JP2004514433A - エポチロン耐性セルライン - Google Patents
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- C12N2503/00—Use of cells in diagnostics
- C12N2503/02—Drug screening
Abstract
エポチロン耐性セルラインが開示されている。本発明はまた、エポチロン耐性細胞に対し細胞傷害性であるかまたはエポチロンの化学センシタイザーまたは類似体である物質の同定方法を開示している。さらに本発明は、インビトロまたはインビボでのエポチロン耐性細胞の同定方法およびエポチロン耐性細胞の成長阻害方法を開示している。本発明はまた、エポチロン耐性細胞に特異的な抗体を開示している。また、開示されたエポチロン耐性セルラインを用いる微小管安定剤の同定方法が開示されている。
Description
【0001】
この発明は、新たに同定されたエポチロンAおよびエポチロンB耐性セルラインに関するものである。
【0002】
発明の背景
多剤耐性とは、細胞がある種の細胞傷害性薬剤に対する耐性を獲得し、また構造的および機能的に関連の無い場合もある他の薬剤に対し獲得交差耐性を示すプロセスをいう。この点で化学療法薬に対する獲得耐性は、有効な癌治療にとっての重大な障害である。充分に特性確認された抗癌剤に対する耐性機序は、細胞から多様な細胞傷害性薬剤を流出させる原形質膜ATP依存的ポンプである、P−糖タンパク質(P−gp)および多剤関連タンパク質(MRP)群のタンパク質の過剰発現を伴うが、必ずしも全ての多剤耐性細胞がこれらのタンパク質を過剰発現するわけではないことから、多剤耐性の非P−gp/MRP仲介機序の存在が示されている。
【0003】
エポチロン類、特にエポチロンAおよびBは、例えば式
【化1】
[式中、Rは、水素(エポチロンA)またはメチル(エポチロンB)である]
を有する、新種の微小管安定化細胞傷害性薬剤(Gerth,K. et al.、J.Antibiot.49、560−3(1996)、またはHoefle et al.、DE4138042参照)を代表する。
【0004】
エポチロン類は、パクリタキセル(タキソール(登録商標))と同様、有糸分裂において細胞を抑止し、直接チューブリンおよび優先的には微小管に結合し、非有糸分裂細胞における細胞内微小管の束の形成を誘発し、超安定性チューブリンポリマーの形成を誘導する能力を有するマクロライドポリケチド類である。しかしながら、タキソール(登録商標)とは対照的に、エポチロンAおよびBは、それらがP−gp発現性多剤耐性癌セルラインに対する活性を保持している点で、P−gpについての基質であるとは思われない。さらに、エポチロン仲介による微小管安定化は、内毒素シグナル伝達、すなわち癌治療においてタキソール(登録商標)の非血液学的作用を仲介すると考えられている作用を誘発することはない(Muhlardt,P.F.およびSasse,F.(1997)Cancer Research 57:3344−3346参照)。
【0005】
さらに、エポチロンは、タキソール(登録商標)より高い水溶性を示すため、処方するのにより適している。エポチロン類はP−gpまたはMRP仲介多剤耐性を被らないため、それらは、他方でP−糖蛋白質排出ポンプの活性故に他の化学療法による治療に耐性を示す細胞の増殖を阻止し得る。細胞をエポチロンとインキュベーションすると、微小管の安定化、次いでアポトーシスが誘導される(Bollag,D.M.et al.,“Epothilones,a new class of microtubule−stabilizing agents with a TAXOL(R)−like mechanism of action”Cancer Research 55、2325−33(1995)、および Bollag D.M.,Exp.Opin.Invest.Drugs 6、867−73(1997)参照)。さらに、見たところ微小管上の同一または立体的に近い結合部位を共有しているにもかかわらず、エポチロン類は、β−チューブリンイソ型に一突然変異をもつタキソール(登録商標)耐性卵巣癌セルラインに対して活性を示すことが示されている(Kowalski,R.J.,et al.,J.Biol.Chem.272(4)、2534−2541(1997)参照)。
【0006】
2種のエポチロン耐性ヒト卵巣癌セルラインが以前文献において報告されているが(Giannakakou et al.,PNAS 97(6):2904−2909(2000))、本明細書に開示されているデータは、本発明セルラインが先に報告されたエポチロン耐性細胞とは表現型が異なることを示している。例えば、Giannakakou et al.により開示されたセルラインは、エポチロンAおよびBの両方に耐性を示し、本明細書に開示されているEA150細胞は、タキソール(登録商標)およびエポチロンBにごく僅かな耐性を呈すると思われる。同様に、Giannakakou et al.によるEpoA8セルラインはエポチロン耐性を示すが、パクリタキセル耐性については制限されており、本明細書に開示されているC5/0およびD4/40セルラインは両方ともパクリタキセルに対して完全な交差耐性を示す。さらに、本明細書に開示されているD4/40セルラインは、薬剤耐性だけでなく薬剤依存性も示す。さらに、Giannakakou et al.により開示されたエポチロン耐性セルラインは、チューブリンポリマー化を誘導し、細胞成長を阻止するエポチロンの能力に影響する獲得βチューブリン突然変異を含むことが示された。本明細書に開示されているC5/0およびD4/40セルラインは両方とも、HM40チューブリンイソ型に単一の点突然変異(274位のトレオニンをプロリンにより置換)をもつ。突然変異部位はEpoA8セルラインについて報告されたのと同一であり、突然変異(274位のトレオニンをイソロイシンにより置換)の性質は同一ではない。すなわち、類似突然変異は、本明細書に開示されているセルラインで見られる耐性機序に部分的に関与し得、本発明セルラインおよび Giannakakou et al.により報告されたセルライン間における表現型の差異は、依然として完全には特性確認されていないエポチロン耐性および付随的遺伝子型改変の作用機序が全耐性セルラインにおいて必ずしも同じではあり得ないことを示している。そのこと自体で、本発明のセルラインは、以前に報告されたエポチロン耐性細胞とは表現型および遺伝子型が異なるものと考えられる。
【0007】
発明の要約
本発明の一態様は、MDA−MB−435胸部腺癌セルラインのエポチロン耐性サブラインを提供する。一例において、エポチロン耐性セルラインは、10nMのエポチロンAに耐性を示し、EA10セルラインである。別の例において、エポチロン耐性セルラインは、20nMのエポチロンAに耐性を示し、EA20セルラインである。さらに別の例において、エポチロン耐性セルラインは、40nMのエポチロンAに耐性を示し、EA40セルラインである。さらに別の例において、エポチロン耐性セルラインは、60nMのエポチロンAに耐性を示し、EA60セルラインである。別の例において、エポチロン耐性セルラインは、150nMのエポチロンAに耐性を示し、EA150セルラインである。
【0008】
本発明の別の態様は、KB−31癌セルラインのエポチロン耐性サブラインを提供する。一例において、エポチロン耐性セルラインは癌セルライン297/C5/0である。別の例において、エポチロン耐性セルラインは、癌セルライン298/D4/40である。さらに別の例において、エポチロン耐性セルラインは癌セルライン315/sc5.9である。
【0009】
本発明の別の態様は、エポチロンと比べてエポチロン耐性細胞に対し改善された細胞傷害性を示す薬剤の同定方法であって、エポチロン耐性細胞および感受性細胞を試験すべき薬剤とインキュベーションし、エポチロン耐性細胞および感受性細胞について薬剤の細胞傷害性を測定し、そしてエポチロンと比べて低い耐性係数(耐性細胞についてのIC50値を親細胞についてのIC50値により除す)を示す薬剤を同定する工程を包含する方法である。
【0010】
本発明のさらに別の態様は、エポチロンと比較してエポチロン耐性細胞に対する選択的細胞傷害性を示す薬剤の同定方法であって、エポチロン耐性細胞および感受性細胞と試験すべき薬剤をインキュベーションし、エポチロン耐性細胞および感受性細胞についての薬剤の細胞傷害性を測定し、そして1より小さい耐性係数(耐性細胞についてのIC50値を親細胞についてのIC50値により除す)を示す薬剤を同定する工程を包含する方法を提供する。
【0011】
さらに別の態様において、本発明は、エポチロン耐性細胞に対し選択的細胞傷害性を示す本明細書に開示された方法にしたがって同定された薬剤を提供する。
【0012】
本発明の別の態様は、エポチロン耐性細胞の成長をインビトロまたはインビボで選択的に阻害する方法であって、本明細書に開示された方法にしたがって同定された1種またはそれ以上の細胞傷害性薬剤と耐性細胞を接触させることを含む方法である。
【0013】
本発明の別の態様は、エポチロン類の化学センシタイザーである薬剤の同定方法であって、試験すべき薬剤の存在および不存在下においてエポチロン耐性細胞を細胞が耐性を示すエポチロンとインキュベーションし、細胞についてのエポチロンの細胞傷害性を測定する工程を包含する方法で、薬剤の不存在下でインキュベーションされた培養物の場合と比べて薬剤の存在下でインキュベーションされた培養物における細胞傷害性の方が高いということが、薬剤が化学センシタイザーであることを示すものである方法である。
【0014】
さらに別の態様において、本発明は、本明細書に開示された方法にしたがって同定されたエポチロンの化学センシタイザーを提供する。
【0015】
さらに別の態様において、本発明は、インビトロまたはインビボでのエポチロン耐性細胞の成長を阻止する方法であって、エポチロン耐性細胞を1種またはそれ以上のエポチロンおよび本明細書に開示された方法にしたがって同定された1種またはそれ以上の化学センシタイザーと接触させることを含む方法を提供する。
【0016】
本発明の別の態様は、腫瘍細胞を含む潜在的エポチロン耐性細胞の同定方法であって、試験細胞から全mRNAを調製し、試験細胞の全mRNAからcDNAを調製し、慣用的方法により、例えばチップアレイ技術を用いてcDNA標本の遺伝子発現分析を遂行し、そして試験細胞から誘導された発現パターンを、エポチロン耐性細胞について得られたパターンと比較する工程を包含する方法であり、その場合、類似した発現パターンは、試験細胞が潜在的にエポチロン耐性細胞であることを示唆している。この方法の延長として、慣用的方法、例えばチップアレイ技術を適用することによって、罹患組織または試験細胞を非罹患対照組織または細胞と比較することにより差次的遺伝子発現パターンが得られ、次いで親エポチロン感受性細胞とエポチロン耐性細胞との比較により得られたパターンと差次的発現遺伝子のパターンが比較され得る。類似した差次的遺伝子発現パターンは、罹患組織または試験細胞が潜在的にエポチロンに耐性を示すことを示唆し得る。
【0017】
さらに別の態様において、本発明は、本発明のエポチロン耐性細胞に特異的な精製抗体を提供する。さらに、本発明は、医薬上許容される担体または希釈剤と共に1種またはそれ以上のこれらの精製抗体を含む医薬組成物を提供する。
【0018】
別の態様において、本発明は、エポチロン耐性セルラインの同定方法であって、本明細書に開示された1またはそれ以上の抗体を標識し、1またはそれ以上の標識抗体に試験細胞を暴露し、そしてそれへの1またはそれ以上の標識抗体の結合を測定する工程を包含する方法を提供する。
【0019】
さらに別の態様において、本発明は、エポチロン耐性セルラインの単離方法であって、本明細書に開示されている1またはそれ以上の抗体を蛍光染料で標識し、1またはそれ以上の蛍光標識抗体と細胞混合物をインキュベーションし、そして蛍光活性化細胞選別機の使用により1またはそれ以上の抗体で蛍光標識されたエポチロン耐性細胞を単離することを包含する方法を提供する。正常の非反応性細胞から抗体反応性エポチロン耐性細胞を分離する別の方法では、磁気ビーズと1またはそれ以上の請求の範囲に主張された抗体を共有結合的に結合させ、次いで磁気供給源を用いてそれらを固定し、未結合の非反応性細胞を洗浄することによりエポチロン耐性細胞を単離する。
【0020】
別の態様において、本発明は、エポチロン耐性細胞を殺す方法であって、細胞傷害性または治療活性を有する物質をエポチロン耐性細胞に特異的な1またはそれ以上の抗体に結合させ、細胞培養物(または患者)に1またはそれ以上の抗体を投与し、そしてエポチロン耐性細胞に細胞傷害性薬剤をターゲッティングしてこれらの細胞を選択的に殺すことを含む方法を提供する。
【0021】
さらに別の態様において、本発明は、インビボでのエポチロン耐性癌の診断方法であって、本明細書に開示された抗体の1またはそれ以上を標識し、1またはそれ以上の標識抗体を患者または患者組織標本に投与し、そして1またはそれ以上の抗体が結合している組織を同定することを含む方法を提供する。
【0022】
さらに別の態様において、本発明は、癌の治療方法であって、治療を必要とする対象にエポチロン耐性細胞に特異的な抗体の1またはそれ以上の治療有効量を投与することを含む方法を提供する。
【0023】
別の態様において、本発明は、エポチロンAまたはBの場合と類似した作用機序をもつ微小管結合性薬剤の同定方法であって、本発明のエポチロン耐性セルラインおよび対応する親セルラインを増加濃度の試験物質と接触させ、そして試験物質に対する親セルラインの耐性と比較された試験物質に対するエポチロン耐性セルラインの耐性を測定する工程を包含する方法を提供しており、親セルラインと比べてエポチロン耐性セルラインの試験物質に対する耐性の方が大きい場合、試験物質は、エポチロンAまたはBと類似した形でチューブリンと相互作用する微小管結合性薬剤であることが示唆される。この方法で同定された薬剤は、必ずしも限定されるわけではないが、エポチロン類似体を含み得る。
【0024】
さらに別の態様において、本発明は、上記で開示された方法にしたがって同定されたエポチロン類似体を含む微小管結合性薬剤を提供する。
【0025】
別の態様において、本発明は、潜在的微小管安定剤である化合物の同定方法であって、エポチロン依存的細胞を試験化合物とインキュベーションし(この場合、耐性細胞はエポチロンが剥奪されている)、そして依存的細胞の成長について検定する工程を包含する方法を提供し、依存的細胞が成長する場合は、化合物が潜在的微小管安定剤であることを示している。本明細書で開示されている方法にしたがって同定された微小管安定剤もまた、本発明の一態様として本発明に包含される。
【0026】
本発明のさらに別の態様は、腫瘍細胞を含む潜在的エポチロン耐性細胞の同定方法であって、慣用的分子生物学的技術を用いることにより、本明細書に開示されているエポチロン耐性細胞の特性を示す点突然変異を含む細胞を同定する工程を包含する方法を提供する。
【0027】
さらに別の態様において、本発明は、ベータチューブリンの突然変異形態の翻訳を阻止、すなわち本明細書に開示されているエポチロン耐性細胞の特性を示す点突然変異を含む核酸の領域に対しアンチセンスである核酸を用いて腫瘍細胞におけるエポチロン耐性を阻止する方法を提供する。
【0028】
発明の詳細な記載
以下、本開示全体を通じて使用されている略語を下記に列挙する。
P−gp=P−糖蛋白質
MDR=多剤耐性
MRP=MDR関連タンパク質
MEM=最少必須培地
MTS=3−(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル)−5−(3−カルボキシメトキシフェニル)−2−(4−スルホフェニル)−2H−テトラゾリウム、内部塩
PMS=フェナジンメトサルフェート
【0029】
この発明は、概してエポチロンAおよびエポチロンB耐性セルラインに関するものである。本発明の種々の態様は、エポチロン耐性の阻止および/または同定に関与する抗体および方法に関するものである。本発明の様々な態様は、以下の小節に記載されている。
【0030】
I.エポチロン耐性セルライン
薬剤耐性セルラインの選択方法は当業界では公知であり、一般的に増加濃度の薬剤の存在下において細胞を培養および継代培養することを含む。生存している細胞コロニーを、さらに高濃度の薬剤の存在下で拡大させることにより、結局は細胞の個々の耐性セルラインおよびサブラインが生じる(例えば、Akiyama et al.,Somat.Cell.Mol.Genetics 11:117−126(1985)参照)。本明細書で使用されている薬剤に対する細胞の「耐性」の語は、細胞が、感受性細胞よりもさらに高濃度の薬剤に抵抗する能力をいう。すなわち、ある細胞のエポチロン耐性は、適切なエポチロン感受性細胞に対して測定される。例えば、薬剤に連続的に暴露されていた細胞のエポチロンA耐性は、薬剤耐性細胞が誘導された親感受性細胞に対して測定され得る。薬剤(例、エポチロンA)に対する細胞の耐性は、典型的には対照感受性細胞に対するIC50(細胞成長を50%阻止するのに必要とされる薬剤の濃度)の増加として定量される。本明細書で使用されている「エポチロン耐性」の語は、エポチロンA、エポチロンBまたはその両方に対する耐性をいう。
【0031】
「エポチロン」の語は、エポチロンまたはエポチロン誘導体を全て包含する。好ましくは、「エポチロン」の語はエポチロンA、エポチロンB、PCT公開WO98/25929に開示されたエポチロン誘導体、またはそれらの混合物を意味する。さらに好ましくは、その語は、その化学構造が上記で提供されているエポチロンAおよびエポチロンBを意味する。
【0032】
本明細書で使用されている「試験細胞」は、エポチロン耐性である場合もそうではない場合もあり得る細胞をいう。
【0033】
本明細書で開示されている幾つかのエポチロン耐性セルラインは、増加濃度のエポチロンAの存在下におけるMDA−MB−435セルラインの培養および継代培養から得られた。MDA−MB−435セルラインは、胸部腺癌セルラインであり、ATCC(マナッサス、バージニア、アメリカ合衆国)から入手され得る。このセルラインは、10%胎児牛血清、1%L−グルタミン、ペニシリン(50単位/ml)およびストレプトマイシン(50μg/ml)を補った最少必須培地(MEM)を用いて単層で培養され、5.0%CO2中37℃で維持され得る。培地および補給物質は全て、メリーランド、ロックビルのギブコ・ライフ・テクノロジーズから入手され得る。細胞は、約20時間の倍加時間および約60%の相対的平板効率を示す。
【0034】
本明細書に開示されているエポチロン耐性EA10サブラインは、10nMのエポチロンA中、上記要領で親MDA−MB−435胸部腺癌セルラインをインキュベーションすることから誘導される。本明細書で使用されている「サブライン」(または「サブクローン」)の語は、1種またはそれ以上のエポチロンに対するその耐性によって親セルラインから誘導されるセルラインをいう。本明細書でEA20、EA40、EA60およびEA150と称されるエポチロン耐性セルラインは、各々20nM、40nM、60nMおよび150nMのエポチロン中における上記の連続インキュベーションによりEA10セルラインから選択される。本発明は、他の濃度のエポチロンAの存在下においてMDA−MB−435胸部腺癌セルラインの細胞を培養することにより選択され得る他のエポチロンA耐性セルラインを包含するものとする。エポチロンに対する細胞の比率耐性の増加は、耐性セルラインが誘導された親セルラインに対して評価され得る(例、耐性セルラインについてのエポチロンAのIC50対親セルラインについてのエポチロンAのIC50)。本発明のEA20、EA40、EA60およびEA150エポチロン耐性セルラインは、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約の規定に従って、2000年11月21日付でアメリカ合衆国20110−2209バージニア、マナッサスにあるアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)に寄託され、各々寄託番号PTA−2702、PTA−2708、PTA−2703およびPTA−2706が割当てられた。
【0035】
本発明の追加的エポチロン耐性セルラインは、KB−31ヒト類表皮腫癌セルラインを培養および継代培養することにより選択された。KB−31細胞は、上記で検討したMDA−MB−435セルラインと同様、ATCC(ATCC番号CCL−17)から入手され得るKB類表皮腫癌セルラインのサブクローンである。ヒト類表皮腫癌セルラインKB−31およびKB−8511、すなわちKB−31細胞から誘導されたP−gp過剰発現性MDRセルラインは、当初ロズウェル・パーク・メモリアル・インスティテュート(バッファロー、ニューヨーク)の、ドクターR.M.Bakerから入手されたもので(記載については、Akiyama et al.,Somat.Cell.Mol.Genetics 11:117−126(1985)および Fojo,A.etal.,Cancer Res.45:3002−3007(1985)参照)、以前に報告された要領で培養されている(Meyer,T.et al., Int.J.Cancer 43:851−856(1989))。KB−8511セルラインは、受入番号DSM ACC2342としてドイチェ・サムルンク・フォン・ミクロオルガニスメン・ウント・ツェルクルツレン・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング(DSMZ、マシェローダー・ベーク1b、D−38124ブラウンシュバイク、ドイツ国)において1998年2月20日にブタペスト条約のもとで寄託された。出願者らはまた、ブダペスト条約のもと2000年11月21日に本明細書で開示されている親KB−31セルラインをATCCに寄託した。このセルラインには、特許寄託指定番号PTA−2701が与えられた。
【0036】
KB−31細胞は、5%胎児牛血清、L−グルタミン(1%v/v)、ペニシリン(50単位/ml)を補った最少必須培地アルファ(MEMアルファ)を用いて単層で培養され得、さらにストレプトマイシン(50μg/ml)も加えられ得る(アニメド、バーゼル、スイス国)。細胞は約22時間の倍加時間を示す。コルチシン処理によりKB−31セルラインから誘導されたKB−8511は、KB−31細胞と比較してコルチシンに対し約40倍の相対耐性を示す。それらは、KB−31細胞と同じ条件下で培養され得る。長期の組織培養中、高レベルのP−gp発現を維持するために、デメコルシン(50ng/ml)をストック培養物の培地に加え得る(シグマ、セントルイス、ミズーリ)。KBセルラインは当初口の表皮癌から誘導されると考えられていたが、イソ酵素分析、ヒーラマーカー染色体およびDNAフィンガープリンティングは、親KBセルラインがヒーラ細胞汚染故に確立された可能性があることを示している。KBセルラインの特徴に関する追加的詳細および関連参考文献については、ATCCウェブサイト、http://www.atcc.orgで見ることができる。
【0037】
以下、実施例で詳細に説明されている通り、エポチロンAおよびB耐性セルラインは、増加濃度の薬剤中でKB−31細胞を培養することにより誘導された。得られた298/D4/40(KB−31/298)、297/C5/0(KB−31/297)および315/sc5.9(KB−31/315)と称されるセルラインは、ブダペスト条約の規約に従い、2000年11月21日付でATCCに寄託され、寄託番号PTA−2705、PTA−2704、PTA−2707が各々割当てられた。
【0038】
本発明は、他濃度のエポチロンの存在下、KBセルライン系統の細胞を培養することにより選別され得る他のエポチロン耐性セルラインを包含するものとする。
【0039】
II.抗体
本発明の別の態様は、本明細書に開示されたエポチロン耐性セルラインを用いて生産された抗体である。好ましくは、抗体は、本明細書に開示された1種またはそれ以上のセルラインに結合するが、(1)健康な組織には結合せず、および/または(2)親セルラインには結合しないモノクローナル抗体である。かかる抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体(mAb)、ヒト化(すなわち、非抗原結合領域におけるアミノ酸配列が改変されたことにより、抗体がヒト抗体とより密接に似たものとなるが、依然としてその本来の結合能力を保持している抗体分子)、キメラ抗体、一本鎖抗体、Fabフラグメント、F(ab’)2フラグメント、Fab発現ライブラリーにより製造されたフラグメント、抗イディオタイプ(抗−Id)抗体、および上記のいずれかのエピトープ結合性フラグメントを包含し得るが、限定されるわけではない。上記抗体は、(1)耐性セルラインを同定するための診断ツールとして、および(2)エポチロン耐性癌に罹患した患者を処置するために、細胞傷害性または治療活性を有する物質にカップリングされた場合には治療剤として有用である。本明細書で使用されている「細胞傷害性または治療活性を有する物質」の語は、その作用が細胞を破壊し得る分子、例えば放射性同位元素、毒素(例、ジフテリア毒素またはリシン)または化学療法薬、並びにその作用が別の細胞を破壊し得る細胞、例えば細胞傷害性細胞をいう。「細胞傷害性細胞」の語は、例えばマクロファージ、好中球、好酸球、NK細胞、LAK細胞および大型顆粒リンパ球といった細胞を包含する。抗体は、細胞傷害性細胞におけるFc受容体を通じて細胞傷害性細胞にカップリングされ得ると考えられる。エポチロン耐性細胞に結合する分子は、細胞傷害性または治療活性を有する物質に直接カップリングされ得るか(例、リシン結合モノクローナル抗体)またはかかる物質に間接的に連結され得る。例えば、腫瘍細胞および細胞傷害性細胞に架橋し得る二重特異性抗体が使用され得、それによって腫瘍細胞の溶解が容易になり得る。二重特異性抗体は、細胞傷害性細胞のFc受容体に結合することにより腫瘍細胞および細胞傷害性細胞を架橋させ得る。
【0040】
本発明は、本発明の抗体を用いてエポチロン耐性細胞を同定、単離および/または殺す方法、および(b)エポチロン耐性癌処置用医薬の製造におけるかかる抗体の使用法、かかる抗体を医薬上許容される担体または希釈剤と組合わせるかまたはそれらを随伴して含む医薬組成物を包含する。
【0041】
ポリクローナル抗体は、抗原、例えば標的遺伝子産物、またはその抗原機能性誘導体により免疫化された動物の血清から誘導された抗体分子の不均一集団である。ポリクローナル抗体を製造するためには、様々な宿主、例えば限定するわけではないが、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒトおよびその他を、生きている細胞、全細胞リゼイト、エポチロン耐性細胞からの部分精製リゼイトまたはエポチロン耐性細胞で優先的に発現されるタンパク質での注射により免疫化し得る。ラットおよびマウスは、モノクローナル抗体生産を伴う下流適用に好ましい宿主である。宿主の種により、様々なアジュバントが免疫応答を高めるのに使用され得る。上記アジュバントは、限定するわけではないが、フロイント(不完全または完全)アジュバント、鉱物ゲル、例えば水酸化アルミニウムおよび表面活性物質、例えばリゾレシチン、プルロニックポリオール類、ポリアニオン類、ペプチド類、油エマルジョン、KLH(キーホールリンペットヘモシアニン)およびジニトロフェノールを包含する。ヒトで使用されるアジュバントの中では、BCG(カルメット‐ゲラン杆菌)およびコリネバクテリウム・パルブム(Cornybacterium parvum)が特に好ましい。(抗体生産方法および分析の概説については、例えば Harlow,E.および Lane,D.(1988)Antibodies:A Laboratory Manual(コールドスプリングハーバー・ラボラトリー、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク)参照)。
【0042】
特定抗原に対する抗体の均一集団である、モノクローナル抗体は、培養中の連続セルラインによる抗体分子の生産を誘導する技術により得られる。これらには、Kohlerおよび Milsteinのハイブリドーマ技術(1975、Nature 256:495−497、および米国特許第4376110号)、ヒトB−細胞ハイブリドーマ技術(Kosbor et al.,1983、Immunology Today、4:72、Cole et al.,1983、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:2026−2030)、およびEBV−ハイブリドーマ技術(Cole et al.,1985、Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy、アラン・アール・リス、インコーポレイテッド、77−96頁)が含まれるが、限定されるわけではない。上記抗体は、IgG、IgM、IgE、IgA、IgDおよびそれらのサブクラスを含む免疫グロブリンクラスに属し得る。この発明のmAbを生産するハイブリドーマは、インビトロまたはインビボで培養され得る。高力価のmAbがインビボで製造されることから、現時点では好ましい製造方法である。
【0043】
さらに、適切な生物学的活性を有するヒト抗体分子からの遺伝子と一緒に適切な抗原特異性を有するマウス抗体分子からの遺伝子をスプライシングすることによる「キメラ抗体」の生産を目的として開発された技術(Morrison et al.,1984、Proc.Natl.Acad.Sci.、81:6851−6855、Neuberger et al.,1984、Nature、312:604−608、Takeda et al.,1985、Nature、314:452−454)が使用され得る。キメラ抗体は、異なる部分では由来する動物種も異なる分子、例えばネズミmAbに由来する可変または超可変域およびヒト免疫グロブリン不変域を有する分子である。
【0044】
別法として、一本鎖抗体の製造用を目的として報告された技術(米国特許第4946778号、Bird、1988、Science 242:423−426、Huston et al.,1988、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879−5883、および Ward et al.,1989、Nature 334:544−546)は、特異的発現遺伝子−一本鎖抗体を製造するように適合され得る。一本鎖抗体は、アミノ酸架橋を介してFv領域の重および軽鎖フラグメントを連結することにより形成され、エポチロン耐性細胞に特異的な一本鎖抗体が製造される。特異性は関連しているが、イディオタイプ組成が異なる抗体は、ランダムな組み合わせ免疫グロブリンライブラリーから鎖シャッフリング法により生成され得る。(例、Burton,D.R.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci. 88:10134−10137参照)。
【0045】
最も好ましくは、「ヒト化抗体」の生産に有用な技術は、本明細書に開示されているポリペプチド、フラグメント、誘導体およびそれらの機能的均等内容物質に対する抗体を産生させるように適合化され得る。上記技術は、米国特許第5932448、5693762、5693761、5585089、5530101、5910771、5569825、5625126、5633425、5789650、5545580、5661016および5770429号に開示されている。
【0046】
抗体はまた、リンパ球集団でのインビボ産生を誘導することにより、または文献に開示された高特異結合性試薬の免疫グロブリンライブラリーまたはパネルをスクリーニングすることにより製造され得る。(例、Orlandi,R.et al.,(1989) Proc.Natl.Acad.Sci.86:3833−3837、および Winter,G.et al.(1991)Nature 349:293−299参照)。
【0047】
特異的エピトープを認識する抗体フラグメントは、公知技術により生成され得る。例えば、上記フラグメントには、抗体分子のペプシン消化により製造され得るF(ab’)2フラグメントおよびF(ab’)2フラグメントのジスルフィド架橋を還元することにより生成され得るFabフラグメントがあるが、これらに限定はされない。別法として、Fab発現ライブラリーを構築することにより(Huse et al.、1989、Science、246:1275−1281)、所望の特異性をもつモノクローナルFabフラグメントの迅速で容易な同定が可能となり得る。
【0048】
本発明は、当業者が本発明セルラインに結合する二重特異性抗体およびテトラマー抗体複合体を製造することを可能にする。二重特異性抗体は、ハイブリッドハイブリドーマを形成することにより製造され得る。ハイブリッドハイブリドーマは、当業界で公知の手順、例えばStaerzおよびBevan、PNAS USA(1986)83:1453および Immunology Today(1986)7:241に開示された手順を用いて製造され得る。一般に、ハイブリッドハイブリドーマは、本発明のセルラインに結合し得る第一モノクローナル抗体を生産する第一セルラインおよび検出可能な物質、または毒性または治療活性を有する物質に結合し得る第二モノクローナル抗体を生産する第二セルラインを融合することにより形成される。二重特異性抗体はまた、Staerz et al.Nature(1985)314:628および Perez et al.Nature(1985)316:354で以前に報告された手順を用いる化学的手段を用いて構築され得る。テトラマー抗体複合体は、当業者によく知られた方法、例えば米国特許第4868109号に記載された教示内容にしたがって製造され得る。
【0049】
様々なイムノアッセイが、所望の特異性を有し、交差反応性が最小限である抗体を同定するためのスクリーニングに使用され得る。特異性が確立されたポリクローナルまたはモノクローナル抗体を用いる競争的結合または免疫放射線検定法用の多様なプロトコルは、当業界ではよく知られている。上記イムノアッセイは、典型的には、エポチロン耐性細胞で優先的に発現されるエポチロン耐性細胞またはタンパク質およびその特異抗体間の複合体形成の測定を含む。
【0050】
抗体結合親和力は、ラジオイムノアッセイ技術と連係的なスキャッチャード分析を含む慣用的方法により測定され得る。
【0051】
検出を容易にするために特に好ましいのは、サンドイッチアッセイであって、その若干の変形が存在しており、それらも全て本発明に包含されるものとする。例えば、典型的なフォワードアッセイでは、非標識抗体を固体基質に固定し、試験すべき標本を結合分子と接触した状態にする。適切なインキュベーション期間後、充分な時間をかけて抗体―抗原二元複合体を形成させ得る。この時点において、次いで検出可能なシグナルを誘導し得るリポーター分子で標識した第二抗体を加え、インキュベーションし、抗体‐抗原‐標識抗体の三元複合体を形成させ得るのに充分な時間をかける。未反応物質があれば洗浄し、そしてシグナルの観察により抗原の存在を測定するか、または既知量の抗原を含有する対照標本と比較することにより定量し得る。フォワードアッセイに関する変形は、標本および抗体の両方を結合抗体へ同時に加える同時検定法、または標識抗体および試験すべき標本を最初に合わせ、インキュベーションし、非標識表面結合抗体に加える逆検定法を包含する。これらの技術は当業者には熟知されており、小さな変化を加え得ることは容易に理解されるはずである。本明細書で使用されている「サンドイッチアッセイ」は、基本的2サイト技術に対する変形を全て包含するものとする。本発明のイムノアッセイの場合、唯一の制限因子は、標識抗体がエポチロン耐性細胞特異的抗体であることである。
【0052】
このタイプの検定法において最も一般的に使用されるリポーター分子は、酵素、発蛍光団−または放射性核種−含有分子である。酵素イムノアッセイの場合、通常グルタルアルデヒドまたは過ヨウ素酸手段により、酵素を第二抗体にコンジュゲートする。しかしながら、容易に認められるように、広く多様な種々のライゲーション技術が存在し、それらは当業者にはよく知られている。常用されている酵素には、特に西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ‐ガラクトシダーゼおよびアルカリ性ホスファターゼがある。特異酵素と共に使用される基質は、一般的に、対応する酵素による加水分解時に、検出可能な色の変化を生じるように選択される。例えば、p−ニトロフェニルホスフェートは、アルカリ性ホスファターゼコンジュゲートと使用するのに適しており、ペルオキシダーゼコンジュゲートの場合、1,2−フェニレンジアミンまたはトルイジンを一般的に使用する。また蛍光性基質を使用することも可能であり、それらは上記の色素原基質よりも蛍光性生成物を生じる。次いで、適切な基質を含有する溶液を抗体‐エポチロン耐性細胞特異抗原‐標識抗体の三元複合体に加える。この基質は第二抗体に結合した酵素と反応して定性的可視シグナルを与え、それを通常分光光度計によってさらに定量することにより、血清標本中に存在するエポチロン耐性細胞特異的抗原の量の評価が行われ得る。
【0053】
C5/0およびD4/40細胞、試験セルラインで同定された特定単一ヌクレオチド突然変異の存在可能性についてプローブするため、患者の腫瘍または血清標本は、当業界の分子生物学者に周知の突然変異検出技術により分析され得る。これらの技術には、SSO(配列特異的オリゴヌクレオチドの使用)、PASA(特異的対立遺伝子のPCR増幅)、固相ミニシーケンシング(小規模配列決定法)、マルチプレックス固相蛍光プライマー伸長法、OLA(デュアルカラー・オリゴヌクレオチドライゲーション検定法)、LCR(リガーゼ連鎖反応)およびUHG(普遍的ヘテロ二本鎖ジェネレーター)分析が包含され得る(これらの方法の概要については、Landgren(1996)“Laboratory Protocols for Mutation Detection”、オックスフォード・ユニバーシティー・プレス、ISBN0198577958参照)。
【0054】
別法として、蛍光性化合物、例えばフルオレセインおよびローダミンは、それらの結合能力を改変することなく抗体に化学的にカップリングされ得る。特定波長の光線での照明により活性化されると、蛍光色素標識抗体は、光エネルギーを吸収し、分子における興奮状態を誘導した後、特徴的なより長い波長の光を放射する。放射は、光学顕微鏡で視覚的に検出可能な特有の色として現れる。免疫蛍光およびEIA技術は、両方とも当業界では充分に確立されており、特に本発明方法には好ましい。しかしながら、他の受容体分子、例えば放射性同位元素、化学発光または生物発光分子も使用され得る。如何に要求された用途に適うよう手順を変更するかは当業者には容易に想到できることである。
【0055】
本発明の追加的態様は、医薬上許容される担体と連係させた、本明細書で検討されている治療効果のいずれかを目的とする、医薬組成物の投与に関するものである。上記医薬組成物は、エポチロン耐性細胞抗原に対する抗体を含み得るが、それらに限定はされない。上記組成物は、単独または少なくとも1種の他の薬剤、例えば安定性化合物と組合わせて投与され得、その場合、無菌の生体適合性医薬用担体、例えば限定するわけではないが食塩水、緩衝食塩水、デキストロースおよび水中で投与され得る。上記組成物は、患者に単独でまたは他の薬剤、例えば他の化学療法薬、薬剤またはホルモン剤と組合わせて投与され得る。
【0056】
本明細書で使用されている「他の化学療法薬」の語は、特に腫瘍疾患の処置で使用されるかまたは使用され得る化学療法薬をいい、例えば以下の種類から誘導された化学療法薬がある:
(A)アルキル化剤、好ましくは架橋化学療法薬、好ましくはビス−アルキル化剤、
(B)抗腫瘍抗生物質、好ましくはドキソルビシン(アドリアマイシン(登録商標)、ルベックス(登録商標))、
(C)代謝拮抗物質、
(D)植物アルカロイド類、
(E)ホルモン剤およびアンタゴニスト、
(F)生物応答修飾因子、好ましくはリンホカイン類またはインターフェロン類、(G)プロテインチロシンキナーゼおよび/またはセリン/トレオニンキナーゼの阻害剤、
(H)アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド誘導体、
(I)微小管安定剤/または不安定剤、または
(J)多種多様な薬剤またはその他または未知の作用機序をもつ薬剤。
【0057】
本発明に包含される医薬組成物は、限定されるわけではないが、経口、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、骨髄内、鞘内、心室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、経腸、局所、舌下または直腸手段を含むかなり多数の経路により投与され得る。
【0058】
有効成分に加えて、これらの医薬組成物は、医薬上使用され得る製剤への活性化合物の加工処理を容易にする賦形剤および補助物質を含む医薬上許容される担体または希釈剤を含み得る。「医薬上許容される担体または希釈剤」の語は、充填剤(フィラー)、例えば糖類、例えば乳糖、サッカロース、マンニトールまたはソルビトール、セルロース調製物および/またはリン酸カルシウム、例えばリン酸三カルシウムまたはリン酸水素カルシウム、および結合剤、例えばトウモロコシ、小麦、イネまたはジャガイモ澱粉を用いる例えば澱粉ペースト、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムおよび/またはポリビニルピロリドン、および/または所望ならば、崩壊剤、例えば上述の澱粉、同じくカルボキシメチル澱粉、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸またはその塩、例えばアルギン酸ナトリウムを包含するが、これらに限定はされない。賦形剤は、特に流動性調節剤および滑沢剤、例えば珪酸、タルク、ステアリン酸またはその塩類、例えばステアリン酸マグネシウムまたはカルシウム、および/またはポリエチレングリコールである。糖剤コアには、適切な、所望により腸溶のコーティングが施され、その場合、特に、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコールおよび/または二酸化チタンを含み得る濃縮糖溶液、または適切な有機溶媒中のコーティング溶液、または腸溶コーティングを製造する場合、適切なセルロース調製物、例えばエチルセルロースフタレートまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレートの溶液が使用される。カプセルは、ゼラチンでできた乾燥充填カプセル並びにゼラチンおよび可塑剤、例えばグリセリンまたはソルビトールでできた軟カプセルである。乾燥充填カプセルは、顆粒形態の有効成分を例えば充填剤、例えば乳糖、結合剤、例えば澱粉、および/または流動促進剤、例えばタルクまたはステアリン酸マグネシウムと共に、および所望の場合安定剤と共に含有し得る。軟カプセルでは、有効成分は、好ましくは適切な油性賦形剤、例えば脂肪油、パラフィン油または液体ポリエチレングリコール類に溶解または懸濁されており、また、安定剤および/または抗菌剤も添加され得る。染料または色素は、識別目的または異なる用量の有効成分を区別するため、錠剤または糖剤コーティングまたはカプセルケーシングに添加され得る。
【0059】
本明細書で使用されている「治療有効量」は、毒性または治療活性を有する物質に結合されたとき、徴候または病状を改善し得る、例えば腫瘍細胞の死を誘発し得る有効成分の量、例えば本明細書で開示されたエポチロン耐性セルラインに対して産生される抗体の量をいう。治療効率および毒性は、細胞培養物または実験動物における標準的医薬手順により決定され得、例えばED50(集団の50%における治療有効量)およびLD50(集団の50%における致死量)である。毒性および治療作用間の用量比が治療指数であり、それはLD50/ED50の比率として表され得る。高い治療指数を呈する医薬組成物が好ましい。細胞培養検定および動物試験から得られたデータは、ヒトに用いられる用量範囲の処方で使用される。上記組成物に含まれる用量は、好ましくはED50を含む循環濃度の範囲内であり、毒性をほとんどまたは全く伴わない。用量は、使用される用量形態、患者の感受性、および投与経路によりこの範囲内で変動する。
【0060】
いずれの化合物についても、治療有効量は、最初、例えば新生物細胞の細胞培養検定法、または通常はマウス、ウサギ、イヌまたはブタを用いる動物モデルにおいて評価され得る。動物モデルはまた、適切な濃度範囲および投与経路を決定するのに使用され得る。次いで、上記情報は、ヒトの場合に有用な用量および投与経路を決定するのに使用され得る。
【0061】
正確な用量は、処置を必要とする対象に関連した因子に照らして、現場の医師により決定される。用量および投与を調節することにより、活性部分のレベルを充分なものにし、または所望の効果を維持させる。考慮され得る因子には、病状の重症度、対象の全般的健康状態、対象の年齢、体重および性別、食餌療法、投与の時間および頻度、薬剤の組み合わせ(複数も可)、反応感受性、および治療に対する耐性/応答がある。長時間作用性の医薬組成物は、特定処方物の半減期およびクリアランス速度により、3〜4日ごと、毎週、または2週間ごとに1回、または3週間ごとに1回投与され得る。
【0062】
特定用量および送達方法に関するガイダンスは、文献に提供されており、一般的に当業界の実践者にとって入手可能なものである。当業者であれば、ヌクレオチドについてはタンパク質またはそれらの阻害剤の場合とは異なる処方物を使用するはずである。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は、特定の細胞、状態、位置などに特異的である。タンパク質の経口投与に適した医薬処方物は、例えば米国特許5008114、5505962、5641515、5681811、5700486、5766633、5792451、5853748、5972387、5976569および6051561号に記載されている。他の化学療法薬(複数も可)との組み合わせの場合、他の化学療法薬(複数も可)は、市販されており、当業者に周知の標準的処方物で使用される。
【0063】
処方および投与技術に関するさらなる詳細については、Remington’s Pharmaceutical Sciences(マーアック・パブリッシング・カンパニー、イーストン、ペンシルベニア)の最新版で見ることができる。
【0064】
III.本発明方法
本発明の一態様は、上記で開示された抗体を用いて、腫瘍細胞を含むエポチロン耐性細胞を同定し、単離し、および/または殺す方法に関するものである。例えば、検出方法は、試験細胞を、本明細書に開示されたエポチロン耐性細胞の内側または優先的には同細胞上で発現されたタンパク質に指向した抗体と接触させることを含み得る。この方法では、抗体を検出可能な物質で標識する。上記の検出可能な物質には、インビトロまたはエクスビボまたはインビボの腫瘍標本中においてエポチロン耐性腫瘍細胞を同定するのに使用され得る蛍光マーカー、酵素または放射性マーカーがある。エポチロン耐性腫瘍細胞は、エポチロン耐性について試験すべき腫瘍細胞と本発明抗体をインキュベーションすることにより同定され得る。エポチロン耐性特異抗体により認識される抗原が細胞の内側で発現されることが知られている場合、抗体投与前に細胞を透過性にするかまたは固定しなければならない。腫瘍細胞への抗体の結合は、エポチロン耐性細胞の内側または同細胞上で発現されたタンパク質が腫瘍細胞に存在していることを示している。腫瘍細胞への抗体結合レベルは、正常対照細胞への抗体結合レベルと比較され得、そして正常細胞と比べて腫瘍細胞への抗体結合が増加していることが、エポチロン耐性の指標として使用され得る。細胞(例、試験すべき腫瘍細胞または正常対照細胞)への抗体の結合は、抗体を標識している検出可能物質を検出することにより測定される。検出可能物質は抗体へ直接カップリングされ得るか、または別法として、検出可能物質は抗体と結合し得る別の分子にカップリングされ得る。例えば、第一抗体に指向した第二抗体の場合、第二抗体が検出可能物質にカップリングされている。
【0065】
エポチロン耐性腫瘍細胞は、インビトロまたはインビボの腫瘍標本から検出され得る。例えば、患者から摘出された腫瘍組織は、腫瘍標本として使用され得る。標本は、即座に使用されるかまたは後で使用するため−20℃未満の温度で冷凍貯蔵され得る。顕微鏡スライド上の腫瘍薄片は、標準的免疫組織化学技術を用いて抗体と、または標準的in situハイブリダイゼーション技術により核酸と反応し得る。さらに、腫瘍細胞の単一細胞懸濁液が得られる場合、腫瘍細胞を抗体と反応させ、フローサイトメトリーにより分析し得る。別法として、エポチロン耐性腫瘍細胞は、腫瘍をもつ対象からインビボで検出され得る。標識抗体は対象に導入され得、腫瘍に結合した抗体が検出され得る。例えば、抗体は、対象におけるその存在および位置が標準的造影技術により検出され得る放射性マーカーで標識され得る。
【0066】
エポチロン耐性腫瘍の同定に有用な試薬、例えば本発明抗体は、診断用キット中に組込まれ得る。このキットは、標本と比較される標準物質を含み得る。多様な試薬が適切な容器中でキットに内包され得、キットは、容器用ホルダーおよび使用説明書を含み得る。
【0067】
患者からの腫瘍薄片または血漿は、上記突然変異検出技術に基いて設計された分子プローブを用いるかまたは他の慣用的方法にしたがって分析され得る。さらに、本明細書で開示されているエポチロンA耐性細胞に特有な点突然変異を含む核酸の領域に指向したアンチセンス核酸が、当業者に熟知されている分子生物学的技術を用いて作製され得ると予想される。アンチセンス遺伝子を用いた遺伝子発現の調節に関する論文については、Weintraub,H. et al. Antisense RNA as a molecular tool for geneteic analysis(遺伝分析用分子ツールとしてのアンチセンスRNA)、Reviews−Trends in Genetics、1(1)巻(1986)を参照。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞においてエポチロン耐性を付与するタンパク質をコード化する核酸(例、mRNA)の発現を阻害する方法で使用され得る。このタンパク質の発現の減少は、アンチセンス核酸が導入された細胞のエポチロン耐性を阻害または除去する手段として使用され得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドを培養中のエポチロン耐性細胞に加えることにより、耐性が阻害された細胞が作製され得る。インビトロで上記細胞は、可能性のある治療剤を試験するのに使用され得る。また、アンチセンスオリゴヌクレオチドを遺伝子療法で使用することにより、対象においてエポチロン耐性癌を除去または阻止し得ることが予想される。これは、インビボでの核酸の慣用的送達技術を用いて行われ得る。当業者には公知であるアンチセンス核酸を含有する医薬化合物および処方物の使用および投与に関して多くの参考文献が存在する。(例えば、米国特許第6124133、6096543および6117848号参照)。
【0068】
さらに本発明は、腫瘍細胞を含むエポチロン耐性細胞の同定方法であって、cDNAマイクロアレイまたは他の慣用的方法を用いることにより、試験細胞、エポチロン耐性標本および対応するレファレンス標本(非罹患組織対照組織およびエポチロン感受性細胞)の全mRNAプールから調製されたcDNAの差次的遺伝子発現分析を遂行する工程を伴う方法を提供する。潜在的エポチロン耐性細胞の同定は、試験細胞および本発明エポチロン耐性セルライン対それらの対応する対照における差次的発現遺伝子の類似パターンを得ることに基いている。差次的遺伝子発現は、慣用的方法を用いてインビトロまたはインビボ供給源からの細胞標本から単離されたRNAから生成されたcDNAを用いて遂行され得る。全およびメッセンジャーRNA調製物、ノーザン分析および差次的遺伝子発現分析は、当業界で公知の方法のいずれかにしたがって遂行され得る。
【0069】
同様に、プロテオーム解析(細胞性タンパク質の2−Dゲル電気泳動)を遂行することにより、耐性関連タンパク質パターン(フィンガープリント)が同定され得る。具体的には、エポチロン耐性および感受性親細胞をプロテオーム技術で分析することにより、エポチロン耐性細胞に伴う差次的タンパク質発現パターンが同定され得る。すなわち、細胞からのタンパク質抽出物は、慣用的方法にしたがって二次元ゲル電気泳動(一次元等電点電気泳動および二次元SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動)により分解され得る。次いで、発現されたタンパク質は、銀染色または他の慣用的タンパク質染色方法により可視化され、2種のセルライン間でパターンが比較され得る。耐性セルラインの典型的な特徴である差次的タンパク質発現パターンは、他の推定的エポチロン耐性細胞を同定できる可能性をもつ「フィンガープリント」として使用され得る。
【0070】
さらに本発明は、エポチロン類の化学センシタイザーである物質の同定方法を提供する。本明細書で使用されている「エポチロン類の化学センシタイザー」の語は、耐性細胞に対する治療剤の効力を高め、および/または治療剤についての細胞の耐性を減少させ得る物質をいう。例えば、ベラパミルは、P−gp−仲介多剤耐性の化学センシタイザーである。ベラパミルの存在下では、多剤耐性細胞はアントラサイクリン類の細胞傷害性作用に対する感受性が高くなる。本発明のセルラインは、エポチロン類の化学センシタイザーである物質の同定方法において特に有用である。これは、試験すべき薬剤の存在および不存在下において細胞が耐性を示すエポチロンとエポチロン耐性細胞をインキュベーションし、そして細胞についてのエポチロンの細胞傷害性を測定する工程を包含し得、薬剤の不存在下でインキュベーションした培養物と比べて薬剤とインキュベーションした培養物の細胞傷害性の方が高い場合、その薬剤は化学センシタイザーであることが判る。細胞傷害性は、当業者に公知の方法、例えば比色分析システム、例えばCELLTITER96(登録商標)AQUEOUSアッセイ(プロメガ、マディソン、ウィスコンシン)を用いて測定され得る。
【0071】
本発明はまた、エポチロン類似体の同定方法を提供する。本明細書で使用されている「エポチロン類似体」の語は、エポチロン様特性を有する合成または天然化合物をいう。この語は、微小管安定剤を包含し得るが、限定するわけではない。ここで予測される通り、本発明のセルラインは、エポチロン類についてのセルラインの耐性を部分的に克服し得るエポチロン類似体を同定するのに使用され得る。例えば、エポチロン耐性セルラインおよび対応する親セルラインを増加濃度の試験物質とインキュベーションし、次いで耐性セルラインについて測定されたIC50値を親セルラインについて測定された同値で除すことにより、相対耐性係数が決定され得る。耐性係数が低い(レファレンスとして同検定法に含まれるエポチロンと比べて)試験化合物は、興味の対象である潜在的類似体を構成する。例えば、297/C5/0細胞および親KB−31細胞を増加濃度の試験物質とインキュベーションし、次いで297/C5/0について測定されたIC50値をKB−31細胞について測定された同値で除すことにより相対耐性係数が測定され得る。耐性係数が低い(レファレンスとして同検定法に含まれるエポチロンAと比べて)試験化合物は、潜在的ヒットを構成する。さらに、本明細書で開示されている298/D4/40セルライン(エポチロン耐性であり、エポチロン依存性でもある)による実験は、エポチロンの場合と類似した作用機構をもつ化合物の同定に有用である。例えば、慣用的方法を用いることにより、エポチロンAと類似した作用機序をもつ薬剤を同定する方法として、これらの細胞の増殖を支える薬剤についての様々なライブラリーがスクリーニングされ得る。
【0072】
本発明はまた、エポチロン耐性細胞に対して選択的細胞傷害性を示す物質の同定方法を提供する。本明細書で使用されている「細胞傷害性薬剤」の語は、細胞増殖を阻害し、細胞死を誘導する、抗癌剤を含む化合物をいう。この方法は、標準的方法を用いて、本明細書で開示されている耐性セルラインを試験すべき物質とインキュベーションし、耐性セルラインについての物質の細胞傷害性を測定し、それを親セルラインの場合と比較することを含み得る。エポチロン耐性セルラインを優先的に殺す化合物、すなわち成長阻害についてのIC50が耐性細胞の方が対応する親細胞化合物の場合よりも低い化合物がヒットとなる。これについての一例は、297/C5/0および298/D4/40細胞におけるビンクリスチンおよびデメコルシンである。
【0073】
本発明方法にしたがって同定された細胞傷害性薬剤およびエポチロン類の化学センシタイザーは、エポチロン耐性セルラインの成長を阻害する方法において特に有用である。細胞傷害性薬剤およびエポチロン類の化学センシタイザーを用いるエポチロン耐性セルラインの成長阻害方法では、エポチロン耐性細胞を1種またはそれ以上のエポチロンおよび1種またはそれ以上の化学センシタイザーと接触させる。本発明方法にしたがって同定された細胞傷害性薬剤を用いるエポチロン耐性セルラインの成長阻害方法では、耐性細胞を1種またはそれ以上の細胞傷害性薬剤と接触させる。「接触させる」の語は、インビトロ、エクスビボまたはインビボ投与を包含するものとする。本発明方法にしたがって同定された細胞傷害性薬剤および化学センシタイザーはまた、エポチロン耐性腫瘍を患う対象における(すなわち、エポチロン類が天然または獲得耐性故にもともとまたはもはや有効な治療剤ではない状況における)治療有用性を有し得る。上記細胞傷害性薬剤および化学センシタイザーの適切な医薬組成物、投与方法および用量は、当業者にとっては明白なものであり、上記で検討されたものを含む慣用的方法にしたがって遂行され得る。
【0074】
本発明を実践する場合、他に指示がなければ、当業者にとって遂行可能な細胞生物学、分子生物学、細胞培養、免疫学などの慣用的技術が使用される。これらの技術は最近の文献で詳細に開示されており、具体的にはSambrook,Fritschおよび Maniatis編、“Molecular Cloning A Laboratory Manual”第2版、(コールドスプリングハーバー・ラボラトリー・プレス、1989)、the series Methods of Enzymology(アカデミック・プレス、インコーポレイテッド)、および Antibodies:A Laboratory Manual、Harlow et al.編、コールドスプリングハーバー・ラボラトリー・プレス(1987)を参照。
【0075】
この明細書で述べられている出版物、特許および特許出願は全て、この発明が関係する技術分野の専門家の技能レベルを示すものである。
【0076】
上記で概説された本発明は、以下の実施例によりさらに理解し易くなるはずであり、これらは本発明のある態様の説明を目的としているに過ぎず、いかなる意味にせよ本発明を制限する意図はないものとする。
【0077】
実験
以下の原材料および方法を用いて実施例1〜6を行う:
エポチロン耐性細胞の選択
MDA−MB−435細胞を播種(1プレートにつき1×106細胞)し、37℃および5.0%CO2で10%胎児牛血清を補った薬剤不含有MEMにおいて密集度約80%まで成長させる。次いで、細胞の成長を、頻繁に培地を変えながら5週間にわたって10nmのエポチロンA(ノバルチス・アクチエン・ゲゼルシャフト、バーゼル、スイス国)含有培地で続行させる。個々の耐性コロニーを単離し、慣用的方法にしたがって12ウェル、6ウェル、25cmおよび75cmプレートで連続的に発展させる。次いで、耐性細胞(創始細胞)を高濃度のエポチロン中でインキュベーションすることにより、より高度の耐性セルラインを得る。
【0078】
成長阻害検定法
成長阻害は慣用的方法を用いて分析され得、例えばMTS検定法(プロメガ、ウィスコンシン)が使用され得る。この検定法では、1ウェルにつき約4000細胞を、10%胎児牛血清を補ったMEM中の96ウェルプレートに播種し、5.0%CO2中37℃でインキュベーションする。24時間後、薬剤の希釈液(使用される濃度範囲は1nMおよび1000nM間である)を加え、さらに72時間細胞を薬剤とインキュベーションさせる。次いで、PMSと混合したMTS試薬(製造会社の使用説明書によると、MTS:PMS 20:1)を加え、慣用的方法にしたがってサーモマックスのマイクロプレート読取りシステム(モレキュラー・ディバイシーズ、サニーヴェール、カリフォルニア)を用いて吸光度を定量する。24時間薬剤無しで成長させた細胞を成長対照として用いて薬剤濃度を測定することにより、細胞成長の50%阻害(IC50)が得られた。1プレートで1薬剤につき6検定を遂行する。
【0079】
ウエスタンイムノブロッティング
当業界で公知の技術にしたがって原形質膜タンパク質を抽出する(例えば、Georges,E.et al.(1991)J.Cell Physiol.148:479−484、Archianl−Matheis,A.et al.(1995)Oncol.Res.12:603−610参照)。等量のタンパク質をSDS−PAGEによる電気泳動にかけ、PVDF膜(ミリポア、マサチューセッツ)に移し、Monks,A et al.,JNCI、83:757−766(1991)にしたがってP−gpおよびMRPに対するモノクローナル抗体でプローブした。
【0080】
RNA単離およびノーザンブロッティング
慣用的方法(例えば、化合物および方法体系は、カリフォルニアのキアゲンにより市販されている)にしたがって、全RNAおよびポリA RNAを様々なセルラインから単離する。ポリA RNAの標識およびマイクロアレイチップのハイブリダイゼーションを購入する(インサイト・ファーマシューティカルズ、パロアルト、カリフォルニア)。慣用的方法にしたがってノーザン・ブロッティングを行い、10μgの全RNAを1%アガロースゲルにおいて電気泳動させ、ナイロン膜に移し、ESTクローン(ゲノム・システムズ、インコーポレイテッド、セントルイス、ミズーリ)から合成された33P標識プローブとハイブリダイズさせる。ノーザンブロットシグナルが検出され、慣用的方法にしたがいホスホイメージング技術を用いてこれらを定量する。フルオレサミン標識ヌクレオチドCy3−dUTPまたはCy5−dUTPを含むcDNAプローブは、カリフォルニア、パロアルトのインサイト・ファーマシューティカルズから入手される。
【0081】
細胞周期分析
慣用的方法にしたがって、細胞を、10%胎児牛血清を補ったMEM中1×106細胞の密度で10cm2組織培養皿に播種し、5.0%CO2中37℃で一晩インキュベーションし、薬剤(2×IC50濃度)に24時間暴露し、トリプシン処理により採取し、遠心分離により集め、10mlのPBS(リン酸緩衝食塩水)で1回洗浄する。冷70%エタノールに再懸濁し、5mlのPBSで再洗浄し、PI溶液(70μlのよう化プロピジウム、38mMのクエン酸ナトリウム、20μg/mlのリボヌクレアーゼA)に再懸濁することにより、細胞を固定する。37℃で30分間、PI溶液中でインキュベーション後、細胞を慣用的方法論にしたがってフローサイトメトリーにより分析する(装置およびソフトウェアはカリフォルニアのベクトン・ディッキンソン・イムノサイトメトリー・システムズにより市販されている)。
【0082】
実施例1
エポチロンA耐性セルラインの生成
上記方法にしたがって、親MDA−MB−435胸部腺癌セルラインのエポチロンA耐性サブクローンを確立する。具体的には、MDA−MB−435胸部腺癌細胞を、5週間37℃で5%CO2下10nMのエポチロンAの存在下において10%胎児牛血清を補ったMEM中でインキュベーションする。細胞の大多数は死ぬが、生残っているクローンを選択し、10nMのエポチロンAを含む培地中でさらに拡大させる。12耐性コロニーのうち一つが充分に拡大し、ここでこれをEA10セルラインと命名する。10nMエポチロンA含有培地中でEA10細胞を維持する。さらに高濃度のエポチロンAでのEA10細胞(創始細胞)の連続培養により、追加的な、より耐性の高いセルラインが得られる。20nM(EA20)、40nM(EA40)、60nM(EA60)または150nM(EA150)エポチロンAに耐性を示すセルラインをこの要領で単離する。
【0083】
実施例2
エポチロンA耐性細胞は、エポチロンA誘導G2/Mブロックを克服する
エポチロンA耐性および親MDA−MB−435エポチロンA感受性細胞の細胞周期分布パターンを、標準FACS分析法により比較する。データは、20nMエポチロンAの存在下で24時間培養されたMDA−MB−435細胞のほとんどにおける細胞分裂過程が、細胞周期のG2/M期で遮断されていることを示す。対照的に、60nMエポチロンA中で24時間培養されたEA60細胞の大集団は、G2/M期ブロックを克服し、G1およびS期に再び入る。すなわち、エポチロンA耐性細胞集団のかなりの部分は、通常エポチロンA感受性細胞の細胞周期で起こるG2/Mブロックを克服すると思われる。
【0084】
実施例3
エポチロンA耐性細胞において可能性のある2種の耐性機序
MTS検定法を用いて、50%のMDA−MB−435、EA10、EA20、EA40、EA60およびEA150細胞の成長阻害に必要とされる薬剤の濃度(IC50)を測定する。表1で示されている通り、EA10およびEA20細胞におけるエポチロンAのIC50は、MDA−MB−435細胞よりもそれぞれ5倍および7倍増加している。興味深いことに、エポチロンAのIC50は、EA20およびEA40細胞において本質的に同じであるが、EA40細胞は、EA20細胞の選択に使用されるエポチロンAの2倍濃度で選択される。しかしながら、EA60およびEA150細胞においてエポチロンAのIC50の15倍および>100倍増加がそれぞれ観察される。さらに、エポチロンAに対する耐性が増加しているのとは対照的に、EA40およびEA150細胞は等しくタキソール(登録商標)に対し耐性を示す。すなわち、エポチロンA耐性の少なくとも2種の機序が存在し得る可能性があり、低い方の耐性機序はタキソール(登録商標)に対し交差耐性であり、そして高い方はエポチロンA特異的耐性機序である。
【0085】
表1
MDA−MB−435、EA10、EA20、EA40、EA60およびEA150細胞で比較されたエポチロンA(EpoA)、エポチロンB(EpoB)およびタキソール(登録商標)のIC50値
【表1】
【0086】
実施例4
P−gpまたはMRPは、エポチロンAに対する耐性を仲介しない
P−gpおよび/またはMRP発現レベルを、ウエスタンイムノブロッティングによりエポチロンA感受性および耐性細胞において分析する。データは、多剤耐性MDA/T0.3細胞およびアドリアマイシン耐性HL60細胞がそれぞれP−gpおよびMRPを発現するが、P−gpもMRPも感受性MDA−MB−435細胞または耐性EA10もしくはEA20細胞からは検出されないことを示している。
【0087】
本明細書に開示されているエポチロンA耐性細胞がP−gp基質であるタキソール(登録商標)に対して呈する交差耐性は限られているため、エポチロン耐性はウエスタンブロッティングにより検出され得ないほど低いレベルのP−gpにより仲介される可能性が存在する。それなりに、エポチロン耐性細胞は、P−gp阻害剤により除去され得る他のP−gp基質に対しある程度の交差耐性を有する。この可能性を調べるため、MTS検定法を用いて、P−gp基質、ビンクリスチン、ドキソルビシンおよびビンブラスチンの細胞傷害性をエポチロンA耐性細胞に対して測定する。表2で示されている通り、親MDA−MB−435セルラインおよびエポチロンA耐性EA40セルラインは、3種の細胞傷害性薬剤全てに等しく感受性を示す。EA20および耐性MDA/T0.3細胞を[3’−デスオキシ−3’−オキソ−MeBmt]1−[Val]2−シクロスポリン(PSC−833、米国特許第5525590号に開示されているP−gp阻害剤)の存在下においてタキソール(登録商標)またはエポチロンAとインキュベーションすると、タキソール(登録商標)に対するMDA/T0.3細胞の耐性は除去されるが、エポチロンAに対するEA2の耐性に対する効果は全く観察されない。
【0088】
MDA/T0.3は、タキソール(登録商標)へのMDA−MB−435細胞の暴露を増強することにより選択されたMDA−MB−435細胞のクローン性サブラインである。MDA/T0.3細胞は、高レベルのP−糖蛋白質を発現し、様々な化学的および機能的に関連の無い化合物に対し耐性を示す。MDA/T0.3細胞は、P−糖蛋白質排除剤PSC−833での処理により多様な細胞傷害性薬剤に感作され得る。
【0089】
これらのデータを考え合わせると、P−gpまたはMRPはエポチロン耐性を仲介せず、これらの薬剤排出タンパク質はこれらの細胞でアップレギュレーションされないことが示されている。
【0090】
表2
MDA−MB−435、MDA/T0.3およびEA40細胞で比較した様々なP−gp基質のIC50
【表2】
【0091】
実施例5
エポチロン耐性細胞の特徴である差次的遺伝子発現
高密度cDNAマイクロアレイを含む慣用的方法を用いて、エポチロン耐性細胞に特有な差次的遺伝子発現が検査され得る。例えば、RNAをMDA−MB−435、EA20、EA40およびEA150細胞から単離し、これらを用いてフルオレサミン標識ヌクレオチドcye3−dUTPまたはcye5−dUTPを組込むcDNAプローブを製造した。ガラスチップ(インサイト・ファーマシューティカルズ、カリフォルニアにより市販されている)上における7500の非重複遺伝子特異的cDNA配列のマイクロアレイを、試験標本としてEA20、EA40またはEA150細胞および対照としてMDA−MB−435からの全RNAプールの蛍光標識cDNA発現産物と同時にハイブリダイズさせる(標識およびハイブリダイゼーションは、カリフォルニア、パロアルトのインサイト・ファーマシューティカルズにより行なわれた)。各ハイブリダイゼーションについて、試験および対照を異なる蛍光標識で標識し、各cDNAスポットについて、各プールにおけるその発現産物の相対量を、当業界で公知の方法にしたがってそのスポットで発生された純(ネット)蛍光シグナルにより測定する(例えば、Shena,M.et al.(1995)Science 270:467−470参照)。MDA−MB−435およびEA150細胞からのcDNAとハイブリダイズしたチップ(ただし、各cDNAプールは異なる染料で標識されている)からは、幾つかの差次的発現遺伝子が生じる。遺伝子発現データの分析は、プロプライエタリ(知的所有権をもつ)ソフトウェアを用いて行われるが、慣用的方法体系も使用され得る。デュプリケイト実験の比較は、3倍未満での差次的発現遺伝子のレベルにおける揺らぎを示している(データは示さず)。3倍を越えて差次的発現された遺伝子についてさらなる分析を行った。マイクロアレイ結果を確証するため、差次的発現遺伝子のサブセットを慣用的方法にしたがってノーザンブロッティングにより分析し、分析された遺伝子のサブセットの差次的発現を確認する。
【0092】
遺伝子発現における大規模で非特異的な変化がエポチロンA耐性細胞の選択中に生じなかったことを確かめるために、3倍より大きく変化している遺伝子の比率を算出する。チップ上に配列された7500の遺伝子のうち、4000スポットからシグナルが検出され、発現が変化しているのは僅か1.8%に過ぎない。同数の遺伝子が、EA40およびEA150細胞において差次的に発現されている。
【0093】
特異的にエポチロン耐性細胞において差次的に発現されている遺伝子をさらに区別するため、マイクロアレイチップは、MDA−MB−435親セルラインおよびタキソール(登録商標)の存在下で選択された多剤耐性MDA/T0.3セルラインから合成されたcDNAによりプローブされ得る。MDA/T0.3またはEA150細胞で差次的に発現された遺伝子の比較により、両セルラインでアップレギュレーションまたは抑制された遺伝子が同定され得る。発現がEA150細胞で変化した遺伝子のうちの僅かなパーセンテージのみがMDA/T0.3細胞でも変化した。すなわち、マイクロアレイヒットの大部分はエポチロンA耐性細胞に特異的である。
【0094】
マイクロアレイに存在するEST配列によりNCBIデータベースを検索すると、エポチロンA耐性セルラインでアップレギュレーションされた遺伝子が50%を越える割合で既知インターフェロン誘導性タンパク質をコード化することが示されている。これらのアップレギュレーション遺伝子の大部分は、組織適合性II類タンパク質(HLAII)をコード化する。興味深いことに、若干のアップレギュレーションされた遺伝子の発現はエポチロンA耐性の増加と共に変化し、HLAIIタンパク質を含む。
【0095】
非インターフェロン誘導性アップレギュレーション遺伝子のほとんどは、細胞表面タンパク質または細胞内シグナル伝達性タンパク質をコード化する(表3)。少数のアップレギュレーション遺伝子はまた、微小管関連または細胞骨格タンパク質、薬剤代謝性酵素またはストレスタンパク質としても同定された。
【0096】
表3
生化学的機能または発現部位によるEA150細胞でアップレギュレーションされた遺伝子の分類
【表3】
【0097】
本明細書に開示されているエポチロンA耐性細胞、特にEA150セルラインの場合に特有な遺伝子発現パターンを用いることにより、エポチロン耐性であり得る腫瘍細胞を含む細胞が同定され得る。例えば、cDNAを試験細胞から入手し、これらの細胞の遺伝子発現について慣用的方法にしたがって特性検定し得る。本明細書で主張されているエポチロンA耐性細胞の場合(例、EA150セルライン)と類似した発現パターンは、試験細胞が潜在的にエポチロン耐性であることを示している。
【0098】
以下の原材料および方法を用いて実施例6〜13を遂行する。
エポチロンAおよびBは、バイオモレキュラー・プロダクション・ユニット、ノヴァリティス・アクチエン・ゲゼルシャフトにより粘液細菌ソランギウム・セルロスム(Sorrangium cellulosum)を醗酵させ、次いで精製することにより得られる(例、Hofmann et al.、WO9942602)。パクリタキセルはカルビオケム(ラジョラ、カリフォルニア)から入手される。ディスコデルモリドは、S.Pomponi(ハーバー・ブランチ・オーシャングラフィック・インスティテュート、フォートピアス、フロリダ)から得られるが、米国特許5010099記載の要領でも入手され得る。ヴィンブラスチンサルフェート(ヴェルベ(登録商標))は、イーライ・リリー(インディアナポリス、インディアナ)から購入され、デメコルシンおよび5−フルオロウラシルはシグマ(セントルイス、ミズーリ)から購入される。パラプラチンは、ブリストル・マイヤーズ・スクイブ(プリンストン、ニュージャージー)から入手される。
【0099】
エポチロン耐性細胞の選択
ヒトKB−31(薬剤感受性)およびKB−8511(多剤耐性、P−gp(P−糖蛋白質)過剰発現性)類表皮腫癌細胞は、ロズウェル・パーク・メモリアル・インスティテュート(バッファロー、ニューヨーク、アメリカ合衆国)のドクターR.M.Bakerから得られ(ATCCを通じても得られる)、前記にしたがって培養される(Utz et al.,Int.J.Cancer57:104(1984))。簡単に述べると、5%(v/v)CO2および80%相対湿度雰囲気中37℃で完全MEM−アルファ培地(5%胎児牛血清および1%(v/v)L−グルタミンを補った最少必須培地−アルファ)により細胞を培養する。
【0100】
KB−31類表皮腫癌細胞を、10cm皿1枚につき0.5×106細胞で播種し、1.7nMエポチロンAの存在下、完全MEM−アルファ培地中で3日間インキュベーションする。5nMのエポチロンAの存在下でさらに3日間インキュベーション後、細胞を継代培養(分裂比1:10)し、5nMのエポチロンAの存在下で拡大させる。次いで、段階的(2倍)増加濃度のエポチロンAへの断続的暴露により、生残っている細胞を選別する。この過程中における幾つかの段階で、単一細胞コロニーを機械的な力により10cm皿から除去し、24ウェル皿、25cmおよび75cmフラスコで拡大させる。皿に残っているコロニーをプールし、2倍高濃度のエポチロンAの存在下で再播種し、上記と同様個々のコロニーを拡大させる。この選別手順によりEpoA320−80Cと呼ばれるサブラインが得られ、これをまず320nMエポチロンA(他の培地交換/継代培養ごとに含まれる)の断続的存在下で選別し、それに続いて80nMエポチロンA(培地交換/継代培養ごとに含まれる)中での連続成長に適合化させる。このサブラインは、エポチロンAの存在に部分的に依存していることが判った。しかしながら、薬剤の不存在下で成長したEpoA320−80Cのサブライン(おそらく代償的突然変異を伴うと思われる)を単離することも可能であり、これをEpoA320/NDと命名した。サブラインのクローン性を確認するため、それらを追加ラウンドの継代培養にかけることにより、EpoA320−80CおよびEpoA320/NDからそれぞれ誘導される、298/D4/40および297/C5/0ラインが得られた。298/D4/40の最適成長は40nMエポチロンAの存在下で行なわれ、297/C5/0はエポチロンAの不存在下で成長する。同様のスキームを用いて、エポチロンBの存在下で成長するKB−31細胞を選別する(出発濃度0.6nM)。315/sc5.9と称される耐性度が最高であるサブクローンを最初2.0nMエポチロンBの存在中で維持し、次いでエポチロンBの不存在下での成長に適合化させた。
【0101】
インビトロ細胞成長阻害検定
基本的には報告された要領(Meyer et al.,Int.J.Cancer43:851(1989))で抗増殖検定法を遂行する。簡単に述べると、細胞を1.5×103細胞/ウェルで96ウェルのマイクロタイタープレートに播種し、一晩のインキュベーションにより接着させる。化合物を1日目に連続希釈で加える。次いで、プレートをさらに3日間インキュベーションした後、慣用的方法にしたがって、細胞を3.3%v/vグルタルアルデヒドにより固定し、水で洗浄し、0.05%w/vメチレンブルーで染色する。洗浄後、染料を3%HClで溶離し、製造会社の使用説明書にしたがってスペクトラマックス・プラス(モレキュラー・デヴァイシーズ、サニーヴェール、カリフォルニア)により光学密度を665nmで測定する。式(処理OD−出発OD)/(対照OD−出発OD)×100を用いたSoftPro2.6.1プログラム(モレキュラー・デヴァイシーズ、サニーヴェール、カリフォルニア)を用いて数学曲線の当てはめによりIC50値を測定する。IC50は、インキュベーション期間の最後における純細胞成長の50%阻害に至らしめる薬剤濃度として定義される。セルライン298/D4/40によるIC50測定は、40nMのエポチロンAの存在下で遂行される。
【0102】
細胞ベースおよび細胞不含有チューブリンポリマー化検定法
それぞれ無傷および溶解細胞における非ポリマー化およびポリマー化チューブリン間の割合の薬剤誘発による変化は、基本的には報告された要領(Giannakakou et al.,Int.J.Cancer75:57−63(1998))で評価される。簡単に述べると、細胞薬剤効果を評価するため、2×105細胞を24ウェルプレート1枚につき最大6ウェルまで1mlの容量で播種する。37℃で18〜24時間インキュベーションして細胞を付着させた後、試験物質を細胞培養培地に加えて所望の濃度を達成し、次いで37℃で2時間細胞のインキュベーションを行う。最終賦形剤濃度は1%である。次いで、一度に1プレートを減光した組織培養フードに移し、細胞を、Ca++およびMg++を欠く室温リン酸緩衝食塩水(PBS/O)1mlで2回洗浄する。残存するPBS/Oを注意深く除去した後、100μlの室温低張性溶解緩衝液A(HLB/A:20mMのトリス−HCl(pH6.8)、1mMのMg2Cl、2mMのEGTA、2mMのペファブロック、1mMのベンズアミジン、10μg/mlのアプロチニン、10μg/mlのロイペプチン、0.5%のノニデットP−40)を加え、プレートをアルミホイルで包むことにより、光に誘導されたチューブリンポリマー化によるアーチファクトを最小限にする。37℃で正確に5分間インキュベーション後、細胞を削り取って採取し、室温のエッペンドルフ管に移す。採取したウェルを100μlの室温HLB/Aで1回洗浄し、対応する初回標本とプールする。管を5秒間渦状に混合して細胞溶解を促した後、12000×gの卓上遠心分離器中室温で10分間遠心分離することにより、非ポリマー化チューブリン(上清)から微小管(ペレット)を分離する。次いで、上清を注意深く新たなエッペンドルフ管に移し、さらなる処理時まで氷上で貯蔵する。同時に、沈澱物質を、200μlの室温再懸濁緩衝液(RSB:10mMのトリス−HCl(pH7.5)、1.5mMのMg2Cl、2mMのEGTA、1mMのペファブロック、1mMのベンズアミジン、10μg/mlのアプロチニン、10μg/mlのロイペプチン、0.5%のノニデットP−40)に再懸濁する。30秒間ソニケーター水浴中にエッペンドルフ管を置くことにより、ペレットの可溶化を助ける。次いで、上清および可溶化されたペレット標本に、95℃で5分間加熱した6×標本ローディング緩衝液(U.K.Laemmli(1999)Nature 227、680−685)を補足し、下記要領により10%分解/5%濃縮用ポリアクリルアミドゲルでのSDS−PAGEにかける。
【0103】
細胞不含有系における非ポリマー化およびポリマー化チューブリン間の割合に対する薬剤効果を評価するため、細胞を薬剤添加時に溶解し、以下の要領で処理する。上記と同様に、細胞を播種し、18〜24時間インキュベーションする。次いで、一度に1プレートを減光した組織培養フードに移し、細胞を1mlの室温PBS/Oで2回洗浄する。残存するPBS/Oを注意深く除去した後、所望の濃度の試験物質を含有する200μlの室温HLB/Aを細胞に加える。最終賦形剤濃度は1%である。プレートをアルミホイルで包み、37℃で5分間インキュベーションする。次いで、リゼイトをエッペンドルフ管に移し、5秒間ボルテックスした後、12000×gの卓上遠心分離器中室温で30秒間遠心分離にかける。標本のさらなる処理は上記と同様に遂行される。
【0104】
粗細胞下分画
本質的には報告された要領(Borner et al.,J.Biol.Chem.264:13902−909(1989))で粗細胞下分画を行うことにより、細胞質ゾルおよび膜(「顆粒」)細胞構成成分を分離する。簡単に述べると、1×106細胞を10cm皿に播種し、密集成長の70〜80%に達するまで37℃でインキュベーションする。氷へ移した後、培地を吸引除去し、細胞を10mlの氷冷PBS/Oで2回洗浄する。残存する洗浄緩衝液を注意深く除去した後、細胞を500μlの低張性溶解緩衝液B(HLB/B:25mMのヘペス(pH7.5)、25mMのβ−グリセロホスフェート、2mMのEDTA(pH7.4)、1mMのPMSF、10μg/mlのアプロチニン、10μg/mlのロイペプチン、1mMのNa3VO4)中で採取し、エッペンドルフ管へ移し、氷上に置く。溶液の泡立ちを回避する、ブランソン振動器250(50%デューティーサイクル、パワー出力設定6)を用いて細胞を10バーストで音波処理にかける。次いで、音波処理した細胞リゼイトを、4℃に予冷しておいた卓上遠心分離器中12’00×gで15分間遠心分離する。次いで、上清(=細胞質ゾル)を新たなエッペンドルフ管に移し、さらなる処理時まで氷上で貯蔵する。その間、残存するペレット標本を注意深く1mlのHLB/Bですすぐ。250μlのトリトン溶解緩衝液(TLB:HLB/B、1%トリトンX−100を補充)を加えた後、上記と同様に標本を音波処理し、遠心分離にかける。次いで、生じた上清(=膜)を新たなエッペンドルフ管に移す。タンパク質含有量を測定(BCAキット、ピアス、ロックフォード、イリノイ)後、等タンパク質量をSDS−PAGE(7%分解/5%濃縮用ポリアクリルアミドゲル)により分解し、下記要領で抗原を免疫ブロッティングにより検出する。
【0105】
免疫ブロッティング
タンパク質をSDS−PAGEにより分離し、PVDF膜(ミリポア)に移し、ウサギ抗P−gp抗体(PC03、希釈率1:100)(カルビオケム、サンディエゴ、カリフォルニア)またはマウス抗ベータ−チューブリン(tub2.1、希釈率1:1000)(シグマ、セントルイス、ミズーリ)および対応する西洋ワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体(希釈率1:10000)(アマーシャム、ピスキャタウェイ、ニュージャージー)でプローブする。製造会社の使用説明書(ECL)(アマーシャム、ピスキャタウェイ、ニュージャージー)にしたがって強化された化学発光方法を用いて免疫複合体を検出する。
【0106】
実施例6
エポチロン耐性セルラインの生成
エポチロン耐性セルライン、EpoA320−80C、EpoA320/ND、298/D4/40、297/C5/0および315/sc5.9を上記で開示されている要領で生成させる。具体的には、KB−31細胞の増殖を、3.2nMのエポチロンAの存在下で半最大阻害する。段階的増加濃度のエポチロンAと断続的スケジュールでKB−31類表皮腫癌細胞をインキュベーションすると、顕著に高い濃度のエポチロンAの存在下でも成長し得る細胞の出現が誘発される。すなわち、EpoA−320細胞は、3日間薬剤不在断続期間をもって週1回投与されると、320nMのエポチロンAの存在下でも成長した。サブクローン、298/D4/40を、週2回(すなわち、培地交換ごとに)投与された40nMエポチロンAの存在下で成長するように適合化させる。興味深いことに、これらの細胞は、親細胞において50%の細胞成長低下に至らしめる濃度の10倍を越える濃度のエポチロンAの存在下でも生残るだけでなく、さらに最適な成長についてもこの薬剤量に依存的であることが見出された。さらに、298/D4/40細胞からエポチロンAが剥奪されているとき、それらは細胞周期のG2/M期で成長を停止し、結局はアポトーシスにより死ぬ。興味深いことに、2種の他の微小管安定剤である、エポチロンBおよびパクリタキセルは、このセルラインの成長を維持する場合にエポチロンAの代わりに用いられ得る(類似した薬剤依存的表現型は、既にEpoA−320−80C細胞について言及されている)。これは、298/D4/40細胞が、他の微小管安定剤により補足され得る形でそのチューブリンの機能性に欠陥を生じさせる突然変異を獲得したことを示唆している。すなわち、このセルラインは薬剤スクリーンで使用され得、その場合微小管安定機構を伴う可能性がある化合物は、エポチロンA剥奪298/D4/40細胞の成長を維持することによって同定され得る(下記参照)。それにもかかわらず、エポチロンAの不存在下で長期間インキュベーションすると、エポチロンAに対しまだ部分的に耐性を示すが、298/D4/40の薬剤依存的表現型を喪失したサブラインを単離することができ、これは代償的突然変異に起因すると予測される。このセルラインのサブクローン、297/C5/0は、さらなる分析に使用される。
【0107】
エポチロンAをエポチロンBまたはパクリタキセル(タキソール(登録商標))と置き換えてもエポチロンA耐性/依存的セルライン298/D4/40の成長が維持され得るという事実は、このセルラインを薬剤スクリーンに使用しても、エポチロンAの場合と類似した作用機序を有する化合物が同定され得ることを示している。それを行うために、298/D4/40細胞(予めエポチロンAが剥奪されている)を増加濃度の試験化合物とインキュベーションした後、慣用的方法にしたがって3日間のインキュベーション期間の最後に細胞数が測定され得る。可能性のあるヒットは、この検定法における陽性対照として含まれ得るエポチロンA(またはパクリタキセル)と同様に298/D4/40細胞の成長を維持するものである。
【0108】
実施例7
298/D4/40および297/C5/0細胞の薬剤耐性プロフィール
第1セットの分析において、298/D4/40および297/C5/0の薬剤耐性プロフィールを測定する(表1参照)。両エポチロンA選択セルラインは、部分的または完全にエポチロンBおよびパクリタキセルに対して交差耐性を示すが、興味深いことに別の微小管安定剤であるディスコデルモリドには交差耐性を示さない。他方、298/D4/40および、程度は劣るにせよ297/C5/0は、微小管不安定剤ビンブラスチンおよびデメコルシンに対し高感受性であると思われる。いずれのセルラインとも標準細胞傷害性薬剤ドキソルビシン、5−フルオロウラシルまたはパラプラチンに交差耐性を示さない(298/D4/40について示されたパラプラチンに対する耐性のごく僅かな増加を除く)。対照的に、P−糖蛋白質過剰発現性KB−8511細胞は、パクリタキセル、ビンブラスチン、デメコルシンおよびドキソルビシンに耐性を示すため、古典的多剤耐性プロフィールを呈する。これらを考え合わせると、292/D4/40および297/C5/0について観察される耐性プロフィールは、古典的な多剤耐性の場合とは区別される。
【0109】
表4 エポチロン選択KB−31サブラインの交差耐性プロフィール
【表4】
【0110】
以下の方法にしたがって表4のデータを集める。細胞(1×103)を96ウェルプレートに播種し、24時間付着させる。次いで、化合物を2倍連続希釈として加え、インキュベーションをさらに72時間続行する。実験開始時および終了時の細胞数を、慣用的方法にしたがって細胞性タンパク質マス(塊)のメチレンブルー染色により推定する。賦形剤処理細胞の実質マス増加を100%成長として設定する。IC50は、対照と比較した半最大成長阻害に至らしめる薬剤濃度として測定される。耐性セルラインで測定されたIC50を親KB−31細胞で測定された同値で除すことにより、特定薬剤についての耐性係数(RF)を計算する。データを別々の3実験の平均±標準偏差(SD)として表すが、例外はna=適用不可能(n<3)である。P−糖蛋白質を過剰発現するコルチシン選択KB−31細胞は、古典的多剤耐性表現型についてのレファレンスとしての役割を果たした。
【0111】
エポチロンBの存在下で選択されるKB−31サブライン315/sc5.9は、エポチロンBに対して3.1倍耐性、およびエポチロンA、パクリタキセルおよびドキソルビシンに対し下限に近い交差耐性を示した。298/D4/40と同様に、315/sc5.9は、微小管不安定剤ビンクリスチンおよびデメコルシン、並びに非微小管ターゲッティング薬剤、5−フルオロウラシルに対してやや高感受性である。エポチロンA選択クローン292/D4/40および297/C5/0の場合と比べてこのクローンについて達成された顕著に低い全般的耐性レベルは不確かであるが、選ばれた選択スケジュール(段階的な2倍濃度増加)の結果であり得る。
【0112】
実施例8
P−gpは、315/sc5.9、298/D4/40および297/C5/0細胞ではエポチロン耐性を仲介しない。
エポチロン耐性がP−糖蛋白質を必然的に伴うわけではないことを確認するために、膜タンパク質について濃厚化した細胞リゼイトを、イムノブロッティングによりP−糖蛋白質の存在について評価する。具体的には、細胞(2×106)を15cm皿において播種し、密集成長の70〜80%まで成長させる。細胞を低張性溶解緩衝液中で採取し、上記と同様遠心分離により粗細胞下分画にかける。顆粒画分(原形質膜で濃厚化)を構成するペレットを、常用のデタージェント緩衝液に再懸濁する。等タンパク質量(10μg)をSDS−PAGEにより分離し、PVDF膜に移し、そしてECLシステムを用い、市販の抗体(mdr−1(P−糖蛋白質)(Ab−1)、カルビオケム−ノヴァケム、サンディエゴ、カリフォルニア)を用いてP−糖蛋白質を検出する。コルチシン選択KB−8511細胞(P−糖蛋白質を過剰発現する)の顆粒画分は、陽性対照としての役割を果たす。
【0113】
結果は、親KB−31細胞と同様、P−gp発現が315/sc5.9、298/D4/40および297/C5/0細胞からは全く検出され得ないことを示している。対照的に、コルチシンでの選択によりKB−31細胞から誘導される(Akiyam et al.,Som.Cell Mol Gen.11:117−126(1985))、「古典的」多剤耐性KB−8511細胞は、P−糖蛋白質を過剰発現する。エポチロンAおよびBがKB−8511細胞に対して完全な活性を保持しているという事実(表4参照)と考え合わせると、これらの観察結果は、エポチロン耐性がP−糖蛋白質を伴うわけではないことを強く示唆しているだけでなく、これらの薬剤により細胞を反復暴露しても、この薬剤排出ポンプは誘導されないことも示唆している。
【0114】
実施例9
298/D4/40または297/C5/0細胞におけるチューブリンポリマー化
特定薬剤の細胞蓄積の減少または代謝的不活化の増加に至る機序以外に、標的遺伝子における改変も観察されることが多い。すなわち、我々は、エポチロンAに暴露されたとき、298/D4/40または297/C5/0細胞が有するチューブリンポリマー化ポテンシャルが減少するか否かを試験した。具体的には、KB−31、297/C5/0および298/D4/40細胞(2×105)を6ウェルプレートで別々に播種し、24時間付着させる。細胞を、0、1、10、100または1000nM濃度のエポチロンAまたは賦形剤(0.1%DMSO)と2時間インキュベーションする。次いで、処理細胞を低張性溶解緩衝液中で採取し、上記と同様遠心分離により可溶性チューブリン(上清に存在)を微小管ポリマー(ペレットに存在)から分離する。SDS−PAGEによって上清タンパク質の画分を分離した後、β−チューブリン特異的抗体TUB2.1(シグマ、セントルイス、ミズーリ)およびECLシステムを製造会社の使用説明書にしたがって用いることによりブロットされたタンパク質を免疫検出することによって、非ポリマー化チューブリンの量を評価する。
【0115】
結果は、増加濃度のエポチロンAと親KB−31細胞のインキュベーションにより、これらの細胞におけるチューブリンの非ポリマー化プールの用量依存的減少が誘導され、ポリマー化微小管のプールにおける付随的増加を伴うこと(データは示さず)を示している。興味深いことに、非ポリマー化チューブリンの減少をまねくエポチロンAの濃度は、成長阻害についてのIC50と類似した範囲に含まれる(表4参照)。対照的に、297/C5/0細胞で非ポリマー化チューブリン画分を減少させるのに要求される薬剤濃度は顕著に高く、298/D4/40細胞は、試験された用量範囲(すなわち、1000nM以下)でのエポチロンA仲介チューブリンポリマー化に対し完全に不応性である。しかしながら、エポチロンA仲介チューブリンポリマー化の減少が、薬剤摂取の減少またはチューブリン機能性の真性欠陥に起因するかは、この実験からは明らかにされなかった。この問題と取り組むため、エポチロンAとのインキュベーション前に細胞を溶解する。具体的には、KB−31、297/C5/0および298/D4/40細胞(2×105)を別々に6ウェルプレートに播種し、24時間付着させる。次いで、0、1、10または100μMエポチロンA含有低張性緩衝液で細胞を溶解する。賦形剤(DMSO)濃度は1%であった。37℃で5分間インキュベーション後、標本を遠心分離にかけて、ポリマー化チューブリンから可溶性物質を分離し、上記と同様に非ポリマー化チューブリンのレベルをウエスタンブロッティングにより評価する。
【0116】
結果は、増加濃度のエポチロンAが、KB−31細胞リゼイトにおけるチューブリンの非ポリマー化プールの用量依存的減少をまねくことを示している。297/C5/0細胞についての用量応答曲線は高濃度にシフトし、298/D4/40におけるチューブリンプールはまた、非ポリマー化チューブリンのレベルでのエポチロンA仲介変化に対し完全に不応性である。また、この細胞不含有検定フォーマットで効果を発揮するのに必要とされるエポチロンAの濃度は、細胞ベースの検定法の場合に観察される濃度より数桁大きいことは注目に値する。これは、エポチロン類(およびパクリタキセル)が細胞内側で数百倍蓄積するという初期の観察結果と一致している。これらの結果を考え合わせると、297/C5/0および298/D4/40細胞が、直接的または間接的にそれらのチューブリン機能性を改変する一突然変異または幾つかの突然変異を獲得したことが示唆されている。
【0117】
HM40β−チューブリンイソ型のヌクレオチド配列決定は、親KB−31と比較したときに297/C5/0および298/D4/40細胞に存在する単一塩基突然変異の存在を明らかにした。すなわち、ヌクレオチド820、コドン274における第1ヌクレオチドは、AからCに改変された。改変されたコドン(ACC→CCC)により、トレオニンからプロリンへの非同類アミノ酸変化(Thr274Pro)が生じた。標準的分子生物学的方法を使用する。簡単に述べると、全コーディング配列を包含するオーバーラップフラグメントをRT−PCRにより全RNAから増幅し、ABI PRISM(登録商標)ビッグダイ(商標)ターミネーターサイクル配列決定キット(PEバイオシステムズ)を用いて自動式サイクルPCRにより配列決定する。使用した4種のイソ型特異的プライマーセットは以前に報告されている(Giannakakou et al.,J.Biol.Chem.272(27):17118−17125(1997))。
この発明は、新たに同定されたエポチロンAおよびエポチロンB耐性セルラインに関するものである。
【0002】
発明の背景
多剤耐性とは、細胞がある種の細胞傷害性薬剤に対する耐性を獲得し、また構造的および機能的に関連の無い場合もある他の薬剤に対し獲得交差耐性を示すプロセスをいう。この点で化学療法薬に対する獲得耐性は、有効な癌治療にとっての重大な障害である。充分に特性確認された抗癌剤に対する耐性機序は、細胞から多様な細胞傷害性薬剤を流出させる原形質膜ATP依存的ポンプである、P−糖タンパク質(P−gp)および多剤関連タンパク質(MRP)群のタンパク質の過剰発現を伴うが、必ずしも全ての多剤耐性細胞がこれらのタンパク質を過剰発現するわけではないことから、多剤耐性の非P−gp/MRP仲介機序の存在が示されている。
【0003】
エポチロン類、特にエポチロンAおよびBは、例えば式
【化1】
[式中、Rは、水素(エポチロンA)またはメチル(エポチロンB)である]
を有する、新種の微小管安定化細胞傷害性薬剤(Gerth,K. et al.、J.Antibiot.49、560−3(1996)、またはHoefle et al.、DE4138042参照)を代表する。
【0004】
エポチロン類は、パクリタキセル(タキソール(登録商標))と同様、有糸分裂において細胞を抑止し、直接チューブリンおよび優先的には微小管に結合し、非有糸分裂細胞における細胞内微小管の束の形成を誘発し、超安定性チューブリンポリマーの形成を誘導する能力を有するマクロライドポリケチド類である。しかしながら、タキソール(登録商標)とは対照的に、エポチロンAおよびBは、それらがP−gp発現性多剤耐性癌セルラインに対する活性を保持している点で、P−gpについての基質であるとは思われない。さらに、エポチロン仲介による微小管安定化は、内毒素シグナル伝達、すなわち癌治療においてタキソール(登録商標)の非血液学的作用を仲介すると考えられている作用を誘発することはない(Muhlardt,P.F.およびSasse,F.(1997)Cancer Research 57:3344−3346参照)。
【0005】
さらに、エポチロンは、タキソール(登録商標)より高い水溶性を示すため、処方するのにより適している。エポチロン類はP−gpまたはMRP仲介多剤耐性を被らないため、それらは、他方でP−糖蛋白質排出ポンプの活性故に他の化学療法による治療に耐性を示す細胞の増殖を阻止し得る。細胞をエポチロンとインキュベーションすると、微小管の安定化、次いでアポトーシスが誘導される(Bollag,D.M.et al.,“Epothilones,a new class of microtubule−stabilizing agents with a TAXOL(R)−like mechanism of action”Cancer Research 55、2325−33(1995)、および Bollag D.M.,Exp.Opin.Invest.Drugs 6、867−73(1997)参照)。さらに、見たところ微小管上の同一または立体的に近い結合部位を共有しているにもかかわらず、エポチロン類は、β−チューブリンイソ型に一突然変異をもつタキソール(登録商標)耐性卵巣癌セルラインに対して活性を示すことが示されている(Kowalski,R.J.,et al.,J.Biol.Chem.272(4)、2534−2541(1997)参照)。
【0006】
2種のエポチロン耐性ヒト卵巣癌セルラインが以前文献において報告されているが(Giannakakou et al.,PNAS 97(6):2904−2909(2000))、本明細書に開示されているデータは、本発明セルラインが先に報告されたエポチロン耐性細胞とは表現型が異なることを示している。例えば、Giannakakou et al.により開示されたセルラインは、エポチロンAおよびBの両方に耐性を示し、本明細書に開示されているEA150細胞は、タキソール(登録商標)およびエポチロンBにごく僅かな耐性を呈すると思われる。同様に、Giannakakou et al.によるEpoA8セルラインはエポチロン耐性を示すが、パクリタキセル耐性については制限されており、本明細書に開示されているC5/0およびD4/40セルラインは両方ともパクリタキセルに対して完全な交差耐性を示す。さらに、本明細書に開示されているD4/40セルラインは、薬剤耐性だけでなく薬剤依存性も示す。さらに、Giannakakou et al.により開示されたエポチロン耐性セルラインは、チューブリンポリマー化を誘導し、細胞成長を阻止するエポチロンの能力に影響する獲得βチューブリン突然変異を含むことが示された。本明細書に開示されているC5/0およびD4/40セルラインは両方とも、HM40チューブリンイソ型に単一の点突然変異(274位のトレオニンをプロリンにより置換)をもつ。突然変異部位はEpoA8セルラインについて報告されたのと同一であり、突然変異(274位のトレオニンをイソロイシンにより置換)の性質は同一ではない。すなわち、類似突然変異は、本明細書に開示されているセルラインで見られる耐性機序に部分的に関与し得、本発明セルラインおよび Giannakakou et al.により報告されたセルライン間における表現型の差異は、依然として完全には特性確認されていないエポチロン耐性および付随的遺伝子型改変の作用機序が全耐性セルラインにおいて必ずしも同じではあり得ないことを示している。そのこと自体で、本発明のセルラインは、以前に報告されたエポチロン耐性細胞とは表現型および遺伝子型が異なるものと考えられる。
【0007】
発明の要約
本発明の一態様は、MDA−MB−435胸部腺癌セルラインのエポチロン耐性サブラインを提供する。一例において、エポチロン耐性セルラインは、10nMのエポチロンAに耐性を示し、EA10セルラインである。別の例において、エポチロン耐性セルラインは、20nMのエポチロンAに耐性を示し、EA20セルラインである。さらに別の例において、エポチロン耐性セルラインは、40nMのエポチロンAに耐性を示し、EA40セルラインである。さらに別の例において、エポチロン耐性セルラインは、60nMのエポチロンAに耐性を示し、EA60セルラインである。別の例において、エポチロン耐性セルラインは、150nMのエポチロンAに耐性を示し、EA150セルラインである。
【0008】
本発明の別の態様は、KB−31癌セルラインのエポチロン耐性サブラインを提供する。一例において、エポチロン耐性セルラインは癌セルライン297/C5/0である。別の例において、エポチロン耐性セルラインは、癌セルライン298/D4/40である。さらに別の例において、エポチロン耐性セルラインは癌セルライン315/sc5.9である。
【0009】
本発明の別の態様は、エポチロンと比べてエポチロン耐性細胞に対し改善された細胞傷害性を示す薬剤の同定方法であって、エポチロン耐性細胞および感受性細胞を試験すべき薬剤とインキュベーションし、エポチロン耐性細胞および感受性細胞について薬剤の細胞傷害性を測定し、そしてエポチロンと比べて低い耐性係数(耐性細胞についてのIC50値を親細胞についてのIC50値により除す)を示す薬剤を同定する工程を包含する方法である。
【0010】
本発明のさらに別の態様は、エポチロンと比較してエポチロン耐性細胞に対する選択的細胞傷害性を示す薬剤の同定方法であって、エポチロン耐性細胞および感受性細胞と試験すべき薬剤をインキュベーションし、エポチロン耐性細胞および感受性細胞についての薬剤の細胞傷害性を測定し、そして1より小さい耐性係数(耐性細胞についてのIC50値を親細胞についてのIC50値により除す)を示す薬剤を同定する工程を包含する方法を提供する。
【0011】
さらに別の態様において、本発明は、エポチロン耐性細胞に対し選択的細胞傷害性を示す本明細書に開示された方法にしたがって同定された薬剤を提供する。
【0012】
本発明の別の態様は、エポチロン耐性細胞の成長をインビトロまたはインビボで選択的に阻害する方法であって、本明細書に開示された方法にしたがって同定された1種またはそれ以上の細胞傷害性薬剤と耐性細胞を接触させることを含む方法である。
【0013】
本発明の別の態様は、エポチロン類の化学センシタイザーである薬剤の同定方法であって、試験すべき薬剤の存在および不存在下においてエポチロン耐性細胞を細胞が耐性を示すエポチロンとインキュベーションし、細胞についてのエポチロンの細胞傷害性を測定する工程を包含する方法で、薬剤の不存在下でインキュベーションされた培養物の場合と比べて薬剤の存在下でインキュベーションされた培養物における細胞傷害性の方が高いということが、薬剤が化学センシタイザーであることを示すものである方法である。
【0014】
さらに別の態様において、本発明は、本明細書に開示された方法にしたがって同定されたエポチロンの化学センシタイザーを提供する。
【0015】
さらに別の態様において、本発明は、インビトロまたはインビボでのエポチロン耐性細胞の成長を阻止する方法であって、エポチロン耐性細胞を1種またはそれ以上のエポチロンおよび本明細書に開示された方法にしたがって同定された1種またはそれ以上の化学センシタイザーと接触させることを含む方法を提供する。
【0016】
本発明の別の態様は、腫瘍細胞を含む潜在的エポチロン耐性細胞の同定方法であって、試験細胞から全mRNAを調製し、試験細胞の全mRNAからcDNAを調製し、慣用的方法により、例えばチップアレイ技術を用いてcDNA標本の遺伝子発現分析を遂行し、そして試験細胞から誘導された発現パターンを、エポチロン耐性細胞について得られたパターンと比較する工程を包含する方法であり、その場合、類似した発現パターンは、試験細胞が潜在的にエポチロン耐性細胞であることを示唆している。この方法の延長として、慣用的方法、例えばチップアレイ技術を適用することによって、罹患組織または試験細胞を非罹患対照組織または細胞と比較することにより差次的遺伝子発現パターンが得られ、次いで親エポチロン感受性細胞とエポチロン耐性細胞との比較により得られたパターンと差次的発現遺伝子のパターンが比較され得る。類似した差次的遺伝子発現パターンは、罹患組織または試験細胞が潜在的にエポチロンに耐性を示すことを示唆し得る。
【0017】
さらに別の態様において、本発明は、本発明のエポチロン耐性細胞に特異的な精製抗体を提供する。さらに、本発明は、医薬上許容される担体または希釈剤と共に1種またはそれ以上のこれらの精製抗体を含む医薬組成物を提供する。
【0018】
別の態様において、本発明は、エポチロン耐性セルラインの同定方法であって、本明細書に開示された1またはそれ以上の抗体を標識し、1またはそれ以上の標識抗体に試験細胞を暴露し、そしてそれへの1またはそれ以上の標識抗体の結合を測定する工程を包含する方法を提供する。
【0019】
さらに別の態様において、本発明は、エポチロン耐性セルラインの単離方法であって、本明細書に開示されている1またはそれ以上の抗体を蛍光染料で標識し、1またはそれ以上の蛍光標識抗体と細胞混合物をインキュベーションし、そして蛍光活性化細胞選別機の使用により1またはそれ以上の抗体で蛍光標識されたエポチロン耐性細胞を単離することを包含する方法を提供する。正常の非反応性細胞から抗体反応性エポチロン耐性細胞を分離する別の方法では、磁気ビーズと1またはそれ以上の請求の範囲に主張された抗体を共有結合的に結合させ、次いで磁気供給源を用いてそれらを固定し、未結合の非反応性細胞を洗浄することによりエポチロン耐性細胞を単離する。
【0020】
別の態様において、本発明は、エポチロン耐性細胞を殺す方法であって、細胞傷害性または治療活性を有する物質をエポチロン耐性細胞に特異的な1またはそれ以上の抗体に結合させ、細胞培養物(または患者)に1またはそれ以上の抗体を投与し、そしてエポチロン耐性細胞に細胞傷害性薬剤をターゲッティングしてこれらの細胞を選択的に殺すことを含む方法を提供する。
【0021】
さらに別の態様において、本発明は、インビボでのエポチロン耐性癌の診断方法であって、本明細書に開示された抗体の1またはそれ以上を標識し、1またはそれ以上の標識抗体を患者または患者組織標本に投与し、そして1またはそれ以上の抗体が結合している組織を同定することを含む方法を提供する。
【0022】
さらに別の態様において、本発明は、癌の治療方法であって、治療を必要とする対象にエポチロン耐性細胞に特異的な抗体の1またはそれ以上の治療有効量を投与することを含む方法を提供する。
【0023】
別の態様において、本発明は、エポチロンAまたはBの場合と類似した作用機序をもつ微小管結合性薬剤の同定方法であって、本発明のエポチロン耐性セルラインおよび対応する親セルラインを増加濃度の試験物質と接触させ、そして試験物質に対する親セルラインの耐性と比較された試験物質に対するエポチロン耐性セルラインの耐性を測定する工程を包含する方法を提供しており、親セルラインと比べてエポチロン耐性セルラインの試験物質に対する耐性の方が大きい場合、試験物質は、エポチロンAまたはBと類似した形でチューブリンと相互作用する微小管結合性薬剤であることが示唆される。この方法で同定された薬剤は、必ずしも限定されるわけではないが、エポチロン類似体を含み得る。
【0024】
さらに別の態様において、本発明は、上記で開示された方法にしたがって同定されたエポチロン類似体を含む微小管結合性薬剤を提供する。
【0025】
別の態様において、本発明は、潜在的微小管安定剤である化合物の同定方法であって、エポチロン依存的細胞を試験化合物とインキュベーションし(この場合、耐性細胞はエポチロンが剥奪されている)、そして依存的細胞の成長について検定する工程を包含する方法を提供し、依存的細胞が成長する場合は、化合物が潜在的微小管安定剤であることを示している。本明細書で開示されている方法にしたがって同定された微小管安定剤もまた、本発明の一態様として本発明に包含される。
【0026】
本発明のさらに別の態様は、腫瘍細胞を含む潜在的エポチロン耐性細胞の同定方法であって、慣用的分子生物学的技術を用いることにより、本明細書に開示されているエポチロン耐性細胞の特性を示す点突然変異を含む細胞を同定する工程を包含する方法を提供する。
【0027】
さらに別の態様において、本発明は、ベータチューブリンの突然変異形態の翻訳を阻止、すなわち本明細書に開示されているエポチロン耐性細胞の特性を示す点突然変異を含む核酸の領域に対しアンチセンスである核酸を用いて腫瘍細胞におけるエポチロン耐性を阻止する方法を提供する。
【0028】
発明の詳細な記載
以下、本開示全体を通じて使用されている略語を下記に列挙する。
P−gp=P−糖蛋白質
MDR=多剤耐性
MRP=MDR関連タンパク質
MEM=最少必須培地
MTS=3−(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル)−5−(3−カルボキシメトキシフェニル)−2−(4−スルホフェニル)−2H−テトラゾリウム、内部塩
PMS=フェナジンメトサルフェート
【0029】
この発明は、概してエポチロンAおよびエポチロンB耐性セルラインに関するものである。本発明の種々の態様は、エポチロン耐性の阻止および/または同定に関与する抗体および方法に関するものである。本発明の様々な態様は、以下の小節に記載されている。
【0030】
I.エポチロン耐性セルライン
薬剤耐性セルラインの選択方法は当業界では公知であり、一般的に増加濃度の薬剤の存在下において細胞を培養および継代培養することを含む。生存している細胞コロニーを、さらに高濃度の薬剤の存在下で拡大させることにより、結局は細胞の個々の耐性セルラインおよびサブラインが生じる(例えば、Akiyama et al.,Somat.Cell.Mol.Genetics 11:117−126(1985)参照)。本明細書で使用されている薬剤に対する細胞の「耐性」の語は、細胞が、感受性細胞よりもさらに高濃度の薬剤に抵抗する能力をいう。すなわち、ある細胞のエポチロン耐性は、適切なエポチロン感受性細胞に対して測定される。例えば、薬剤に連続的に暴露されていた細胞のエポチロンA耐性は、薬剤耐性細胞が誘導された親感受性細胞に対して測定され得る。薬剤(例、エポチロンA)に対する細胞の耐性は、典型的には対照感受性細胞に対するIC50(細胞成長を50%阻止するのに必要とされる薬剤の濃度)の増加として定量される。本明細書で使用されている「エポチロン耐性」の語は、エポチロンA、エポチロンBまたはその両方に対する耐性をいう。
【0031】
「エポチロン」の語は、エポチロンまたはエポチロン誘導体を全て包含する。好ましくは、「エポチロン」の語はエポチロンA、エポチロンB、PCT公開WO98/25929に開示されたエポチロン誘導体、またはそれらの混合物を意味する。さらに好ましくは、その語は、その化学構造が上記で提供されているエポチロンAおよびエポチロンBを意味する。
【0032】
本明細書で使用されている「試験細胞」は、エポチロン耐性である場合もそうではない場合もあり得る細胞をいう。
【0033】
本明細書で開示されている幾つかのエポチロン耐性セルラインは、増加濃度のエポチロンAの存在下におけるMDA−MB−435セルラインの培養および継代培養から得られた。MDA−MB−435セルラインは、胸部腺癌セルラインであり、ATCC(マナッサス、バージニア、アメリカ合衆国)から入手され得る。このセルラインは、10%胎児牛血清、1%L−グルタミン、ペニシリン(50単位/ml)およびストレプトマイシン(50μg/ml)を補った最少必須培地(MEM)を用いて単層で培養され、5.0%CO2中37℃で維持され得る。培地および補給物質は全て、メリーランド、ロックビルのギブコ・ライフ・テクノロジーズから入手され得る。細胞は、約20時間の倍加時間および約60%の相対的平板効率を示す。
【0034】
本明細書に開示されているエポチロン耐性EA10サブラインは、10nMのエポチロンA中、上記要領で親MDA−MB−435胸部腺癌セルラインをインキュベーションすることから誘導される。本明細書で使用されている「サブライン」(または「サブクローン」)の語は、1種またはそれ以上のエポチロンに対するその耐性によって親セルラインから誘導されるセルラインをいう。本明細書でEA20、EA40、EA60およびEA150と称されるエポチロン耐性セルラインは、各々20nM、40nM、60nMおよび150nMのエポチロン中における上記の連続インキュベーションによりEA10セルラインから選択される。本発明は、他の濃度のエポチロンAの存在下においてMDA−MB−435胸部腺癌セルラインの細胞を培養することにより選択され得る他のエポチロンA耐性セルラインを包含するものとする。エポチロンに対する細胞の比率耐性の増加は、耐性セルラインが誘導された親セルラインに対して評価され得る(例、耐性セルラインについてのエポチロンAのIC50対親セルラインについてのエポチロンAのIC50)。本発明のEA20、EA40、EA60およびEA150エポチロン耐性セルラインは、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約の規定に従って、2000年11月21日付でアメリカ合衆国20110−2209バージニア、マナッサスにあるアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)に寄託され、各々寄託番号PTA−2702、PTA−2708、PTA−2703およびPTA−2706が割当てられた。
【0035】
本発明の追加的エポチロン耐性セルラインは、KB−31ヒト類表皮腫癌セルラインを培養および継代培養することにより選択された。KB−31細胞は、上記で検討したMDA−MB−435セルラインと同様、ATCC(ATCC番号CCL−17)から入手され得るKB類表皮腫癌セルラインのサブクローンである。ヒト類表皮腫癌セルラインKB−31およびKB−8511、すなわちKB−31細胞から誘導されたP−gp過剰発現性MDRセルラインは、当初ロズウェル・パーク・メモリアル・インスティテュート(バッファロー、ニューヨーク)の、ドクターR.M.Bakerから入手されたもので(記載については、Akiyama et al.,Somat.Cell.Mol.Genetics 11:117−126(1985)および Fojo,A.etal.,Cancer Res.45:3002−3007(1985)参照)、以前に報告された要領で培養されている(Meyer,T.et al., Int.J.Cancer 43:851−856(1989))。KB−8511セルラインは、受入番号DSM ACC2342としてドイチェ・サムルンク・フォン・ミクロオルガニスメン・ウント・ツェルクルツレン・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング(DSMZ、マシェローダー・ベーク1b、D−38124ブラウンシュバイク、ドイツ国)において1998年2月20日にブタペスト条約のもとで寄託された。出願者らはまた、ブダペスト条約のもと2000年11月21日に本明細書で開示されている親KB−31セルラインをATCCに寄託した。このセルラインには、特許寄託指定番号PTA−2701が与えられた。
【0036】
KB−31細胞は、5%胎児牛血清、L−グルタミン(1%v/v)、ペニシリン(50単位/ml)を補った最少必須培地アルファ(MEMアルファ)を用いて単層で培養され得、さらにストレプトマイシン(50μg/ml)も加えられ得る(アニメド、バーゼル、スイス国)。細胞は約22時間の倍加時間を示す。コルチシン処理によりKB−31セルラインから誘導されたKB−8511は、KB−31細胞と比較してコルチシンに対し約40倍の相対耐性を示す。それらは、KB−31細胞と同じ条件下で培養され得る。長期の組織培養中、高レベルのP−gp発現を維持するために、デメコルシン(50ng/ml)をストック培養物の培地に加え得る(シグマ、セントルイス、ミズーリ)。KBセルラインは当初口の表皮癌から誘導されると考えられていたが、イソ酵素分析、ヒーラマーカー染色体およびDNAフィンガープリンティングは、親KBセルラインがヒーラ細胞汚染故に確立された可能性があることを示している。KBセルラインの特徴に関する追加的詳細および関連参考文献については、ATCCウェブサイト、http://www.atcc.orgで見ることができる。
【0037】
以下、実施例で詳細に説明されている通り、エポチロンAおよびB耐性セルラインは、増加濃度の薬剤中でKB−31細胞を培養することにより誘導された。得られた298/D4/40(KB−31/298)、297/C5/0(KB−31/297)および315/sc5.9(KB−31/315)と称されるセルラインは、ブダペスト条約の規約に従い、2000年11月21日付でATCCに寄託され、寄託番号PTA−2705、PTA−2704、PTA−2707が各々割当てられた。
【0038】
本発明は、他濃度のエポチロンの存在下、KBセルライン系統の細胞を培養することにより選別され得る他のエポチロン耐性セルラインを包含するものとする。
【0039】
II.抗体
本発明の別の態様は、本明細書に開示されたエポチロン耐性セルラインを用いて生産された抗体である。好ましくは、抗体は、本明細書に開示された1種またはそれ以上のセルラインに結合するが、(1)健康な組織には結合せず、および/または(2)親セルラインには結合しないモノクローナル抗体である。かかる抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体(mAb)、ヒト化(すなわち、非抗原結合領域におけるアミノ酸配列が改変されたことにより、抗体がヒト抗体とより密接に似たものとなるが、依然としてその本来の結合能力を保持している抗体分子)、キメラ抗体、一本鎖抗体、Fabフラグメント、F(ab’)2フラグメント、Fab発現ライブラリーにより製造されたフラグメント、抗イディオタイプ(抗−Id)抗体、および上記のいずれかのエピトープ結合性フラグメントを包含し得るが、限定されるわけではない。上記抗体は、(1)耐性セルラインを同定するための診断ツールとして、および(2)エポチロン耐性癌に罹患した患者を処置するために、細胞傷害性または治療活性を有する物質にカップリングされた場合には治療剤として有用である。本明細書で使用されている「細胞傷害性または治療活性を有する物質」の語は、その作用が細胞を破壊し得る分子、例えば放射性同位元素、毒素(例、ジフテリア毒素またはリシン)または化学療法薬、並びにその作用が別の細胞を破壊し得る細胞、例えば細胞傷害性細胞をいう。「細胞傷害性細胞」の語は、例えばマクロファージ、好中球、好酸球、NK細胞、LAK細胞および大型顆粒リンパ球といった細胞を包含する。抗体は、細胞傷害性細胞におけるFc受容体を通じて細胞傷害性細胞にカップリングされ得ると考えられる。エポチロン耐性細胞に結合する分子は、細胞傷害性または治療活性を有する物質に直接カップリングされ得るか(例、リシン結合モノクローナル抗体)またはかかる物質に間接的に連結され得る。例えば、腫瘍細胞および細胞傷害性細胞に架橋し得る二重特異性抗体が使用され得、それによって腫瘍細胞の溶解が容易になり得る。二重特異性抗体は、細胞傷害性細胞のFc受容体に結合することにより腫瘍細胞および細胞傷害性細胞を架橋させ得る。
【0040】
本発明は、本発明の抗体を用いてエポチロン耐性細胞を同定、単離および/または殺す方法、および(b)エポチロン耐性癌処置用医薬の製造におけるかかる抗体の使用法、かかる抗体を医薬上許容される担体または希釈剤と組合わせるかまたはそれらを随伴して含む医薬組成物を包含する。
【0041】
ポリクローナル抗体は、抗原、例えば標的遺伝子産物、またはその抗原機能性誘導体により免疫化された動物の血清から誘導された抗体分子の不均一集団である。ポリクローナル抗体を製造するためには、様々な宿主、例えば限定するわけではないが、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒトおよびその他を、生きている細胞、全細胞リゼイト、エポチロン耐性細胞からの部分精製リゼイトまたはエポチロン耐性細胞で優先的に発現されるタンパク質での注射により免疫化し得る。ラットおよびマウスは、モノクローナル抗体生産を伴う下流適用に好ましい宿主である。宿主の種により、様々なアジュバントが免疫応答を高めるのに使用され得る。上記アジュバントは、限定するわけではないが、フロイント(不完全または完全)アジュバント、鉱物ゲル、例えば水酸化アルミニウムおよび表面活性物質、例えばリゾレシチン、プルロニックポリオール類、ポリアニオン類、ペプチド類、油エマルジョン、KLH(キーホールリンペットヘモシアニン)およびジニトロフェノールを包含する。ヒトで使用されるアジュバントの中では、BCG(カルメット‐ゲラン杆菌)およびコリネバクテリウム・パルブム(Cornybacterium parvum)が特に好ましい。(抗体生産方法および分析の概説については、例えば Harlow,E.および Lane,D.(1988)Antibodies:A Laboratory Manual(コールドスプリングハーバー・ラボラトリー、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク)参照)。
【0042】
特定抗原に対する抗体の均一集団である、モノクローナル抗体は、培養中の連続セルラインによる抗体分子の生産を誘導する技術により得られる。これらには、Kohlerおよび Milsteinのハイブリドーマ技術(1975、Nature 256:495−497、および米国特許第4376110号)、ヒトB−細胞ハイブリドーマ技術(Kosbor et al.,1983、Immunology Today、4:72、Cole et al.,1983、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:2026−2030)、およびEBV−ハイブリドーマ技術(Cole et al.,1985、Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy、アラン・アール・リス、インコーポレイテッド、77−96頁)が含まれるが、限定されるわけではない。上記抗体は、IgG、IgM、IgE、IgA、IgDおよびそれらのサブクラスを含む免疫グロブリンクラスに属し得る。この発明のmAbを生産するハイブリドーマは、インビトロまたはインビボで培養され得る。高力価のmAbがインビボで製造されることから、現時点では好ましい製造方法である。
【0043】
さらに、適切な生物学的活性を有するヒト抗体分子からの遺伝子と一緒に適切な抗原特異性を有するマウス抗体分子からの遺伝子をスプライシングすることによる「キメラ抗体」の生産を目的として開発された技術(Morrison et al.,1984、Proc.Natl.Acad.Sci.、81:6851−6855、Neuberger et al.,1984、Nature、312:604−608、Takeda et al.,1985、Nature、314:452−454)が使用され得る。キメラ抗体は、異なる部分では由来する動物種も異なる分子、例えばネズミmAbに由来する可変または超可変域およびヒト免疫グロブリン不変域を有する分子である。
【0044】
別法として、一本鎖抗体の製造用を目的として報告された技術(米国特許第4946778号、Bird、1988、Science 242:423−426、Huston et al.,1988、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879−5883、および Ward et al.,1989、Nature 334:544−546)は、特異的発現遺伝子−一本鎖抗体を製造するように適合され得る。一本鎖抗体は、アミノ酸架橋を介してFv領域の重および軽鎖フラグメントを連結することにより形成され、エポチロン耐性細胞に特異的な一本鎖抗体が製造される。特異性は関連しているが、イディオタイプ組成が異なる抗体は、ランダムな組み合わせ免疫グロブリンライブラリーから鎖シャッフリング法により生成され得る。(例、Burton,D.R.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci. 88:10134−10137参照)。
【0045】
最も好ましくは、「ヒト化抗体」の生産に有用な技術は、本明細書に開示されているポリペプチド、フラグメント、誘導体およびそれらの機能的均等内容物質に対する抗体を産生させるように適合化され得る。上記技術は、米国特許第5932448、5693762、5693761、5585089、5530101、5910771、5569825、5625126、5633425、5789650、5545580、5661016および5770429号に開示されている。
【0046】
抗体はまた、リンパ球集団でのインビボ産生を誘導することにより、または文献に開示された高特異結合性試薬の免疫グロブリンライブラリーまたはパネルをスクリーニングすることにより製造され得る。(例、Orlandi,R.et al.,(1989) Proc.Natl.Acad.Sci.86:3833−3837、および Winter,G.et al.(1991)Nature 349:293−299参照)。
【0047】
特異的エピトープを認識する抗体フラグメントは、公知技術により生成され得る。例えば、上記フラグメントには、抗体分子のペプシン消化により製造され得るF(ab’)2フラグメントおよびF(ab’)2フラグメントのジスルフィド架橋を還元することにより生成され得るFabフラグメントがあるが、これらに限定はされない。別法として、Fab発現ライブラリーを構築することにより(Huse et al.、1989、Science、246:1275−1281)、所望の特異性をもつモノクローナルFabフラグメントの迅速で容易な同定が可能となり得る。
【0048】
本発明は、当業者が本発明セルラインに結合する二重特異性抗体およびテトラマー抗体複合体を製造することを可能にする。二重特異性抗体は、ハイブリッドハイブリドーマを形成することにより製造され得る。ハイブリッドハイブリドーマは、当業界で公知の手順、例えばStaerzおよびBevan、PNAS USA(1986)83:1453および Immunology Today(1986)7:241に開示された手順を用いて製造され得る。一般に、ハイブリッドハイブリドーマは、本発明のセルラインに結合し得る第一モノクローナル抗体を生産する第一セルラインおよび検出可能な物質、または毒性または治療活性を有する物質に結合し得る第二モノクローナル抗体を生産する第二セルラインを融合することにより形成される。二重特異性抗体はまた、Staerz et al.Nature(1985)314:628および Perez et al.Nature(1985)316:354で以前に報告された手順を用いる化学的手段を用いて構築され得る。テトラマー抗体複合体は、当業者によく知られた方法、例えば米国特許第4868109号に記載された教示内容にしたがって製造され得る。
【0049】
様々なイムノアッセイが、所望の特異性を有し、交差反応性が最小限である抗体を同定するためのスクリーニングに使用され得る。特異性が確立されたポリクローナルまたはモノクローナル抗体を用いる競争的結合または免疫放射線検定法用の多様なプロトコルは、当業界ではよく知られている。上記イムノアッセイは、典型的には、エポチロン耐性細胞で優先的に発現されるエポチロン耐性細胞またはタンパク質およびその特異抗体間の複合体形成の測定を含む。
【0050】
抗体結合親和力は、ラジオイムノアッセイ技術と連係的なスキャッチャード分析を含む慣用的方法により測定され得る。
【0051】
検出を容易にするために特に好ましいのは、サンドイッチアッセイであって、その若干の変形が存在しており、それらも全て本発明に包含されるものとする。例えば、典型的なフォワードアッセイでは、非標識抗体を固体基質に固定し、試験すべき標本を結合分子と接触した状態にする。適切なインキュベーション期間後、充分な時間をかけて抗体―抗原二元複合体を形成させ得る。この時点において、次いで検出可能なシグナルを誘導し得るリポーター分子で標識した第二抗体を加え、インキュベーションし、抗体‐抗原‐標識抗体の三元複合体を形成させ得るのに充分な時間をかける。未反応物質があれば洗浄し、そしてシグナルの観察により抗原の存在を測定するか、または既知量の抗原を含有する対照標本と比較することにより定量し得る。フォワードアッセイに関する変形は、標本および抗体の両方を結合抗体へ同時に加える同時検定法、または標識抗体および試験すべき標本を最初に合わせ、インキュベーションし、非標識表面結合抗体に加える逆検定法を包含する。これらの技術は当業者には熟知されており、小さな変化を加え得ることは容易に理解されるはずである。本明細書で使用されている「サンドイッチアッセイ」は、基本的2サイト技術に対する変形を全て包含するものとする。本発明のイムノアッセイの場合、唯一の制限因子は、標識抗体がエポチロン耐性細胞特異的抗体であることである。
【0052】
このタイプの検定法において最も一般的に使用されるリポーター分子は、酵素、発蛍光団−または放射性核種−含有分子である。酵素イムノアッセイの場合、通常グルタルアルデヒドまたは過ヨウ素酸手段により、酵素を第二抗体にコンジュゲートする。しかしながら、容易に認められるように、広く多様な種々のライゲーション技術が存在し、それらは当業者にはよく知られている。常用されている酵素には、特に西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ‐ガラクトシダーゼおよびアルカリ性ホスファターゼがある。特異酵素と共に使用される基質は、一般的に、対応する酵素による加水分解時に、検出可能な色の変化を生じるように選択される。例えば、p−ニトロフェニルホスフェートは、アルカリ性ホスファターゼコンジュゲートと使用するのに適しており、ペルオキシダーゼコンジュゲートの場合、1,2−フェニレンジアミンまたはトルイジンを一般的に使用する。また蛍光性基質を使用することも可能であり、それらは上記の色素原基質よりも蛍光性生成物を生じる。次いで、適切な基質を含有する溶液を抗体‐エポチロン耐性細胞特異抗原‐標識抗体の三元複合体に加える。この基質は第二抗体に結合した酵素と反応して定性的可視シグナルを与え、それを通常分光光度計によってさらに定量することにより、血清標本中に存在するエポチロン耐性細胞特異的抗原の量の評価が行われ得る。
【0053】
C5/0およびD4/40細胞、試験セルラインで同定された特定単一ヌクレオチド突然変異の存在可能性についてプローブするため、患者の腫瘍または血清標本は、当業界の分子生物学者に周知の突然変異検出技術により分析され得る。これらの技術には、SSO(配列特異的オリゴヌクレオチドの使用)、PASA(特異的対立遺伝子のPCR増幅)、固相ミニシーケンシング(小規模配列決定法)、マルチプレックス固相蛍光プライマー伸長法、OLA(デュアルカラー・オリゴヌクレオチドライゲーション検定法)、LCR(リガーゼ連鎖反応)およびUHG(普遍的ヘテロ二本鎖ジェネレーター)分析が包含され得る(これらの方法の概要については、Landgren(1996)“Laboratory Protocols for Mutation Detection”、オックスフォード・ユニバーシティー・プレス、ISBN0198577958参照)。
【0054】
別法として、蛍光性化合物、例えばフルオレセインおよびローダミンは、それらの結合能力を改変することなく抗体に化学的にカップリングされ得る。特定波長の光線での照明により活性化されると、蛍光色素標識抗体は、光エネルギーを吸収し、分子における興奮状態を誘導した後、特徴的なより長い波長の光を放射する。放射は、光学顕微鏡で視覚的に検出可能な特有の色として現れる。免疫蛍光およびEIA技術は、両方とも当業界では充分に確立されており、特に本発明方法には好ましい。しかしながら、他の受容体分子、例えば放射性同位元素、化学発光または生物発光分子も使用され得る。如何に要求された用途に適うよう手順を変更するかは当業者には容易に想到できることである。
【0055】
本発明の追加的態様は、医薬上許容される担体と連係させた、本明細書で検討されている治療効果のいずれかを目的とする、医薬組成物の投与に関するものである。上記医薬組成物は、エポチロン耐性細胞抗原に対する抗体を含み得るが、それらに限定はされない。上記組成物は、単独または少なくとも1種の他の薬剤、例えば安定性化合物と組合わせて投与され得、その場合、無菌の生体適合性医薬用担体、例えば限定するわけではないが食塩水、緩衝食塩水、デキストロースおよび水中で投与され得る。上記組成物は、患者に単独でまたは他の薬剤、例えば他の化学療法薬、薬剤またはホルモン剤と組合わせて投与され得る。
【0056】
本明細書で使用されている「他の化学療法薬」の語は、特に腫瘍疾患の処置で使用されるかまたは使用され得る化学療法薬をいい、例えば以下の種類から誘導された化学療法薬がある:
(A)アルキル化剤、好ましくは架橋化学療法薬、好ましくはビス−アルキル化剤、
(B)抗腫瘍抗生物質、好ましくはドキソルビシン(アドリアマイシン(登録商標)、ルベックス(登録商標))、
(C)代謝拮抗物質、
(D)植物アルカロイド類、
(E)ホルモン剤およびアンタゴニスト、
(F)生物応答修飾因子、好ましくはリンホカイン類またはインターフェロン類、(G)プロテインチロシンキナーゼおよび/またはセリン/トレオニンキナーゼの阻害剤、
(H)アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド誘導体、
(I)微小管安定剤/または不安定剤、または
(J)多種多様な薬剤またはその他または未知の作用機序をもつ薬剤。
【0057】
本発明に包含される医薬組成物は、限定されるわけではないが、経口、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、骨髄内、鞘内、心室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、経腸、局所、舌下または直腸手段を含むかなり多数の経路により投与され得る。
【0058】
有効成分に加えて、これらの医薬組成物は、医薬上使用され得る製剤への活性化合物の加工処理を容易にする賦形剤および補助物質を含む医薬上許容される担体または希釈剤を含み得る。「医薬上許容される担体または希釈剤」の語は、充填剤(フィラー)、例えば糖類、例えば乳糖、サッカロース、マンニトールまたはソルビトール、セルロース調製物および/またはリン酸カルシウム、例えばリン酸三カルシウムまたはリン酸水素カルシウム、および結合剤、例えばトウモロコシ、小麦、イネまたはジャガイモ澱粉を用いる例えば澱粉ペースト、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムおよび/またはポリビニルピロリドン、および/または所望ならば、崩壊剤、例えば上述の澱粉、同じくカルボキシメチル澱粉、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸またはその塩、例えばアルギン酸ナトリウムを包含するが、これらに限定はされない。賦形剤は、特に流動性調節剤および滑沢剤、例えば珪酸、タルク、ステアリン酸またはその塩類、例えばステアリン酸マグネシウムまたはカルシウム、および/またはポリエチレングリコールである。糖剤コアには、適切な、所望により腸溶のコーティングが施され、その場合、特に、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコールおよび/または二酸化チタンを含み得る濃縮糖溶液、または適切な有機溶媒中のコーティング溶液、または腸溶コーティングを製造する場合、適切なセルロース調製物、例えばエチルセルロースフタレートまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレートの溶液が使用される。カプセルは、ゼラチンでできた乾燥充填カプセル並びにゼラチンおよび可塑剤、例えばグリセリンまたはソルビトールでできた軟カプセルである。乾燥充填カプセルは、顆粒形態の有効成分を例えば充填剤、例えば乳糖、結合剤、例えば澱粉、および/または流動促進剤、例えばタルクまたはステアリン酸マグネシウムと共に、および所望の場合安定剤と共に含有し得る。軟カプセルでは、有効成分は、好ましくは適切な油性賦形剤、例えば脂肪油、パラフィン油または液体ポリエチレングリコール類に溶解または懸濁されており、また、安定剤および/または抗菌剤も添加され得る。染料または色素は、識別目的または異なる用量の有効成分を区別するため、錠剤または糖剤コーティングまたはカプセルケーシングに添加され得る。
【0059】
本明細書で使用されている「治療有効量」は、毒性または治療活性を有する物質に結合されたとき、徴候または病状を改善し得る、例えば腫瘍細胞の死を誘発し得る有効成分の量、例えば本明細書で開示されたエポチロン耐性セルラインに対して産生される抗体の量をいう。治療効率および毒性は、細胞培養物または実験動物における標準的医薬手順により決定され得、例えばED50(集団の50%における治療有効量)およびLD50(集団の50%における致死量)である。毒性および治療作用間の用量比が治療指数であり、それはLD50/ED50の比率として表され得る。高い治療指数を呈する医薬組成物が好ましい。細胞培養検定および動物試験から得られたデータは、ヒトに用いられる用量範囲の処方で使用される。上記組成物に含まれる用量は、好ましくはED50を含む循環濃度の範囲内であり、毒性をほとんどまたは全く伴わない。用量は、使用される用量形態、患者の感受性、および投与経路によりこの範囲内で変動する。
【0060】
いずれの化合物についても、治療有効量は、最初、例えば新生物細胞の細胞培養検定法、または通常はマウス、ウサギ、イヌまたはブタを用いる動物モデルにおいて評価され得る。動物モデルはまた、適切な濃度範囲および投与経路を決定するのに使用され得る。次いで、上記情報は、ヒトの場合に有用な用量および投与経路を決定するのに使用され得る。
【0061】
正確な用量は、処置を必要とする対象に関連した因子に照らして、現場の医師により決定される。用量および投与を調節することにより、活性部分のレベルを充分なものにし、または所望の効果を維持させる。考慮され得る因子には、病状の重症度、対象の全般的健康状態、対象の年齢、体重および性別、食餌療法、投与の時間および頻度、薬剤の組み合わせ(複数も可)、反応感受性、および治療に対する耐性/応答がある。長時間作用性の医薬組成物は、特定処方物の半減期およびクリアランス速度により、3〜4日ごと、毎週、または2週間ごとに1回、または3週間ごとに1回投与され得る。
【0062】
特定用量および送達方法に関するガイダンスは、文献に提供されており、一般的に当業界の実践者にとって入手可能なものである。当業者であれば、ヌクレオチドについてはタンパク質またはそれらの阻害剤の場合とは異なる処方物を使用するはずである。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は、特定の細胞、状態、位置などに特異的である。タンパク質の経口投与に適した医薬処方物は、例えば米国特許5008114、5505962、5641515、5681811、5700486、5766633、5792451、5853748、5972387、5976569および6051561号に記載されている。他の化学療法薬(複数も可)との組み合わせの場合、他の化学療法薬(複数も可)は、市販されており、当業者に周知の標準的処方物で使用される。
【0063】
処方および投与技術に関するさらなる詳細については、Remington’s Pharmaceutical Sciences(マーアック・パブリッシング・カンパニー、イーストン、ペンシルベニア)の最新版で見ることができる。
【0064】
III.本発明方法
本発明の一態様は、上記で開示された抗体を用いて、腫瘍細胞を含むエポチロン耐性細胞を同定し、単離し、および/または殺す方法に関するものである。例えば、検出方法は、試験細胞を、本明細書に開示されたエポチロン耐性細胞の内側または優先的には同細胞上で発現されたタンパク質に指向した抗体と接触させることを含み得る。この方法では、抗体を検出可能な物質で標識する。上記の検出可能な物質には、インビトロまたはエクスビボまたはインビボの腫瘍標本中においてエポチロン耐性腫瘍細胞を同定するのに使用され得る蛍光マーカー、酵素または放射性マーカーがある。エポチロン耐性腫瘍細胞は、エポチロン耐性について試験すべき腫瘍細胞と本発明抗体をインキュベーションすることにより同定され得る。エポチロン耐性特異抗体により認識される抗原が細胞の内側で発現されることが知られている場合、抗体投与前に細胞を透過性にするかまたは固定しなければならない。腫瘍細胞への抗体の結合は、エポチロン耐性細胞の内側または同細胞上で発現されたタンパク質が腫瘍細胞に存在していることを示している。腫瘍細胞への抗体結合レベルは、正常対照細胞への抗体結合レベルと比較され得、そして正常細胞と比べて腫瘍細胞への抗体結合が増加していることが、エポチロン耐性の指標として使用され得る。細胞(例、試験すべき腫瘍細胞または正常対照細胞)への抗体の結合は、抗体を標識している検出可能物質を検出することにより測定される。検出可能物質は抗体へ直接カップリングされ得るか、または別法として、検出可能物質は抗体と結合し得る別の分子にカップリングされ得る。例えば、第一抗体に指向した第二抗体の場合、第二抗体が検出可能物質にカップリングされている。
【0065】
エポチロン耐性腫瘍細胞は、インビトロまたはインビボの腫瘍標本から検出され得る。例えば、患者から摘出された腫瘍組織は、腫瘍標本として使用され得る。標本は、即座に使用されるかまたは後で使用するため−20℃未満の温度で冷凍貯蔵され得る。顕微鏡スライド上の腫瘍薄片は、標準的免疫組織化学技術を用いて抗体と、または標準的in situハイブリダイゼーション技術により核酸と反応し得る。さらに、腫瘍細胞の単一細胞懸濁液が得られる場合、腫瘍細胞を抗体と反応させ、フローサイトメトリーにより分析し得る。別法として、エポチロン耐性腫瘍細胞は、腫瘍をもつ対象からインビボで検出され得る。標識抗体は対象に導入され得、腫瘍に結合した抗体が検出され得る。例えば、抗体は、対象におけるその存在および位置が標準的造影技術により検出され得る放射性マーカーで標識され得る。
【0066】
エポチロン耐性腫瘍の同定に有用な試薬、例えば本発明抗体は、診断用キット中に組込まれ得る。このキットは、標本と比較される標準物質を含み得る。多様な試薬が適切な容器中でキットに内包され得、キットは、容器用ホルダーおよび使用説明書を含み得る。
【0067】
患者からの腫瘍薄片または血漿は、上記突然変異検出技術に基いて設計された分子プローブを用いるかまたは他の慣用的方法にしたがって分析され得る。さらに、本明細書で開示されているエポチロンA耐性細胞に特有な点突然変異を含む核酸の領域に指向したアンチセンス核酸が、当業者に熟知されている分子生物学的技術を用いて作製され得ると予想される。アンチセンス遺伝子を用いた遺伝子発現の調節に関する論文については、Weintraub,H. et al. Antisense RNA as a molecular tool for geneteic analysis(遺伝分析用分子ツールとしてのアンチセンスRNA)、Reviews−Trends in Genetics、1(1)巻(1986)を参照。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞においてエポチロン耐性を付与するタンパク質をコード化する核酸(例、mRNA)の発現を阻害する方法で使用され得る。このタンパク質の発現の減少は、アンチセンス核酸が導入された細胞のエポチロン耐性を阻害または除去する手段として使用され得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドを培養中のエポチロン耐性細胞に加えることにより、耐性が阻害された細胞が作製され得る。インビトロで上記細胞は、可能性のある治療剤を試験するのに使用され得る。また、アンチセンスオリゴヌクレオチドを遺伝子療法で使用することにより、対象においてエポチロン耐性癌を除去または阻止し得ることが予想される。これは、インビボでの核酸の慣用的送達技術を用いて行われ得る。当業者には公知であるアンチセンス核酸を含有する医薬化合物および処方物の使用および投与に関して多くの参考文献が存在する。(例えば、米国特許第6124133、6096543および6117848号参照)。
【0068】
さらに本発明は、腫瘍細胞を含むエポチロン耐性細胞の同定方法であって、cDNAマイクロアレイまたは他の慣用的方法を用いることにより、試験細胞、エポチロン耐性標本および対応するレファレンス標本(非罹患組織対照組織およびエポチロン感受性細胞)の全mRNAプールから調製されたcDNAの差次的遺伝子発現分析を遂行する工程を伴う方法を提供する。潜在的エポチロン耐性細胞の同定は、試験細胞および本発明エポチロン耐性セルライン対それらの対応する対照における差次的発現遺伝子の類似パターンを得ることに基いている。差次的遺伝子発現は、慣用的方法を用いてインビトロまたはインビボ供給源からの細胞標本から単離されたRNAから生成されたcDNAを用いて遂行され得る。全およびメッセンジャーRNA調製物、ノーザン分析および差次的遺伝子発現分析は、当業界で公知の方法のいずれかにしたがって遂行され得る。
【0069】
同様に、プロテオーム解析(細胞性タンパク質の2−Dゲル電気泳動)を遂行することにより、耐性関連タンパク質パターン(フィンガープリント)が同定され得る。具体的には、エポチロン耐性および感受性親細胞をプロテオーム技術で分析することにより、エポチロン耐性細胞に伴う差次的タンパク質発現パターンが同定され得る。すなわち、細胞からのタンパク質抽出物は、慣用的方法にしたがって二次元ゲル電気泳動(一次元等電点電気泳動および二次元SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動)により分解され得る。次いで、発現されたタンパク質は、銀染色または他の慣用的タンパク質染色方法により可視化され、2種のセルライン間でパターンが比較され得る。耐性セルラインの典型的な特徴である差次的タンパク質発現パターンは、他の推定的エポチロン耐性細胞を同定できる可能性をもつ「フィンガープリント」として使用され得る。
【0070】
さらに本発明は、エポチロン類の化学センシタイザーである物質の同定方法を提供する。本明細書で使用されている「エポチロン類の化学センシタイザー」の語は、耐性細胞に対する治療剤の効力を高め、および/または治療剤についての細胞の耐性を減少させ得る物質をいう。例えば、ベラパミルは、P−gp−仲介多剤耐性の化学センシタイザーである。ベラパミルの存在下では、多剤耐性細胞はアントラサイクリン類の細胞傷害性作用に対する感受性が高くなる。本発明のセルラインは、エポチロン類の化学センシタイザーである物質の同定方法において特に有用である。これは、試験すべき薬剤の存在および不存在下において細胞が耐性を示すエポチロンとエポチロン耐性細胞をインキュベーションし、そして細胞についてのエポチロンの細胞傷害性を測定する工程を包含し得、薬剤の不存在下でインキュベーションした培養物と比べて薬剤とインキュベーションした培養物の細胞傷害性の方が高い場合、その薬剤は化学センシタイザーであることが判る。細胞傷害性は、当業者に公知の方法、例えば比色分析システム、例えばCELLTITER96(登録商標)AQUEOUSアッセイ(プロメガ、マディソン、ウィスコンシン)を用いて測定され得る。
【0071】
本発明はまた、エポチロン類似体の同定方法を提供する。本明細書で使用されている「エポチロン類似体」の語は、エポチロン様特性を有する合成または天然化合物をいう。この語は、微小管安定剤を包含し得るが、限定するわけではない。ここで予測される通り、本発明のセルラインは、エポチロン類についてのセルラインの耐性を部分的に克服し得るエポチロン類似体を同定するのに使用され得る。例えば、エポチロン耐性セルラインおよび対応する親セルラインを増加濃度の試験物質とインキュベーションし、次いで耐性セルラインについて測定されたIC50値を親セルラインについて測定された同値で除すことにより、相対耐性係数が決定され得る。耐性係数が低い(レファレンスとして同検定法に含まれるエポチロンと比べて)試験化合物は、興味の対象である潜在的類似体を構成する。例えば、297/C5/0細胞および親KB−31細胞を増加濃度の試験物質とインキュベーションし、次いで297/C5/0について測定されたIC50値をKB−31細胞について測定された同値で除すことにより相対耐性係数が測定され得る。耐性係数が低い(レファレンスとして同検定法に含まれるエポチロンAと比べて)試験化合物は、潜在的ヒットを構成する。さらに、本明細書で開示されている298/D4/40セルライン(エポチロン耐性であり、エポチロン依存性でもある)による実験は、エポチロンの場合と類似した作用機構をもつ化合物の同定に有用である。例えば、慣用的方法を用いることにより、エポチロンAと類似した作用機序をもつ薬剤を同定する方法として、これらの細胞の増殖を支える薬剤についての様々なライブラリーがスクリーニングされ得る。
【0072】
本発明はまた、エポチロン耐性細胞に対して選択的細胞傷害性を示す物質の同定方法を提供する。本明細書で使用されている「細胞傷害性薬剤」の語は、細胞増殖を阻害し、細胞死を誘導する、抗癌剤を含む化合物をいう。この方法は、標準的方法を用いて、本明細書で開示されている耐性セルラインを試験すべき物質とインキュベーションし、耐性セルラインについての物質の細胞傷害性を測定し、それを親セルラインの場合と比較することを含み得る。エポチロン耐性セルラインを優先的に殺す化合物、すなわち成長阻害についてのIC50が耐性細胞の方が対応する親細胞化合物の場合よりも低い化合物がヒットとなる。これについての一例は、297/C5/0および298/D4/40細胞におけるビンクリスチンおよびデメコルシンである。
【0073】
本発明方法にしたがって同定された細胞傷害性薬剤およびエポチロン類の化学センシタイザーは、エポチロン耐性セルラインの成長を阻害する方法において特に有用である。細胞傷害性薬剤およびエポチロン類の化学センシタイザーを用いるエポチロン耐性セルラインの成長阻害方法では、エポチロン耐性細胞を1種またはそれ以上のエポチロンおよび1種またはそれ以上の化学センシタイザーと接触させる。本発明方法にしたがって同定された細胞傷害性薬剤を用いるエポチロン耐性セルラインの成長阻害方法では、耐性細胞を1種またはそれ以上の細胞傷害性薬剤と接触させる。「接触させる」の語は、インビトロ、エクスビボまたはインビボ投与を包含するものとする。本発明方法にしたがって同定された細胞傷害性薬剤および化学センシタイザーはまた、エポチロン耐性腫瘍を患う対象における(すなわち、エポチロン類が天然または獲得耐性故にもともとまたはもはや有効な治療剤ではない状況における)治療有用性を有し得る。上記細胞傷害性薬剤および化学センシタイザーの適切な医薬組成物、投与方法および用量は、当業者にとっては明白なものであり、上記で検討されたものを含む慣用的方法にしたがって遂行され得る。
【0074】
本発明を実践する場合、他に指示がなければ、当業者にとって遂行可能な細胞生物学、分子生物学、細胞培養、免疫学などの慣用的技術が使用される。これらの技術は最近の文献で詳細に開示されており、具体的にはSambrook,Fritschおよび Maniatis編、“Molecular Cloning A Laboratory Manual”第2版、(コールドスプリングハーバー・ラボラトリー・プレス、1989)、the series Methods of Enzymology(アカデミック・プレス、インコーポレイテッド)、および Antibodies:A Laboratory Manual、Harlow et al.編、コールドスプリングハーバー・ラボラトリー・プレス(1987)を参照。
【0075】
この明細書で述べられている出版物、特許および特許出願は全て、この発明が関係する技術分野の専門家の技能レベルを示すものである。
【0076】
上記で概説された本発明は、以下の実施例によりさらに理解し易くなるはずであり、これらは本発明のある態様の説明を目的としているに過ぎず、いかなる意味にせよ本発明を制限する意図はないものとする。
【0077】
実験
以下の原材料および方法を用いて実施例1〜6を行う:
エポチロン耐性細胞の選択
MDA−MB−435細胞を播種(1プレートにつき1×106細胞)し、37℃および5.0%CO2で10%胎児牛血清を補った薬剤不含有MEMにおいて密集度約80%まで成長させる。次いで、細胞の成長を、頻繁に培地を変えながら5週間にわたって10nmのエポチロンA(ノバルチス・アクチエン・ゲゼルシャフト、バーゼル、スイス国)含有培地で続行させる。個々の耐性コロニーを単離し、慣用的方法にしたがって12ウェル、6ウェル、25cmおよび75cmプレートで連続的に発展させる。次いで、耐性細胞(創始細胞)を高濃度のエポチロン中でインキュベーションすることにより、より高度の耐性セルラインを得る。
【0078】
成長阻害検定法
成長阻害は慣用的方法を用いて分析され得、例えばMTS検定法(プロメガ、ウィスコンシン)が使用され得る。この検定法では、1ウェルにつき約4000細胞を、10%胎児牛血清を補ったMEM中の96ウェルプレートに播種し、5.0%CO2中37℃でインキュベーションする。24時間後、薬剤の希釈液(使用される濃度範囲は1nMおよび1000nM間である)を加え、さらに72時間細胞を薬剤とインキュベーションさせる。次いで、PMSと混合したMTS試薬(製造会社の使用説明書によると、MTS:PMS 20:1)を加え、慣用的方法にしたがってサーモマックスのマイクロプレート読取りシステム(モレキュラー・ディバイシーズ、サニーヴェール、カリフォルニア)を用いて吸光度を定量する。24時間薬剤無しで成長させた細胞を成長対照として用いて薬剤濃度を測定することにより、細胞成長の50%阻害(IC50)が得られた。1プレートで1薬剤につき6検定を遂行する。
【0079】
ウエスタンイムノブロッティング
当業界で公知の技術にしたがって原形質膜タンパク質を抽出する(例えば、Georges,E.et al.(1991)J.Cell Physiol.148:479−484、Archianl−Matheis,A.et al.(1995)Oncol.Res.12:603−610参照)。等量のタンパク質をSDS−PAGEによる電気泳動にかけ、PVDF膜(ミリポア、マサチューセッツ)に移し、Monks,A et al.,JNCI、83:757−766(1991)にしたがってP−gpおよびMRPに対するモノクローナル抗体でプローブした。
【0080】
RNA単離およびノーザンブロッティング
慣用的方法(例えば、化合物および方法体系は、カリフォルニアのキアゲンにより市販されている)にしたがって、全RNAおよびポリA RNAを様々なセルラインから単離する。ポリA RNAの標識およびマイクロアレイチップのハイブリダイゼーションを購入する(インサイト・ファーマシューティカルズ、パロアルト、カリフォルニア)。慣用的方法にしたがってノーザン・ブロッティングを行い、10μgの全RNAを1%アガロースゲルにおいて電気泳動させ、ナイロン膜に移し、ESTクローン(ゲノム・システムズ、インコーポレイテッド、セントルイス、ミズーリ)から合成された33P標識プローブとハイブリダイズさせる。ノーザンブロットシグナルが検出され、慣用的方法にしたがいホスホイメージング技術を用いてこれらを定量する。フルオレサミン標識ヌクレオチドCy3−dUTPまたはCy5−dUTPを含むcDNAプローブは、カリフォルニア、パロアルトのインサイト・ファーマシューティカルズから入手される。
【0081】
細胞周期分析
慣用的方法にしたがって、細胞を、10%胎児牛血清を補ったMEM中1×106細胞の密度で10cm2組織培養皿に播種し、5.0%CO2中37℃で一晩インキュベーションし、薬剤(2×IC50濃度)に24時間暴露し、トリプシン処理により採取し、遠心分離により集め、10mlのPBS(リン酸緩衝食塩水)で1回洗浄する。冷70%エタノールに再懸濁し、5mlのPBSで再洗浄し、PI溶液(70μlのよう化プロピジウム、38mMのクエン酸ナトリウム、20μg/mlのリボヌクレアーゼA)に再懸濁することにより、細胞を固定する。37℃で30分間、PI溶液中でインキュベーション後、細胞を慣用的方法論にしたがってフローサイトメトリーにより分析する(装置およびソフトウェアはカリフォルニアのベクトン・ディッキンソン・イムノサイトメトリー・システムズにより市販されている)。
【0082】
実施例1
エポチロンA耐性セルラインの生成
上記方法にしたがって、親MDA−MB−435胸部腺癌セルラインのエポチロンA耐性サブクローンを確立する。具体的には、MDA−MB−435胸部腺癌細胞を、5週間37℃で5%CO2下10nMのエポチロンAの存在下において10%胎児牛血清を補ったMEM中でインキュベーションする。細胞の大多数は死ぬが、生残っているクローンを選択し、10nMのエポチロンAを含む培地中でさらに拡大させる。12耐性コロニーのうち一つが充分に拡大し、ここでこれをEA10セルラインと命名する。10nMエポチロンA含有培地中でEA10細胞を維持する。さらに高濃度のエポチロンAでのEA10細胞(創始細胞)の連続培養により、追加的な、より耐性の高いセルラインが得られる。20nM(EA20)、40nM(EA40)、60nM(EA60)または150nM(EA150)エポチロンAに耐性を示すセルラインをこの要領で単離する。
【0083】
実施例2
エポチロンA耐性細胞は、エポチロンA誘導G2/Mブロックを克服する
エポチロンA耐性および親MDA−MB−435エポチロンA感受性細胞の細胞周期分布パターンを、標準FACS分析法により比較する。データは、20nMエポチロンAの存在下で24時間培養されたMDA−MB−435細胞のほとんどにおける細胞分裂過程が、細胞周期のG2/M期で遮断されていることを示す。対照的に、60nMエポチロンA中で24時間培養されたEA60細胞の大集団は、G2/M期ブロックを克服し、G1およびS期に再び入る。すなわち、エポチロンA耐性細胞集団のかなりの部分は、通常エポチロンA感受性細胞の細胞周期で起こるG2/Mブロックを克服すると思われる。
【0084】
実施例3
エポチロンA耐性細胞において可能性のある2種の耐性機序
MTS検定法を用いて、50%のMDA−MB−435、EA10、EA20、EA40、EA60およびEA150細胞の成長阻害に必要とされる薬剤の濃度(IC50)を測定する。表1で示されている通り、EA10およびEA20細胞におけるエポチロンAのIC50は、MDA−MB−435細胞よりもそれぞれ5倍および7倍増加している。興味深いことに、エポチロンAのIC50は、EA20およびEA40細胞において本質的に同じであるが、EA40細胞は、EA20細胞の選択に使用されるエポチロンAの2倍濃度で選択される。しかしながら、EA60およびEA150細胞においてエポチロンAのIC50の15倍および>100倍増加がそれぞれ観察される。さらに、エポチロンAに対する耐性が増加しているのとは対照的に、EA40およびEA150細胞は等しくタキソール(登録商標)に対し耐性を示す。すなわち、エポチロンA耐性の少なくとも2種の機序が存在し得る可能性があり、低い方の耐性機序はタキソール(登録商標)に対し交差耐性であり、そして高い方はエポチロンA特異的耐性機序である。
【0085】
表1
MDA−MB−435、EA10、EA20、EA40、EA60およびEA150細胞で比較されたエポチロンA(EpoA)、エポチロンB(EpoB)およびタキソール(登録商標)のIC50値
【表1】
【0086】
実施例4
P−gpまたはMRPは、エポチロンAに対する耐性を仲介しない
P−gpおよび/またはMRP発現レベルを、ウエスタンイムノブロッティングによりエポチロンA感受性および耐性細胞において分析する。データは、多剤耐性MDA/T0.3細胞およびアドリアマイシン耐性HL60細胞がそれぞれP−gpおよびMRPを発現するが、P−gpもMRPも感受性MDA−MB−435細胞または耐性EA10もしくはEA20細胞からは検出されないことを示している。
【0087】
本明細書に開示されているエポチロンA耐性細胞がP−gp基質であるタキソール(登録商標)に対して呈する交差耐性は限られているため、エポチロン耐性はウエスタンブロッティングにより検出され得ないほど低いレベルのP−gpにより仲介される可能性が存在する。それなりに、エポチロン耐性細胞は、P−gp阻害剤により除去され得る他のP−gp基質に対しある程度の交差耐性を有する。この可能性を調べるため、MTS検定法を用いて、P−gp基質、ビンクリスチン、ドキソルビシンおよびビンブラスチンの細胞傷害性をエポチロンA耐性細胞に対して測定する。表2で示されている通り、親MDA−MB−435セルラインおよびエポチロンA耐性EA40セルラインは、3種の細胞傷害性薬剤全てに等しく感受性を示す。EA20および耐性MDA/T0.3細胞を[3’−デスオキシ−3’−オキソ−MeBmt]1−[Val]2−シクロスポリン(PSC−833、米国特許第5525590号に開示されているP−gp阻害剤)の存在下においてタキソール(登録商標)またはエポチロンAとインキュベーションすると、タキソール(登録商標)に対するMDA/T0.3細胞の耐性は除去されるが、エポチロンAに対するEA2の耐性に対する効果は全く観察されない。
【0088】
MDA/T0.3は、タキソール(登録商標)へのMDA−MB−435細胞の暴露を増強することにより選択されたMDA−MB−435細胞のクローン性サブラインである。MDA/T0.3細胞は、高レベルのP−糖蛋白質を発現し、様々な化学的および機能的に関連の無い化合物に対し耐性を示す。MDA/T0.3細胞は、P−糖蛋白質排除剤PSC−833での処理により多様な細胞傷害性薬剤に感作され得る。
【0089】
これらのデータを考え合わせると、P−gpまたはMRPはエポチロン耐性を仲介せず、これらの薬剤排出タンパク質はこれらの細胞でアップレギュレーションされないことが示されている。
【0090】
表2
MDA−MB−435、MDA/T0.3およびEA40細胞で比較した様々なP−gp基質のIC50
【表2】
【0091】
実施例5
エポチロン耐性細胞の特徴である差次的遺伝子発現
高密度cDNAマイクロアレイを含む慣用的方法を用いて、エポチロン耐性細胞に特有な差次的遺伝子発現が検査され得る。例えば、RNAをMDA−MB−435、EA20、EA40およびEA150細胞から単離し、これらを用いてフルオレサミン標識ヌクレオチドcye3−dUTPまたはcye5−dUTPを組込むcDNAプローブを製造した。ガラスチップ(インサイト・ファーマシューティカルズ、カリフォルニアにより市販されている)上における7500の非重複遺伝子特異的cDNA配列のマイクロアレイを、試験標本としてEA20、EA40またはEA150細胞および対照としてMDA−MB−435からの全RNAプールの蛍光標識cDNA発現産物と同時にハイブリダイズさせる(標識およびハイブリダイゼーションは、カリフォルニア、パロアルトのインサイト・ファーマシューティカルズにより行なわれた)。各ハイブリダイゼーションについて、試験および対照を異なる蛍光標識で標識し、各cDNAスポットについて、各プールにおけるその発現産物の相対量を、当業界で公知の方法にしたがってそのスポットで発生された純(ネット)蛍光シグナルにより測定する(例えば、Shena,M.et al.(1995)Science 270:467−470参照)。MDA−MB−435およびEA150細胞からのcDNAとハイブリダイズしたチップ(ただし、各cDNAプールは異なる染料で標識されている)からは、幾つかの差次的発現遺伝子が生じる。遺伝子発現データの分析は、プロプライエタリ(知的所有権をもつ)ソフトウェアを用いて行われるが、慣用的方法体系も使用され得る。デュプリケイト実験の比較は、3倍未満での差次的発現遺伝子のレベルにおける揺らぎを示している(データは示さず)。3倍を越えて差次的発現された遺伝子についてさらなる分析を行った。マイクロアレイ結果を確証するため、差次的発現遺伝子のサブセットを慣用的方法にしたがってノーザンブロッティングにより分析し、分析された遺伝子のサブセットの差次的発現を確認する。
【0092】
遺伝子発現における大規模で非特異的な変化がエポチロンA耐性細胞の選択中に生じなかったことを確かめるために、3倍より大きく変化している遺伝子の比率を算出する。チップ上に配列された7500の遺伝子のうち、4000スポットからシグナルが検出され、発現が変化しているのは僅か1.8%に過ぎない。同数の遺伝子が、EA40およびEA150細胞において差次的に発現されている。
【0093】
特異的にエポチロン耐性細胞において差次的に発現されている遺伝子をさらに区別するため、マイクロアレイチップは、MDA−MB−435親セルラインおよびタキソール(登録商標)の存在下で選択された多剤耐性MDA/T0.3セルラインから合成されたcDNAによりプローブされ得る。MDA/T0.3またはEA150細胞で差次的に発現された遺伝子の比較により、両セルラインでアップレギュレーションまたは抑制された遺伝子が同定され得る。発現がEA150細胞で変化した遺伝子のうちの僅かなパーセンテージのみがMDA/T0.3細胞でも変化した。すなわち、マイクロアレイヒットの大部分はエポチロンA耐性細胞に特異的である。
【0094】
マイクロアレイに存在するEST配列によりNCBIデータベースを検索すると、エポチロンA耐性セルラインでアップレギュレーションされた遺伝子が50%を越える割合で既知インターフェロン誘導性タンパク質をコード化することが示されている。これらのアップレギュレーション遺伝子の大部分は、組織適合性II類タンパク質(HLAII)をコード化する。興味深いことに、若干のアップレギュレーションされた遺伝子の発現はエポチロンA耐性の増加と共に変化し、HLAIIタンパク質を含む。
【0095】
非インターフェロン誘導性アップレギュレーション遺伝子のほとんどは、細胞表面タンパク質または細胞内シグナル伝達性タンパク質をコード化する(表3)。少数のアップレギュレーション遺伝子はまた、微小管関連または細胞骨格タンパク質、薬剤代謝性酵素またはストレスタンパク質としても同定された。
【0096】
表3
生化学的機能または発現部位によるEA150細胞でアップレギュレーションされた遺伝子の分類
【表3】
【0097】
本明細書に開示されているエポチロンA耐性細胞、特にEA150セルラインの場合に特有な遺伝子発現パターンを用いることにより、エポチロン耐性であり得る腫瘍細胞を含む細胞が同定され得る。例えば、cDNAを試験細胞から入手し、これらの細胞の遺伝子発現について慣用的方法にしたがって特性検定し得る。本明細書で主張されているエポチロンA耐性細胞の場合(例、EA150セルライン)と類似した発現パターンは、試験細胞が潜在的にエポチロン耐性であることを示している。
【0098】
以下の原材料および方法を用いて実施例6〜13を遂行する。
エポチロンAおよびBは、バイオモレキュラー・プロダクション・ユニット、ノヴァリティス・アクチエン・ゲゼルシャフトにより粘液細菌ソランギウム・セルロスム(Sorrangium cellulosum)を醗酵させ、次いで精製することにより得られる(例、Hofmann et al.、WO9942602)。パクリタキセルはカルビオケム(ラジョラ、カリフォルニア)から入手される。ディスコデルモリドは、S.Pomponi(ハーバー・ブランチ・オーシャングラフィック・インスティテュート、フォートピアス、フロリダ)から得られるが、米国特許5010099記載の要領でも入手され得る。ヴィンブラスチンサルフェート(ヴェルベ(登録商標))は、イーライ・リリー(インディアナポリス、インディアナ)から購入され、デメコルシンおよび5−フルオロウラシルはシグマ(セントルイス、ミズーリ)から購入される。パラプラチンは、ブリストル・マイヤーズ・スクイブ(プリンストン、ニュージャージー)から入手される。
【0099】
エポチロン耐性細胞の選択
ヒトKB−31(薬剤感受性)およびKB−8511(多剤耐性、P−gp(P−糖蛋白質)過剰発現性)類表皮腫癌細胞は、ロズウェル・パーク・メモリアル・インスティテュート(バッファロー、ニューヨーク、アメリカ合衆国)のドクターR.M.Bakerから得られ(ATCCを通じても得られる)、前記にしたがって培養される(Utz et al.,Int.J.Cancer57:104(1984))。簡単に述べると、5%(v/v)CO2および80%相対湿度雰囲気中37℃で完全MEM−アルファ培地(5%胎児牛血清および1%(v/v)L−グルタミンを補った最少必須培地−アルファ)により細胞を培養する。
【0100】
KB−31類表皮腫癌細胞を、10cm皿1枚につき0.5×106細胞で播種し、1.7nMエポチロンAの存在下、完全MEM−アルファ培地中で3日間インキュベーションする。5nMのエポチロンAの存在下でさらに3日間インキュベーション後、細胞を継代培養(分裂比1:10)し、5nMのエポチロンAの存在下で拡大させる。次いで、段階的(2倍)増加濃度のエポチロンAへの断続的暴露により、生残っている細胞を選別する。この過程中における幾つかの段階で、単一細胞コロニーを機械的な力により10cm皿から除去し、24ウェル皿、25cmおよび75cmフラスコで拡大させる。皿に残っているコロニーをプールし、2倍高濃度のエポチロンAの存在下で再播種し、上記と同様個々のコロニーを拡大させる。この選別手順によりEpoA320−80Cと呼ばれるサブラインが得られ、これをまず320nMエポチロンA(他の培地交換/継代培養ごとに含まれる)の断続的存在下で選別し、それに続いて80nMエポチロンA(培地交換/継代培養ごとに含まれる)中での連続成長に適合化させる。このサブラインは、エポチロンAの存在に部分的に依存していることが判った。しかしながら、薬剤の不存在下で成長したEpoA320−80Cのサブライン(おそらく代償的突然変異を伴うと思われる)を単離することも可能であり、これをEpoA320/NDと命名した。サブラインのクローン性を確認するため、それらを追加ラウンドの継代培養にかけることにより、EpoA320−80CおよびEpoA320/NDからそれぞれ誘導される、298/D4/40および297/C5/0ラインが得られた。298/D4/40の最適成長は40nMエポチロンAの存在下で行なわれ、297/C5/0はエポチロンAの不存在下で成長する。同様のスキームを用いて、エポチロンBの存在下で成長するKB−31細胞を選別する(出発濃度0.6nM)。315/sc5.9と称される耐性度が最高であるサブクローンを最初2.0nMエポチロンBの存在中で維持し、次いでエポチロンBの不存在下での成長に適合化させた。
【0101】
インビトロ細胞成長阻害検定
基本的には報告された要領(Meyer et al.,Int.J.Cancer43:851(1989))で抗増殖検定法を遂行する。簡単に述べると、細胞を1.5×103細胞/ウェルで96ウェルのマイクロタイタープレートに播種し、一晩のインキュベーションにより接着させる。化合物を1日目に連続希釈で加える。次いで、プレートをさらに3日間インキュベーションした後、慣用的方法にしたがって、細胞を3.3%v/vグルタルアルデヒドにより固定し、水で洗浄し、0.05%w/vメチレンブルーで染色する。洗浄後、染料を3%HClで溶離し、製造会社の使用説明書にしたがってスペクトラマックス・プラス(モレキュラー・デヴァイシーズ、サニーヴェール、カリフォルニア)により光学密度を665nmで測定する。式(処理OD−出発OD)/(対照OD−出発OD)×100を用いたSoftPro2.6.1プログラム(モレキュラー・デヴァイシーズ、サニーヴェール、カリフォルニア)を用いて数学曲線の当てはめによりIC50値を測定する。IC50は、インキュベーション期間の最後における純細胞成長の50%阻害に至らしめる薬剤濃度として定義される。セルライン298/D4/40によるIC50測定は、40nMのエポチロンAの存在下で遂行される。
【0102】
細胞ベースおよび細胞不含有チューブリンポリマー化検定法
それぞれ無傷および溶解細胞における非ポリマー化およびポリマー化チューブリン間の割合の薬剤誘発による変化は、基本的には報告された要領(Giannakakou et al.,Int.J.Cancer75:57−63(1998))で評価される。簡単に述べると、細胞薬剤効果を評価するため、2×105細胞を24ウェルプレート1枚につき最大6ウェルまで1mlの容量で播種する。37℃で18〜24時間インキュベーションして細胞を付着させた後、試験物質を細胞培養培地に加えて所望の濃度を達成し、次いで37℃で2時間細胞のインキュベーションを行う。最終賦形剤濃度は1%である。次いで、一度に1プレートを減光した組織培養フードに移し、細胞を、Ca++およびMg++を欠く室温リン酸緩衝食塩水(PBS/O)1mlで2回洗浄する。残存するPBS/Oを注意深く除去した後、100μlの室温低張性溶解緩衝液A(HLB/A:20mMのトリス−HCl(pH6.8)、1mMのMg2Cl、2mMのEGTA、2mMのペファブロック、1mMのベンズアミジン、10μg/mlのアプロチニン、10μg/mlのロイペプチン、0.5%のノニデットP−40)を加え、プレートをアルミホイルで包むことにより、光に誘導されたチューブリンポリマー化によるアーチファクトを最小限にする。37℃で正確に5分間インキュベーション後、細胞を削り取って採取し、室温のエッペンドルフ管に移す。採取したウェルを100μlの室温HLB/Aで1回洗浄し、対応する初回標本とプールする。管を5秒間渦状に混合して細胞溶解を促した後、12000×gの卓上遠心分離器中室温で10分間遠心分離することにより、非ポリマー化チューブリン(上清)から微小管(ペレット)を分離する。次いで、上清を注意深く新たなエッペンドルフ管に移し、さらなる処理時まで氷上で貯蔵する。同時に、沈澱物質を、200μlの室温再懸濁緩衝液(RSB:10mMのトリス−HCl(pH7.5)、1.5mMのMg2Cl、2mMのEGTA、1mMのペファブロック、1mMのベンズアミジン、10μg/mlのアプロチニン、10μg/mlのロイペプチン、0.5%のノニデットP−40)に再懸濁する。30秒間ソニケーター水浴中にエッペンドルフ管を置くことにより、ペレットの可溶化を助ける。次いで、上清および可溶化されたペレット標本に、95℃で5分間加熱した6×標本ローディング緩衝液(U.K.Laemmli(1999)Nature 227、680−685)を補足し、下記要領により10%分解/5%濃縮用ポリアクリルアミドゲルでのSDS−PAGEにかける。
【0103】
細胞不含有系における非ポリマー化およびポリマー化チューブリン間の割合に対する薬剤効果を評価するため、細胞を薬剤添加時に溶解し、以下の要領で処理する。上記と同様に、細胞を播種し、18〜24時間インキュベーションする。次いで、一度に1プレートを減光した組織培養フードに移し、細胞を1mlの室温PBS/Oで2回洗浄する。残存するPBS/Oを注意深く除去した後、所望の濃度の試験物質を含有する200μlの室温HLB/Aを細胞に加える。最終賦形剤濃度は1%である。プレートをアルミホイルで包み、37℃で5分間インキュベーションする。次いで、リゼイトをエッペンドルフ管に移し、5秒間ボルテックスした後、12000×gの卓上遠心分離器中室温で30秒間遠心分離にかける。標本のさらなる処理は上記と同様に遂行される。
【0104】
粗細胞下分画
本質的には報告された要領(Borner et al.,J.Biol.Chem.264:13902−909(1989))で粗細胞下分画を行うことにより、細胞質ゾルおよび膜(「顆粒」)細胞構成成分を分離する。簡単に述べると、1×106細胞を10cm皿に播種し、密集成長の70〜80%に達するまで37℃でインキュベーションする。氷へ移した後、培地を吸引除去し、細胞を10mlの氷冷PBS/Oで2回洗浄する。残存する洗浄緩衝液を注意深く除去した後、細胞を500μlの低張性溶解緩衝液B(HLB/B:25mMのヘペス(pH7.5)、25mMのβ−グリセロホスフェート、2mMのEDTA(pH7.4)、1mMのPMSF、10μg/mlのアプロチニン、10μg/mlのロイペプチン、1mMのNa3VO4)中で採取し、エッペンドルフ管へ移し、氷上に置く。溶液の泡立ちを回避する、ブランソン振動器250(50%デューティーサイクル、パワー出力設定6)を用いて細胞を10バーストで音波処理にかける。次いで、音波処理した細胞リゼイトを、4℃に予冷しておいた卓上遠心分離器中12’00×gで15分間遠心分離する。次いで、上清(=細胞質ゾル)を新たなエッペンドルフ管に移し、さらなる処理時まで氷上で貯蔵する。その間、残存するペレット標本を注意深く1mlのHLB/Bですすぐ。250μlのトリトン溶解緩衝液(TLB:HLB/B、1%トリトンX−100を補充)を加えた後、上記と同様に標本を音波処理し、遠心分離にかける。次いで、生じた上清(=膜)を新たなエッペンドルフ管に移す。タンパク質含有量を測定(BCAキット、ピアス、ロックフォード、イリノイ)後、等タンパク質量をSDS−PAGE(7%分解/5%濃縮用ポリアクリルアミドゲル)により分解し、下記要領で抗原を免疫ブロッティングにより検出する。
【0105】
免疫ブロッティング
タンパク質をSDS−PAGEにより分離し、PVDF膜(ミリポア)に移し、ウサギ抗P−gp抗体(PC03、希釈率1:100)(カルビオケム、サンディエゴ、カリフォルニア)またはマウス抗ベータ−チューブリン(tub2.1、希釈率1:1000)(シグマ、セントルイス、ミズーリ)および対応する西洋ワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体(希釈率1:10000)(アマーシャム、ピスキャタウェイ、ニュージャージー)でプローブする。製造会社の使用説明書(ECL)(アマーシャム、ピスキャタウェイ、ニュージャージー)にしたがって強化された化学発光方法を用いて免疫複合体を検出する。
【0106】
実施例6
エポチロン耐性セルラインの生成
エポチロン耐性セルライン、EpoA320−80C、EpoA320/ND、298/D4/40、297/C5/0および315/sc5.9を上記で開示されている要領で生成させる。具体的には、KB−31細胞の増殖を、3.2nMのエポチロンAの存在下で半最大阻害する。段階的増加濃度のエポチロンAと断続的スケジュールでKB−31類表皮腫癌細胞をインキュベーションすると、顕著に高い濃度のエポチロンAの存在下でも成長し得る細胞の出現が誘発される。すなわち、EpoA−320細胞は、3日間薬剤不在断続期間をもって週1回投与されると、320nMのエポチロンAの存在下でも成長した。サブクローン、298/D4/40を、週2回(すなわち、培地交換ごとに)投与された40nMエポチロンAの存在下で成長するように適合化させる。興味深いことに、これらの細胞は、親細胞において50%の細胞成長低下に至らしめる濃度の10倍を越える濃度のエポチロンAの存在下でも生残るだけでなく、さらに最適な成長についてもこの薬剤量に依存的であることが見出された。さらに、298/D4/40細胞からエポチロンAが剥奪されているとき、それらは細胞周期のG2/M期で成長を停止し、結局はアポトーシスにより死ぬ。興味深いことに、2種の他の微小管安定剤である、エポチロンBおよびパクリタキセルは、このセルラインの成長を維持する場合にエポチロンAの代わりに用いられ得る(類似した薬剤依存的表現型は、既にEpoA−320−80C細胞について言及されている)。これは、298/D4/40細胞が、他の微小管安定剤により補足され得る形でそのチューブリンの機能性に欠陥を生じさせる突然変異を獲得したことを示唆している。すなわち、このセルラインは薬剤スクリーンで使用され得、その場合微小管安定機構を伴う可能性がある化合物は、エポチロンA剥奪298/D4/40細胞の成長を維持することによって同定され得る(下記参照)。それにもかかわらず、エポチロンAの不存在下で長期間インキュベーションすると、エポチロンAに対しまだ部分的に耐性を示すが、298/D4/40の薬剤依存的表現型を喪失したサブラインを単離することができ、これは代償的突然変異に起因すると予測される。このセルラインのサブクローン、297/C5/0は、さらなる分析に使用される。
【0107】
エポチロンAをエポチロンBまたはパクリタキセル(タキソール(登録商標))と置き換えてもエポチロンA耐性/依存的セルライン298/D4/40の成長が維持され得るという事実は、このセルラインを薬剤スクリーンに使用しても、エポチロンAの場合と類似した作用機序を有する化合物が同定され得ることを示している。それを行うために、298/D4/40細胞(予めエポチロンAが剥奪されている)を増加濃度の試験化合物とインキュベーションした後、慣用的方法にしたがって3日間のインキュベーション期間の最後に細胞数が測定され得る。可能性のあるヒットは、この検定法における陽性対照として含まれ得るエポチロンA(またはパクリタキセル)と同様に298/D4/40細胞の成長を維持するものである。
【0108】
実施例7
298/D4/40および297/C5/0細胞の薬剤耐性プロフィール
第1セットの分析において、298/D4/40および297/C5/0の薬剤耐性プロフィールを測定する(表1参照)。両エポチロンA選択セルラインは、部分的または完全にエポチロンBおよびパクリタキセルに対して交差耐性を示すが、興味深いことに別の微小管安定剤であるディスコデルモリドには交差耐性を示さない。他方、298/D4/40および、程度は劣るにせよ297/C5/0は、微小管不安定剤ビンブラスチンおよびデメコルシンに対し高感受性であると思われる。いずれのセルラインとも標準細胞傷害性薬剤ドキソルビシン、5−フルオロウラシルまたはパラプラチンに交差耐性を示さない(298/D4/40について示されたパラプラチンに対する耐性のごく僅かな増加を除く)。対照的に、P−糖蛋白質過剰発現性KB−8511細胞は、パクリタキセル、ビンブラスチン、デメコルシンおよびドキソルビシンに耐性を示すため、古典的多剤耐性プロフィールを呈する。これらを考え合わせると、292/D4/40および297/C5/0について観察される耐性プロフィールは、古典的な多剤耐性の場合とは区別される。
【0109】
表4 エポチロン選択KB−31サブラインの交差耐性プロフィール
【表4】
【0110】
以下の方法にしたがって表4のデータを集める。細胞(1×103)を96ウェルプレートに播種し、24時間付着させる。次いで、化合物を2倍連続希釈として加え、インキュベーションをさらに72時間続行する。実験開始時および終了時の細胞数を、慣用的方法にしたがって細胞性タンパク質マス(塊)のメチレンブルー染色により推定する。賦形剤処理細胞の実質マス増加を100%成長として設定する。IC50は、対照と比較した半最大成長阻害に至らしめる薬剤濃度として測定される。耐性セルラインで測定されたIC50を親KB−31細胞で測定された同値で除すことにより、特定薬剤についての耐性係数(RF)を計算する。データを別々の3実験の平均±標準偏差(SD)として表すが、例外はna=適用不可能(n<3)である。P−糖蛋白質を過剰発現するコルチシン選択KB−31細胞は、古典的多剤耐性表現型についてのレファレンスとしての役割を果たした。
【0111】
エポチロンBの存在下で選択されるKB−31サブライン315/sc5.9は、エポチロンBに対して3.1倍耐性、およびエポチロンA、パクリタキセルおよびドキソルビシンに対し下限に近い交差耐性を示した。298/D4/40と同様に、315/sc5.9は、微小管不安定剤ビンクリスチンおよびデメコルシン、並びに非微小管ターゲッティング薬剤、5−フルオロウラシルに対してやや高感受性である。エポチロンA選択クローン292/D4/40および297/C5/0の場合と比べてこのクローンについて達成された顕著に低い全般的耐性レベルは不確かであるが、選ばれた選択スケジュール(段階的な2倍濃度増加)の結果であり得る。
【0112】
実施例8
P−gpは、315/sc5.9、298/D4/40および297/C5/0細胞ではエポチロン耐性を仲介しない。
エポチロン耐性がP−糖蛋白質を必然的に伴うわけではないことを確認するために、膜タンパク質について濃厚化した細胞リゼイトを、イムノブロッティングによりP−糖蛋白質の存在について評価する。具体的には、細胞(2×106)を15cm皿において播種し、密集成長の70〜80%まで成長させる。細胞を低張性溶解緩衝液中で採取し、上記と同様遠心分離により粗細胞下分画にかける。顆粒画分(原形質膜で濃厚化)を構成するペレットを、常用のデタージェント緩衝液に再懸濁する。等タンパク質量(10μg)をSDS−PAGEにより分離し、PVDF膜に移し、そしてECLシステムを用い、市販の抗体(mdr−1(P−糖蛋白質)(Ab−1)、カルビオケム−ノヴァケム、サンディエゴ、カリフォルニア)を用いてP−糖蛋白質を検出する。コルチシン選択KB−8511細胞(P−糖蛋白質を過剰発現する)の顆粒画分は、陽性対照としての役割を果たす。
【0113】
結果は、親KB−31細胞と同様、P−gp発現が315/sc5.9、298/D4/40および297/C5/0細胞からは全く検出され得ないことを示している。対照的に、コルチシンでの選択によりKB−31細胞から誘導される(Akiyam et al.,Som.Cell Mol Gen.11:117−126(1985))、「古典的」多剤耐性KB−8511細胞は、P−糖蛋白質を過剰発現する。エポチロンAおよびBがKB−8511細胞に対して完全な活性を保持しているという事実(表4参照)と考え合わせると、これらの観察結果は、エポチロン耐性がP−糖蛋白質を伴うわけではないことを強く示唆しているだけでなく、これらの薬剤により細胞を反復暴露しても、この薬剤排出ポンプは誘導されないことも示唆している。
【0114】
実施例9
298/D4/40または297/C5/0細胞におけるチューブリンポリマー化
特定薬剤の細胞蓄積の減少または代謝的不活化の増加に至る機序以外に、標的遺伝子における改変も観察されることが多い。すなわち、我々は、エポチロンAに暴露されたとき、298/D4/40または297/C5/0細胞が有するチューブリンポリマー化ポテンシャルが減少するか否かを試験した。具体的には、KB−31、297/C5/0および298/D4/40細胞(2×105)を6ウェルプレートで別々に播種し、24時間付着させる。細胞を、0、1、10、100または1000nM濃度のエポチロンAまたは賦形剤(0.1%DMSO)と2時間インキュベーションする。次いで、処理細胞を低張性溶解緩衝液中で採取し、上記と同様遠心分離により可溶性チューブリン(上清に存在)を微小管ポリマー(ペレットに存在)から分離する。SDS−PAGEによって上清タンパク質の画分を分離した後、β−チューブリン特異的抗体TUB2.1(シグマ、セントルイス、ミズーリ)およびECLシステムを製造会社の使用説明書にしたがって用いることによりブロットされたタンパク質を免疫検出することによって、非ポリマー化チューブリンの量を評価する。
【0115】
結果は、増加濃度のエポチロンAと親KB−31細胞のインキュベーションにより、これらの細胞におけるチューブリンの非ポリマー化プールの用量依存的減少が誘導され、ポリマー化微小管のプールにおける付随的増加を伴うこと(データは示さず)を示している。興味深いことに、非ポリマー化チューブリンの減少をまねくエポチロンAの濃度は、成長阻害についてのIC50と類似した範囲に含まれる(表4参照)。対照的に、297/C5/0細胞で非ポリマー化チューブリン画分を減少させるのに要求される薬剤濃度は顕著に高く、298/D4/40細胞は、試験された用量範囲(すなわち、1000nM以下)でのエポチロンA仲介チューブリンポリマー化に対し完全に不応性である。しかしながら、エポチロンA仲介チューブリンポリマー化の減少が、薬剤摂取の減少またはチューブリン機能性の真性欠陥に起因するかは、この実験からは明らかにされなかった。この問題と取り組むため、エポチロンAとのインキュベーション前に細胞を溶解する。具体的には、KB−31、297/C5/0および298/D4/40細胞(2×105)を別々に6ウェルプレートに播種し、24時間付着させる。次いで、0、1、10または100μMエポチロンA含有低張性緩衝液で細胞を溶解する。賦形剤(DMSO)濃度は1%であった。37℃で5分間インキュベーション後、標本を遠心分離にかけて、ポリマー化チューブリンから可溶性物質を分離し、上記と同様に非ポリマー化チューブリンのレベルをウエスタンブロッティングにより評価する。
【0116】
結果は、増加濃度のエポチロンAが、KB−31細胞リゼイトにおけるチューブリンの非ポリマー化プールの用量依存的減少をまねくことを示している。297/C5/0細胞についての用量応答曲線は高濃度にシフトし、298/D4/40におけるチューブリンプールはまた、非ポリマー化チューブリンのレベルでのエポチロンA仲介変化に対し完全に不応性である。また、この細胞不含有検定フォーマットで効果を発揮するのに必要とされるエポチロンAの濃度は、細胞ベースの検定法の場合に観察される濃度より数桁大きいことは注目に値する。これは、エポチロン類(およびパクリタキセル)が細胞内側で数百倍蓄積するという初期の観察結果と一致している。これらの結果を考え合わせると、297/C5/0および298/D4/40細胞が、直接的または間接的にそれらのチューブリン機能性を改変する一突然変異または幾つかの突然変異を獲得したことが示唆されている。
【0117】
HM40β−チューブリンイソ型のヌクレオチド配列決定は、親KB−31と比較したときに297/C5/0および298/D4/40細胞に存在する単一塩基突然変異の存在を明らかにした。すなわち、ヌクレオチド820、コドン274における第1ヌクレオチドは、AからCに改変された。改変されたコドン(ACC→CCC)により、トレオニンからプロリンへの非同類アミノ酸変化(Thr274Pro)が生じた。標準的分子生物学的方法を使用する。簡単に述べると、全コーディング配列を包含するオーバーラップフラグメントをRT−PCRにより全RNAから増幅し、ABI PRISM(登録商標)ビッグダイ(商標)ターミネーターサイクル配列決定キット(PEバイオシステムズ)を用いて自動式サイクルPCRにより配列決定する。使用した4種のイソ型特異的プライマーセットは以前に報告されている(Giannakakou et al.,J.Biol.Chem.272(27):17118−17125(1997))。
Claims (28)
- MDA−MB−435胸部腺癌セルラインから誘導されたエポチロン耐性セルライン。
- セルラインが10nMのエポチロンAに対して耐性を示す、請求項1記載のセルライン。
- セルラインが、20nMのエポチロンAに対して耐性を示し、特許寄託指定PTA−2702として寄託されたEA20セルラインである、請求項1記載のセルライン。
- セルラインが、40nMのエポチロンAに対して耐性を示し、特許寄託指定PTA−2708として寄託されたEA40セルラインである、請求項1記載のセルライン。
- セルラインが、60nMのエポチロンAに対して耐性を示し、特許寄託指定PTA−2703として寄託されたEA60セルラインである、請求項1記載のセルライン。
- セルラインが、150nMのエポチロンAに対して耐性を示し、特許寄託指定PTA−2706として寄託されたEA150セルラインである、請求項1記載のセルライン。
- KB−31癌セルラインから誘導されたエポチロン耐性セルライン。
- セルラインが、特許寄託指定PTA−2705として寄託された癌セルラインKB−31/298である、請求項7記載のセルライン。
- セルラインが、特許寄託指定PTA−2704として寄託された癌セルラインKB−31/297である、請求項7記載のセルライン。
- セルラインが、特許寄託指定PTA−2707として寄託された癌セルラインKB−31/315である、請求項7記載のセルライン。
- エポチロンと比較して、エポチロン耐性細胞に対し改善された細胞傷害性を示す薬剤の同定方法であって、
a)エポチロン耐性細胞および感受性細胞を、試験すべき薬剤とインキュベーションし、
b)エポチロン耐性細胞および感受性細胞についての薬剤の細胞傷害性を測定し、そして
c)エポチロンと比べて低い耐性係数(耐性細胞についてのIC50値を親細胞についてのIC50値により除す)を示す薬剤を同定する
工程を包含する方法。 - エポチロンと比べてエポチロン耐性細胞に対し選択的細胞傷害性を示す薬剤の同定方法であって、
a)エポチロン耐性細胞および感受性細胞を試験すべき薬剤とインキュベーションし、
b)エポチロン耐性細胞および感受性細胞についての薬剤の細胞傷害性を測定し、そして
c)1より小さい耐性係数(耐性細胞についてのIC50値を親細胞についてのIC50値により除す)を示す薬剤を同定する
工程を包含する方法。 - インビトロまたはインビボでエポチロン耐性細胞の成長を阻止する方法であって、耐性細胞を請求項11または12記載の細胞傷害性薬剤の1種またはそれ以上と接触させる工程を含む方法。
- エポチロンの化学センシタイザーである薬剤の同定方法であって、
a)試験すべき薬剤の存在および不存在下で、細胞が耐性を示すエポチロンとエポチロン耐性細胞をインキュベーションし、
b)細胞についてのエポチロンの細胞傷害性を測定する
工程を包含し、その場合薬剤の不存在下でインキュベーションした培養物と比べて薬剤とインキュベーションした培養物の細胞傷害性が高いということが、その薬剤が化学センシタイザーであることを示すものである方法。 - 請求項14記載の方法にしたがって同定されたエポチロンの化学センシタイザー。
- インビボまたはインビトロでエポチロン耐性細胞の成長を阻止する方法であって、エポチロン耐性細胞を1種またはそれ以上のエポチロンおよび請求項14記載の方法にしたがって同定された1種またはそれ以上の化学センシタイザーと接触させる工程を包含する方法。
- 腫瘍細胞を含む、潜在的エポチロン耐性細胞の同定方法であって、
a)試験細胞および対応する正常細胞または腫瘍および非罹患組織、並びに対照エポチロン耐性細胞および親エポチロン−感受性細胞から全mRNAを調製し、
b)細胞または組織の全mRNAからcDNAを調製し、
c)cDNA標本の差次的遺伝子発現分析を遂行し、そして
d)試験細胞または腫瘍対それらの対応する対照について観察された差次的発現パターンを、エポチロン耐性細胞対親エポチロン感受性細胞の場合と比較する工程を包含し、その場合、差次的遺伝子発現パターンが類似していることが、試験細胞が潜在的エポチロン耐性細胞であることを示唆するものである方法。 - 請求項1〜10のいずれかにおけるエポチロン耐性細胞に特異的な精製抗体。
- 医薬上許容される担体または希釈剤と共に請求項18記載の1またはそれ以上の精製抗体を含む医薬組成物。
- エポチロン耐性セルラインの同定方法であって、
a)請求項18記載の1またはそれ以上の抗体を標識し、
b)試験細胞を1またはそれ以上の標識抗体に暴露し、そして
c)前記細胞への1またはそれ以上の標識抗体の結合を測定する
工程を包含する方法。 - エポチロン耐性セルラインの単離方法であって、
a)蛍光染料により請求項18記載の1またはそれ以上の抗体を標識し、
b)1またはそれ以上の蛍光標識抗体と細胞混合物をインキュベーションし、そして
c)蛍光活性化細胞選別機の使用により1またはそれ以上の抗体により蛍光標識されたエポチロン耐性細胞を単離する
工程を包含する方法。 - エポチロン耐性細胞を殺す方法であって、
a)毒性または治療活性を有する物質を請求項18記載の1またはそれ以上の抗体に結合させ、
b)細胞培養物(または患者)に1またはそれ以上の抗体を投与し、そして、
c)エポチロン耐性細胞へ細胞傷害性薬剤をターゲッティングさせ、これらの細胞を選択的に殺す
ことを包含する方法。 - インビボでのエポチロン耐性癌の診断方法であって、
a)請求項18記載の1またはそれ以上の抗体を標識し、
b)患者に1またはそれ以上の標識抗体を投与し、そして
c)1またはそれ以上の標識抗体が結合している組織を同定する
ことを包含する方法。 - 癌の処置方法であって、処置を必要とする対象に請求項18にしたがって同定された1またはそれ以上の抗体の治療有効量を投与することを含む方法。
- エポチロン類似体の同定方法であって、
a)請求項1〜10のいずれか1項記載のエポチロン耐性セルラインおよび対応する親セルラインを増加濃度の試験物質と接触させ、そして
b)試験物質に対する親セルラインの耐性と比較された試験物質に対するエポチロン耐性セルラインの耐性を測定する
工程を包含し、親セルラインと比べてエポチロン耐性セルラインの試験物質に対する耐性の方が大きいということが、試験物質がエポチロン類似体であることを示唆するものである方法。 - 請求項25記載の方法にしたがって同定されたエポチロン類似体。
- 潜在的微小管安定剤である化合物の同定方法であって、
a)試験すべき化合物とエポチロン依存的細胞をインキュベーションし(ただし、耐性細胞はエポチロン剥奪状態である)、そして
b)依存的細胞の成長について検定する
工程を包含し、依存的細胞の成長が、化合物が潜在的微小管安定剤であることを示すものである方法。 - 請求項27記載の方法にしたがって同定された微小管安定剤。
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