KR100229598B1 - 고민감도의 은염색 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 미량의 DNA를 검출하기 위해 사용되는 종래의 은염색(silver staining)방법을 개량하여 그 검출 민감도를 획기적으로 향상시킨 고민감도의 은염색방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 DNA에 직접 은 이온을 결합시키는 종래의 은염색 방법과는 달리, DNA와의 결합력을 갖는 폴리머를 DNA에 일차적으로 결합시킨 다음, 그 폴리머에 다량의 은 이온을 결합시킴으로써, DNA의 검출 민감도를 향상시킨 개량된 은염색 방법에 관한 것이다. 본 발명의 은염색 방법은 DNA 검출에 대한 민감도를 매우 향상시켜, 검출 민감도가 가장 높은 것으로 보고된 종래 바삼(Bassam) 등의 방법(참조: Bassam, B. J. et al., Anal. Biochem., 196: 80(1991)이 ㎍단위의 미량 DNA를 검출하는데 반하여, ng 단위의 미량 DNA를 검출할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 미량 DNA의 염기서열 결정이나 그의 검출에 매우 효과적으로 이용될 수 있다.

Description

고민감도의 은염색(silver staining) 방법
본 발명은 미량의 DNA를 검출하기 위해 사용되는 종래의 은염색(silver staining) 방법을 개량하여 그 검출 민감도를 획기적으로 향상시킨 고민감도의 은염색방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 DNA에 직접 은 이온을 결합시키는 종래의 은염색 방법과는 달리, DNA와의 결합력을 갖는 폴리머를 DNA에 일차적으로 결합시킨 다음, 그 폴리머에 다량의 은 이온을 결합시킴으로써, DNA의 검출 민감도를 향상시킨 개량된 은염색 방법에 관한 것이다.
일반적으로, 은염색법은 검출하고자 하는 표적물질에 결합한 은 이온을 화학약품이나 빛을 이용하여 선택적으로 환원시키고(참조: Beidler, J. L. et al., Anal. Biochem., 126:374(1982):Goldman, D. and Merril, C. R., Electrophoresis, 3:24(1982)), 이때 형성된 은 입자(silver grains)의 빛의 산란에 의해 나타나는 색깔을 감지하는 방법이다(참조: Merril, C. R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85:453(1988)). 현재 사용되고 있는 다양한 은염색법은 강 알카리 조건에 형성된 질산은 (silver nitrate)의 디아민(diamine) 복합체를 포름알데히드를 포함하는 약산 용액에서 환원시키는 염기성 방법 및 질산은을 포름알데히드를 포함하는 염기성 용액에서 환원시키는 산성 방법으로 크게 분류할 수 있다(참조: Bassam, B. J. et al., Applied Biochemistry and Biotechnology, 42:181 (1993)).
은염색법은 처음에는 아크릴아마이드 겔 전기영동후 미량의 단백질을 검출하기 위해 개발되었으나(참조:Switzer, R. C. et al., Anal. Biochem., 98:231(1979)), 차츰 개량과 변형을 거듭하면서 보다 다양한 방법들이 개발되어, 단백질 뿐만 아니라 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide)(참조: Tsai, C. and Frasch, C. E., Anal. Biochem., 119:115(1982)) 및 핵산(참조: Somervile, L. L. and Wang, K., Biochem. Biophys. Res. Commun.,102:54(1981))을 검출하는 방법으로 폭넓게 사용되고 있다.
현재까지, DNA 검출을 위한 은염색법은 디아민 복합체 은염색법(참조: Wary, W. et al., Anal. Biochem., 118:197(1981)), 산성 음연색법(참조: Heukeshoven, J. and Dernick, R., Electrophoresis, 6:103(1985); Gottlieb, M. and Chavco, K., Anal. Biochem., 165:33(1987); Bassam, B. J. et al., Anal. Biochem., 196:80(1991)) 및 구리(II)-은 (cupric-silver) 염색법(참조: Switzer, R. C. et al., Anal. Biochem., 98:231(1979))등 다양한 방법들이 개발되어 사용되고 있다. 그러나, 이들 은염색법은 아직까지 ng단위의 미량 DNA를 검출할 수 없고, 설령 검출가능하다 하더라도 정확성 및 재현성에 있어서의 신뢰도를 제공할 수준이 되지 못하여, 그의 사용이 제한되어 있는 실정이다.
이에, 본 발명자들은 전술한 DNA 검출용 은염색 방법 중에서 간편하면서도 검출 민감도가 가장 높은 것으로 보고된 바삼(Bassam) 등의 방법을 기본으로 하여(참조: Bassam, B. J. et al., Anal. Biochem., 196:80(1991)), DNA에 대한 결합력이 큰 폴리머를 DNA에 먼저 결합시킨 다음, 다량의 은 이온을 그 폴리머에 결합시킴으로써, 은 이온을 DNA에 직접 결합시키는 종래의 은염색 방법에 비해 검출 민감도가 크게 향상됨을 발견하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 목적은 미량의 DNA 검출에 대한 민감도를 획기적으로 향상시킨 은염색 방법을 제공하는 것이다.
제1a도는 바삼(Bassam) 등의 종래방법으로 은염색된 니트로셀룰로스 막의사진이다.
제1b도는 폴리아크릴산의 처리과정을 거친 본 발명의 방법으로 은염색된 니트로셀룰로스 막의 사진이다.
제2a도는 바삼(Bassam) 등의 종래방법으로 은염색된 니트로셀룰로스 막의사진이다.
제2b도 내지 제2e도는 폴리아크릴산을 0.05%,0.1%0.2%,0.4% 처리한 본 발명의 방법으로 은염색된 각 니트로셀룰로스 막의 사진이다.
제3a도는 바삼(Bassam) 등의 종래방법으로 은염색된 염기서열 분석용 아크릴아미드 겔의 전기영동 사진이다.
제3b도는 0.2% 폴리아크릴산을 처리한 본 발명의 방법으로 은염색된 염기서열 분석용 아크릴아미드 겔의 전기영동 사진이다.
이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.
본 발명은 간편하면서도 검출 민감도가 가장 높은 것으로 알려진 바삼(Bassam) 등의 DNA 검출용 은염색 방법(참조: Bassam, B. J. et al., Anal. Biochem., 196:80(1991)을 개량하여, DNA와의 결합력을 갖는 폴리며, 바람직하게는 폴리아크릴산(polyacrylic acid) 또는 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine)에 DNA 함유의 젤을 침지시켜, DNA에 전기 폴리머를 먼저 결합시킨 다음, 바삼(Bassam) 등의 방법에 따라 다량의 은 이온을 그 폴리머에 결합시키고, 은의 발색을 유도하였다. 그 결과, DNA를 니트로셀룰로스 막에 직경 5㎜의 원형으로 농도별로 점적한 경우, 상기 폴리머의 처리과정을 도입한 본 발명의 은염색 방법은 DNA 검출에 대한 민감도를 매우 향상시켜, 종래 바삼(Bassam) 등의 방법이 ㎍단위의 미량 DNA를 검출하는데 반하여, ng단위의 미량 DNA를 검출할 수 있음을 확인하였다.
상기 본 발명의 은염색 방법에 적합한 폴리머의 농도는 사용되는 폴리머의 종류에 따라 상이할 것이며, 폴리아크릴산의 경우에는 0.2% 내지 0.4%이었다.
아울러, 본 발명의 방법은 미량 DNA의 염기서열 결정이나 그의 검출에 매우 효과적으로 이용된다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
[실시예 1] 폴리아크릴산에 의한 은염색 감도 증가 효과
폴리아크릴산이 DNA의 은염색 정도에 미치는 효과를 조사하기 위하여, 일정농도로 희석한 λ DNA를 니트로셀룰로스 막에 직경 5㎜의 원형으로 점적하여, 65℃ 오븐에서 1시간 건조시키고, 그 니트로셀룰로스 막을 0.2% 폴리아크릴산에 10분간 1차로 먼저 담가 둔 다음, 바삼(Bassam) 등의 방법(참조: Bassam, B. J. et al., Anal. Biochem., 196:80(1991)으로 은염색을 수행하였다. 즉, 폴리아크릴산이 처리된 전기니트로셀룰로스 막을 은수용액(1g/L 질산은 용액 및 1.5ml/L 포름알데히드로 구성된 용액)에 20분간 침지시켜 은 이온을 폴리아크릴산에 결합시키고, 이어 증류수에 5초간 담구어 결합하지 않은 은 이온을 제거한 다음, 현색제(developer) 수용액(30g/L 탄산나트륨, 3ml/L 포름알데히드 및 2mg/L 티오황산나트륨으로 구성된 용액)에 담구어 색깔이 나타날 때 7.5% 아세트산을 가해 발색반응을 정지시켰다. 이때, 대조구는 폴리아크릴산의 처리과정이 없는 바삼(Bassam) 등의 종래방법으로 은염색시킨 DNA를 사용하였다.
제1a도는 간편성과 검출 민감도 측면에서 지금까지 가장 우수한 것으로 보고된 바삼(Bassam) 등의 방법으로 은염색된 니트로셀룰로스 막의 사진이고, 제1b도는 폴리아크릴산의 처리과정을 거친 상술한 본 발명의 방법으로 은염색된 니트로셀룰로스 막의 사진이다.
제1a 및 1b도에서, 제1내지 9레인은 1㎍, 500ng, 250ng, 125ng, 60ng, 40ng, 12ng, 1ng, 100pg의 λ DNA를 사용한 경우를 각각 나타낸다. 제1a 및 1b도에서 보듯이, 종래 방법의 경우는 1㎍, 폴리아크릴산을 사용한 본 발명의 경우는 1ng까지 DNA를 검출할 수 있음을 알 수 있었다. 따라서, 폴리아크릴산의 처리과정을 도입한 본 발명의 은염색 방법은 DNA 검출에 대한 민감도를 매우 향상시킴을 확인하였다.
[실시예 2] 폴리아크릴산의 농도에 따른 은염색 감도의 변화
은염색에 대한 폴리아크릴산의 최적 농도를 조사하기 위하여, 0.05%, 0.1%, 0.2%, 0.4%의 각 폴리아크릴산을 사용하여 실시예1과 동일한 방법으로 은염색하였다(참조: 제2a, 2b, 2c, 2c 및 2e도). 제2a도는 바삼(Bassam) 등의 종래방법으로 은염색된 니트로셀룰로스 막의 사진이고, 제2b도 내지 제2e도는 폴리아크릴산을 0.05%, 0.1%, 0.2%, 0.4% 처리한 본 발명의 방법으로 은염색된 각 니트로셀룰로스 막의 사진이다.
제2a도 내지 제2e도에서, 제1내지 9레인은 1㎍, 500ng, 250ng, 125ng, 60ng, 40ng, 12ng, 1ng, 100pgdml λ DNA를 사용한 경우를 각각 나타낸다. 제2a도 내지 제2e도에서 보듯이, 폴리아크릴산의 농도가 증가함에 따라 DNA의 검출 민감도가 증가하지만, 0.4% 이상의 폴리아크릴산 농도에서는 배경(background)의 염색도가 증가하는 현상이 나타남을 알 수 있었다. 따라서, 본 발명의 은염색 방법에 요구되는 폴리아크릴산의 최적농도는 0.2%임을 확인하였다.
[실시예 3] 폴리아크릴산을 이용한 DNA 염기서열 분석용 아크릴아미드 겔의 은염색
DNA 염기서열 분석용 아크릴아미드 겔에 대한 폴리아크릴산의 은염색 감도 증가 효과를 확인하기 위하여, 200ng, 100ng, 20ng 및 10ng의 각 주형 DNA를 사용하여 염기서열 결정 반응을 수행한 다음, 6%의 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동하고 실시예 1과 동일한 방법으로 폴리아크릴산을 사용하여 은염색하였다.
상기에서, 염기서열 결정 반응은 TopTMDNA Sequencing Kit((주)바이오니아, 대한민국)를 사용하여 하기와 같이 수행하였다. 우선, 상기 각 농도의 주형 DNA(497bp PCR 산물(polymerase chain reaction product)), 30pmoles의 프라이머(5,-GTTTTGGCTTCCAGTTCCACC-3,)및 증류수를 혼합하여 총 40μl의 용액으로 제조한 다음, TopTMDNA 중합효소((주)바이오니아, 대한민국) 및 완충용액(2mM MgCl2를 함유한 50mM Tris-HCl(pH 8.3))을 포함하고 있는 G(20μM ddGTP/6μMdNTP), A(170μM ddATP/6μM dNTP), T(300μM ddTTP/6μM dNTP), C(200μM ddCTP/6μM dNTP) 4개의 반응용기에 10μl씩 분주하였다. 이어, 94℃에서 5분간 미리 변성(pre-denaturation)시키고, 변성(denaturation, 94℃에서 30초), 결합(annealing, 55℃에서 30초) 및 연장(extension, 72℃에서 1분)을 총 40회 진행시키는 PCR을 수행하였다. PCR이 종결되면, 4μl의 반응정지용액(98% 포름아마이드, 10mM EDTA, 0.025% 크실렌 시아놀(xylene cyanol) 및 0.025% 브로모페놀 블루(bromophenol blue)로 구성된 용액)을 가해 95℃에서 5분간 가열하고, 6% 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동하였다.
제3a도는 바삼(Bassam) 등의 종래방법으로 은염색된 염기서열 분석용 아크릴아미드 겔의 전기영동 사진이고, 제3b도는 0.2% 폴리아크릴산을 처리한 본 발명의 방법으로 은염색된 염기서열 분석용 아크릴아미드 겔의 전기영동 사진이다. 제3a 및 3b도에서, 제1내지 4레인은 200ng, 100ng, 20ng, 10ng의 497bp PCR 산물을 주형 DNA로 각기 사용한 경우를 나타낸다.
제3a 및 3b도에서 보듯이, 종래 방법의 경우는 100ng의 주형 DNA, 폴리아크릴산을 사용한 본 발명의 경우는 10ng의 주형 DNA를 사용한 경우까지 DNA 밴드를 뚜렷이 확인할 수 있었다. 따라서, 폴리아크릴산의 처리과정을 도입한 본 발명의 은염색 방법은 DNA 염기서열 결정에도 유효하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명의 은염색 방법은 DNA 검출에 대한 민감도를 매우 향상시켜, 종래 바삼(Bassam) 등의 방법이 ㎍단위의 미량 DNA를 검출하는데 반하여, ng 단위의 미량 DNA를 검출할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 미량 DNA의 염기서열 결정이나 그의 검출에 매우 효과적으로 이용될 수 있다.

Claims (1)

  1. DNA에 대한 결합력을 갖는 폴리아크릴산 (polyacrylic acid)또는 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine)에 DNA 함유의 젤 (gel)을 침지시켜, DNA에 전기 폴리머를 먼저 결합시킨 다음, 은 이온을 그 폴리머에 결합 시킴으로써, DNA의 검출 민감도를 향상시킨 고민감도의 은염색(silive rstaining)방법.
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