JP2004528528A - マトリクス中の生体高分子の染色増強用物質 - Google Patents
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Abstract
マトリクス中の生体高分子の検出法が開示されている。より詳細には、本発明は以下の段階を含む：(a)マトリクスを、1種または複数の任意に置換されたヘテロ芳香族化合物を含有する増感剤と接触させる段階；(b)マトリクスを、1種または複数の還元可能な金属塩と接触させ、該生体高分子を染色する段階；および、(c)染色された生体高分子を検出する段階。本発明はまた、本発明を実施するための組成物および本発明により作製された組成物にも関連する。本発明はまた、本発明の方法を実行するためのキットにも関連する。
Description
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
発明の技術分野
本発明は、合成マトリクス中に固定されたタンパク質、ポリペプチドおよび核酸分子などの生体高分子の金属染色の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
関連技術
ゲル電気泳動は、核酸、ポリペプチド、タンパク質およびオリゴ糖の分離に関する研究の関連分野および生化学分野において常用される分析技術である。関心対象の試料はマトリクス中に配置され、その後様々な成分の移動ならびに分子の分子量、電荷、およびその他の物理特性に基づく個別のバンドへの分離をもたらすような電界に曝露される。大部分の分子は、それにより可視化を可能にしうるような発色団またはフルオロフォアを内蔵していないため、電気泳動終了後の移動パターンは、通常解読不可能である。マトリクス中の関心対象の分子の正確な位置を可視化するための多くの方法が開発されているが、事実上染色されないマトリクスのブランク領域が残存したままである。これらは、クーマシーブリリアントブルー色素、臭化エチジウム、およびポンソーS染色を含む。銀染色は、これらの色素により達成されるよりも感度を増大させるために開発された。初期に広範に使用された銀染色技法のひとつは、Merrilらにより報告された(Meth. Enzymol.、96:230(1983))。この論文においては、電気泳動マトリクス、特にポリアクリルアミドを、酸または酸/アルコール溶液のいずれかに約1時間浸漬し、タンパク質をマトリクス中に固定する。マトリクスを次に、典型的には約30分間洗浄する。その後マトリクスを、約5分間二クロム酸溶液に浸し、タンパク質を酸化させる。次にこれらのゲルは、硝酸銀溶液に20分間浸して、その後炭酸ナトリウム/ホルムアルデヒド緩衝液で濯ぎ、タンパク質および核酸に結合した銀イオンを還元する。銀パターンを現像し、その後酢酸の添加により停止する。パターンは次に、直接視認または機器的技法のいずれかにより分析される。
【０００３】
Merrilらの方法は、Oakleyら(Anal. Biochem.、105:361(1980))により簡略化された。電気泳動されたゲルは、タンパク質を架橋するために、非緩衝グルタルアルデヒドで処理された。これらのゲルは、濯ぎ後、硝酸銀/水酸化アンモニウム/水酸化ナトリウム溶液で処理された。最後に、ホルムアルデヒドのクエン酸溶液を用いて銀イオンを銀へ還元し、ゲルマトリクス中のバンドを可視化した。
【０００４】
グルタルアルデヒドは、多くの実験室において、銀染色によるタンパク質検出の限界を下げるために使用されている(Rabilloud, T.、Electrophoresis、11:785-794(1990)；Rabilloud, T.、Cell. Mol. Biol.、40:57-75(1994))。この化合物が感度を増大させる正確な機構は大規模には評価されていないが、最初にタンパク質中の遊離アミノ基へ結合して、遊離アルデヒド官能来を残存させるシッフ塩基を形成することにより機能すると考えられる。遊離アミノ基は、タンパク質のN末端に見出され、かつリシンおよびアルギニンの側鎖上にも見出される。このアルデヒドは、タンパク質ゾーン（zone）の銀を還元し、銀金属析出の開始をもたらす。銀金属は銀イオンの銀への更なる還元を触媒し、最終的な結果として、タンパク質に隣接する銀析出の速度を増大させると考えられる。このようなグルタルアルデヒド増感を用いた製品の例とは、Invitrogen社(Carlsbad、CA)により販売されているSILVERXPRESS銀染色である。
【０００５】
グルタルアルデヒドの使用は低レベルのタンパク質の染色感度を改善するが、質量分析によるゲルの更なる分析が望ましい場合には、望ましくない作用を有する。Schelerら、Electrophoresis、19:918-927(1998)。質量分析によるタンパク質分析に広く使用される技術とは、酵素トリプシンによりタンパク質を断片へと切断することである。トリプシン切断により作製されたタンパク質断片は、この酵素はリシンまたはアルギニンのような塩基性アミノ酸の直ぐ後ろのアミド結合を優先的に切断するので、容易に推測される。リシンまたはアルギニンのアミノ基がグルタルアルデヒドによりシッフ塩基に結合している場合は、これは最早トリプシン切断部位ではない。さらに、最初の複合体がグルタルアルデヒド分子とタンパク質との間に形成される場合は、残存する遊離アルデヒド基を、その他のアミノ基との縮合に使用することができ、これにより架橋したタンパク質が形成される。この特性は、組織学的用途において有効な固定液であるグルタルアルデヒドを形成するものである。しかしランダムな形でアミノ基を含むペプチドおよびタンパク質を架橋することにより、潜在的トリプシン切断部位が妨害されるだけでなく、タンパク質１次構造の分析からはその分子量が予想できないような架橋されたペプチドおよびペプチドがランダムに形成される。その結果、その分子量がタンパク質の同定のために診断的であり得る多くの断片の発生量が減る。他の酵素をタンパク質断片化に使用することができるが、トリプシンの特異性がこれを好ましい選択肢としている。
【０００６】
米国特許第4,405,720号は、 酸化剤を用いた処理によるポリペプチドゲルの光反転(photo-reversing)段階、感光性塩と称される還元可能な金属塩を用いたポリペプチドゲルの処理による染色潜像の形成段階、および還元剤を用いたポリペプチドゲルの処理による染色像の現像段階を含む、ゲル中でのポリペプチドの銀染色法を開示している。このような感光性塩の例とは、銀、金、白金、パラジウムおよび/またはイリジウムの塩を含む。
【０００７】
米国特許第4,468,466号は、還元剤ジチオスレイトールによる処理、その後の銀塩および照射作動(actuating radiation)による処理を含む、銀染色法を開示している。この特許において、ジチオスレイトールは、光反転性に作用しかつ非タンパク質の銀染色を避けるための還元剤として作用する。
【０００８】
米国特許第4,703,016号は、タンパク質およびDNAの銀染色法を開示している。本方法は以下の段階を含む：酢酸第二銅溶液中で膜上にタンパク質を固定する段階；酢酸、塩化ナトリウム、およびクエン酸を含有する溶液と膜とを接触させる段階；酢酸および硝酸銀を含有する溶液と膜とを接触させて、光源を用いて照射する段階；酢酸、塩化ナトリウム、およびクエン酸を含有する溶液と膜とを接触させる段階；膜を硝酸銀溶液に戻して、膜を照射する段階；ヒドロキノンおよびホルムアルデヒドを含有する溶液に移すことによる、画像を現像する段階；水を用いて洗浄して、チオ硫酸ナトリウムと接触させる段階；ならびに、その後、水により洗浄する段階。
【０００９】
米国特許第4,575,452号は、第三級アミンを有する芳香族スルホン酸化合物およびN,N'-ジ-(9-アクリジル)-ジアミノアルキレン化合物を用いて、マトリクス中のタンパク質および核酸を固定する段階を含む、マトリクス中のタンパク質および核酸の検出法を開示している。このような化合物の具体例は、4,4'-[1,4-フェニレンビス(2,5-オキサゾールジイル)]-ビスベンゼンスルホン酸、4,4'-[1,4-フェニレンビス(4-メチル-2,5-オキサゾールジイル)ビスベンゼンスルホン酸、2,2'-(2,5-チオフェンジイル)ビス[5-(1,1-ジメチルエチル)-7-ベンゾオキサゾールスルホン酸、N,N,N-トリメチル-2-フェニル-5-(4-スルホフェニル)-4-オキサゾールメタン水酸化アンモニウム、2,2'-(1,4-フェニレン)ビス[N,N,N-トリメチル-5-(4-スルホフェニル)]-4-オキサゾールメタン水酸化アンモニウム、およびN,N'-ジ-(9-アクリジル)-1,6-ジアミノヘキサンがある。
【発明の開示】
【００１０】
発明の概要
本発明は、ペプチドの架橋またはトリプシン切断部位の妨害を引き起すことなく、染色前のグルタルアルデヒド固定により提供されるものと同等またはより良い検出感度を提供することが可能であるという発見にある程度関連する。
【００１１】
更に、銀イオンに結合することが可能なヘテロ原子を含む芳香族構造を保持する化合物を使用して、トリプシンによるタンパク質の切断を妨げることなく、銀染色の感度を改善できることも発見されている。
【００１２】
本発明は、マトリクス中の生体高分子を検出する方法であり、以下の段階を含む方法に関する：
(a)マトリクスを、1種または複数の任意に置換されたヘテロ芳香族化合物を含有する増感剤と接触させる段階；
(b)マトリクスを、1種または複数の還元可能な金属塩と接触させ、該生体高分子を染色する段階；および、
(c)染色された生体高分子を検出する段階。
【００１３】
本発明は更に、本発明に従い検出された生体高分子の質量分析による分析に関する。この態様において、生体高分子は、マトリクスから回収され、切断試薬により切断され、かつ質量分析に供される。好ましい態様において、生体高分子はタンパク質またはペプチドであり、かつ切断試薬はトリプシンを含む。従って、更に好ましい態様において、本発明は、マトリクス中のタンパク質またはペプチドを同定する方法であり、以下の段階を含む方法に関する：
(a)マトリクスを、1種または複数の任意に置換されたヘテロ芳香族化合物を含む増感剤と接触させる段階；
(b)マトリクスを、1種または複数の還元可能な金属塩と接触させ、該タンパク質またはペプチドを染色する段階；
(c)染色されたタンパク質またはペプチドを検出する段階；
(d)タンパク質またはペプチドに対して切断反応を行い、断片を得る段階；および
(e)該断片に対し質量分析を行い、これによりタンパク質またはペプチドを同定する段階。
【００１４】
本発明は、生体高分子検出用のキットであり、以下からなる群より選択される1種または複数の構成要素を含むキットも更に含む：
(a)1種または複数の任意に置換されたヘテロ芳香族化合物を含有する増感剤；
(b)1種または複数の還元可能な金属塩；
(c)還元剤を含有する1種または複数の現像液；
(d)還元可能な金属塩の更なる還元を防止する1種または複数の停止液；
(e)1種または複数のコントラスト増強剤；
(f)1種または複数の緩衝液；
(g)1種または複数の固定化剤；
(h)1種または複数の切断試薬；
(i)1種または複数の生体高分子；
(j)1種または複数のマトリクス；および
(k)pH変化に対し感受性のある1種または複数の指示薬。
【００１５】
本発明は更に、本発明を実行するための組成物、および、本発明によって作製された組成物にも関する。本発明のこのような組成物は、前述のキットの構成要素の1種または複数を含みうる。
【００１６】
発明の詳細な説明
マトリクス中のタンパク質、ポリペプチドおよび核酸を電気泳動的に分離する技術は公知である。ゲル電気泳動において、これらの分子は、それが配置された電界がマトリクスを通っての移動を引き起す速度に応じて、バンドに分類される。本発明において有用な特に好ましいマトリクスは、ポリアクリルアミドゲルである。その他の有用なマトリクスは、アガロース、紙、酢酸セルロース、ニトロセルロースなどを含む。
【００１７】
本発明によって検出され得る生体高分子の例とは、核酸分子(例えば、DNA、RNA、ハイブリッドDNA-RNA、ホスホチオエートおよび混合型骨格の誘導体のようなDNAおよびRNAの誘導体)、タンパク質、ペプチドなどを含む。
【００１８】
生体高分子をマトリクスに固定するために、このマトリクスを固定化剤と接触させるか、またはマイクロ波照射により処理する。このような固定化剤は、生体高分子をマトリクスへ固定して、染色手順を妨害し得る物質を除去するように機能する。このような固定化剤は、例えば、水銀、鉛およびオスミウムのような重金属の酸化剤、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、トリクロロ酢酸、および酢酸のような任意の従来の固定化剤を含む。別の態様において、固定化剤は、米国特許第4,575,452号に開示された、芳香族スルホン酸化合物またはN,N'-ジ-(9-アクリジル)-ジアミノアルキレン化合物でありうる。好ましい態様において、固定化剤は、有機酸および1個〜4個の炭素原子を含む低級アルコールの水溶液を含む。より好ましい固定化剤は、通常使用される有機酸を任意に含む、メタノール、エタノール、プロパノール、またはイソプロパノールのような低級アルコールを含む。このような有機酸は、酢酸、クエン酸、スルホサリチル酸、およびトリクロロ酢酸を含むが、これらに限定されるわけではない。最も好ましい態様において、固定化剤は、約40容量％エタノール、約10容量％酢酸および約50容量％蒸留水からなる。典型的には、マトリクスは、固定化剤への浸漬により固定されうり、新鮮な固定化剤中への浸漬は最大3回まで繰り返されうる。
【００１９】
固定化剤を用いたインキュベーション時間は経験的に決定され、かつマトリクスの厚さおよびインキュベーションが実行される温度に依存する。固定化速度の増大は、例えばマイクロ波発生装置を用いて、固定化液中に浸漬されたマトリクスを加熱することにより達成されうる。8cm×8cm×0.1cmゲルを用いる室温固定については、最適固定時間は、プラットフォームローター上で、60回転/分で約60分間である。当業者は、慣習的実験の域を出ることなく、所与のマトリクスを固定するのに最適な時間および温度を決定することができる。
【００２０】
マトリクスをその後洗浄液で処理して、遊離酸をできる限り多く除去することができる。洗浄液は、水、約10％〜30％水性エタノール/メタノール、または約10％〜30％水性エタノール/メタノールを含んでもよく、マトリクス中の残留酸を中和するための緩衝液をさらに含む。好ましい洗浄液は、30％エタノール水溶液である。洗浄液中のマトリクスに関する典型的インキュベーション時間は、約10分間である。マイクロ波加熱が使用される場合は、2分間〜5分間とより短い時間が好ましい。好ましい態様において、マトリクスは、染色に有害に作用する物質を除去するのに十分な時間、洗浄液中に浸漬される。
【００２１】
その後マトリクスを増感剤と接触させる。増感剤は、好ましくは少なくとも2個のヘテロ原子を有しかつ水溶性の、少なくとも1種の任意に置換されたヘテロ芳香族化合物、ならびに任意に、1種または複数のコントラスト増強剤および緩衝液を含有する。
【００２２】
少なくとも2個のヘテロ原子を有する任意に置換されたヘテロ芳香族化合物は、5個〜24個の環原子を有し；環状配列(cyclic array)において共有された6個、10個または14個のπ電子を有し；かつ、炭素原子ならびに2個、3個または4個の酸素、窒素、および/または硫黄原子を含む基を含む。このようなヘテロ芳香族化合物の例とは、チアントレン、フェノキサチン、イミダゾール、ピラゾール、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、インダゾール、プリン、フタラジン（phthalzine）、ナフチリジン、キノキサリン、1,4-ジヒドロキノキサリン-2,3-ジオン、キノザリン、シンノリン、プテリジン、β-カルボリン、ペリミジン、フェナントロリン、フェナジン、イソチアゾール、フェノチアジン、イソオキサゾール、フラザン、フェノキサジン、ピリド[1,2-a]ピリミジン-4-オン、1,2-ベンゾイソオキサゾール、ベンズイミダゾール、およびベンゾチアゾールを含むが、これらに限定されるわけではない。任意の置換基は、1個、2個、3個または4個の、アルキル基、ハロ基、ハロアルキル基、ニトロ基、アミノ基、シアノ基、イソシアノ基、ヒドロキシ基、チオール基、アルコキシ基、スルホニル基、カルボキシ基、任意に置換されたアリール基および任意に置換されたヘテロ芳香族基を含む。好ましい置換基は、例えば、アミノ基、ヒドロキシ基、スルホニル基およびカルボキシ基など、化合物に水溶性を付与するものを含む。ヘテロ芳香族基は、前述のヘテロ芳香族基に加え、チエニル基、ベンゾチエニル基、ナフトチエニル基、フリル基、ピラニル基、クロマニル基、イソクロマニル基、クロメニル基、ピロリル基、ピリジル基、インドリル基、キノリニル基、イソキノリニル基、クマリニル基、およびカルバゾリル基などを含む。
【００２３】
有用なアルキル基は、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、sec-ブチル基、t-ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、オクチル基、デシル基、ドデシル基、オクタデシル基などを含む、C1-20アルキル基である。低級アルキル基とは、C1-4アルキル基である。
【００２４】
有用なハロ基は、フルオロ基、クロロ基、ブロモ基、およびヨード基を含む。
【００２５】
有用なハロアルキル基は、クロロメチル基、ブロモメチル基、トリフルオロメチル基、トリクロロメチル基、ペンタクロロメチル基およびペンタフルオロメチル基を含む。
【００２６】
有用なアミノ基は、-NH2に加え、例えばメチルアミノ基、ジメチルアミノ基、エチルアミノ基、プロピルアミノ基、イソプロピルアミノ基、ブチルアミノ基などの、モノアルキルアミノ基およびジアルキルアミノ基を含む。
【００２７】
有用なアリール基は、C6-14アリール、特にC6-10アリールを含む。典型的なC6-14アリール基は、フェニル基、ナフチル基、フェナントリル基、アントラシル基、インデニル基、ビフェニル基、ビフェニレニル基、およびフルオレニル基を含む。
【００２８】
好ましい任意に置換されたヘテロ芳香族化合物とは、下記式を有する置換されたベンゾチアゾールである：
【化１】
式中、Xは酸素、NR7、または硫黄であってよく、ここでR7は水素またはアルキルであり；
R1は、失われるかまたは低級アルキル基であり；
R2は、水素、アミノ、任意に置換された低級アルキル、低級アルコキシ、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリール、任意に置換されたアラルキル、任意に置換されたヘテロアラルキル、任意に置換された低級アルキルチオ、任意に置換されたアリールチオ、任意に置換されたヘテロアリールチオ、2-アミノ-α-(メトキシイミノ)-4-チアゾールチオールアセテート、グアニジノ、カルボキシ、アルキルカルボキシ、任意に置換されたウレイド、アセトアセタミド、p-トルエンスルホンアミジル、または低級アルカノイルオキシであり；かつ
R3〜R6は、独立して、水素、アミノ、ハロ、ニトロ、シアノ、イソシアノ、ヒドロキシ、スルホニル、カルボキシ、任意に置換されたアルキル、アルコキシ、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリール、任意に置換されたアラルキル、任意に置換されたヘテロアラルキル、任意に置換された低級アルキルチオ、任意に置換されたアリールチオ、任意に置換されたヘテロアリールチオ、グアニジノ、任意に置換されたウレイド、または低級アルカノイルオキシである）。好ましいR3基〜R6基は、化合物に水溶性を付与するものを含む。R1が失われている化合物もまた好ましい。
【００２９】
本発明の実践において使用することができる任意に置換されたヘテロ芳香族化合物の例とは、プリムリン、チオフラビンS、2-(4-アミノフェニル)-6-メチル-7-スルホベンゾチアゾール、Direct Yellow 8、Direct Yellow 9、Direct Yellow 27、S-2-ベンゾチアゾリル-2-アミノ-α-(メトキシイミノ)-4-チアゾールチオールアセテート、3-(2-ベンゾチアゾリル)-1-プロパンスルホン酸(およびその塩)、3-(2-ベンゾチアゾリル)-7-(ジエチルアミノ)クマリン、3-(2-ベンズイミダゾリル)-7-(ジエチルアミノ)クマリン、3-(2-ベンゾチアゾリル)-7-オクタデシルオキシクマリン、7-オクタデシルオキシ-3-[3-(3-スルホプロピル)-2-ベンゾチアゾリルイオ]クマリン、3-(2-ベンゾチアゾリル)ウンベリフェロン、(2-ベンゾチアゾリル)グアニジン、2,6-ジメトキシ-4-(2-ベンゾチアゾリル)フェノール、2-(2-ベンゾチアゾリル)エタノール、2-(4-アミノフェニル)-6-メチルベンゾチアゾール、2-ベンゾチアゾールスルフィド、2-ベンゾチアゾリルスルホン酸(およびその塩)、3-(2-ベンゾチアゾリルアミノ)-5-ニトロフェノール、3-(2-ベンゾチアゾリル)プロプリオニトリル、4-(6-メチル-2-ベンゾチアゾリル)アセトアニリド、4-(2-ベンゾチアゾリルチオ)酪酸(およびその塩)、4-(6-メチル-2-ベンゾチアゾリル)フェニルイソシアナート、ルシフェリン、エチル(2-ベンゾチアゾリルチオ)ギ酸、N-(2-ベンゾチアゾリル)アセトアセタミド、N-(2-メチル-6-ベンゾチアゾリル)アセトアミド、N-(3-(2-ベンゾチアゾリル)-4-ヒドロキシフェニル)-p-トルエンスルホンアミド、およびN-(6-ニトロ-2-ベンゾチアゾリル)アセトアミドを含み、その多くはAldrich社(ミルウォーキー、WI)から市販されている。
【００３０】
任意に置換されたヘテロ芳香族化合物がカルボキシ基またはスルホニル基により置換されている場合、この基は、塩の形上、例えばナトリウム塩、カリウム塩またはアンモニウム塩であることができる。マトリクスにおいて、塩の陽イオンは、タンパク質由来の正電荷側鎖と置き換えられうる。さらに、タンパク質/ポリペプチド上のアミノ基は、銀などの金属と配位錯体を形成することができる。しかし、これらのアミノ基はまたマトリクスに付加された陰イオン性分子とも反応するため、タンパク質/ポリペプチドが銀イオンに配位する能力は、劇的に変化すると考えられる。しかし、ヘテロ芳香族化合物が銀に結合可能なさらなる基を含む場合には、錯体のキレート特性は保持されると考えられる。タンパク質/ペプチドの正のタンパク質側鎖と、負のスルホン酸塩置換増感剤との間の塩錯体の形成は、特に低分子量タンパク質に関して、感度の点で他の銀染色法に勝る利点をもたらす。
【００３１】
ポリアミノベンゾチアゾールスルホン酸誘導体の多くは、暗色の物質である。これらの材料は、マトリクス中に残った残渣の暗色がバックグラウンドの上昇をもたらすので、銀染色には適していない。従って好ましい態様において、任意に置換されたヘテロ芳香族化合物は、溶液中で黒色または濃暗色ではない。プリムリンおよびチオフラビンSは、典型的には褐色固体である。しかし濃縮溶液中でこれらはオレンジ色であり、希釈した場合は黄色である。
【００３２】
コントラスト増強剤の例とは、硫化ナトリウム、チオ尿素、ジチオスレイトール、テトラチオン酸カリウム、亜ジチオン酸ナトリウム、およびチオ硫酸のナトリウム塩またはカリウム塩である。チオ硫酸ナトリウムは、コントラスト増強剤として作用することが知られている(Wood, H. W.、J. Phot. Sci.、2:154(1954))。マトリクス中の生体高分子に沈着した銀は、硫黄含有化合物の存在下において、より容易に還元される。硫化銀は銀イオンの還元のための触媒として作用すると考えられる。好ましい態様において、コントラスト増強剤は、濃度約0.05％〜0.25％で存在する。
【００３３】
本発明の実践において使用されうる緩衝液の例とは、pKaが約5〜10であるような公知の生物学的緩衝液を含む。Sigma Life Sciences社カタログ2000-2001、962-965ページ参照。好ましい緩衝液は、水性モルホリノエタンスルホン酸、モルホリノプロパンスルホン酸(MOPS)、4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンプロパンスルホン酸(EPPS)、4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)などである。
【００３４】
好ましい増感剤は、約0.1Mモルホリノエタンスルホン酸(MES)、約5mMチオ硫酸ナトリウム、および約0.025％プリムリンを含む。増感剤は、約30％エタノール水溶液を更に含みうる。別の好ましい増感剤は、約0.1M MES、約5mMチオ硫酸ナトリウム五水和物、約0.025g/LチオフラビンS、および約1％ジメチルホルムアミド(DMF)を含む。この試薬を調製するために、チオフラビンSをDMF中に溶解し、かつ不溶性の不純物を除去する。その後この溶液をMESおよびチオ硫酸塩の溶液に添加して、pH6.1まで滴定する。塩が沈殿するが、これは試薬の性能には影響を及ぼさない。あるいは、チオフラビンS、MESおよびチオ硫酸塩は、水に溶解して、DMFを含まない溶液を形成することができる。反応がマイクロ波エネルギーにより加熱される場合には十分作用しないので、この試薬は好ましくない。溶液中にDMFを戻すことにより性能は回復するが、沈殿が起こるようになる。
【００３５】
次に、任意に照射を作動させながら、1種または複数の感光性のまたは還元可能な金属塩を含有する染色液とマトリクスを接触させて、生体高分子を染色するかまたは染色画像を形成する。好ましくは、還元可能な金属塩は、還元電位約0.5ボルト〜約1.9ボルトを有する。このような還元可能な金属塩の例とは、銀塩、金塩、白金塩および/またはイリジウム塩である。銀塩は比較的安価であるので好ましい。最も好ましい還元可能な金属塩は、硝酸銀である。あるいは、例えば硝酸銀および水酸化アンモニウムにより調製された、アンモニア銀錯体を使用することができる。塩の水中濃度は、マトリクスの厚さに(比例的でなく)反比例的に依存する。従って、0.001mmまたはそれ未満の超薄型マトリクスは高濃度の還元可能な金属塩を必要とするが、より厚いマトリクスはより低い濃度を必要とする。米国特許第4,405,720号参照のこと。典型的濃度は、蒸留水中硝酸銀0.1％〜0.2％である。マトリクスは、約10分間〜60分間インキュベーションされるが、約15分間が好ましい。マイクロ波加熱を使用する場合、インキュベーション時間を、照射時間を含めて5分間に短縮することができる。
【００３６】
マトリクス厚が約1mmを上回る場合、またはDNAなどのある種の有機高分子が染色される場合に、光照射を使用することができる。照射は任意の通常の様式でありうり、かつ光化学反応に作用するのに十分でなければならない。赤外線および/または熱による光化学線からの光照射を使用することができる。照射が使用される場合、還元可能な塩による処置の最初の数分間で最大感度を生じることが好ましい。典型的には、1,500ワットタングステン光源と同等の光を発する160ワット蛍光グリッドランプのような、明るく均一な光源を使用することができる。当業者は、慣習的実験の域を出ることなく、所与のマトリクス、タンパク質/ポリペプチド、および核酸分子について最適な光源および照射時間を選択することができる。
【００３７】
次に、マトリクスを水で迅速に濯ぎ、還元可能な遊離金属塩を除去する。銀結合は可逆的であるので、濯ぎの時間は約1分以下に維持されなければならない。
【００３８】
次に、染色画像が現像される。これは、1種または複数の還元剤を含有する現像液とマトリクスとの接触により達成されうる。このような還元剤は、鉄、タングステン、バナジウム、およびモリブデンの金属化合物、ならびにヒドロキノン、ピロガロール、p-フェニレンジアミン、パラホルムアルデヒドおよびホルムアルデヒドを含む有機化合物を含む、写真撮影において使用される任意のものを含む。有機還元剤が好ましい。ホルムアルデヒドまたはパラホルムアルデヒドが還元剤である場合、炭酸ナトリウムまたはメタホウ酸ナトリウムなどのアルカリ化剤をこの溶液へ更に添加することが好ましい。マトリクスが還元剤と接触するまで潜像現像は継続されうるため、このマトリクスを、還元可能な金属塩含有溶液から取除いたらすぐ還元剤に浸漬することができる。
【００３９】
好ましい態様において、pHが11〜12でありかつホルムアルデヒドを含有する塩基性緩衝液に、マトリクスが浸漬される。好ましい緩衝液は、炭酸ナトリウムおよび炭酸カリウムを含む。必要に応じて、または望ましいならば、浸漬を繰り返すことができる。任意にマトリクスを穏やかな攪拌に供することができる。最も好ましい現像液は、2.5％炭酸カリウムおよび0.35％(37質量％)ホルムアミドの水溶液からなる。現像時間は約3分間〜30分間であるが、これはゲル厚、試料負荷の程度およびバックグラウンド染色強度に依存する。当業者は、慣習的実験の域を出ることなく、最適現像時間を決定することができる。
【００４０】
最後に、マトリクスにおける反応は、停止液により停止される。これは、水による洗浄を通じて、ならびに/または現像液のpHを7〜10まで低下させるおよび未還元銀とキレート剤とを錯体形成させることにより達成される。都合がよいことに、緩衝液または酸およびキレート剤を含有する停止液を、直接現像液に添加することができる。使用されうる酸の例とは、酢酸、クエン酸および塩酸の水溶液を含む。キレート剤の例とは、エチレンジアミン四酢酸を含む。緩衝液としても作用する好ましいキレート剤とは、エチレンジアミン四酢酸およびその塩である。好ましい停止液は、0.5Mエチレンジアミン四酢酸三ナトリウム塩、pH8である。典型的には、任意にゆっくり攪拌しながら、マトリクスを停止液に10分間浸漬し、その後蒸留水で洗浄する。当業者は、慣習的実験の域を出ることなく、潜像の現像を停止するのに最適な時間および条件を決定することができる。
【００４１】
染色画像が現像されたら、肉眼による検査、例えば従来の平面式スキャナーによる走査、または撮像カメラなどの任意の従来の検出手段によりこれを検出することができる。例えば米国特許第4,703,016号参照のこと。
【００４２】
本発明はまた、マトリクス中のタンパク質またはペプチドを同定する方法であって、以下の段階を含む方法に関する：
(a)マトリクスを、1種または複数の任意に置換されたヘテロ芳香族化合物を含む増感剤と接触させる段階；
(b)マトリクスを、1種または複数の還元可能な金属塩と接触させ、該タンパク質またはペプチドを染色する段階；
(c)染色されたタンパク質またはペプチドを検出し、これによりタンパク質またはペプチドを検出する段階；
(d)タンパク質またはペプチドに対して切断反応を行い、断片を得る段階；および
(e)該断片に対して質量分析を行い、これによりタンパク質またはペプチドを同定する段階。
【００４３】
本方法を実施する際に、本明細書に説明されたように、タンパク質またはペプチドをまずマトリクスへ固定することができる。好ましい態様において、エタノール、酢酸および水からなる固定化剤とマトリクスとの接触により、タンパク質またはペプチドはマトリクスへ固定される。
【００４４】
染色タンパク質またはペプチドが検出される前に、本明細書記載の、1種または複数の還元剤を含有する現像液により処理することができる。染色画像はその後、本明細書記載の方法のいずれかにより検出されうる。
【００４５】
タンパク質またはペプチドの切断反応を行うために、染色タンパク質またはペプチドをマトリクスから切出すことができ、その後タンパク質またはペプチドをマトリクスから単離する。例えばタンパク質またはペプチドをマトリクスから外科用メスで切出して、容器に入れてもよい。好ましい態様において、フェリシアン化カリウムおよびチオ硫酸ナトリウムの混合水溶液を容器に添加して、実質的に全ての還元銀金属粒子を銀イオンに再酸化し、これらをチオ硫酸に複合させる。タンパク質またはポリペプチドを、水により1回から最大6回までまたはそれ以上抽出することができる。その後抽出物を、トリプシンなどのプロテアーゼを含有する切断試薬で処理することができ、次に断片を質量分析に供して同一性を決定する。Shevenko, A.ら、Anal. Chem.、68:850-858(1996)；Helmannn, V.ら、Anal. Biochem.、224:451-455(1995)；Coligan, J.E.ら、「タンパク質科学最新プロトコール(Current Protocols in Protein Science)」、V.B. Chanda(編集)(1998)；Patterson, S.D.およびAebersold, R.、Electrophoresis、16:1791-1814(1995)；および、Bergmanら、Electrophoresis、21:679-686(2000)を参照のこと。前述したように、本方法は、タンパク質およびポリペプチドの架橋が生じないので、グルタルアルデヒドを使用する従来法の改善となる。さらに増感剤は、グルタルアルデヒドを必要とせずに、タンパク質およびポリペプチドの高感度検出を提供する。
【００４６】
本発明は、新たな種類の増感剤が発見された点で、当技術分野における大きな前進となる。これらの新規物質は、マトリクス中に固定されている生体高分子へ結合し、かつ還元可能な金属塩の生体高分子ゾーンへの局所的結合を増大させる。マトリクスが本明細書記載の還元条件に供された場合にイオンの還元が生じるように、これらの増感剤は、還元可能な金属塩イオンにのみ弱く結合する。
【００４７】
本発明により達成される生体高分子に関する感度の増大は、以下に考察したいくつかの要因から生じると考えられる。第一に、特定の理論に縛られるわけではないが、正電荷側鎖とチオフラビンSのスルホン酸基との電荷-電荷引力、およびおそらくは芳香族ベンゾチアゾール環とタンパク質構造の疎水領域との相互作用が、マトリクス中のタンパク質への増感剤の結合を可能にすると考えられる。さらに、ベンゾチアゾール環構造の硫黄原子および窒素原子は、その後希ホルムアルデヒド溶液によりpH＞10で効率的に銀金属に還元され得る、銀(+1)イオンとの弱い配位錯体を形成できると考えられる。核酸については、この機構は、ベンゾチアゾール環構造の平面芳香核が2個の隣接ピリミジン塩基またはプリン塩基の間に並べられて、πスタッキング相互作用により安定化される複合体を形成するような介在作用である可能性がより高いと考えられる。ベンゾチアゾール環系の硫黄および/または窒素を介して銀結合が再度生じて、pH10を上回るアルカリ培地中でホルムアルデヒドにより還元されるのに十分な弱さで結合する。
【００４８】
本発明はまた、生体高分子を検出するためのキットであり、以下からなる群より選択される1種または複数の構成要素を含むキットに関する：
(a)1種または複数の任意に置換されたヘテロ芳香族化合物を含有する増感剤；
(b)1種または複数の還元可能な金属塩；
(c)還元剤を含有する1種または複数の現像液；
(d)還元可能な金属塩の更なる還元を防止する1種または複数の停止液；
(e)1種または複数の緩衝液；
(f)1種または複数の固定化剤；
(g)1種または複数の切断試薬；
(h)1種または複数の生体高分子；
(i)1種または複数のマトリクス；および
(j)pH変化に対し感受性のある1種または複数の指示薬。
【００４９】
本キットは一般に、カートン、箱、チューブなどであり、かつ1個または複数の容器を含み、その各々が、上記で列挙された1種または複数の構成要素を含む。このような容器は、箱、瓶、広口瓶、チューブ、アンプルなどを含む。
【００５０】
生体高分子を、例えば標準または対照として使用するために、キットの中に含めることができる。
【００５１】
キットに含まれうるマトリクスの例とは、ポリアクリルアミドゲル、アガロース、紙、酢酸セルロース、またはニトロセルロースを含む。
【００５２】
キットに含まれうる指示薬の例とは、フェノールフタレインおよびチモールフタレインである。
【００５３】
本発明はまた、本発明の方法を実行するための組成物および本発明の実施の際に形成される組成物に関する。このような組成物は、以下からなる群より選択される、1種または複数の構成要素を含むことができる：
(a)1種または複数の任意に置換されたヘテロ芳香族化合物を含有する増感剤；
(b)1種または複数の還元可能な金属塩；
(c)還元剤を含有する1種または複数の現像液；
(d)還元可能な金属塩の更なる還元を防止する1種または複数の停止液；
(e)1種または複数の緩衝液；
(f)1種または複数の固定化剤；
(g)1種または複数の切断試薬；
(h)1種または複数の生体高分子；
(i)1種または複数のマトリクス；および
(j)pH変化に対し感受性のある1種または複数の指示薬。
【００５４】
本発明はまた、本発明の実践により得られた組成物に関する。このような組成物は、得られる様々な反応混合液、ならびに切断試薬により得られる切断タンパク質および切断ペプチドを含むが、これらに限定されるわけではない。
【００５５】
下記実施例は、本発明の方法および組成物を例証しているが、限定を意図したものではない。当技術分野において通常起こりうりかつ当業者に明らかである、様々な条件およびパラメータに対するその他の好適な修飾および適合荷は、本発明の精神および範囲内であると考えられる。
【００５６】
実施例
実施例1
基本的染色法
下記実施例においては、製剤は下記のような構成であった。全ての溶液を、w/超純水で作製した。
増感剤：1M モルホリノエタンスルホン酸
50mM チオ硫酸ナトリウム五水和物
0.25g/L チオフラビンS
10％ ジメチルホルムアミド
染色剤：20％ 硝酸銀
現像剤：15％ 炭酸カリウム
0.075％ チオ硫酸ナトリウム五水和物
0.002％ フェノールフタレイン
現像促進剤：37％ ホルムアルデヒド
停止液：0.5M エチレンジアミン四酢酸
1.5M トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン
脱色剤A：30mM フェリシアン化カリウム
脱色剤B：100mM チオ硫酸ナトリウム五水和物
【００５７】
基本的染色プロトコール
開始前に、染色用の下記溶液を調製する。
*増感液
エタノール 30ml
増感剤 10ml
総量100mlとなるまで超純水を加える
*染色液
染色剤 1ml
総量100mlとなるまで超純水を加える
*現像液
現像剤 10ml
現像促進剤 1滴
総量100mlとなるまで超純水を加える
【００５８】
溶液は、染色プロトコール開始直前、または次段階に進む度に調製されうる。
【００５９】
手順
本手順は、8×8cm NuPAGE(登録商標)Bis-Tris、Tris-酢酸、TBE、またはTris-グリシンミニ-ゲル（厚さ1.0mm）の使用に向けたものである。2個のミニゲル（厚さ1.0mm）または1個の大きい(18×18cm)ゲルを1回で染色する場合、全ての溶液の容量を2倍にしなめればならないが、インキュベーション時間は同じままである。ゲルの寸法が上記と同じでなくとも、染色プロトコールを最適化することができる。
【００６０】
全てのインキュベーションは、室温において約1回転/秒の速度で回転する回転振盪機上で行うこととする。ゲル1個あたり溶液100mlとする。
1. 電気泳動後、カセットからゲルを取り出し、適当なサイズの清潔な染色トレイ中に置く。任意で、ゲルを超純水で2回濯いでもよい。
2. 固定液100ml中で60分間、ゲルをゆっくり回転させながら固定する。(注意：染色プロトコールを完了するのに十分な時間がない場合は、ゲルを固定液中で一晩保存することができる。)
3. 固定液をデカントし、ゲルを30％エタノール100ml中で10分間洗浄する。
4. 染色容器内の洗浄したゲルに、増感液100mlを添加する。ゲルを増感液中で10分間インキュベーションする。
5. ゲルを30％エタノール100ml中で10分間洗浄する。
6. 増感液をデカントし、ゲルを超純水100ml中で10分間洗浄する。
7. ゲルを染色液100ml中に15分間入れる。
8. 染色が完了した後、染色液をデカントして、超純水100mlで1分間ゲルを洗浄する。
注意：ゲルの洗浄が1分を上回ると、ゲルから銀イオンが除去されて感度の減少につながると考えられる。
9. バンドが出現し始めるまでの5分間〜8分間、ゲルを現像液100ml中でインキュベーションする。
10. 所望のバンド強度が達成されたらすぐに、現像液に浸漬されたままのゲルに停止液10mlを直接添加する。ゲルを10分間ゆるやかに攪拌する。色がピンク色から無色へ変化するが、これは現像が停止したことを示している。
11. 停止液をデカントし、かつゲルを超純水100mlで10分間洗浄する。
【００６１】
質量分析のためにゲルを脱色する場合は、実施例3を参照のこと。
【００６２】
実施例2
高速染色法
概論
高速染色プロトコールは、基本的染色プロトコールの変法である。本方法では、タンパク質ゲルを迅速に銀染色するために電子レンジを使用する。この染色プロトコールは、1時間未満で完了されうる。
必要な材料
*超純水
*電子レンジ用染色トレイ
*電子レンジ
*回転振盪機
*テフロンコーティングされた攪拌子
*使い捨て10mlピペット
*試薬調製用の清潔なガラス瓶
*目盛り付きガラスシリンダー
*30％エタノール(超純水で調製)
*100％エタノール
*固定液(40％エタノール、10％酢酸、超純水で調製)
【００６３】
開始前
下記の染色用溶液を調製する。
*増感液
エタノール 30ml
増感剤 10ml
総量100mlとなるまで超純水を加える
*染色液
染色剤 1ml
総量100mlとなるまで超純水を加える
*現像液
現像剤 10ml
現像促進剤 1滴
総量100mlとなるまで超純水を加える
注意：全ての溶液は、染色プロトコール開始直前に調製されうるか、または次段階に進む度に調製されうる。
【００６４】
手順
厚さ1.0mmの、8×8cm NuPAGE(登録商標)ゲルの使用に向けたものである。ゲル1個あたり溶液100mlが必要であることを確認されたい。(注意：使用するゲル寸法が上記のものと同じでない場合は、染色プロトコールを最適化することができる。)
1. 電気泳動後、ゲルをカセットから取り外し、適当な大きさの清潔な電子レンジ用染色トレイに入れる。ゲルを超純水で2回濯ぐ。
2. ゲルを固定液100ml中に入れ、高出力で30秒間電子レンジにかける。電子レンジからゲルを取り出し、室温で5分間ゆっくり攪拌する。固定液をデカントする。
3. ゲルを高出力で30秒間電子レンジにかけながら、30％エタノール100mlで洗浄する。電子レンジからゲルを取り出し、回転振盪機上で5分間、室温でゆっくり攪拌する。
4. 増感液100mlを、洗浄したゲルに添加する。ゲルを、高出力で30秒間電子レンジにかける。電子レンジからゲルを取り出し、回転振盪機上で2分間、室温でゆっくり攪拌する。増感液をデカントする。
5. ゲルを超純水100mlで2回洗浄する。高出力で30秒間電子レンジにかける。電子レンジからゲルを取り出し、室温で2分間ゆっくり攪拌する。水をデカントする。
6. 染色液100ml中にゲルを入れる。高出力で30秒間電子レンジにかける。電子レンジからゲルを取り出し、室温で5分間ゆっくり攪拌する。
7. 染色液をデカントし、ゲルを超純水100mlで1分間洗浄する。
8. ゲルを現像液100ml中に入れ、回転浸透機上でゆるやかに攪拌しながら5分間インキュベーションする。(電子レンジにはかけない。)
9. 所望のバンド強度が達成されたらすぐ、現像液に浸漬されたままのゲルに停止液10mlを直接添加して、ゲルを10分間ゆるやかに攪拌する。色がピンク色から無色に変化するが、これは現像が停止したことを示している。
10. ゲルを超純水100mlで10分間洗浄する。
11. 質量分析のためにゲルを脱色しなければならない場合は、実施例3を参照のこと。
【００６５】
実施例3
質量分析のための脱色法
質量分析のために試料を調製する場合、ゲル内でトリプシン消化を行う前に、タンパク質バンドから銀イオンを除去することが重要である(Gharahdaghiら、Electrophoresis、20:601-605(1999))。効率的に銀イオンをゲルから取除く脱色プロトコールを以下で説明する。
必要な材料：
清潔な外科用メス
1.5ml滅菌微量遠心管
超純水
微量遠心機
【００６６】
手順
NuPAGE(登録商標)Bis Tris、Tris-グリシン、またはTris-酢酸の8x8ミニ-ゲル（厚さ1.0mm）の使用に向けたものである。
1. ゲルの銀染色後、超純水でゲルを完全に洗浄する。
2. 清潔な外科用メスを用いて関心対象のバンドを慎重に切出し、1.5mlの滅菌微量遠心管に入れる。ゲルのブランク領域から同じ大きさの別のゲル片を切出し、別の滅菌微量遠心管に入れる。これは後で、トリプシン消化の対照として使用されることになる。
3. 脱色液A 50μlおよび脱色液B 50μlを、各微量遠心管に入れる。
注意：多数のゲルバンドを脱色する場合には、脱色液Aおよび脱色液Bの混合により必要量の脱色液を調製し、直ちに使用されたい。脱色液Aおよび脱色液Bは、一旦混合されたら長期保存することができない。
1. チューブの内容物を完全に混合し、室温で15分間インキュベーションする。
2. 清潔なピペットチップを用い、上清を慎重に除去する。
3. 超純水200μlをチューブに添加し、完全に混合する。室温で10分間インキュベーションする。
【００６７】
段階5〜段階6を少なくとも2回繰り返す。トリプシン消化および質量分析機による分析を進める。
【００６８】
本発明を十分に説明したことで、当業者は、広範かつ同等の範囲内の条件、製剤およびその他のパラメータにより、本発明の範囲またはどの態様にも影響を及ぼすことなく、同様のことを実施できることが理解されると考えられる。本明細書において引用された全ての特許、特許出願および刊行物は、その全体が本明細書に参照として完全に組入れられている。
【０００１】
発明の背景
発明の技術分野
本発明は、合成マトリクス中に固定されたタンパク質、ポリペプチドおよび核酸分子などの生体高分子の金属染色の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
関連技術
ゲル電気泳動は、核酸、ポリペプチド、タンパク質およびオリゴ糖の分離に関する研究の関連分野および生化学分野において常用される分析技術である。関心対象の試料はマトリクス中に配置され、その後様々な成分の移動ならびに分子の分子量、電荷、およびその他の物理特性に基づく個別のバンドへの分離をもたらすような電界に曝露される。大部分の分子は、それにより可視化を可能にしうるような発色団またはフルオロフォアを内蔵していないため、電気泳動終了後の移動パターンは、通常解読不可能である。マトリクス中の関心対象の分子の正確な位置を可視化するための多くの方法が開発されているが、事実上染色されないマトリクスのブランク領域が残存したままである。これらは、クーマシーブリリアントブルー色素、臭化エチジウム、およびポンソーS染色を含む。銀染色は、これらの色素により達成されるよりも感度を増大させるために開発された。初期に広範に使用された銀染色技法のひとつは、Merrilらにより報告された(Meth. Enzymol.、96:230(1983))。この論文においては、電気泳動マトリクス、特にポリアクリルアミドを、酸または酸/アルコール溶液のいずれかに約1時間浸漬し、タンパク質をマトリクス中に固定する。マトリクスを次に、典型的には約30分間洗浄する。その後マトリクスを、約5分間二クロム酸溶液に浸し、タンパク質を酸化させる。次にこれらのゲルは、硝酸銀溶液に20分間浸して、その後炭酸ナトリウム/ホルムアルデヒド緩衝液で濯ぎ、タンパク質および核酸に結合した銀イオンを還元する。銀パターンを現像し、その後酢酸の添加により停止する。パターンは次に、直接視認または機器的技法のいずれかにより分析される。
【０００３】
Merrilらの方法は、Oakleyら(Anal. Biochem.、105:361(1980))により簡略化された。電気泳動されたゲルは、タンパク質を架橋するために、非緩衝グルタルアルデヒドで処理された。これらのゲルは、濯ぎ後、硝酸銀/水酸化アンモニウム/水酸化ナトリウム溶液で処理された。最後に、ホルムアルデヒドのクエン酸溶液を用いて銀イオンを銀へ還元し、ゲルマトリクス中のバンドを可視化した。
【０００４】
グルタルアルデヒドは、多くの実験室において、銀染色によるタンパク質検出の限界を下げるために使用されている(Rabilloud, T.、Electrophoresis、11:785-794(1990)；Rabilloud, T.、Cell. Mol. Biol.、40:57-75(1994))。この化合物が感度を増大させる正確な機構は大規模には評価されていないが、最初にタンパク質中の遊離アミノ基へ結合して、遊離アルデヒド官能来を残存させるシッフ塩基を形成することにより機能すると考えられる。遊離アミノ基は、タンパク質のN末端に見出され、かつリシンおよびアルギニンの側鎖上にも見出される。このアルデヒドは、タンパク質ゾーン（zone）の銀を還元し、銀金属析出の開始をもたらす。銀金属は銀イオンの銀への更なる還元を触媒し、最終的な結果として、タンパク質に隣接する銀析出の速度を増大させると考えられる。このようなグルタルアルデヒド増感を用いた製品の例とは、Invitrogen社(Carlsbad、CA)により販売されているSILVERXPRESS銀染色である。
【０００５】
グルタルアルデヒドの使用は低レベルのタンパク質の染色感度を改善するが、質量分析によるゲルの更なる分析が望ましい場合には、望ましくない作用を有する。Schelerら、Electrophoresis、19:918-927(1998)。質量分析によるタンパク質分析に広く使用される技術とは、酵素トリプシンによりタンパク質を断片へと切断することである。トリプシン切断により作製されたタンパク質断片は、この酵素はリシンまたはアルギニンのような塩基性アミノ酸の直ぐ後ろのアミド結合を優先的に切断するので、容易に推測される。リシンまたはアルギニンのアミノ基がグルタルアルデヒドによりシッフ塩基に結合している場合は、これは最早トリプシン切断部位ではない。さらに、最初の複合体がグルタルアルデヒド分子とタンパク質との間に形成される場合は、残存する遊離アルデヒド基を、その他のアミノ基との縮合に使用することができ、これにより架橋したタンパク質が形成される。この特性は、組織学的用途において有効な固定液であるグルタルアルデヒドを形成するものである。しかしランダムな形でアミノ基を含むペプチドおよびタンパク質を架橋することにより、潜在的トリプシン切断部位が妨害されるだけでなく、タンパク質１次構造の分析からはその分子量が予想できないような架橋されたペプチドおよびペプチドがランダムに形成される。その結果、その分子量がタンパク質の同定のために診断的であり得る多くの断片の発生量が減る。他の酵素をタンパク質断片化に使用することができるが、トリプシンの特異性がこれを好ましい選択肢としている。
【０００６】
米国特許第4,405,720号は、 酸化剤を用いた処理によるポリペプチドゲルの光反転(photo-reversing)段階、感光性塩と称される還元可能な金属塩を用いたポリペプチドゲルの処理による染色潜像の形成段階、および還元剤を用いたポリペプチドゲルの処理による染色像の現像段階を含む、ゲル中でのポリペプチドの銀染色法を開示している。このような感光性塩の例とは、銀、金、白金、パラジウムおよび/またはイリジウムの塩を含む。
【０００７】
米国特許第4,468,466号は、還元剤ジチオスレイトールによる処理、その後の銀塩および照射作動(actuating radiation)による処理を含む、銀染色法を開示している。この特許において、ジチオスレイトールは、光反転性に作用しかつ非タンパク質の銀染色を避けるための還元剤として作用する。
【０００８】
米国特許第4,703,016号は、タンパク質およびDNAの銀染色法を開示している。本方法は以下の段階を含む：酢酸第二銅溶液中で膜上にタンパク質を固定する段階；酢酸、塩化ナトリウム、およびクエン酸を含有する溶液と膜とを接触させる段階；酢酸および硝酸銀を含有する溶液と膜とを接触させて、光源を用いて照射する段階；酢酸、塩化ナトリウム、およびクエン酸を含有する溶液と膜とを接触させる段階；膜を硝酸銀溶液に戻して、膜を照射する段階；ヒドロキノンおよびホルムアルデヒドを含有する溶液に移すことによる、画像を現像する段階；水を用いて洗浄して、チオ硫酸ナトリウムと接触させる段階；ならびに、その後、水により洗浄する段階。
【０００９】
米国特許第4,575,452号は、第三級アミンを有する芳香族スルホン酸化合物およびN,N'-ジ-(9-アクリジル)-ジアミノアルキレン化合物を用いて、マトリクス中のタンパク質および核酸を固定する段階を含む、マトリクス中のタンパク質および核酸の検出法を開示している。このような化合物の具体例は、4,4'-[1,4-フェニレンビス(2,5-オキサゾールジイル)]-ビスベンゼンスルホン酸、4,4'-[1,4-フェニレンビス(4-メチル-2,5-オキサゾールジイル)ビスベンゼンスルホン酸、2,2'-(2,5-チオフェンジイル)ビス[5-(1,1-ジメチルエチル)-7-ベンゾオキサゾールスルホン酸、N,N,N-トリメチル-2-フェニル-5-(4-スルホフェニル)-4-オキサゾールメタン水酸化アンモニウム、2,2'-(1,4-フェニレン)ビス[N,N,N-トリメチル-5-(4-スルホフェニル)]-4-オキサゾールメタン水酸化アンモニウム、およびN,N'-ジ-(9-アクリジル)-1,6-ジアミノヘキサンがある。
【発明の開示】
【００１０】
発明の概要
本発明は、ペプチドの架橋またはトリプシン切断部位の妨害を引き起すことなく、染色前のグルタルアルデヒド固定により提供されるものと同等またはより良い検出感度を提供することが可能であるという発見にある程度関連する。
【００１１】
更に、銀イオンに結合することが可能なヘテロ原子を含む芳香族構造を保持する化合物を使用して、トリプシンによるタンパク質の切断を妨げることなく、銀染色の感度を改善できることも発見されている。
【００１２】
本発明は、マトリクス中の生体高分子を検出する方法であり、以下の段階を含む方法に関する：
(a)マトリクスを、1種または複数の任意に置換されたヘテロ芳香族化合物を含有する増感剤と接触させる段階；
(b)マトリクスを、1種または複数の還元可能な金属塩と接触させ、該生体高分子を染色する段階；および、
(c)染色された生体高分子を検出する段階。
【００１３】
本発明は更に、本発明に従い検出された生体高分子の質量分析による分析に関する。この態様において、生体高分子は、マトリクスから回収され、切断試薬により切断され、かつ質量分析に供される。好ましい態様において、生体高分子はタンパク質またはペプチドであり、かつ切断試薬はトリプシンを含む。従って、更に好ましい態様において、本発明は、マトリクス中のタンパク質またはペプチドを同定する方法であり、以下の段階を含む方法に関する：
(a)マトリクスを、1種または複数の任意に置換されたヘテロ芳香族化合物を含む増感剤と接触させる段階；
(b)マトリクスを、1種または複数の還元可能な金属塩と接触させ、該タンパク質またはペプチドを染色する段階；
(c)染色されたタンパク質またはペプチドを検出する段階；
(d)タンパク質またはペプチドに対して切断反応を行い、断片を得る段階；および
(e)該断片に対し質量分析を行い、これによりタンパク質またはペプチドを同定する段階。
【００１４】
本発明は、生体高分子検出用のキットであり、以下からなる群より選択される1種または複数の構成要素を含むキットも更に含む：
(a)1種または複数の任意に置換されたヘテロ芳香族化合物を含有する増感剤；
(b)1種または複数の還元可能な金属塩；
(c)還元剤を含有する1種または複数の現像液；
(d)還元可能な金属塩の更なる還元を防止する1種または複数の停止液；
(e)1種または複数のコントラスト増強剤；
(f)1種または複数の緩衝液；
(g)1種または複数の固定化剤；
(h)1種または複数の切断試薬；
(i)1種または複数の生体高分子；
(j)1種または複数のマトリクス；および
(k)pH変化に対し感受性のある1種または複数の指示薬。
【００１５】
本発明は更に、本発明を実行するための組成物、および、本発明によって作製された組成物にも関する。本発明のこのような組成物は、前述のキットの構成要素の1種または複数を含みうる。
【００１６】
発明の詳細な説明
マトリクス中のタンパク質、ポリペプチドおよび核酸を電気泳動的に分離する技術は公知である。ゲル電気泳動において、これらの分子は、それが配置された電界がマトリクスを通っての移動を引き起す速度に応じて、バンドに分類される。本発明において有用な特に好ましいマトリクスは、ポリアクリルアミドゲルである。その他の有用なマトリクスは、アガロース、紙、酢酸セルロース、ニトロセルロースなどを含む。
【００１７】
本発明によって検出され得る生体高分子の例とは、核酸分子(例えば、DNA、RNA、ハイブリッドDNA-RNA、ホスホチオエートおよび混合型骨格の誘導体のようなDNAおよびRNAの誘導体)、タンパク質、ペプチドなどを含む。
【００１８】
生体高分子をマトリクスに固定するために、このマトリクスを固定化剤と接触させるか、またはマイクロ波照射により処理する。このような固定化剤は、生体高分子をマトリクスへ固定して、染色手順を妨害し得る物質を除去するように機能する。このような固定化剤は、例えば、水銀、鉛およびオスミウムのような重金属の酸化剤、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、トリクロロ酢酸、および酢酸のような任意の従来の固定化剤を含む。別の態様において、固定化剤は、米国特許第4,575,452号に開示された、芳香族スルホン酸化合物またはN,N'-ジ-(9-アクリジル)-ジアミノアルキレン化合物でありうる。好ましい態様において、固定化剤は、有機酸および1個〜4個の炭素原子を含む低級アルコールの水溶液を含む。より好ましい固定化剤は、通常使用される有機酸を任意に含む、メタノール、エタノール、プロパノール、またはイソプロパノールのような低級アルコールを含む。このような有機酸は、酢酸、クエン酸、スルホサリチル酸、およびトリクロロ酢酸を含むが、これらに限定されるわけではない。最も好ましい態様において、固定化剤は、約40容量％エタノール、約10容量％酢酸および約50容量％蒸留水からなる。典型的には、マトリクスは、固定化剤への浸漬により固定されうり、新鮮な固定化剤中への浸漬は最大3回まで繰り返されうる。
【００１９】
固定化剤を用いたインキュベーション時間は経験的に決定され、かつマトリクスの厚さおよびインキュベーションが実行される温度に依存する。固定化速度の増大は、例えばマイクロ波発生装置を用いて、固定化液中に浸漬されたマトリクスを加熱することにより達成されうる。8cm×8cm×0.1cmゲルを用いる室温固定については、最適固定時間は、プラットフォームローター上で、60回転/分で約60分間である。当業者は、慣習的実験の域を出ることなく、所与のマトリクスを固定するのに最適な時間および温度を決定することができる。
【００２０】
マトリクスをその後洗浄液で処理して、遊離酸をできる限り多く除去することができる。洗浄液は、水、約10％〜30％水性エタノール/メタノール、または約10％〜30％水性エタノール/メタノールを含んでもよく、マトリクス中の残留酸を中和するための緩衝液をさらに含む。好ましい洗浄液は、30％エタノール水溶液である。洗浄液中のマトリクスに関する典型的インキュベーション時間は、約10分間である。マイクロ波加熱が使用される場合は、2分間〜5分間とより短い時間が好ましい。好ましい態様において、マトリクスは、染色に有害に作用する物質を除去するのに十分な時間、洗浄液中に浸漬される。
【００２１】
その後マトリクスを増感剤と接触させる。増感剤は、好ましくは少なくとも2個のヘテロ原子を有しかつ水溶性の、少なくとも1種の任意に置換されたヘテロ芳香族化合物、ならびに任意に、1種または複数のコントラスト増強剤および緩衝液を含有する。
【００２２】
少なくとも2個のヘテロ原子を有する任意に置換されたヘテロ芳香族化合物は、5個〜24個の環原子を有し；環状配列(cyclic array)において共有された6個、10個または14個のπ電子を有し；かつ、炭素原子ならびに2個、3個または4個の酸素、窒素、および/または硫黄原子を含む基を含む。このようなヘテロ芳香族化合物の例とは、チアントレン、フェノキサチン、イミダゾール、ピラゾール、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、インダゾール、プリン、フタラジン（phthalzine）、ナフチリジン、キノキサリン、1,4-ジヒドロキノキサリン-2,3-ジオン、キノザリン、シンノリン、プテリジン、β-カルボリン、ペリミジン、フェナントロリン、フェナジン、イソチアゾール、フェノチアジン、イソオキサゾール、フラザン、フェノキサジン、ピリド[1,2-a]ピリミジン-4-オン、1,2-ベンゾイソオキサゾール、ベンズイミダゾール、およびベンゾチアゾールを含むが、これらに限定されるわけではない。任意の置換基は、1個、2個、3個または4個の、アルキル基、ハロ基、ハロアルキル基、ニトロ基、アミノ基、シアノ基、イソシアノ基、ヒドロキシ基、チオール基、アルコキシ基、スルホニル基、カルボキシ基、任意に置換されたアリール基および任意に置換されたヘテロ芳香族基を含む。好ましい置換基は、例えば、アミノ基、ヒドロキシ基、スルホニル基およびカルボキシ基など、化合物に水溶性を付与するものを含む。ヘテロ芳香族基は、前述のヘテロ芳香族基に加え、チエニル基、ベンゾチエニル基、ナフトチエニル基、フリル基、ピラニル基、クロマニル基、イソクロマニル基、クロメニル基、ピロリル基、ピリジル基、インドリル基、キノリニル基、イソキノリニル基、クマリニル基、およびカルバゾリル基などを含む。
【００２３】
有用なアルキル基は、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、sec-ブチル基、t-ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、オクチル基、デシル基、ドデシル基、オクタデシル基などを含む、C1-20アルキル基である。低級アルキル基とは、C1-4アルキル基である。
【００２４】
有用なハロ基は、フルオロ基、クロロ基、ブロモ基、およびヨード基を含む。
【００２５】
有用なハロアルキル基は、クロロメチル基、ブロモメチル基、トリフルオロメチル基、トリクロロメチル基、ペンタクロロメチル基およびペンタフルオロメチル基を含む。
【００２６】
有用なアミノ基は、-NH2に加え、例えばメチルアミノ基、ジメチルアミノ基、エチルアミノ基、プロピルアミノ基、イソプロピルアミノ基、ブチルアミノ基などの、モノアルキルアミノ基およびジアルキルアミノ基を含む。
【００２７】
有用なアリール基は、C6-14アリール、特にC6-10アリールを含む。典型的なC6-14アリール基は、フェニル基、ナフチル基、フェナントリル基、アントラシル基、インデニル基、ビフェニル基、ビフェニレニル基、およびフルオレニル基を含む。
【００２８】
好ましい任意に置換されたヘテロ芳香族化合物とは、下記式を有する置換されたベンゾチアゾールである：
【化１】
R1は、失われるかまたは低級アルキル基であり；
R2は、水素、アミノ、任意に置換された低級アルキル、低級アルコキシ、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリール、任意に置換されたアラルキル、任意に置換されたヘテロアラルキル、任意に置換された低級アルキルチオ、任意に置換されたアリールチオ、任意に置換されたヘテロアリールチオ、2-アミノ-α-(メトキシイミノ)-4-チアゾールチオールアセテート、グアニジノ、カルボキシ、アルキルカルボキシ、任意に置換されたウレイド、アセトアセタミド、p-トルエンスルホンアミジル、または低級アルカノイルオキシであり；かつ
R3〜R6は、独立して、水素、アミノ、ハロ、ニトロ、シアノ、イソシアノ、ヒドロキシ、スルホニル、カルボキシ、任意に置換されたアルキル、アルコキシ、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリール、任意に置換されたアラルキル、任意に置換されたヘテロアラルキル、任意に置換された低級アルキルチオ、任意に置換されたアリールチオ、任意に置換されたヘテロアリールチオ、グアニジノ、任意に置換されたウレイド、または低級アルカノイルオキシである）。好ましいR3基〜R6基は、化合物に水溶性を付与するものを含む。R1が失われている化合物もまた好ましい。
【００２９】
本発明の実践において使用することができる任意に置換されたヘテロ芳香族化合物の例とは、プリムリン、チオフラビンS、2-(4-アミノフェニル)-6-メチル-7-スルホベンゾチアゾール、Direct Yellow 8、Direct Yellow 9、Direct Yellow 27、S-2-ベンゾチアゾリル-2-アミノ-α-(メトキシイミノ)-4-チアゾールチオールアセテート、3-(2-ベンゾチアゾリル)-1-プロパンスルホン酸(およびその塩)、3-(2-ベンゾチアゾリル)-7-(ジエチルアミノ)クマリン、3-(2-ベンズイミダゾリル)-7-(ジエチルアミノ)クマリン、3-(2-ベンゾチアゾリル)-7-オクタデシルオキシクマリン、7-オクタデシルオキシ-3-[3-(3-スルホプロピル)-2-ベンゾチアゾリルイオ]クマリン、3-(2-ベンゾチアゾリル)ウンベリフェロン、(2-ベンゾチアゾリル)グアニジン、2,6-ジメトキシ-4-(2-ベンゾチアゾリル)フェノール、2-(2-ベンゾチアゾリル)エタノール、2-(4-アミノフェニル)-6-メチルベンゾチアゾール、2-ベンゾチアゾールスルフィド、2-ベンゾチアゾリルスルホン酸(およびその塩)、3-(2-ベンゾチアゾリルアミノ)-5-ニトロフェノール、3-(2-ベンゾチアゾリル)プロプリオニトリル、4-(6-メチル-2-ベンゾチアゾリル)アセトアニリド、4-(2-ベンゾチアゾリルチオ)酪酸(およびその塩)、4-(6-メチル-2-ベンゾチアゾリル)フェニルイソシアナート、ルシフェリン、エチル(2-ベンゾチアゾリルチオ)ギ酸、N-(2-ベンゾチアゾリル)アセトアセタミド、N-(2-メチル-6-ベンゾチアゾリル)アセトアミド、N-(3-(2-ベンゾチアゾリル)-4-ヒドロキシフェニル)-p-トルエンスルホンアミド、およびN-(6-ニトロ-2-ベンゾチアゾリル)アセトアミドを含み、その多くはAldrich社(ミルウォーキー、WI)から市販されている。
【００３０】
任意に置換されたヘテロ芳香族化合物がカルボキシ基またはスルホニル基により置換されている場合、この基は、塩の形上、例えばナトリウム塩、カリウム塩またはアンモニウム塩であることができる。マトリクスにおいて、塩の陽イオンは、タンパク質由来の正電荷側鎖と置き換えられうる。さらに、タンパク質/ポリペプチド上のアミノ基は、銀などの金属と配位錯体を形成することができる。しかし、これらのアミノ基はまたマトリクスに付加された陰イオン性分子とも反応するため、タンパク質/ポリペプチドが銀イオンに配位する能力は、劇的に変化すると考えられる。しかし、ヘテロ芳香族化合物が銀に結合可能なさらなる基を含む場合には、錯体のキレート特性は保持されると考えられる。タンパク質/ペプチドの正のタンパク質側鎖と、負のスルホン酸塩置換増感剤との間の塩錯体の形成は、特に低分子量タンパク質に関して、感度の点で他の銀染色法に勝る利点をもたらす。
【００３１】
ポリアミノベンゾチアゾールスルホン酸誘導体の多くは、暗色の物質である。これらの材料は、マトリクス中に残った残渣の暗色がバックグラウンドの上昇をもたらすので、銀染色には適していない。従って好ましい態様において、任意に置換されたヘテロ芳香族化合物は、溶液中で黒色または濃暗色ではない。プリムリンおよびチオフラビンSは、典型的には褐色固体である。しかし濃縮溶液中でこれらはオレンジ色であり、希釈した場合は黄色である。
【００３２】
コントラスト増強剤の例とは、硫化ナトリウム、チオ尿素、ジチオスレイトール、テトラチオン酸カリウム、亜ジチオン酸ナトリウム、およびチオ硫酸のナトリウム塩またはカリウム塩である。チオ硫酸ナトリウムは、コントラスト増強剤として作用することが知られている(Wood, H. W.、J. Phot. Sci.、2:154(1954))。マトリクス中の生体高分子に沈着した銀は、硫黄含有化合物の存在下において、より容易に還元される。硫化銀は銀イオンの還元のための触媒として作用すると考えられる。好ましい態様において、コントラスト増強剤は、濃度約0.05％〜0.25％で存在する。
【００３３】
本発明の実践において使用されうる緩衝液の例とは、pKaが約5〜10であるような公知の生物学的緩衝液を含む。Sigma Life Sciences社カタログ2000-2001、962-965ページ参照。好ましい緩衝液は、水性モルホリノエタンスルホン酸、モルホリノプロパンスルホン酸(MOPS)、4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンプロパンスルホン酸(EPPS)、4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)などである。
【００３４】
好ましい増感剤は、約0.1Mモルホリノエタンスルホン酸(MES)、約5mMチオ硫酸ナトリウム、および約0.025％プリムリンを含む。増感剤は、約30％エタノール水溶液を更に含みうる。別の好ましい増感剤は、約0.1M MES、約5mMチオ硫酸ナトリウム五水和物、約0.025g/LチオフラビンS、および約1％ジメチルホルムアミド(DMF)を含む。この試薬を調製するために、チオフラビンSをDMF中に溶解し、かつ不溶性の不純物を除去する。その後この溶液をMESおよびチオ硫酸塩の溶液に添加して、pH6.1まで滴定する。塩が沈殿するが、これは試薬の性能には影響を及ぼさない。あるいは、チオフラビンS、MESおよびチオ硫酸塩は、水に溶解して、DMFを含まない溶液を形成することができる。反応がマイクロ波エネルギーにより加熱される場合には十分作用しないので、この試薬は好ましくない。溶液中にDMFを戻すことにより性能は回復するが、沈殿が起こるようになる。
【００３５】
次に、任意に照射を作動させながら、1種または複数の感光性のまたは還元可能な金属塩を含有する染色液とマトリクスを接触させて、生体高分子を染色するかまたは染色画像を形成する。好ましくは、還元可能な金属塩は、還元電位約0.5ボルト〜約1.9ボルトを有する。このような還元可能な金属塩の例とは、銀塩、金塩、白金塩および/またはイリジウム塩である。銀塩は比較的安価であるので好ましい。最も好ましい還元可能な金属塩は、硝酸銀である。あるいは、例えば硝酸銀および水酸化アンモニウムにより調製された、アンモニア銀錯体を使用することができる。塩の水中濃度は、マトリクスの厚さに(比例的でなく)反比例的に依存する。従って、0.001mmまたはそれ未満の超薄型マトリクスは高濃度の還元可能な金属塩を必要とするが、より厚いマトリクスはより低い濃度を必要とする。米国特許第4,405,720号参照のこと。典型的濃度は、蒸留水中硝酸銀0.1％〜0.2％である。マトリクスは、約10分間〜60分間インキュベーションされるが、約15分間が好ましい。マイクロ波加熱を使用する場合、インキュベーション時間を、照射時間を含めて5分間に短縮することができる。
【００３６】
マトリクス厚が約1mmを上回る場合、またはDNAなどのある種の有機高分子が染色される場合に、光照射を使用することができる。照射は任意の通常の様式でありうり、かつ光化学反応に作用するのに十分でなければならない。赤外線および/または熱による光化学線からの光照射を使用することができる。照射が使用される場合、還元可能な塩による処置の最初の数分間で最大感度を生じることが好ましい。典型的には、1,500ワットタングステン光源と同等の光を発する160ワット蛍光グリッドランプのような、明るく均一な光源を使用することができる。当業者は、慣習的実験の域を出ることなく、所与のマトリクス、タンパク質/ポリペプチド、および核酸分子について最適な光源および照射時間を選択することができる。
【００３７】
次に、マトリクスを水で迅速に濯ぎ、還元可能な遊離金属塩を除去する。銀結合は可逆的であるので、濯ぎの時間は約1分以下に維持されなければならない。
【００３８】
次に、染色画像が現像される。これは、1種または複数の還元剤を含有する現像液とマトリクスとの接触により達成されうる。このような還元剤は、鉄、タングステン、バナジウム、およびモリブデンの金属化合物、ならびにヒドロキノン、ピロガロール、p-フェニレンジアミン、パラホルムアルデヒドおよびホルムアルデヒドを含む有機化合物を含む、写真撮影において使用される任意のものを含む。有機還元剤が好ましい。ホルムアルデヒドまたはパラホルムアルデヒドが還元剤である場合、炭酸ナトリウムまたはメタホウ酸ナトリウムなどのアルカリ化剤をこの溶液へ更に添加することが好ましい。マトリクスが還元剤と接触するまで潜像現像は継続されうるため、このマトリクスを、還元可能な金属塩含有溶液から取除いたらすぐ還元剤に浸漬することができる。
【００３９】
好ましい態様において、pHが11〜12でありかつホルムアルデヒドを含有する塩基性緩衝液に、マトリクスが浸漬される。好ましい緩衝液は、炭酸ナトリウムおよび炭酸カリウムを含む。必要に応じて、または望ましいならば、浸漬を繰り返すことができる。任意にマトリクスを穏やかな攪拌に供することができる。最も好ましい現像液は、2.5％炭酸カリウムおよび0.35％(37質量％)ホルムアミドの水溶液からなる。現像時間は約3分間〜30分間であるが、これはゲル厚、試料負荷の程度およびバックグラウンド染色強度に依存する。当業者は、慣習的実験の域を出ることなく、最適現像時間を決定することができる。
【００４０】
最後に、マトリクスにおける反応は、停止液により停止される。これは、水による洗浄を通じて、ならびに/または現像液のpHを7〜10まで低下させるおよび未還元銀とキレート剤とを錯体形成させることにより達成される。都合がよいことに、緩衝液または酸およびキレート剤を含有する停止液を、直接現像液に添加することができる。使用されうる酸の例とは、酢酸、クエン酸および塩酸の水溶液を含む。キレート剤の例とは、エチレンジアミン四酢酸を含む。緩衝液としても作用する好ましいキレート剤とは、エチレンジアミン四酢酸およびその塩である。好ましい停止液は、0.5Mエチレンジアミン四酢酸三ナトリウム塩、pH8である。典型的には、任意にゆっくり攪拌しながら、マトリクスを停止液に10分間浸漬し、その後蒸留水で洗浄する。当業者は、慣習的実験の域を出ることなく、潜像の現像を停止するのに最適な時間および条件を決定することができる。
【００４１】
染色画像が現像されたら、肉眼による検査、例えば従来の平面式スキャナーによる走査、または撮像カメラなどの任意の従来の検出手段によりこれを検出することができる。例えば米国特許第4,703,016号参照のこと。
【００４２】
本発明はまた、マトリクス中のタンパク質またはペプチドを同定する方法であって、以下の段階を含む方法に関する：
(a)マトリクスを、1種または複数の任意に置換されたヘテロ芳香族化合物を含む増感剤と接触させる段階；
(b)マトリクスを、1種または複数の還元可能な金属塩と接触させ、該タンパク質またはペプチドを染色する段階；
(c)染色されたタンパク質またはペプチドを検出し、これによりタンパク質またはペプチドを検出する段階；
(d)タンパク質またはペプチドに対して切断反応を行い、断片を得る段階；および
(e)該断片に対して質量分析を行い、これによりタンパク質またはペプチドを同定する段階。
【００４３】
本方法を実施する際に、本明細書に説明されたように、タンパク質またはペプチドをまずマトリクスへ固定することができる。好ましい態様において、エタノール、酢酸および水からなる固定化剤とマトリクスとの接触により、タンパク質またはペプチドはマトリクスへ固定される。
【００４４】
染色タンパク質またはペプチドが検出される前に、本明細書記載の、1種または複数の還元剤を含有する現像液により処理することができる。染色画像はその後、本明細書記載の方法のいずれかにより検出されうる。
【００４５】
タンパク質またはペプチドの切断反応を行うために、染色タンパク質またはペプチドをマトリクスから切出すことができ、その後タンパク質またはペプチドをマトリクスから単離する。例えばタンパク質またはペプチドをマトリクスから外科用メスで切出して、容器に入れてもよい。好ましい態様において、フェリシアン化カリウムおよびチオ硫酸ナトリウムの混合水溶液を容器に添加して、実質的に全ての還元銀金属粒子を銀イオンに再酸化し、これらをチオ硫酸に複合させる。タンパク質またはポリペプチドを、水により1回から最大6回までまたはそれ以上抽出することができる。その後抽出物を、トリプシンなどのプロテアーゼを含有する切断試薬で処理することができ、次に断片を質量分析に供して同一性を決定する。Shevenko, A.ら、Anal. Chem.、68:850-858(1996)；Helmannn, V.ら、Anal. Biochem.、224:451-455(1995)；Coligan, J.E.ら、「タンパク質科学最新プロトコール(Current Protocols in Protein Science)」、V.B. Chanda(編集)(1998)；Patterson, S.D.およびAebersold, R.、Electrophoresis、16:1791-1814(1995)；および、Bergmanら、Electrophoresis、21:679-686(2000)を参照のこと。前述したように、本方法は、タンパク質およびポリペプチドの架橋が生じないので、グルタルアルデヒドを使用する従来法の改善となる。さらに増感剤は、グルタルアルデヒドを必要とせずに、タンパク質およびポリペプチドの高感度検出を提供する。
【００４６】
本発明は、新たな種類の増感剤が発見された点で、当技術分野における大きな前進となる。これらの新規物質は、マトリクス中に固定されている生体高分子へ結合し、かつ還元可能な金属塩の生体高分子ゾーンへの局所的結合を増大させる。マトリクスが本明細書記載の還元条件に供された場合にイオンの還元が生じるように、これらの増感剤は、還元可能な金属塩イオンにのみ弱く結合する。
【００４７】
本発明により達成される生体高分子に関する感度の増大は、以下に考察したいくつかの要因から生じると考えられる。第一に、特定の理論に縛られるわけではないが、正電荷側鎖とチオフラビンSのスルホン酸基との電荷-電荷引力、およびおそらくは芳香族ベンゾチアゾール環とタンパク質構造の疎水領域との相互作用が、マトリクス中のタンパク質への増感剤の結合を可能にすると考えられる。さらに、ベンゾチアゾール環構造の硫黄原子および窒素原子は、その後希ホルムアルデヒド溶液によりpH＞10で効率的に銀金属に還元され得る、銀(+1)イオンとの弱い配位錯体を形成できると考えられる。核酸については、この機構は、ベンゾチアゾール環構造の平面芳香核が2個の隣接ピリミジン塩基またはプリン塩基の間に並べられて、πスタッキング相互作用により安定化される複合体を形成するような介在作用である可能性がより高いと考えられる。ベンゾチアゾール環系の硫黄および/または窒素を介して銀結合が再度生じて、pH10を上回るアルカリ培地中でホルムアルデヒドにより還元されるのに十分な弱さで結合する。
【００４８】
本発明はまた、生体高分子を検出するためのキットであり、以下からなる群より選択される1種または複数の構成要素を含むキットに関する：
(a)1種または複数の任意に置換されたヘテロ芳香族化合物を含有する増感剤；
(b)1種または複数の還元可能な金属塩；
(c)還元剤を含有する1種または複数の現像液；
(d)還元可能な金属塩の更なる還元を防止する1種または複数の停止液；
(e)1種または複数の緩衝液；
(f)1種または複数の固定化剤；
(g)1種または複数の切断試薬；
(h)1種または複数の生体高分子；
(i)1種または複数のマトリクス；および
(j)pH変化に対し感受性のある1種または複数の指示薬。
【００４９】
本キットは一般に、カートン、箱、チューブなどであり、かつ1個または複数の容器を含み、その各々が、上記で列挙された1種または複数の構成要素を含む。このような容器は、箱、瓶、広口瓶、チューブ、アンプルなどを含む。
【００５０】
生体高分子を、例えば標準または対照として使用するために、キットの中に含めることができる。
【００５１】
キットに含まれうるマトリクスの例とは、ポリアクリルアミドゲル、アガロース、紙、酢酸セルロース、またはニトロセルロースを含む。
【００５２】
キットに含まれうる指示薬の例とは、フェノールフタレインおよびチモールフタレインである。
【００５３】
本発明はまた、本発明の方法を実行するための組成物および本発明の実施の際に形成される組成物に関する。このような組成物は、以下からなる群より選択される、1種または複数の構成要素を含むことができる：
(a)1種または複数の任意に置換されたヘテロ芳香族化合物を含有する増感剤；
(b)1種または複数の還元可能な金属塩；
(c)還元剤を含有する1種または複数の現像液；
(d)還元可能な金属塩の更なる還元を防止する1種または複数の停止液；
(e)1種または複数の緩衝液；
(f)1種または複数の固定化剤；
(g)1種または複数の切断試薬；
(h)1種または複数の生体高分子；
(i)1種または複数のマトリクス；および
(j)pH変化に対し感受性のある1種または複数の指示薬。
【００５４】
本発明はまた、本発明の実践により得られた組成物に関する。このような組成物は、得られる様々な反応混合液、ならびに切断試薬により得られる切断タンパク質および切断ペプチドを含むが、これらに限定されるわけではない。
【００５５】
下記実施例は、本発明の方法および組成物を例証しているが、限定を意図したものではない。当技術分野において通常起こりうりかつ当業者に明らかである、様々な条件およびパラメータに対するその他の好適な修飾および適合荷は、本発明の精神および範囲内であると考えられる。
【００５６】
実施例
実施例1
基本的染色法
下記実施例においては、製剤は下記のような構成であった。全ての溶液を、w/超純水で作製した。
増感剤：1M モルホリノエタンスルホン酸
50mM チオ硫酸ナトリウム五水和物
0.25g/L チオフラビンS
10％ ジメチルホルムアミド
染色剤：20％ 硝酸銀
現像剤：15％ 炭酸カリウム
0.075％ チオ硫酸ナトリウム五水和物
0.002％ フェノールフタレイン
現像促進剤：37％ ホルムアルデヒド
停止液：0.5M エチレンジアミン四酢酸
1.5M トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン
脱色剤A：30mM フェリシアン化カリウム
脱色剤B：100mM チオ硫酸ナトリウム五水和物
【００５７】
基本的染色プロトコール
開始前に、染色用の下記溶液を調製する。
*増感液
エタノール 30ml
増感剤 10ml
総量100mlとなるまで超純水を加える
*染色液
染色剤 1ml
総量100mlとなるまで超純水を加える
*現像液
現像剤 10ml
現像促進剤 1滴
総量100mlとなるまで超純水を加える
【００５８】
溶液は、染色プロトコール開始直前、または次段階に進む度に調製されうる。
【００５９】
手順
本手順は、8×8cm NuPAGE(登録商標)Bis-Tris、Tris-酢酸、TBE、またはTris-グリシンミニ-ゲル（厚さ1.0mm）の使用に向けたものである。2個のミニゲル（厚さ1.0mm）または1個の大きい(18×18cm)ゲルを1回で染色する場合、全ての溶液の容量を2倍にしなめればならないが、インキュベーション時間は同じままである。ゲルの寸法が上記と同じでなくとも、染色プロトコールを最適化することができる。
【００６０】
全てのインキュベーションは、室温において約1回転/秒の速度で回転する回転振盪機上で行うこととする。ゲル1個あたり溶液100mlとする。
1. 電気泳動後、カセットからゲルを取り出し、適当なサイズの清潔な染色トレイ中に置く。任意で、ゲルを超純水で2回濯いでもよい。
2. 固定液100ml中で60分間、ゲルをゆっくり回転させながら固定する。(注意：染色プロトコールを完了するのに十分な時間がない場合は、ゲルを固定液中で一晩保存することができる。)
3. 固定液をデカントし、ゲルを30％エタノール100ml中で10分間洗浄する。
4. 染色容器内の洗浄したゲルに、増感液100mlを添加する。ゲルを増感液中で10分間インキュベーションする。
5. ゲルを30％エタノール100ml中で10分間洗浄する。
6. 増感液をデカントし、ゲルを超純水100ml中で10分間洗浄する。
7. ゲルを染色液100ml中に15分間入れる。
8. 染色が完了した後、染色液をデカントして、超純水100mlで1分間ゲルを洗浄する。
注意：ゲルの洗浄が1分を上回ると、ゲルから銀イオンが除去されて感度の減少につながると考えられる。
9. バンドが出現し始めるまでの5分間〜8分間、ゲルを現像液100ml中でインキュベーションする。
10. 所望のバンド強度が達成されたらすぐに、現像液に浸漬されたままのゲルに停止液10mlを直接添加する。ゲルを10分間ゆるやかに攪拌する。色がピンク色から無色へ変化するが、これは現像が停止したことを示している。
11. 停止液をデカントし、かつゲルを超純水100mlで10分間洗浄する。
【００６１】
質量分析のためにゲルを脱色する場合は、実施例3を参照のこと。
【００６２】
実施例2
高速染色法
概論
高速染色プロトコールは、基本的染色プロトコールの変法である。本方法では、タンパク質ゲルを迅速に銀染色するために電子レンジを使用する。この染色プロトコールは、1時間未満で完了されうる。
必要な材料
*超純水
*電子レンジ用染色トレイ
*電子レンジ
*回転振盪機
*テフロンコーティングされた攪拌子
*使い捨て10mlピペット
*試薬調製用の清潔なガラス瓶
*目盛り付きガラスシリンダー
*30％エタノール(超純水で調製)
*100％エタノール
*固定液(40％エタノール、10％酢酸、超純水で調製)
【００６３】
開始前
下記の染色用溶液を調製する。
*増感液
エタノール 30ml
増感剤 10ml
総量100mlとなるまで超純水を加える
*染色液
染色剤 1ml
総量100mlとなるまで超純水を加える
*現像液
現像剤 10ml
現像促進剤 1滴
総量100mlとなるまで超純水を加える
注意：全ての溶液は、染色プロトコール開始直前に調製されうるか、または次段階に進む度に調製されうる。
【００６４】
手順
厚さ1.0mmの、8×8cm NuPAGE(登録商標)ゲルの使用に向けたものである。ゲル1個あたり溶液100mlが必要であることを確認されたい。(注意：使用するゲル寸法が上記のものと同じでない場合は、染色プロトコールを最適化することができる。)
1. 電気泳動後、ゲルをカセットから取り外し、適当な大きさの清潔な電子レンジ用染色トレイに入れる。ゲルを超純水で2回濯ぐ。
2. ゲルを固定液100ml中に入れ、高出力で30秒間電子レンジにかける。電子レンジからゲルを取り出し、室温で5分間ゆっくり攪拌する。固定液をデカントする。
3. ゲルを高出力で30秒間電子レンジにかけながら、30％エタノール100mlで洗浄する。電子レンジからゲルを取り出し、回転振盪機上で5分間、室温でゆっくり攪拌する。
4. 増感液100mlを、洗浄したゲルに添加する。ゲルを、高出力で30秒間電子レンジにかける。電子レンジからゲルを取り出し、回転振盪機上で2分間、室温でゆっくり攪拌する。増感液をデカントする。
5. ゲルを超純水100mlで2回洗浄する。高出力で30秒間電子レンジにかける。電子レンジからゲルを取り出し、室温で2分間ゆっくり攪拌する。水をデカントする。
6. 染色液100ml中にゲルを入れる。高出力で30秒間電子レンジにかける。電子レンジからゲルを取り出し、室温で5分間ゆっくり攪拌する。
7. 染色液をデカントし、ゲルを超純水100mlで1分間洗浄する。
8. ゲルを現像液100ml中に入れ、回転浸透機上でゆるやかに攪拌しながら5分間インキュベーションする。(電子レンジにはかけない。)
9. 所望のバンド強度が達成されたらすぐ、現像液に浸漬されたままのゲルに停止液10mlを直接添加して、ゲルを10分間ゆるやかに攪拌する。色がピンク色から無色に変化するが、これは現像が停止したことを示している。
10. ゲルを超純水100mlで10分間洗浄する。
11. 質量分析のためにゲルを脱色しなければならない場合は、実施例3を参照のこと。
【００６５】
実施例3
質量分析のための脱色法
質量分析のために試料を調製する場合、ゲル内でトリプシン消化を行う前に、タンパク質バンドから銀イオンを除去することが重要である(Gharahdaghiら、Electrophoresis、20:601-605(1999))。効率的に銀イオンをゲルから取除く脱色プロトコールを以下で説明する。
必要な材料：
清潔な外科用メス
1.5ml滅菌微量遠心管
超純水
微量遠心機
【００６６】
手順
NuPAGE(登録商標)Bis Tris、Tris-グリシン、またはTris-酢酸の8x8ミニ-ゲル（厚さ1.0mm）の使用に向けたものである。
1. ゲルの銀染色後、超純水でゲルを完全に洗浄する。
2. 清潔な外科用メスを用いて関心対象のバンドを慎重に切出し、1.5mlの滅菌微量遠心管に入れる。ゲルのブランク領域から同じ大きさの別のゲル片を切出し、別の滅菌微量遠心管に入れる。これは後で、トリプシン消化の対照として使用されることになる。
3. 脱色液A 50μlおよび脱色液B 50μlを、各微量遠心管に入れる。
注意：多数のゲルバンドを脱色する場合には、脱色液Aおよび脱色液Bの混合により必要量の脱色液を調製し、直ちに使用されたい。脱色液Aおよび脱色液Bは、一旦混合されたら長期保存することができない。
1. チューブの内容物を完全に混合し、室温で15分間インキュベーションする。
2. 清潔なピペットチップを用い、上清を慎重に除去する。
3. 超純水200μlをチューブに添加し、完全に混合する。室温で10分間インキュベーションする。
【００６７】
段階5〜段階6を少なくとも2回繰り返す。トリプシン消化および質量分析機による分析を進める。
【００６８】
本発明を十分に説明したことで、当業者は、広範かつ同等の範囲内の条件、製剤およびその他のパラメータにより、本発明の範囲またはどの態様にも影響を及ぼすことなく、同様のことを実施できることが理解されると考えられる。本明細書において引用された全ての特許、特許出願および刊行物は、その全体が本明細書に参照として完全に組入れられている。
Claims (40)
- マトリクス中の生体高分子を検出する方法であり、以下の段階を含む方法：
(a)マトリクスを、1種または複数の任意に置換されたヘテロ芳香族化合物を含有する増感剤と接触させる段階；
(b)マトリクスを、1種または複数の還元可能な金属塩と接触させ、該生体高分子を染色する段階；および
(c)染色された生体高分子を検出する段階。 - マトリクスが、ポリアクリルアミドゲル、アガロース、紙、酢酸セルロース、またはニトロセルロースである、請求項1記載の方法。
- 有機酸および1個〜4個の炭素原子を含む低級アルコールの水溶液を含有する固定化剤によるマトリクスの処理により、生体高分子がマトリクスに固定される、請求項1記載の方法。
- 低級アルコールが、メタノール、エタノール、プロパノール、またはイソプロパノールである、請求項3記載の方法。
- 有機酸が、酢酸、クエン酸、スルホサリチル酸またはトリクロロ酢酸である、請求項3記載の方法。
- 固定化剤が、約40容量％エタノール、約10容量％酢酸、および約50容量％蒸留水からなる、請求項3記載の方法。
- 置換されたヘテロ芳香族化合物が、水溶性を付与する基により置換される、請求項1記載の方法。
- 任意に置換されたヘテロ芳香族化合物が、プリムリン、チオフラビンS、または2-(4-アミノフェニル)-6-メチル-7-スルホベンゾチアゾールである、請求項1記載の方法。
- マトリクスを、1種または複数のコントラスト増強剤および1種または複数の緩衝液と共に、増感剤と接触させる段階を更に含む、請求項1記載の方法。
- コントラスト増強剤が、硫化ナトリウム、チオ尿素、ジチオスレイトール、テトラチオン酸カリウム、亜ジチオン酸ナトリウム、および、チオ硫酸のナトリウム塩またはカリウム塩からなる群より選択される、請求項9記載の方法。
- 1種または複数の緩衝液が、pKa5〜10を有する、請求項9記載の方法。
- 1種または複数の緩衝液が水性モルホリノエタンスルホン酸である、請求項9記載の方法。
- 1種または複数の還元可能な金属塩が硝酸銀である、請求項1記載の方法。
- 染色された生体高分子が、マトリクスを1種または複数の還元剤と接触させることによる検出段階の前に現像される、請求項1記載の方法。
- 1種または複数の還元剤がホルムアルデヒドである、請求項14記載の方法。
- 染色された生体高分子が可視的に検出される、請求項1記載の方法。
- 染色された生体高分子が、電子スキャナーによる画像走査により検出される、請求項1記載の方法。
- 染色された生体高分子が撮像カメラにより検出される、請求項1記載の方法。
- マトリクスが、少なくとも1種の増感剤および1種または複数の還元可能な金属塩と接触した際に加熱される、請求項1記載の方法。
- 加熱がマイクロ波エネルギーにより行われる、請求項19記載の方法。
- 生体高分子がタンパク質である、請求項1記載の方法。
- 生体高分子がペプチドである、請求項1記載の方法。
- 生体高分子が核酸分子である、請求項1記載の方法。
- ポリアクリルアミドゲル中のタンパク質/ペプチドまたは核酸分子を検出する方法であり、以下の段階を含む方法：
(a)タンパク質/ペプチドまたは核酸分子をポリアクリルアミドゲルに固定する段階；
(b)ポリアクリルアミドゲルを、プリムリン、チオフラビンS、または2-(4-アミノフェニル)-6-メチル-7-スルホベンゾチアゾールを含有する増感剤と接触させる段階；
(c)ポリアクリルアミドゲルを銀塩水溶液と接触させ、タンパク質/ペプチドまたは核酸分子を染色する段階；
(d)染色されたタンパク質/ペプチドまたは核酸分子を現像する段階；および
(e)染色されたタンパク質/ペプチドまたは核酸分子を検出する段階。 - 約40容量％エタノール、約10容量％酢酸、および約50容量％蒸留水からなる固定化剤と、ポリアクリルアミドゲルとの接触により、タンパク質/ペプチドまたは核酸分子がポリアクリルアミドゲルに固定される、請求項24記載の方法。
- 増感剤が、水性モルホリノエタンスルホン酸、ならびに、硫化ナトリウム、チオ尿素、ジチオスレイトール、テトラチオン酸カリウム、亜ジチオン酸ナトリウム、およびチオ硫酸のナトリウム塩またはカリウム塩からなる群より選択される1種または複数のコントラスト増強剤を更に含む、請求項24記載の方法。
- ポリアクリルアミドゲルと水性ホルムアルデヒドとの接触により、染色されたタンパク質/ペプチドまたは核酸分子が現像される、請求項24記載の方法。
- マトリクス中のタンパク質またはペプチドを同定する方法であり、以下の段階を含む方法：
(a)マトリクスを、1種または複数の任意に置換されたヘテロ芳香族化合物を含む増感剤と接触させる段階；
(b)マトリクスを、1種または複数の還元可能な金属塩と接触させ、該タンパク質またはペプチドを染色する段階；
(c)染色されたタンパク質またはペプチドを検出する段階；
(d)タンパク質またはペプチドに対して切断反応を行い、断片を得る段階；および
(e)該断片に対し質量分析を行い、これによりタンパク質またはペプチドを同定する段階。 - 生体高分子の検出用キットであり、以下からなる群より選択される1種または複数の構成要素を含むキット：
(a)1種または複数の任意に置換されたヘテロ芳香族化合物を含有する増感剤；
(b)1種または複数の還元可能な金属塩；
(c)還元剤を含有する1種または複数の現像液；
(d)還元可能な金属塩の更なる還元を防止する1種または複数の停止液；
(e)1種または複数のコントラスト増強剤；
(f)1種または複数の緩衝液；
(g)1種または複数の固定化剤；
(h)1種または複数の切断試薬；
(i)1種または複数の生体高分子；
(j)1種または複数のマトリクス；および
(k)pH変化に対し感受性のある1種または複数の指示薬。 - 以下からなる群より選択される1種または複数の構成要素を含む、組成物：
(a)1種または複数の任意に置換されたヘテロ芳香族化合物を含有する増感剤；
(b)1種または複数の還元可能な金属塩；
(c)還元剤を含有する1種または複数の現像液；
(d)還元可能な金属塩の更なる還元を防止する1種または複数の停止液；
(e)1種または複数のコントラスト増強剤；
(f)1種または複数の緩衝液；
(g)1種または複数の固定化剤；
(h)1種または複数の切断試薬；
(i)1種または複数の生体高分子；
(j)1種または複数のマトリクス；および
(k)pH変化に対し感受性のある1種または複数の指示薬。 - 1種または複数の指示薬が、フェノールフタレインまたはチモールフタレインである、請求項30記載の組成物。
- 1種または複数の固定化剤が、有機酸および1個〜4個の炭素原子を含む低級アルコールの水溶液を含有する、請求項30記載の組成物。
- 低級アルコールが、メタノール、エタノール、プロパノール、またはイソプロパノールである、請求項32記載の組成物。
- 有機酸が、酢酸、クエン酸、スルホサリチル酸、またはトリクロロ酢酸である、請求項32記載の組成物。
- 1種または複数の固定化剤が、約40容量％エタノール、約10容量％酢酸、および約50容量％蒸留水からなる群より選択される、請求項30記載の組成物。
- 任意に置換されたヘテロ芳香族化合物が、プリムリン、チオフラビンS、または2-(4-アミノフェニル)-6-メチル-7-スルホベンゾチアゾールである、請求項30記載の組成物。
- 1種または複数のコントラスト増強剤が、硫化ナトリウム、チオ尿素、ジチオスレイトール、テトラチオン酸カリウム、亜ジチオン酸ナトリウム、およびチオ硫酸のナトリウム塩またはカリウム塩からなる群より選択される、請求項30記載の組成物。
- 1種または複数の緩衝液がpKa5〜10を有する、請求項30記載の組成物。
- 1種または複数の緩衝液が、モルホリノエタンスルホン酸、4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンプロパンスルホン酸(EPPS)、または4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)である、請求項30記載の組成物。
- 1種または複数の還元可能な金属塩が硝酸銀である、請求項30記載の組成物。
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