JP2004508832A - 血液凝固第XIIIa因子の活性化の測定方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、血液凝固第XIIIa因子の活性化の測定方法に関する。本発明の課題は、ハイスループットを有するテストシステムの使用にも適している、容易に実施可能のFXIIIaの活性化の測定方法を記載することである。驚くべきことに、活性化FXIIIがフィブリン血液凝塊の光透過性に影響を及ぼすことが見出された。フィブリノーゲンはフィブリノーゲン分解酵素によって凝固される。存在するFXIIIaの濃度依存性のサンプルの光透過性の変化が記録され、FXIIIaの活性化の基準として利用される。本発明による方法は、特にFXIIIa阻害物質のスクリーニングに適用される。
Description
【0001】
本発明は、血液凝固第XIIIa因子の活性化の測定、特にハイスループットを有するテストシステムの使用のための方法に関する。
【0002】
血液凝固第XIIIa因子(FXIIIa)は、グルタミン転移酵素として血漿凝固系内で唯一の非蛋白質分解作用酵素である。血漿中で循環する不活性のプロ酵素第XIII因子(FXIII)が血液凝固経過中にトロンビンによって活性化され、フィブリンモノマーの分子間網状結合を相互にかつ他の血漿蛋白質(たとえばα2アンチプラスミン)と共にε−(−γ−グルタミル)−リジン結合の形成によって触媒する。それによって繊溶分解に対するフィブリン血液凝塊の機械的強度および抵抗力が増強される。
【0003】
凝固現象のほかに、FXIIIaが創傷治癒においてある役割を果たしている。FXIIIは種々の細胞中(血小板、マクロファージ)および組織中(胎盤)でも検出された。細胞FXIIIaの機能(群)に関しては、これまでまだよく知られていない(L. Muszbekら: Thromb. Res. 94, 1999, 271−305)。
【0004】
しかし、その他のFXIIIaの生理学的役割を解明するための有効な特異的インヒビターがない。このような阻害物質について血栓症罹患予防のための治療適用が検討され、プラスミノーゲン賦活体との組合せが血栓症閉塞の溶解現象を促進する(E.M. Leidyら: Thromb. Res. 59, 1990, 15−26, R.J. Shebuskiら: Blood 75, 2000, 1455−1459)。
【0005】
これまでFXIIIa阻害物質はあまり多く記載されたことがない。その多くは、フィブリン中のグルタミン残基と結合し、それによりフィブリンの交差網状結合を阻止する置換アルキルアミン型の基質である。もちろん充分な作用を達成するために、この擬基質の高い濃度が必要である(S.−Y. Kimら: Biochem. Biophys. Res. Commun. 233, 1997, 39−44)。
【0006】
FXIIIaの直接的阻害物質として、中でも酵素の活性中心でスルフヒドリル基を不可逆的に阻止するイミダゾール誘導体、トリアゾール−およびテトラゾリウム化合物が記載されている(米国特許第5,077,285号;米国特許第5,177,092号;米国特許第5,047,416号)。
【0007】
メルク・シャープ・アンド・ドーム社が開発したFXIIIa阻害物質L722151、チアゾロ−チアジアゾリウム誘導体は、動物モデル中でプラスミノーゲン賦活体による血栓溶解の改善を達成することができる(E.M. Leidyら: Thromb. Res. 59, 1990, 15−26)。
【0008】
合成阻害物質のほかに、FXIIIaの天然の阻害物質も公知である。高作用のトリデジンがエーゲル・ヘメンテリア・ギリアニ(Egel Haementeria ghilianii)から単離され、その他の阻害物質は種々の微生物から単離された(米国特許第6,025,330号;米国特許第5,710,174号;K. Ikuraら: Biosci. Biotechnol. Biochem. 64, 2000, 116−124)。
【0009】
FXIIIaの活性化同定のための公知の方法は、次の2つの原理に基づいている:
(1)「血餅溶解度試験」(Clot−Solubility−Test)は尿素中の網状結合および非網状結合のフィブリン血液凝塊の様々な溶解性を利用するが、FXIIIa活性化の半定量的同定のみを可能にする(P. Sigg: Thromb. Diath. Haemorrh. 15, 1966, 238−251; A.A. Tymiakら: J. Antibiotics 46, 1993, 204−206)。
(2)は標識またはビオチニル化アミン基質(ダンシルカダベリン、ビオチンペンチルアミン)を常法により不動化したペプチド(たとえばカゼインまたはフィブリン)に結合するためにFXIIIaの触媒性質が利用される。結合した基質の同定は、直接的に(蛍光もしくは化学発光の変化)または抗体−もしくはストレプタビジン結合酵素を介して行われる(米国特許第5,015,588号、米国特許第4,601,977号)。これらの方法は全て複数のインキュベーション・ステップを必要とし、そのため時間−および作業コストがかかり、前記方法がハイスループットによる自動化テストシステムの適用を可能にしないため、新規の効果的かつ特異的なFXIIIaの阻害物質に対する探索に適していない。またグリシンエチルエステルがグルタミン含有ペプチド基質と結合され、その際に遊離したアンモニアが酵素反応で測定される方法は、ハイスループットによるスクリーニングに適していない(K. Fickenscherら: Thromb. Haemost. 65, 1991, 535−540)。
【0010】
本発明は、特にハイスループットを有するテストシステムの使用下にFXIIIa阻害物質のスクリーニングに適用できる容易に実施可能のFXIIIaの活性化の測定方法を記載する課題を基礎においている。
【0011】
驚くべきことに、FXIIIaが使用濃度との依存性(たとえばトロンビンまたはバトロキソビンのようなフィブリノーゲン分解酵素の作用によって発生)においてフィブリン血液凝塊の光透過性が変化することが見出された。
【0012】
この結果に基づき、以下詳しく説明するFXIIIaの活性化の測定方法が開発された。
【0013】
フィブリノーゲンはフィブリノーゲン分解酵素によって凝血される。好ましくはヘビ毒酵素バトロキソビンが使用される。これはトロンビンと異なりフィブリノーゲン分子からフィブリノペプチドAのみを分離するボトロプス・アトロクス(Bothrops atrox)毒からのトロンビン状酵素である。トロンビンの使用が同様に可能である。ヒトまたはその他の哺乳動物から精製されたフィブリノーゲンの使用が特に有利であることが証明されている。しかしフィブリノーゲン源としてヒトまたは他の哺乳動物の抗凝血性血漿(たとえばクエン酸またはヒルジンによる)も利用してよい。好ましくは、本発明による方法は緩衝液中で実施される。pH値7.4を有するトリスHCl緩衝液が有利である。試験方法の感度を高めるために測定第一液に、血液凝塊の光透過性が低減されるような発生するフィブリン繊維の構造を変化させることができる物質(常法によりポリマー)が添加される。好ましくはポリエチレングリコール6000が濃度0.2%で使用される。
【0014】
フィブリノーゲン凝固によって発生する吸光増加(混濁)が連続的に一定の時間にわたり光度計で検出される。終点測定が同様に可能である。この測定は、有利には37℃および波長405nmで実施される。活性化FXIIIの測定第一液が添加されると、反応中に吸光増加がより少なくなる。すなわち発生した血液凝塊の光透過性がより大きくなる。FXIIIaを含まない第一液とFXIIIaを含む第一液の吸光時間曲線下の吸光変化もしくは面積の間の差分がFXIIIaの活性化の基準として利用される。記載したテスト第一液により、阻害物質が血液凝塊の光透過性を阻害作用の強度に応じて低下させるため、FXIIIaの阻害物質を検出することができる。テスト物質を含むおよび含まない因子第XIIIaの活性が比較される。この活性の差分が、求めているテスト物質の阻害作用の基準として利用される。フィブリノーゲン分解酵素としてのトロンビンの使用と共に、平行してトロンビン阻害物質も探索することができる。探索している物質がトロンビンに対する阻害作用を有していれば、フィブリノーゲン凝固が阻止され、サンプルの吸光が変化しない。
【0015】
本発明による方法は血漿および細胞のFXIIIaの活性化の測定のために使用することができる。プロ酵素FXIIIは測定前に別の第一液中で活性化される。この活性化はCaイオンの存在下にトロンビンによって行われる。バトロキソビンのような他のフィブリノーゲン分解酵素の使用時に測定に及ぼすトロンビンの妨害的影響を回避するために、FXIIIの完全な活性化後に活性化第一液に天然または合成のトロンビン阻害物質が充分な濃度で添加される。好ましくは組換えヒルジンが使用される。フィブリノーゲン分解酵素としてのトロンビンを使用する場合は、このステップが省かれる。
【0016】
本発明は、以下、図面に表した4実施例を利用してより詳しく説明する。
【0017】
実施例1:
活性化FXIIIの存在下のバトロキソビンによるクエン酸凝血性血漿の凝固FXIIIの活性化:
トリス緩衝液865μl(0.05M;0.154MNaCl;pH7.4)、CaCl225μl(0.2M)、トロンビン100μl(ウシ血漿由来、100E/ml)および細胞組換えFXIII 10μl(アヴェンティス−ベーリング、マールブルク、ドイツ;8.6mg/mlもしくは1155E/ml)を混合し、10分間37℃でインキュベートする。それに続き、組換えヒルジン25μl(HBW023、ヘキスト、フランクフルト、ドイツ;1000E/ml)を添加する。
【0018】
測定第一液:
マイクロタイタープレート上でクエン酸血漿100μl、トリス緩衝液60μl(pH7.4)および上記活性化第一液40μlを混合し、37℃に温度調節する。この反応をバトロキソビン50μl(ペンタプファルム社、バーゼル、スイス;2.5E/ml)の添加により開始する。吸光増加を15分にわたり37℃および波長405nmでマイクロタイタープレート光度計(iEMS、ラブシステムズ、ヘルシンキ、フィンランド)で追跡する。因子第XIIIaを含まない測定第一液を対照として利用する。
【0019】
この測定曲線は図1に示している。
【0020】
結果:
短い遅滞期後、凝固の開始により吸光が増加し、測定曲線の後部で平坦値に近接する。活性化FXIIIの存在下における吸光増加は、FXIIIaを含まないサンプル中よりも明らかに減少する。非活性化FXIIIは血液凝塊の光透過性に全く影響を及ぼさない。
【0021】
実施例2:
バトロキソビンによるフィブリノーゲンの凝固に及ぼす種々のポリマーの影響 フィブリノーゲン100μl(シグマ、ダイゼンホーフェン、ドイツ;0.6%);ポリマー25μl(25mg/ml);トリス緩衝液75μlをマイクロタイタープレート上で混合し、37℃に温度調節する。バトロキソビン50μl(2.5E/ml)の添加後、吸光増加を20分にわたり実施例1に記載した条件下に測定する。
【0022】
フィブリノーゲン血液凝塊の光透過性に及ぼすヒドロキシエチルデンプン、デキストランスルフェートおよびポリエチレングリコールの影響は図2に示す。
【0023】
結果:
添加したポリマーは、明らかに強化された吸光の増加において、血液凝塊の光透過性の低減を生ぜしめる。ヒドロキシエチルデンプン、デキストランおよびポリエチレングリコール1500の影響は比較的小さい。それに対してポリエチレングリコール6000および20000は、ポリマーを添加しないサンプルに比べ吸光を約15倍高める。
【0024】
実施例3:
種々のFXIIIa濃度の存在下のバトロキソビンによるフィブリノーゲンの凝固
FXIIIの活性化は実施例1にしたがって行う。
【0025】
マイクロタイタープレート上でフィブリノーゲン100μl(0.6%)、PEG6000 25μl(2%)、活性化第一液100μl(種々のFXIIIa濃度)を混合し、37℃に温度調節後にバトロキソビン25μl(5E/ml)と反応させる。吸光は実施例2と同様に測定する。サンプルの吸光増加は、FXIIIaを含まないサンプル(対照=100%)中の吸光増加を基準として%で表示する。
【0026】
図3はFXIIIaの較正曲線である。表示したものは平均値(n=6)±標準偏差である。
【0027】
結果:
FXIIIaは濃度依存性に血液凝塊の光透過性を高める。較正曲線は線形的に1および12μg/mlの間のFXIIIa濃度で推移する。
【0028】
実施例4:
ヨード酢酸によるFXIIIaの阻害
FXIIIの活性化は実施例1にしたがって行う。
【0029】
フィブリノーゲン100μl(0.6%)、PEG6000 25μl(2%)、緩衝液(0.2から0.8mM)中のヨード酢酸80μlおよび活性化第一液20μlを混合し、37℃に温度調節する。バトロキソビン25μl(5E/ml)の添加後、吸光を上記と同様に測定する。
【0030】
この測定曲線は図4Aに示している。図4Bは阻害物質濃度に依存するFXIIIa活性化である。
【0031】
結果:
ヨード酢酸は、血液凝塊の光透過性の低減で検出可能に、濃度依存性にFXIIIaの活性化を阻害する。この阻害作用の基準として、FXIII活性化を50%低減する阻害物質濃度(IC50)を算出する。このヨード酢酸のためのIC50値は147μMになる。
【図面の簡単な説明】
【図1】
活性化FXIIIの存在下のバトロキソビンによるクエン酸抗凝血性血漿の凝固である。
【図2】
バトロキソビンによるフィブリノーゲンの凝固に及ぼす種々のポリマーの影響である。
【図3】
種々のFXIIIa濃度の存在下にバトロキソビンによるフィブリノーゲンの凝固である。
【図4】
ヨード酢酸によるFXIIIaの阻害である。
【図4A】
測定曲線である。
【図4B】
阻害物質濃度に依存するFXIIIa活性化である。
本発明は、血液凝固第XIIIa因子の活性化の測定、特にハイスループットを有するテストシステムの使用のための方法に関する。
【0002】
血液凝固第XIIIa因子(FXIIIa)は、グルタミン転移酵素として血漿凝固系内で唯一の非蛋白質分解作用酵素である。血漿中で循環する不活性のプロ酵素第XIII因子(FXIII)が血液凝固経過中にトロンビンによって活性化され、フィブリンモノマーの分子間網状結合を相互にかつ他の血漿蛋白質(たとえばα2アンチプラスミン)と共にε−(−γ−グルタミル)−リジン結合の形成によって触媒する。それによって繊溶分解に対するフィブリン血液凝塊の機械的強度および抵抗力が増強される。
【0003】
凝固現象のほかに、FXIIIaが創傷治癒においてある役割を果たしている。FXIIIは種々の細胞中(血小板、マクロファージ)および組織中(胎盤)でも検出された。細胞FXIIIaの機能(群)に関しては、これまでまだよく知られていない(L. Muszbekら: Thromb. Res. 94, 1999, 271−305)。
【0004】
しかし、その他のFXIIIaの生理学的役割を解明するための有効な特異的インヒビターがない。このような阻害物質について血栓症罹患予防のための治療適用が検討され、プラスミノーゲン賦活体との組合せが血栓症閉塞の溶解現象を促進する(E.M. Leidyら: Thromb. Res. 59, 1990, 15−26, R.J. Shebuskiら: Blood 75, 2000, 1455−1459)。
【0005】
これまでFXIIIa阻害物質はあまり多く記載されたことがない。その多くは、フィブリン中のグルタミン残基と結合し、それによりフィブリンの交差網状結合を阻止する置換アルキルアミン型の基質である。もちろん充分な作用を達成するために、この擬基質の高い濃度が必要である(S.−Y. Kimら: Biochem. Biophys. Res. Commun. 233, 1997, 39−44)。
【0006】
FXIIIaの直接的阻害物質として、中でも酵素の活性中心でスルフヒドリル基を不可逆的に阻止するイミダゾール誘導体、トリアゾール−およびテトラゾリウム化合物が記載されている(米国特許第5,077,285号;米国特許第5,177,092号;米国特許第5,047,416号)。
【0007】
メルク・シャープ・アンド・ドーム社が開発したFXIIIa阻害物質L722151、チアゾロ−チアジアゾリウム誘導体は、動物モデル中でプラスミノーゲン賦活体による血栓溶解の改善を達成することができる(E.M. Leidyら: Thromb. Res. 59, 1990, 15−26)。
【0008】
合成阻害物質のほかに、FXIIIaの天然の阻害物質も公知である。高作用のトリデジンがエーゲル・ヘメンテリア・ギリアニ(Egel Haementeria ghilianii)から単離され、その他の阻害物質は種々の微生物から単離された(米国特許第6,025,330号;米国特許第5,710,174号;K. Ikuraら: Biosci. Biotechnol. Biochem. 64, 2000, 116−124)。
【0009】
FXIIIaの活性化同定のための公知の方法は、次の2つの原理に基づいている:
(1)「血餅溶解度試験」(Clot−Solubility−Test)は尿素中の網状結合および非網状結合のフィブリン血液凝塊の様々な溶解性を利用するが、FXIIIa活性化の半定量的同定のみを可能にする(P. Sigg: Thromb. Diath. Haemorrh. 15, 1966, 238−251; A.A. Tymiakら: J. Antibiotics 46, 1993, 204−206)。
(2)は標識またはビオチニル化アミン基質(ダンシルカダベリン、ビオチンペンチルアミン)を常法により不動化したペプチド(たとえばカゼインまたはフィブリン)に結合するためにFXIIIaの触媒性質が利用される。結合した基質の同定は、直接的に(蛍光もしくは化学発光の変化)または抗体−もしくはストレプタビジン結合酵素を介して行われる(米国特許第5,015,588号、米国特許第4,601,977号)。これらの方法は全て複数のインキュベーション・ステップを必要とし、そのため時間−および作業コストがかかり、前記方法がハイスループットによる自動化テストシステムの適用を可能にしないため、新規の効果的かつ特異的なFXIIIaの阻害物質に対する探索に適していない。またグリシンエチルエステルがグルタミン含有ペプチド基質と結合され、その際に遊離したアンモニアが酵素反応で測定される方法は、ハイスループットによるスクリーニングに適していない(K. Fickenscherら: Thromb. Haemost. 65, 1991, 535−540)。
【0010】
本発明は、特にハイスループットを有するテストシステムの使用下にFXIIIa阻害物質のスクリーニングに適用できる容易に実施可能のFXIIIaの活性化の測定方法を記載する課題を基礎においている。
【0011】
驚くべきことに、FXIIIaが使用濃度との依存性(たとえばトロンビンまたはバトロキソビンのようなフィブリノーゲン分解酵素の作用によって発生)においてフィブリン血液凝塊の光透過性が変化することが見出された。
【0012】
この結果に基づき、以下詳しく説明するFXIIIaの活性化の測定方法が開発された。
【0013】
フィブリノーゲンはフィブリノーゲン分解酵素によって凝血される。好ましくはヘビ毒酵素バトロキソビンが使用される。これはトロンビンと異なりフィブリノーゲン分子からフィブリノペプチドAのみを分離するボトロプス・アトロクス(Bothrops atrox)毒からのトロンビン状酵素である。トロンビンの使用が同様に可能である。ヒトまたはその他の哺乳動物から精製されたフィブリノーゲンの使用が特に有利であることが証明されている。しかしフィブリノーゲン源としてヒトまたは他の哺乳動物の抗凝血性血漿(たとえばクエン酸またはヒルジンによる)も利用してよい。好ましくは、本発明による方法は緩衝液中で実施される。pH値7.4を有するトリスHCl緩衝液が有利である。試験方法の感度を高めるために測定第一液に、血液凝塊の光透過性が低減されるような発生するフィブリン繊維の構造を変化させることができる物質(常法によりポリマー)が添加される。好ましくはポリエチレングリコール6000が濃度0.2%で使用される。
【0014】
フィブリノーゲン凝固によって発生する吸光増加(混濁)が連続的に一定の時間にわたり光度計で検出される。終点測定が同様に可能である。この測定は、有利には37℃および波長405nmで実施される。活性化FXIIIの測定第一液が添加されると、反応中に吸光増加がより少なくなる。すなわち発生した血液凝塊の光透過性がより大きくなる。FXIIIaを含まない第一液とFXIIIaを含む第一液の吸光時間曲線下の吸光変化もしくは面積の間の差分がFXIIIaの活性化の基準として利用される。記載したテスト第一液により、阻害物質が血液凝塊の光透過性を阻害作用の強度に応じて低下させるため、FXIIIaの阻害物質を検出することができる。テスト物質を含むおよび含まない因子第XIIIaの活性が比較される。この活性の差分が、求めているテスト物質の阻害作用の基準として利用される。フィブリノーゲン分解酵素としてのトロンビンの使用と共に、平行してトロンビン阻害物質も探索することができる。探索している物質がトロンビンに対する阻害作用を有していれば、フィブリノーゲン凝固が阻止され、サンプルの吸光が変化しない。
【0015】
本発明による方法は血漿および細胞のFXIIIaの活性化の測定のために使用することができる。プロ酵素FXIIIは測定前に別の第一液中で活性化される。この活性化はCaイオンの存在下にトロンビンによって行われる。バトロキソビンのような他のフィブリノーゲン分解酵素の使用時に測定に及ぼすトロンビンの妨害的影響を回避するために、FXIIIの完全な活性化後に活性化第一液に天然または合成のトロンビン阻害物質が充分な濃度で添加される。好ましくは組換えヒルジンが使用される。フィブリノーゲン分解酵素としてのトロンビンを使用する場合は、このステップが省かれる。
【0016】
本発明は、以下、図面に表した4実施例を利用してより詳しく説明する。
【0017】
実施例1:
活性化FXIIIの存在下のバトロキソビンによるクエン酸凝血性血漿の凝固FXIIIの活性化:
トリス緩衝液865μl(0.05M;0.154MNaCl;pH7.4)、CaCl225μl(0.2M)、トロンビン100μl(ウシ血漿由来、100E/ml)および細胞組換えFXIII 10μl(アヴェンティス−ベーリング、マールブルク、ドイツ;8.6mg/mlもしくは1155E/ml)を混合し、10分間37℃でインキュベートする。それに続き、組換えヒルジン25μl(HBW023、ヘキスト、フランクフルト、ドイツ;1000E/ml)を添加する。
【0018】
測定第一液:
マイクロタイタープレート上でクエン酸血漿100μl、トリス緩衝液60μl(pH7.4)および上記活性化第一液40μlを混合し、37℃に温度調節する。この反応をバトロキソビン50μl(ペンタプファルム社、バーゼル、スイス;2.5E/ml)の添加により開始する。吸光増加を15分にわたり37℃および波長405nmでマイクロタイタープレート光度計(iEMS、ラブシステムズ、ヘルシンキ、フィンランド)で追跡する。因子第XIIIaを含まない測定第一液を対照として利用する。
【0019】
この測定曲線は図1に示している。
【0020】
結果:
短い遅滞期後、凝固の開始により吸光が増加し、測定曲線の後部で平坦値に近接する。活性化FXIIIの存在下における吸光増加は、FXIIIaを含まないサンプル中よりも明らかに減少する。非活性化FXIIIは血液凝塊の光透過性に全く影響を及ぼさない。
【0021】
実施例2:
バトロキソビンによるフィブリノーゲンの凝固に及ぼす種々のポリマーの影響 フィブリノーゲン100μl(シグマ、ダイゼンホーフェン、ドイツ;0.6%);ポリマー25μl(25mg/ml);トリス緩衝液75μlをマイクロタイタープレート上で混合し、37℃に温度調節する。バトロキソビン50μl(2.5E/ml)の添加後、吸光増加を20分にわたり実施例1に記載した条件下に測定する。
【0022】
フィブリノーゲン血液凝塊の光透過性に及ぼすヒドロキシエチルデンプン、デキストランスルフェートおよびポリエチレングリコールの影響は図2に示す。
【0023】
結果:
添加したポリマーは、明らかに強化された吸光の増加において、血液凝塊の光透過性の低減を生ぜしめる。ヒドロキシエチルデンプン、デキストランおよびポリエチレングリコール1500の影響は比較的小さい。それに対してポリエチレングリコール6000および20000は、ポリマーを添加しないサンプルに比べ吸光を約15倍高める。
【0024】
実施例3:
種々のFXIIIa濃度の存在下のバトロキソビンによるフィブリノーゲンの凝固
FXIIIの活性化は実施例1にしたがって行う。
【0025】
マイクロタイタープレート上でフィブリノーゲン100μl(0.6%)、PEG6000 25μl(2%)、活性化第一液100μl(種々のFXIIIa濃度)を混合し、37℃に温度調節後にバトロキソビン25μl(5E/ml)と反応させる。吸光は実施例2と同様に測定する。サンプルの吸光増加は、FXIIIaを含まないサンプル(対照=100%)中の吸光増加を基準として%で表示する。
【0026】
図3はFXIIIaの較正曲線である。表示したものは平均値(n=6)±標準偏差である。
【0027】
結果:
FXIIIaは濃度依存性に血液凝塊の光透過性を高める。較正曲線は線形的に1および12μg/mlの間のFXIIIa濃度で推移する。
【0028】
実施例4:
ヨード酢酸によるFXIIIaの阻害
FXIIIの活性化は実施例1にしたがって行う。
【0029】
フィブリノーゲン100μl(0.6%)、PEG6000 25μl(2%)、緩衝液(0.2から0.8mM)中のヨード酢酸80μlおよび活性化第一液20μlを混合し、37℃に温度調節する。バトロキソビン25μl(5E/ml)の添加後、吸光を上記と同様に測定する。
【0030】
この測定曲線は図4Aに示している。図4Bは阻害物質濃度に依存するFXIIIa活性化である。
【0031】
結果:
ヨード酢酸は、血液凝塊の光透過性の低減で検出可能に、濃度依存性にFXIIIaの活性化を阻害する。この阻害作用の基準として、FXIII活性化を50%低減する阻害物質濃度(IC50)を算出する。このヨード酢酸のためのIC50値は147μMになる。
【図面の簡単な説明】
【図1】
活性化FXIIIの存在下のバトロキソビンによるクエン酸抗凝血性血漿の凝固である。
【図2】
バトロキソビンによるフィブリノーゲンの凝固に及ぼす種々のポリマーの影響である。
【図3】
種々のFXIIIa濃度の存在下にバトロキソビンによるフィブリノーゲンの凝固である。
【図4】
ヨード酢酸によるFXIIIaの阻害である。
【図4A】
測定曲線である。
【図4B】
阻害物質濃度に依存するFXIIIa活性化である。
Claims (8)
- サンプル溶液が因子第XIIIaを含有し、またはサンプル溶液中にFXIIIaが生成する前記サンプル溶液中の血液凝固第XIIIa因子の活性化の測定方法であって、
前記サンプル溶液にフィブリノーゲン分解酵素により凝固されるフィブリノーゲンが添加され、その際に発生する吸光変化が測定され、評価されることを特徴とする方法。 - フィブリノーゲン分解酵素としてバトロキソビンが使用されることを特徴とする、請求項1記載の方法。
- フィブリノーゲン分解酵素としてトロンビンが使用されることを特徴とする、請求項1記載の方法。
- フィブリノーゲン源として抗凝血性血漿が使用されることを特徴とする、請求項1および2記載の方法。
- 吸光測定のための第一液に血液凝塊の光透過性を低減する物質、特にポリマーが添加されることを特徴とする、請求項1ないし3記載の方法。
- ポリマーとしてポリエチレングリコール6000が使用されることを特徴とする、請求項5記載の方法。
- FXIIIaの阻害物質のスクリーニングのための、請求項1ないし6記載の方法の使用。
- FXIIIaの阻害物質とトロンビンとを同時にスクリーニングするための、請求項3記載の方法の使用。
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