的部位選択）
７０Ｓリボソームまたはその一部の構造座標は、リボソーム機能を阻害または活性化するために標的化され得る７０Ｓリボソームの構造特徴を設計するのに有用である。構造座標によって規定される７０Ｓリボソームの以下の領域は、阻害化合物または活性化化合物の開発に対する、特に有用な標的を表す。
【０１８８】
原核生物リボソーム標的部位に特異的なインヒビターまたはアクチベーターを開発するための１つの手法は、原核生物リボソーム成分および真核生物リボソーム成分の一次構造中に見出される系統発生的に多様な領域に基づいて標的領域を選択すること、および本５．５Ａ ７０Ｓ構造上にこれらの領域をマッピングすることによって決定すること（この系統発生的に多様な領域が、不安定化した場合におそらくリボソーム機能を破壊するリボソームの一部を含む）である。系統発生的に多様な領域は、タンパク質配列データベースまたは核酸配列データベースを使用して、周知の配列整列ツール（例えば、ＢＬＡＳＴ）を用いて異なる生物からの関連する配列間の配列比較を実行することによって、これらの成分の一次構造中に配置され得る。Ｉｌｌｉｎｏｉｓ大学のＣａｒｌ Ｗｏｅｓｅは、リボソームデータベースプロジェクトの一部として、このような配列比較をコンパイルしている（ｗｗｗ．ｃｍｅ．ｍｓｕ．ｅｄｕ／ＲＤＰ／ｈｔｍｌ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）。このようなデータベースは、２３Ｓ、Ｌ２、Ｌ５、Ｌ１４、およびＬ１９、１６Ｓ、Ｓ１３、およびＳ１５の非保存領域を位置付けるのに有用である。代表的なアライメントを表Ｉに示す。
【０１８９】
当然、原核生物特異性も真核生物特異性も必要としない例が存在する。このような場合、系統発生的に多様な領域が同定される必要はない。
【０１９０】
界面相互作用は、３０Ｓサブユニットと５０Ｓサブユニットとの間の相互作用の強度を破壊または増強する因子のファルマコフォアまたは候補化合物設計に有用な構造領域を提供する。Ｂａｎら、２０００の２．４オングストローム５０Ｓ構造と本５０Ｓ構造を比較することによって、７０Ｓサブユニットに結合した際に５０Ｓ構造に生じるコンフォメーション変化に関する手掛かりを提供する、これら２つの間の差異が、容易に決定される。これらのコンフォメーション差異は、上に記載される。標的選択についてのいくつかの手法が使用され得る。
【０１９１】
１つの手法は、サブユニットを離したままで、界面またはブリッジ領域を標的化することである。他の手法は、サブユニットが一緒になった場合に低分子にアクセス可能な領域を標的化することである。リボソームは、タンパク質翻訳の間に一緒になり、次いで翻訳プロセスの終りに再び分離する、分離した３０Ｓサブユニットと５０Ｓサブユニットとして生物内に存在する。いずれかのブリッジ領域および全てのブリッジ領域が、３０Ｓと５０Ｓとの間の会合を破壊するのに良好な標的である。特に良好な標的は、宿主と病原との間の５０Ｓリボソーム構造の上記の系統発生的に異なる領域中に見出されるものである。これらの領域は、５０Ｓ内に含まれる異なるｒＲＮＡ間の配列比較によって、容易に推定され得る（５０Ｓの界面成分は、２３Ｓ ｒＲＮＡの一部およびリボソームタンパク質Ｌ２、Ｌ５、Ｌ１４、およびＬ１９の一部を含む）。３０Ｓブリッジ成分は、１６Ｓ ｒＲＮＡならびにタンパク質Ｓ１３およびＳ１５の一部を含む。サブユニット間のブリッジ接触を作製するのに関与する構造の領域を、表ＩＩＩに示す。
【０１９２】
表ＩＶに示されるような、Ａ部位、Ｐ部位、およびＥ部位のｔＲＮＡを結合するのに関与する７０Ｓリボソームの領域もまた、標的部位選択に使用され得る。
【０１９３】
ｍＲＮＡと接触する７０Ｓリボソームの領域はまた、タンパク質翻訳に影響を与えるファルマコフォアおよび候補化合物の開発のための、潜在的な標的部位もまた提供する。これらとしては、タンパク質Ｓ３の残基１５６〜１６３；１２７〜１３２；タンパク質Ｓ４の残基４７〜５２；タンパク質Ｓ５の残基９〜３０および４６〜５６；１６Ｓ ｒＲＮＡの残基１３〜１７；５２８〜５３２；１１９４〜１１９８；および１０５４〜１０５６を含む構造のエレメントが挙げられる。
【０１９４】
シャイン・ダルガルノヘリックス（翻訳開始の間に、ｍＲＮＡの−１０領域と１６Ｓ ｒＲＮＡの３’末端との間に形成される）は、細胞質ヒトリボソームおよびミトコンドリアヒトリボソームの両方に存在しないが、全ての病原体（例えば、細菌）中に存在する。従って、上記のように、シャイン・ダルガルノヘリックス部分を形成する１６Ｓ ｒＲＮＡの一部は、良好な標的部位を提供する。ｍＲＮＡの結合の際に、リボソーム構造の３０Ｓ部分に、コンフォメーションシフトが生じる。１６Ｓ ｒＲＮＡのテイルは、ｍＲＮＡのシャイン・ダルガルノ配列と塩基対を形成し、次いで、そのヘリックスが、３０Ｓリボソームサブユニットの「プラットホーム」の溶媒側でシャイン・ダルガルノ結合ポケットに結合する。本発明者らは、本発明者らの７０Ｓ構造を単離された３０Ｓ構造（Ｗｉｍｂｅｒｌｙら、２０００；ＰＤＢ 同上 １ＦＪＦ）に対して比較し、シャイン・ダルガルノ結合ポケットを位置付けた。このポケットはまた、標的部位を提供し、そして以下のエレメントを含む構造の領域によって規定される：タンパク質Ｓ１１、残基８５〜９０；１１２〜１２９；２２〜２７；タンパク質Ｓ１８、残基１〜２４；１６Ｓヘリックス２０、ヘリックス２８、ヘリックス３７、ヘリックス４５およびバルジループ７２３（１６Ｓ 残基９２７〜９３１；１３８８〜１３９３；１５２６〜１５２９；１５０５〜１５０８；および７１９〜７２４を含む）。
【０１９５】
さらなる標的部位としては、リボソーム結合因子（例えば、ＩＦ３）に対する結合部位、そのドッキングを上で記載した、ＥＦ−ＴｕおよびＥＦ−Ｇの結合部位、ならびにＧＴＰａｓｅおよび因子関連機能に関与する５０Ｓサブユニットの領域が挙げられる。これらとしては、ＳＲＬ（サルシンリッチループ、図２およびＬ１１を参照のこと）が挙げられる。これらの２つの部位は、ＥＦ−ＴｕおよびＥＦ−Ｇと相互作用する。ＥＦ−Ｔｕの構造は、Ｋｊｅｌｄｇａａｒｄら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ １５、３５（１９９３）（ＰＤＢ １ＥＦＴ、８４７、ＩＴＴＴ；５４０１、ＩＴＵＩ；６２００、１ＥＦＣ；９８７９）およびＣｚｗｏｒｋｏｗｓｋｉら、ＥＭＢＯ Ｊ １３、３６６１（ＰＤＢ ＩＥＦＧ；８４５；ＩＤＡＲ；４５８６、ＩＥＬＯ；４９２０、２ＥＦＧ；１２０８５、１ＦＮＭ；１４５３２）、およびＬｉｌｊａｓ（ａｌ−Ｋａｒａｄａｇｈｉら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ４、５５５（ＰＤＢ ２ＥＦＧ；１２０８５，１ＦＮＭ；１４５３２）によって報告されている。
【０１９６】
本発明者らは、以下の基準に基づいて７０Ｓ構造に対して上記の技術を用いて、これらの構造をドッキングした：（１）７０Ｓに対するＥＦ−Ｇの立体一致；（２）２３Ｓ ＲＮＡに対するこれらの因子のフットプリンティング（Ｍｏａｚｅｄら、１９８８）；および方向付けられたヒドロキシルラジカルブローブ付け（Ｗｉｌｓｏｎら、「Ｍａｐｐｉｎｇ ｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ＥＦ−Ｇ ｉｎ ｔｈｅ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｂｙ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｈｙｄｒｏｘｙｌ ｒａｄｉｃａｌ ｐｒｏｂｉｎｇ」Ｃｅｌｌ（１９９８）９２（１）：１３１−９）。新規７０Ｓ構造ならびに伸長因子の公知の高解像度構造ならびに上記の詳述されるさらなる情報に基づいて、ＥＦ−ＴｕおよびＥＦ−Ｇは、７０Ｓ構造に正確にドッキングされて、リボソームＧＴＰａｓｅ活性および結果としてタンパク質合成を妨害する低分を設計するための鋳型を提供し得る。
【０１９７】
本発明者らのドッキング研究は、ＥＦ−Ｔｕ接触が２３Ｓ ｒＲＮＡ 残基２６５１〜２６６５、１６Ｓ ｒＲＮＡ 残基５４〜５７、および３５７〜３６１、ならびにＬ１１残基２０〜３６上であることを示す。ＥＦ−Ｇ接触は、２３Ｓ ｒＲＮＡ 残基１０６５〜１０６９、１０９４〜１０９７、および２６５１〜２６６５、１６Ｓ ｒＲＮＡ 残基５４〜５７、３４０〜３４５および３５７〜３６１、ならびにＬ１１ 残基２０〜３６で見出される。
【０１９８】
ＥＦ−ＴｕおよびＥＦ−Ｇの正確なドッキングは、ＳＲＬループは解明するがＬ１１（これは、５０Ｓ構造において乱れている）は解明していないＢａｎら（２０００）の５０Ｓ構造のような先行技術におけるリボソーム構造では、可能ではなかった。Ｌ１１密度は、本５．５Å構造で観察可能であり、そして高解像度の幾何は、上記のように密度を適合させたＬ１１およびＬ１１ ＲＮＡ複合体の高解像度構造を用いたフィッティング方法に従って推定され得（Ｃｏｎｎ ＧＬ、Ｄｒａｐｅｒ ＤＥ、Ｌａｔｔｍａｎ ＥＥ、Ｇｉｔｔｉｓ ＡＧ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９９ Ｍａｙ １４；２８４（５４１７）；１１７１−４．（１ＱＡ６；１０２９４）およびＷｉｍｂｅｒｌｙ ＢＴ、Ｇｕｙｍｏｎ Ｒ、ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ ＪＰ、Ｗｈｉｔｅ ＳＷ、Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ Ｖ．Ｃｅｌｌ．１９９９ Ｍａｙ １４；９７（４）：４９１−５０２（１ＥＧ０；１２６２６、１ＭＭＳ；１３２３６、４８７Ｄ；１３２８５）、そして本構造のモデルである。
【０１９９】
実際、本発明者らは、上記で参照されるＲａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ Ｌ１１構造を用いて５．５Å ７０Ｓ構造にＬ１１のドッキングを実行した。この新規に同定されたかまたは新しく解明された７０Ｓリボソーム構造の局面、および上記のドッキングアルゴリズムが与えられれば、当業者は容易に標的部位およびファルマコフォアを推定し得、ＥＦ−ＴｕおよびＥＦ−Ｇのリボソームへの結合を妨害し得る低分子および他の因子の調製を可能にする。このような因子は、リボソーム会合ＧＴＰａｓｅ活性を阻害することによってタンパク質合成を阻害することが予想される。チオストレプトンのような抗生物質およびミクロコッシン（ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｉｎ）は、Ｌ１１タンパク質に作用して、タンパク質合成を阻害する。Ｐｏｒｓｅ ＢＴ，Ｃｕｎｄｌｉｆｆｅ Ｅ，Ｇａｒｒｅｔｔ ＲＡ．「Ｔｈｅ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｉｎ ａｃｔｓ ｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ１１ ａｔ ｔｈｅ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＧＴＰａｓｅ ｃｅｎｔｒｅ」Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．Ｍａｒ １９；２８７（１）３３−４５（１９９９）；Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ．Ｊｕｌ−Ａｕｇ；７３（７−８）：１１３１−５（１９９１）。これらの抗生物質は、本発明者らが決定した７０Ｓ構造に対して鋳型をドッキングするために使用され得、他のファルマコフォアまたは候補化合物がＬ１１領域を標的化し、そしてＧＴＰａｓｅ活性を阻害するように設計され得るさらなる情報を提供する。このように、因子の部位への結合を妨げる新規因子が発見され得る。
【０２００】
さらに、ＧＴＰａｓｅは阻害しないがＥＦ−Ｇの放出を妨害し、そして結合したままで発生ポリペプチド鎖の伸長を妨害することによって翻訳をブロックする伸長因子に結合する化合物（例えば、ＥＦ−Ｇに結合するフシジン酸）が存在する。Ｌａｕｒｂｅｒｇ Ｍ，Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎ Ｏ，Ｍａｒｔｅｍｙａｎｏｖ Ｋ，Ｇｕｄｋｏｖ ＡＴ，Ｎａｇａｅｖ Ｉ，Ｈｕｇｈｅｓ Ｄ，Ｌｉｌｊａｓ Ａ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａ ｍｕｔａｎｔ ＥＦ−Ｇ ｒｅｖｅａｌｓ ｄｏｍａｉｎ ＩＩＩ ａｎｄ ｐｏｓｓｉｂｌｙ ｔｈｅ ｆｕｓｉｄｉｃ ａｃｉｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．Ｎｏｖ ３；３０３（４）：５９３−６０３（２０００）（１ＦＮＭ；１４５３２）。これらの化合物はまた、７０Ｓ ５．５Å構造にドッキングされて、ＥＦ−Ｇ放出を阻害するフシジン酸と類似の様式で作用する他の分子を設計し得る。
【０２０１】
さらなる他のクラスの因子が、ファルマコフォアまたは候補化合物設計のために、７０Ｓ ５．５Å構造にドッキングされ得る。例えば、ＧＴＰａｓｅ関連薬物「キロマイシン（ｋｉｒｒｏｍｙｃｉｎ）」は、ＥＦ−Ｔｕに結合し、そしてＥＦ−Ｔｕがリボソームから放出され、そしてｔＲＮＡを放出するコンフォメーション変化を妨害する。
【０２０２】
【表６】

【０２０３】
【表７】

【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、５．５Åの解像度における、７０ＳリボソームのＰ部位に結合したｔＲＮＡ^Ｍｅｔ _ｆの電子密度を示す図である。
【図２】
図２は、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ７０Ｓリボソームの構造の図である。Ａ、Ｂ、ＣおよびＤは、垂直軸の回りの連続的な９０゜回転であり；Ｅは、Ａに示される図の平行軸の回りの９０°回転である。（Ａ）３０Ｓサブユニットの後からの図。Ｈ、ヘッド；Ｐ、プラットホーム；Ｎ、ネック；Ｂ、ボディ。（Ｂ）右手側からの図であって、サブユニットインターフェースキャビティを示し、３０Ｓサブユニットは左にあり、そして５０Ｓサブユニットは右にある。Ａ−ｔＲＮＡ（金）のアンチコドンアームは、インターフェースキャビティ中に見える。（Ｃ）５０Ｓサブユニットの後ろからの図。ＥＣポリペプチド出口チャンネルの末端。（Ｄ）左手側からの図であって、５０Ｓサブユニットは左にあり、そして３０Ｓサブユニットは右にある。Ｅ−ｔＲＮＡ（赤）のアンチコドンアームが部分的に見える。（Ｅ）上からの図であって、５０Ｓサブユニットが上にあり、そして３０Ｓサブユニットは下にある。Ｅ−、Ｐ−およびＡ−ｔＲＮＡは、インターフェースキャビティにあり、それらのアンチコドンアームは、３０Ｓサブユニット中に下方向を指している。（Ｆ）３０Ｓサブユニットのインターフェースの図（Ａから１８０゜回転）であって、３つのｔＲＮＡの位置を示す。（Ｇ）５０Ｓサブユニットのインターフェース図。ＡＳＦ、Ａ−部位フィンガー、ＳＲＬ、サルシン−リシンループ。異なる分子成分を識別のために着色している：シアン、１６ＳｒＲＮＡ；グレー、２３ＳｒＲＮＡ；ライトブルー、５ＳｒＲＮＡ（５Ｓ）；ダークブルー、３０Ｓタンパク質；マジェンタ、５０Ｓタンパク質。電子密度に適合するタンパク質はオレンジで番号付けた；電子密度は識別されたが適合しなかった５０Ｓタンパク質はマジェンタで番号付けた。Ａ、Ｐ、Ｅ、Ａ−、Ｐ−およびＥ−部位ｒＲＮＡ（それぞれ、金、オレンジおよび赤）。
【図３】
図３は、１６Ｓ、２３Ｓおよび５ＳｒＲＮＡの二次および三次構造を示す図である。（Ａ）Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ１６ＳｒＲＮＡの二次構造、その５’、中央、３’−メジャーおよび３’−マイナードメインをブルー、マジェンタ、赤および黄色でそれぞれ陰影をつけた。（Ｂ）Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ２３Ｓおよび５ＳｒＲＮＡの二次構造の図であって、２３ＳｒＲＮＡのドメインＩ（ブルー）、ＩＩ（シアン）、ＩＩＩ（グリーン）、ＩＶ（黄色）、Ｖ（赤）およびＶＩ（マジェンタ）を示す。ｒＲＮＡは、Ｅ．ｃｏｌｉ（７５）に従って番号付ける。（Ｃ）７０Ｓリボソーム中の１６ＳｒＲＮＡの三次元折り畳みであって、そのドメインは、（Ａ）中のように着色される。（Ｄ）２３Ｓおよび５ＳｒＲＮＡの三次元折り畳みであって、それらのドメインは（Ｂ）におけるように着色される。
【図４】
図４は、７０Ｓリボソーム中のｒＲＮＡと、３０Ｓおよび５０Ｓサブユニットとの間の立体構造の差異を示す図である。（Ａ）Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ３０Ｓサブユニット（１５）および７０Ｓリボソームからの１６ＳｒＲＮＡ中の差異．Ｒｍｓｄ差異を、黄色（＞１０Å）、オレンジ（５．５Å＞ｒｍｓｄ＞１０Å）、赤（３．５Å＞ｒｍｓｄ＞５．５Å）およびブルー（ｒｍｓｄ＜３．５Å）で着色する。Ｈ、ヘッド；ＰＳ、最後から２番目のステム；ＳＰ、突起。（Ｂ）３０Ｓサブユニット（（１５）；赤）および７０Ｓリボソーム（ブルー）からの１６ＳｒＲＮＡのスーパーインポウズ構造を示す立体図である。（Ｃ、Ｄ）Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ５０Ｓサブユニット（１４）とＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ７０Ｓリボソームとの間の差異を示す、２３ＳｒＲＮＡの前面図および後面図である。黄色、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ５０Ｓ構造中で不規則であった特徴；シアン、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ構造に特異的である特徴；白、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ構造に特異的な特徴。残りの領域中の立体構造の差異は、オレンジ（ｒｍｓｄ＞５．５Å）および赤（３．５Å＜ｒｍｓｄ＜５．５Å）で着色される。Ｈａｌｏａｒｃｕｌａ特異的特徴のヌクレオチド番号は、Ｈによって先行され；残りの番号は、Ｅ．ｃｏｌｉ番号付けに従う。（Ｅ）Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（ライトブルー）およびＨ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ（赤）中の２３ＳｒＲＮＡのドメインＩＩＩの頂端ステム領域間の立体構造の差異。Ｈ１４９５は、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ中のＴ１４９５に対応する、古細菌配列中の頂端ヌクレオチドを示す（古細菌番号付けを用いて、ヌクレオチド１５９７）。（Ｆ）タンパク質Ｌ９の、結晶中の別のリボソーム中の３０Ｓサブユニットとの結晶パッキング相互作用を示す、５．５Å電子密度の立体図である。位置Ｇｌｙ８４（Ｇ８４）の周りのＬ９のＣ−ドメインと、アデノシン５５（Ａ５５）の周りの別のリボソームの１６ＳｒＲＮＡとの接触、およびＬｙｓ１２（Ｋ１２）の周りのＬ９のＮ−ドメインとグアニン４９３（Ｇ４９３）の周りの１６ＳｒＲＮＡとの間の接触が示される。黄色で示されるのは、ファージＴ４遺伝子６０ｍＲＮＡ上のリボソームの「ホッピング」を刺激する、Ｌ９中の変異である。Ｌ９の骨格は赤で示され、１６ＳｒＲＮＡはマジェンタで示され、そしてヘリックス５（Ｌ９のＣ−ドメインとの主要な接触）は、シアンで強調される。
【図５】
図５は、サブユニット間接触（赤）に関与する特徴を示す、１６Ｓおよび２３ＳｒＲＮＡの二次構造を示す図である。（Ｂ、Ｃ）５０Ｓおよび３０Ｓサブユニットのインターフェースの図であって、ブリッジを番号付けている（Ｆｒａｎｋら、１９９５ａ；Ｃａｔｅら、１９９９）。ＲＮＡ−ＲＮＡ接触を赤（１６ＳｒＲＮＡ）およびマジェンタ（２３ＳｒＲＮＡ）で示す；タンパク質−ＲＮＡおよびタンパク質−タンパク質接触を、黄およびピンクで示す。Ａ、ＰおよびＥは、３つのｒＲＮＡを示す。（Ｄ−Ｇ）（Ｄ）図２Ｂ、（Ｅ）図２Ｃ、（Ｆ）図２Ｄ；（Ｇ）図２Ｄの水平軸の回りに９０゜回転におけるように見られる、ブリッジ相互作用の詳細な立体図であり。
【図６】
図６は、ｒＲＮＡ−リボソーム相互作用を示す図である。（Ａ）７０Ｓリボソーム中のそれらの各ｍＲＮＡコドンと複合体化した、Ｐ−ｔＲＮＡ（左；５．５Å）およびＡ−ｒＲＮＡ（右；７Å）の電子密度マップを示す図である。（Ｂ）コドン−アンチコドン相互作用およびＡコドンとＰコドン間のねじれを示す、Ａ−、Ｐ−およびＥ−ｔＲＮＡ（それぞれ、金、オレンジ、および赤）の相対的配向を示す図である。（Ｃ、Ｄ）３０ＳサブユニットＰ部位中のそのコドンに結合したＰ−ｔＲＮＡアンチコドンステム−ループの２つの図である。（Ｅ）Ｐ−ｔＲＮＡのＤステム、エルボーおよびアクセプターと、５０Ｓサブユニット間の相互作用。（Ｆ）５．５Åにおける、脱アシル化ｔＲＮＡ Ｍｅｔ ｆと複合体化したＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ７０Ｓリボソームに対する実験的電子密度であり、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉＣＣｄＡｐ−ピューロマイシン遷移状態アナログ構造モデルをスーパーインポウズしている。（Ｇ）５．５Åで計算された、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ５０Ｓサブユニット（３）の対応する領域に対する電子密度（赤）。２３ＳｒＲＮＡ（３）のアナログおよび周囲部分の構造が示される。（Ｈ、Ｉ）３０ＳサブユニットＡ部位中のそのコドンに結合したＡ−ｔＲＮＡアンチコドンステム−ループの２つの図である。（Ｊ）７ÅにおけるＡ−ｔＲＮＡに対するフーリエ差異マップであって、Ａ−ｔＲＮＡおよびＡ−コドンをスーパーインポウズしてある。塩基Ａ１４９２およびＡ１４９３の位置を、それらがパロモマイシン（１７）の存在下（赤）および不在下（マジェンタ）で見出されるので示している。負の密度（赤）のパッチが、Ａ１４９２およびＡ１４９３の位置の近傍に見出され得、それらが、Ｃａｒｔｅｒら（１７）により示唆されるように、Ａ−ｔＲＮＡが結合するとき、再配置され、コドン−アンチコドンヘリックスの副溝と相互作用し得ることを示す。（Ｋ）Ａ−ｔＲＮＡのＤステム、エルボーおよびアクセプター端部の５０Ｓサブユニットとの相互作用。（Ｌ）Ｌ１６の部分に対応し得る、Ａ−ｔＲＮＡエルボーと割り当てられていないｒタンパク質との間のクラッシュを示す電子密度。（Ｍ）Ｅ−ｔＲＮＡのリボソームとの相互作用。すべてのパネルにおいて、１６ＳｒＲＮＡはシアンで、２３ＳｒＲＮＡはグレーで、そしてリボソームタンパク質はブルー、グリーンおよびマジェンタで示される。ｔＲＮＡと接触するリボソームの部分は、金（Ａ−ｔＲＮＡ接触）、オレンジ（Ｐ−ｔＲＮＡ接触）または赤（Ｅ−ｔＲＮＡ接触）で着色される。ｒＲＮＡヘリックスは、図３Ａ、Ｂのように番号付けしてある。ｔＲＮＡ結合により化学的プローブから保護されているｔＲＮＡ中の塩基（２１、４５、５１）は球体で示されている。直接相互作用により保護されている塩基は、接触と同じ着色である；立体構造変化の結果として保護されている塩基は、マジェンタ、またはクラスＩＩＩ部位（７１）の場合グレーブルーで示されている。テキスト中で論議され、そして表ＩＶに列挙される、異なる特異的リボソーム接触は、小文字により示される。（Ｎ）Ａ−ｔＲＮＡ（金）、Ｐ−ｔＲＮＡ（オレンジ）およびＥ−ｔＲＮＡ（赤）と接触する分子を示す，１６Ｓおよび２３ＳｒＲＮＡの二次構造である。
【図７】
図７は、（Ａ）リボソーム中のＡ−、Ｐ−およびＥ−ｔＲＮＡならびにｍＲＮＡの相対的配置を示す図である。（Ｂ）翻訳サイクルのためのハイブリッド状態モデル（Ｍｏａｚｅｄら、１９８９ｂ）のアップデートバージョンの略図。（Ｃ）ハイブリッド状態サイクルを通るｔＲＮＡの動きの三次元図である。
【図８】
図８は、サブユニットインターフェースにおける、Ａ−およびＰ−ｔＲＮＡを取り囲むｒＲＮＡエレメントを示す図である。Ｅ−ｔＲＮＡのリボース７１の位置を赤の球体で示す。詳細はテキストを参照のこと。
【図９】
図９は、本研究で用いた３つのモデルｍＲＮＡのヌクレオチド配列を示す図である。Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列（Ｓ／Ｄ）、ならびにＰ−およびＡ−部位コドンに下線を引いてある。ＭＦ３６ｍＲＮＡ中の推定のＡ部位ヘリックスを形成する自己相補性配列の上に線を引いてある。
【図１０】
図１０は、（Ａ）ｍＲＮＡモデル（黄）が入った、ＭＫ２７ｍＲＮＡの７Åフーリエ差異マップであって、３０Ｓリボソームサブユニットの頂部から見た、Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列（Ｓ／Ｄ）ヘリックスの位置（マジェンタ）、およびＡ−およびＰ−部位コドン（それぞれオレンジおよび赤）の位置を示す図である。（Ｂ）ＭＦ３６ｍＲＮＡの差異マップであって、Ａ部位における特別の密度に適合した４塩基対テトラループヘリックス（Ａ部位ヘリックス）を示す図である。（Ｃ）（Ｂ）と同じ図である。但し、Ａ部位ｍＲＮＡヘリックスの代わりに、Ａ−ｔＲＮＡアンチコドンステム−ループ（緑）が、Ａ−ｔＲＮＡ差異マップ（Ｙｕｓｕｐｏｖら、２００１）中で実験的に観察された位置に示される。Ｓｈｉｎｅ Ｄａｌｇａｎｏの５ヌクレオチド（ＧＧＡＧＧ／ＣＣＵＣＣ）（配列番号ＸＸ）コア相互作用がマジェンタで示され、そして１６ＳｒＲＮＡテイルの残りがシアンで示される。
【図１１】
図１１は、３０Ｓリボソームサブユニット、Ａ、Ｐ、Ａ−部位およびＰ−部位コドン中のｍＲＮＡの（Ａ）インターフェースおよび（Ｂ）溶媒の図である。５’、３’５’および３’は、ｍＲＮＡモデルの位置−１５および＋１５に対応する。サブユニットのヘッド、プラットホーム、ショルダーおよびボディ、ならびにリボソームタンパク質Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５、Ｓ７、Ｓ１１、Ｓ１２およびＳ１８が示されている。リボソームタンパク質がダークブルーで示され，１６ＳｒＲＮＡがシアンで、そしてｍＲＮＡは図２におけるように着色される。
【図１２】
図１２は、（Ａ）ヘリックス２０、２８および３７（ｈ２０、ｈ２８、ｈ３７）、ならびに１６ＳｒＲＮＡの７２３ループ、ならびにタンパク質Ｓ１１およびＳ１８、ならびに上流トンネルを通るｍＲＮＡヌクレオチド−１〜−４の経路により形成される、その間隙中に結合したＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ（Ｓ／Ｄ）ヘリックスの溶媒−立体側面図である。ＭＶ３６ Ｆｏｕｒｉｅｒ差異マップが示される。（Ｂ）１６ＳｒＲＮＡ中の、Ａ−およびＰ−部位コドンならびにそれらの隣接ヌクレオチド（５３０、７９０、７９１、９２６、１４９２、１４９３および１４９８）の立体インターフェース図である。リボソームタンパク質Ｓ１２中の制限変異の位置を黄（ユニバーサルＰＮＳＡ配列）およびオレンジで示す。Ｇ９２６およびＵ１４９８に対する塩基の位置を、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ３０Ｓサブユニットの高解像度構造（Ｗｉｍｂｅｒｌｙら、２０００）からモデル化した。（Ｃ）（Ｂ）と同様の図である。しかし、Ａ−およびＰ−ｔＲＮＡ（それぞれオレンジおよび赤）が、それらの実験的に観察された位置に従って入っている（Ｙｕｓｕｐｏｖら、２００１）。
【図１３】
図１３は、（Ａ）ｍＲＮＡ位置＋７〜＋１０を取り囲む１６ＳｒＲＮＡ層の特徴を示す、下流トンネルの立体インターフェース図である。（Ｂ）タンパク質Ｓ３、Ｓ４およびＳ５によって、ｍＲＮＡの位置＋１１〜＋１５を取り囲むタンパク質層の形成を示す、下流トンネルの溶媒−立体側面図である。タンパク質Ｓ５の二本鎖ＲＮＡ結合ドメインをマジェンタで示す。ＭＫ２７差異マップが示される。
【図１４】
図１４は、７０Ｓリボソーム−ｍＲＮＡ−ｔＲＮＡ複合体（Ｙｕｓｕｐｏｖら、２００１）の結晶学的に４つの折り畳み軸を見下ろす図であって、隣接するリボソーム間のモデルｍＲＮＡのヘッド−テイル並置を示す（赤−オレンジ）。示される分子成分は、１６ＳｒＲＮＡ（シアン）、２３ＳｒＲＮＡ（グレー）、５ＳｒＲＮＡ（グレー−ブルー）、小サブユニットタンパク質（ダークブルー）、大サブユニットタンパク質（マジェンタ）、Ａ−、Ｐ−およびＥ−ｔＲＮＡ（黄、オレンジおよび赤）およびｍＲＮＡ（赤−オレンジ）である。
【図１５】
図１５は、１６ＳｒＲＮＡ上のＦｅ（ＩＩ）誘導体化ＩＦ３改変体の化学的フットープリンティングを示す図である。プライマー伸長は、３０Ｓサブユニット中の１６ＳｒＲＮＡ上の位置Ｇ７００およびＧ７０３におけるＩＦ３−ＨｉｓＴａｇ（野生型）およびＦｅ（ＩＩ）ＢＡＢＥ誘導体化ＩＦ３改変体のケトキサールフットプリントを示す。両方のパネルにおいて、ＡおよびＧは、配列決定レーンである。Ｋおよび３０Ｓと標識されたレーンは、それぞれ、非改変３０Ｓサブユニットおよびケトキサール改変３０Ｓサブユニットである。ＩＦ３は、ケトキサール改変３０Ｓ−ＩＦ３−Ｈｉｓ６複合体である。左のパネルにおいて、−ｃｙｓは、ケトキサール改変システインフリーＩＦ３−３０Ｓであり、そしてすべての他のレーンは、各レーンの頂部に示されるように、ケトキサール−改変ＮドメインＦｅ（ＩＩ）−ＩＦ３−３０Ｓ複合体である。右のパネルにおいて、すべの他のレーンは、示されるように、ケトキサールで処理されたＣ−ドメインＦｅ（ＩＩ）−ＩＦ３−３０Ｓ複合体である。
【図１６】
図１６は、１６ＳｒＲＮＡ上のＩＦ３のヒドロキシラジカルフットプリンティングの図である。（Ａ）３０Ｓサブユニット中の１６ＳｒＲＮＡ上のＩＦ３のヒドロキシラジカルフットプリントのプライマー伸長分析。左から右のレーンは以下の通りである：Ａ、Ｇは配列決定レーンである；Ｋ、非改変３０Ｓサブユニット；３０Ｓ、ヒドロキシラジカルに曝された３０Ｓサブユニット。次のレーンは、（標識されるように）ヒドロキシラジカルに曝された開始因子−３０Ｓ複合体である。各オートラジオグラムの右にある棒は保護の領域を示す。（Ｂ）１６ＳｒＲＮＡの二次構造上にマップされた遊離のヒドロキシルラジカルからの３０Ｓサブユニットおける１６ＳｒＲＮＡの１１７３−依存保護。示されたドットは、保護の程度の大きさを示す。
【図１７】
図１７は、ＩＦ３の表面上の異なる位置からの１６ＳｒＲＮＡの指向されたヒドロキシラジカルプロービングを示す図である。（Ａ）Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓからのＩＦ３のＮ−およびＣ−ドメインの結晶構造のリボンダイアグラムである（Ｂｉｏｕら、１９９５）。球体は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ中の対応する残基に従って番号付けた、Ｆｅ（ＩＩ）をつなぐために用いた操作されたシステイン残基のＣα位置を示す。（Ｂ）プライマー伸長分析により検出されたＦｅ（ＩＩ）−ＩＦ３からの、３０Ｓサブユニット中の１６ＳｒＲＮＡの指向されたヒドロキシルラジカル切断。ＡおよびＧは、配列決定レーンである。すべの他のレーンは、システインフリーのコントロール反応（−ｃｙｓ）を含む、示されたような、異なるＩＦ３位置につながれたＦｅ（ＩＩ）でプローブされた３０Ｓ−ＩＦ３複合体である。各オートラジオグラムの左のレーンは、１６ＳｒＲＮＡの配列を示す。各パネルの右にある棒は、ヒドロキシルラジカルによる切断の領域を示す。（Ｃ）３０Ｓサブユニットに結合したＦｅ（ＩＩ）−ＩＦ３からの１６ＳｒＲＮＡの（陰影をつけたグレー、左から時計周りに）、中央、３’−メジャー、および３’−マイナードメイン中のヒドロキシラジカル切断の位置の要約。強い、中程度、または弱いとして割り当てた切断の強さは、黒丸のサイズに比例する。
【図１８】
図１８は、ＩＦ３上の異なる位置からの開始剤ｔＲＮＡの指向されたヒドロキシルラジカルプロービングを示す図である。（Ａ）Ｆｅ（ＩＩ）ＩＦ３から生成されたヒドロキシラジカルによる切断を示す、５’−末端−標識されたｔＲＮＡＭｅｔｆのオートラジオグラフ。レーンは、ＩＦ３へのＦｅ（ＩＩ）−ＢＡＢＥの付着部位に従って標識されている。切断は、ゲルの右側で棒によって示されている。
【図１９】
図１９は、３０Ｓサブユニット上のＩＦ３の位置決めを示す図である。（Ａ）Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓからの３０Ｓサブユニットの結晶構造のリボンダイアグラム上にマップされたＩＦ３のヒドロキシルラジカルフットプリント。最も強い保護はマジェンタで着色され、そしてより弱い保護はより薄いピンクである。塩基特異的保護は、赤い球体として表される。（Ｂ）ＩＦ３のリボンダイウグラム（黄）は、３０Ｓサブユニットフットプリント上にドッキングした。Ｎ−およびＣ−ドメインは、それぞれ、ＮおよびＣと標識される。（Ｃ）指向されたヒドロキシルラジカルプロービングおよびヒドロキシルラジカルフットプリンティングにより決定したときの、３０ＳサブユニットとのＩＦ３の相互作用のモデル（黒リボン）。Ｆｅ（ＩＩ）−ＩＦ３により切断されたヌクレオチドは、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓリボソームの結晶構造からの３０Ｓサブユニット中の１６ＳｒＲＮＡのリボンダイアグラム上にマップされる（Ｙｕｓｕｐｏｖら、２００１）。リボソームタンパク質Ｓ７およびＳＩＩは、緑に着色され、そして１６ＳｒＲＮＡ骨格は、Ｆｅ（ＩＩ）誘導体化ＩＦ３により切断された場所を除き、白でトレースされる。プロービング位置９７および１３５から切断されたヌクレオチドは、ブルー（強いヒット）およびより薄いブルー（より弱いヒット）であり、その一方、Ｎ−ドメインプローブから切断されたヌクレオチドは、赤（強いヒット）およびより薄い赤（弱いヒット）で着色される。位置１０４からの切断は、金の陰影をつけてある。対応するプロービング位置は球体として表され、そしてそれらの個々の切断標的に一致するように着色されている。
【図２０】
図２０は、開始ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、およびＩＦ１に対するＩＦ３の位置の図である。（Ａ）Ｐ部位に結合した開始剤ｔＲＮＡをもつＩＦ３−３０Ｓモデル、および結晶構造により測定されたとき（Ｃａｒｔｅｒら、２００１）のＩＦ１の位置の図である。１６ＳｒＲＮＡおよび小サブユニットタンパク質は、それぞれ、薄いグレーおよび濃いグレーで陰影をつけた。ＩＦ３は、ＣＰＫ中に表され、そして赤に着色している。ＩＦ１は、ブルーの陰影を付けてある。開始ｔＲＮＡは黄でトレースされ、そしてｍＲＮＡは紫に着色してある。（Ｂ）指向されたプロービング実験からの切断を示す、ＩＦ３およびＰ部位結合開始ｔＲＮＡの拡大図。開始ｔＲＮＡは、Ｆｅ−Ｃ１３５（緑）およびＦｅ−Ｃ７６およびＦｅ−Ｃ８０（ブルー）による切断を除き、黄に着色してある。対応するプロービング位置は、ＩＦ３（グレー）上に同様に着色してある。ｍＲＮＡは、紫で表されている。
【図２１】
図２１は、ＩＦ３Ｃ−ドメインが、２３ＳｒＲＮＡのヘリックス６９の位置を占める図である。（Ａ）１６ＳｒＲＮＡのヘリックス２３、２４、および４５（ブルー）との、２３ＳｒＲＮＡのヘリックスｒＲＮＡのヘリックス６９（黄）の相互作用の図である。２３ＳｒＲＮＡと１６ＳｒＲＮＡとの間の接触の部位を紫で着色してある。（Ｂ）ＩＦ３のＣドメインの３０Ｓサブユニット（赤）上の２３ＳｒＲＮＡのヘリックス６９（黄）と重複する結合部位を示す図。

Claims (53)

1. 細菌性７０Ｓリボソームまたはその部分に結合する化合物を同定する方法であって、該方法は、以下の工程：
   細菌性７０Ｓリボソームの三次元構造に基づいて、化合物を設計する工程であって、該三次元構造は、付録Ｉ内の構造座標によって規定される、工程；
   該化合物を提供する工程；
   該化合物を、該細菌性７０Ｓリボソームまたはその部分と接触させる工程；および
   該化合物が、該細菌性７０Ｓリボソームまたはその部分に結合するか否かを決定する工程、
   を包含する、方法。
2. 前記付録Ｉ内の構造座標のサブセットが、前記設計する工程のために使用される、請求項１に記載の方法。
3. 前記部分が、細菌性３０Ｓリボソームサブユニットである、請求項１に記載の方法。
4. 前記部分が、細菌性５０Ｓリボソームサブユニットである、請求項１に記載の方法。
5. 請求項１に記載の方法であって、前記化合物が、以下：Ｓ１３（配列番号３６）９２〜９４、２〜１１、Ｓ１５（配列番号３８）４０〜４４、８５〜８９、Ｌ２（配列番号２）１６２〜１６４、１７２〜１７４、１７７〜１７８、１９８〜２０２、Ｌ５（配列番号５）１３４〜１５３、Ｌ１４（配列番号１２）１１６〜１１９、Ｌ１９（配列番号１６）４４、１６Ｓ ｒＲＮＡ（配列番号４５）１４０８〜１４１０、１４９４、１４９５、７８４、７８５、７９４、１５１６〜１５１９、７７０、７７１、９００、９０１、７６３、７６４、６９８、７０２、７１２、７１３、７７３〜７７６、３４５〜３４７、２３Ｓ ｒＲＮＡ（配列番号２３）８８６〜８８８、１９１３〜１９１４、１９１８、１８３６〜１８３６、１９１９、１９２０、１９２２、１９３２、１８３２〜１８３３、１９４７〜１９４８、１９６０〜１９６１、１７６８〜１７６９、４４〜４９、１６８９〜１６９０、１９８９、１６８９、１６９０、１７０２〜１７０５、１８４８〜１８４９および１８９６、からなる群より選択される残基に対応する残基と非共有結合を形成するように設計され、ここで、該１６Ｓ ｒＲＮＡおよび該２３Ｓ ｒＲＮＡの残基番号は、Ｅ．ｃｏｌｉの番号付けに従う、方法。
6. 請求項５に記載の方法であって、前記残基が、Ｓ１３（配列番号３６）９２〜９４、２〜１１、Ｌ５（配列番号５）１３４〜１５３、１６Ｓ ｒＲＮＡ（配列番号４５）１４０８〜１４１０、１４９４、１４９５、２３Ｓ ｒＲＮＡ（配列番号２３）８８６〜８８８、１９１３〜１９１４および１９１８からなる群より選択され、ここで、該１６Ｓ ｒＲＮＡおよび該２３Ｓ ｒＲＮＡの残基番号は、Ｅ．ｃｏｌｉの番号付けに従う、方法。
7. 請求項１に記載の方法であって、該化合物が、以下：１６Ｓ ｒＲＮＡ（配列番号４５）１２２９、１３３８、１３３９、７９０、９６６、９２６、１４９８、１４００、５３０、１０４５、９５５、１４９３、１３３９〜１３４０、１３８２、９３７、７８８〜７８９、６９３〜６９５、Ｓ９（配列番号３２）１２８、Ｌ５（配列番号５）５５〜６６、Ｓ１３（配列番号３６）１２０〜１２２、Ｓ１２（配列番号３５）４６〜４８、Ｌ１６（配列番号１４）２７、３０、Ｓ７（配列番号３０）７６〜８７、１４０〜１５２、Ｌ１（配列番号１）１２４〜１２８、５２〜５４、１６５〜１６９、２３Ｓ ｒＲＮＡ（配列番号２３）１９０８、１９０９、１９２２、１９２３、２２５５〜２２５６、２２５２、２６０２、２５８５、１９１３〜１９１５、８８１〜８８３、８９８、８９９、２４７０〜２４７２、２４８２〜２４８４、１９４２、１９４３、２４５２、２４９４、２５５３、２１１２〜２１１３、２１１６、２１１７、１８５０〜１８５３、１８９２、２２３５、２４３３、２４３４および１９９からなる群より選択される残基に対応する残基と非共有結合を形成するように設計され、ここで、該１６Ｓ ｒＲＮＡおよび該２３Ｓ ｒＲＮＡの残基番号は、Ｅ．ｃｏｌｉの番号付けに従う、方法。
8. 請求項１に記載の方法であって、前記化合物が、以下：Ｓ３（配列番号２６）１２７〜１３２、１５６〜１６３、Ｓ４（配列番号２７）４７〜５２、Ｓ５（配列番号２８）９〜３０、４６〜５６、１６Ｓ ｒＲＮＡ（配列番号４５）１３〜１７、５２８〜５３２、１０５４〜１０５６、１１９４〜１１９７および１１９８からなる群より選択される残基に対応する残基と非共有結合を形成するように設計され、ここで、該１６Ｓ ｒＲＮＡの残基番号は、Ｅ．ｃｏｌｉの番号付けに従う、方法。
9. 請求項１に記載の方法であって、前記化合物が、以下：１６Ｓ ｒＲＮＡ（配列番号４５）６８５〜７０５、７８３〜７９５、７９９〜８０２および８０３からなる群より選択される残基に対応する残基と非共有結合を形成するように設計され、ここで、該１６Ｓ ｒＲＮＡの残基番号は、Ｅ．ｃｏｌｉの番号付けに従う、方法。
10. 請求項１に記載の方法であって、前記化合物が、以下：Ｌ１１（配列番号１０）２０〜３６、１６Ｓ ｒＲＮＡ（配列番号４５）５４〜５７、３５７〜３６１ならびに２３Ｓ ｒＲＮＡ（配列番号２３）２６５１〜２６６４および２６６５からなる群より選択される残基に対応する残基と非共有結合を形成するように設計され、ここで、該１６Ｓ ｒＲＮＡおよび該２３Ｓ ｒＲＮＡの残基番号は、Ｅ．ｃｏｌｉの番号付けに従う、方法。
11. 請求項１に記載の方法であって、前記化合物が、以下：Ｌ１１（配列番号１０）２０〜３６、１６Ｓ ｒＲＮＡ（配列番号４５）５４〜５７、３４０〜３４５、３５７〜３６１ならびに２３Ｓ ｒＲＮＡ（配列番号２３）１０６５〜１０６９、１０９４〜１０９７、２６５１〜２６６４および２６６５からなる群より選択される残基に対応する残基と非共有結合を形成するように設計され、ここで、該１６Ｓ ｒＲＮＡおよび該２３Ｓ ｒＲＮＡの残基番号は、Ｅ．ｃｏｌｉの番号付けに従う、方法。
12. 請求項１に記載の方法であって、前記化合物が、シャイン・ダルガルノヘリックス結合ポケットを満たす残基と非共有結合を形成するように設計され、該残基は、Ｓ１１（配列番号３４）８５〜９０、１１２〜１２９、２２〜２７、Ｓ１８（配列番号４１）１〜２４ならびに１６Ｓ ｒＲＮＡ（配列番号４５）９２７〜９３１、１３８８〜１３９３、１５２６〜１５２９、１５０５〜１５０８、７１９〜７２３および７２４からなる群より選択される残基に対応し、ここで、該１６Ｓ ｒＲＮＡの残基番号は、Ｅ．ｃｏｌｉの番号付けに従う、方法。
13. 前記化合物が新規に設計される、請求項１に記載の方法。
14. 前記化合物が既知の化合物から設計される、請求項１に記載の方法。
15. 前記既知の化合物が、抗生物質、開始因子および伸長因子からなる群より選択される、請求項１４に記載の方法。
16. 前記抗生物質が、パラモマイシン、プロマイシン、ストレプトマイシン、ネオマイシン、チオストレプトン、ミクロコッシン、フシジン酸、キロマイシン、クロラムフェニコール、クリンダマイシン、エリスロマイシン、クラリスロマイシンおよびロキシスロマイシンからなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
17. 前記開始因子が、ＩＦ１、ＩＦ２およびＩＦ３からなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
18. 前記伸長因子が、ＥＦ−ＴｕおよびＥＦ−Ｇからなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
19. 前記設計された化合物がタンパク質翻訳を阻害するか否かを決定する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
20. 前記設計された化合物がタンパク質翻訳の忠実度を変更するか否かを決定する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
21. 前記設計された化合物が３０Ｓリボソームサブユニットと５０Ｓリボソームサブユニットとの間の会合に影響するか否かを決定する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
22. 前記設計された化合物が、リボソームｔＲＮＡ結合部位に対するｔＲＮＡの結合に影響するか否かを決定する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
23. 前記設計された化合物が、リボソームｍＲＮＡ結合部位に対するｍＲＮＡの結合に影響するか否かを決定する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
24. 前記設計された化合物が、リボソームＩＦ３結合部位に対するＩＦ３の結合に影響するか否かを決定する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
25. 前記設計された化合物が、リボソームＥＦ−Ｔｕリボソーム結合部位に対するＥＦ−Ｔｕの結合に影響するか否かを決定する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
26. 前記設計された化合物が、リボソームＥＦ−Ｇリボソーム結合部位に対するＥＦ−Ｇの結合に影響するか否かを決定する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
27. 細菌性７０Ｓリボソームまたはその部分に結合する化合物を同定する方法であって、該方法は、以下の工程：
    細菌性７０Ｓリボソームの構造座標の決定のために、少なくとも５．５Åの解像度までＸ線を回折する、細菌性７０Ｓリボソーム結晶の三次元構造を規定する構造座標のセットを獲得する工程であって、該細菌性７０Ｓリボソームは、配列番号２３の残基１〜２９１６を有する２３Ｓ ｒＲＮＡ、配列番号２４の残基１〜１２３を有する５Ｓ ｒＲＮＡおよび配列番号４５の残基１〜１５２２を有する１６Ｓ ｒＲＮＡを含み、ここで該結晶は、ａ＝ｂ＝５０７．２Åおよびｃ＝８０３．７Åのユニットセル寸法を有するＩ４２２の空間群を有する、工程；
    該結晶から獲得された該構造座標に基づいて化合物を設計する工程；
    該化合物を提供する工程；
    該化合物を、該７０Ｓリボソームまたはその部分と接触させる工程；および
    該化合物が、該細菌性７０Ｓリボソームまたはその部分に結合するか否かを決定する工程、
    を包含する、方法。
28. 前記結晶から獲得される前記構造座標のサブセットが、前記設計する工程のために使用される、請求項２７に記載の方法。
29. 前記部分が、細菌性３０Ｓリボソームサブユニットである、請求項２７に記載の方法。
30. 前記部分が、細菌性５０Ｓリボソームサブユニットである、請求項２７に記載の方法。
31. 前記化合物が新規に設計される、請求項２７に記載の方法。
32. 前記化合物が既知の化合物から設計される、請求項２７に記載の方法。
33. 前記既知の化合物が、抗生物質、開始因子および伸長因子からなる群より選択される、請求項３２に記載の方法。
34. 前記抗生物質が、パラモマイシン、プロマイシン、ストレプトマイシン、ネオマイシン、チオストレプトン、ミクロコッシン、フシジン酸、キロマイシン、クロラムフェニコール、クリンダマイシン、エリスロマイシン、クラリスロマイシンおよびロキシスロマイシンからなる群より選択される、請求項３３に記載の方法。
35. 前記開始因子が、ＩＦ１、ＩＦ２およびＩＦ３からなる群より選択される、請求項３３に記載の方法。
36. 前記伸長因子が、ＥＦ−ＴｕおよびＥＦ−Ｇからなる群より選択される、請求項３３に記載の方法。
37. 前記設計された化合物がタンパク質翻訳を阻害するか否かを決定する工程をさらに包含する、請求項２７に記載の方法。
38. 前記設計された化合物がタンパク質翻訳の忠実度を変更するか否かを決定する工程をさらに包含する、請求項２７に記載の方法。
39. 前記設計された化合物が３０Ｓリボソームサブユニットと５０Ｓリボソームサブユニットとの間の会合に影響するか否かを決定する工程をさらに包含する、請求項２７に記載の方法。
40. 前記設計された化合物が、リボソームｔＲＮＡ結合部位に対するｔＲＮＡの結合に影響するか否かを決定する工程をさらに包含する、請求項２７に記載の方法。
41. 前記設計された化合物が、リボソームｍＲＮＡ結合部位に対するｍＲＮＡの結合に影響するか否かを決定する工程をさらに包含する、請求項２７に記載の方法。
42. 前記設計された化合物が、リボソームＩＦ３結合部位に対するＩＦ３の結合に影響するか否かを決定する工程をさらに包含する、請求項２７に記載の方法。
43. 前記設計された化合物が、リボソームＥＦ−Ｔｕリボソーム結合部位に対するＥＦ−Ｔｕの結合に影響するか否かを決定する工程をさらに包含する、請求項２７に記載の方法。
44. 前記設計された化合物が、リボソームＥＦ−Ｇリボソーム結合部位に対するＥＦ−Ｇの結合に影響するか否かを決定する工程をさらに包含する、請求項２７に記載の方法。
45. コンピュータシステムであって、以下：
    細菌性７０Ｓリボソームの少なくとも一部を規定するＸ線結晶学的構造座標を含むメモリであって、該構造座標は、少なくとも５．５Åの解像度までＸ線を回折する細菌性７０Ｓリボソームの結晶から決定され、そしてａ＝ｂ＝５０７．２Åおよびｃ＝８０３．７Åのユニットセル寸法を有するＩ４２２の空間群を有する、メモリ；および
    該メモリと電気的に連絡したプロセッサであって、該プロセッサは、該細菌性７０Ｓリボソームの少なくとも一部の三次元形状表示を有する分子モデルを作成する、プロセッサ、
    を備える、コンピュータシステム。
46. 前記分子モデルが、前記細菌性７０Ｓリボソームの少なくとも一部の、三次元の溶媒接近可能な表面の表示を含む、請求項４５に記載のシステム。
47. 前記分子モデルが、３０Ｓサブユニットと５０Ｓサブユニットとの間の界面の少なくとも一部の表示である、請求項４５に記載のシステム。
48. 前記分子モデルが、ｍＲＮＡ結合部位、ｔＲＮＡ結合部位、開始因子結合部位、伸長因子結合部位および抗生物質結合部位からなる群より選択される結合部位の表示である、請求項４５に記載のシステム。
49. 前記結合部位が、ｍＲＮＡ結合部位である、請求項４８に記載のシステム。
50. 前記結合部位が、ｔＲＮＡ結合部位である、請求項４８に記載のシステム。
51. 前記結合部位が、開始因子結合部位である、請求項４８に記載のシステム。
52. 前記結合部位が、伸長因子結合部位である、請求項４８に記載のシステム。
53. 前記結合部位が、抗生物質結合部位である、請求項４８に記載のシステム。

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