【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、腫瘍学の領域及び改良された化学療法の処方に関する。
【０００２】
【従来の技術】
タキソール（Ｔａｘｏｌ（商標））（パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ））は、生体内で優れた抗腫瘍活性を有することが示されている。タキソールは、乳癌、卵巣癌及び肺癌を含む種々の癌の治療に使用されている。
【０００３】
癌の治療におけるドキソルビシン（ＤＯＸ）即ちアントラサイクリンの臨床上の使用は、特に累積の投与量が約５００ｍｇ／ｍ２を超えたとき、慢性の心筋障害及びうっ血性心不全の発生の可能性により制限される。ＤＯＸとパクリタキセル（ＰＴＸ）とを併用すると、約５００ｍｇ／ｍ２より少ないアントラサイクリンの累積投与量で心臓性の外傷が許容できない発生率で生ずることを示している。心臓毒性のこれらの増加のために、ＤＯＸの累積投与量は、アントラサイクリンがＰＴＸとの併用で投与されるとき、約３６０ｍｇ／ｍ２に低下されなければならない。また、ドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ（ＤＣＴ））との併用療法がＤＯＸの心臓毒性を増大させないことを示す報告がある。しかし、これらの研究において注目すべきことは、非常にわずかな患者が約３６０−４００ｍｇ／ｍ２より多いＤＯＸの累積投与量にさらされている。
【０００４】
ＤＯＸの側鎖のカルボニル基の２個の電子の還元が、アントラサイクリンをドキソルビシノール（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎｏｌ（ＤＯＸｏｌ））と呼ばれるジヒドロキシ（二価アルコール）代謝物に転換する。この反応は、サイトゾル中に存在するＮＡＤＰＨオキシドレダクターゼにより触媒化される。ＤＯＸｏｌが心臓毒性の重要なメディエータであるかもしれないという証拠が増えてきている。ＤＯＸのテトラサイクリン環中のキノン部分の１個の電子の還元が、酸素を還元してフリーラジカルにすることにより、酸化して元のアントラサイクリンを再発生させるセミキノンを生じさせる。この反応は、ミクロソームＮＡＤＰＨチトクロームＰ−４５０レダクターゼ及びミトコンドリアＮＡＤＨデヒドロゲナーゼを含む数種のレダクターゼにより触媒化される。アントラサイクリン誘発心臓毒性のフリーラジカルの役割は論議をよんでいるが、これらの種は、ＤＯＸｏｌの同時形成により相乗化されるとき、さらに明確な役割を果たすものと思われる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
腫瘍学の領域で経験する人々が理解するように、改良された有効性及び安全性を有する併用化学療法の処方が必要とされる。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明によれば、その必要がある患者に４−デスアセチル−４−メチルカーボネートタキソール及びドキソルビシンを投与することからなる癌を治療する方法が提供される。驚くべきことに、４−デスアセチル−４−メチルカーボネートタキソールが心臓毒性代謝物であるドキソルビシン副生物の形成を刺激しないことが分かった。本発明の１つの態様では、４−デスアセチル−４−メチルカーボネートタキソール及びドキソルビシンが、任意の順序で逐次患者に投与される。別の態様では、４−デスアセチル−４−メチルカーボネートタキソール及びドキソルビシンは併用して投与される。好ましくは、薬剤は、先ず投与されるドキソルビシンに逐次投与される。
【０００７】
また本発明により提供されるのは、化学療法的に有効な量の４−デスアセチル−４−メチルカーボネートタキソール及びドキソルビシンからなる化学療法用組成物である。本発明の他の態様では、化学療法用組成物は、製薬上許容できる担体内に配置される。別の態様では、それぞれの薬剤である４−デスアセチル−４−メチルカーボネートタキソール及びドキソルビシンは、別々に処方されて組成物の逐次的な投与を助けることができる。
【０００８】
製薬組成物は、所望の抗癌作用を得るのに好適な任意の経路及び任意の量で投与できる。１つの態様では、４−デスアセチル−４−メチルカーボネートタキソール及びドキソルビシンは、約３０分−２４時間に及ぶ点滴（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）間の間隔で患者に別々に点滴され、約１時間の間隔が好ましい。薬剤の静脈内投与も好ましい。
【０００９】
図１は、有毒な副生物へのドキソルビシンの代謝転換を示す概略図である。
【００１０】
図２Ａ〜２Ｃは、パクリタキセル（ＰＴＸ）（図２Ａ）；ドセタキセル（ＤＣＴ）（図２Ｂ）；及び４−デスアセチル−４−メチルカーボネートタキソール（図２Ｃ）の構造を示す。
【００１１】
図３は、ＰＴＸ及びＤＣＴが心臓サイトゾル中のＤＯＸｏｌ形成を刺激することを示すグラフである。４−デスアセチル−４−メチルカーボネートタキソールは、テストされた濃度でＤＯＸｏｌ生成を刺激しなかった。＊Ｐ＝＜０．０５。
【００１２】
図４Ａ及び４Ｂは、ＰＴＸ及びＤＣＴが、ドキソルビシノロン（以下ＤＯＸｏｌアグリコン）へのドキソルビシン（以下ＤＯＸアグリコン）の転換を刺激することを示すグラフである（図４Ａ）。４−デスアセチル−４−メチルカーボネートタキソールは、この転換を刺激することができなかった（図４Ｂ）。＊Ｐ＝＜０．０２５対コントロール。
【００１３】
図５Ａ及び５Ｂは、ＰＴＸ及びＤＣＴがともに、ＤＯＸとインキュベートされたときヒトの心臓から単離されたデオキシコレート可溶化ミクロソームによりＮＡＤＰＨ酸化を刺激することを示すグラフである（図５Ａ）。４−デスアセチル−４−メチルカーボネートタキソールは、テストされた最高のレベルでのみこの酸化を刺激した（図５Ｂ）。＊Ｐ＝＜０．０５対コントロール。
【００１４】
図６は、ＤＯＸがスーパーオキシドアニオン形成を増大することを示すグラフである。１０μＭのＰＴＸまたはＤＣＴを含むことは、スーパーオキシドアニオン形成を有意に増大させたが、４−デスアセチル−４−メチルカーボネートタキソールではそうでなかった。＊Ｐ＝＜０．０２５対ＤＯＸ；＊＊Ｐ＝ＮＳ対ＤＯＸ。
【００１５】
４−デスアセチル−４−メチルカーボネートタキソールが心臓のＤＯＸｏｌ及びフリーラジカルを増加させるかどうかについて知るために、系統だった研究が行われた。ＰＴＸ、ＤＣＴ及び４−デスアセチル−４−メチルカーボネートタキソールの並立的な比較をした。研究は、ドキソルビシン（ＤＯＸ）誘発心臓毒性の投与量依存発生率がパクリタキソール（ＰＴＸ）により増加するが、ドセタキソール（ＤＣＴ）ではそうではないことを示している。しかし、ＤＯＸ−ＤＣＴ併用による低下した心臓毒性作用は、ＤＯＸのより少ない累積投与量を投与することにより可能である。ＤＯＸ−タキサンの相互作用のメカニズム及びアナログ特異性を明らかにするために、ヒトの心筋における毒性種へのＤＯＸの代謝転換に対するＰＴＸ、ＤＣＴ及び新しいタキサン４−デスアセチル−４−メチルカーボネートタキソールの作用の評価を行った。ＤＯＸ代謝は、大動脈冠状動脈バイパス移植中に配置される心筋のサンプルの細胞レベル下のフラクションにおいて評価された。心臓毒性の急性及び慢性の相（それぞれ酸素フリーラジカル、アグリコン性アルコール代謝物ドキソルビシノロン、及びグリコシド性アルコール代謝物ドキソルビシノール）を仲介するＤＯＸ代謝物の形成を測定した。ＰＴＸ及びＤＣＴ（１μＭ）は、それぞれドキソルビシノール及びドキソルビシノロンへのＤＯＸ及びドキソルビシノンの細胞質転換を増加させる［ドキソルビシノール：０．４６±０．０４から１．１±０．２及び１．２±０．２ｎモル／ｍｇ蛋白／４時間；ドキソルビシノロン：０．８±０．１から１．４±０．２及び１．３±０．２ｎモル／ｍｇ蛋白／４時間；ｎ＝３、ｐ＜０．０５］。ＰＴＸ及びＤＣＴ（１０μＭ）も酸素によるＤＯＸのレドックスサイクル及びミクロソームフラクション中のスーパーオキシドアニオンラジカルの必然の発生を増加させる（それぞれ１．６±０．１から２．２±０．２及び２．４±０．２ｎモル／ｍｇ蛋白／分；ｎ＝４−１０、Ｐ＜０．０５）。同様な条件下、４−デスアセチル−４−メチルカーボネートタキソールは、ドキソルビシノール、ドキソルビシノロンまたはスーパーオキシドアニオンラジカルを増加させなかった。下記のように、市販のタキサンＰＴＸ及びＤＣＴは、４−デスアセチル−４−メチルカーボネートタキソールではないが、ヒトの心筋の有毒なＤＯＸ代謝物のレベルを増大させる可能性をともにする。ＤＯＸ及びＰＴＸまたはＤＣＴにより治療された患者において心臓の監視を勧めているが、これらの発見は、４−デスアセチル−４−メチルカーボネートタキソールとＤＯＸとを組み合わせるとき、より心臓毒性の可能性が低いことを示唆している。有利には、より多い蓄積投与量のドキソルビシンは、ドキソルビシンとＰＴＸまたはＤＣＴとの組み合わせに比べて４−デスアセチル−４−メチルカーボネートタキソールとの組み合わせで使用できる。
【００１６】
ＤＯＸ代謝の酵素は、極めて種に関連する。動物モデルの研究に伴う見落としの可能性を避けるために、生体外のヒト心臓アッセイを利用した。アッセイは、ＤＯＸｏｌを発生するサイトゾルフラクション及びフリーラジカルへＤＯＸを転換するミクロソームフラクションの両者の単離を含む。
【００１７】
４−デスアセチル−４−メチルカーボネートタキソールを合成する材料及び方法は、ＰＣＴ／ＵＳ９３／１２１７３及びヨーロッパ特許０６０４９１０Ｂ１（これら特許のそれぞれの全記述は、本明細書で参考として引用される）で提供される。心臓毒性副生物の形成を刺激する能力が低下した４−デスアセチル−４−メチルカーボネートタキソールの製薬上許容できる塩は、本発明の範囲内にある。塩酸塩またはナトリウム塩を含むがそれらに限定されないこれらの塩は、当業者に周知の方法に従って製造できる。
【００１８】
本発明の化学療法剤の投与方法も開示されている。ドキソルビシン及び４−デスアセチル−４−メチルカーボネートタキソールは、同時に患者に投与されるか、またはそれらは任意の順序で逐次的に投与できる。好ましい態様では、アントラサイクリンであるドキソルビシンが最初に投与される。約３０分から２４時間のおよその期間後、４−デスアセチル−４−メチルカーボネートタキソールを投与する。本発明の化学療法用組成物の投与に好適な投与量は、以下に示される。
【００１９】
逐次的にまたは同時に投与されるにせよ、組成物は、癌の治療に有効な任意の量または任意の投与経路により投与できる。従って、用語「化学療法的に有効な」は、本明細書で使用されるとき、所望の抗癌作用をもたらすのに充分な量の本発明の化合物をいう。必要な正確な量は、患者に応じて、または化学療法化合物の投与の態様などにより変化する。
【００２０】
本発明は、４−デスアセチル−４−メチルカーボネートタキソール及びドキソルビシンの両者からなる化学療法用組成物をまた提供する。別の態様では、本発明の化学療法用製薬組成物は、製薬上許容できる担体媒体または補助剤と組み合わされた、活性成分として上記の化合物の１つを含む。従って、この態様では、４−デスアセチル−４−メチルカーボネートタキソール及びドキソルビシンは、別々に処方される。
【００２１】
本発明の製薬組成物は、錠剤、カプレット、ピルまたは糖衣錠を含む投与用の種々の形態で製造されるか、または好適な容器例えばカプセルに充填されるか、あ懸濁物の場合には瓶に充填される。本明細書で使用するとき、「製薬上許容できる担体媒体」は、所望の特別な投与形態に好適な、任意かつすべての溶媒、希釈剤、他の液体媒体、分散または懸濁助剤、表面活性成分、保存剤、固体結合剤、潤滑剤などを含む。「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ´ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｎｅｃｅ」１５版、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．Ｅａｓｔｏｎ ＰＡ １９７５）は、製薬組成物を処方するのに使用される種々の媒体または担体、並びにその製造の周知の技術を開示している。任意の従来の担体媒体が、例えば任意の望ましくない生物学的作用を生成するか、またはそれ以外に製薬組成物の任意の他の成分の１つ以上と有害なやり方で相互反応することにより、本発明の化合物と共存できない場合を除いて、その使用は、本発明の範囲内にあると考えられる。
【００２２】
本発明の製薬的に併用する組成物では、活性剤は、担体媒体及び補助剤の１つ以上を含む組成物の全重量に基づいて、少なくとも約０．１重量％そして約９５重量％以下の量で存在できる。好ましくは、活性剤の割合は、組成物の約１重量％と約７５重量％との間で変化する。腸溶性または非経口の投与に好適な製薬上の有機または無機の固体または液体の担体媒体を使用して組成物を製造できる。ゼラチン、乳糖、澱粉、マグネシウム、ステアレート、タルク、植物及び動物の脂肪及び油、ガム、ポリアルキレングリコールまたは薬剤用の他の周知の助剤または希釈剤は、すべて担体媒体として好適である。
【００２３】
本明細書で記述された化学療法組成物は、好ましくは、投与の容易さ及び投与物の均一性のために投与物単位の形に処方される。「投与物単位の形」は、本明細書で使用されるとき、治療されるべき患者用の化学療法用組成物の物理的に分離した単位をいう。各投与物は、それ自体でまたは選択された製薬担体媒体と組み合わせての何れかで、所望の治療効果を生成するように計算された量の活性材料を含まねばならない。代表的には、ドキソルビシンを含むアントラサイクリンは、剤の約４０−約２００ｍｇに及ぶ投与物単位で投与され、約４０−１５０ｍｇの範囲が好ましい。代表的には、４−デスアセチル−４−メチルカーボネートタキソールを含むタキサンは、剤の約５０−３８０ｍｇに及ぶ投与物単位で投与され、約５０−３００ｍｇの範囲が好ましい。本発明の化学療法用併用組成物は、筋肉内注射、腹腔内注射、静脈内点滴などにより、経口的、非経口的に投与できる。静脈内投与が特に好ましい。本発明の化学療法用組成物は、代表的には、種々の持続時間の静脈内点滴により投与され、１−２４時間の点滴が好ましい。
【００２４】
本発明の化学療法用組成物は、所望の治療効果を得るために、毎月１回以上投与される。本発明の好ましい態様では、化学療法剤は、静脈内点滴により逐次投与され、ドキソルビシンが好ましくは始めに投与される。化合物の投与間の異なる間隔が選択できる。これらの間隔は、約３０分から２４時間の間に及び、１時間が好ましい。
【００２５】
併用化学療法処方の生物学的研究は、心臓の細胞フラクションで行われた。驚くべきことに、ヒトの心臓のサイトゾル中のアントラサイクリンとのインキュベーション時に、４−デスアセチル−４−メチルカーボネートタキソールがドキソルビシンの心臓毒性の代謝物及び副生物の生成を刺激しないことが分かった。これらの研究のテスト方法及び結果は以下に示される。
【００２６】
ヒトの心臓サイトゾル中のタキサンを添加または無添加したときのＤＯＸ代謝及びＤＯＸｏｌ形成の再構成
【００２７】
ヒトの心筋を、大動脈−冠状動脈のバイパス移植をした患者から得る。すべてのサンプルは、心臓−肺バイパス用のカニュレーション中摘出された右心房の外側から外科医により通常通り処理された。−８０℃で貯蔵された後、１５−２０個のサンプルのプールを、連続するホモゲネーション、超遠心分離及び１０５０００ｇ上清の１晩の６５％硫酸アンモニウム沈澱によりサイトゾル調製について処理される。次に、サイトゾルを１００ｍＭのトリスＨＣｌ−４０ｍＭのＫＣｌｐＨ８．９について透析し、同じ緩衝液により３ｍｇ蛋白／ｍＬに希釈し、そして１００ｍＭのジチオスレイトールで室温で１５分間インキュベートして細胞質アコニターゼの［４Ｆｅ−４Ｓ］クラスターの非変性分解を促進する。この処理は、ＤＯＸｏｌと［４Ｆｅ−４Ｓ］クラスターとの反応がこの代謝物をＤＯＸへ戻すかもしれないために、必要である。それゆえ、かなりな量のＤＯＸｏｌが、もしそれらがそれらのアッセイ前に［４Ｆｅ−４Ｓ］クラスターと反応したならば、検出されないままであろう。未反応ジチオスレイトールは、次いで連続する（１．５×１０ｃｍ）セファロース６Ｂカラムによるゲル濾過、６５％硫酸アンモニウムによる蛋白再沈澱、及び０．３Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０によるエキシテンシブ透析により除かれた。ドキソルビシン代謝は、０．３Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７．０）３７℃中のサイトゾル（０．１５ｍｇ蛋白）、ＮＡＤＰＨ（１００μＭ）及びＤＯＸ（２５μＭ）を含む０．５ｍＬのインキュベーション中で再構成された。指示されたように、エタノールに溶解したタキサン（１−５０μＭ）を含ませた。タキサンのないエタノール（５μＬ）の一部を適切ならば含ませて、すべてのインキュベーション中１０μＬの最終体積に調節した。４時間後、ＤＯＸ及びＤＯＸｏｌを２ｍＬのＣＨＣｌ３／ＣＨ３ＯＨ（１：１）により抽出し、両方の次元で移動相としてＣＨＣｌ３／ＣＨ３ＯＨ／ＣＨ３ＣＯＯＨ／Ｈ２Ｏ（８０：２０：１４：６）を使用して、（２０×２０ｃｍ）０．２５ｍＭ Ｆ５２４シリカゲルプレート上の既に確認した二次元ＴＬＣにより分離した。ドキソルビシノールは、ＤＯＸのＮａＢＨ４還元後精製された（Ｓ）（Ｒ）−ＤＯＸｏｌまたはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｅｕｃｅｔｉｕｓからの（Ｓ）ＤＯＸｏｌによる共クロマトグラフィにより同定された。指示されたように、インキュベーションは、ＤＯＸをＤＯＸアグリコンにより置換しそしてＤＯＸｏｌアグリコンの形成を測定することにより調製された。後者は、それぞれ第一の次元及び第二の次元でＣＨＣｌ３／ＣＨ３ＯＨ／ＣＨ３ＣＯＯＨ（１００：２：５）及びＣＨ３ＣＯＯＣ２Ｈ５−ＣＨ３ＣＨ２ＯＨ−ＣＨ３ＣＯＯＨ−Ｈ２Ｏ（８０：１０：５：５）を使用することによりＤＯＸアグリコンから分離された。ＤＯＸアグリコンは、ＤＯＸの加熱酸加水分解後精製された。
【００２８】
ヒトの心臓のミクロソーム中のタキサンの添加または無添加のＤＯＸ代謝及びフリーラジカル形成の再構成
【００２９】
ヒトの心筋のホモジネートからの１０５０００ｇのペレットを、デオキシコレートにより可溶化し、そして０．３Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０、３７℃中の１０μＭのＤＯＸ、１−１０μＭのタキサン及び０．１ｍＭのＮＡＤＰＨにより０．０２５ｍｇ ｐｒｏｔ／ｍＬの最終濃度で再構成する。
【００３０】
ＮＡＤＰＨチトクロームＰ−４５０レダクターゼからＤＯＸのキノン基への電子の流れは、ＮＡＤＰＨ酸化をモニターすることにより検出される。酸素によるセミキノンのレドックスカップリングは、チトクロームｃ（２５μＭ）のスーパーオキシドディスムターゼ阻害可能な還元によりスーパーオキシドアニオンラジカルの形成をモニターすることにより検出される。これらのアッセイは、スキャーター及び濁度のためのコンピュータによる補正を備えたＨｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋｅｒｄ ８４５３Ａ ＵＶ／ＶＩＳ／ＮＩＲ分光計で行われる。
【００３１】
【実施例】
実施例 １ ＰＴＸ及びＤＣＴは有毒なドキソルビシン代謝物の形成を刺激する ＰＴＸ及びＤＣＴの両者は、［４Ｆｅ−４Ｓ］欠如ヒト心臓サイトゾル中でＤＯＸｏｌ形成を刺激する。図３で示されるように、濃度レスポンス曲線は鐘状であり、タキサンがアントラサイクリンレダクターゼのアロステリックモジュレータとして作用することを示唆している。刺激を許容する濃度の範囲は、ＰＴＸの場合には、より広くなり勝ちであるが、２つのタキサンによる最大の刺激は、実験のこのセットで同じである。４−デスアセチル−４−メチルカーボネートタキソールは、テストされた濃度のすべてでＤＯＸｏｌ形成を刺激しなかった。
【００３２】
図４に示されるように、ＰＴＸ及びＤＣＴは、またＤＯＸｏｌアグリコンへのＤＯＸアグリコンの転換を刺激可能であった。また、濃度レスポンス曲線は鐘形であり、２つのタキサンは達成可能な全刺激とこの刺激を許容する濃度の範囲との両者に関して殆ど同じであった（パネルＡ）。４−デスアセチル−４−メチルカーボネートタキソールは、ＤＯＸアグリコンからのＤＯＸｏｌアグリコンの形成を刺激しないことが分かった（パネルＢ）。
【００３３】
実施例 ２ タキサンによるＮＡＤＰＨ酸化の刺激
ＰＴＸ及びＤＣＴは、ＤＯＸによりインキュベートされたヒトの心臓のデオキシコレート可溶化ミクロソームによるＮＡＤＰＨ酸化を刺激できた。この系では、濃度レスポンス曲線は、鐘形ではないが、刺激はそれが平坦になるまで増大した（図５Ａ）。４−デスアセチル−４−メチルカーボネートタキソールは、テストされた最高の濃度でのみＮＡＤＰＨ酸化を刺激したが、これは統計上有意ではなかった（図５Ｂ）。テストされたタキサンのいずれも、ＤＯＸの不存在下でＮＡＤＰＨ酸化に影響しなかった。
【００３４】
図６に示されるように、ＤＯＸは、デオキシコレート可溶化ミクロソームによるスーパーオキシドアニオン形成を増大でき、そのキノン基の還元−酸化を経てＮＡＤＰＨチトクロームＰ−４５０レダクターゼから分子状酸素への電子をそらすその能力と一致した。１０μＭのＰＴＸまたはＤＣＴの混在は、スーパーオキシド形成に有意な増加を生じさせ、それは同様な条件下ＮＡＤＰＨ酸化を刺激するこれら２つのタキサンの能力と一致した。また、４−デスアセチル−４−メチルカーボネートタキソールは、これらの設定において有意な刺激を何ももたらさず、それはＮＡＤＰＨ酸化に対する有意な作用のないことと一致した。
【００３５】
本明細書で示された結果は、ＰＴＸ及びＤＣＴの両者がヒトの心臓においてＤＯＸ代謝を刺激し、スーパーオキシドアニオンのような潜在的な心臓毒性のＤＯＸｏｌ、ＤＯＸｏｌアグリコン、及び酸素フリーラジカルの形成を増大させることを示す。これらの知見は、ＤＯＸ−ＰＴＸの組み合わせの心臓毒性の増加を説明する分子の相関関係を提供し、そして増大した心臓毒性が、もしＤＯＸの蓄積投与量が約３６０−４００ｍｇ／ｍ２より多く増加するならば、ＤＯＸ−ＤＣＴ処方後にも生ずるだろうことを示唆している。対照的に、４−デスアセチル−４−メチルカーボネートタキソールは、ＤＯＸ代謝に対するこの作用を欠いているようにみえる。従って、４−デスアセチル−４−メチルカーボネートタキソールは、ＤＯＸとの組み合わせた化学療法処方で使用される優れたタキサンを提供する。
【００３６】
本発明の或る好ましい態様は、上記で記載されそして特に例示されているが、本発明がこれらの態様に限定されることを目的とするものではない。種々の変化が、特許請求の範囲に示された範囲及び趣旨から逸脱することなく本発明に行うことができる。
【００３７】
【非特許文献１】
Ｇｅｈｌ Ｊ，Ｂｏｅｓｇａａｒｄ Ｍ，Ｐａａｓｋｅ Ｔ，Ｖｉｔｔｒｕｐ Ｊｅｎｓｅｎ Ｂ，Ｄｏｍｂｅｒｎｏｗｓｋｙ Ｐ，Ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ ａｎｄ ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ ｉｎ ａｄｖａｎｃｅｄ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ：ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｃａｒｄｉｏｔｏｘｉｃ． Ａｎｎ Ｏｎｃｏｌ １９９６；７：６８７−９３．
【００３８】
【非特許文献２】
Ｇｉａｎｎｉ Ｌ，Ｍｕｎｚｏｎｅ Ｅ，Ｃａｐｒｉ Ｇ，Ｆｕｌｆａｒｏ Ｆ，Ｔａｒｅｎｚｉ Ｅ，Ｖｉｌｌａｎｉ Ｆ ｅｔ ａｌ．Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ ｂｙ ３−ｈｏｕｒ ｉｎｆｕｓｉｏｎ ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｂｏｌｕｓ ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ ｉｎ ｗｏｍｅｎ ｗｉｔｈ ｕｎｔｒｅａｔｅｄ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ：ｈｉｇｈ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｅｆｆｉｃａｃｙ ａｎｄ ｃａｒｄｉａｃ ｅｆｆｅｃｔｓ ｉｎ ａ ｄｏｓｅ−ｆｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｆｉｎｄｉｎｇ ｓｔｕｄｙ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ １９９５；１３：２６８８−９９．
【００３９】
【非特許文献３】
Ｇｉａｎｎｉ Ｌ，Ｄｏｍｂｅｒｎｏｗｓｋｙ Ｐ，Ｓｌｅｄｇｅ Ｇ，Ａｍａｄｏｒｉ Ｇ，Ｍａｒｔｉｎ Ｍ，Ｂａｙｎｅｓ Ｒ ｅｔ ａｌ．Ｃａｒｄｉａｃ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ ｗｉｔｈ Ｔａｘｏｌ７ ａｎｄ Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ ｆｏｒ ａｄｖａｎｃｅｄ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ． Ｐｒｏｃ Ａｎｎｕ Ｍｅｅｔ Ａｍ Ｓｏｃ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ １９９８；１７：１１５ａ（ａｂｓｔｒａｃｔ ４４４）．
【００４０】
【非特許文献４】
Ｎａｂｈｏｌｔｚ ＪＭ，Ｓｍｙｌｉｅ Ｍ，Ｍａｃｋｅｙ ＪＲ，Ｎｏｅｌ Ｄ，Ｐａｔｅｒｓｏｎ ＡＨ，ａｌ−Ｔｗｅｉｇｅｒｉ Ｔ ｅｔ ａｌ．Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ／ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ／ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐａｍｉｄｅ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ． Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １９９７；１１（Ｓｕｐｐｌ ８）：３７−４１．
【００４１】
【非特許文献５】
Ｏｌｓｏｎ ＲＤ，Ｍｕｓｈｌｉｎ ＰＳ．Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ ｃａｒｄｉｏｔｏｘｉｃｉｔｙ：ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｒｅｖａｉｌｉｎｇ ｈｙｐｏｔｈｅｓｅｓ． ＦＡＳＥＢ Ｊ １９９０；４：３０７６−８６．
【００４２】
【非特許文献６】
Ｍｉｎｏｔｔｉ Ｇ，Ｃａｉｒｏ Ｇ，Ｍｏｎｔｉ Ｅ，Ｒｏｌｅ ｏｆ ｉｒｏｎ ｉｎ ａｎｔｈｒａｃｙｃｌｉｎｅ ｃａｒｄｉｏｔｏｘｉｃｉｔｙ：ｎｅｗ ｔｕｎｅｓ ｆｏｒ ａｎ ｏｌｄ ｓｏｎｇ？ ＦＡＳＥＢ Ｊ １９９９；１３：１９９−２１２．
【００４３】
【非特許文献７】
Ｂｏｕｃｅｋ ＲＪ Ｊｒ，Ｏｌｓｏｎ ＲＤ，Ｂｒｅｎｎｅｒ ＤＥ，Ｏｇｕｍｂｕｍｎｉ ＭＥ，Ｉｎｕｉ Ｍ，Ｆｌｅｉｓｃｈｅｒ Ｓ．Ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ ｏｆ ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ ｉｓ ａ ｐｏｔｅｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｍｅｍｂｒａｎｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｉｏｎ ｐｕｍｐｓ：ａ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｖｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｃａｒｄｉａｃ ｍｕｓｃｌｅ ｗｉｔｈ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｒａｃｔｉｏｎｓ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９８７；２６２：１５８５１−５６．
【００４４】
【非特許文献８】
Ｍｉｎｏｔｔｉ Ｇ，Ｒｅｃａｌａｃｔｉ Ｓ，Ｌｉｂｅｒｉ Ｇ，Ｃａｌａｆｉｏｒｅ ＡＭ，Ｍａｎｃｕｓｏ Ｃ，Ｐｒｅｚｉｏｓｉ Ｐ ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ａｌｃｏｈｏｌ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ ｏｆ ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ ｉｒｒｅｖｅｒｓｉｂｌｙ ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｓ ａｃｏｎｔａｓｅ／ｉｒｏｎ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ−１ ｉｎ ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ｆｒａｃｔｉｏｎｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｍｙｏｃａｒｉｄｉｕｍ． ＦＡＳＥＢ Ｊ １９９８；１２：５４１−５１．
【００４５】
【非特許文献９】
Ｍｉｎｏｔｉｉ Ｇ，Ｃａｖａｌｉｅｒｅ ＡＦ，Ｍｏｒｄｅｎｔｅ Ａ，Ｒｏｓｓｉ Ｍ，Ｓｃｈｉａｖｅｌｌｏ Ｒ，Ｚａｍｐａｒｅｌｌｉ Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ａｌｃｏｈｏｌ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ ｍｅｄｉａｔｅ ｉｒｏｎ ｄｅｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ｆｒａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｂｉｏｐｓｉｅｓ ｅｘｐｏｓｅｄ ｔｏ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ａｎｔｈｒａｃｙｃｌｉｎｅｓ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １９９５；９５：１５９５−１６０５．
【００４６】
【非特許文献１０】
Ｐｏｗｉｓ Ｇ，Ｆｒｅｅ ｒａｄｉｃａｌ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｂｙ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｑｕｉｎｏｎｅｓ．Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ １９８９；６：６３−１０１．
【図面の簡単な説明】
【図１】
有毒な副生物へのドキソルビシンの代謝転換を示す概略図である。
【図２】
Ａはパクリタキセル（ＰＴＸ）の構造を示す。Ｂはドセタキセル（ＤＣＴ）の構造を示す。Ｃは４−デスアセチル−４−メチルカーボネートタキソールの構造を示す。
【図３】
ＰＴＸ及びＤＣＴが心臓サイトゾル中のＤＯＸｏｌ形成を刺激することを示すグラフである。４−デスアセチル−４−メチルカーボネートタキソールは、テストされた濃度でＤＯＸｏｌ生成を刺激しなかった。＊Ｐ＝＜０．０５。
【図４】
ＡはＰＴＸ及びＤＣＴが、ドキソルビシノロン（以下ＤＯＸｏｌアグリコン）へのドキソルビシン（以下ＤＯＸアグリコン）の転換を刺激することを示すグラフである。Ｂは４−デスアセチル−４−メチルカーボネートタキソールは、この転換を刺激することができなかったことを示すグラフである。＊Ｐ＝＜０．０２５対コントロール。
【図５】
ＡはＰＴＸ及びＤＣＴがともに、ＤＯＸとインキュベートされたときヒトの心臓から単離されたデオキシコレート可溶化ミクロソームによりＮＡＤＰＨ酸化を刺激することを示すグラフである。Ｂは４−デスアセチル−４−メチルカーボネートタキソールは、テストされた最高のレベルでのみこの酸化を刺激したことを示すグラフである。＊Ｐ＝＜０．０５対コントロール。
【図６】
ＤＯＸがスーパーオキシドアニオン形成を増大することを示すグラフである。１０μＭのＰＴＸまたはＤＣＴを含むことは、スーパーオキシドアニオン形成を有意に増大させたが、４−デスアセチル−４−メチルカーボネートタキソールではそうでなかった。＊Ｐ＝＜０．０２５対ＤＯＸ；＊＊Ｐ＝ＮＳ対ＤＯＸ。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to the area of oncology and to the prescription of improved chemotherapy.
[0002]
[Prior art]
Taxol ™ (paclitaxel) has been shown to have excellent antitumor activity in vivo. Taxol has been used to treat a variety of cancers, including breast, ovarian and lung cancer.
[0003]
The clinical use of doxorubicin (DOX), or anthracycline, in the treatment of cancer has been, in particular, a cumulative dose of about 500 mg / m 2 Is exceeded, limited by the likelihood of developing chronic myocardial damage and congestive heart failure. When DOX and paclitaxel (PTX) are used together, about 500 mg / m 2 The cumulative dose of lower anthracycline shows that cardiac trauma occurs at an unacceptable rate. Due to these increases in cardiotoxicity, the cumulative dose of DOX is about 360 mg / m 2 when anthracycline is administered in combination with PTX. 2 Must be lowered. There are also reports showing that combination therapy with docetaxel (DCET) does not increase the cardiotoxicity of DOX. However, it should be noted that in these studies, very few patients had about 360-400 mg / m 2 Exposure to higher cumulative doses of DOX.
[0004]
Reduction of two electrons in the carbonyl group of the side chain of DOX converts anthracycline to a dihydroxy (dihydric alcohol) metabolite called doxorubicinol (DOXol). This reaction is catalyzed by the NADPH oxidoreductase present in the cytosol. There is increasing evidence that DOXol may be an important mediator of cardiotoxicity. Reduction of one electron in the quinone moiety in the tetracycline ring of DOX results in a semiquinone that oxidizes to regenerate the original anthracycline by reducing oxygen to free radicals. This reaction is catalyzed by several reductases, including microsomal NADPH cytochrome P-450 reductase and mitochondrial NADH dehydrogenase. Although the role of free radicals in anthracycline-induced cardiotoxicity is controversial, these species appear to play a more prominent role when synergized by co-formation of DOXol.
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
As those experienced in the area of oncology will appreciate, there is a need for prescribing combination chemotherapy with improved efficacy and safety.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
According to the present invention there is provided a method of treating cancer comprising administering 4-desacetyl-4-methylcarbonate taxol and doxorubicin to a patient in need thereof. Surprisingly, it has been found that 4-desacetyl-4-methylcarbonate taxol does not stimulate the formation of the cardiotoxic metabolite doxorubicin by-product. In one aspect of the invention, 4-desacetyl-4-methylcarbonate taxol and doxorubicin are administered to a patient sequentially, in any order. In another aspect, 4-desacetyl-4-methylcarbonate taxol and doxorubicin are administered in combination. Preferably, the drug is administered sequentially to doxorubicin which is administered first.
[0007]
Also provided by the present invention is a chemotherapeutic composition comprising a chemotherapeutic effective amount of 4-desacetyl-4-methylcarbonate taxol and doxorubicin. In another aspect of the invention, the chemotherapeutic composition is located in a pharmaceutically acceptable carrier. In another aspect, the respective agents, 4-desacetyl-4-methylcarbonate taxol and doxorubicin, can be formulated separately to aid sequential administration of the composition.
[0008]
Pharmaceutical compositions can be administered by any route and in any amount suitable to produce the desired anti-cancer effect. In one embodiment, the 4-desacetyl-4-methylcarbonate taxol and doxorubicin are infused separately into the patient at intervals between infusions ranging from about 30 minutes to 24 hours, with an interval of about 1 hour being preferred. Intravenous administration of the drug is also preferred.
[0009]
FIG. 1 is a schematic diagram showing the metabolic conversion of doxorubicin to toxic by-products.
[0010]
2A-2C show the structures of paclitaxel (PTX) (FIG. 2A); docetaxel (DCT) (FIG. 2B); and 4-desacetyl-4-methylcarbonate taxol (FIG. 2C).
[0011]
FIG. 3 is a graph showing that PTX and DCT stimulate DOXol formation in cardiac cytosol. 4-Desacetyl-4-methyl carbonate taxol did not stimulate DOXol production at the concentrations tested. * P = <0.05.
[0012]
4A and 4B are graphs showing that PTX and DCT stimulate the conversion of doxorubicin (hereinafter DOX aglycone) to doxorubicinolone (hereinafter DOXol aglycone) (FIG. 4A). 4-Desacetyl-4-methylcarbonate taxol failed to stimulate this conversion (FIG. 4B). * P = <0.025 vs control.
[0013]
FIGS. 5A and 5B are graphs showing that both PTX and DCT stimulate NADPH oxidation by deoxycholate-solubilized microsomes isolated from human heart when incubated with DOX (FIG. 5A). 4-desacetyl-4-methylcarbonate taxol stimulated this oxidation only at the highest levels tested (FIG. 5B). * P = <0.05 vs control.
[0014]
FIG. 6 is a graph showing that DOX increases superoxide anion formation. Including 10 μM PTX or DCT significantly increased superoxide anion formation, but not 4-desacetyl-4-methylcarbonate taxol. * P = <0.025 vs. DOX; ** P = NS vs. DOX.
[0015]
A systematic study was performed to see if 4-desacetyl-4-methylcarbonate taxol increases cardiac DOXol and free radicals. A parallel comparison of PTX, DCT and 4-desacetyl-4-methylcarbonate taxol was made. Studies have shown that the dose-dependent incidence of doxorubicin (DOX) -induced cardiotoxicity is increased by paclitaxol (PTX), but not by docetaxol (DCT). However, the reduced cardiotoxic effects of the DOX-DCT combination are possible by administering lower cumulative doses of DOX. Effects of PTX, DCT and a new taxane 4-desacetyl-4-methylcarbonate taxol on metabolic conversion of DOX to toxic species in human myocardium to elucidate the mechanism of DOX-taxane interaction and analog specificity Was evaluated. DOX metabolism was assessed in subcellular fractions of myocardial samples placed during aortic coronary artery bypass grafting. The formation of DOX metabolites that mediate the acute and chronic phases of cardiotoxicity (oxygen free radical, aglyconic alcohol metabolite doxorubicinolone, and glycosidic alcohol metabolite doxorubicinol, respectively) was measured. PTX and DCT (1 μM) increase the cytoplasmic conversion of DOX and doxorubicinone to doxorubicinol and doxorubicinolone, respectively [doxorubicinol: 0.46 ± 0.04 to 1.1 ± 0.2 And 1.2 ± 0.2 nmol / mg protein / 4 hours; Doxorubicinolone: 0.8 ± 0.1 to 1.4 ± 0.2 and 1.3 ± 0.2 nmol / mg protein / 4 Time; n = 3, p <0.05]. PTX and DCT (10 μM) also increase the redox cycle of DOX by oxygen and the consequent generation of superoxide anion radicals in the microsomal fraction (1.6 ± 0.1 to 2.2 ± 0.2 and 2.4, respectively). ± 0.2 nmol / mg protein / min; n = 4-10, P <0.05). Under similar conditions, 4-desacetyl-4-methylcarbonate taxol did not increase doxorubicinol, doxorubicinolone or superoxide anion radicals. As described below, the commercial taxanes PTX and DCT are not 4-desacetyl-4-methylcarbonate taxol but share the potential to increase the levels of toxic DOX metabolites in human myocardium. Although cardiac monitoring is recommended in patients treated with DOX and PTX or DCT, these findings suggest that cardiotoxic potential is less when DOX is combined with 4-desacetyl-4-methylcarbonate taxol. Suggest that. Advantageously, a higher cumulative dose of doxorubicin can be used in combination with 4-desacetyl-4-methylcarbonate taxol compared to the combination of doxorubicin with PTX or DCT.
[0016]
The enzymes of DOX metabolism are extremely species-related. To avoid the potential for oversight associated with studying animal models, an in vitro human heart assay was utilized. The assay involves the isolation of both a cytosolic fraction that generates DOXol and a microsomal fraction that converts DOX to free radicals.
[0017]
Materials and methods for synthesizing 4-desacetyl-4-methylcarbonate taxol are provided in PCT / US93 / 12173 and European Patent 0604910B1 (the entire description of each of these patents is incorporated herein by reference). You. Pharmaceutically acceptable salts of 4-desacetyl-4-methylcarbonate taxol with reduced ability to stimulate the formation of cardiotoxic by-products are within the scope of the invention. These salts, including but not limited to the hydrochloride or sodium salt, can be prepared according to methods well known to those skilled in the art.
[0018]
Also disclosed are methods of administering the chemotherapeutic agents of the present invention. Doxorubicin and 4-desacetyl-4-methylcarbonate taxol are administered to the patient simultaneously, or they can be administered sequentially in any order. In a preferred embodiment, the anthracycline doxorubicin is administered first. After an approximate period of about 30 minutes to 24 hours, 4-desacetyl-4-methylcarbonate taxol is administered. Suitable dosages for administration of the chemotherapeutic composition of the present invention are set forth below.
[0019]
The compositions, whether administered sequentially or simultaneously, can be administered by any amount or by any route of administration effective for treating cancer. Thus, the term "chemotherapeutically effective" as used herein refers to an amount of a compound of the invention sufficient to provide the desired anti-cancer effect. The exact amount required will vary depending on the patient or the mode of administration of the chemotherapeutic compound.
[0020]
The present invention also provides a chemotherapeutic composition comprising both 4-desacetyl-4-methylcarbonate taxol and doxorubicin. In another aspect, the chemotherapeutic pharmaceutical composition of the present invention comprises one of the compounds described above as an active ingredient in combination with a pharmaceutically acceptable carrier vehicle or adjuvant. Thus, in this aspect, 4-desacetyl-4-methylcarbonate taxol and doxorubicin are separately formulated.
[0021]
The pharmaceutical compositions of the invention may be manufactured in various forms for administration, including tablets, caplets, pills or dragees, or filled in suitable containers such as capsules, or bottles in the case of suspension. Is filled. As used herein, "pharmaceutically acceptable carrier medium" refers to any and all solvents, diluents, other liquid media, dispersion or suspension aids, surfaces, suitable for the particular dosage form desired. Contains active ingredients, preservatives, solid binders, lubricants and the like. "Remington's Pharmaceutical Science", 15th edition, E.M. W. Martin (Mack Publishing Co. Easton PA 1975) discloses various media or carriers used to formulate pharmaceutical compositions, as well as well-known techniques for their manufacture. Any conventional carrier medium, for example, produces any undesirable biological effect or otherwise interacts in a deleterious manner with one or more of any other components of the pharmaceutical composition, Except insofar as they cannot coexist with the compounds of the present invention, their use is considered to be within the scope of the present invention.
[0022]
In the pharmaceutically used compositions of the present invention, the active agent comprises at least about 0.1% by weight and up to about 95% by weight, based on the total weight of the composition including the carrier medium and one or more of the adjuvants. Can be present in quantity. Preferably, the percentage of active agent will vary between about 1% and about 75% by weight of the composition. The compositions can be prepared using a pharmaceutical organic or inorganic solid or liquid carrier medium suitable for enteric or parenteral administration. Gelatin, lactose, starch, magnesium, stearate, talc, vegetable and animal fats and oils, gums, polyalkylene glycols or other well-known auxiliaries or diluents for pharmaceuticals are all suitable as carrier vehicles.
[0023]
The chemotherapeutic compositions described herein are preferably formulated in dosage unit form for ease of administration and uniformity of dosage. "Dosage unit form" as used herein refers to a physically discrete unit of a chemotherapeutic composition for the patient to be treated. Each dose, either on its own or in combination with a selected pharmaceutical carrier vehicle, should contain the amount of active ingredient calculated to produce the desired therapeutic effect. Typically, anthracyclines, including doxorubicin, will be administered in dosage units ranging from about 40 to about 200 mg of the agent, with a range of about 40-150 mg being preferred. Typically, taxanes, including 4-desacetyl-4-methylcarbonate taxol, are administered in dosage units ranging from about 50-380 mg of the agent, with a range of about 50-300 mg being preferred. The combination composition for chemotherapy of the present invention can be administered orally or parenterally by intramuscular injection, intraperitoneal injection, intravenous drip, or the like. Intravenous administration is particularly preferred. The chemotherapeutic compositions of the present invention are typically administered by intravenous infusion of varying duration, with infusions of 1 to 24 hours being preferred.
[0024]
The chemotherapeutic compositions of the present invention are administered at least once a month to achieve the desired therapeutic effect. In a preferred embodiment of the invention, the chemotherapeutic agent is administered sequentially by intravenous infusion, and doxorubicin is preferably administered first. Different intervals between administration of the compounds can be selected. These intervals range from about 30 minutes to 24 hours, with 1 hour being preferred.
[0025]
Biological studies of combination chemotherapy regimens have been performed on cardiac cell fractions. Surprisingly, it was found that 4-desacetyl-4-methylcarbonate taxol does not stimulate the production of cardiotoxic metabolites and by-products of doxorubicin upon incubation with anthracyclines in the cytosol of the human heart. . The test methods and results of these studies are set forth below.
[0026]
Reconstitution of DOX metabolism and DOXol formation with and without taxane in human heart cytosol
[0027]
Human myocardium is obtained from patients undergoing aortic-coronary artery bypass grafting. All samples were routinely processed by the surgeon from the outside of the right atrium removed during cannulation for cardio-pulmonary bypass. After storage at −80 ° C., a pool of 15-20 samples is processed for cytosol preparation by serial homogenization, ultracentrifugation and overnight 65% ammonium sulfate precipitation of 105000 g supernatant. Next, the cytosol was dialyzed against 100 mM Tris HCl-40 mM KCl pH 8.9, diluted to 3 mg protein / mL with the same buffer, and incubated with 100 mM dithiothreitol at room temperature for 15 minutes to allow cytoplasmic aconitase [ [4Fe-4S] promotes non-denaturing decomposition of clusters. This treatment is necessary because the reaction of DOXol with the [4Fe-4S] cluster may return this metabolite to DOX. Therefore, significant amounts of DOXol will remain undetected if they reacted with the [4Fe-4S] cluster prior to their assay. Unreacted dithiothreitol was then removed by gel filtration on a continuous (1.5 x 10 cm) Sepharose 6B column, protein reprecipitation with 65% ammonium sulfate, and extensive dialysis with 0.3 M NaCl, pH 7.0. Doxorubicin metabolism was reconstituted in a 0.5 mL incubation containing cytosol (0.15 mg protein), NADPH (100 μM) and DOX (25 μM) in 0.3 M NaCl (pH 7.0) at 37 ° C. Taxanes (1-50 μM) dissolved in ethanol were included as indicated. A portion of taxane-free ethanol (5 μL) was included as appropriate and adjusted to a final volume of 10 μL during all incubations. After 4 hours, DOX and DOXol were added to 2 mL of CHCl 3 / CH 3 Extracted with OH (1: 1) and used CHCl as mobile phase in both dimensions 3 / CH 3 OH / CH 3 COOH / H 2 Separation by two-dimensional TLC previously identified on (20 × 20 cm) 0.25 mM F524 silica gel plate using O (80: 20: 14: 6). Doxorubicinol is DOX NaBH 4 Identified by co-chromatography with (S) (R) -DOXol purified after reduction or (S) DOXol from Streptomyces peucetius. As indicated, incubations were prepared by replacing DOX with DOX aglycone and measuring the formation of DOXol aglycone. The latter has CHCl in the first and second dimensions, respectively. 3 / CH 3 OH / CH 3 COOH (100: 2: 5) and CH 3 COOC 2 H 5 -CH 3 CH 2 OH-CH 3 COOH-H 2 Separated from DOX aglycone by using O (80: 10: 5: 5). DOX aglycone was purified after heating acid hydrolysis of DOX.
[0028]
Reconstitution of DOX metabolism and free radical formation with or without taxane in human heart microsomes
[0029]
A 105,000 g pellet from a human myocardial homogenate was solubilized with deoxycholate and 0% with 0.3 M NaCl, pH 7.0, 10 μM DOX, 1-10 μM taxane and 0.1 mM NADPH in 37 ° C. Reconstitute at a final concentration of .025 mg prot / mL.
[0030]
Electron flow from NADPH cytochrome P-450 reductase to the quinone group of DOX is detected by monitoring NADPH oxidation. Redox coupling of semiquinone by oxygen is detected by monitoring the formation of superoxide anion radicals by superoxide dismutase-inhibitable reduction of cytochrome c (25 μM). These assays are performed on a Hewlett Packard 8453A UV / VIS / NIR spectrometer with computerized correction for skaters and turbidity.
[0031]
【Example】
Example 1 PTX and DCT Stimulate the Formation of Toxic Doxorubicin Metabolites Both PTX and DCT stimulate DOXol formation in human heart cytosol lacking [4Fe-4S]. As shown in FIG. 3, the concentration response curve is bell-shaped, suggesting that the taxane acts as an allosteric modulator of anthracycline reductase. The range of concentrations that allow stimuli tends to be wider in the case of PTX, but the maximal stimulation with the two taxanes is the same in this set of experiments. 4-desacetyl-4-methylcarbonate taxol did not stimulate DOXol formation at all of the concentrations tested.
[0032]
As shown in FIG. 4, PTX and DCT were also able to stimulate the conversion of DOX aglycone to DOXol aglycone. Also, the concentration response curves were bell-shaped and the two taxanes were almost identical for both the achievable stimulus and the range of concentrations that allowed this stimulus (panel A). 4-desacetyl-4-methylcarbonate taxol was found not to stimulate the formation of DOXol aglycone from DOX aglycone (Panel B).
[0033]
Example 2 Stimulation of NADPH oxidation by taxane
PTX and DCT were able to stimulate NADPH oxidation by human heart deoxycholate solubilized microsomes incubated with DOX. In this system, the concentration response curve was not bell-shaped, but the stimulus increased until it was flat (FIG. 5A). 4-Desacetyl-4-methylcarbonate taxol stimulated NADPH oxidation only at the highest concentration tested, but this was not statistically significant (FIG. 5B). None of the taxanes tested affected NADPH oxidation in the absence of DOX.
[0034]
As shown in FIG. 6, DOX can increase superoxide anion formation by deoxycholate solubilized microsomes and divert electrons from NADPH cytochrome P-450 reductase to molecular oxygen via reduction-oxidation of its quinone group. Matched ability. Mixing 10 μM PTX or DCT caused a significant increase in superoxide formation, consistent with the ability of these two taxanes to stimulate NADPH oxidation under similar conditions. Also, 4-desacetyl-4-methylcarbonate taxol did not produce any significant stimulation in these settings, consistent with no significant effect on NADPH oxidation.
[0035]
The results presented herein show that both PTX and DCT stimulate DOX metabolism in the human heart, leading to the formation of potentially cardiotoxic DOXol, DOXol aglycone, and oxygen free radicals such as superoxide anion. Indicates an increase. These findings provide a molecular correlation that explains the increased cardiotoxicity of the DOX-PTX combination, and that increased cardiotoxicity indicates that if the cumulative dose of DOX is about 360-400 mg / m 2 It suggests that higher increases would also occur after DOX-DCT formulation. In contrast, 4-desacetyl-4-methylcarbonate taxol appears to lack this effect on DOX metabolism. Thus, 4-desacetyl-4-methylcarbonate taxol provides an excellent taxane for use in chemotherapeutic regimens in combination with DOX.
[0036]
Certain preferred embodiments of the invention have been described and particularly exemplified above, but are not intended to limit the invention to these embodiments. Various changes may be made to the invention without departing from the scope and spirit of the following claims.
[0037]
[Non-patent document 1]
Gehl J, Boesgaard M, Paaske T, Vittrup Jensen B, Dumbernowsky P, Combined doxorubicin and pacificaxel advanced breathecancer edica: Ann Oncol 1996; 7: 687-93.
[0038]
[Non-patent document 2]
Gianni L, Munzone E, Capri G, Fulfaro F, Tarenzi E, Villani F et al. Paclitaxel by 3-hour infusion in combination with bolus doxorubicin in women with untreated metastatic breast cancer: high antitumor efficacy and cardiac effects in a dose-finding and sequence-finding study J Clin Oncol 1995; 13: 2688-99.
[0039]
[Non-Patent Document 3]
Gianni L, Dumbernowsky P, Sledge G, Amadori G, Martin M, Baynes R et al. Cardiac function following combination combination with Taxol7 and Doxorubicin for advanced breast cancer. Proc Annu Meet Am Soc Clin Oncol 1998; 17: 115a (abstract 444).
[0040]
[Non-patent document 4]
Nabholtz JM, Smylie M, Mackey JR, Noel D, Paterson AH, al-Tweigeri T et al. Docetaxel / doxorubicin / cyclophospamide in the treatment of metastatic breast cancer. Oncology 1997; 11 (Suppl 8): 37-41.
[0041]
[Non-Patent Document 5]
Olson RD, Muslin PS. Doxorubicin cardiotoxicity: analysis of prevailing hypotheses. FASEB J 1990; 4: 3076-86.
[0042]
[Non-Patent Document 6]
Minotti G, Cairo G, Monti E, Role of iron in anthracycline cardiotoxicity: new tunes for an old song? FASEB J 1999; 13: 199-212.
[0043]
[Non-Patent Document 7]
Bousek RJ Jr, Olson RD, Brenner DE, Ogumbuni ME, Inui M, Fleischer S. The major metabolite of doxorubicin in is a potent inhibitor of membrane-associated ion pumps: a correlating study of cardiatic musculature. J Biol Chem 1987; 262: 15851-56.
[0044]
[Non-Patent Document 8]
Minotti G, Recalacti S, Liberi G, Calafiore AM, Mancuso C, Preziosi Pet et al. The secondary alcohol metabolite of doxorubicin irreversible inactivates acontase / iron regulatory protein protein-1 infrasofraction fratomy radiation FASEB J 1998; 12: 541-51.
[0045]
[Non-Patent Document 9]
Minotii G, Cavaliere AF, Moderne A, Rossi M, Schiavello R, Zampaelli R. et al. Secondary alcohol metabolites mediate iron delocalization in cytosolic fractions of myocardial biopsies exposed to anticancer anthracies. J Clin Invest 1995; 95: 1595-1605.
[0046]
[Non-Patent Document 10]
Powis G, Free radical formation by antitumor quinones. Free Radic Biol Med 1989; 6: 63-101.
[Brief description of the drawings]
FIG.
1 is a schematic diagram showing the metabolic conversion of doxorubicin to toxic by-products.
FIG. 2
A shows the structure of paclitaxel (PTX). B shows the structure of docetaxel (DCT). C shows the structure of 4-desacetyl-4-methyl carbonate taxol.
FIG. 3
FIG. 4 is a graph showing that PTX and DCT stimulate DOXol formation in cardiac cytosol. 4-Desacetyl-4-methyl carbonate taxol did not stimulate DOXol production at the concentrations tested. * P = <0.05.
FIG. 4
A is a graph showing that PTX and DCT stimulate the conversion of doxorubicin (hereinafter DOX aglycone) to doxorubicinolone (hereinafter DOXol aglycone). B is a graph showing that 4-desacetyl-4-methylcarbonate taxol failed to stimulate this conversion. * P = <0.025 vs control.
FIG. 5
A is a graph showing that both PTX and DCT stimulate NADPH oxidation by deoxycholate solubilized microsomes isolated from human heart when incubated with DOX. B is a graph showing that 4-desacetyl-4-methylcarbonate taxol stimulated this oxidation only at the highest levels tested. * P = <0.05 vs control.
FIG. 6
FIG. 4 is a graph showing that DOX increases superoxide anion formation. Including 10 μM PTX or DCT significantly increased superoxide anion formation, but not 4-desacetyl-4-methylcarbonate taxol. * P = <0.025 vs. DOX; ** P = NS vs. DOX.
