JP2004531225A - ペプチド、蛋白質及び疑似ペプチド合成のための方法及び組成物 - Google Patents

Abstract

本発明は、翻訳因子ＥＦ−Ｐ、Ｗ、Ｗ２又はレスキューの添加を必要としない、単純化され、高度に精製された前進型の翻訳系である。新規の翻訳プロセスが現在のところ別経路で合成されている全てのペプチド、蛋白質及び疑似ペプチドに新規で改良された経路を提供する。

Description

【技術分野】
【０００１】
本発明は、翻訳因子ＥＦ−Ｐ、Ｗ、Ｗ２又はレスキュー（ｒｅｓｃｕｅ）の添加を必要としない単純化され、高度に精製された前進的な翻訳系に関する。
【背景技術】
【０００２】
リガンドの認識及び結合は、免疫認識、細胞シグナリング、細胞連絡、転写、翻訳、細胞内シグナリング及び触媒反応、即ち酵素反応のようなほとんど全ての生物学的プロセスを調節する。ホルモン、増殖因子及び神経伝達物質のようなアゴニストとして作用し又はリガンド活性を作動若しくは拮抗させることができる天然又は非天然のリガンド分子（このものは、Ｂ細胞（抗体仲介）免疫又はＴ細胞（細胞仲介）免疫を誘導し、化学反応を触媒でき、或いは遺伝子発現を転写又は翻訳レベルで調節できる）を同定及び合成するための技術には、長年にわたって関心が寄せられている。このようなリガンドの大部分は、蛋白質、ペプチド及び疑似ペプチド（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）である。
【０００３】
リガンド及び薬剤発見への伝統的なアプローチは、運と激務の混ぜ合わせに大きく依存している。動物及び植物組織からの天然産物又は発酵培養基の産物をスクリーニングすること、或いは保管された合成分子を無作為スクリーニングすることが新規のリード化合物を同定するために最も生産的な手段であった。
【０００４】
しかしながら、新薬の探索における最近の動向は、新薬発見に関して可能性のある新規のリード化合物源としてのコンビナトリアル・ライブラリーを調製することに集中している。「コンビナトリアル・ケミストリー」というこの新しい分野の核心は、非生合成又は生合成のいずれかで調製でき且つ生物活性ごとに様々な形式でスクリーニングできる異なった分子を集めることである。非生合成技術、例えば、コード化、空間的アドレッシング及び／又はデコンボリューションの使用によって、ペプチド、疑似ペプチド及び非ペプチドベースの分子のコンビナトリアル・ライブラリーがバッチプロセスで合成でき、そして重要なことに、このライブラリーの個々の要素の分子同一性は、薬剤スクリーニング形式で確認できる（例えば、「Ｌａｍ他（１９９３）Ｇｅｎｅ １３７，１３−１６」、Ｄｏｏｌｅｙ他（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６，２０１９−２０２２）。非生合成ライブラリーは、生物学的単量体（例えば天然のアミノ酸及びヌクレオチド）及びそれらの誘導体に制限されないという利点を有するが、このライブラリーは、数週間のうちにスクリーニングできる分子の数が制限されるという不利点を有する（通常せいぜい１０⁵〜１０⁸個であり、これは、対象の標的に対して高い親和性のリガンドを同定するには小数すぎる分子である）（「Ｒｏｂｅｒｔｓ（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．３，２６８−２７３」、「Ｗｉｌｓｏｎ他（２００１）ＰＮＡＳ９８，３７５０−３７５５」）。しかしながら、生合成ライブラリーは、多くの場合この制限をほとんど受けない。なぜならば、１０¹⁵個の異なるペプチド、ＲＮＡ又はＤＮＡ分子を数週間のうちにスクリーニングできるというこのようなライブラリーの例が存在するからである（Ｒｏｂｅｒｔｓ，上記）。これは、個々の生合成ライブラリー要素を、多くの場合時として定向進化と呼ばれるダーウィンの進化論に類似したプロセスである関連した突然変異誘発段階（例えば、親和性成熟、突然変異誘発ＰＣＲ又はＤＮＡシャフリング（Ｒｏｂｅｒｔｓ，上記））でもって反復選択し且つ増幅させることによって達成される。
【０００５】
部分的に又は完全に無作為化されたプールからの蛋白質の単離を可能にした従来の方法の多くは、そのような in vivo 段階によるものであった。この種の方法には、モノクローナル抗体技術（「Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｓｃｉ．Ａｍｅｒ．２４３：６６（１９８０）」及び「Ｓｃｈｕｌｔｚ他，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｅｎｇｎｇ．Ｎｅｗｓ ６８：２６（１９９０）」）、ファージディスプレイ（「Ｓｍｉｔｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１３１５（１９８５）」、「Ｐａｒｍｌｅｙ及びＳｍｉｔｈ，Ｇｅｎｅ ７３：３０５（１９８８）」並びに「ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ他，Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２（１９９０）」）、ペプチド・ｌａｃリプレッサー融合（Ｃｕｌｌ他、ＰＮＡＳ ８９：１８６５（１９９２））及び古典的な遺伝学的選択が含まれる。これらの方法のそれぞれは、蛋白質と核酸の間のトポロジカルな結合に依拠する。なぜならば、核酸しか複製できないからである。しかして、蛋白質の情報は保持され且つ読み込み可能な核酸の形で回収できる。
【０００６】
他の蛋白質選択技術は、in vivo 段階なしに実施される。多くの場合リボソームディスプレイと呼ばれる失速翻訳法は、リボソーム及びｍＲＮＡとさらに複合体を形成する新生蛋白質鎖のいくらかの特性ごとに選択を行う技術である（「川崎，米国特許第５６５８７５４号」、「Ｔｕｅｒｋ及びＧｏｌｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：５０５（１９９０）」、「Ｉｒｖｉｎｅ他，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３７９（１９９１）」、「Ｋｏｒｍａｎ他，ＰＮＡＳ ７９：１８４４−１８４８（１９８２）」、「Ｍａｔｔｈｅａｋｉｓ他，ＰＮＡＳ ９１：９０２２−９０２６（１９９４）」、「Ｍａｔｔｈｅａｋｉｓ他，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６７：１９５（１９９６）」並びに「Ｈａｎｅｓ及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，ＰＮＡＳ ９４：４９３７（１９９７）」）。ｍＲＮＡ・蛋白質融合法又はｍＲＮＡディスプレイ法（「根本他、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４１４，４０５−４０８（１９９７）」、「柳川他，米国特許第６２２８９９４号」、「Ｓｚｏｓｔａｋ他，米国特許第６２８１３４４号、同６２６１８０４号、同６２５８５５８号、同６２１４５５３号及び同６２０７４４６号」並びに「Ｒｏｂｅｒｔｓ及びＳｚｏｓｔａｋ，ＰＮＡＳ ９４，１２２９７−１２３０２（１９９７）」）は、ｍＲＮＡをＤＮＡ／プロマイシンリンカーによってその蛋白質産物に直接共有結合させる。終止コドンの存在によっては損なわれない「裸の」ｍＲＮＡ・ペプチド融合体を合成させるための方法は、ペプチドをミセルの状態でそれらのペプチドをリボソームから分離させ、次いでそれらの特異的ｍＲＮＡに再結合できるような方法でもって合成させることである（例えば、ストレプトアビジン配列を含む蛋白質は、ビオチニル化ｍＲＮＡに結合するであろう。土井及び柳川（１９９９）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４７５，２２７−２３０）。
【０００７】
しかしながら、この先行技術の「天然」（Ｌ−）ペプチドライブラリー技術は、多くの不都合がある。第１に、ほぼ完全にキラルな単量体（アミノ酸）からなるこのライブラリーは、このキラル単量体の鏡像異性体を欠失している。例えば、Ｌ−ペプチドライブラリーについて、この２０種の天然型アミノ酸は、幅広い立体性、電子性及び官能性の基を与えるが、Ｃ−α炭素のキラリティーは、先行技術のディスプレイ技術によって達成できる三次元形状の空間を事実上制限する。また、Ｌ−ペプチドライブラリーは、標的物との非共有結合又は共有結合複合体を形成させるのに有用であり得る多数の一般的な有機化学官能基も欠失しており（例えば、アルケン、アルキル尿素、ハロゲン化アルキル及びケトン）、しかも「非天然」アミノ酸（予め合成されたものか又は理論上のものかのいずれか）で達成できる非常に大きい付加形状の多様性も欠如している。さらに、治療剤として、天然Ｌ−アミノ酸のペプチドは、通常それらの非天然鏡像異性体（Ｄ−ペプチド）又はアナログよりも好ましいわけではない。なぜならば、Ｌ−ペプチドは、in vivo プロセシングのため乏しい薬物動態学的プロファイルによって使用が制限され得るからである。例えば、Ｌ−ペプチドは、動物への投与後にプロテアーゼによって迅速に分解され得、しかしてより高い有効投与量を必要とする。さらに、薬用ペプチドは、患者の強力な免疫原性応答を誘導でき、さらにその迅速なクリアランスに寄与し、また有害であるかもしれない炎症反応も生じさせる。この薬用ペプチドの分解を回避するための一方法は、レトロインベルソアナログ（Ｓｉｓｔｏ他の米国特許第４５２２７５２号を参照）、レトロエナンチオアナログ（Ｇｏｉｓｓｉｓ他のＪ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ １９：１２８７−９０（１９７６）を参照）のような非加水分解性のペプチドアナログ、トランス−オレフィン誘導体（Ｓｈｕｅ他のＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２８：３２２５（１９８７）を参照）及びホスホネート誘導体（Ｌｏｏｔｓ他の「ケミストリーアンドバイオロジー」（エスコムサイエンス出版，ライデン，１９８８，ｐ１１８）の「ペプチド」を参照）を生成させることであった。しかしながら、多くの場合、ペプチドの主鎖は、蛋白質分解に耐性のある疑似ペプチドにするために変質される。このようにすると、得られた疑似ペプチドは、天然ペプチド主鎖と標的受容体との間のある種の結合性接触の欠如並びに二面角などの変化による該ペプチドに対する立体空間の変化によって生物活性が低下する欠点を有し得る。別の問題は、ほとんど全てのＬ−ペプチドがその親水性のために生体膜を横断しないことである。対照的に、Ｄ−ペプチド及びＮ−メチルアミノ酸のようなその他の非天然アミノ酸を含むペプチド（疑似ペプチド）はプロテアーゼ耐性を増大させ、そして疑似ペプチド薬のシクロスポリンＡは、膜を横断でき且つ経口的に利用できる。なぜならば、部分的にではあるが、このものは、天然のペプチド結合よりも疎水性であるいくつかのＮ−メチルペプチド結合を含有するからである（「Ｚａｗａｄｚｋｅ及びＢｅｒｇ（１９９２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ １１４：４００２」、Ｗａｌｓｈ他（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７，１３１１５−１３１１８）。残念ながら、Ｄ−ペプチドライブラリーのような化学的に合成された（非生合成の）疑似ペプチドライブラリー（Ｌａｍ他（上記）、Ｄｏｏｌｙ（上記））は上で論じたライブラリーサイズの制限を受け、鏡像ファージ又はリボソームディスプレイ（「Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ他（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７１，１８５４−１８５７」、「Ｅｃｋｅｒｔ他（１９９９）Ｃｅｌｌ ９９，１０３−１１５」及び「Ｆｏｒｓｔｅｒ他ＰＣＴ公開ＷＯ９７／３５１９４」）のような疑似ペプチドライブラリーのサイズ制限を克服するための方法論的策略は、鏡像異性体の標的物を化学的に合成するという厄介な必要条件によって制限される。
【０００８】
蛋白質、ペプチド及び疑似ペプチドは、一般に、３つの異なる方法で合成され、それぞれ固有の制限を有している。
【０００９】
１．合成ペプチド化学は、長さが約３０残基までの非常に多様な疑似ペプチドを高収率且つ高純度で合成するために日常的に使用され得る（Ｅｃｋｅｒｔ他，上記）。
しかしながら、この方法は、非効率的なカップリング段階、精製の問題及び折りたたみの困難性のためにより長い産物については非効率的又は非実用的である。また、所望の生成物の反応性側鎖の全てについて相溶性のある保護基が必要であるため、合成が制限される。さらに合成疑似ペプチドは、反復選択、増幅及び変異（進化）のために遺伝学的にコードされ得ず、合成疑似ペプチドライブラリーの複雑性を最適な薬剤発見には少なすぎる約１０⁸種の分子に制限させる。
【００１０】
２．生細胞を使用する in vitro 翻訳が、遺伝学的にコードされた天然又は組換えＤＮＡ配列からの短い又は長い蛋白質を効率的に合成し且つ翻訳後に修飾するために広く使用されている。
しかしながら、合成は、その遺伝子産物が有毒である場合には役に立たず、特にその蛋白質が封入体中で発現する場合には精製が困難であり得、しかも復元の問題もあり得る。最も重要なことには、この方法は、複数の非天然アミノ酸を選択的に取り込むことができない、或いは翻訳後修飾プロセス（例えば、プロテアーゼ触媒プロセシング又は分解）を制御することができない欠点がある。
【００１１】
３．粗製細胞抽出物による in vitro 翻訳は、一般に、毒性の問題を克服し（しかし、翻訳後修飾を制御しない）、より容易な精製及び折りたたみを生じさせることができ、しかも人工のサプレッサーｔＲＮＡを使用して蛋白質当たり１個の非天然アミノ酸の選択的な取り込みを可能にさせる（Ｎｏｒｅｎ他（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４，１８２−１８８）。
しかしながら、この方法による非天然アミノ酸の取り込みは、in vivo 系よりも収率が非常に低い難点がある。なぜならば、この方法は、終結因子と競合する本質的に非効率なサプレッサーｔＲＮＡに依存するからである。１００個以上の異なる非天然アミノ酸が個々に取り込まれたが（例えば、Ｍｅｎｄｅｌ他（１９９５）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．２４，４３５−４６２）、この戦略は、３種の終止（ナンセンス）コドンの一つ（ＵＡＧコドン）のみでの蛋白質当たり１個だけの非天然アミノ酸の選択的な取り込みに制限された。これは、２０種の異なるアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼのｔＲＮＡ結合活性及びプルーフリーディング活性によって触媒される天然アミノ酸によるアミノ酸（センス）コドンでの競合のため及びリボソームによるリードスルーのため第２の終止コドン（ＵＧＡ）を使用しようとする試みが失敗したためである（Ｃｌｏａｄ他（１９９６）Ｃｈｅｍ．ａｎｄ Ｂｉｏｌ．３，１０３３−１０３８）。
【００１２】
また、非天然アミノ酸をセンスコドンに一般的な態様で選択的に取り込もうとする多くの試みも失敗した。例えば、非天然型アミノ酸を取り込むために最も一般的に使用される方法では、天然アミノ酸の高比活性放射性同位元素誘導体を in vitro 翻訳によって取り込んで放射性標識された蛋白質を合成させる場合に、この放射性アミノ酸の比活性が、通常、粗製翻訳系に存在するアミノ酸の非標識型による取り込みのための競合によってこの非標識型を添加された非標識アミノ酸プールから与えないにもかかわらず減少することは周知である。プロメガ社によって、類似するアナログの希釈の結果が別のレポーター群であるビオチン標識リシンの取り込み用の市販キットを使用して得られている（Ｔｒａｓｃｅｎｄ（商標）非放射性翻訳系の付属文献）。さらに、粗製の翻訳抽出液を濾過して天然アミノ酸を除去し、次いでリシンを除く天然アミノ酸の全てを追加し且つアミノ酸アナログが付加されたリシンｔＲＮＡを追加すると、リシンアナログ対リシンがわずか１：３〜１：４の比で取り込まれた（Ｃｒｏｗｌｅｙ他（１９９３）Ｃｅｌｌ ７３，１１０１−１１１５）。アミノ酸アナログの取り込みの低い選択性は、ある種の用途には十分であるが（Ｒｏｔｈｓｃｈｉｌｄ他，米国特許第５６４３７２２号）、遺伝学的にコードされた特異的な疑似ペプチド配列の増幅及び特徴付けを必要とするような多くの用途には明らかに適さない。２種の異なるフレームシフトサプレッサーｔＲＮＡを使用して２種の異なる非天然アミノ酸を取り込めることが証明され（芳坂他（１９９９）ＪＡＣＳ １２１，１２１９４−１２１９５）、多くの同一の非天然アミノ酸がＰｈｅアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼに対して特異的な阻害剤を使用して取り込まれた（Ｂａｌｄｉｎｉ他（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７，７９５１−７９５９）。しかしながら、これらの方法の両方は、多くの異なる非天然アミノ酸を単一の疑似ペプチドに取り込むのに必要な態様には一般化できない。粗製及び in vivo 翻訳に固有のこれらの制限を克服するために、遺伝暗号を直交ｔＲＮＡ及び直交非天然核酸塩基対に基づいて拡張させるための綿密な戦略が提案されたが、単一の試験管内改変終止コドン（Ｂａｉｎ他（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ ３５６，５３７−５３９）を超える開発は、技術的に非常に困難であることが分かった（Ｓｅｒｖｉｃｅ（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８９，２３２−２３５）。
【００１３】
本発明者は、この問題が純粋な in vitro 翻訳系を使用して解決できるかもしれないと考えた。非天然アミノ酸と天然アミノ酸又は終結因子との間の競合は、ある種のアミノ酸、ｔＲＮＡ、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ及び／又は終結因子のようなある種の成分を除外することによって回避できたかもしれない。不運にも、ｍＲＮＡ依存性ポリペプチド合成のための最低限の必要条件は、含まれる高分子が非常に多いために定義するのが困難であった。精製された成分からの翻訳の再構成がＥ．ｃｏｌｉについて達成されたが、必要とされる翻訳因子の数は、いまだ議論の余地がある。
【００１４】
ワイスバッハ研究所によって構築された最初の精製翻訳系は、４種のＥ．ｃｏｌｉ ｍＲＮＡを、高度に塩洗浄されたリボソーム、開始因子（部分的なＩＦ−１依存性）、伸長因子Ｔｕ（ＥＦ−ＴｕＨ）及びアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの群に強く依存して、ｍｅｔ−ｔＲＮＡ_i ^fMetホルミルトランスフェラーゼ及び伸長因子Ｇ（ＥＦ−Ｇ）に部分的に依存して、伸長因子Ｔｓ（ＥＦ−Ｔｓ）又は終結因子に全く依存しないで効率的に翻訳した（Ｋｕｎｇ他（１９７８）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓ．１８７，４５７−４６３）。非常に多くの精製成分を維持し且つ微量の汚染物を除去する際の困難性のために、追加の一般的な翻訳因子についてのサーチは、ｆＭｅｔ−ｔＲＮＡ_i ^fMet及び１又は２種の伸長体アミノアシルｔＲＮＡによるジペプチド又はトリペプチドの合成へとこの系を単純化させることによって促進され、それによってアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼのための必要条件が回避された（Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ他（１９８４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ２，１６−２２））。
【００１５】
Ｇａｎｏｚａが率いる第２グループは、後者の単純化された方法を試験管内で付加された全ｔＲＮＡ及び終結因子を使用してより長いペプチドに拡大させたときに、バクテリオファージＭＳ２及びｆ１の翻訳がＥＦ−Ｐ、Ｗ及びレスキュー（ｒｅｓｃｕｅ）と呼ばれる３種の追加の因子に依存することを発見した（「Ｇｒｅｅｎ他（１９８５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ．１２６，７９２−７９８」、「Ｇａｎｏｚａ他（１９８５）ＰＮＡＳ ８２，１６４８−１６５２」）。これらの因子を存在させないと、連続移動性が非効率的になった。例えば、ヘキサペプチド合成反応ではジ、トリ、テトラ及びペンタペプチドの休止産物又は早期終結産物が支配的であった。ｄｅａＤ／Ｗ２（Ｗよりも数ｋＤ大きい）と呼ばれる恐らくは関連のある翻訳因子及びＥＦ−Ｐもクローン化され、これらのものは最大限の成長にとって必要であり、そして真核細胞の開始因子に相同的である（「青木他（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９，６２１５−６２２０」、「青木他（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，３２２５４−３２２５９」、「Ｌｕ他（１９９９）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３１，２１５−２２９」）。
【００１６】
Ｇａｎｏｚａの結果とは明らかに相反して、その他２つのグループが精製成分をＥＦ−Ｐ、Ｗ、Ｗ２又はレスキューを加えることなく使用してアミノアシルｔＲＮＡ基質から短いペプチドを合成することを報告したが、これら２つのグループは、それらの系の連続移動性又はそれらのリボソームの純度を直接記録していなかった（「Ｓｔａｄｅ他（１９９５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３，２３７１−２３８０」、「Ｐａｖｌｏｖ他（１９９７）ＥＭＢＯ Ｊ．１６，４１３４−４１４１」）。この矛盾が本当ならば、これは単に解釈に関して推測しているにすぎない。例えば、ＥＦ−Ｐ、Ｗ及びレスキューは、リボソーム調製物から精製できるため（Ｇａｎｏｚａ他（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ ７８，５１−６１）、Ｇａｎｏｚａのグループが使用したのとはかなり異なる手順によって調製された後者２つのグループが使用したリボソームは、ＥＦ−Ｐ、Ｗ、Ｗ２及び／又はレスキューで汚染されていた可能性がある。これは問題が多い。なぜならば、ＥＦ−Ｐ、Ｗ、Ｗ２及び／又はレスキューによる汚染は、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ及び終結因子のような、望ましくない反応の原因となり得るより多数の蛋白質による汚染を暗示しかねないからである。一方、ＥＦ−Ｐ、Ｗ、Ｗ２及び／又はレスキューは、Ｇａｎｏｚａの系では単に効率的な連続移動性のために必要とされ得るにすぎない。
【００１７】
可能ならば、ペプチド又は蛋白質を純粋な翻訳系によってＥＦ−Ｐ、Ｗ（多くの場合Ｗ２と呼ばれる）及びレスキューを添加することなく合成できることが望ましい。なぜならば、これらの蛋白質は、機能に関してあまりよく理解されておらず、結果的にそれらの活性を検査するのが困難となり、しかしてその前に活性な蛋白質を精製するのが困難になるからである。さらに、Ｗ（又はＷ２）の実際寸法及びＷとＷ２が同一蛋白質の誘導体に相当するのかどうかについての議論があり、また、レスキューについての遺伝子をさらにクローン化しなければならない。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明は、翻訳因子ＥＦ−Ｐ、Ｗ、Ｗ２又はレスキューの添加を必要としない単純化され、高度に精製された前進的な翻訳系である。新規な翻訳プロセスは、これまでのところ別経路によって合成されていた全てのペプチド及び蛋白質に新規でともすれば改善された経路を提供する。このプロセスは、蛋白質、ペプチド及び疑似ペプチド合成のために上記された方法１、２及び３に固有の制限を克服する。
【００１９】
ある好ましい具体例では、この精製された系は、インスリン、成長ホルモン又はエリスロポエチンのようなペプチド又は蛋白質リガンド又は触媒の合成のために使用できる。
【００２０】
別の好ましい具体例では、この精製系は、粗製の細胞抽出液に依存する既存のリボソーム及びｍＲＮＡディスプレイ系とは異なり、「純粋なリボソームディスプレイ」及び「純粋なｍＲＮＡディスプレイ」選択実験のために使用できる。ペプチドの翻訳後修飾の欠如が予期されること、しばしば蛋白質分解の問題を生じさせるプロテアーゼがないこと及び選択段階で汚染物による競合がないことのような、純粋系でペプチド及び蛋白質ディスプレイを実施することに関連するいくつかの利点がある。追加の利点として、以下のことが挙げられる。
（ｉ）リボヌクレアーゼが存在しないこと（本発明の純粋なＥ．ｃｏｌｉ系で測定された放射性ｍＲＮＡの長期間安定性によって立証される（結果は示さない））は、様々な粗製系、特にＥ．Ｃｏｌｉ（Ｒｏｂｅｒｔｓ，上記）で観察されるｍＲＮＡ分解に関わる問題を回避させる。ｍＲＮＡが翻訳及び選択され得る前に分解されないことは明らかに重要である。
（ii）純粋な再構成系は翻訳終結因子によって汚染されないことが予期される。実際に、本発明の系は、終結因子の添加によって刺激される。最も一般的な粗製ディスプレイ系を使用する研究者が未完成ペプチドの急速な放出を回避するために選択前又は選択前のｍＲＮＡ結合体への融合前にｍＲＮＡから終止コドンを除去することが必要であることを発見した（融合及び選択の両方は、緩慢なプロセスである）。この終止コドンの除去は、通常、個々のｍＲＮＡの場合には特別の突然変異誘発段階を必要とし、しかも特に全ての終止コドンを変異させることが不可能である天然ｍＲＮＡライブラリー又は合成コンビナトリアルライブラリーについては多くの問題がある。このライブラリーにおける終止コドンに関連する問題は、蛋白質の小さなサブドメインのライブラリー（このものは、全長の蛋白質を欠いており、十分に現れないカルボキシ末端ドメインを有し、正確に折りたたむ能力に対して多くの不適切な境界をコードし、しかも非天然のオープンリーディングフレームからの多数の配列を含有する）を無作為に生成させることによって、或いは終止コドンを含有する無作為ライブラリーの要素を選択することによって回避されてきた（それによって、合成反応及び多様性の大部分を浪費する。「Ｃｈｏ他（２０００）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９７，３０９−３１９」）。精製リボソーム及び精製ｍＲＮＡディスプレイ系では、ペプチジルｔＲＮＡが１日以上にわたってリボソームと安定に結合したままであることができる（翻訳が完了した後に、温度を低下させ及び／又は塩濃度を増加させる場合に安定していることが特に有利である（Ｓｃｈａｆｆｉｔｚｅｌ他（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３１，１１９−１３５））：リボソームは、ｔＲＮＡが与えられないセンスコドンで伸長を停止させるか（それによって終結因子との競合を完全に回避させる）又は終止コドンで停止させるか又は終止コドンを欠失したｍＲＮＡの末端で停止させるかのいずれかである。しかして、天然ｍＲＮＡからの全長翻訳産物のライブラリーが本発明により調製でき、そして、このような発現ライブラリーは、in vitro 選択に直接付され、或いはこれらのものは、特に、ハイブリダイゼーションによってゲノム及びプロテオミクス研究のためのＤＮＡマイクロチップに対応できる。
（iii）この純粋な再構成系は、終止コドンを欠失したｍＲＮＡから合成されたペプチドを分解させるｔｍＲＮＡ系によって汚染されないことが予期される。粗製系を使用する研究者がこのｔｍＲＮＡ系を阻害するように試みることが重要であることを発見した（Ｈａｎｅｓ及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ（１９９７）ＰＮＡＳ ９４，４９３７−４９４２）。
【００２１】
他の好ましい具体例では、本発明は、特定の疑似ペプチド（ペプチドアナログ）のｍＲＮＡ指令合成を一般的な態様でできるようにし、得られる疑似ペプチドの多様性及び長さを大いに増大させることができる。見込まれるものとしては、既存の疑似ペプチドリガンド及び疑似ペプチド薬（シクロスポリンＡのようなリボソームによらないで生合成されたリガンドを含めて）並びにそれらの誘導体が挙げられる。
【００２２】
他の具体例では、本発明は、in vitro 進化によって（例えば、上記の純粋なリボソームディスプレイ又は純粋なｍＲＮＡディスプレイを使用することによって）触媒、リガンド及び薬剤発見のために疑似ペプチド産物を遺伝学的にコードできるようにする。疑似ペプチドの特異的な合成は、既存の粗製リボソーム及びｍＲＮＡディスプレイの手法では不可能である。なぜならば、粗製翻訳系では、天然アミノ酸が非天然アミノ酸と取り込みのために競合するからである。
【００２３】
本発明は、所望の特性を有するペプチド及び疑似ペプチドの単離を容易にさせる。一つの具体例では、この方法は、標的分子のためのリガンドを同定することに関する。例として、標的分子にはペプチド、核酸、炭水化物及び非重合性分子、例えば、ステロイド、イノシトール、脂溶性ビタミン、テルペン、アセトゲニム、神経伝達物質又は遷移状態のアナログが含まれる。好ましい具体例では、標的分子は蛋白質である。蛋白質の標的は、例示すると、受容体、酵素、ＤＮＡ結合蛋白質又は蛋白質複合体又はスクリーニングできる活性を保持しているそれらの部分若しくはドメインであることができる。
【００２４】
好ましい具体例では、主題の方法を使用して少なくとも１０³種の異なる配列、好ましくは少なくとも１０⁸種の異なる配列、最も好ましくは少なくとも１０¹⁵種の異なる配列の試験ペプチド又は疑似ペプチドの多様な集団を生成させる。
【００２５】
本発明のさらに別の態様は、主題の方法によって同定されたペプチド及び疑似ペプチドのような化合物及びそれらの使用に関する。また、これらのものには、このようなペプチド及び疑似ペプチドの結合体及び誘導体も含まれる（例えば、結合したペプチド又は疑似ペプチド配列を膜を横切って効率的に輸送できるようにする陽イオン性ペプチド配列への結合体）（Ｍｏｏｒｅ及びＲｏｓｂａｓｈ（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９４，１８４１−１８４２）。
【００２６】
本発明の別の態様は、ペプチド又は疑似ペプチドの合成及び／又は進化用のキットに関する。
【００２７】
図面の説明
図１：Ｅ．ｃｏｌｉからの５種のｈｉｓタグＥ．ｃｏｌｉ翻訳因子の過剰発現及び精製。１５％ゲルでのＳＤＳ−ＰＡＧＥ後に、試料をクマシーブルーで染色した。Ｕは誘導されなかった全細胞であり、ＩはＩＰＴＧ誘導された全細胞であり、ＰはＮｉ²⁺ビーズから溶出した精製蛋白質であり、Ｍは分子量マーカーの蛋白質（寸法はｋＤで示される）である。
【００２８】
図２：リボソーム指令ペプチド合成段階の概略図である。矢印によって示された３種の酵素反応は、開始（上）、第１伸長段階（右）、次の転位及び伸長段階（下）である。ペプチド産物は、分析のために塩基触媒加水分解によってペプチジルｔＲＮＡから放出され得る。産物のＧＤＰ及びＰｉは示されていない。Ｅは出口部位であり、Ｐはペプチジル部位、Ａはアミノアシル部位である。
【００２９】
図３：短鎖ｍＲＮＡ鋳型。最長ｍＲＮＡを合成するのに使用したＤＮＡプライマーと鋳型の対を上部に示している。また、本発明の精製系からの予測される翻訳産物も示している（３’の終止コドンＧＡＡ（Ｇｌｕ）及びＵＵＣ（Ｐｈｅ）についてのアミノアシルｔＲＮＡは使用しなかった）。ｂＫはビオチン標識されたリシンであり、Ｓ−Ｄはシャイン・ダルガーノリボソーム結合部位である。
【００３０】
図４：精製ｈｉｓタグ翻訳系におけるｍＲＮＡからのオリゴペプチド合成速度の特徴付け。ｆＭＴＶは、ＩＦ１Ｈ、ＩＦ２Ｈ、ＩＦ３Ｈ、ＥＦ−ＴｕＨ、ＥＦ−ＧＨ及び０．０２０Ａ₂₆₀／μｌのリボソームを含有する翻訳系でペプチド産物に取り込まれた³Ｈ−バリンによって測定された。三角形：翻訳は、プレインキュベートされた開始成分をプレインキュベートされた伸長成分と混合することによって開始された。四角形：翻訳は、翻訳混合物を０℃から３７℃に移すことによって開始された。アリコートを１分から始める所定の時間にＮａＯＨで終了させた。ペプチド産物のｄ．ｐ．ｍ．は、３７℃のインキュベーション前に終了されたアリコートで得られたｄ．ｐ．ｍ．を引き算することによって計算された。代表的な実験からの個々のデータのポイントがプロットされ、推定される偏差は２０％未満であった。プレインキュベーション反応の曲線に対して接線を引いて定常状態の速度を推定する。
【００３１】
図５：ｍＲＮＡのＭＴＶを有する精製翻訳系における翻訳因子の依存性。淡い棒：ペプチド産物に取り込まれた³Ｈ−バリン（ｆＭＴＶの測定値）は、ＩＦ２Ｈ、ＩＦ３Ｈ、ＥＦ−ＴｕＨ及びＥＦ−ＧＨへの強い依存性を示している（ＩＦ１Ｈは、これらの翻訳系から除外された。材料及び方法を参照されたい）。黒い棒：同一の産物に取り込まれた¹⁴Ｃ−トレオニン（ｆＭＴとｆＭＴＶを一緒に測定したもの）。０℃から３７℃に移すことによって開始された３０分の翻訳でのペプチド合成は、全ｄ．ｐ．ｍ．からｍＲＮＡなしの対照反応で得られたｄ．ｐ．ｍ（最大のｄ．ｐ．ｍの１．３％）を引き算することによって計算された。得られた合成産物の最大濃度は、Ｔ及びＶ両者について０．１２μＭであった。
【００３２】
図６：ＭＴＴＶのｍＲＮＡ鋳型から産生された産物のＨＰＬＣ分析。二重標識翻訳のペプチド産物は、まず、ｔＲＮＡから塩基により放出され、次いで標識されていないマーカーペプチドと混合された。この混合物を酸性化させ、微量遠心分離して不溶性の物質を除去し、そして分析のために注入前に１０ｋＤフィルターによって微量遠心分離した（材料及び方法参照）。マーカーペプチドの溶出位置は、クロマトグラムの上に示されている。黒丸は¹⁴Ｃ−トレオニンの全ｄ．ｐ．ｍ．である。白丸は同一画分の³Ｈ−バリンの全ｄ．ｐ．ｍ．である。産物の合成量は、３０μｌ当たり２．１ｐｍｏｌ（７０ｎＭ）であった。
【００３３】
図７：ε配列の包含は、精製翻訳系でのオリゴペプチド産物の合成を向上させる。ｍＲＮＡであるＭＶＴ（丸）、スクランブルされたεＭＴＶ（四角形）及びεを欠失したＭＶＴ（三角形）からのｆＭＶＴ合成の速度の間の比較。ＩＦ１Ｈ、ＩＦ２Ｈ、ＩＦ３Ｈ、ＥＦ−ＴｕＨ及びＥＦ−ＧＨを含有する二重標識翻訳系を図５に記載されるように分析した。３０分で合成されたオリゴペプチドの最大濃度は、それぞれのアミノアシルｔＲＮＡのうち０．５μＭを使用して０．２５μＭであった。
【００３４】
図８：精製ｈｉｓタグ翻訳系を使用した非天然アミノ酸を含むペプチドの合成及び選択。ビオチン標識ｌｙｓ−ｔＲＮＡ^lys、ｆｍｅｔ−ｔＲＮＡ_i ^fmet、ｔｈｒ−ｔＲＮＡ₃ ^thr及び³Ｈ−ｖａｌ−ｔＲＮＡ₁ ^val基質並びにｍＲＮＡであるＭＴＫＶ又はＭＴＶ（翻訳産物については図３を参照されたい）のいずれかを含有する翻訳混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。ペプチド及びアミノ酸をｔＲＮＡ及びリボソームから塩基により放出させ、中和し、そしてこの混合物を軟質のアビジンビーズと共にインキュベートしてビオチン含有分子を結合させた。結合された³Ｈ（黒い棒：³Ｈ−バリンに共有結合したビオチン標識リシンを含有する産物の測定値）をカウントする前にこのビーズを４回洗浄してビオチニル化していない分子を除去した。プールされた洗浄物をろ過し、酸性化させ、そして陽イオン交換カラムに通して結合していない³Ｈ（淡い棒：³Ｈ−バリンを含有し、ビオチン標識リシン又はリシンを含有しないホルミル化ペプチド産物の測定値）をカウントした。結合した及び結合していない³Ｈのｄ．ｐ．ｍ．は、ｍＲＮＡなしの対照反応で得られたｄ．ｐ．ｍ．（最大の結合及び非結合のｄ．ｐ．ｍ．のそれぞれ２３％及び１５％）を引き算した後にプロットしている。ビオチン標識ｌｙｓ−ｔＲＮＡ^lysがｍＲＮＡのＭＴＫＶの翻訳から除外されたときに、³Ｈのビーズへの結合は観察されない（図示しない）。
【００３５】
図９：Ｃｙｓ−ｔＲＮＡ^cysの化学的ビオチニル化。
【００３６】
図１０：ビオチニル−Ｃｙｓ−ｔＲＮＡ^cysの精製。ビオチニル−Ｃｙｓ−ｔＲＮＡは、図１６に示すように電気泳動され（以下参照）、その産物は、適切なバンド（即ち、レーン７又は９の大きい方のバンド）を切り出し、４℃で溶出させることによって精製された。ｔＲＮＡにＣｙｓを付加させたものとさせていないもの、ビオチニル化させたもの（ｐＨ６．０又は６．９のいずれかで）とさせていないもの及びその後にアミノアシル結合をＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．８で加水分解させたものとさせていないものを含む対照（レーン１〜６、８、１０）は、ビオチニル化がＣｙｓに特異的であり、しかもＣｙｓ−ｔＲＮＡがビオチニル−Ｃｙｓ−ｔＲＮＡと共移動しなかったことを示した。
【００３７】
図１１：精製系を使用した精製ビオチニルＣｙｓのｆＭ−Ｔ−ｂＣ−Ｖ疑似ペプチドへの取り込み。翻訳は、ｍＭＴＣＶ、ｆＭとＴとＶとをそれぞれ結合したｔＲＮＡ及び非結合の、Ｃｙｓ結合の又は精製ビオチニル−Ｃｙｓ−結合のｔＲＮＡを含み、対照はｍＲＮＡがないものであった。選択は図８に示すような軟質アビジンによるものであった。³Ｈペプチドのビオチニル−Ｃｙｓ基質との不完全な結合は、軟質アビジン（ほぼ１０^-7Ｍの非常に高いＫ_dを有するように誘導体化されたアビジン）の単一のビオチンを含有するペプチドに対する低い親和性のためであると思われた。
【００３８】
図１２：隣接する多数の非天然アミノ酸をｆＭ−Ｔ−ｂＣ−ｂＣ−Ｖ疑似ペプチドに取り込むためのアッセイ。この実験は、図１１に示すように実施された。軟質アビジンによる結合は、１個以上のビオチンを含有するペプチドに対する非常に低い親和性のために予想されるように、ｆＭ−Ｔ−ｂＣ−ｂＣ−Ｖについては完全であったが、ｆＭ−Ｔ−ｂＣ−Ｖについては不完全であったことに留意されたい。
【００３９】
図１３：全ｔＲＮＡと１５種の異なる¹⁴Ｃ標識アミノ酸の混合物（ニュー・イングランド・ニュークレア社）との結合活性（ＴＣＡ沈殿法によって測定される）についての本発明の純粋な翻訳系のアッセイ（「蛋白質ポリメラーゼ」）。添加されたシンテターゼは、ｔＲＮＡを含まない粗製のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ細胞抽出物からなる。
【００４０】
図１４：選択のコドンに対して特異的な非天然アミノ酸を結合したアミノアシルｔＲＮＡを合成するために一般化できる方法。合成オリゴデオキシリボヌクレオチドから調製された本発明の組換えＤＮＡクローンから試験管内で合成された伸長体ｔＲＮＡ^Asn-CA（図１６のレーン５）は、矢印で示される天然ｔＲＮＡ^Asnからの実質的な塩基改変物を含有する。このｔＲＮＡのアンチコドンは、大きい文字で示されている。アミノＮＶＯＣで保護された天然アミノ酸は、ｐｄＣＡ上で化学的にアミノアシル化され（右上参照）、次いでｔＲＮＡ^Asn-CA（ＦｏｋＩ切断鋳型のランオフ転写法によって形成された）にＴ４ＲＮＡリガーゼで連結された（図１６、レーン６）。この方法は一般化できる。なぜならば、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ又は天然ｔＲＮＡが全く必要とされなかったからである。
【００４１】
図１５：左から右にｔＲＮＡ^Asn（Ｔ）ｔＲＮＡ^Asn（Ｓ）ｔＲＮＡ^Asn（Ｖ）と命名されたｔＲＮＡ^Asn（Ｎ）の３種のアンチコドン変異体。これらｔＲＮＡの新規なアンチコドンは、これらのｔＲＮＡが認識するコドンの上に大きい文字で示されている。この遺伝暗号は、コドンが、どちらのアミノ酸（天然又は非天然）がそれぞれのｔＲＮＡ^Asn-CAに連結するために選択されるのかを直ちに指定するように再設計された。
【００４２】
図１６：非結合ｔＲＮＡ（レーン１、３及び５）及びアミノアシルｔＲＮＡ基質（レーン２、４及び６）の酸／尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｖａｒｓｈｎｅｙ他（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６，２４７１２−２４７１８）。このゲル系において、遊離のＲＮＡ種（レーン１、３及び５）の観察された移動度は、アミノアシル化（レーン２、４）によって、或いはアミノアシル化ＣＡジヌクレオチド（レーン６）の連結によって抑制された。
【００４３】
図１７：隣接するａＧアミノ酸を疑似ペプチドに選択的に取り込むための一般的な方法。この実験は、図８及び１１と同様に実施したが、ただし選択段階は実施しなかった。ここで、ｔＲＮＡ^Asn（Ｎ）はＡｓｎをベースとしてｔＲＮＡ^AsnBと略記されていることに留意されたい。
【００４４】
図１８：純粋リボソームディスプレイ。これは、ペプチドと疑似ペプチドの反復合成及び選択（定向進化）のために使用できるＭａｔｔｈｅａｋｉｓ他（上記）の粗製 in vitro 系（生体物質なしの）の純粋なタイプである。疑似ペプチドは、選択されるためには非放出 de novo 合成ペプチドを取り囲むほぼ１００Åの長さのリボソームトンネルを超える程度に長いことが必要である。ｍＲＮＡ（及びリボソーム）からのペプチドの分離は、終止コドン、終結因子又はある種のアミノアシルｔＲＮＡを除外し且つリボソームを立ち往生させる抗体を使用することによって防止できる。
【００４５】
図１９：本発明のスペーサーｍＲＮＡ及びそれらのコードペプチド産物。
【００４６】
図２０：本発明の精製系を使用した図１９のスペーサーｍＲＮＡの翻訳。ペプチド産物に取り込まれた伸長体バリン（³Ｈ標識）対開始体ホルミルメチオニン（³⁵Ｓ標識）の比率は、二重標識ｄ．ｐ．ｍ．計数プログラムを使用してＴＣＡ沈殿産物を分析することによって測定された。観察された直線のグラフは、高い連続移動性について予期されるものである。
【００４７】
図２１：純粋ｍＲＮＡディスプレイ。これは、Ｍａｔｔｈｅａｋｉｓ他（図１８）の粗製 in vitro 系を基にした根本他（上記）並びにＲｏｂｅｒｔｓ及びＳｚｏｓｔａｋ（上記）の粗製 in vitro 系の純粋なタイプであって、ｍＲＮＡをプロマイシン（Ｐｍ）と結合させてそのｍＲＮＡをそれらのペプチド又は疑似ペプチド産物に共有結合的に融合させるようにできるという点で異なるものである。しかして、このｍＲＮＡと疑似ペプチドの融合体は、選択前にその他の翻訳成分から精製できるため、非常に短い疑似ペプチドをリボソームトンネルによって遮蔽することなく表示できる。この融合反応は緩やかであるため、終止コドンを含むｍＲＮＡを使用するときに終結因子を除外して終結因子が触媒するペプチドの放出を防止することが重要である。典型的には、リボソームをｍＲＮＡに結合したデオキシヌクレオチド配列によって立ち往生させる。本発明者は、ｍＭＴＫＶ及びｍＭＴＣＶ（図８及び１１）を、注文合成された「添え木」ＤＮＡ（ｍＲＮＡ及びｐｄＡ₂₇ｄＣｄＣＰｍのいずれかの末端にハイブリダイズさせるように設計されたＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＡＴＴＣＡＡＣ）及びＴ４ＤＮＡリガーゼを使用してｐｄＡ₂₇ｄＣｄＣＰｍに効率的に連結させ（トリ連結）、次いで融合及び選択実験に使用するためにこの結合体をゲル精製した（Ｒｏｂｅｒｔｓ及びＳｚｏｓｔａｋ（１９９７）ＰＮＡＳ ９４，１２２９７−１２３０２）。ここで、図中のＸは、Ｃ又はｂＣ（図９）又はｂＫ（図２２）のような容易に選択できるアミノ酸である。
【００４８】
図２２：プロメガ社製のＴｒａｎｓｃｅｎｄビオチニル−リシンｔＲＮＡ^lys（Ｅ．ｃｏｌｉ、材料及び方法を参照）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４９】
発明の詳細な説明
（Ｉ）概説
本発明は、複数の異なる天然及び非天然アミノ酸残基を高度に制御され且つ一般化できる態様で特異的に取り込めるようにするための精製成分から再構成された in vitro 翻訳系に関する。ある種の野生型のアミノ酸及び終結因子による望ましくない競合を取り除くため、遺伝学的にコードされた小さい及び長い疑似ペプチドの分子及びライブラリーを効率的且つ特異的に合成することが可能である。
【００５０】
本発明は、斯界の多数の研究者による長年にわたる相当な努力にもかかわらず未解決のままであった遺伝学的にコードされた疑似ペプチドを合成することのできる生合成方法に対する長く切望された必要性のために開発された。
【００５１】
また、本発明は、効率的な連続移動性のためにＥＦ−Ｐ、Ｗ、Ｗ２又はレスキューの添加を必要としない、単純化され、高度に精製された翻訳系に対する長く切望された必要性のためにも開発された。斯界におけるこのような系の最も高度に精製されたタイプでの翻訳の連続移動性の問題及び明らかな解答のないこの分野における１０年間の研究を基にすれば、成功する見込みは小さいように思われる。
【００５２】
（II）用語の定義
ここで、便宜上、明細書、実施例及び添付された特許請求の範囲で使用したある種の用語を収録する。
【００５３】
「蛋白質」とは、１個以上のペプチド結合によって結合された任意の２個以上の天然型アミノ酸を意味する。ここでは、「蛋白質」及び「ペプチド」が互換性を持つように使用される。
【００５４】
用語「ペプチド」とは、それらの単量体がアミド結合によって互いに結合された天然アミノ酸（α−アミノ酸）であるオリゴマーをいう。ペプチドは、２個以上のアミノ酸単量体の長さであるが、たいていは５〜１０個のアミノ酸単量体の長さであり、さらにはそれよりも長い、即ち２０個まで又はそれ以上のアミノ酸であることができるが、２０個のアミノ酸よりも長いペプチドは、「ポリペプチド」と呼ぶのが適当である。用語「蛋白質」とは、斯界に周知のものであり、いくつかの生物学的機能を有する非常に大きなポリペプチド又は会合した相同若しくは異種ポリペプチドをいう。本発明の目的のために、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「蛋白質」は、３つのタイプ全てが翻訳系によって合成できるときにはたいてい置き換えることができ、そのため一括して蛋白質と呼ばれる。
【００５５】
「疑似ペプチド」とは、非天然主鎖を有する産物及びさらにエステル、チオエステル若しくはその他の結合で部分的に又は全体的に置換されたアミド（ペプチド）結合を有するもの（Ｍｅｎｄｅｌ、前述）を含めて、１種以上の非天然アミノ酸（例えば、非天然側鎖、非天然キラリティー、Ｎ−置換アミノ酸若しくはβ−アミノ酸）、非天然トポロジー（例えば、環状若しくは分岐）又は非天然化学誘導体（例えば、メチル化若しくは末端がブロックされたもの）を含むペプチドアナログ、或いは天然アミノ酸を含むペプチド以外の任意の分子であってリボソームによって合成されるものを意味する。
【００５６】
用語「アミノ酸残基」及び「ペプチド残基」とは、アミノ酸又はペプチド分子であってそのカルボキシル基の−ＯＨがないもの（Ｃ末端が結合されたもの）又はそのアミノ基のプロトンがないもの（Ｎ末端が結合されたもの）を意味する。一般的に、アミノ酸及び保護基を示すためにここで使用される略称は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会の提言に基づくものである（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９７２）１１：１７２６−１７３２参照）。ペプチド中のアミノ酸残基は、次のように略記する。アラニンはＡｌａ又はＡ、システインはＣｙｓ又はＣ、アスパラギン酸はＡｓｐ又はＤ、グルタミン酸はＧｌｕ又はＥ、フェニルアラニンはＰｈｅ又はＦ、グリシンはＧｌｙ又はＧ、ヒスチジンはＨｉｓ又はＨ、イソロイシンはＩｌｅ又はＩ、リシンはＬｙｓ又はＫ、ロイシンはＬｅｕ又はＬ、メチオニンはＭｅｔ又はＭ、アスパラギンはＡｓｎ又はＮ、プロリンはＰｒｏ又はＰ、グルタミンはＧｌｎ又はＱ、アルギニンはＡｒｇ又はＲ、セリンはＳｅｒ又はＳ、トレオニンはＴｈｒ又はＴ、バリンはＶａｌ又はＶ、トリプトファンはＴｒｐ又はＷ及びチロシンはＴｙｒ又はＹである。ホルミルメチオニンはｆＭｅｔ又はｆＭと略記する。用語「残基」とは、相当するα−アミノ酸からそのカルボシキル基のＯＨ部分及びα−アミノ基のＨ部分を取り除くことによって誘導される基を意味する。用語「アミノ酸側鎖」とは、「Ｋ．Ｄ．Ｋｏｐｐｌｅ，”ペプチド及びアミノ酸”，Ｗ．Ａ．Ｂｅｎｊａｍｉｎ社，ニューヨーク及びアムステルダム，１９６６年，２及び３３ページ」によって定義されるように、−ＣＨ（ＮＨ₂）ＣＯＯＨ部分を除いたアミノ酸の一部分のことである。一般的なアミノ酸のこのような側鎖の例は、−ＣＨ₂ＣＨ₂ＳＣＨ₃（メチオニンの側鎖）、−ＣＨ₂（ＣＨ₃）−ＣＨ₂ＣＨ₃（イソロイシンの側鎖）、−ＣＨ₂ＣＨ（ＣＨ₃）₂（ロイシンの側鎖）又は−Ｈ（グリシンの側鎖）である。
【００５７】
ある具体例では、本発明の用途で使用されるアミノ酸は、蛋白質中に見いだされる天然型のアミノ酸である。特に好適なアミノ酸側鎖には、次の２１種の天然アミノ酸：アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セレノシステイン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリンの側鎖から選択されるものが含まれる。しかしながら、本発明は、ここで言及される任意の特定のアミノ酸のアナログ、誘導体及び同族体を使用することを意図する。例えば、本発明は、放射性アミノ酸アナログ、側鎖を長くし又は短くすると同時に重合のためのカルボキシル、アミノ又はその他の反応性の前駆体官能基をさらに与えるアミノ酸アナログ並びに異なる側鎖（適切な官能基を有する）を有するアミノ酸アナログを使用することを意図する。例えば、主題の疑似ペプチドは、例えばβ−シアノアラニン、カナバニン、ジエンコル酸、ノルロイシン、３−ホスホセリン、ホモセリン、ジヒドロキシフェニルアラニン、５−ヒドロキシトリプトファン、１−メチルヒスチジン、３−メチルヒスチジン、アリルグリシン（又はそのアルキン誘導体）、Ｏ−メチルセリン、ビオチニルリシン、ビオチニルシステイン（又はその他のビオチン標識アミノ酸）、シクロヘキシルアラニン、ホモグルタメート、Ｄ−アラニン（又はその他のＤ−アミノ酸）、Ｎ−メチルグリシン（又はその他のＮ−メチルアミノ酸）、ε−Ｎ−メチルリシンとしてのアミノ酸アナログ及び２１種の天然アミノ酸又は非天然アミノ酸の放射性同位元素誘導体を包含できる。ここで好適なその他の天然型アミノ酸又は非天然型アミノ酸は、当業者であれば容易に認識され且つ本発明の範囲に含められる。
【００５８】
用語「キラル」とは、鏡像の相手を重ね合わすことができないという特性を有する分子をいい、一方、用語「アキラル」とは、その鏡像の相手に重ね合わすことができる分子をいう。
【００５９】
用語「立体異性体」とは、同一の化学構成を有する化合物であるが、原子又は基の空間配置に関して異なるものをいう。特に、「鏡像異性体」とは、互いの鏡像を重ね合わすことができない化合物の２種の立体異性体をいう。一方、「ジアステレオマー」とは、非対称である２つ以上の中心を有する立体異性体であってその分子が互いに鏡像でないものをいう。キラル中心の命名に関して、用語「Ｄ」及び「Ｌ」立体配置は、ＩＵＰＡＣの推奨によって定義されるようなものである。この用語の使用に関して、ジアステレオマー、ラセミ化合物及び鏡像異性体は、ペプチド調製物の立体化学を説明するためにその一般的な状況で使用されるであろう。
【００６０】
用語「Ｄ−アミノ酸」及び「Ｌ−アミノ酸」とは、それぞれ、グリセルアルデヒドの予想される立体異性体に関する規則による絶対配置を意味する。しかして、所定の異性体による偏光面の回転方向にかかわらず、立体化学的にＬ−グリセルアルデヒドに関わる全ての立体異性体はＬ−と表記され、Ｄ−グリセルアルデヒドに関わるものはＤ−と表記される。トレオニン及びイソロイシンの場合には、２つの立体化学中心、即ち、Ｃα及びＣβ原子がある。ここで使用されるＤ−トレオニン及びＤ−イソロイシンは、好ましくは、両方のキラル部位においてこれらのアミノ酸のＬ−立体異性体の立体配置とは逆である（鏡像異性である）立体配置を有する。例えば、これらのものは完全に鏡像である。グリシンは一般的に生じる唯一のアキラルなアミノ酸である。グリシンのようなアキラルなアミノ酸残基の存在は、そのキラリティーの名称に影響を及ぼさない。
【００６１】
自然界で de novo 合成される蛋白質の全てのキラルなアミノ酸（例えば、「天然型」）は、Ｌ−アミノ酸である。
【００６２】
「Ｄ−鏡像異性体」又は「Ｄ−ペプチド鏡像異性体」とは、Ｌ−アミノ酸ではなく、Ｄ−アミノ酸残基からなるペプチドをいう。
【００６３】
用語「合成」とは、試験管内での化学的又は酵素的合成による産生をいう。
【００６４】
ＤＮＡとは、２個以上の共有結合された天然型又は修飾デオキシリボヌクレオチドの配列を意味する。
【００６５】
「ＲＮＡ」とは、２個以上の共有結合された天然型又は修飾リボヌクレオチドの配列を意味する。この用語に包含される修飾ＲＮＡの２つの例は、ホスホロチオエート型ＲＮＡ及び天然の修飾塩基を含有する「トランスファーＲＮＡ」である。
【００６６】
「トランスファーＲＮＡ」又は「ｔＲＮＡ」とは、ペプチド又は疑似ペプチド前駆体をｍＲＮＡへの部分的な塩基の対合によって特定される態様でリボソームに運搬できる任意のＲＮＡ分子を意味する。
【００６７】
「翻訳開始配列」とは、機能性のリボソーム進入部位を与えることができる任意の配列を意味する。細菌の系では、この領域は、時としてリボソーム結合配列又はシャイン・ダルガーノ配列と呼ばれる。
【００６８】
「メッセンジャーＲＮＡ」又は「ｍＲＮＡ」とは、「翻訳開始配列」を含有する任意の核酸を意味する。
【００６９】
「再構成翻訳系」とは、in vitro 翻訳、例えばｍＲＮＡ依存性蛋白質合成を行うことのできる反応混合物（ａ）及び細胞溶解物の翻訳系又は麦芽抽出物の翻訳系に見いだされる汚染性蛋白質の１０％未満を有し、さらに好ましくはこのような汚染性蛋白質の５％未満又はさらに１％未満を有することを特徴とする反応混合物（ｂ）をいう。ある好ましい具体例では、主題の再構成翻訳系は、組換えによって生産された及び／又は精製された蛋白質を混合することによって生成される。
【００７０】
「開始コドン」とは、蛋白質コード配列の始まりを表す３種の塩基を意味する。一般的には、これらの塩基は、ＡＵＧ（又はＡＴＧ）であるが、この態様で使用できる任意のその他の塩基のトリプレットは置換されていてよい。
【００７１】
「終止コドン」とは、蛋白質コード配列の終わりを表す３種の塩基を意味する。一般的には、これらの塩基は、ＵＡＧ、ＵＡＡ又はＵＧＡ（ここで、ＵはＴで置換されていてよい）であるが、この態様で使用できる任意のその他の塩基のトリプレットは置換されていていよい。
【００７２】
「休止配列」とは、リボソームにその翻訳速度の遅延及び停止を生じさせる核酸配列、例えばＤＮＡ配列を意味する。
【００７３】
「ペプチドアクセプター」とは、リボソームのペプチジルトランスフェラーゼ機能の触媒活性によって、成長しつつある蛋白質鎖のカルボキシル末端に付加できる任意の分子を意味する。典型的には、このような分子は、（ｉ）ヌクレオチド又はヌクレオチド様の部分（例えば、アデノシン又はアデノシンアナログ（Ｎ−６アミノ部位でのジメチル化が許容できる））、（ii）アミノ酸又はアミノ酸様の部分（例えば、２０種のＤ−又はＬ−アミノ酸又はそれらの任意のアミノ酸アナログのいずれか（例えば、Ｏ−メチルチロシン又は「Ｅｌｌｍａｎ他，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０２：３０１，１９９１」に記載されたアナログのうち任意のもの））及び（iii）これら２種の間の結合（例えば、エステル、アミド又は３’の位置若しくはあまり好ましくはないが２’の位置でのケトン結合）（好ましくは、この結合は、天然リボヌクレオチドのコンホメーションによる環の縮みを有意に摂動させない）を含有する。また、ペプチドアクセプターは求核基も有し、このものは、アミノ基、ヒドロキシル基又はスルフヒドリル基であることができるが、これらに制限されるわけではない。さらに、ペプチドアクセプターは、ヌクレオチドの疑似体、アミノ酸の疑似体又はヌクレオチド・アミノ酸の結合構造の疑似体から構成されていてもよい。
【００７４】
「それぞれのコドンでの高選択的な取り込み」とは、コドンに相当するペプチド又は疑似ペプチド中のある位置でのアミノ酸残基の少なくとも８０％の選択的な取り込み、より好ましくは少なくとも９０、９５又はさらには９８％の選択的な取り込みを意味する。
【００７５】
ペプチドアクセプターが蛋白質コード配列の「３’末端」に配置されるとは、ペプチドアクセプター分子がその蛋白質コード配列の最後のコドンの後に配置されることを意味する。この用語には、蛋白質コード配列の３’末端に正確に配置されるペプチドアクセプター分子並びにコード配列又は非コード配列を介在させることによって最後のコドンから隔てられるもの（例えば、休止部位に相当する配列）が含まれるが、これに限定されるものではない。また、この用語には、コード又は非コード配列がペプチドアクセプター分子に追従する（即ち、３’からそれに）構築物も含まれる。さらに、この用語には、蛋白質コード配列に共有結合される（直接的に又は核酸配列を介在させることによって間接的に）ペプチドアクセプター分子並びに蛋白質コード配列にいくつかの非共有結合の手段によって、例えば、蛋白質コード配列の３’末端に又はその近傍に結合する第２の核酸配列を使用するハイブリダイゼーションによって結合し、しかもそれ自体がペプチドアクセプター分子に結合するものが含まれるが、これに限定されるわけではない。
【００７６】
ペプチドアクセプターに「共有結合する」とは、ペプチドアクセプターが「蛋白質コード配列」に共有結合によって直接的に、或いは別の共有結合した配列（例えば、休止部位に相当するＤＮＡ）によって間接的に結合することを意味する。
【００７７】
「ｍＲＮＡディスプレイ」とは、共有又は非共有結合によって、ｍＲＮＡの翻訳からのペプチド又は疑似ペプチド産物をそのペプチド又は疑似ペプチド産物に関わる同種の（コグネイト）ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ又はヌクレオチド配列に結合させるための任意の方法を意味する。一般的に使用される結合はプロマイシンを含む。
【００７８】
「変化した機能」とは、ある分子の機能における任意の定性的な又は定量的な変化を意味する。
【００７９】
ここで使用するときに、「結合の相手」とは、所望のｍＲＮＡ・ペプチド／疑似ペプチドのリボソーム複合体又は融合体の一部分に対する特異的で共有結合的又は非共有結合的な親和性を有する任意の分子を意味する。結合の相手の例として、抗原／抗体の対、蛋白質／阻害剤の対、受容体／リガンドの対（例えば、ホルモン受容体／ペプチドホルモンの対のような細胞表面受容体／リガンドの対）、酵素／基質の対（例えば、キナーゼ／基質の対）、レクチン／炭水化物の対、オリゴマー又はヘテロオリゴマー蛋白質集合体、ＤＮＡ結合蛋白質／ＤＮＡ結合部位の対、ＲＮＡ／蛋白質の対及び核酸の二本鎖、ヘテロ二本鎖又は連結鎖並びにＲＮＡ・蛋白質融合体の任意の部分と１個以上の共有又は非共有結合（例えば、ジスルフィド結合）を形成することができる任意の分子よりなる構成要素が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８０】
用語「リガンド」とは、蛋白質、例えば受容体のような特定の標的によって認識される分子をいう。標的が結合する又はそれと反応する任意の薬剤が「リガンド」と呼ばれるため、この用語には、酵素の基質及び触媒反応の反応体が含まれる。用語「リガンド」とは、任意の特定の分子の大きさ又は問題の物質が標的と結合でき、さもなくばそれと相互作用できること以外のその他の構造的特徴又は組成的特徴を意味するものではない。「リガンド」は、標的が結合する天然のリガンド又はアゴニスト若しくはアンタゴニストとして作用できる機能性アナログとしての役割を果たし得る。
【００８１】
用語「基質」とは、酵素のリガンドであって触媒として作用し且つ酵素によって生成物に化学的に変換されるものをいう。
【００８２】
用語「受容体」とは、所定のリガンドに対して親和性を有する分子をいう。
【００８３】
用語「固体担体」とは、硬質又は半硬質の表面を有する材料をいう。このような材料は、好ましくは、小型のビーズ、ペレット、ディスク、チップ、皿状物、マルチウェルプレート、ウエハーなどの形をとるであろうが、その他の形を使用してもよい。いくらかの具体例では、この材料の少なくとも一つの表面は、実質的に平坦である。用語「表面」とは、ある固形物上の任意の一般的には二次元構造をいい、表面が無くならなければ段差、隆起、屈曲、テラスなどがあってもよい。
【００８４】
ここで使用するときに、「集団」とは、１種以上の分子（例えば、１種以上のＲＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ・蛋白質又はＲＮＡ・疑似ペプチド融合分子）を意味する。本発明の方法は、所望ならば多数の候補分子から始める選択を容易にするものであるから、本発明に従う「集団」とは、好ましくは、少なくとも１０³種の異なる配列、さらに好ましくは少なくとも１０⁸種の異なる配列、そして最も好ましくは少なくとも１０¹⁵種の異なる配列を意味する。
【００８５】
用語「無作為ペプチドライブラリー」とは、無作為の又は半無作為のペプチド集団並びにこれらの無作為ペプチドを含有する融合蛋白質の集団（応用できるように）を意味する。疑似ペプチドの１種以上の残基が非天然型アミノ酸様の部分であるということを認識した上で、同様の意味が用語「無作為疑似ペプチドライブラリー」に与えられる。
【００８６】
「選択」とは、ある分子をある集団内のその他の分子から実質的に分離することを意味する。ここで使用されるときに、「選択」段階は、この選択段階の後に所望の分子を集団中の望ましくない分子に対して少なくとも２倍、好ましくは１０倍、さらに好ましくは１００倍、最も好ましくは１０００倍以上富化させる。ここに示されるときに、選択段階を何度でも繰り返してよく、また、異なるタイプの選択段階を所定の方法に組み合わせてもよい。
【００８７】
試験ペプチド又は疑似ペプチドを標的と結合させることに関して、句「個々に選択的な態様」及び「個々に選択的な結合」とは、標的の分子同一性に対して特異的な結合及びそれに依存した結合をいう。
【００８８】
用語「差異結合手段」並びに「親和性選択」及び「親和性富化」とは、ペプチド又は疑似ペプチドディスプレイライブラリーの構成要素を、このライブラリーのディスプレイパッケージのそれぞれについて試験ペプチド又は疑似ペプチドを標的に結合する異なる能力に基づいて分離させることをいう。ディスプレイ分子による標的の差異結合は、標的と特に相互作用する分子を相互作用しない分子から親和性によって分離するのに使用できる。親和性選択の例として、アフィニティークロマトグラフィー、沈殿法、蛍光表示式細胞分取法及びプラークリフト法が挙げられる。以下に記載するように、アフィニティークロマトグラフィーには、例えば固定化された標的蛋白質を使用するパンニング技術が含まれる。
【００８９】
用語「レポーター群」又は「タグ」とは、他の分子に結合したとき及び化学的な分離プロセスで利用されたときに容易に検出できる原子、化合物又は生体分子若しくは複合体をいう。レポーター群は、例えば、蛍光性若しくは放射性原子又は１個以上のこのような原子を含有する化合物であることができる。
【００９０】
アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの「プルーフリーディング」活性とは、同種でない（非コグネイト）アミノ酸（天然又は非天然）を認識し、次いでこれをシンテターゼのアミノアシル化された同種のｔＲＮＡアイソアクセプターから除去するというこの酵素の加水分解触媒活性を意味する。
【００９１】
（III）代表的な具体例
一般に、本発明の方法は、ペプチド又は疑似ペプチドを生成させる in vitro 又は in situ 転写／翻訳プロトコルからなる。これは、ｍＲＮＡ分子を天然型及び／又は非天然型アミノ酸又はアミノ酸アナログを結合した１種以上のｔＲＮＡ分子で合成し且つ in vitro 又は in situ 翻訳することによって達成される。本発明者は、細菌の翻訳がＥＦ−Ｐ、Ｗ、Ｗ２又はレスキューを添加することなく再構成できることを発見した。
【００９２】
一般に、好ましい最小の翻訳系は、次の高分子成分：リボソーム、ｍＲＮＡ、アミノアシルｔＲＮＡ及び翻訳因子であるＩＦ２Ｈ、ＩＦ３Ｈ、ＥＦ−ＴｕＨ、ＥＦ−ＧＨを含む。ＩＦ１ＨとＥＦ−Ｔｓは促進性であるので、しばしば添加される。更なる別法を以下に詳述する。
【００９３】
標識開始因子の高レベル過剰発現用のクローンが入手できないため、精製翻訳系を再構成するために大量の高度に精製された因子を再現可能に調製することが大きな技術的障害であった。実際に、多くの研究が主要成分の資質に依存していた。この問題を克服するために、本発明者は、（Ｈｉｓ）₆タグ（ｈｉｓタグと呼ばれる）を有する３種のＥ．ｃｏｌｉ開始因子全てをサブクローニングし且つ過剰産生させ、精製翻訳系でそれぞれの因子の活性を検査した。
【００９４】
ｈｉｓタグＥ．ｃｏｌｉ翻訳因子のサブクローニング、過剰発現及び精製。
公表されたＥ．ｃｏｌｉのＩＦ１、ＩＦ２及びＩＦ３発現用クローンは、多数の初期研究には有用ではあるものの、親和精製できず且つ一つの例外を除いて熱誘導できる非標識因子のためのものである（「Ｃａｌｏｇｅｒｏ他（１９８７）Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ ２０８，６３−９」、「Ｌａａｌａｍｉ他（１９９１）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２２０，３３５−４９」、「Ｄｅ Ｂｅｌｌｉｓ及びＳｃｈｗａｒｔｚ（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １８，１３１１」、「Ｍｏｒｔｅｎｓｅｎ他（１９９１）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ ７３，９８３−９」、「Ｂｒｏｍｂａｃｈ及びＰｏｎ（１９８７）Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ ２０８，９４−１００」）。ＩＦ３の過剰発現について考慮すべき重要な事項は、希少なＡＵＵ開始コドンが存在することである（Ｂｒｏｍｂａｃｈ及びＰｏｎ（１９８７）Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ ２０８，９４−１００）。ｆｍｅｔ−ｔＲＮＡ_i ^fmetと対合する開始コドンは、ＩＦ３によって直接校正され（Ｍｅｉｎｎｅｌ他（１９９９）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９０，８２５−３７）、それによって生体内で自身の遺伝子の翻訳をＩＦ３仲介フィードバック抑制することができる（Ｂｒｏｍｂａｃｈ及びＰｏｎ（１９８７）Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ ２０８，９４−１００）。従って、発現レベルを増大させ且つ３種の開始因子全ての精製を単純化させるために、本発明者は、開始コドンをＰＣＲ法によってＡＵＧ（ＣＡＣ）₆配列で置き換え、そのコード配列をｐＥＴ由来の発現用プラスミドにサブクローニングした（材料及び方法参照）。得られたｈｉｓタグクローンは、非毒性であり且つ溶解物の可溶性画分中でそれら因子（ＩＦ１Ｈ、ＩＦ２Ｈ及びＩＦ３Ｈと呼ぶ）を非常に高いレベルで過剰産生した（図１、レーン１、２、５、６、８、９）。さらに、Ｎ末端ｈｉｓ₆タグを有するＥ．ｃｏｌｉのＥＦ−Ｔｕ及びＥＦ−Ｇ（ＥＦ−ＴｕＨ及びＥＦ−ＧＨと呼ぶ）を市販のクローンを使用して過剰発現させた（図１、レーン１２、１３、１５、１６（「Ｈｗａｎｇ他（１９９７）Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｐｈｙｓ ３４８，１５７−６２」、「Ｓｅｍｅｎｋｏｖ他（１９９６）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９３，１２１８３−８」））。また、Ｎｉ²⁺精製開始因子及び伸長因子のゲル分析も図１に示す（レーン３，７、１０、１４及び１７）。ＩＦ２Ｈ、ＩＦ３Ｈ、ＥＦ−ＴｕＨ及びＥＦ−ＧＨは、真正のＥ．ｃｏｌｉ蛋白質と共に移動し（データは示さない）、ＩＦ１Ｈは、分子量マーカーとの比較に基づいて予期された電気泳動度を有していた（図１、レーン１〜４）。ＩＦ２のより短い形のＩＦ２−２は、おそらくＩＦ２Ｈと共に過剰発現したが（図１、レーン６）、内部翻訳開始機構によるその合成（Ｓａｃｅｒｄｏｔ他（１９９２）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２２５，６７−８０）はｈｉｓ₆タグを取り込まないであろうから、ＩＦ２Ｈと共に精製しなかった（図１、レーン７）。
【００９５】
開始アッセイにおけるｈｉｓタグ開始因子の依存性。
３種の開始因子の活性及び純度を、リボソーム：ｆｍｅｔ−ｔＲＮＡ_i ^fmet：ＡｐＵｐＧのトリヌクレオチド複合体構成によって測定した（図２、頂部線）。３×塩洗浄リボソームを有する開始複合体構成中でのｈｉｓタグ開始因子の依存性は、ネイティブ因子について報告された依存性に匹敵した（表１、「Ｋｕｎｇ他（１９７４）Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｐｈｙｓ １６２，５７８−８４」、「Ｄｕｂｎｏｆｆ及びＭａｉｔｒａ（１９７２）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２４７，２８７６−８３」）。ＩＦ３依存の変差は、異なる７０Ｓリボソーム調製物中の異なる量の遊離３０Ｓリボソームサブユニットに起因する可能性がある。なぜならば、ＩＦ３は、このアッセイで７０Ｓリボソームの代わりに遊離３０Ｓサブユニットを使用すると、開始複合体構成物を強くは刺激しないからである（Ｃａｎｏｎａｃｏ他（１９８７）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ ６９，９５７−６３）。開始因子がリボソームと共に精製される傾向があれば（Ｋｕｎｇ他（１９７４）Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ １６２，５７８−８４）、この結果もリボソームの純粋さを裏付けるものである。ＡＵＧトリヌクレオチド鋳型をＭＴＴＶ ｍＲＮＡ鋳型と非常に低濃度（０．３μＭ）で置き換えると（図３、以下に説明される）、同等の収率の複合体構成が可能になる（データは示さない）。
【００９６】
トリペプチド合成におけるｈｉｓタグ因子の依存性。
本発明者は、次に、開始複合体が図２に示される成分を使用する精製翻訳系で伸長を受けることができたかどうかを試験した。本発明者が選択したｍＲＮＡのデザイン（Ｐａｖｌｏｖ他（１９９７）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ ７９，４１５−２２）は、最適なシャイン・ダルガーノ配列及びε翻訳エンハンサー（Ｏｌｉｎｓ及びＲａｎｇｗａｌａ（１９８９）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６４，１６９７３−６）を含む。本発明のデザイン（図３）は、標準的な１８ｍｅｒオリゴデオキシリボヌクレオチドにハイブリダイズされる一本鎖の長い合成ＤＮＡの鋳型から直接合成される程度に短いｍＲＮＡを、クローン化する必要なくコードするという利点を有する（Ｍｉｌｌｉｇａｎ及びＵｈｌｅｎｂｅｃｋ（１９８９）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８０，５１−６２）。この鋳型の翻訳は、リボソームがあるコドンに転位し、この場合に同種の（コグネイト）ｔＲＮＡが全く供給されないとき完了する（Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ他（１９８４）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２，１６−２２）。
【００９７】
図４に示すように、３×塩洗浄リボソーム及びＭＴＶ ｍＲＮＡ（図３）を使用して図２に示される成分の全てによりオリゴペプチド合成を再構成すると、³Ｈ標識バリンの単離ペプチド産物への取り込みによって判断されるように、ｆＭＴＶの合成に帰着する。合成のタイムコースがプレインキュベートされた開始因子の混合物をプレインキュベートされた伸長因子の混合物と結合させることによって開始されるときには（図４の三角形、凡例参照）、最初の１分以内での産物合成の迅速な初期バースト及び定常状態での緩やかな合成速度が存在する。１０分間のプレインキュベーションなしでは（図４の四角形、凡例参照）、最初の１分以内では産物がほとんど合成されず、また合成は、時間経過につれてほぼ直線である（図７も参照）。
【００９８】
図５は、¹⁴Ｃ標識トレオニン及び³Ｈ標識バリンのペプチド産物への取り込みに基づいて、in vitro 翻訳に必要なそれぞれの因子（ＩＦ１はこの実験では除外された）への依存性を示している。この完全な系は、ｆＭＴＶ合成について予期されるように、１．０のトレオニン／バリン（Ｔ／Ｖ）比のペプチド産物を産生した。任意の１種の因子の除外は、ｆＭＴＶ合成を劇的に減少させ（図５）、ネイティブ因子について報告された依存性に匹敵する依存性を与える（「Ｒｏｂａｋｉｓ他（１９８１）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７８，４２６１−４」、「Ｃｅｎａｔｉｅｍｐｏ他（１９８２）Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ ２１８，５７２−８」）。翻訳因子ＥＦ−ＧＨの除外は、転位におけるＥＦ−Ｇの既知の主要な役割と一致して翻訳をトリペプチド合成からｆＭＴジペプチド合成に転換させた（図５）。ジペプチドの合成はＩＦ１の添加を必要とせず（Ｒｏｂａｋｉｓ他（１９８１）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７８，４２６１−４）、しかも本発明の翻訳系にＩＦ１Ｈを含めても全体的な収率の劇的な増加には至らないが、ＩＦ１Ｈは、前に報告されたネイティブＩＦ１の研究（Ｒｏｂａｋｉｓ他（１９８１）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７８，４２６１−４）と一致して、プレインキュベーションなしで実施される翻訳の最初の数分の間にｆＭＴＶ合成の速度を２．５倍促進させる（データは示さない）。従って、この翻訳の結果は、開始アッセイからの知見を確認し且つ拡大するものである（表１）。翻訳系のその他の高分子成分を除外した追加の対照の翻訳は、予期された依存性を示す（材料及び方法参照）。１回だけ洗浄されたリボソームは、図５に示されるタイプの翻訳アッセイでは不十分な因子依存性を示した（データは示さない）。
【００９９】
テトラペプチド合成。
次に、本発明者は、開始及び伸長の全ての段階が高度に精製された系で起こり得ることを示すために、テトラペプチド合成についてのこの系の適合性を調査した。トリペプチド合成とは対照的に、テトラペプチド合成は、脱アシル化ｔＲＮＡのリボソーム出口部位からの解離なしにはあり得ない（Ｗｉｌｓｏｎ及びＮｏｌｌｅｒ（１９９８）Ｃｅｌｌ ９２，３３７−４９）。テトラペプチドｆＭＴＴＶをコードする鋳型を使用して（図３）、二重標識産物の合成を逆相ＨＰＬＣで評価した（図６）。放射性ペプチドを化学合成された非放射性標準物との共移動に基づいて同定した。ペプチジル分離範囲の主要放射性ピークは、予期されるＴ／Ｖ比に近い比を有するｆＭＴＴＶテトラペプチドに相当する（この範囲内の¹⁴Ｃ又は³Ｈ放射活性の８０〜８５％）。２つの副ピークは、予期されるように、³Ｈが全く取り込まれていない休止又は早期終結産物であるｆＭＴ及びｆＭＴＴに相当する。ｆＭＴ及びｆＭＴＴは、共に、ペプチジル範囲内の¹⁴Ｃ放射活性の１２％を含有し、これはモルベースでは結合産物ｆＭＴＴＶ、ｆＭＴＴ及びｆＭＴの２０％に相当する。残りの２つの副ピーク（２４及び５０分での）は、おそらくｆＭＴＶの誘導体（例えば、メチオニン酸化産物又はホルミル化されていないペプチド）、その他のペプチジル産物及び／又はペプチドでなはない放射性汚染物に相当する。従って、精製されたｈｉｓタグテトラペプチド翻訳系は、大多数ではあるが完全に前進的ではなく、全長テトラペプチド産物の収率は、ペプチド産物の８０％に等しい。この詳細な分析は、添加されたＥＦ−Ｐ、Ｗ及びレスキューがない場合の連続移動性が以前に報告されたもの（Ｇａｎｏｚａ他（１９８５）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８２，１６４８−５２）よりも非常に高いことを示した。
【０１００】
本発明の in vitro 翻訳系によって効率的に合成されるペプチドのさらなる例を表２に示す。予期される７−ｍｅｒの全長ｆＭＴＴＴＴＴＶペプチド産物の合成は非常に前進的であった。これは、早期終結産物の圧倒性が、測定された６．４の値よりもさらに大きいＴ／Ｖ比を生じさせたためであろう。
【０１０１】
オリゴペプチド合成に及ぼす上流でのｍＲＮＡ変異の影響。
翻訳開始に関して未解決の問題は、精製系におけるε配列の影響である。従って、εをスクランブリング又は欠失させる効果を、ｍＲＮＡのεスクランブルＭＶＴとε欠失ＭＶＴ（図３）及びｍＲＮＡのＭＶＴに対して飽和する鋳型濃度（１μＭ）を使用して、開始速度を制限する条件下（図４参照）で決定した。図７は、Ｕリッチなε配列をスクランブリングするとｆＭＴＶ合成が低下し、この配列を欠失させると産物合成の初速度が５倍低下することを示している。ｍＲＮＡε欠失ＭＶＴの濃度がそれよりも高い１４倍までであると、ｆＭＶＴの収率を実質的に増加させることができなかった（データは示さない）。
【０１０２】
非天然アミノ酸の取り込み及び選択。
本発明のテトラペプチド合成方式は、力学的実験又は選択実験用のリボソームによる非天然アミノ酸の取り込みについての試験を含めて、多くのタイプの開始及び伸長アッセイに直接適用できる。例えば、基質である³Ｈ−ｆｍｅｔ−ｔＲＮＡ_i ^fmet、¹⁴Ｃ−ｔｈｒ−ｔＲＮＡ₃ ^thr、ビオチン標識ｌｙｓ−ｔＲＮＡ^lys（プロメガ社）及び³Ｈ−ｖａｌ−ｔＲＮＡ_l ^valを使用してｍＲＮＡのｍＭＴＫＶを翻訳すると（図３）、ｍＲＮＡのリシンコドンとビオチン標識ｌｙｓ−ｔＲＮＡ^lysとに依存する態様で産物を軟質アビジンビーズ（プロメガ社）と共に精製することによって評価されるように、ビオチンと³Ｈ−バリンの両方を含有するペプチド産物（ｆＭ−Ｔ−ｂＫ−Ｖ）を産生した（図８）。この実験は、この精製翻訳系が容易に選択できる大きな非天然アミノ酸を取り込むことができることを示している。
【０１０３】
ビオチン・アビジン相互作用のＫ_d（１０^-15Ｍ）が標的に非共有結合的に且つ１価として結合される任意のリガンドで知られている最も低いものの一つであれば、本発明者が合成したビオチン含有疑似ペプチドは、そのコグネイト標的（アビジン）の１種に対して親和性を有し、これはそれと同様の長さのどんな天然ペプチドのそのコグネイト標的に対する親和性よりも大きいことが予期される。非常に高い親和性のリガンドの同定がライブラリースクリーニング実験に最も望ましいならば、非天然アミノ酸を使用できるリガンドスクリーニング法の天然アミノ酸しか使用できない方法を超える見込まれる利点は、本発明のビオチニルリシン含有ペプチドについての上記の例によって例示される。
【０１０４】
また、図８の実験に類似する実験もビオチニルＣｙｓ−ｔＲＮＡ^cysで実施したが、ただし、この場合には、使用したビオチニル−アミノアシルｔＲＮＡ種を他の手段で精製した。純粋なｔＲＮＡ^cysアイソアクセプター（Ｓｕｂｒｉｄｅｎ ＲＮＡ）にｔＲＮＡを含まない粗製のシンテターゼ抽出物を使用してＣｙｓを結合させ、得られたＣｙｓ−ｔＲＮＡ^cysを、公開された方法（大塚他（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｙｍｐ．３７，１２５−１２６）を多少改変してビオチンで化学的に標識し（図９）、ビオチニル−Ｃｙｓ−ｔＲＮＡ^Cysをゲル精製し（図１０）、次いでビオチニル−Ｃｙｓ（ｂＣと略記する）を疑似ペプチドに取り込ませ、そして軟質アビジンに結合させた（図１１及び１２）。図１２の結果は、本発明の in vitro 系が特に２種の隣接する大きな非天然アミノ酸を取り込むことができる可能性があることを示唆している。
【０１０５】
重要なことには、図１１の非結合ｔＲＮＡ^cysによる翻訳は、³Ｈの取り込みを全く与えなかったので、この精製系は結合活性がなく且つ外因性の基質に特異的であったことを示している。また、これは、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを含まない純粋な系について予期されるように、非結合ｔＲＮＡ^Thr又は非結合ｔＲＮＡ^Valによって「種をまかれる」翻訳のためであることも示している。このシンテターゼはＥ．ｃｏｌｉの最も数の多い蛋白質の１種であり、しかもリボソーム調製物はそれらの精製のために使用できる（Ｇａｎｏｚａ他（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ ７８，５１−６１）ので、本発明の純粋な翻訳系がシンテターゼ活性を欠損していたことを確かめるためにさらなる実験を行った。図１３は、本発明の「蛋白質ポリメラーゼ」が汚染性のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを欠損していたことを裏付けた。
【０１０６】
ペプチド及び疑似ペプチド産物の精製。
斯界において標準的ないくつかの別法（非変性法又は変性法のいずれか）がペプチジルｔＲＮＡから遊離のペプチド又は疑似ペプチドを放出させるために使用できる。この方法の例として、塩基による化学的加水分解（例えば、図４〜８）、終結因子（表３）又はペプチジルｔＲＮＡ加水分解酵素（Ｋａｒｉｍｉ他（１９９８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８１，２４１−２５２のように精製され且つ使用される）による酵素的触媒作用及びプロマイシン抗生物質又はその誘導体（図２１）による求核攻撃が挙げられるが、これらに限定されない。ペプチド又は蛋白質精製のための斯界において標準的な多数の方法うち任意の方法（非変性法又は変性法）がペプチド及び疑似ペプチド産物の精製のために使用できる。これらの方法の例として、固形物担体を使用する親和性精製（例えば、図８、１１及び１２の軟質アビジンビーズとビオチンの間の相互作用を使用する）、クロマトグラフィー（例えば、図４及び５の陽イオン交換クロマトグラフィー若しくは図６の逆相ＨＰＬＣを使用する）又は溶液からの沈殿（例えば、図２０のＴＣＡを使用する）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０７】
高いことが示された本発明の翻訳系の純度（表１、図１、５、１１及び１３）並びにＥＦ−Ｐ、Ｗ及びレスキューが前進型翻訳のために明らかに重要でないことにもかかわらず、これらの因子の１種以上がリボソームを汚染しているという議論（発明の背景参照）を除外するためにさらなる実験を行った。リボソームからＥＦ−Ｐ、Ｗ及びレスキューを除去するための公開された方法（Ｇｒｅｅｎ他（１９８５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１２６，７９２−７９８）は、リボソームを５倍にまでそれぞれの遠心分離の間に高濃度塩（０．５〜１Ｍ）で一晩洗浄することによってペレット化することである（塩洗浄が多ければ多いほどリボソームの純度は高い）。本発明のリボソームは３回の高濃度塩洗浄で４倍にペレット化されたため、本発明のリボソームはＧｏａｎｚａのものに匹敵する純度を有していよう。それにもかかわらず、追加の（４回目の）高濃度塩洗浄を取り入れた異なるバッチのリボソームを調製し（Ｇｏａｎｚａの最も高度に洗浄されたリボソームと同一の総数）、さらに、最後の１５００００ｇの遠心分離物を、ペレット化物を容易に取り出すために２段階に分けた。第１段階では、遠心分離を最大速度で１分間にわたって行い、得られたペレットを処分した（この物質は２６０ｎｍでの低い吸光度に基づく主にリボソームではないものであった）。第２段階では、上澄み液からリボソームを長期間にわたる遠心分離によってペレット化させた。これら４×洗浄リボソームの純度は、開始及び翻訳のための翻訳因子への大きな依存に基づいて非常に高いものであることが立証された（表１及び図５のようにアッセイされた）。追加の対照として、本発明の翻訳因子の全て（このものはＮｉアフィニティークロマトグラフィーによって予め精製された）をさらに追加のゲルろ過クロマトグラフィー段階によって別々に精製した。これら４×洗浄リボソームとＮｉ／ゲル精製因子の組合せは、１０１個のアミノ酸（図２０参照）程度に長いペプチドの合成では活性且つ前進的でり、しかもこの追加の精製段階は、３×洗浄リボソーム及びＮｉ精製因子と比較して本発明に有意に影響を及ぼさないことが分かった。これらの研究は、本発明の翻訳系がＥＦ−Ｐ、Ｗ及びレスキューに依存しないことを確認するものである。
【０１０８】
本発明の他の具体例は、ＥＦ−Ｐ、Ｗ及びレスキューを欠失した本発明の単純化された翻訳系のバージョンであって、その成分の１種以上が実質的に濃度調節され又は完全に除外されたものである。例えば、たいていの場合、ＰＥＧを除外すると収率がほぼ２５％だけ減少し、効率的な翻訳はＩＦ１なしで生じる（表２、図５）。本発明のその他の標準的な翻訳開始因子及び伸長因子を含めることは、一般的に使用される条件下では効率のために重要であるが、産物合成にとって必須ではない（図５）。実際に、モデル系での効率的な翻訳は、細菌の開始因子（即ち、ＩＦ１、ＩＦ２及びＩＦ３）をより高濃度の陽イオンで置き換える（例えば、Ｍｇ²⁺又はポリアミン、Ｗａｇｎｅｒ他（１９８２）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，１２２，１９３−１９７）ならば、この開始因子のいずれかなしに可能である。
【０１０９】
本発明のさらに別の具体例は、上に詳述した本発明の単純化された精製翻訳系のバージョンであって、翻訳に関与し又は翻訳を刺激することが知られているその他の精製高分子及び小分子のうち１種以上が添加されたものである。これらは、細胞性の全ｔＲＮＡ又はそれらの画分、細胞性の全アミノアシルｔＲＮＡ又はそれらの画分、合成型の結合又は非結合ｔＲＮＡ、２０種の天然アミノ酸のそれぞれに対するアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼのうち１種以上、Ｍｅｔ−ｔＲＮＡ_i ^fMetホルミルトランスフェラーゼ（メチオニルｔＲＮＡトランスフェラーゼとも呼ばれる）、Ｎ¹⁰−ホルミルＴＨＦシンテターゼ及びＴＨＦ誘導体、伸長因子Ｔｓ（材料及び方法参照）、終結因子（ＲＦ１、ＲＦ２、ＲＦ３及びＲＲＦ又はＲＦ４）、転写と翻訳を対で行うためのＤＮＡ鋳型とＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡヘリカーゼ、シャペロン（Ｈａｒｄｅｓｔｙ他（１９９９）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ ９，１１１−４）、ショ糖密度勾配遠心分離法のような異なる手順により精製されたリボソーム（サブユニットへの分離を含めて）、ポリアミンを含めて「ポリミックス緩衝液」の成分（Ｊｅｌｅｎｃ及びＫｕｒｌａｎｄ（１９７９）ＰＮＡＳ ７６，３１７４−３１７８）並びにクレアチンキナーゼ、ミオキナーゼ及び／又はピロホスファターゼ（清水他（２００１）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９，７５１−７５５）を有する系のような本発明のピルビン酸キナーゼ系とは異なるエネルギー関連系を包含するが、これらに限定されるべきではない。また、非天然アミノ酸の取り込みを改善させる本発明の組換え非標識ＩＦ１、ＩＦ２及びＩＦ３（材料及び方法参照）又はＥＦ−Ｔｕ誘導体のような天然成分の非標識の又は変異されたタイプを添加し、或いはこれらで置き換えることも純粋な翻訳系では可能である。
【０１１０】
例えば、図６及び１１のような本発明の単純化された精製翻訳系は、細菌の終結因子の添加によって刺激される（表３）。本発明の翻訳にシンテターゼ（例えば、Ｔｈｒ及びＶａｌに対するシンテターゼ）をアミノ酸ＴｈｒとＶａｌ及びＡＴＰと共に添加すると、それぞれの非結合ｔＲＮＡからそれぞれのアミノアシルｔＲＮＡを生成及び再生成できる（示さない）。ＤＮＡ鋳型、ＮＴＰ及びＲＮＡポリメラーゼを添加すると、転写と翻訳を対で行うことができた（表２）。また、ポリエチレングリコールのようなその他の分子の添加でも刺激されることが分かった（示さない）。また、細胞から酸・フェノール抽出によって単離された全アミノアシルｔＲＮＡ（「Ｖａｒｓｈｎｅｙ他（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６，２４７１２−２４７１８」、以下の図１６、レーン２も参照）も本発明の精製翻訳に有効である。基質調製のための別法は、脱アシル化された全ｔＲＮＡを翻訳前に試験管内で結合させることである（Ｇｒｅｅｎ他（１９８５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１２６，７９２−７９８）。後者の方法は、適切なｔＲＮＡ上に結合した放射性標識された又は非天然のアミノ酸の取り込みを可能にさせるように、ある種のアイソアクセプターｔＲＮＡを選択的に消耗させ又は不活性化させる（例えば、アイソアクセプターに特異的なＤＮＡオリゴマーとＲＮアーゼＨを使用して（神田他（１９９８）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４４０，２７３−２７６））ことにさらに容易に適合できるという利点を有する。
【０１１１】
仮特許出願の６ヶ月後に、精製翻訳系におけるＥＦ−Ｐ、Ｗ及びレスキューのこの可欠性に関してさらなる証拠が公開された（所望ならば清水他（２００１）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９，７５１−７５５を参照されたい）。本発明の好ましい系とは対照的に、これらの本発明系の変形系は、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを含有していた。翻訳は、よく特徴付けられた翻訳因子及びシンテターゼの全ての組換えタイプでもってＥＦ−Ｐ、Ｗ、Ｗ２及びレスキューを添加することなく効率的に再構成されていた。しかしながら、リボソームは、Ｇａｎｏｚａ及び本発明の方法とは別の方法（より少ない塩洗浄を使用する）によって調製され、そして２０種の異なるシンテターゼのうち３種への依存性が不十分であった。これは、ＥＦ−Ｐ、Ｗ、Ｗ２及びレスキューによる汚染の可能性を高める。それにもかかわらず、これらの因子の大部分への強い依存性が報告され、いくらかの蛋白質を効率的に合成した。
【０１１２】
シンテターゼの認識を回避するように変異された化学結合サプレッサーｔＲＮＡを使用してバリンを効率的に取り込むためにある種の終止コドンが補充されたが、この文献の主張に反して、非天然アミノ酸の取り込みは試験されなかった（清水他（２００１）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９，７５１−７５５）。場合によっては、この本発明の系を変形した系でのサプレッサーｔＲＮＡによる非天然アミノ酸の取り込みは、ある種の終結因子との競合をこれらのものを単に除外することによって回避できるという利点を有するかもしれない。しかしながら、粗製抽出物を使用する非天然アミノ酸の取り込みのための既存の系（発明の背景参照）と同様に、この戦略は、おそらく３種の終止コドンのうち１種のみ（ＵＡＧコドン）での１蛋白質当たり１個だけのタイプの非天然アミノ酸の取り込みに制限される。これは、添加された２０種の異なるアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼのｔＲＮＡ結合活性とプルーフリーディング活性によって触媒されるセンスコドンでの天然アミノ酸による競合のため及びリボソームによるリードスルーのため第２の終止コドン（ＵＧＡ）を使用する試みが失敗したためである（Ｃｌｏａｄ他（１９９６）Ｃｈｅｍ．ａｎｄ Ｂｉｏｌ．３，１０３３−１０３８）。場合によっては、このような系で複数の異なる非天然アミノ酸の取り込みを可能にさせるために、このサプレッサーアンチコドンは、ある種のセンスコドンを認識させるように変異できたかもしれず（塩基対合によって）、これらのコドンでの競合は、同種の（コグネイト）天然アミノ酸及びシンテターゼを除外することによって回避できたかもしれない。しかしながら、２０種のシンテターゼの大部分にとっては、そのコグネイトｔＲＮＡアイソアクセプター基質のアンチコドンは最も重要な認識要素であるため、サプレッサーｔＲＮＡのアンチコドンが変化すると望ましくないシンテターゼの認識に至り（時として交差認識の予測できない特異性によって）、しかしてプルーフリーディング及び／又は天然アミノ酸の結合に至ると思われる（Ｇｉｅｇｅ他（１９９８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２６，５０１７−５０３５）。さらに、シンテターゼの認識を防止することを意図したｔＲＮＡの変異は、ＥＦ−Ｔｕ及び／又はリボソームの認識効率をも減少させ、それによって運ばれたアミノ酸の取り込み効率を減少させる可能性がある。これらのシンテターゼ認識の困難性及び２０種類もの数の異なるシンテターゼ蛋白質を過剰発現させることに関わる困難性のために（Ｓｗａｒｔｚ（２００１）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９，７３２−７３３）、本発明者は、非天然アミノ酸による本発明の試験のためにシンテターゼを含まない翻訳系を選んだ。
【０１１３】
本発明者は、化学的に結合されたｔＲＮＡを使用して数種の非天然アミノ酸の取り込みを試験した。第１段階は、非天然アミノ酸による化学的な誤アシル化を可能にさせるように、末端ＣＡジヌクレオチドを欠失した合成伸長体ｔＲＮＡを一般化できる態様で構築することであった。現在の技術は、シンテターゼのいずれかによる結合及びプルーフリーディングを避けるように特別に設計された人工サプレッサーｔＲＮＡに依存している。本発明の精製系では、本発明者は、ｔＲＮＡ塩基修飾活性の予期される欠如について見込まれる効果のみを問題にした。なぜならば、このような修飾は機能にとって重要であり得（Ｂｊｏｒｋ他（１９９９）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４５２，４７−５１）、粗製翻訳系は合成ｔＲＮＡを修飾し得るからである（Ｃｌａｅｓｓｏｎ他（１９９０）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２７３，１７３−６）。新規の試験の雛形として、本発明者は、Ｅ．ＣｏｌｉのｔＲＮＡ^Asn（図１４、大橋他（１９７６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３，３３６９−３３７６）及びｔＲＮＡ^Ala（以下に議論する。Ｐｉｃｋｉｎｇ他（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９，５７４９−５７５４）を選択した。ｔＲＮＡ^Asnの５’末端配列をＴ７ＲＮＡポリメラーゼによる最適な転写のために変異させたが、Ｍ１ＲＮＡ又はＲＮアーゼＰを使用して合成非修飾ｔＲＮＡ前駆体を処理するような突然変異誘発とは別の戦略もある（Ｆｏｒｓｔｅｒ及びＡｌｔｍａｎ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９，７８３−７８６）。また、両者のｔＲＮＡのアンチコドンも改変されたコドン認識特性を有するいくつかの変異体を生じさせるように変異させた（本発明のｔＲＮＡ^Asn変異体のうち３種を図１５に示す。ｔＲＮＡによって認識されるアミノ酸コドンはその括弧内に示されている）。非天然アミノ酸であるアリルグリシン（ａＧ、或いは２Ｐと略記される）をＮＶＯＣ基でアミノ保護し、そしてＴ４ＲＮＡリガーゼを使用して標準的且つ一般的な戦略で（材料及び方法参照。「Ｔｈｏｒｓｏｎ他（１９８８）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ７７，４３−４７」、「Ｓｔｅｗａｒｄ及びＣｈａｍｂｅｒｌｉｎ（１９９８）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ７７，３２５−３５４」）ｔＲＮＡ^Asn（Ｎ）に連結して（図１４）ゲル上で予期される移動度でもって移動する種を得た（図１６、レーン６）。
【０１１４】
ＮＶＯＣａＧ−ｔＲＮＡ^Asn（Ｎ）のアミノ基を紫外線光分解法によって脱保護し、そのａＧ−ｔＲＮＡ^Asn（Ｎ）をｍＭＴＮＶ鋳型を含有する純粋な翻訳反応に添加した。ａＧは、下流の³Ｈ−Ｖの取り込みを可能にするようにＮコドンにうまく取り込まれたが、ｍＭＴＶの対照の翻訳よりも低い収率を示した（図１７）。このより低い収率は、主にこの系を飽和させるのには不十分なａＧ−ｔＲＮＡ^Asn（Ｎ）を使用するためであることが分かった。なぜならば、ａＧ−ｔＲＮＡ^AsnのＲＮＡ濃度を１μＭにまで倍加させる（転写及び連結反応からのａＧ−ｔＲＮＡ^Asn（Ｎ）の収率が１００％であると見なして翻訳系中のそれぞれの天然アミノアシルｔＲＮＡ濃度を倍加させる）と、収率が倍増し且つ約６５％の連続移動率でアナログを取り込んだ（アナログの前の¹⁴Ｃ−Ｔ及びその後の³Ｈ−Ｖの取り込みに基づく）からである。ｍＭＴＮＮＶの翻訳は、隣接したアナログの取り込みを示し、この第２のアナログの取り込みについての連続移動率（％）は、これらのアナログ基質制限条件下では第１のアナログと同様であった。一般的な偏在性ＣＣＡ３’配列で終結することを除いて図１４のｔＲＮＡ^Asn（Ｎ）と同一構造を有する非結合ｔＲＮＡによるｍＭＴＮＶ及びｍＭＴＮＮＶ（ＢｓｔＮＩで切断された鋳型のランオフ転写によって生じる）の翻訳は、取り込みを全く与えなかったことに留意されたい。これは、この精製系がこの変異ｔＲＮＡ^Asn（Ｎ）についての結合活性を欠損しており、しかもＮコドンでの外因性基質の取り込みに対して特異的であったことを示している。追加の対照として、非結合ｔＲＮＡ^Asn（Ｎ）は、ｍＭＴＶの翻訳を抑制しなかった（図１７）。
【０１１５】
センスコドンが選択的なアミノ酸の取り込みに一般的な態様で奪い取られたという確証を得たならば、次の段階は、ａＧ及びその他の非天然アミノ酸の取り込み効率を最適化することなので、Ｏ−メチルセリン（ｍＳ）及びアラニンのＮＶＯＣアミノ保護型を調製した（材料及び方法参照）。ａＧ、ｍＳ又はＡｌａで化学的にアミノアシル化された高濃度（７μＭまで）の様々なｔＲＮＡ^Asn（図１４及び１５）を使用することによって、Ｔｈｒ−ｔＲＮＡ^Thrで得られた取り込み効率の９０％以上の取り込み効率が得られた（示さない）。
【０１１６】
興味深いことに、非修飾ａＧ−ｔＲＮＡ^Ala（Ｎ）であって、公表された合成ｔＲＮＡ^Ala（Ｐｉｃｋｉｎｇ他（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９，５７４９−５７５４）と比較してそのアンチコドンにＧＵＵ置換を有するものは、翻訳が全体的に不活性であった。しかしながら、粗製のｔＲＮＡを含まない細胞抽出物を使用してＡｌａを結合させると、効率的に取り込まれるＡｌａ−ｔＲＮＡ^Ala（Ｎ）を生じた。この活性の獲得は、ａＧがｔＲＮＡ^Asn（Ｎ）に良好に作用したので恐らくアミノ酸の相違によるものではなく、粗製抽出物の塩基修飾活性によるものと思われる。この結果は、ｔＲＮＡの塩基修飾がある種のｔＲＮＡの翻訳活性にとって極めて重要であり、しかも適切な原型ｔＲＮＡの初期選択が試行錯誤を必要とする自明でないプロセスであるという本発明の仮説と一致する。別の問題は、ある種の非修飾アミノアシルｔＲＮＡが標準的な精製手順中に変性によって不活性化されることである（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ他（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２，７６１７−７６２２）。それにもかかわらず、いったん本発明のｔＲＮＡ^Ala（Ｎ）のような安定な活性の非修飾ｔＲＮＡが同定されたならば、アンチコドン変異体であってその他のコドンを予測できる態様で認識するものを作るのは容易である（図１５、下部参照）。
【０１１７】
表４は、５個の連続的な非天然アミノ酸（ａＧ）の７ｍｅｒ疑似ペプチド産物内への添加されたａＧ−ｔＲＮＡ^Asn（Ｔ）に完全に依存する態様での典型的な取り込みを示している。これは、長さの点だけでなく、より重要なことには一般化及び有用性の点でも、２個の連続的な非天然アミノ酸について公表された記録（芳坂他（１９９９）ＪＡＣＳ １２１，１２１９４−１２１９５）を向上させている。十分に異なるアミノ酸単量体を与えると、無作為の７ｍｅｒ疑似ペプチドライブラリーは、実質的な疑似ペプチド多様性をコードできる。４種の異なる非修飾ｔＲＮＡ^Asn変異体であってそのＴコドンについてｍＳで及びそのＮ、Ｓ及びＶコドンについてａＧで化学的にアミノアシル化されたものを使用することが図１４及び１５に示されており、全長産物がカルボキシ末端³Ｈ−Ｅの取り込みに基づいて合成された（表５）。これは、単一産物中に複数且つ異なる非天然アミノ酸が取り込まれた証拠を与える。付加されたｍＳへの完全な依存性は、ｍＳが実際に取り込まれ、しかもこのＴコドンがｔＲＮＡ^Asn（Ｔ）に対して特異的である（即ち、図１４及び１５に示される密接に関連したアンチコドン変異体のｔＲＮＡ^Asn（Ｎ）、ｔＲＮＡ^Asn（Ｓ）及びｔＲＮＡ^Asn（Ｖ）によって誤読されない）ということを立証した。
【０１１８】
非天然アミノ酸によるセンスコドン置換という本発明の戦略は一般化できるものであり、しかして６１種のセンスコドン全てに拡張すべきである。自然型（２１種の天然アミノ酸のみ）によるコドン使用の有意な重複を与えるならば、単一のｍＲＮＡを実質的に２１種以上の異なるアミノ酸に翻訳できるアミノアシルｔＲＮＡライブラリーを創作することが可能であろう。３種の終止コドンは本発明の系では必ずしも必要ではないが、これら全てはサプレッサーにより翻訳され得るかもしれないので、見込まれるリードスルーの問題（Ｃｌｏａｄ他（１９９６）Ｃｈｅｍ．ａｎｄ Ｂｉｏｌ．３，１０３３−１０３８）は、リードスルーを引き起こす天然のアミノアシルｔＲＮＡを除外することによって克服される。ＡＵＧ開始コドンとｆＭｅｔ開始体アミノ酸を効果的に置換すると、伸長から一連の異なる分子間接触が維持されるが、これは既知の許容できる置換に基づいて生体内及び試験管内でできる（「Ｐｉｃｋｉｎｇ他（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９，５７４９−５７５４」、「Ｗｕ及びＲａｊＢｈａｎｄａｒｙ（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，１８９１−１８９５」）。
【０１１９】
Ａ．in vitro ライブラリー
リボソーム上で発現するペプチドアナログのコンビナトリアル・ライブラリーからのペプチド又は疑似ペプチドの試験管内での定向進化は、任意の選択の標的分子に結合するリガンド又は薬剤候補物の迅速な進化のために効果的な方法である。粗製抽出物で実施されるリボソームディスプレイ（Ｍａｔｔｈｅａｋｉｓ及びＤｏｗｅｒ（１９９５）ＰＣＴ ＷＯ９５／１１９２２）に関連する本発明の「純粋なリボソームディスプレイ」（図１８）の例は、次の段階及びそれらの別法からなる。
【０１２０】
ＤＮＡライブラリーの構築：
無作為化された又は部分的に無作為化されたコード配列を含む合成オリゴデオキシリボヌクレオチドを化学的に合成し、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター（例えば、バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼ）、翻訳開始配列及び開始コドンを含むオリゴデオキシリボヌクレオチドにハイブリダイズさせ、ＤＮＡポリメラーゼで伸長させ、ＤＮＡリガーゼによってオープンリーディングフレームをコードするプラスミド制限断片（例えば、図１９に示される本発明の長鎖配列のような反復スペーサーアミノ酸配列）に連結し、ゲルで精製し、そして定量する。
【０１２１】
段階１（図１８）：合成ＤＮＡライブラリーをＲＮＡポリメラーゼでｍＲＮＡライブラリーに転写する。
【０１２２】
段階２：ｍＲＮＡライブラリーを、本発明の精製されたリボソーム、翻訳因子及びある種の（全てではない）野生型アミノアシルｔＲＮＡとアミノ酸アナログを結合した特別に合成されたｔＲＮＡとの混合物を含有する再構成アミノアシルｔＲＮＡプールでペプチドアナログに翻訳する。好ましくは、それぞれのｍＲＮＡコドンは、該プール中のユニークな結合ｔＲＮＡによって解読されるため、このｍＲＮＡの配列は、ユニークなペプチドアナログ配列を規定している。例えば、図１９の本発明のスペーサー配列であってそのいくつかがリボソームトンネルを横断するほどに長いものは、良好な連続移動率で合成された（図２０）。蛋白質合成を、例えば、終止コドンを欠失している鋳型の末端に到達させることによって、終結因子を除外することによって、供給されるアミノアシルｔＲＮＡが全くないコドン（図１９及び２０の最長産物の場合にはＡｓｎコドンのような）に到達させることによって又は抗生物質で立ち往生させることによって停止させる。
【０１２３】
段階３：無作為ペプチドアナログを含有するリボソームを遠心分離によって単離し、次いで固定化された標的物と共にインキュベートし、そして結合していないリボソームを洗い流す。結合したリボソームを解離させ（例えばＥＤＴＡで）、放出された選択ｍＲＮＡを精製する。
【０１２４】
段階４：ｃＤＮＡ合成及びＰＣＲ増幅。Ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ ＰＣＲを使用して突然変異を導入する。
【０１２５】
段階１〜４の反復：これらの選択及び増幅段階を必要に応じて１回以上繰り返す（以下参照）。
【０１２６】
段階５（示さない）：増幅されたＤＮＡを、選択され且つ増幅された疑似ペプチドの構造を推定するために、ＤＮＡシーケンス法による分析用のプラスミドにクローン化させる。選択されたコンセンサス配列の同定は、反復した選択及び増幅（段階１〜４）の十分なラウンドが使用され、しかもリガンドがこの実験によって同定されたという証拠となる。さらに、サイクルを使用してより高い親和性を有するリガンドを生じさせることができる。
【０１２７】
リボゾームの非存在下での選択段階を可能にする方法の改変：
ＤＮＡ鋳型を、タンパク合成中にペプチドアナログに導入されるときに、ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡに結合する分子（例えば、ペプチドタグに対して高い親和性を有する抗体に共有結合するハイブリダイズした相補ＤＮＡプライマー）に対して高い親和性を有するペプチドタグをコードするように修飾する。このとき、このペプチド・ｍＲＮＡを選択段階の前にリボソームから分離してもよい。これらの方法及びその他の可能な別法は今までに記載されている（Ｍａｔｔｈｅａｋｉｓ及びＤｏｗｅｒ，上記、土井及び柳川（１９９９）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４５７，２２７−２３０）。別法として、ｍＲＮＡは、プロマイシンで３’末端標識されていてもよく、そのため「純粋なｍＲＮＡディスプレイ」用のペプチドに直接結合できる（図２１、以下参照）。
【０１２８】
Ｓｚｏｓｔａｋ他のＰＣＴ公開ＷＯ００／０４７７７５号及びＷＯ９８／３１７００号（所望ならば参照されたい）は、対象のペプチド及び疑似ペプチドをコードするＲＮＡ分子に共有結合される該ペプチド及び疑似ペプチドの形を生じさせるために、本発明に容易に適合できる方法を記載している。即ち、本発明は、疑似ペプチドであってその自身のｍＲＮＡの３’末端に共有結合したもの、即ち、ＲＮＡ・疑似ペプチド融合体を生成させるプロトコルを提供する。
【０１２９】
これは、ｍＲＮＡ分子をその３’末端に結合したペプチドアクセプターと共に合成及び in vitro 又は in situ 翻訳することによって達成される。一つの好ましいペプチドアクセプターは、成長しつつあるペプチド鎖のＣ末端に付加し且つ翻訳を終結させるヌクレオシドアナログのプロマイシンである。一つの好ましい設計では、あるＤＮＡ配列が遺伝子情報の末端とリボソームをオープンリーディングフレームの末端で停止させるためのペプチドアクセプターとの間に含まれ、このペプチドアクセプター（例えば、プロマイシン）がペプチジルｔＲＮＡ連結体の加水分解前に初期のペプチド鎖を受容する追加時間を与える（図２１）。
【０１３０】
所望ならば、得られたＲＮＡ・疑似ペプチド融合体は、選択及び増幅のラウンドを繰り返してもよい。なぜならば、このコード配列の情報は、逆転写及び増幅（例えば、ＰＣＲ増幅並びに３ＳＲ又はＴＳＡのようなＲＮＡベースの増幅技術を含めてその他の増幅技術によって）によって回復できるからである。次いで、増幅された核酸を転写させ、修飾させ、in vitro 又は in situ 翻訳させて次の選択ラウンド用のｍＲＮＡ・疑似ペプチド融合体を生成させる。この選択及び増幅の複数ラウンドを実施する能力は、非常に希少な分子（例えば、１０⁵種の構成分子からの１種の所望の分子）を富化及び単離するのを可能にする。このことは、結果として、新規な又は改良された、特に任意の標的を実質的に認識し又は所望の化学反応を触媒するペプチド及び疑似ペプチドの単離を可能にする。
【０１３１】
従って、ある態様では、本発明は、（ａ）候補のＲＮＡ分子集団であって、これらのいずれかが翻訳開始配列及びある候補の蛋白質コード配列に作動可能に連結した開始コドンを含み、これらのいずれかが該候補蛋白質コード配列の３’末端でペプチドアクセプターに作動可能に連結したものを与え、（ｂ）天然型及び／又は非天然型アミノ酸の存在下に該候補蛋白質コード配列を in vitro 又は in situ 翻訳させて候補のＲＮＡ・疑似ペプチド融合体の集団を産生させ、（ｃ）所望のＲＮＡ・疑似ペプチド融合体を選択し、それによって所望の疑似ペプチドを選択する段階を含む、所望の蛋白質又は疑似ペプチドの選択方法に関する。
【０１３２】
上記方法の好ましい具体例では、候補ＲＮＡ分子の集団は、少なくとも１０²種、好ましくは、少なくとも１０⁵種、より好ましくは１０¹⁰種又は１０¹⁵程度の異なるＲＮＡ分子を含む。重要なことには、in situ 翻訳反応は、好ましくは、粗製翻訳系ではなく再構成された精製混合物中で実施される。選択段階は、疑似ペプチドを固定化された結合の相手に結合させること又は疑似ペプチドの機能活性についてアッセイすることを含む。
【０１３３】
別の関連する態様では、本発明は、ここに記載される選択方法のいずれかを実施するためのキットに関する。
【０１３４】
最後の態様では、本発明は、固定化された本発明の疑似ペプチドの配置を含むマイクロチップに関する。
【０１３５】
Ｂ．標的分子
標的分子は、実質的には、本発明のペプチド又は疑似ペプチドとの相互作用が有用であり得る任意の分子であることができる。ある種の具体例では、標的分子は、核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）、蛋白質、脂質、炭水化物などのような生体高分子である。
【０１３６】
ポリペプチドスクリーニング用標的物を選択する際に考慮され得る因子には、溶解度、ペプチド鎖の長さ、翻訳後修飾の必要条件若しくはコファクターの付加及び／又はこの標的がベースとしている蛋白質のモノマー又はオリゴマーの性質が含まれる。一般に、ペプチドの標的は、可溶性で、部分的に精製され又は純粋であり、しかも斯界に標準的な方法によって固体担体上に固定化されていることが望ましいであろう。
【０１３７】
従って、本発明は、ＳＨ２ドメイン、ＳＨ３ドメイン、アンキリン様リピート、ＷＤ４０モチーフ、Ｋｕｎｉｔｚ型阻害剤のドメイン、ＥＦＧ様ドメインのような増殖因子様ドメイン、クリングルドメイン、フィブロネクチンンフィンガー様ドメイン、ヘパリン結合ドメイン、デスドメイン、ＴＲＡＦドメイン、プレクストリン相同（ＰＨ）ドメイン、ＩＴＡＭ、キナーゼドメインのような触媒ドメイン、ホスファターゼドメイン、ホスホリパーゼドメイン、グアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）ドメイン及びヒドロラーゼドメイン（例えばプロテアーゼドメイン）又はＤＮＡ結合ドメイン、例えばロイシンジッパー、ジンクフィンガー及びへリックス・ループ・へリックスモチーフのようなドメイン構造に相当する（例えば、これらを含む）スクリーニング用標的物を意図する。
【０１３８】
対象の蛋白質が膜貫通蛋白質である場合には、スクリーニング用標的物は、可溶性の細胞外又は細胞質ドメインから得ることができる。例示のために、スクリーニング用標的物は、グアニリルシクラーゼ、シトキン受容体、チロシンキナーゼ受容体又はセリン／トレオニンキナーゼ受容体の細胞外ドメインに相当し得る。その他の具体例では、スクリーニング用標的物は、リガンド結合活性を保持しているＧ蛋白質共役型受容体（ＧＣＲ）の可溶性部分に相当し得る。例えば、上記のように、ＧＣＲの膜貫通部分の間の細胞外ループのうちのある種のものは、溶液状でなくなったときでさえもリガンド結合活性を保持することが示された。さらに別の具体例では、スクリーニング用標的物は、リポソームのような脂質二重層又はその他の小胞中で再構成でき（例えば、Ｋａｌｖａ Ｋｏｌａｎｕ他（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １１：２４８並びにＨｕａｎｇの米国特許第４９５７７３５号及び同第４７０８９３３号を参照）、この脂質／蛋白質結合体をスクリーニング用標的物として使用できる。
【０１３９】
単なる例示の目的のために、以下の蛋白質標的物を対象の方法に使用するために記載する。
【０１４０】
一具体例では、見込まれる治療用標的物は、ｎｅｕ受容体ファミリーからの受容体である。米国の女性において、乳癌は最も一般的な癌であり且つ癌死亡率が肺ガンに次いで単独で第２位である。主な乳癌の標的は、１８５ｋＤの膜貫通ホスホ糖タンパク質のチロシンキナーゼであるｎｅｕ／ｅｒｂＢ−２／ＨＥＲ−２である（Ｓｈｉｈ他、（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２９０：２６１）。ｎｅｕ癌遺伝子の増幅又は過剰発現は、乳房及び卵巣の約３０％で発生し、これは一次治療のまずい対応に相関することが分かっている（Ｓｌａｍｏｎ他（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５：１７７及びＨａｙｅｓ他（１９９３）Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ４：８０７）。ＮＩＨ ３Ｔ３細胞にｎｅｕ癌遺伝子をトランスフェクトすると形質転換を生じ（Ｓｈｉｈ他，上記）、活性化されたｎｅｕ癌遺伝子をマウスに導入すると全乳房上皮組織の形質転換（Ｍｕｌｌｅｒ他，（１９８８）Ｃｅｌｌ ５４：１０５）を生じ又は乳房腫瘍が確率的に出現する（Ｂｏｕｃｈａｒｄ他（１９８９）Ｃｅｌｌ ５７：９３１）。
【０１４１】
乳癌がｎｅｕ又はヘレグリンファミリーの一員のようなｎｅｕのリガンドに結合する分子によって抑制できるという証拠が蓄積している（Ｈｏｌｍｅｓ他、１９９２，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：１２０５）。ｎｅｕの細胞外ドメインに結合するＭＡｂ及びそれらの放射性標識結合体は、ｎｅｕ陰性細胞クローンの選択なしに培養液中及びヌードマウス内で乳癌細胞の増殖を遅延させる（ＤｅＳａｎｔｅｓ他，（１９９２）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：１９１６及びＤｒｅｂｉｎ他（１９８６）ＰＮＡＳ ８３：９１２９）。高度乳癌治療のための診療所で使用される組換えヒト化Ｍａｂであるヘルセプチン（Ｃｏｌｏｍｅｒ他（２００１）Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ １９，４９−５６）のような当該ＭＡｂ及びそれらの誘導体は、ｎｅｕの情報伝達経路を変更し且ついくつかの異なる方法で腫瘍の増殖に影響を及ぼし得る。これらのものは、（ｉ）ｎｅｕを過剰に刺激し、それによって分化を生じさせ（Ｂａｃｕｓ他（１９９２）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：２５８０）、（ｉｉ）ｎｅｕのホモ又はヘテロ二量体化を妨げ、それによってｎｅｕを不活性化させ（Ｃａｒａｗａｙ他（１９９４）Ｃｅｌｌ ７８：５）、（ｉｉｉ）ｎｅｕの細胞性インターナリゼーション及びダウンレギュレーションを生じさせ（Ｔａｇｌｉａｂｕｅ他（１９９１）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４７：９３）、（ｉｖ）細胞表面又は細胞質に共役細胞傷害性放射性ヌクレオチド又は毒素を送達し、或いは（ｖ）リガンドがｎｅｕに結合しないようにする。
【０１４２】
本発明によって誘導され得る疑似ペプチドは、例えばｎｅｕのそのリガンド又はその他の蛋白質との結合を競争的に開裂させ又はｎｅｕに関わる酵素活性のアロステリックな活性化を阻害することによってｎｅｕの生物学的機能を抑制するのに有用であり得る。別法として、これらのものは、ｎｅｕの過剰刺激又はダウンレギュレーションを生じさせるアゴニストとして有用であり得る。
【０１４３】
さらに別の見込まれる標的は、インターロイキン８（ＩＬ−８）である。ＩＬ−８は、好中球の化学誘引物質及び活性化物質であり且つ様々な急性及び慢性の炎症性疾患に関与している（Ｍｕｒｐｈｙ（１９９４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：５９３−６３３）。ヒトＩＬ−８は、腫瘍壊死因子のような因子、インターロイキン１及びリポ多糖による誘導に基づいて単球、繊維芽細胞、角化細胞及び内皮細胞によって産生される７２アミノ酸残基のポリペプチドである（Ｍｕｒｐｈｙ，上記）。ＩＬ−８のある種のアナログは、試験管内で好中球の活性化（走化性、エキソサイトーシス及び呼吸バースト）を阻害することによってＩＬ−８アンタゴニストとして作用するため、ＩＬ−８抑制剤が炎症性疾患に対する治療上の可能性を有し得ることを示唆する（Ｍｏｓｅｒ他（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：７１２５−７１２８）。
【０１４４】
単量体のＩＬ−８ペプチドは、試験管内で２０ＭのＫ_dでもって二量体を形成する（Ｐａｏｌｉｎｉ他（１９９４）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １５３：２７０４及びＢｕｒｒｏｗｓ他（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３：１２７４１−１２７４５）ため、この単量体及び／又は二量体は生体内で活性であることが可能である。二量体化できない変異体は、試験管内での機能アッセイでは活性である（Ｒａｊａｒａｔｈｎａｍ他（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６４：９０）。興味深いことに、ＩＬ−８二量体の三次元構造のＮＭＲ及びＸ線測定（Ｃｌｏｒｅ他（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２９：１６８９−１６９６及びＢａｌｄｗｉｎ他（１９９１）ＰＮＡＳ ８８：５０２）により、このものがＭＨＣのクラスＩ及びII蛋白質のペプチド結合の溝に類似していることが明らかになった（Ｂｊｏｒｋｍａｎ他（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ ３２９：５０６）ため、ＩＬ−８二量体は、ＭＨＣ分子と同様の態様で in vitro 選択ペプチド又は疑似ペプチド配列に結合できる可能性があると考えられる。従って、ＩＬ−８単量体に加えて、その二量体は、魅力的な標的である。
【０１４５】
ＩＬ−８経路の場合には、ＩＬ−８とは別の標的は、ＩＬ−８受容体の機能性断片である。それぞれ３９個及び４４個のアミノ酸のヒトＩＬ−８タイプ１受容体及びウサギＩＬ−８タイプ１受容体のさらに小さい断片は、ＩＬ−８結合アッセイでは機能的である（Ｇａｙｌｅ他（１９９３）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６８：７２８３−７２８９）。従って、最も大きな受容体のファミリーの一部である７種の膜貫通受容体が見込まれる標的である。
【０１４６】
細胞性の癌原遺伝子であるｃ−ｍｙｃは、細胞増殖及び形質転換に関与するか、プログラム細胞死（アポトーシス）の誘導にも関わる。ｃ−Ｍｙｃ蛋白質は、カルボキシル末端塩基性領域／ヘリックス・ループ・ヘリックス（ＨＬＨ）／ロイシンジッパー（ＬＺ）ドメインを有する転写活性化物質である。このものは、ＨＬＨ／ＬＺ蛋白質のＭａｘとヘテロ二量体を形成し、ＤＮＡのＥボックス要素に結合した後に遺伝子発現をトランスに活性化する。Ｍａｘ蛋白質は、現在までに分析された多くのその生物学的機能にとって必須のｃ−Ｍｙｃのパートナーである。例えば、Ｍｙｃは、ＤＮＡに結合し且つその癌遺伝子活性を果たすためにはＭａｘと共にヘテロ二量体化しなければならない。
【０１４７】
本発明によれば、主題の方法は、ＭｙｃとＭａｘのようなその他の蛋白質との間の複合体の形成を阻害できる及び／又はＭｙｃ複合体が遺伝子内のｍｙｃ応答配列に結合するのを阻害できるペプチド及び疑似ペプチドを誘導するために使用できる。Ｍｙｃ・Ｍａｘ及びＭａｘ・Ｍａｘ二量体の全合成は、Ｃａｎｎｅ他（１９９５）Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １１７：２９９８−３００７に記載されている。
【０１４８】
ＴＧＦの全合成は、Ｗｏｏ他（１９８９）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ ３：２９−３７に記載されており、これは別の見込まれる標的分子を与えるものである。
【０１４９】
主題の方法に使用するために誘導できるさらに別の標的は、細胞接着、組織器質化及び創傷治癒に関わる糖蛋白質のフィブロネクチンである。フィブロネクチンン分子の全合成は、例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓ他（１９９４）Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １１６：１０７９７−１０７９８に記載されている。
【０１５０】
これまでに、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）の主要ｇａｇ蛋白質であるｐ２４の発現は、ＨＩＶ−１に感染した細胞の表面上で持続することが示された（西野他（１９９２）Ｖａｃｃｉｎｅ １０：６７７−６８３）。ｐ２４のＣ末端の１００アミノ酸断片の全合成は、Ｍａｓｃａｇｎｉ他（１９９０）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ ３１：４６３７−４６４０）によって説明され、ｐ２４蛋白質のその部分を使用してスクリーニング用標的物を生成することができる。
【０１５１】
同様に、ＨＩＶプロテアーゼは、すべて化学合成手段によって合成され（ｋｅｎｔ他ＰＣＴ公開ＷＯ９３／２００９８）且つ触媒活性の阻害剤並びにこのプロテアーゼに関わる蛋白質・蛋白質相互作用の阻害剤を開発するためのユニークな標的となる。
【０１５２】
上に例示された標的物の多くは化学合成によって調製できるが、これは決して必要条件又はさらに優先的に選択されるものではない。本発明の利点は、生物学的供給源からの精製、生合成又は組換えＤＮＡベースの発現のような任意の他の方法を使用して部分的に精製された又は純粋な標的物を調製できることである。
【０１５３】
材料及び方法
ｈｉｓタグ及び非標識Ｅ．ｃｏｌｉ ＩＦ１、ＩＦ２及びＩＦ３蛋白質の過剰発現用プラスミドの構築。
Ｎ末端メチオニンのすぐ後に６個のヒスチジン挿入物をそれぞれ含むＥ．ｃｏｌｉの開始因子コード配列を公表されたプラスミドからＰＣＲによって合成し、ｐＥＴ２４ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）由来のベクターにサブクローニングした。Ｅ．ｃｏｌｉ優先コドン（ｉｎｆＡコドンの代わりに）の人工配列によってコードされるネイティブＩＦ１配列を含むプラスミドｐＸＲ２０１を、Ｒ．Ｓｐｕｒｉｏ及びＣ．Ｇｕａｌｅｒｚｉ両氏から快く提供してもらい（Ｃａｌｏｇｅｒｏ他（１９８７）Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ ２０８，６３−９）、所定のｐＡＦ１Ｈにサブクローニングした。ｉｎｆＢによってコードされるネイティブＩＦ２配列を含むプラスミドｐＳＬ４を、Ｓ．Ｌａａｌａｍｉ及びＭ．Ｇｒｕｎｂｅｒｇ−ｍａｎａｇｏ両氏から快く提供してもらい（Ｌａａｌａｍｉ他（１９９１）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２２０，３３５−４９）、所定のｐＡＦ２Ｈにサブクローニングした。ｉｎｆＣによってコードされるネイティブＩＦ３配列を含むプラスミドｐＤＤ１を、Ｎ．ｂｒｏｔ及びＩ．Ｓｃｈｗａｒｔｚ両氏から快く提供してもらい（Ｄｅ Ｂｅｌｌｉｓ及びＳｃｈｗａｒｔｚ（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １８，１３１１）、所定のｐＡＦ３Ｈにサブクローニングした。この３種のサブクローンの配列は、制限酵素消化と配列分析の組み合わせによって特徴付けられ、第２アミノ酸の前のＴＡＴＡＣＡ／ＴＡＴＧ（ＣＡＣ）₆から始まる（連結部位に下線を施した）。最後のアミノ酸の後にＴＡＡＧ／ＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＣＧＴＣＧＡ／４２ｂｐ欠失／ＡＧＡＴＣＣ配列が続き、この配列の残余は、ｐＥＴ２４ａからのものである。また、ＩＦ１、ＩＦ２及びＩＦ３の非標識バージョンをクローン化し且つ過剰発現させるために類似の方法も使用した。
【０１５４】
Ｅ．ｃｏｌｉ翻訳因子蛋白質の過剰発現及び精製。
ＴｕｆＡの最初の２つのコドン間に挿入されたｈｉｓ₆配列を含むｈｉｓタグＥ．ｃｏｌｉＥＦ−ＴｕをコードするプラスミドｐＨＴＡ７（Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）内の）及びＴｓｆの最初の２つのコドン間に挿入されたｈｉｓ₆配列を含むプラスミドｐＨＴＳは、Ｙ−Ｗ．Ｈｗａｎｇ及びＤ．Ｍｉｌｌｅｒ両氏が提供してくれた（Ｈｗａｎｇ他（１９９７）Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ ３４８，１５７−６２参照）。ｈｉｓ₆を含めて約３０個のアミノ酸のＮ末端伸長を含む、ｈｉｓタグＥ．ｃｏｌｉＥＦ−ＧをコードするプラスミドｐＲＳＥＴ／ＥＦ−Ｇ（Ｈｉｓ）（ｐＬｙｓＳプラスミドと共にＥ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）細胞内の）は、Ａ．Ｓａｖｅｌｓｂｅｒｇｈ及びＷ．Ｗｉｎｔｅｒｍｅｙｅｒ両氏が提供してくれた（Ｓｅｍｅｎｋｏｖ他（１９９６）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ９３，１２１８３−８）。本発明の３種のｈｉｓタグ開始因子のサブクローン（Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳの：Ｎｏｖａｇｅｎ社）及び提供された３種のクローンの発現をＩＰＴＧによって誘導した。これらの因子全てを主として可溶性細胞画分中で発現させ、標準的なプロトコルを使用してＮｉＮＴＡアガロースカラム（Ｑｉａｇｅｎ社）から段階溶出によって精製した（ただし、１０μＭのＧＤＰをＥＦ−ＴｕＨのための最後の透析段階まで含めた）。全ての因子を緩衝液Ａ（１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．４，１ｍＭのＭｇＣｌ₂，１ｍＭのＤＴＴ）に透析した。沈殿したＩＦ３Ｈを５Ｍの尿素に再溶解させることによって回収し（Ｈｅｒｓｈｅｙ他（１９７７）Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ １８２，６２６−３８）、希釈し、次いで１００ｍＭのＮＨ₄Ｃｌを含有する緩衝液Ａに透析した。ネイティブＩＦ２の過剰発現及び精製中に他の者によって観察された広範囲にわたる蛋白質分解性の分解（Ｍｏｒｔｅｎｓｅｎ他（１９９１）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ ７３，９８３−９）とは異なり、組換えＩＦ２Ｈは、蛋白質分解に不安定ではなかった。純粋なＥ．ｃｏｌｉ終結因子（ＲＦ）のＲＦ１、ＲＦ２、ＲＦ３及びＲＲＦを、記載されているように（Ｙｕ他（１９９８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８４，５７９−５９０）調製した。全ての因子を−８０℃で保存した。これらのものを、ＥＦ−ＴｕＨを除いて活性を損失させることなく何度も解凍し、解凍後には４℃で保存し且つ数週間以内に使用した。
【０１５５】
Ｅ．ｃｏｌｉリボソームの精製（Ｋｕｎｇ他（１９７４）Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ １６２，５７８−８４）。
対数増殖中期にまで増殖したＳＯＬＲ（商標）細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を緩衝液Ｂ（６０ｍＭのＫＯＡｃ，１４ｍＭのＭｇ（ＯＡｃ）₂，１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＯＡｃ，１ｍＭのＤＴＴ，ｐＨ７．９）に再懸濁し、超音波処理し、１００００ｇで遠心分離した。上澄液を３００００ｇで遠心分離し、次いで得られた上澄液を１５００００ｇで遠心分離した。このリボソームペレットを１ＭのＮＨ₄Ｃｌを含有する緩衝液Ｂ中で４℃で一晩攪拌し、次いで１５００００ｇで再ペレット化することによって洗浄した。この洗浄を２回以上繰り返して３×洗浄リボソームを与え、このものを緩衝液Ｃ（１０ｍＭのＭｇ（ＯＡｃ）₂，１ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．４，１ｍＭのＤＴＴ）に再懸濁し、−８０℃で保存した。
【０１５６】
ｍＲＮＡの合成。
ｍＲＮＡをオリゴデオキシリボヌクレオチド（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社）から転写し（Ｍｉｌｌｉｇａｎ及びＵｈｌｅｎｂｅｃｋ（１９８９）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８０，５１−６２）、ゲル電気泳動により精製した（Ｆｏｒｓｔｅｒ及びＳｙｍｏｎｓ（１９８７）Ｃｅｌｌ ４９，２１１−２０）。鋳型が比較的長いため、最適な転写を可能にするにはブロックされたオリゴヌクレオチドの合成の後に長期の脱保護時間が必要であった（１２時間）。
【０１５７】
アミノアシルｔＲＮＡの調製。
純粋なＥ．ｃｏｌｉ ｔＲＮＡアイソアクセプターは、ＳｕｂｒｉｄｅｎのＲＮＡからのものであった。それぞれのアイソアクセプターは、Ｅ．ｃｏｌｉの全ｔＲＮＡ（Ｐｌｅｎｕｍ社）から３つのカラムクロマトグラフィー段階を使用してメーカーにより製造された。第１の分画はＢＤセルロースを使用し、第２はｐＨ７でのＤＥＡＥセファデックスを使用し、第３はｐＨ５でのＤＥＡＥセファデックス又はセファロースを使用した。天然のアミノアシルｔＲＮＡをこれらのアイソアクセプターから次のように調製した。高特異的活性³Ｈ−ｆｍｅｔ−ｔＲＮＡ_i ^fmet（表１において２４０００ｄ．ｐ．ｍ．／ｐｍｏｌ）及び低特異的活性³Ｈ−又は³⁵Ｓ−ｆｍｅｔ−ｔＲＮＡ_i ^fmet（数百ｄ．ｐ．ｍ．／ｐｍｏｌ、全ての他の研究のために使用される）を、ＭｅｔＲＳ、ｍｅｔ−ｔＲＮＡ_i ^fmetホルミルトランスフェラーゼ及びＮ^5,10−メテニルＴＨＦ（Ｎ¹⁰−ホルミルＴＨＦシンテターゼを使用して合成された）を使用して記載されるように（Ｒｏｂａｋｉｓ他（１９８１）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７８，４２６１−４）調製した。¹⁴Ｃ−ｔｈｒ−ｔＲＮＡ₃ ^thr（５１０ｄ．ｐ．ｍ．／ｐｍｏｌ）及び³Ｈ−ｖａｌ−ｔＲＮＡ₁ ^val（図５〜７において２１０００ｄ．ｐ．ｍ．／ｐｍｏｌ、図４及び８において２８０００ｄ．ｐ．ｍ．／ｐｍｏｌ）を、記載されるように（Ｒｏｂａｋｉｓ他（１９８１）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７８，４２６１−４）、ＴｈｒＲＳ、ＶａｌＲＳ又は、低特異的活性ｖａｌ−ｔＲＮＡについては、１５００００ｇの上澄液から０．３ＭのＫＣｌでＤＥＡＥセファロースから段階溶出することによって部分的に精製された全Ｅ．ｃｏｌｉシンテターゼ（Ｋｕｎｇ他（１９７５）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２５０，１５５６−６２参照）のｔＲＮＡを含まない調製物でもってアミノアシル化した。
【０１５８】
ビオチン標識ｌｙｓ−ｔＲＮＡ^lys（Ｔｒａｎｓｃｅｎｄ（商標）ｔＲＮＡ、図２２）をプロメガ社から購入した。この材料は、このメーカーによって、Ｅ．ｃｏｌｉの全ｔＲＮＡから全シンテターゼの粗製調製物を使用してリシンを結合させ、ｌｙｓ−ｔＲＮＡ^lysをイオン交換クロマトグラフィーにより富化させ、そして非電荷の１３個の炭素の長さのスペーサーを介してビオチンに化学的に結合させることによって調製された。
【０１５９】
ＮＶＯＣアミノ保護アミノアシルｔＲＮＡを斯界に標準的な方法によって調製し、保存し、使用した（「Ｔｈｏｒｓｏｎ他（１９８８）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ７７，４３−７３」、「Ｓｔｅｗａｒｄ及びＣｈａｍｂｅｒｌｉｎ（１９９８）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ７７，３２５−３５４」に詳述されている）。手短に言えば、ｐｄＣｐＡをアデノシンとデオキシシチジン誘導体から化学的に合成した。種々の非天然アミノ酸を標準的な業者（例えば、Ｓｉｇｍａ社、Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｆｌｕｋａ社、Ｂａｃｈｅｍ社及びＮｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ社）から保護されていない形で購入した。ａＧ、ｍＳ及びＡｌａのような本発明者が最も一般的に使用したＮＶＯＣアミノ酸は、化学的な保護を必要とする反応性のアミノ酸側鎖を欠失していたため、これを保護されていないアミノ酸からＮＶＯＣ−Ｃｌによるアミノ保護によって直接合成した。標準法によって合成された追加の側鎖保護を有するものを含めて、適切に保護された全てのアミノ酸をシアノメチルエステル合成によって活性化させ、次いでｐｄＣｐＡに結合させた。得られたＮＶＯＣ保護アミノアシル化ｐｄＣｐＡ化合物（及びそれらのＲＮＡとの結合体）は、水溶液中に−８０℃の暗所でほぼ５のｐＨでもって保存したときに安定であった。ＮＶＯＣ保護アミノアシル化ｐｄＣｐＡ化合物を、末端ＣＡジヌクレオチドを欠失した様々なｔＲＮＡ誘導体にＴ４ＲＮＡリガーゼで連結し、そして結合体を精製し、保存した（上記参照）。得られたＮＶＯＣ保護アミノアシルｔＲＮＡを翻訳に使用する前に直ちにＵＶ照射によって脱保護した。
【０１６０】
ｈｉｓタグＥ．ｃｏｌｉ翻訳因子蛋白質のアッセイ。
開始因子アッセイ（Ｋｕｎｇ他（１９７４）Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ １６２，５７８−８４）は、受注合成されたＡｐＵｐＧ ＲＮＡ鋳型（ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を使用した。０．９５μＭのＩＦ１Ｈ、０．１５μＭのＩＦ２Ｈ、０．７８μＭのＩＦ３Ｈ、０．０２９Ａ₂₆₀／μｌの３×洗浄リボソーム（３３ｎＭが翻訳において活性であると見積もられる。以下参照）、０．２９μＭの³Ｈ−ｆｍｅｔ−ｔＲＮＡ_i ^fmet、１５０μＭのＡＵＧ及び０．４ｍＭのＧＴＰを含んでなる（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．４，１００ｍＭのＮＨ₄Ｃｌ，５ｍＭのＭｇ（ＯＡｃ）₂，２ｍＭのＤＴＴ）混合溶液を３７℃で１０分間インキュベートした。希釈後、この混合液を素早くニトロセルロースで濾過して開始複合体結合ｆｍｅｔ−ｔＲＮＡ_i ^fmetを非結合種から分離した。鋳型を欠いた反応を非特異的な結合のための対照として使用した（表１に関して最大のｄ．ｐ．ｍ．の２９％、³Ｈ−ｆｍｅｔ−ｔＲＮＡ_i ^fmetの７０％を結合したより高（飽和）濃度を使用して最大ｄ．ｐ．ｍ．の９％）。ＥＦ−Ｔｓに対するＥＦ−Ｔｕの高い親和性のため、ＥＦ−Ｔｓの活性アッセイ（Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ及びＰｅｓｔｋａ（１９７７）Ｍｏｌｅｃｕａｒ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク，ＮＹ）をＥＦ−ＴｕＨと共に実施したところ、約２％の共精製レベルを示した。ＥＦ−ＴｕＨ活性をＧＤＰの結合によって測定し（Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ及びＰｅｓｔｋａ（１９７７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク，ＮＹ）、ＥＦ−ＧＨ活性をリボソーム依存型ＧＴＰアーゼアッセイによって測定した（Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ及びＰｅｓｔｋａ（１９７７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク，ＮＹ）。
【０１６１】
翻訳。
翻訳混合物の成分を公表された実験法（「Ｒｏｂａｋｉｓ他（１９８１）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７８，４２６１−４」、「Ｃｅｎａｔｉｅｍｐｏ他（１９８２）Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ ２１８，５７２−８」）から改変した。５×プレミックス緩衝液を、１８０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＯＡｃ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭの３，３−ジメチルグルタル酸ナトリウム（ｐＨ６．０）、１８０ｍＭのＮＨ₄ＯＡｃ、１０ｍＭのＤＴＴ、１４０ｍＭのホスホエノールピルビン酸カリウム（ｐＨ６．６）、１９５ｍＭのＫＯＡｃ及び４ｍＭのスペルミジン・３ＨＣｌを含有する溶液からこれをＮａＯＨでｐＨ６．８に調整することによって調製した。代表例として、ＭＴＴＶｍＲＮＡ鋳型（図６、３０μｌの総容量）を翻訳する際の混合物は、１×プレミックス緩衝液、９．５ｍＭのＭｇ（ＯＡｃ）₂、１ｍＭのＧＴＰ、１４ｎｇ／μｌのピルベートキナーゼ、４．３％のＰＥＧ８０００、０．９５μＭのＩＦ１Ｈ、０．１５μＭのＩＦ２Ｈ、０．７８μＭのＩＦ３Ｈ、３．１μＭのＥＦ−ＴｕＨ、０．８８μＭのＥＦ−ＧＨ、０．０２９Ａ₂₆₀／μｌの３×洗浄リボソーム（３３ｎＭが翻訳の際に活性であると見積もられる。図４参照）、０．２９μＭの³Ｈ−ｆｍｅｔ−ｔＲＮＡ_i ^fmet、０．５８μＭの¹⁴Ｃ−ｔｈｒ−ｔＲＮＡ₃ ^thr、０．２９μＭの³Ｈ−ｖａｌ−ｔＲＮＡ₁ ^val及び１μＭのｍＲＮＡを包含した。この混合物を３７℃で５０分間インキュベートしたが、いくらかの翻訳は１分程であった（図４）。また、いくらかの翻訳のための設定は、開始混合物（ＧＴＰ、ＩＦ１Ｆ、ＩＦ２Ｈ、ＩＦ３Ｈ、リボソーム、³Ｈ−ｆｍｅｔ−ｔＲＮＡ_i ^fmet及びｍＲＮＡ）及び伸長因子混合物（ＧＴＰ、ＥＦ−ＴｕＨ、ＥＦ−ＧＨ、¹⁴Ｃ−ｔｈｒ−ｔＲＮＡ₃ ^thr及び³Ｈ−ｖａｌ−ｔＲＮＡ₁ ^val（図４））の３７℃で１０分間のプレインキュベーションを包含した。
【０１６２】
ＨＰＬＣ分析（図６）のために、ペプチド及びアミノ酸を１ＭのＮａＯＨ（６μｌ）の添加及び３７℃で２０分間のインキュベーションによりｔＲＮＡから放出させた。次いで、非標識マーカーのペプチド（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社）を添加し（Ｈ₂Ｏ中に１０μｇ／μｌの合わせたペプチド濃度で１８μｌ）、この溶液を氷酢酸（５μｌ）で酸性化し、微量遠心分離し、次いで上澄液をＭｉｃｒｏｃｏｎ１０限外濾過装置（１０ｋＤカットオフ、Ａｍｉｃｏｎ社）によって微量遠心分離した。濾過液の一部分（２０μｌ）をＣ１８逆相カラム（Ｖｙｄａｃ社）上に添加し、０．１％のＴＦＡを含有する０〜３１．５％のＨ₂Ｏ／ＭｅＣＮ勾配でもって１ｍｌ／分で溶出させ、２２９ｎｍの吸光度で検出し、二重標識ｄ．ｐ．ｍ．プログラム（Ｐａｃｋａｒｄ社）を使用して４２個の滴下画分をシンチレーション計数した。
【０１６３】
ｆＭＴＶ及びｆＭＶＴ合成の分析のために、ホルミル化されたペプチド及びホルミルメチオニンを塩基加水分解、酸性化及び小型カラム上での陽イオン交換クロマトグラフィーによってホルミル化されていないアミノ酸から分離した（Ｐｅａｃｏｃｋ他（１９８４）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ８１，６００９−１３）。
【０１６４】
対照の翻訳。
追加の翻訳を実施して翻訳因子以外の成分への依存性を評価した。³Ｈ−ｆｍｅｔ−ｔＲＮＡ_i ^fmet又は¹⁴Ｃ−ｔｈｒ−ｔＲＮＡ₃ ^thrの除外は、³Ｈ−ｖａｌの産物への取り込みに基づいてｍＲＮＡＭＴＶからのｆＭＴＶ合成を停止させる。¹⁴Ｃ−ｔｈｒ−ｔＲＮＡ₃ ^thrを除外した実験において、非結合ｔＲＮＡ₃ ^thrを添加すると精製系で予期されるような測定可能なｆＭＴＶ合成を再構成しなことから、翻訳条件下ではＴｈｒＲＳ活性がないことを示している（さらなる対照として、ｔｈｒ−ｔＲＮＡ₃ ^thrの添加はｆＭＴＶ合成を阻害しなかった）。³Ｈ−ｖａｌ−ｔＲＮＡ₁ ^valの除外は、¹⁴Ｃ−ｔｈｒ−ｔＲＮＡ₃ ^thrの産物への取り込みに基づいてｍＲＮＡのＭＶＴからのｆＭＴＶ合成（図４）を停止させる。ｍＲＮＡＭＶＴ及びｍＲＮＡｍＭＶ（図３）産物中のＴ／Ｖ比は、予期されるように、それぞれ約１．０及び０である。リボソームを除外すると、最も低いバックグラウンド放射能測定値が得られ、ｍＲＮＡを欠失した翻訳は、ホルミル化ペプチド産物を時間経過と共に蓄積しない。ウサギ筋肉のピルベートキナーゼ（シグマ社製のこの蛋白質（Ｊｅｌｅｎｃ及びＫｕｒｌａｎｄ（１９７９）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７６，３１７４−８）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで単一の主要バンドとして移動する）を除外すると、産物の収率が５０％だけ減少する。Ｍｇ²⁺の標準濃度（９．５ｍＭ）が最適であるが、翻訳はそれよりも高い及び低い濃度で効率的に起こり得る。
【０１６５】
本研究の一部は、ＮＩＨ承認Ｋ０８−ＣＡ８０８３３によって裏付けられた。アメリカ合衆国政府は本発明に関して一定の権利を有する。
【０１６６】
【表１】

【０１６７】
【表２】

【０１６８】
【表３】

【０１６９】
【表４】

【０１７０】
【表５】

【図面の簡単な説明】
【０１７１】
【図１】Ｅ．ｃｏｌｉからの５種のｈｉｓタグＥ．ｃｏｌｉ翻訳因子の過剰発現及び精製。
【図２】リボソーム指令ペプチド合成段階の概略図。
【図３】短鎖ｍＲＮＡ鋳型。
【図４】精製ｈｉｓタグ翻訳系におけるｍＲＮＡからのオリゴペプチド合成速度の特徴付け。
【図５】ｍＲＮＡのＭＴＶを有する精製翻訳系における翻訳因子の依存性。
【図６】ＭＴＴＶのｍＲＮＡ鋳型から産生された産物のＨＰＬＣ分析。
【図７】精製翻訳系でのオリゴペプチド産物の合成。
【図８】精製ｈｉｓタグ翻訳系を使用した非天然アミノ酸を含むペプチドの合成及び選択。
【図９】Ｃｙｓ−ｔＲＮＡ^cysの化学的ビオチニル化。
【図１０】ビオチニル−Ｃｙｓ−ｔＲＮＡ^cysの精製。
【図１１】精製系を使用した精製ビオチニルＣｙｓのｆＭ−Ｔ−ｂＣ−Ｖ疑似ペプチドへの取り込み。
【図１２】隣接する多数の非天然アミノ酸をｆＭ−Ｔ−ｂＣ−ｂＣ−Ｖ疑似ペプチドに取り込むためのアッセイ。
【図１３】全ｔＲＮＡと１５種の異なる¹⁴Ｃ標識アミノ酸の混合物（ニュー・イングランド・ニュークレア社）との結合活性（ＴＣＡ沈殿法によって測定される）についての本発明の純粋な翻訳系のアッセイ（「蛋白質ポリメラーゼ」）。
【図１４】選択のコドンに対して特異的な非天然アミノ酸を結合したアミノアシルｔＲＮＡを合成するために一般化できる方法。
【図１５】左から右にｔＲＮＡ^Asn（Ｔ）ｔＲＮＡ^Asn（Ｓ）ｔＲＮＡ^Asn（Ｖ）と命名されたｔＲＮＡ^Asn（Ｎ）の３種のアンチコドン変異体。
【図１６】非結合ｔＲＮＡ（レーン１、３及び５）及びアミノアシルｔＲＮＡ基質（レーン２、４及び６）の酸／尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動。
【図１７】隣接するａＧアミノ酸を疑似ペプチドに選択的に取り込むための一般的な方法。
【図１８】純粋リボソームディスプレイ。
【図１９】本発明のスペーサーｍＲＮＡ及びそれらのコードペプチド産物。
【図２０】本発明の精製系を使用した図１９のスペーサーｍＲＮＡの翻訳。
【図２１】純粋ｍＲＮＡディスプレイ。
【図２２】プロメガ社製のＴｒａｎｓｃｅｎｄビオチニル−リシンｔＲＮＡ^lys。

Claims (22)

1. 細胞を含まない再構成翻訳系において、翻訳因子及びｔＲＮＡ種であって外因的に添加されたｍＲＮＡをそれぞれのコドンでの高選択的な取り込みでもって翻訳してペプチド産物又は該系が非天然型アミノ酸若しくはアミノ酸アナログを結合したｔＲＮＡの１種以上を含むときには疑似ペプチド産物を形成できるものを含む、細胞を含まない再構成翻訳系。
2. 調製物が翻訳因子ＥＦ−Ｐ、Ｗ、Ｗ２又はレスキューを実質的に含まない、ペプチド産物生成用の請求項１に記載の翻訳系。
3. 疑似ペプチド産物の主鎖に取り込まれる非天然型アミノ酸又はアミノ酸アナログを結合したｔＲＮＡ種の１種以上を含む、疑似ペプチド産物生成用の請求項１に記載の翻訳系。
4. 調製物が翻訳因子ＥＦ−Ｐ、Ｗ、Ｗ２又はレスキューを実質的に含まない、疑似ペプチド産物生成用の請求項２に記載の翻訳系。
5. アミノ酸アナログがβ−シアノアラニン、カナバニン、ジエンコル酸、ノルロイシン、３−ホスホセリン、ホモセリン、ジヒドロキシフェニルアラニン、５−ヒドロキシトリプトファン、１−メチルヒスチジン、３−メチルヒスチジン、アリルグリシン（又はそのアルキン誘導体）、Ｏ−メチルセリン、ビオチニルリシン、ビオチニルシステイン（又はその他のビオチン標識アミノ酸）、シクロヘキシルアラニン、ホモグルタメート、Ｄ−アラニン（又はその他のＤ−アミノ酸）、Ｎ−メチルグリシン（又はその他のＮ−メチルアミノ酸）、ε−Ｎ−メチルリシン及び２１種の天然アミノ酸又は非天然アミノ酸の放射性同位元素誘導体よりなる群から選択される請求項２に記載の翻訳系。
6. １種以上の外因的に添加されたｍＲＮＡ種をさらに含む請求項１に記載の翻訳系。
7. 翻訳因子及びｔＲＮＡ種であって外因的に添加されたｍＲＮＡを翻訳して疑似ペプチド産物を形成できるものを含む細胞を含まない翻訳系において、その調製物が
   （ａ）１種以上の活性な野生型アミノアシルｔＲＮＡと該野生型アミノアシルｔＲＮＡを合成する能力とを欠損しており、
   （ｂ）該活性のないｔＲＮＡ種の代わりに非天然アミノ酸種又はアミノ酸アナログを結合した少なくとも１種の外因性アミノアシルｔＲＮＡを含む、
   細胞を含まない翻訳系。
8. 複数の異なるｍＲＮＡ種を含む請求項７に記載の翻訳系。
9. （ａ）外因的に添加されたＲＮＡを翻訳してペプチド又は疑似ペプチドを形成できる細胞を含まない再構成翻訳系を形成させるために混合され得る請求項１に記載の翻訳系の成分及び（ｂ）それに関する説明書からなるキット。
10. （ａ）外因的に添加されたＲＮＡを翻訳して疑似ペプチドを形成できる細胞を含まない翻訳系を形成させるために混合され得る請求項７に記載の翻訳系の成分及び（ｂ）それに関する説明書からなるキット。
11. 次の段階：
    （ａ）請求項１に記載の細胞を含まない翻訳系を準備し、
    （ｂ）該翻訳系を１種以上の外因性ｍＲＮＡ種と接触させ、
    （ｃ）該翻訳系のペプチド若しくは疑似ペプチド産物を単離及び／又は同定すること
    を含むペプチド又は疑似ペプチドの生成方法。
12. 翻訳系のｔＲＮＡ種の１種以上に疑似ペプチド産物の主鎖に取り込まれる非天然型アミノ酸又はアミノ酸アナログを結合させる請求項１１に記載の方法。
13. 前記方法を少なくとも１００種の異なるＲＮＡ種のライブラリーについて実施し、しかもペプチド又は疑似ペプチド産物を翻訳系から触媒活性又は結合活性に基づいて同定又は単離する、請求項１１に記載の方法。
14. ｍＲＮＡを前記翻訳系で in vitro 転写によって生成させる請求項１１に記載の方法。
15. ペプチド又は疑似ペプチド産物を、該産物をコードする外因性ｍＲＮＡの共有結合付加物として形成させる、請求項１１に記載の方法。
16. 翻訳系を異なる外因性ｍＲＮＡ種のライブラリーと接触させて少なくとも１０³種の異なる配列のペプチド又は疑似ペプチド産物の多様な集団を生じさせる請求項１１に記載の方法。
17. 少なくとも１０⁸種の異なる配列を生じさせる請求項１６に記載の方法。
18. 請求項１１に記載の方法によって同定若しくは合成されたペプチド又は疑似ペプチド。
19. 次の段階：
    （ａ）請求項７に記載の細胞を含まない翻訳系を準備し、
    （ｂ）該翻訳系を１種以上の外因性ｍＲＮＡ種と接触させ、
    （ｃ）該翻訳系の疑似ペプチド産物を単離及び／又は同定すること
    を含む疑似ペプチドの生成方法。
20. 次の段階：
    （ａ）請求項１１に記載の方法によって所望の生物学的活性を有する翻訳系のペプチド又は疑似ペプチド産物を同定し、
    （ｂ）段階（ａ）で同定されたペプチド又は疑似ペプチド産物の生物学的活性をさらに試験管内又は生体内アッセイによって確認し、
    （ｃ）段階（ｂ）で確認された産物又はさらにそのアナログの動物における有効性及び毒性についての治療プロファイリングを行い、
    （ｄ）許容できる治療プロファイルを有する段階（ｃ）で同定された１種以上の産物を含む医薬品を処方すること
    を含む薬剤発見ビジネスを行う方法。
21. 販売用の前記医薬品を流通させるための流通システムを確立する追加の段階を含み、随意として該医薬品を販売するための販売部門を設立することを含む、請求項２０に記載の方法。
22. 次の段階：
    （ａ）請求項１１に記載の方法によって所望の生物学的活性を有する翻訳系のペプチド又は疑似ペプチド産物を同定し、
    （ｂ）段階（ａ）で同定されたペプチド又は疑似ペプチド産物の生物学的活性をさらに試験管内又は生体内アッセイによって確認し、
    （ｃ）随意として段階（ｂ）で確認された産物又はさらにそのアナログの動物における有効性及び毒性についての治療プロファイリングを行い、
    （ｄ）確認された産物のさらなる薬剤開発についての権利を第三者にライセンス供与すること
    を含む薬剤発見ビジネスを行う方法。

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