JP2004524830A5 - - Google Patents
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【特許請求の範囲】
【請求項1】
少なくとも
a) 髄外脂肪組織の試料から血管間質細胞の分画を単離し、
b) ウシ胎児血清、ウシ血清、インスリン、トランスフェリン、SCF、IL3及びIL6を補った
メチルセルロースを含む半固形培地で細胞を培養し、かつ
c) 遠心分離又はエルトリエーション法、及び免疫選択によって細胞を精製する
工程からなることを特徴とする、α−アクチニン及びGATA-4因子から選択される少なくと
も1つのマーカーを発現する、培養されて心筋細胞に分化した細胞の調製方法。
【請求項2】
血管間質細胞が、ヒト由来であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
【請求項3】
前記血管間質細胞の分画が、細胞外マトリクスをタンパク質分解酵素で消化し、遠心分
離又はエルトリエーションすることによって、髄外脂肪組織の試料から単離されることを
特徴とする請求項1又は2に記載の方法。
【請求項4】
a)髄外脂肪組織の血管間質細胞の分画の単離かつ精製された細胞を、ウシ胎児血清、
ウシ血清、インスリン、トランスフェリン、SCF、IL3及びIL6を補ったメチルセルロース
を含む半固形培地で培養し、
b)ムスカリンのアセチルコリンレセプターのアゴニストにより反転可能に阻害される自
発収縮活性を有するか又はβ−アドレナリン作動性レセプターのアゴニストにより反転可
能に刺激される収縮頻度を有する細胞を選択する
工程を含むことを特徴とする心筋細胞を調製する方法。
【請求項1】
少なくとも
a) 髄外脂肪組織の試料から血管間質細胞の分画を単離し、
b) ウシ胎児血清、ウシ血清、インスリン、トランスフェリン、SCF、IL3及びIL6を補った
メチルセルロースを含む半固形培地で細胞を培養し、かつ
c) 遠心分離又はエルトリエーション法、及び免疫選択によって細胞を精製する
工程からなることを特徴とする、α−アクチニン及びGATA-4因子から選択される少なくと
も1つのマーカーを発現する、培養されて心筋細胞に分化した細胞の調製方法。
【請求項2】
血管間質細胞が、ヒト由来であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
【請求項3】
前記血管間質細胞の分画が、細胞外マトリクスをタンパク質分解酵素で消化し、遠心分
離又はエルトリエーションすることによって、髄外脂肪組織の試料から単離されることを
特徴とする請求項1又は2に記載の方法。
【請求項4】
a)髄外脂肪組織の血管間質細胞の分画の単離かつ精製された細胞を、ウシ胎児血清、
ウシ血清、インスリン、トランスフェリン、SCF、IL3及びIL6を補ったメチルセルロース
を含む半固形培地で培養し、
b)ムスカリンのアセチルコリンレセプターのアゴニストにより反転可能に阻害される自
発収縮活性を有するか又はβ−アドレナリン作動性レセプターのアゴニストにより反転可
能に刺激される収縮頻度を有する細胞を選択する
工程を含むことを特徴とする心筋細胞を調製する方法。
【0008】
この脂肪組織は、2つの細胞分画からなる:
- 分化した脂肪細胞からなる脂肪細胞分画: 脂肪組織細胞の30〜60%を占める未熟脂肪細
胞(小さな脂肪細胞)と成熟脂肪細胞。この細胞分画は、トリグリセリドの蓄積と後期なら
びに極めて後期のマーカー、例えばGPDH (グリセロール-3-ホスフェートデヒドロゲナー
ゼ)の発現によって特徴付けられる、及び
- 幾つかの血液細胞、内皮細胞、血管周囲細胞、線維芽細胞及び脂肪細胞前駆体、特に細
胞質に脂質がないことと初期マーカー、例えばコラーゲンVI (A2COL6/pOb24)とリポタン
パク質リパーゼ(LPL)のα2鎖の発現によって特徴付けられる脂肪前駆細胞からなる、血管
間質分画と称される非-脂肪細胞分画。
この脂肪組織は、2つの細胞分画からなる:
- 分化した脂肪細胞からなる脂肪細胞分画: 脂肪組織細胞の30〜60%を占める未熟脂肪細
胞(小さな脂肪細胞)と成熟脂肪細胞。この細胞分画は、トリグリセリドの蓄積と後期なら
びに極めて後期のマーカー、例えばGPDH (グリセロール-3-ホスフェートデヒドロゲナー
ゼ)の発現によって特徴付けられる、及び
- 幾つかの血液細胞、内皮細胞、血管周囲細胞、線維芽細胞及び脂肪細胞前駆体、特に細
胞質に脂質がないことと初期マーカー、例えばコラーゲンVI (A2COL6/pOb24)とリポタン
パク質リパーゼ(LPL)のα2鎖の発現によって特徴付けられる脂肪前駆細胞からなる、血管
間質分画と称される非-脂肪細胞分画。
【0011】
さらに、先の研究(Cousinら、The FASEB Journal, 1999, 13, 305-312)では、肥満と炎
症反応における脂肪細胞とマクロファージとの関係に関心をもった発明者は、脂肪前駆細
胞(血管間質分画由来の一次培養、つまり3T3-L1系)がマクロファージのように食作用活性
を有すること、及び単球-マクロファージに特異的なMOMA-2マーカーが脂肪前駆細胞及び
脂肪細胞によっても発現されることを示した。しかし、脂肪前駆細胞がマクロファージと
異なることは文献から明らかであり、従来技術を用いる限り、成熟マクロファージに特異
的なF4/80 及びMac1 マーカーの存在を、これらの細胞表面で検出することはできない。
さらに、先の研究(Cousinら、The FASEB Journal, 1999, 13, 305-312)では、肥満と炎
症反応における脂肪細胞とマクロファージとの関係に関心をもった発明者は、脂肪前駆細
胞(血管間質分画由来の一次培養、つまり3T3-L1系)がマクロファージのように食作用活性
を有すること、及び単球-マクロファージに特異的なMOMA-2マーカーが脂肪前駆細胞及び
脂肪細胞によっても発現されることを示した。しかし、脂肪前駆細胞がマクロファージと
異なることは文献から明らかであり、従来技術を用いる限り、成熟マクロファージに特異
的なF4/80 及びMac1 マーカーの存在を、これらの細胞表面で検出することはできない。
【0012】
脂肪組織は、個体の生存のあいだ持続する再生の可能性を有しており、種々の脂肪の沈
着物内に脂肪前駆細胞群を維持しながら結合している。実際、所定の沈着物に存在する脂
肪細胞数は、生理学的又は生理病理学的な条件にしたがってかなりの割合で変化し得る。
この結果、ヒト又は高齢ですらある成体、齧歯動物で、分化の初期マーカー(A2COL6/pO
b24、LPL、IFG-1など)を発現する脂肪前駆細胞を高い割合で含む脂肪組織の血管間質分画
の細胞がインビトロで増殖でき、脂肪細胞に分化できることが示された(Ailhaudら、1992
, 上記)。
脂肪組織は、個体の生存のあいだ持続する再生の可能性を有しており、種々の脂肪の沈
着物内に脂肪前駆細胞群を維持しながら結合している。実際、所定の沈着物に存在する脂
肪細胞数は、生理学的又は生理病理学的な条件にしたがってかなりの割合で変化し得る。
この結果、ヒト又は高齢ですらある成体、齧歯動物で、分化の初期マーカー(A2COL6/pO
b24、LPL、IFG-1など)を発現する脂肪前駆細胞を高い割合で含む脂肪組織の血管間質分画
の細胞がインビトロで増殖でき、脂肪細胞に分化できることが示された(Ailhaudら、1992
, 上記)。
【0013】
したがって、脂肪組織の血管間質分画由来多能性幹細胞を、造血系、ならびに神経組織
及び肝臓組織(国際出願WO 01/62901)又は筋肉、骨ならびに軟骨組織(Zukら、Tissue Eng.
, 2001, 7, 20, 211-228)の再生に使用することが提案されている。しかし、これらの書
類に記載される手段は、造血活性、筋活性、神経活性又は肝臓活性を再生できる機能細胞
に効率的に分化できるような幹細胞を単離できない。
意外なことに、本発明者らは、髄外脂肪組織の血管間質分画(又は血管間質細胞の分画)
の細胞が、造血系ならびに心筋細胞に効率的に分化できることをここに示した; このよう
な細胞は、哺乳動物、特に致死量を照射したマウスで造血系を再生でき、特に心臓の事象
後の梗塞領域に移植すると、機能的な心臓を再生できる。
したがって、脂肪組織の血管間質分画由来多能性幹細胞を、造血系、ならびに神経組織
及び肝臓組織(国際出願WO 01/62901)又は筋肉、骨ならびに軟骨組織(Zukら、Tissue Eng.
, 2001, 7, 20, 211-228)の再生に使用することが提案されている。しかし、これらの書
類に記載される手段は、造血活性、筋活性、神経活性又は肝臓活性を再生できる機能細胞
に効率的に分化できるような幹細胞を単離できない。
意外なことに、本発明者らは、髄外脂肪組織の血管間質分画(又は血管間質細胞の分画)
の細胞が、造血系ならびに心筋細胞に効率的に分化できることをここに示した; このよう
な細胞は、哺乳動物、特に致死量を照射したマウスで造血系を再生でき、特に心臓の事象
後の梗塞領域に移植すると、機能的な心臓を再生できる。
【0014】
この結果、本発明の対象は、医薬品としての髄外脂肪組織の血管間質細胞の分画である
; 実際、この分画は、意外なことに、造血系を再生でき、心筋組織(心筋層)を再生するこ
とができる。
また、本発明の対象は、誘導されるか又は構成的な髄質の涸渇が認められる疾患、例え
ば悪性血液疾患、骨髄腫瘍、遺伝的又は後天的原因の血液疾患、又は照射もしくは化学療
法後の疾患の治療用医薬品を製造するための該分画の使用である。
また、本発明の対象は、遺伝的又は後天的原因の筋障害及び心筋症、ならびに筋肉変性
を伴う(誘導されるか又は構成的な)病理的症状、例えば心筋梗塞の治療用医薬品を製造す
るための該分画の使用である。
この結果、本発明の対象は、医薬品としての髄外脂肪組織の血管間質細胞の分画である
; 実際、この分画は、意外なことに、造血系を再生でき、心筋組織(心筋層)を再生するこ
とができる。
また、本発明の対象は、誘導されるか又は構成的な髄質の涸渇が認められる疾患、例え
ば悪性血液疾患、骨髄腫瘍、遺伝的又は後天的原因の血液疾患、又は照射もしくは化学療
法後の疾患の治療用医薬品を製造するための該分画の使用である。
また、本発明の対象は、遺伝的又は後天的原因の筋障害及び心筋症、ならびに筋肉変性
を伴う(誘導されるか又は構成的な)病理的症状、例えば心筋梗塞の治療用医薬品を製造す
るための該分画の使用である。
【0015】
実際、髄外脂肪組織の血管間質分画の細胞は、単球/マクロファージ、多核好塩基球、
好酸球及び好中球、血小板及び赤血球を生じる骨髄系及び/又はTリンパ球とBリンパ球を
生じるリンパ球系を再生できる。これらの細胞は、収縮活性を示す機能的な心筋細胞にも
分化できる。
本発明によれば、血管間質細胞の分画は、特にBjorntorpら(上記)によって記載される
プロトコルにしたがって密度の相違により単離される。
実際、髄外脂肪組織の血管間質分画の細胞は、単球/マクロファージ、多核好塩基球、
好酸球及び好中球、血小板及び赤血球を生じる骨髄系及び/又はTリンパ球とBリンパ球を
生じるリンパ球系を再生できる。これらの細胞は、収縮活性を示す機能的な心筋細胞にも
分化できる。
本発明によれば、血管間質細胞の分画は、特にBjorntorpら(上記)によって記載される
プロトコルにしたがって密度の相違により単離される。
【0016】
また、本発明の対象は、髄外脂肪組織の血管間質細胞の分画から単離されることを特徴
とする、造血系を再生し得る単離かつ精製された細胞である。
本発明の対象は、髄外脂肪組織の血管間質細胞の分画から単離されることを特徴とする
、心筋細胞に分化できる単離かつ精製された細胞でもある。
また、本発明の対象は、髄外脂肪組織の血管間質細胞の分画から単離されることを特徴
とする、造血系を再生し得る単離かつ精製された細胞である。
本発明の対象は、髄外脂肪組織の血管間質細胞の分画から単離されることを特徴とする
、心筋細胞に分化できる単離かつ精製された細胞でもある。
【0017】
細胞の有利な具体例によれば、細胞は、
- 髄外脂肪組織の試料を採取し、
- 好ましくは細胞外マトリクスをタンパク質分解酵素で消化し、特に密度の相違により物
理的に分離して、血管間質細胞の分画を単離し、かつ
- 物理的分離及び/又は免疫選択によって細胞を精製する
連続工程によって得ることができる。
細胞の有利な具体例によれば、細胞は、
- 髄外脂肪組織の試料を採取し、
- 好ましくは細胞外マトリクスをタンパク質分解酵素で消化し、特に密度の相違により物
理的に分離して、血管間質細胞の分画を単離し、かつ
- 物理的分離及び/又は免疫選択によって細胞を精製する
連続工程によって得ることができる。
【0018】
有利には:
- 物理的分離は、適当な固体支持体への付着の相違又は密度の相違(適当な勾配での遠心
分離、エルトリエーション法)によって行われ、
- 免疫選択は、脂肪細胞、造血又は心筋細胞前駆体によって発現されるマーカーに特異的
な少なくとも1つの抗体を用いて(ポジティブ選択)、及び/又は当業者にそれ自体公知の該
前駆体にないマーカーに特異的な少なくとも1つの抗体を用いて(ネガティブ選択)行われ
る。
この具体例の有利なアレンジによれば、精製工程は、適当な成長因子及び/又はサイト
カインを含む半固形培地で細胞を培養する追加工程によって先行される。
有利には:
- 物理的分離は、適当な固体支持体への付着の相違又は密度の相違(適当な勾配での遠心
分離、エルトリエーション法)によって行われ、
- 免疫選択は、脂肪細胞、造血又は心筋細胞前駆体によって発現されるマーカーに特異的
な少なくとも1つの抗体を用いて(ポジティブ選択)、及び/又は当業者にそれ自体公知の該
前駆体にないマーカーに特異的な少なくとも1つの抗体を用いて(ネガティブ選択)行われ
る。
この具体例の有利なアレンジによれば、精製工程は、適当な成長因子及び/又はサイト
カインを含む半固形培地で細胞を培養する追加工程によって先行される。
【0026】
また、本発明の対象は、少なくとも
a1) 髄外脂肪組織の試料を採取し、
b1) 好ましくは細胞外マトリクスをタンパク質分解酵素で消化し、物理的に分離すること
によって、血管間質細胞の分画を単離し、かつ
c1) 物理的分離及び/又は免疫選択によって細胞を精製する
工程からなることを特徴とする、上記の造血系を再生可能な単離かつ精製された細胞の調
製法である。
また、本発明の対象は、少なくとも
a2) 髄外脂肪組織の試料を採取し、
b2) 好ましくは細胞外マトリクスをタンパク質分解酵素で消化し、物理的に分離すること
によって、血管間質細胞の分画を単離し、かつ
c2) 物理的分離及び/又は免疫選択によって細胞を精製する
工程からなることを特徴とする、上記の心筋細胞に分化可能な単離かつ精製された細胞の
調製法である。
また、本発明の対象は、少なくとも
a1) 髄外脂肪組織の試料を採取し、
b1) 好ましくは細胞外マトリクスをタンパク質分解酵素で消化し、物理的に分離すること
によって、血管間質細胞の分画を単離し、かつ
c1) 物理的分離及び/又は免疫選択によって細胞を精製する
工程からなることを特徴とする、上記の造血系を再生可能な単離かつ精製された細胞の調
製法である。
また、本発明の対象は、少なくとも
a2) 髄外脂肪組織の試料を採取し、
b2) 好ましくは細胞外マトリクスをタンパク質分解酵素で消化し、物理的に分離すること
によって、血管間質細胞の分画を単離し、かつ
c2) 物理的分離及び/又は免疫選択によって細胞を精製する
工程からなることを特徴とする、上記の心筋細胞に分化可能な単離かつ精製された細胞の
調製法である。
【0027】
この方法の有利な具体例によれば、工程c1又はc2に先立って、適当な成長因子及び/又
はサイトカインを含む半固形培地で細胞を培養する追加工程が含まれる。
また、本発明の対象は、少なくとも
a3) 髄外脂肪組織の試料を採取し、
b3) 好ましくは細胞外マトリクスをタンパク質分解酵素で消化し、物理的に分離すること
によって、血管間質細胞の分画を単離し、かつ
c3) 適当な成長因子及び/又はサイトカインを含む半固形培地で細胞を培養し、かつ
d3) 物理的分離及び/又は免疫選択によって細胞を精製する
工程からなることを特徴とする、骨格筋細胞に分化可能な単離かつ精製された細胞の調製
法である。
この方法の有利な具体例によれば、工程c1又はc2に先立って、適当な成長因子及び/又
はサイトカインを含む半固形培地で細胞を培養する追加工程が含まれる。
また、本発明の対象は、少なくとも
a3) 髄外脂肪組織の試料を採取し、
b3) 好ましくは細胞外マトリクスをタンパク質分解酵素で消化し、物理的に分離すること
によって、血管間質細胞の分画を単離し、かつ
c3) 適当な成長因子及び/又はサイトカインを含む半固形培地で細胞を培養し、かつ
d3) 物理的分離及び/又は免疫選択によって細胞を精製する
工程からなることを特徴とする、骨格筋細胞に分化可能な単離かつ精製された細胞の調製
法である。
【0029】
有利には、本発明による単離かつ精製された細胞の得るための方法を実施するために、
- 容易に入手可能な脂肪沈着物、例えば皮下脂肪沈着物から試料を採取でき(工程a1、a2
又はa3)、
- 特にBjorntorpら(上記)に記載のプロトコルにしたがって、血管間質細胞の分画を密度
の相違によって単離し(工程b1、b2又はb3)、
- 適当な成長因子及び/又はサイトカインを含む半固形培地中での細胞の培養(追加工程又
は工程c3)を、ウシ胎児血清、ウシ血清、インスリン、トランスフェリン、SCF、IL3及びI
L6を補充したメチルセルロースを含む培地中で行い、
有利には、本発明による単離かつ精製された細胞の得るための方法を実施するために、
- 容易に入手可能な脂肪沈着物、例えば皮下脂肪沈着物から試料を採取でき(工程a1、a2
又はa3)、
- 特にBjorntorpら(上記)に記載のプロトコルにしたがって、血管間質細胞の分画を密度
の相違によって単離し(工程b1、b2又はb3)、
- 適当な成長因子及び/又はサイトカインを含む半固形培地中での細胞の培養(追加工程又
は工程c3)を、ウシ胎児血清、ウシ血清、インスリン、トランスフェリン、SCF、IL3及びI
L6を補充したメチルセルロースを含む培地中で行い、
【0030】
- 細胞の精製(工程c1、c2又はd3)を、いずれかの適当な支持体での分離(付着の相違)によ
って、さもなければ、適当な勾配での遠心分離もしくはエルトリエーション法(密度の相
違)、又は従来の免疫細胞化学技術、特に、例えばCurrent protocols in Immunology, (J
ohn E. Coligan, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA)に記載されるよ
うなフローサイトメトリーによるか、あるいは磁気ビーズを用いる免疫標識細胞の(ポジ
ティブ又はネガティブな)分類技術による免疫選択によって、行う; 該細胞によって発現
されるマーカーに特異的な少なくとも1つの抗体(ポジティブ選択)及び/又は上記の細胞に
はないマーカーに特異的な少なくとも1つの抗体(ネガティブ選択)は、細胞分類に用いら
れる;
- インビトロでの細胞の増殖(工程d1、d2又はe3)は、適当な培養培地、例えば非制限的に
はウシ胎児血清又は植物代用血清を含む DMEM F12 培地で行われる。
- 細胞の精製(工程c1、c2又はd3)を、いずれかの適当な支持体での分離(付着の相違)によ
って、さもなければ、適当な勾配での遠心分離もしくはエルトリエーション法(密度の相
違)、又は従来の免疫細胞化学技術、特に、例えばCurrent protocols in Immunology, (J
ohn E. Coligan, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA)に記載されるよ
うなフローサイトメトリーによるか、あるいは磁気ビーズを用いる免疫標識細胞の(ポジ
ティブ又はネガティブな)分類技術による免疫選択によって、行う; 該細胞によって発現
されるマーカーに特異的な少なくとも1つの抗体(ポジティブ選択)及び/又は上記の細胞に
はないマーカーに特異的な少なくとも1つの抗体(ネガティブ選択)は、細胞分類に用いら
れる;
- インビトロでの細胞の増殖(工程d1、d2又はe3)は、適当な培養培地、例えば非制限的に
はウシ胎児血清又は植物代用血清を含む DMEM F12 培地で行われる。
【0033】
- 図1は、髄外脂肪組織又は骨髄細胞(対照)の血管間質細胞の注入によって得られる造血
系の再生を示す。図1Aは、(x-軸に沿って)照射後10週間にわたる、(y-軸に沿って)致死量
照射したマウスの生存割合を示すカプラン-マイヤー(Kaplan-Meier)グラフである。非再
生の照射マウスを円で示し、骨髄細胞を移植したマウスを四角で示し、血管間質細胞を移
植したマウスを三角で示す。各群は、初期数10〜15匹のマウスからなる。図1Bと1Cは、そ
れぞれ骨髄細胞(黒色)又は脂肪組織の血管間質細胞(白色)で再生した照射マウスの血小板
と白血球の数を示す。結果は非照射対照の値に対する%として示し、示した値は5〜15匹
のマウスの群について得られる平均±標準偏差を示す。
- 図1は、髄外脂肪組織又は骨髄細胞(対照)の血管間質細胞の注入によって得られる造血
系の再生を示す。図1Aは、(x-軸に沿って)照射後10週間にわたる、(y-軸に沿って)致死量
照射したマウスの生存割合を示すカプラン-マイヤー(Kaplan-Meier)グラフである。非再
生の照射マウスを円で示し、骨髄細胞を移植したマウスを四角で示し、血管間質細胞を移
植したマウスを三角で示す。各群は、初期数10〜15匹のマウスからなる。図1Bと1Cは、そ
れぞれ骨髄細胞(黒色)又は脂肪組織の血管間質細胞(白色)で再生した照射マウスの血小板
と白血球の数を示す。結果は非照射対照の値に対する%として示し、示した値は5〜15匹
のマウスの群について得られる平均±標準偏差を示す。
【0034】
- 図2は、骨髄細胞又は血管間質細胞の移植から10週間後に行った、再生したメスのマウ
スにおける脾臓(上のパネル)と血液(下のパネル)でのY染色体に特異的なsry遺伝子のPCR
による検出を示す。上のパネル: PCRは、脾臓DNAの50 ng (ライン1、5及び6)又は150 ng
(ライン2〜4)について行う。722 bpの産物が、オスのマウス由来の骨髄細胞(ライン1)又
は血管間質細胞(ライン2〜4)で再生したマウスで検出される。対照のメスのマウスには、
シグナルが認められない(ライン5)。オスのマウス由来の血液試料を、陽性対照として用
いる(ライン6)。分子量マーカーを、基準(MW)として示す。下のパネル: PCRは、50 ngの
血液DNAについて行う。722 bpの産物が、オスのマウス由来の骨髄細胞(ライン5)又は血管
間質細胞(ライン3-4)で再生した動物で検出される。対照のメスのマウスには、シグナル
は検出されない (ライン2)。オスのマウス由来の血液試料を、陽性対照として用いる(ラ
イン1)。分子量マーカーを、基準(MW)として示す。
- 図2は、骨髄細胞又は血管間質細胞の移植から10週間後に行った、再生したメスのマウ
スにおける脾臓(上のパネル)と血液(下のパネル)でのY染色体に特異的なsry遺伝子のPCR
による検出を示す。上のパネル: PCRは、脾臓DNAの50 ng (ライン1、5及び6)又は150 ng
(ライン2〜4)について行う。722 bpの産物が、オスのマウス由来の骨髄細胞(ライン1)又
は血管間質細胞(ライン2〜4)で再生したマウスで検出される。対照のメスのマウスには、
シグナルが認められない(ライン5)。オスのマウス由来の血液試料を、陽性対照として用
いる(ライン6)。分子量マーカーを、基準(MW)として示す。下のパネル: PCRは、50 ngの
血液DNAについて行う。722 bpの産物が、オスのマウス由来の骨髄細胞(ライン5)又は血管
間質細胞(ライン3-4)で再生した動物で検出される。対照のメスのマウスには、シグナル
は検出されない (ライン2)。オスのマウス由来の血液試料を、陽性対照として用いる(ラ
イン1)。分子量マーカーを、基準(MW)として示す。
【0035】
- 図3は、オスのC57Bl/6 マウスの血管間質細胞のフローサイトメトリーによる分析を示
す。パネル1: 領域R1は、x-軸に沿った粒径パラメータ(FSC: 前方散在(forwards scatter
))、及びy-軸に沿ったサイズパラメータ(SSC: 側方散在)の関数として、分析用に選択し
た細胞群に相当する。パネル 2: (y-軸に沿った)細胞のサイズの関数としての(x-軸に沿
った)脂肪前駆細胞に特異的なA2COL6抗原に陽性の細胞の分布。 パネル3 及び4: 脂肪前
駆細胞-特異的な抗原(A2COL6)及び造血幹細胞に特異的な2つの抗原(CD45及びCD34)に対す
る三重標識を示す。パネル3は、CD45+ 細胞群における(x-軸に沿った)A2COL6+ と(y−軸
に沿った)CD34+の分布を示す。パネル4は、CD34+細胞群における(x-軸に沿った)A2COL6+
と(y-軸に沿った)CD45+の分布を示す。
- 図3は、オスのC57Bl/6 マウスの血管間質細胞のフローサイトメトリーによる分析を示
す。パネル1: 領域R1は、x-軸に沿った粒径パラメータ(FSC: 前方散在(forwards scatter
))、及びy-軸に沿ったサイズパラメータ(SSC: 側方散在)の関数として、分析用に選択し
た細胞群に相当する。パネル 2: (y-軸に沿った)細胞のサイズの関数としての(x-軸に沿
った)脂肪前駆細胞に特異的なA2COL6抗原に陽性の細胞の分布。 パネル3 及び4: 脂肪前
駆細胞-特異的な抗原(A2COL6)及び造血幹細胞に特異的な2つの抗原(CD45及びCD34)に対す
る三重標識を示す。パネル3は、CD45+ 細胞群における(x-軸に沿った)A2COL6+ と(y−軸
に沿った)CD34+の分布を示す。パネル4は、CD34+細胞群における(x-軸に沿った)A2COL6+
と(y-軸に沿った)CD45+の分布を示す。
【0037】
- 図5は、本発明の方法によれば、髄外脂肪組織の血管間質から単離される細胞の心筋な
らびに骨格筋細胞への分化の免疫細胞化学による分析を示す。上のパネル: 分化した心筋
細胞と分化した骨格筋細胞の存在は、抗-α-アクチニン抗体を用いて特異的に検出される
(左パネル); 比較として、ネガティブの対照では、抗-α-アクチニン抗体の不在下では標
識は認められない(右パネル)。下のパネル: 分化した骨格筋細胞の存在は、ミオシンのラ
ピッドイソ型(rapid isoform)に対する抗体を用いて特異的に検出される(左パネル); 比
較として、ネガティブの対照では、α-ミオシンのラピッドイソ型に対する抗体の不在下
では標識は認められない(右パネル)。
- 図5は、本発明の方法によれば、髄外脂肪組織の血管間質から単離される細胞の心筋な
らびに骨格筋細胞への分化の免疫細胞化学による分析を示す。上のパネル: 分化した心筋
細胞と分化した骨格筋細胞の存在は、抗-α-アクチニン抗体を用いて特異的に検出される
(左パネル); 比較として、ネガティブの対照では、抗-α-アクチニン抗体の不在下では標
識は認められない(右パネル)。下のパネル: 分化した骨格筋細胞の存在は、ミオシンのラ
ピッドイソ型(rapid isoform)に対する抗体を用いて特異的に検出される(左パネル); 比
較として、ネガティブの対照では、α-ミオシンのラピッドイソ型に対する抗体の不在下
では標識は認められない(右パネル)。
【0038】
実施例1: 材料と方法
1) 骨髄細胞の単離
骨髄細胞を6週齢のオスのC57B1/6マウスの大腿骨から単離する; 赤血球細胞を、9%の
塩化アンモニウム水溶液での処理によって除き、次いで細胞を600 gで10分間遠心分離し
、PBSに再懸濁して、計測し、注入する。
2) 血管間質細胞(血管間質画分、つまりSVF)の単離
上記のBjorntorpらにより記載されるプロトコルにしたがって、細胞を単離する。より
正確には、鼠蹊部の脂肪組織を6週齢のオスのC57Bl/6マウスから採取し、0.2% のBSAと2
mg/mlのコラゲナーゼを含むPBS緩衝液中で 45分のあいだ37℃で消化する。消化生成物を1
00〜25μmのろ紙で連続的に濾過し、次いで10分のあいだ800 gで遠心分離する; こうして
単離した間質細胞をPBS緩衝液に再懸濁し、次いで計測し、移植実験又は免疫分析に用い
る。
実施例1: 材料と方法
1) 骨髄細胞の単離
骨髄細胞を6週齢のオスのC57B1/6マウスの大腿骨から単離する; 赤血球細胞を、9%の
塩化アンモニウム水溶液での処理によって除き、次いで細胞を600 gで10分間遠心分離し
、PBSに再懸濁して、計測し、注入する。
2) 血管間質細胞(血管間質画分、つまりSVF)の単離
上記のBjorntorpらにより記載されるプロトコルにしたがって、細胞を単離する。より
正確には、鼠蹊部の脂肪組織を6週齢のオスのC57Bl/6マウスから採取し、0.2% のBSAと2
mg/mlのコラゲナーゼを含むPBS緩衝液中で 45分のあいだ37℃で消化する。消化生成物を1
00〜25μmのろ紙で連続的に濾過し、次いで10分のあいだ800 gで遠心分離する; こうして
単離した間質細胞をPBS緩衝液に再懸濁し、次いで計測し、移植実験又は免疫分析に用い
る。
【0039】
3) 脂肪前駆細胞系の培養
マウスの脂肪前駆細胞系3T3-L1 (ATCC基準系CL-173)を、10%の熱不活化ウシ胎児血清と
2 mMのL-グルタミンを含むDMEM 培地で培養する。集密した3T3-L1細胞培養物をトリプシ
ン処理で回収し、計測し、移植実験又は免疫分析に用いる。
4) 細胞(骨髄、血管間質及び3T3-L1系)の移植
移植当日に、8〜10週齢のメスのC57Bl/6マウスを単一用量で致死的に10 Gyで照射し、
次いで尾部静脈又は腹膜内の静脈内に400μl用量中の5×106〜107 個の細胞を注入する。
マウスに酸性化水とオートクレーブに付した食物を与える。動物は、動物実験に関する指
示にしたがって扱う。
5) 血液分析
移植から4、8又は10週後に、200μlの末梢血液試料を、移植を行ったマウスの眼窩後部
叢から採取し、すぐにヘパリンを含む管に移す。非照射マウスから採取した末梢血液試料
をポジティブ対照として用い、非再生の照射マウスから採取した末梢血液試料をネガティ
ブ対照として用いる。全血液細胞の計測と種々の核細胞の割合は、血液分析装置で自動的
に行う。
3) 脂肪前駆細胞系の培養
マウスの脂肪前駆細胞系3T3-L1 (ATCC基準系CL-173)を、10%の熱不活化ウシ胎児血清と
2 mMのL-グルタミンを含むDMEM 培地で培養する。集密した3T3-L1細胞培養物をトリプシ
ン処理で回収し、計測し、移植実験又は免疫分析に用いる。
4) 細胞(骨髄、血管間質及び3T3-L1系)の移植
移植当日に、8〜10週齢のメスのC57Bl/6マウスを単一用量で致死的に10 Gyで照射し、
次いで尾部静脈又は腹膜内の静脈内に400μl用量中の5×106〜107 個の細胞を注入する。
マウスに酸性化水とオートクレーブに付した食物を与える。動物は、動物実験に関する指
示にしたがって扱う。
5) 血液分析
移植から4、8又は10週後に、200μlの末梢血液試料を、移植を行ったマウスの眼窩後部
叢から採取し、すぐにヘパリンを含む管に移す。非照射マウスから採取した末梢血液試料
をポジティブ対照として用い、非再生の照射マウスから採取した末梢血液試料をネガティ
ブ対照として用いる。全血液細胞の計測と種々の核細胞の割合は、血液分析装置で自動的
に行う。
【0040】
6) ポリマー鎖反応(PCR)による分析
Current Protocols in Molecular Biology, (1990-2000), John Wiley and Sons, Inc.
New Yorkに記載される従来技術にしたがって、移植から10週間後に、造血組織(骨髄、脾
臓、胸腺、肝臓)と血液の細胞から全ゲノムDNAを抽出する。DNA試料を、上記のPangらに
記載されるプロトコルにしたがって、Y染色体に特異的なsry遺伝子用の各プライマー20 p
molを含む50μlの容量に増幅する。
骨髄細胞又は血管間質細胞を移植したマウスのDNAから、sry遺伝子の256〜978位置に相
当する722 bpのフラグメントが得られる。
3T3-L1 系を移植したマウスのDNAから、sry遺伝子に相当しないが、そのプロフィルが
これらの細胞に特異的な種々のフラグメントを得る。
各増幅系について、オスとメスのマウスから得られる試料を、それぞれポジティブ及び
ネガティブの対照として用いる。
6) ポリマー鎖反応(PCR)による分析
Current Protocols in Molecular Biology, (1990-2000), John Wiley and Sons, Inc.
New Yorkに記載される従来技術にしたがって、移植から10週間後に、造血組織(骨髄、脾
臓、胸腺、肝臓)と血液の細胞から全ゲノムDNAを抽出する。DNA試料を、上記のPangらに
記載されるプロトコルにしたがって、Y染色体に特異的なsry遺伝子用の各プライマー20 p
molを含む50μlの容量に増幅する。
骨髄細胞又は血管間質細胞を移植したマウスのDNAから、sry遺伝子の256〜978位置に相
当する722 bpのフラグメントが得られる。
3T3-L1 系を移植したマウスのDNAから、sry遺伝子に相当しないが、そのプロフィルが
これらの細胞に特異的な種々のフラグメントを得る。
各増幅系について、オスとメスのマウスから得られる試料を、それぞれポジティブ及び
ネガティブの対照として用いる。
【0044】
9) 筋肉の分化
実施例1.2に記載されるようにして単離した血管間質細胞を、上記のメチルセルロース
ベースの半固形培地で培養する(実施例1.8)。
心筋細胞と骨格筋細胞を、製造者の指示に従って特異的な抗体(クローンEA-53, SIGMA)
を用いて顕示されるα-アクチニンの発現で検出する。
骨格筋細胞は、製造者の指示にしたがって特異的な抗体(クローンMY-32, SIGMA)を用い
て顕示されるミオシンイソ型(ラピッドイソ型)の重鎖の発現によって特異的に検出される
。
9) 筋肉の分化
実施例1.2に記載されるようにして単離した血管間質細胞を、上記のメチルセルロース
ベースの半固形培地で培養する(実施例1.8)。
心筋細胞と骨格筋細胞を、製造者の指示に従って特異的な抗体(クローンEA-53, SIGMA)
を用いて顕示されるα-アクチニンの発現で検出する。
骨格筋細胞は、製造者の指示にしたがって特異的な抗体(クローンMY-32, SIGMA)を用い
て顕示されるミオシンイソ型(ラピッドイソ型)の重鎖の発現によって特異的に検出される
。
【0046】
実施例2: 致死量を照射したメスのマウスにおける、骨髄細胞(対照)又は血管間質細胞由
来の造血系の再生
レシピエントのマウスを照射し、次いで実施例1に記載のプロトコルにしたがって、血
管間質細胞、さもなければ骨髄細胞(対照)を用いて腹膜内に移植する。
1) 照射動物の生存
図1Aは、造血系の長期持続再生を評価するための、照射から10週間後に分析した動物の
生存を示す。認められた結果は、照射から3週間以内に非再生マウスが死亡することを示
している。他方、血管間質細胞あるいは骨髄細胞で移植した動物のうち40%の生存が認め
られる。致死量の照射は内因性造血前駆体の大部分を排除するので、認められた結果は、
再生した動物の生存が移植細胞に関連していることを示している。
実施例2: 致死量を照射したメスのマウスにおける、骨髄細胞(対照)又は血管間質細胞由
来の造血系の再生
レシピエントのマウスを照射し、次いで実施例1に記載のプロトコルにしたがって、血
管間質細胞、さもなければ骨髄細胞(対照)を用いて腹膜内に移植する。
1) 照射動物の生存
図1Aは、造血系の長期持続再生を評価するための、照射から10週間後に分析した動物の
生存を示す。認められた結果は、照射から3週間以内に非再生マウスが死亡することを示
している。他方、血管間質細胞あるいは骨髄細胞で移植した動物のうち40%の生存が認め
られる。致死量の照射は内因性造血前駆体の大部分を排除するので、認められた結果は、
再生した動物の生存が移植細胞に関連していることを示している。
【0047】
2) 造血系の分析
図1Bと1Cは、非照射対照の値に関連する%として示される、種々の造血系の再生を示し
ている。
非再生マウスでは、血小板数は、1週間で急速に551×103個の血小板/μlの初期値から1
45±6×103個の血小板/μlの値に低下する。他方、血管間質細胞又は骨髄細胞で移植した
マウスでは、血小板数は徐々に増して、4週間で有意な値に達し、10週では対照の値にほ
とんど等しい(図1C)。
血管間質細胞で再生したマウスでは、白血球は、照射から1週間後にはほぼ検出できず
、7週間後には、対照と同一の値に戻る。
2) 造血系の分析
図1Bと1Cは、非照射対照の値に関連する%として示される、種々の造血系の再生を示し
ている。
非再生マウスでは、血小板数は、1週間で急速に551×103個の血小板/μlの初期値から1
45±6×103個の血小板/μlの値に低下する。他方、血管間質細胞又は骨髄細胞で移植した
マウスでは、血小板数は徐々に増して、4週間で有意な値に達し、10週では対照の値にほ
とんど等しい(図1C)。
血管間質細胞で再生したマウスでは、白血球は、照射から1週間後にはほぼ検出できず
、7週間後には、対照と同一の値に戻る。
【0048】
図1Bと1Cは、血小板と白血球の数の回復が、骨髄細胞で再生したマウスでより迅速であ
ることも示している。
白血球群の分析は、骨髄細胞又は血管間質細胞で再生したマウスでは、白血球、単球及
び顆粒球の割合が非照射の対照マウスの割合に等しいことを示している。
したがって、これらの結果は、血管間質細胞の腹膜内注入によって、致死量を照射した
マウスを生きながらえさせることができ、等しい数の骨髄細胞で認められるものに匹敵す
る効率で、但し、数週間の遅延を伴って、骨髄とリンパ系を再生できることを立証してい
る。
図1Bと1Cは、血小板と白血球の数の回復が、骨髄細胞で再生したマウスでより迅速であ
ることも示している。
白血球群の分析は、骨髄細胞又は血管間質細胞で再生したマウスでは、白血球、単球及
び顆粒球の割合が非照射の対照マウスの割合に等しいことを示している。
したがって、これらの結果は、血管間質細胞の腹膜内注入によって、致死量を照射した
マウスを生きながらえさせることができ、等しい数の骨髄細胞で認められるものに匹敵す
る効率で、但し、数週間の遅延を伴って、骨髄とリンパ系を再生できることを立証してい
る。
【0050】
他方、sry遺伝子に特異的な722 bpの産物は、造血組織(骨髄、胸腺、脾臓)とオスのマ
ウス由来の骨髄細胞を注入したマウスの血液に極めて大量に存在する(図2)。同一サイズ
の生成物は、造血組織(骨髄、胸腺、脾臓)とオスのマウス由来の血管間質細胞の移植から
10週間後のメスのマウスの血液にも認められる(図2)。
したがって、図2に示す結果は、血管間質の幾つかの細胞が、腹膜腔から造血部位への
移動能、増殖能及び循環血液細胞への分化能を有し、この結果、致死量を照射したマウス
で機能的な造血を再生できることを示している。
他方、sry遺伝子に特異的な722 bpの産物は、造血組織(骨髄、胸腺、脾臓)とオスのマ
ウス由来の骨髄細胞を注入したマウスの血液に極めて大量に存在する(図2)。同一サイズ
の生成物は、造血組織(骨髄、胸腺、脾臓)とオスのマウス由来の血管間質細胞の移植から
10週間後のメスのマウスの血液にも認められる(図2)。
したがって、図2に示す結果は、血管間質の幾つかの細胞が、腹膜腔から造血部位への
移動能、増殖能及び循環血液細胞への分化能を有し、この結果、致死量を照射したマウス
で機能的な造血を再生できることを示している。
【0051】
4) 造血分化分析
sry遺伝子は、オスのマウス由来の脂肪組織の血管間質細胞を移植したメスのマウス由
来の精製胸腺細胞(リンパ球前駆体)で検出され、これらの細胞が、リンパ系への分化に潜
在性を有していることを示している。
sry遺伝子を含む骨髄細胞のクローンは、骨髄細胞と脂肪組織の血管間質細胞を移植し
たマウス(C57 Bl/6 及びSCID)の脾臓細胞から得られる; 非致死量を照射したSCIDマウス
では、sry遺伝子を含む造血系クローン数は著しく高い。これらの結果は、脂肪組織の血
管間質細胞が骨髄系に分化できる造血始原細胞を含むことを示している。
この一連の結果は、脂肪組織の血管間質が、照射マウスでリンパ系に分化しうる短期及
び長期の造血始原細胞と機能的な造血を再生し得る骨髄造血系を含むことを示している。
4) 造血分化分析
sry遺伝子は、オスのマウス由来の脂肪組織の血管間質細胞を移植したメスのマウス由
来の精製胸腺細胞(リンパ球前駆体)で検出され、これらの細胞が、リンパ系への分化に潜
在性を有していることを示している。
sry遺伝子を含む骨髄細胞のクローンは、骨髄細胞と脂肪組織の血管間質細胞を移植し
たマウス(C57 Bl/6 及びSCID)の脾臓細胞から得られる; 非致死量を照射したSCIDマウス
では、sry遺伝子を含む造血系クローン数は著しく高い。これらの結果は、脂肪組織の血
管間質細胞が骨髄系に分化できる造血始原細胞を含むことを示している。
この一連の結果は、脂肪組織の血管間質が、照射マウスでリンパ系に分化しうる短期及
び長期の造血始原細胞と機能的な造血を再生し得る骨髄造血系を含むことを示している。
【0052】
実施例3: 血管間質細胞の表現型分析
血管間質が異種細胞群からなる限り、フローサイトメトリーの免疫標識実験を行って、
造血活性を有する血管間質細胞を同定する。
図3は、血管間質細胞群の35.3±3.6%が脂肪前駆細胞に特異的なマーカーであるA2COL6
抗原を発現することを示している(パネル2)。造血幹細胞に特異的な2個の抗原を用いると
、免疫標識実験は、細胞の35.8±6%と30.6%±3.1%が、それぞれCD34とCD45にポジティブ
であることを示し、脂肪組織から単離される血管間質細胞が種々の造血系(骨髄系及びリ
ンパ系)細胞に分化しうる造血幹細胞の意外な源であることを立証している。
補足的な三重標識実験は、A2COL6-ポジティブな細胞の大部分がCD34 及び CD45抗原も
発現していることを示しており(図3: パネル3及び4)、脂肪前駆細胞が造血前駆体である
と考えられることを立証している。この三重標識は、3T3-L1脂肪前駆体系を用いても得ら
れた。
実施例3: 血管間質細胞の表現型分析
血管間質が異種細胞群からなる限り、フローサイトメトリーの免疫標識実験を行って、
造血活性を有する血管間質細胞を同定する。
図3は、血管間質細胞群の35.3±3.6%が脂肪前駆細胞に特異的なマーカーであるA2COL6
抗原を発現することを示している(パネル2)。造血幹細胞に特異的な2個の抗原を用いると
、免疫標識実験は、細胞の35.8±6%と30.6%±3.1%が、それぞれCD34とCD45にポジティブ
であることを示し、脂肪組織から単離される血管間質細胞が種々の造血系(骨髄系及びリ
ンパ系)細胞に分化しうる造血幹細胞の意外な源であることを立証している。
補足的な三重標識実験は、A2COL6-ポジティブな細胞の大部分がCD34 及び CD45抗原も
発現していることを示しており(図3: パネル3及び4)、脂肪前駆細胞が造血前駆体である
と考えられることを立証している。この三重標識は、3T3-L1脂肪前駆体系を用いても得ら
れた。
【0055】
実施例5: 心筋細胞と骨格筋細胞への脂肪組織の血管間質細胞のインビトロの分化
実施例1.2に記載されるようにして単離した血管間質細胞を培養し、実施例1.9に記載す
る条件下で分析する。
これらの条件下、心筋と骨格筋の収縮細胞への細胞の分化によって、細胞の増殖を観察
する。
図5は、α-アクチニンの発現によって特徴付けられる心筋細胞と骨格筋細胞の存在を示
す。それは、ミオシンイソ型の重鎖の発現による骨格筋細胞の特異的な検出も示している
。
下記の表1は、心筋細胞に特異的な細胞の自発的な収縮活性、またカルバミルコリン(
ムスカリンアセチルコリンレセプター)での収縮阻害及びアトロピン(同一レセプターのア
ンタゴニスト)の添加によるその作用の反転を示している。値は、3回の独立した測定の平
均に相当する。
実施例5: 心筋細胞と骨格筋細胞への脂肪組織の血管間質細胞のインビトロの分化
実施例1.2に記載されるようにして単離した血管間質細胞を培養し、実施例1.9に記載す
る条件下で分析する。
これらの条件下、心筋と骨格筋の収縮細胞への細胞の分化によって、細胞の増殖を観察
する。
図5は、α-アクチニンの発現によって特徴付けられる心筋細胞と骨格筋細胞の存在を示
す。それは、ミオシンイソ型の重鎖の発現による骨格筋細胞の特異的な検出も示している
。
下記の表1は、心筋細胞に特異的な細胞の自発的な収縮活性、またカルバミルコリン(
ムスカリンアセチルコリンレセプター)での収縮阻害及びアトロピン(同一レセプターのア
ンタゴニスト)の添加によるその作用の反転を示している。値は、3回の独立した測定の平
均に相当する。
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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FR0100249A FR2819265B1 (fr) | 2001-01-10 | 2001-01-10 | Cellules du tissu adipeux extramedullaire et leurs applications dans la reconstitution des lignees hematopoietiques |
FR01/00249 | 2001-01-10 | ||
PCT/FR2002/000071 WO2002055678A1 (fr) | 2001-01-10 | 2002-01-10 | Cellules du tissu adipeux extramedullaire et leurs applications dans la reconstitution des tissus hematopoïetiques et musculaires |
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Publication Number | Publication Date |
---|---|
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Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
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KR100870508B1 (ko) * | 1999-03-10 | 2008-11-25 | 유니버시티 오브 피츠버그 오브 더 커먼웰쓰 시스템 오브 하이어 에듀케이션 | 지방 유래 간세포 및 격자 |
US20050076396A1 (en) * | 1999-03-10 | 2005-04-07 | Katz Adam J. | Adipose-derived stem cells and lattices |
US20050095228A1 (en) | 2001-12-07 | 2005-05-05 | Fraser John K. | Methods of using regenerative cells in the treatment of peripheral vascular disease and related disorders |
US7514075B2 (en) | 2001-12-07 | 2009-04-07 | Cytori Therapeutics, Inc. | Systems and methods for separating and concentrating adipose derived stem cells from tissue |
US20050008626A1 (en) * | 2001-12-07 | 2005-01-13 | Fraser John K. | Methods of using adipose tissue-derived cells in the treatment of cardiovascular conditions |
US20060204556A1 (en) * | 2001-12-07 | 2006-09-14 | Cytori Therapeutics, Inc. | Cell-loaded prostheses for regenerative intraluminal applications |
US7585670B2 (en) | 2001-12-07 | 2009-09-08 | Cytori Therapeutics, Inc. | Automated methods for isolating and using clinically safe adipose derived regenerative cells |
US9597395B2 (en) | 2001-12-07 | 2017-03-21 | Cytori Therapeutics, Inc. | Methods of using adipose tissue-derived cells in the treatment of cardiovascular conditions |
US8105580B2 (en) | 2001-12-07 | 2012-01-31 | Cytori Therapeutics, Inc. | Methods of using adipose derived stem cells to promote wound healing |
US20030161816A1 (en) | 2001-12-07 | 2003-08-28 | Fraser John K. | Systems and methods for treating patients with processed lipoaspirate cells |
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