JP2004524830A - 髄外脂肪組織細胞及び造血組織ならびに筋肉組織の再生のためのその使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、髄外脂肪組織の脈管支質の細胞画分由来細胞、その製造法、及び特に遺伝的又は後天的な血液病、筋障害ならびに心筋症の治療のための造血系及び心筋ならびに骨格筋組織の再生におけるその使用に関する。

Description

【０００１】
本発明は、髄外脂肪組織由来細胞、その調製方法、ならびに造血系の再生、特に遺伝的又は後天的な血液疾患（癌、化学療法、放射）の治療、ならびに心筋又は骨格筋の再生、特に筋障害、心筋症及び筋変性（心筋梗塞）に伴う疾患の治療のためのその用途に関する。
【０００２】
造血系再生のための既存の手段は、本質的に
− 骨髄移植、及び
− 造血組織から単離された幹細胞又は造血前駆体の移植
からなる。
これらの手段には、
− 骨髄移植は、適合性ドナーの存在に依存しており、レシピエントのリンパ球での移植の汚染に関連して、移植拒絶（移植片対宿主、つまりＧｖＨ反応）の割合が高いために、比較的効率が悪い；
− 精製された幹細胞又は造血前駆体（ＣＤ３４＋、Ｔｈｙ１＋、Ｌｉｎ⁻）の移植も適合性ドナーの存在に依存しており、移植拒絶に関する不首尾を回避することができる。しかし、これらの細胞の増殖能力は限られているので、効率的な移植のために十分な量の細胞を得ることが難しい
という欠点がある。
【０００３】
骨格筋組織を再生するために、骨格筋前駆体（衛星細胞）又は骨髄の使用が長期間にわたって構想されている。しかし、これらの細胞の増殖能力は限られているので、効率的な移植のために十分な量の細胞を得ることが難しい。
心筋組織（心筋層）の再生は、骨格筋と異なって、心臓は前駆体細胞のレザバーを有しないので、ごく最近になって構想されている。心筋層を再生するために、心臓にオートロガス衛星細胞を移植することが提案されている。しかし、この方法は、これらの移植された衛星細胞が心筋細胞と同一の収縮特性を有しない骨格筋細胞に分化する限り、十分ではない。
【０００４】
この結果、種々の造血系を再生でき、心筋と骨格筋を再生できる、従来技術の手段よりも効率的で使用が簡便な新規な手段、特に細胞に対する手段が実質的に求められている。
ある非造血組織の幹細胞は、致死量を照射したマウスの造血系の全て、つまり
− 造血幹細胞に特異的な、ＣＤ４５マーカー以外の全幹細胞（Ｓｃａ−１、ｃ−Ｋｉｔ）に共通のマーカー（Ｊａｃｋｓｏｎら、ＰＮＡＳ， １９９９， ９６， １４４８２−１４４８６），
− 又は、骨髄形態形成タンパク質型２ （ＢＭＰ２）のレセプター（Ｐａｎｇ， Ｂｌｏｏｄ， ２０００， ９５， １１０６−１１０８）
を発現する成体マウスの骨格筋由来の筋幹細胞、及び
成体マウスの脳由来の神経幹細胞（Ｂｊｏｒｎｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９９９， ２８３， ５３４−５３７）
を再生できることが最近、分かった。
【０００５】
同様に、心筋細胞を得るために、ヒトの胚細胞、骨髄間葉細胞又は内皮細胞を使用することが提案されている（Ｋｅｈａｔら、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．， ２００１， １０８， ４０７−４１４； Ｍｕｌｌｅｒら、ＦＡＳＥＢ Ｊ．， ２０００， １４， ２５４０−２５４８， Ｔｏｍａら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ， ２００２， １０５， ９３−９８； Ｌｉｅｃｈｔｙら、 Ｎａｔ． Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ２０００， １１， １２８２−１２８６； Ｃｏｎｄｏｒｅｌｌｉら、ＰＮＡＳ， ２００１， ９８， １０７３３−１０７３８； Ｗａｎｇら、Ｊ． Ｔｈｏｒａｃ． Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ． Ｓｕｒｇ ２００１， １２２， ６９９−７０５； Ｊａｃｋｓｏｎら、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．， ２００１， １０７， １３９５−１４０２）。
これらの結果を説明するために、２つの仮説が提唱されている： 胚細胞の全能性に近い幹細胞は、成体組織（脳、筋肉など）に存続し、種々の細胞型に分化できるであろうし、あるいはこれらの組織の他の分化された幹細胞は、極めて大きな可塑性を有し、脱分化され得るか、もしくは再プログラム化（分化転換）されるであろう。
【０００６】
これらの結果は、骨髄の機能不全（髄質形成不全）の治療、骨髄の腫瘍細胞（神経芽細胞腫）での汚染の治療、及び造血細胞の遺伝的異常の矯正（造血組織の遺伝的操作）に重要な因果関係を有する。これらの結果は、筋肉の機能不全（筋障害及び心筋症）及び筋肉の変性を伴う疾患（心筋梗塞）の治療にも因果関係を有する。
実際、この同一の個体から採取したオートロガスの神経組織又は筋組織を移植することによって、病気の成体個体の造血系の再生が構想される限り、幹細胞又は非造血組織前駆体の使用は、骨髄移植拒絶又は不十分なＣＤ３４細胞量に伴う問題を回避できるであろう。同様に、衛星細胞以外の幹細胞の使用は、骨髄細胞、胚細胞又は内皮細胞を移植することによって、心筋層を再生できるであろう。
【０００７】
しかし、実際上、造血系の効率的な再生及び上記の細胞由来の心筋ならびに骨格筋組織の再生は、サンプリングが技術的に難しく、利用できる組織が少量であるために、実行し難い。これらの技術的な難しさには、胚組織の使用に伴う倫理的な問題も付加される。
したがって、発明者らは、サンプリングしやすい組織から単離され、大量に入手可能な造血系及び筋組織を長期間持続して再生できる細胞を提供することを目的とした。
脂肪組織： 身体の主要貯蔵器官を占める白色脂肪組織、発熱褐色脂肪組織、及び正確な役割が知られていない髄質脂肪組織は、哺乳動物に種々の形態で存在する。
【０００８】
この脂肪組織は、２つの細胞分画からなる：
− 分化した脂肪細胞からなる脂肪細胞分画： 脂肪組織細胞の３０〜６０％を占める未熟脂肪細胞（小さな脂肪細胞）と成熟脂肪細胞。この細胞分画は、トリグリセリドの蓄積と後期ならびに極めて後期のマーカー、例えばＧＰＤＨ （グリセロール−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ）の発現によって特徴付けられる、及び
− 幾つかの血液細胞、内皮細胞、血管周囲細胞、線維芽細胞及び脂肪細胞前駆体、特に細胞質に脂質がないことと初期マーカー、例えばコラーゲンＶＩ （Ａ２ＣＯＬ６／ｐＯｂ２４）とリポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）のα２鎖の発現によって特徴付けられる脂肪前駆細胞からなる、支質の脈管分画と称される非−脂肪細胞分画。
【０００９】
これらの２つの細胞分画は、Ｂｊｏｒｎｔｏｒｐら（Ｊ． Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．， １９７８， １９， ３１６−３２４）に記載されるような方法にしたがって、密度の相違によって分離できる。
したがって、脂肪細胞の分画は、多能性幹細胞→脂肪細胞前駆体つまり脂肪前駆細胞→未熟脂肪細胞→成熟脂肪細胞のように概略的に示される。
極めて初期の前駆体、つまり脂肪細胞と筋細胞のような種々の間葉細胞型を発生できる多能性幹細胞は、同定されていない。しかし、間葉細胞系は脂肪細胞、軟骨細胞又は線維芽細胞に自発的に（奇形癌系Ｔ９８４）又は５−アザシチジン（１０Ｔ１／２、３Ｔ３、ＣＨＥＦ−１８）での処理後に分化できることが示されている。
【００１０】
脂肪細胞前駆体は、これらの系（クローン系１２４６）、マウス胚（３Ｔ３−Ｌ１、３Ｔ３−Ｆ４４２Ａ、Ａ３１Ｔ、ＴＡ１）又はハムスター胚（ＣＨＥＦ−１８）あるいは成体マウス（Ｏｂ１７、ＨＦＧｕ、ＢＦＣ−１、ＳＴ１３、ＭＳ３−２Ａ、ＭＣ ３ｔ３−Ｇ２／ＰＡ６）からクローンされている。これらの脂肪細胞前駆体は、インビトロ又はインビボで脂肪細胞に分化できる（Ａｉｌｈａｕｄら、Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｎｕｔｒ．， １９９２， １２， ２０７−２３３）。
【００１１】
さらに、先の研究（Ｃｏｕｓｉｎら、Ｔｈｅ ＦＡＳＥＢ Ｊｏｕｒｎａｌ， １９９９， １３， ３０５−３１２）では、肥満と炎症反応における脂肪細胞とマクロファージとの関係に関心をもった発明者は、脂肪前駆細胞（支質−脈管分画由来の一次培養、つまり３Ｔ３−Ｌ１系）がマクロファージのように食作用活性を有すること、及び単球−マクロファージに特異的なＭＯＭＡ−２マーカーが脂肪前駆細胞及び脂肪細胞によっても発現されることを示した。しかし、脂肪前駆細胞がマクロファージと異なることは文献から明らかであり、従来技術を用いる限り、成熟マクロファージに特異的なＦ４／８０ 及びＭａｃ１ マーカーの存在を、これらの細胞表面で検出することはできない。
【００１２】
脂肪組織は、個体の生存のあいだ持続する再生の可能性を有しており、種々の脂肪の沈着物内に脂肪前駆細胞群を維持しながら結合している。実際、所定の沈着物に存在する脂肪細胞数は、生理学的又は生理病理学的な条件にしたがってかなりの割合で変化し得る。
この結果、ヒト又は高齢ですらある成体、齧歯動物で、分化の初期マーカー（Ａ２ＣＯＬ６／ｐＯｂ２４、ＬＰＬ、ＩＦＧ−１など）を発現する脂肪前駆細胞を高い割合で含む脂肪組織の支質−脈管分画の細胞がインビトロで増殖でき、脂肪細胞に分化できることが示された（Ａｉｌｈａｕｄら、１９９２， 上記）。
【００１３】
したがって、脂肪組織の支質−脈管分画由来多能性幹細胞を、造血系、ならびに神経組織及び肝臓組織（国際出願ＷＯ ０１／６２９０１）又は筋肉、骨ならびに軟骨組織（Ｚｕｋら、Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ．， ２００１， ７， ２０， ２１１−２２８）の再生に使用することが提案されている。しかし、これらの書類に記載される手段は、造血活性、筋活性、神経活性又は肝臓活性を再生できる機能細胞に効率的に分化できるような幹細胞を単離できない。
意外なことに、本発明者らは、髄外脂肪組織の支質−脈管分画（又は脈管支質の細胞分画）の細胞が、造血系ならびに心筋細胞に効率的に分化できることをここに示した； このような細胞は、哺乳動物、特に致死量を照射したマウスで造血系を再生でき、特に心臓の事象後の梗塞領域に移植すると、機能的な心臓を再生できる。
【００１４】
この結果、本発明の対象は、医薬品としての髄外脂肪組織の脈管支質（ｖａｓｃｕｌａｒ ｓｔｒｏｍａ）の細胞分画である； 実際、この分画は、意外なことに、造血系を再生でき、心筋組織（心筋層）を再生することができる。
また、本発明の対象は、誘導されるか又は構成的な髄質の涸渇が認められる疾患、例えば悪性血液疾患、骨髄腫瘍、遺伝的又は後天的原因の血液疾患、又は照射もしくは化学療法後の疾患の治療用医薬品を製造するための該分画の使用である。
また、本発明の対象は、遺伝的又は後天的原因の筋障害及び心筋症、ならびに筋肉変性を伴う（誘導されるか又は構成的な）病理的症状、例えば心筋梗塞の治療用医薬品を製造するための該分画の使用である。
【００１５】
実際、髄外脂肪組織の支質−脈管分画の細胞は、単球／マクロファージ、多核好塩基球、好酸球及び好中球、血小板及び赤血球を生じる骨髄系及び／又はＴリンパ球とＢリンパ球を生じるリンパ球系を再生できる。これらの細胞は、収縮活性を示す機能的な心筋細胞にも分化できる。
本発明によれば、脈管支質の細胞分画は、特にＢｊｏｒｎｔｏｒｐら（上記）によって記載されるプロトコルにしたがって密度の相違により単離される。
【００１６】
また、本発明の対象は、髄外脂肪組織の脈管支質の細胞分画から単離されることを特徴とする、造血系を再生し得る単離かつ精製された細胞である。
本発明の対象は、髄外脂肪組織の脈管支質の細胞分画から単離されることを特徴とする、心筋細胞に分化できる単離かつ精製された細胞でもある。
【００１７】
細胞の有利な具体例によれば、細胞は、
− 髄外脂肪組織の試料を採取し、
− 好ましくは細胞外マトリクスをタンパク質分解酵素で消化し、特に密度の相違により物理的に分離して、脈管支質の細胞分画を単離し、かつ
− 物理的分離及び／又は免疫選択によって細胞を精製する
連続工程によって得ることができる。
【００１８】
有利には：
− 物理的分離は、適当な固体支持体への付着の相違又は密度の相違（適当な勾配での遠心分離、懸濁分離）によって行われ、
− 免疫選択は、脂肪細胞、造血又は心筋細胞前駆体によって発現されるマーカーに特異的な少なくとも１つの抗体を用いて（ポジティブ選択）、及び／又は当業者にそれ自体公知の該前駆体にないマーカーに特異的な少なくとも１つの抗体を用いて（ネガティブ選択）行われる。
この具体例の有利なアレンジによれば、精製工程は、適当な成長因子及び／又はサイトカインを含む半固形培地で細胞を培養する追加工程によって先行される。
【００１９】
非限定的な例では、ウシ胎児血清、ウシ血清、インスリン、トランスフェリン、ＳＣＦ（幹細胞因子）、ＩＬ３及びＩＬ６を補足したメチルセルロースを含む媒体が挙げられる。
造血系を再生可能な該細胞の別の有利な具体例によれば、それらは、脂肪細胞幹細胞又は前駆体用の少なくとも１つのマーカー及び／又は造血幹細胞又は前駆体用の少なくとも１つのマーカーを発現する。
心筋細胞に分化可能な該細胞の別の有利な具体例によれば、それらは、脂肪細胞幹細胞又は前駆体用の少なくとも１つのマーカー及び／又は心筋細胞幹細胞又は前駆体用の少なくとも１つのマーカーを発現する。
【００２０】
本発明に関連して、幹細胞と前駆体は、クローンの増殖と組織分化の性質を有する多能性細胞に相当し、これらの２つの用語は等価であると考えられる。
造血系を再生可能な細胞と心筋細胞に分化可能な細胞のこの具体例の有利なアレンジによれば、脂肪細胞前駆体用のマーカーは、Ａ２ＣＯＬ６／ｐＯｂ２４、ＬＰＬ 及びＰｒｅｆ−１からなる群から選択される。
造血系を再生可能な細胞のこの具体例の別の有利なアレンジによれば、造血幹細胞又は前駆体用のマーカーは、ＣＤ３４、ＣＤ４５、Ｔｈｙ−１、 Ｓｃａ−１、ＣＤ１１７ 及びＣＤ３８からなる群から選択される。
心筋細胞に分化可能な細胞のこの具体例のさらに別の有利なアレンジによれば、心筋細胞前駆体用のマーカーは、α−アクチニンとＧＡＴＡ−４因子からなる群から選択される。
【００２１】
本発明によれば造血系を再生可能な細胞は、特に少なくともＡ２ＣＯＬ６／ｐＯｂ２４、ＣＤ３４及びＣＤ４５を発現する細胞からなる。
好ましくは、上記細胞は、ヒト由来である。
また、本発明の対象は、遺伝的に修飾された上記の細胞からなることを特徴とする、修飾細胞である。
修飾細胞の有利な具体例によれば、それらはオートロガス遺伝子について少なくとも１つの変異を含む。
本発明の目的のため、表現「遺伝子の変異」は、遺伝子について少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、欠失又は置換を意味することを意図する。
例えば、細胞のＭＨＣ遺伝子を、異種の移植を可能にするために変異することができる。
【００２２】
修飾細胞の別の具体例によれば、細胞は、異種遺伝子、特に治療上の関心がある遺伝子の少なくとも１つのコピーを含む。有利には、該遺伝子産物は、修飾細胞によって分泌される。
例えば、細胞は、インターロイキン又は血液凝固に作用する因子を発現する。
本発明によれば、修飾細胞は、当業者にそれ自体公知の技術にしたがって得られる； 特に、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， （１９９０−２０００）， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ に記載される、相同的組換え、組換えウイルス（レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス又はアデノウイルス−関連ウイルス（ＡＡＶ））のような組換えベクターでの感染又は組換えプラスミドでのトランスフェクションが挙げられる。組換えベクターの性質によって、対象の異種遺伝子は細胞のゲノムに組み込まれるか、でなければ染色体外形態で存在する。
【００２３】
好ましくは、上記の修飾細胞は、ヒト由来である。
また、本発明の対象は、上記のヒト細胞由来の不死化細胞系である。
本発明によれば、不死化細胞系は、Ｇｒｅｅｎら、Ｃｅｌｌ， １９７４， ３， １２７−１３３に記載されるように連続継代で得られる。
本発明の対象は、造血系を再生可能な（単離及び／又は修飾）細胞又は上記のこれらの細胞由来の系と、少なくとも１つの医薬的に許容される賦形剤からなることを特徴とする、造血系の再生用医薬品である。
有利には、該医薬品は、非経口的に、好ましくは静脈内に投与される。
【００２４】
本発明の対象は、心筋細胞に分化できる（単離及び／又は修飾）細胞又は上記のこれらの細胞由来の系と、少なくとも１つの医薬的に許容される賦形剤とからなることを特徴とする、心筋層再生用医薬品である。
有利には、該医薬品は、病変部位に局所的に投与される。
本発明の対象は、誘導されるか又は構成的な髄質の涸渇が認められる疾患の治療用医薬品を製造するための、造血系、さもなければ上記の修飾細胞又はこれらの細胞由来の系に分化できる細胞の使用である。
【００２５】
本発明の対象は、心筋症と心筋変性が認められる疾患の治療用医薬品を製造するための、心筋細胞に分化できる細胞、さもなければ上記の修飾細胞又はこれらの細胞由来の系の使用でもある。
また、本発明の対象は、心臓活性を調節（活性化又は阻害）できる分子をスクリーニングするための、心筋細胞に分化できる細胞、さもなければ上記の修飾細胞又はこれらの細胞由来の系の使用である。
また、本発明の対象は、造血活性を調節（活性化又は阻害）できる分子をスクリーニングするための、造血系に分化できる細胞、さもなければ上記の修飾細胞又はこれらの細胞由来の系の使用である。
【００２６】
また、本発明の対象は、少なくとも
ａ_１） 髄外脂肪組織の試料を採取し、
ｂ_１） 好ましくは細胞外マトリクスをタンパク質分解酵素で消化し、物理的に分離することによって、脈管支質の細胞分画を単離し、かつ
ｃ_１） 物理的分離及び／又は免疫選択によって細胞を精製する
工程からなることを特徴とする、上記の造血系を再生可能な単離かつ精製された細胞の調製法である。
また、本発明の対象は、少なくとも
ａ_２） 髄外脂肪組織の試料を採取し、
ｂ_２） 好ましくは細胞外マトリクスをタンパク質分解酵素で消化し、物理的に分離することによって、脈管支質の細胞分画を単離し、かつ
ｃ_２） 物理的分離及び／又は免疫選択によって細胞を精製する
工程からなることを特徴とする、上記の心筋細胞に分化可能な単離かつ精製された細胞の調製法である。
【００２７】
この方法の有利な具体例によれば、工程ｃ_１又はｃ_２に先立って、適当な成長因子及び／又はサイトカインを含む半固形培地で細胞を培養する追加工程が含まれる。
また、本発明の対象は、少なくとも
ａ_３） 髄外脂肪組織の試料を採取し、
ｂ_３） 好ましくは細胞外マトリクスをタンパク質分解酵素で消化し、物理的に分離することによって、脈管支質の細胞分画を単離し、かつ
ｃ_３） 適当な成長因子及び／又はサイトカインを含む半固形培地で細胞を培養し、かつ
ｄ_３） 物理的分離及び／又は免疫選択によって細胞を精製する
工程からなることを特徴とする、骨格筋細胞に分化可能な単離かつ精製された細胞の調製法である。
【００２８】
方法の有利な具体例によれば、インビトロでの細胞の増殖について追加工程ｄ_１）、ｄ_２） 又はｅ_３） が含まれる。
有利には、物理的分離は、固体支持体への付着の相違、又は密度の相違によって行われ、免疫選択は、該細胞によって発現されるマーカーに特異的な少なくとも１つの抗体を用いて（ポジティブ選択）及び／又は上記の該細胞にはないマーカーに特異的な少なくとも１つの抗体を用いて（ネガティブ選択）行われる。
【００２９】
有利には、本発明による単離かつ精製された細胞の得るための方法を実施するために、
− 容易に入手可能な脂肪沈着物、例えば皮下脂肪沈着物から試料を採取でき（工程ａ_１、ａ_２又はａ_３）、
− 特にＢｊｏｒｎｔｏｒｐら（上記）に記載のプロトコルにしたがって、脈管支質の細胞分画を密度の相違によって単離し（工程ｂ_１、ｂ_２又はｂ_３）、
− 適当な成長因子及び／又はサイトカインを含む半固形培地中での細胞の培養（追加工程又は工程ｃ_３）を、ウシ胎児血清、ウシ血清、インスリン、トランスフェリン、ＳＣＦ、ＩＬ３及びＩＬ６を補充したメチルセルロースを含む培地中で行い、
【００３０】
− 細胞の精製（工程ｃ_１、ｃ_２又はｄ_３）を、いずれかの適当な支持体での分離（付着の相違）によって、さもなければ、適当な勾配での遠心分離もしくは懸濁分離（密度の相違）、又は従来の免疫細胞化学技術、特に、例えばＣｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， （Ｊｏｈｎ Ｅ． Ｃｏｌｉｇａｎ， ２０００， Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ ｓｏｎ Ｉｎｃ， Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ， ＵＳＡ）に記載されるようなフローサイトメトリーによるか、あるいは磁気ビーズを用いる免疫標識細胞の（ポジティブ又はネガティブな）分類技術による免疫選択によって、行う； 該細胞によって発現されるマーカーに特異的な少なくとも１つの抗体（ポジティブ選択）及び／又は上記の細胞にはないマーカーに特異的な少なくとも１つの抗体（ネガティブ選択）は、細胞分類に用いられる；
− インビトロでの細胞の増殖（工程ｄ_１、ｄ_２又はｅ_３）は、適当な培養培地、例えば非制限的にはウシ胎児血清又は植物代用血清を含む ＤＭＥＭ Ｆ１２ 培地で行われる。
【００３１】
造血系の再生又は心筋ならびに骨格筋組織の再生のための既存の手段に比較して、上記の細胞分画と単離された細胞、またそれらの調製方法は、以下の利点を有する：
・ 技術上の利点
− サンプリングの容易性、
− 同種又は異種の移植に好ましい、採取された細胞の潜在的な増殖を伴う極めて大量の組織と細胞、
− 同種又は異種の移植に好ましい、所定培地中でのインビトロの細胞の維持、増殖又は不死化すらもの可能性、
− １個体〜数個体の血液集団及び／又は筋組織の再生の可能性、
− 凍結した細胞の維持の可能性、
− トランスフェクト可能な細胞、
− 治療上の関心があるタンパク質の放出に使用されうる高度な分泌能を有する細胞、
− 心筋又は骨格筋の活性もしくは造血活性を調節し得る大量の治療分子のインビトロのスクリーニングに適した細胞。
【００３２】
・ 経済上の利点
− 入院期間の短縮（条件づけ又は血球アフェレーシスの不要）。
・ 倫理的な利点
− 比較的非侵襲性のサンプリング、
− 胚組織の不使用。
上記のほかに、本発明は、本発明の対象である方法の実施例及び添付図面に言及する以下の記載から明らかになるであろう他のアレンジをも包含する。
【００３３】
− 図１は、髄外脂肪組織又は骨髄細胞（対照）の脈管支質細胞の注入によって得られる造血系の再生を示す。図１Ａは、（ｘ−軸に沿って）照射後１０週間にわたる、（ｙ−軸に沿って）致死量照射したマウスの生存割合を示すカプラン−マイヤー（Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ）グラフである。非再生の照射マウスを円で示し、骨髄細胞を移植したマウスを四角で示し、脈管支質細胞を移植したマウスを三角で示す。各群は、初期数１０〜１５匹のマウスからなる。図１Ｂと１Ｃは、それぞれ骨髄細胞（黒色）又は脂肪組織の脈管支質細胞（白色）で再生した照射マウスの血小板と白血球の数を示す。結果は非照射対照の値に対する％として示し、示した値は５〜１５匹のマウスの群について得られる平均±標準偏差を示す。
【００３４】
− 図２は、骨髄細胞又は脈管支質細胞の移植から１０週間後に行った、再生したメスのマウスにおける脾臓（上のパネル）と血液（下のパネル）でのＹ染色体に特異的なｓｒｙ遺伝子のＰＣＲによる検出を示す。上のパネル： ＰＣＲは、脾臓ＤＮＡの５０ ｎｇ （ライン１、５及び６）又は１５０ ｎｇ （ライン２〜４）について行う。７２２ ｂｐの産物が、オスのマウス由来の骨髄細胞（ライン１）又は脈管支質細胞（ライン２〜４）で再生したマウスで検出される。対照のメスのマウスには、シグナルが認められない（ライン５）。オスのマウス由来の血液試料を、陽性対照として用いる（ライン６）。分子量マーカーを、基準（ＭＷ）として示す。下のパネル： ＰＣＲは、５０ ｎｇの血液ＤＮＡについて行う。７２２ ｂｐの産物が、オスのマウス由来の骨髄細胞（ライン５）又は脈管支質細胞（ライン３−４）で再生した動物で検出される。対照のメスのマウスには、シグナルは検出されない （ライン２）。オスのマウス由来の血液試料を、陽性対照として用いる（ライン１）。分子量マーカーを、基準（ＭＷ）として示す。
【００３５】
− 図３は、オスのＣ５７Ｂｌ／６ マウスの脈管支質細胞のフローサイトメトリーによる分析を示す。パネル１： 領域Ｒ１は、ｘ−軸に沿った粒径パラメータ（ＦＳＣ： 前方散在（ｆｏｒｗａｒｄｓ ｓｃａｔｔｅｒ））、及びｙ−軸に沿ったサイズパラメータ（ＳＳＣ： 側方散在）の関数として、分析用に選択した細胞群に相当する。パネル ２： （ｙ−軸に沿った）細胞のサイズの関数としての（ｘ−軸に沿った）脂肪前駆細胞に特異的なＡ２ＣＯＬ６抗原に陽性の細胞の分布。 パネル３ 及び４： 脂肪前駆細胞−特異的な抗原（Ａ２ＣＯＬ６）及び造血幹細胞に特異的な２つの抗原（ＣＤ４５及びＣＤ３４）に対する三重標識を示す。パネル３は、ＣＤ４５^＋ 細胞群における（ｘ−軸に沿った）Ａ２ＣＯＬ６^＋ と（ｙ−軸に沿った）ＣＤ３４^＋の分布を示す。パネル４は、ＣＤ３４^＋細胞群における（ｘ−軸に沿った）Ａ２ＣＯＬ６^＋ と（ｙ−軸に沿った）ＣＤ４５^＋の分布を示す。
【００３６】
− 図４は、脂肪前駆細胞系３Ｔ３−Ｌ１又は骨髄細胞（対照）の注入によって得られる造血系の再生を示す。図１Ａは、（ｘ−軸に沿って）照射から１０週間にわたる、（ｙ−軸に沿って）致死量照射したマウスの生存割合を示すカプラン−マイヤーグラフである。非−再生の照射マウスは円で示し、骨髄細胞を移植したマウスは四角で示し、３Ｔ３−Ｌ１脂肪前駆細胞系を移植したマウスは三角で示す。各群は、初期数１０〜１５匹のマウスからなる。図４Ｂと４Ｃは、それぞれ骨髄細胞（白色）又は３Ｔ３−Ｌ１脂肪前駆細胞系（黒色）で再生した照射マウスにおける血小板と白血球の数を示している。結果は、非照射対照の値に対する％として示し、示した値は、５〜１５匹のマウスの群について得られる平均±標準偏差を示す。
【００３７】
− 図５は、本発明の方法によれば、髄外脂肪組織の脈管支質から単離される細胞の心筋ならびに骨格筋細胞への分化の免疫細胞化学による分析を示す。上のパネル： 分化した心筋細胞と分化した骨格筋細胞の存在は、抗−α−アクチニン抗体を用いて特異的に検出される（左パネル）； 比較として、ネガティブの対照では、抗−α−アクチニン抗体の不在下では標識は認められない（右パネル）。下のパネル： 分化した骨格筋細胞の存在は、ミオシンのラピッドイソ型（ｒａｐｉｄ ｉｓｏｆｏｒｍ）に対する抗体を用いて特異的に検出される（左パネル）； 比較として、ネガティブの対照では、α−ミオシンのラピッドイソ型に対する抗体の不在下では標識は認められない（右パネル）。
【００３８】
実施例 １： 材料と方法
１） 骨髄細胞の単離
骨髄細胞を６週齢のオスのＣ５７Ｂ１／６マウスの大腿骨から単離する； 赤血球細胞を、９％の塩化アンモニウム水溶液での処理によって除き、次いで細胞を６００ ｇで１０分間遠心分離し、ＰＢＳに再懸濁して、計測し、注入する。
２） 脈管支質細胞 （ 支質 − 脈管画分、つまり ＳＶＦ） の単離
上記のＢｊｏｒｎｔｏｒｐらにより記載されるプロトコルにしたがって、細胞を単離する。より正確には、鼠蹊部の脂肪組織を６週齢のオスのＣ５７Ｂｌ／６マウスから採取し、０．２％ のＢＳＡと２ ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼを含むＰＢＳ緩衝液中で ４５分のあいだ３７℃で消化する。消化生成物を１００〜２５μｍのろ紙で連続的に濾過し、次いで１０分のあいだ８００ ｇで遠心分離する； こうして単離した支質細胞をＰＢＳ緩衝液に再懸濁し、次いで計測し、移植実験又は免疫分析に用いる。
【００３９】
３） 脂肪前駆細胞系の培養
マウスの脂肪前駆細胞系３Ｔ３−Ｌ１ （ＡＴＣＣ基準系ＣＬ−１７３）を、１０％の熱不活化ウシ胎児血清と２ ｍＭのＬ−グルタミンを含むＤＭＥＭ 培地で培養する。集密した３Ｔ３−Ｌ１細胞培養物をトリプシン処理で回収し、計測し、移植実験又は免疫分析に用いる。
４） 細胞 （ 骨髄、脈管支質及び ３Ｔ３−Ｌ１ 系 ） の移植
移植当日に、８〜１０週齢のメスのＣ５７Ｂｌ／６マウスを単一用量で致死的に１０ Ｇｙで照射し、次いで尾部静脈又は腹膜内の静脈内に４００μｌ用量中の５×１０^６〜１０^７ 個の細胞を注入する。マウスに酸性化水とオートクレーブに付した食物を与える。動物は、動物実験に関する指示にしたがって扱う。
５） 血液分析
移植から４、８又は１０週後に、２００μｌの末梢血液試料を、移植を行ったマウスの眼窩後部叢から採取し、すぐにヘパリンを含む管に移す。非照射マウスから採取した末梢血液試料をポジティブ対照として用い、非再生の照射マウスから採取した末梢血液試料をネガティブ対照として用いる。全血液細胞の計測と種々の核細胞の割合は、血液分析装置で自動的に行う。
【００４０】
６） ポリマー鎖反応 （ＰＣＲ） による分析
Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， （１９９０−２０００）， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載される従来技術にしたがって、移植から１０週間後に、造血組織（骨髄、脾臓、胸腺、肝臓）と血液の細胞から全ゲノムＤＮＡを抽出する。ＤＮＡ試料を、上記のＰａｎｇらに記載されるプロトコルにしたがって、Ｙ染色体に特異的なｓｒｙ遺伝子用の各プライマー２０ ｐｍｏｌを含む５０μｌの容量に増幅する。
骨髄細胞又は脈管支質細胞を移植したマウスのＤＮＡから、ｓｒｙ遺伝子の２５６〜９７８位置に相当する７２２ ｂｐのフラグメントが得られる。
３Ｔ３−Ｌ１ 系を移植したマウスのＤＮＡから、ｓｒｙ遺伝子に相当しないが、そのプロフィルがこれらの細胞に特異的な種々のフラグメントを得る。
各増幅系について、オスとメスのマウスから得られる試料を、それぞれポジティブ及びネガティブの対照として用いる。
【００４１】
７） 免疫化学分析
実施例１．２に記載されるようにして単離した懸濁液中の細胞を、最初の抗体、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ緩衝液に希釈したビオチン（Ｃｌｉｎｉｓｃｉｅｎｃｅｓ）に結合した抗−ＣＤ３４又は抗−ＣＤ４５（Ｃｌｉｎｉｓｃｉｅｎｃｅｓ）とインキュベートする。洗浄し、遠心分離した後に、上記のＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙに記載される従来のプロトコルにしたがって、二次抗体［フルオレセインイソチオシアネートに結合した抗−マウス免疫グロブリン（Ａ２ＣＯＬ６）、テキサスレッドに結合した抗−ラット免疫グロブリン（ＣＤ４５）］及びＣｙ−クローム（ｃｈｒｏｍｅ）に結合したストレプトアビジンそれぞれと細胞をインキュベートする。０．０３７％パラホルムアルデヒド含有ＰＢＳ緩衝液に細胞を固定し、フローサイトメトリーで分析するか、あるいは、遠心分離によりカバースリップに固定し、蛍光顕微鏡で観察する。
【００４２】
８） 造血器官の分化
短期の造血始原細胞（ｓｈｏｒｔ−ｔｅｒｍ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）又は前駆体を、実施例１．４に記載されるプロトコルにしたがって致死量照射し、次いで移植したメスのＣ５７ Ｂｌ／６ マウスの造血組織を用いて分析する。
長期の造血始原細胞又は前駆体を、実施例１．４に記載されるプロトコルにしたがって４ Ｇｙの非致死量を照射し、次いで移植したＳＣＩＤマウスの造血組織を用いて分析する。
ａ） リンパ系
胸腺リンパ球（リンパ球前駆体）を、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ （Ｊｏｈｎ Ｅ． Ｃｏｌｉｇａｎ， ２０００， Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎ Ｉｎｃ， Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ， ＵＳＡ）に記載の従来技術にしたがって移植したメスのマウスの胸腺から精製する。次いで、全ゲノム ＤＮＡを胸腺リンパ球から抽出し、実施例１．６に記載されるように増幅する。
【００４３】
ｂ） 骨髄系
移植したマウス由来の骨髄及び脾臓細胞の抽出物を、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ （Ｊｏｈｎ Ｅ． Ｃｏｌｉｇａｎ， ２０００， Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎ Ｉｎｃ， Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ， ＵＳＡ）に記載される従来技術を用いて調製し、次いで製造者の指示に従って、１％ メチルセルロース、１５％ウシ胎児血清、１％ ウシ血清、１０μｇ／ｍｌヒトインシュリン、２００μｇ／ｍｌトランスフェリン、１０^−４ Ｍ メルカプトエタノール、２ ｍＭ Ｌ−グルタミン、５０ ｎｇ／ｍｌ 組換えマウスＳＣＦ、１０ ｎｇ／ｍｌ 組換えマウスＩＬ３及び１０ ｎｇ／ｍｌ組換えヒトＩＬ６を含む培地（培地ＭＥＴＨＯＣＵＬＴＴＭ ＧＦ Ｍ３５３４， ＳＴＥＭ ＣＥＬＬ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ ＩＮＣ），に細胞を播種する。
【００４４】
９） 筋肉の分化
実施例１．２に記載されるようにして単離した脈管支質細胞を、上記のメチルセルロースベースの半固形培地で培養する（実施例１．８）。
心筋細胞と骨格筋細胞を、製造者の指示に従って特異的な抗体（クローンＥＡ−５３， ＳＩＧＭＡ）を用いて顕示されるα−アクチニンの発現で検出する。
骨格筋細胞は、製造者の指示にしたがって特異的な抗体（クローンＭＹ−３２， ＳＩＧＭＡ）を用いて顕示されるミオシンイソ型（ラピッドイソ型）の重鎖の発現によって特異的に検出される。
【００４５】
また、心筋細胞は、ムスカリンのアセチルコリンレセプター（それぞれそれぞれカルバミルコリンとアトロピン）又はβ−アドレナリン作動性レセプター（それぞれイソプロテレノール及びプロプラノロール）のアゴニストもしくはアンタゴニストの存在又は不在下の自発収縮活性によって検出される。
より正確には、カルバミルコリン（２ μＭ）、アトロピン（１０μＭ）、イソプロテレノール（１０μＭ）又はプロプラノロール（４０μＭ）を含む１ ｍｌの ＤＭＥＭ培地を、メチルセルロースベースの培地に加える。分子の拡散に必要な５分間のインキュベート後、過剰量の緩衝液を除き、細胞の収縮を、１分間顕微鏡下で計測する。
【００４６】
実施例 ２： 致死量を照射したメスのマウスにおける、骨髄細胞（対照）又は脈管支質細胞由来の造血系の再生
レシピエントのマウスを照射し、次いで実施例１に記載のプロトコルにしたがって、脈管支質細胞、さもなければ骨髄細胞（対照）を用いて腹膜内に移植する。
１） 照射動物の生存
図１Ａは、造血系の長期持続再生を評価するための、照射から１０週間後に分析した動物の生存を示す。認められた結果は、照射から３週間以内に非再生マウスが死亡することを示している。他方、脈管支質細胞あるいは骨髄細胞で移植した動物のうち４０％の生存が認められる。致死量の照射は内因性造血前駆体の大部分を排除するので、認められた結果は、再生した動物の生存が移植細胞に関連していることを示している。
【００４７】
２） 造血系の分析
図１Ｂと１Ｃは、非照射対照の値に関連する％として示される、種々の造血系の再生を示している。
非再生マウスでは、血小板数は、１週間で急速に５５１×１０^３個の血小板／μｌの初期値から１４５±６×１０^３個の血小板／μｌの値に低下する。他方、脈管支質細胞又は骨髄細胞で移植したマウスでは、血小板数は徐々に増して、４週間で有意な値に達し、１０週では対照の値にほとんど等しい（図１Ｃ）。
脈管支質細胞で再生したマウスでは、白血球は、照射から１週間後にはほぼ検出できず、７週間後には、対照と同一の値に戻る。
【００４８】
図１Ｂと１Ｃは、血小板と白血球の数の回復が、骨髄細胞で再生したマウスでより迅速であることも示している。
白血球群の分析は、骨髄細胞又は脈管支質細胞で再生したマウスでは、白血球、単球及び顆粒球の割合が非照射の対照マウスの割合に等しいことを示している。
したがって、これらの結果は、脈管支質細胞の腹膜内注入によって、致死量を照射したマウスを生きながらえさせることができ、等しい数の骨髄細胞で認められるものに匹敵する効率で、但し、数週間の遅延を伴って、骨髄とリンパ系を再生できることを立証している。
【００４９】
３） レシピエントのマウスにおける移植細胞の立証
造血組織における注入細胞由来のオスの細胞の存在と再生したメスのマウスの血液を、Ｙ染色体に特異的なｓｒｙ遺伝子用プライマーを用いてＰＣＲにより分析した。
非再生マウスの群又は対照のメスのマウスの群では、オスの細胞は検出されない。
【００５０】
他方、ｓｒｙ遺伝子に特異的な７２２ ｂｐの産物は、造血組織（骨髄、胸腺、脾臓）とオスのマウス由来の骨髄細胞を注入したマウスの血液に極めて大量に存在する（図２）。同一サイズの生成物は、造血組織（骨髄、胸腺、脾臓）とオスのマウス由来の脈管支質細胞の移植から１０週間後のメスのマウスの血液にも認められる（図２）。
したがって、図２に示す結果は、脈管支質の幾つかの細胞が、腹膜腔から造血部位への移動能、増殖能及び循環血液細胞への分化能を有し、この結果、致死量を照射したマウスで機能的な造血を再生できることを示している。
【００５１】
４） 造血分化分析
ｓｒｙ遺伝子は、オスのマウス由来の脂肪組織の脈管支質細胞を移植したメスのマウス由来の精製胸腺細胞（リンパ球前駆体）で検出され、これらの細胞が、リンパ系への分化に潜在性を有していることを示している。
ｓｒｙ遺伝子を含む骨髄細胞のクローンは、骨髄細胞と脂肪組織の脈管支質細胞を移植したマウス（Ｃ５７ Ｂｌ／６ 及びＳＣＩＤ）の脾臓細胞から得られる； 非致死量を照射したＳＣＩＤマウスでは、ｓｒｙ遺伝子を含む造血系クローン数は著しく高い。これらの結果は、脂肪組織の脈管支質細胞が骨髄系に分化できる造血始原細胞を含むことを示している。
この一連の結果は、脂肪組織の脈管支質が、照射マウスでリンパ系に分化しうる短期及び長期の造血始原細胞と機能的な造血を再生し得る骨髄造血系を含むことを示している。
【００５２】
実施例 ３： 脈管支質細胞の表現型分析
脈管支質が異種細胞群からなる限り、フローサイトメトリーの免疫標識実験を行って、造血活性を有する脈管支質細胞を同定する。
図３は、脈管支質細胞群の３５．３±３．６％が脂肪前駆細胞に特異的なマーカーであるＡ２ＣＯＬ６抗原を発現することを示している（パネル２）。造血幹細胞に特異的な２個の抗原を用いると、免疫標識実験は、細胞の３５．８±６％と３０．６％±３．１％が、それぞれＣＤ３４とＣＤ４５にポジティブであることを示し、脂肪組織から単離される脈管支質細胞が種々の造血系（骨髄系及びリンパ系）細胞に分化しうる造血幹細胞の意外な源であることを立証している。
補足的な三重標識実験は、Ａ２ＣＯＬ６−ポジティブな細胞の大部分がＣＤ３４ 及び ＣＤ４５抗原も発現していることを示しており（図３： パネル３及び４）、脂肪前駆細胞が造血前駆体であると考えられることを立証している。この三重標識は、３Ｔ３−Ｌ１脂肪前駆体系を用いても得られた。
【００５３】
実施例 ４： 致死量を照射したメスのマウスにおける、３Ｔ３−Ｌ１ 脂肪前駆細胞系細胞由来の造血系の再生
レシピエントのマウスを照射し、実施例１に記載のプロトコルにしたがって、３Ｔ３−Ｌ１脂肪前駆細胞系の細胞を用いて静脈内又は腹膜内に移植した。
予備実験は、おそらくは腹膜腔から造血中心への細胞の移動が遅いために、細胞を腹膜内に注入すると移植の効率が低くなることを示している。
したがって、静脈内注入の結果を図４に示す。
図４Ａは、致死量の照射から１０週間後に、骨髄細胞を移植したマウスの８０％が依然として生存しているが、３Ｔ３−Ｌ１細胞を移植したマウスはわずか５０％が照射を免れていることを示している。
【００５４】
移植したマウスの２群についての血液細胞数は、照射から４週間以内の血小板と白血球数の部分的な回復を示している（図４Ｂ及び４Ｃ）。１０週間目で、血小板数は、移植したマウスの２群について非照射対照の血小板数に等しい値に達する（図４Ｂ）。他方、１０週目で、骨髄細胞で再生したマウスは、非照射対照のそれらに等しい値に再度達するが、白血球数は３Ｔ３−Ｌ１細胞で再生したマウスでは対照の値の５０％を越えない。
白血球群の分析は、３Ｔ３−Ｌ１細胞で再生したマウスでは、リンパ球、単球及び顆粒球の割合が非照射対照マウスのそれらと同等であることを示している。
したがって、これらの結果は、骨髄細胞に匹敵して、より効率的で、非照射対照に匹敵する値で骨髄及びリンパ系を再生でき、照射から８週間後に３Ｔ３−Ｌ１系が造血系を部分的に再生できることを示している。
【００５５】
実施例 ５： 心筋細胞と骨格筋細胞への脂肪組織の脈管支質細胞のインビトロの分化
実施例１．２に記載されるようにして単離した脈管支質細胞を培養し、実施例１．９に記載する条件下で分析する。
これらの条件下、心筋と骨格筋の収縮細胞への細胞の分化によって、細胞の増殖を観察する。
図５は、α−アクチニンの発現によって特徴付けられる心筋細胞と骨格筋細胞の存在を示す。それは、ミオシンイソ型の重鎖の発現による骨格筋細胞の特異的な検出も示している。
下記の表１は、心筋細胞に特異的な細胞の自発的な収縮活性、またカルバミルコリン（ムスカリンアセチルコリンレセプター）での収縮阻害及びアトロピン（同一レセプターのアンタゴニスト）の添加によるその作用の反転を示している。値は、３回の独立した測定の平均に相当する。
【００５６】
【表１】

【００５７】
表２は、イソプロテレノール（β−アドレナリン作動性レセプターのアゴニスト）での収縮頻度の刺激とプロプラノロール（同一レセプターのアンタゴニスト）の添加によるその作用の反転を示す。値は、３回の独立した測定の平均に相当する。
【００５８】
【表２】

【００５９】
上記から明らかなように、本発明は、例示的に記載したにすぎない実施方法、製造及び適用にいかなる方法でも限定されない； 逆に、本発明は、本発明の関連又は範囲から逸脱しないで当業者が行い得る全ての変形を包含するものである。

Claims (30)

1. 医薬品としての髄外脂肪組織の脈管支質の細胞分画。
2. 髄質の涸渇が認められる疾患の治療用医薬品を製造するための髄外脂肪組織の脈管支質の細胞分画の使用。
3. 筋障害、心筋症、ならびに筋肉変性が認められる疾患の治療用医薬品を製造するための髄外脂肪組織の脈管支質の細胞分画の使用。
4. 髄外脂肪組織の脈管支質の細胞分画から単離されることを特徴とする、造血系を再生し得る単離かつ精製された細胞。
5. 髄外脂肪組織の脈管支質の細胞分画から単離されることを特徴とする、心筋細胞に分化できる単離かつ精製された細胞。
6. 細胞が、以下の連続工程：
   − 髄外脂肪組織の試料を採取し、
   − 好ましくは細胞外マトリクスをタンパク質分解酵素で消化し、物理的に分離して、脈管支質の細胞分画を単離し、かつ
   − 物理的分離及び／又は免疫選択によって細胞を精製すること
   によって得られることを特徴とする、請求項４又は請求項５に記載の細胞。
7. 精製工程が、適当な成長因子及び／又はサイトカインを含む半固形培地で細胞を培養する追加工程によって先行されることを特徴とする請求項６に記載の細胞。
8. 脂肪細胞幹細胞又は前駆体用の少なくとも１つのマーカー及び／又は造血幹細胞又は前駆体用の少なくとも１つのマーカーを発現することを特徴とする、請求項４、６又は７のいずれか１つに記載の細胞。
9. 脂肪細胞幹細胞又は前駆体用の少なくとも１つのマーカー及び／又は心筋細胞幹細胞又は前駆体用の少なくとも１つのマーカーを発現することを特徴とする、請求項５、６又は７のいずれか１つに記載の細胞。
10. 脂肪細胞前駆体用のマーカーが、Ａ２ＣＯＬ６／ｐＯｂ２４、ＬＰＬ 及びＰｒｅｆ−１からなる群から選択されることを特徴とする、請求項８又は請求項９に記載の細胞。
11. 造血幹細胞又は前駆体用のマーカーが、ＣＤ３４、ＣＤ４５、Ｔｈｙ−１、 Ｓｃａ−１、ＣＤ１１７ 及びＣＤ３８からなる群から選択されることを特徴とする、請求項８に記載の細胞。
12. 心筋細胞幹細胞又は前駆体用のマーカーが、α−アクチニンとＧＡＴＡ−４因子からなる群から選択されることを特徴とする、請求項９に記載の細胞。
13. 少なくともＡ２ＣＯＬ６／ｐＯｂ２４、ＣＤ３４及びＣＤ４５を発現することを特徴とする、請求項１０又は１１に記載の細胞。
14. ヒト由来であることを特徴とする、請求項４〜１３のいずれか１つに記載の細胞。
15. 遺伝的に修飾された請求項４〜１３のいずれか１つに記載の細胞からなることを特徴とする修飾細胞。
16. オートロガス遺伝子について少なくとも１つの変異を含むことを特徴とする請求項１５に記載の修飾細胞。
17. 異種遺伝子の少なくとも１つのコピーを含むことを特徴とする請求項１５に記載の修飾細胞。
18. ヒト由来であることを特徴とする請求項１５〜１７のいずれか１つに記載の細胞。
19. 請求項１４又は請求項１８に記載のヒト細胞由来の不死化細胞系。
20. 請求項４に記載の細胞、さもなければ請求項１５〜１９のいずれか１つに記載の修飾細胞もしくはこれらの細胞由来の系と、少なくとも１つの医薬的に許容される賦形剤からなることを特徴とする、造血系の再生用医薬品。
21. 請求項５に記載の細胞、さもなければ請求項１５〜１９のいずれか１つに記載の修飾細胞もしくはこれらの細胞由来の系と、少なくとも１つの医薬的に許容される賦形剤とからなることを特徴とする、心筋層再生用医薬品。
22. 誘導されるか又は構成的な髄質の涸渇が認められる疾患の治療用医薬品を製造するための、請求項４に記載の細胞、さもなければ請求項１５〜１９のいずれか１つに記載の修飾細胞又はこれらの細胞由来の系の使用。
23. 心筋症と心筋変性を伴う疾患の治療用医薬品を製造するための、請求項５に記載の細胞、さもなければ請求項１５〜１９のいずれか１つに記載の修飾細胞又はこれらの細胞由来の系の使用。
24. 少なくとも
    ａ_１） 髄外脂肪組織の試料を採取し、
    ｂ_１） 好ましくは細胞外マトリクスをタンパク質分解酵素で消化し、物理的に分離することによって、脈管支質の細胞分画を単離し、かつ
    ｃ_１） 物理的分離及び／又は免疫選択によって細胞を精製する
    工程からなることを特徴とする、請求項４に記載の造血系を再生可能な単離かつ精製された細胞の調製法。
25. 少なくとも
    ａ_２） 髄外脂肪組織の試料を採取し、
    ｂ_２） 好ましくは細胞外マトリクスをタンパク質分解酵素で消化し、物理的に分離することによって、脈管支質の細胞分画を単離し、かつ
    ｃ_２） 物理的分離及び／又は免疫選択によって細胞を精製する
    工程からなることを特徴とする、請求項５に記載の心筋細胞に分化可能な単離かつ精製された細胞の調製法。
26. 工程ｃ_１又はｃ_２に先立って、適当な成長因子及び／又はサイトカインを含む半固形培地で細胞を培養する追加工程を含むことを特徴とする、請求項２４又は請求項２５に記載の方法。
27. 少なくとも
    ａ_３） 髄外脂肪組織の試料を採取し、
    ｂ_３） 好ましくは細胞外マトリクスをタンパク質分解酵素で消化し、物理的に分離することによって、脈管支質の細胞分画を単離し、かつ
    ｃ_３） 適当な成長因子及び／又はサイトカインを含む半固形培地で細胞を培養し、かつ
    ｄ_３） 物理的分離及び／又は免疫選択によって細胞を精製する
    工程からなることを特徴とする、骨格筋細胞に分化可能な単離かつ精製された細胞の調製法。
28. インビトロでの細胞の増殖について追加工程ｄ_１）、ｄ_２） 又はｄ_３） を含むことを特徴とする請求項２４〜２６のいずれか１つに記載の方法。
29. 造血活性を調節可能な分子をスクリーニングするための、請求項４に記載の細胞、さもなければ請求項１５〜１９のいずれか１つに記載の修飾細胞又はこれらの細胞由来の系の使用。
30. 心筋活性を調節可能な分子をスクリーニングするための、請求項５に記載の細胞、さもなければ請求項１５〜１９のいずれか１つに記載の修飾細胞又はこれらの細胞由来の系の使用。

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