JP2004507220A - 味覚受容細胞に発現する一過性受容体電位チャネル、ｔｒｐ８ - Google Patents
味覚受容細胞に発現する一過性受容体電位チャネル、ｔｒｐ８ Download PDFInfo
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Abstract
本発明は、味覚受容細胞に発現し、苦味および甘味の知覚に関連する、本明細書でＴＲＰ８と称する一過性受容体電位チャネルの発見、同定、および特性決定に関する。本発明は、ＴＲＰ８ヌクレオチド、宿主細胞発現系、ＴＲＰ８タンパク質、融合タンパク質、ポリペプチドおよびペプチド、ＴＲＰ８タンパク質に対する抗体、ＴＲＰ８トランスジーンを発現するトランスジェニック動物、ならびにＴＲＰ８を発現しない組換え「ノックアウト」動物を包含する。本発明はさらに、ＴＲＰ８媒介味覚応答のモジュレーターを同定する方法、および苦味または甘味の知覚を阻害または促進するためのそのようなモジュレーターの使用に関する。このＴＲＰ８活性のモジュレーターは、食品、飲料、および医薬品の風味強化剤として用いることができる。
Description
【０００１】
（１．緒言）
本発明は、味覚受容細胞に発現し、苦味および甘味の知覚に関連する、本明細書でＴＲＰ８と称する一過性受容体電位チャネルの発見、同定、および特性決定に関する。本発明は、ＴＲＰ８ヌクレオチド、宿主細胞発現系、ＴＲＰ８タンパク質、融合タンパク質、ポリペプチドおよびペプチド、ＴＲＰ８タンパク質に対する抗体、ＴＲＰ８トランスジーンを発現するトランスジェニック動物、ならびにＴＲＰ８を発現しない組換え「ノックアウト」動物を包含する。本発明はさらに、ＴＲＰ８媒介味覚応答のモジュレーターを同定する方法、および苦味または甘味の知覚を阻害または促進するためのそのようなモジュレーターの使用に関する。このＴＲＰ８活性のモジュレーターは、食品、飲料、および医薬品の風味強化剤として用いることができる。
【０００２】
（２．発明の背景）
哺乳動物は一般に５つの基本的な味覚のカテゴリー、塩味、酸味、甘味、苦味、および旨味（グルタミン酸ナトリウム）を有すると考えられている（概説として、Ｌｉｎｄｅｍａｎｎ、１９９６、Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ、７６：７１９〜７６６、ＨｅｒｎｅｓｓおよびＧｉｌｂｅｒｔｓｏｎ、１９９９、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、６１：８７３〜９００を参照のこと）。味覚シグナルは、味蕾に組織される特殊化された味覚受容細胞（ＴＲＣ）によって感知される。それぞれの味蕾は、直径２０から４０ミクロンのクラスタに集合した約５０から１００個の細胞を含む。神経線維が味蕾の基底から入り、いくつかの味覚受容細胞上にシナプスを形成している。典型的に、単一のＴＲＣはいくつかの知覚神経線維に接しており、各知覚神経線維は同一味蕾内のいくつかのＴＲＣに神経を分布している（前述のＬｉｎｄｅｍａｎｎ）。
【０００３】
すべてではないとしても、たいていの脊椎動物種のＴＲＣは、ニューロンのチャネルと類似の特性を備えた電位型ナトリウム、カリウム、およびカルシウムイオンチャネルを有する（Ｋｉｎｎａｍｏｎ，Ｓ．Ｃ．およびＭａｒｇｏｌｓｋｅｅ，Ｒ．Ｆ．、１９９６、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．６：５０６〜５１３）。異なる類型の一次味覚は異なる類型の変換機構を用いると思われ、ある類型の味覚は、種のなかでの多様な栄養必須物を反映しうる複数の機構を用いる可能性がある（前述のＫｉｎｎａｍｏｎおよびＭａｒｇｏｌｓｋｅｅ）。
【０００４】
苦味および甘味の味覚変換には、ｃＡＭＰおよびＩＰ３が関係していると考えられている（前述のＫｉｎｎａｍｏｎおよびＭａｒｇｏｌｓｋｅｅ）。苦味物質デナトニウムは、ラットのＴＲＣからカルシウムイオンを放出し、齧歯動物味覚組織においてＩＰ３レベルの急激な上昇をもたらす（同上の論文に引用されたＢｅｒｎｈａｒｄｔ，ＳＪ．等、１９９６、Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（Ｌｏｎｄｏｎ）４９０：３２５〜３３６、およびＡｋａｂａｓ，Ｍ．Ｈ．等、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：１０４７〜１０５０）。デナトニウムは細胞膜を通過することができないので、Ｇタンパク質結合受容体を活性化し、それによってαおよび／またはβγＧタンパク質サブユニットがホスホリパーゼＣを活性化して、ＩＰ３の産生、およびカルシウムイオンの放出をもたらす可能性があると考えられてきた（前述のＫｉｎｎａｍｏｎおよびＭａｒｇｏｌｓｋｅｅ）。
【０００５】
近年、網膜Ｇタンパク質のトランスデューシンと相同性のある「ガストデューシン」と呼ばれる味覚特異Ｇタンパク質がクローン化され、特性決定された（同上の論文に引用されたＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ，Ｓ．等、１９９２、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３５７：５６３〜５６９）。ガストデューシンは、苦味および甘味両方の変換において直接的な役割を果たしていると考えられている。たとえば、ガストデューシンおよびサブユニット（α−ガストデューシン）消失（ノックアウト）マウスは、苦味化合物に対する嫌悪性が低減した。意外なことに、このマウスはまた甘味化合物に対して嗜好性を示し、ガストデューシンが甘味変換に関係していることを示した。
【０００６】
最近の生化学の実験は、味覚受容体製剤がデナトニウムおよび他の苦味化合物に応答してトランスデューシンおよびガストデューシンを活性化することを実証した（Ｍｉｎｇ等、１９９８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：８９３３〜８９３８）。
【０００７】
味覚感覚の基礎をなす分子機構を完全に理解するために、味覚シグナル変換経路における各分子成分を同定することが重要である。本発明は、味覚変換に関係すると考えられており、苦味知覚に関わる細胞内カルシウムイオンの変化に関係する可能性のあるイオンチャネル、ＴＲＰ８（一過性受容体電位チャネル８）のクローニングに関する。
【０００８】
（３．発明の概要）
本発明は、味覚シグナル変換経路に関係する、以下でＴＲＰ８と称する一過性受容体電位（ＴＲＰ）チャネルの発見、同定、および特性決定に関する。ＴＲＰ８は、一過性受容体電位チャネルとして知られるカルシウムチャネルタンパク質のファミリーと構造上、高い類似性を有するチャネルタンパク質である。ノーザンブロット分析によって実証されたように、ＴＲＰ８トランスクリプトの発現は厳しく調整されており、味覚組織においてもっとも高いレベルの遺伝子発現が見出され、胃および小腸においては中程度の発現、子宮および精巣においては非常に低いレベルの発現が見出されている。ｉｎ ｓｉｔｕのハイブリッド形成は、有郭乳頭および葉状乳頭におけるＴＲＰ８の発現を示したが、周辺の非味覚上皮では発現を示さなかった。さらに、ＴＲＰ８発現の一般的なパターンは、α−ガストデューシンのパターンに類似するものであったが、α−ガストデューシンのシグナルは多少強度が高かった。
【０００９】
本発明は、ＴＲＰ８ヌクレオチド、そのようなヌクレオチドを発現する宿主、およびそのようなヌクレオチドの発現産物を包含する。本発明は、ＴＲＰ８タンパク質、ＴＲＰ８融合タンパク質、ＴＲＰ８チャネルタンパク質に対する抗体、およびＴＲＰ８トランスジーンを発現するトランスジェニック動物、またはＴＲＰ８タンパク質を発現しない組換え「ノックアウト」動物を包含する。
【００１０】
さらに本発明はまた、ＴＲＰ８活性および／または発現をモジュレートする、すなわちアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する化合物を同定の標的として、ＴＲＰ８遺伝子および／またはＴＲＰ８遺伝子産物を用いるスクリーニング方法に関する。苦味物質に類似の味覚応答を刺激する化合物は、所望の嫌悪応答を引き起こす、たとえば小児または動物にそれらの化合物を含有する組成物の消費を思いとどまらせる添加剤として用いることができる。ＴＲＰ８チャネルの活性を阻害する化合物は、苦味の知覚を阻止するために用いることができる。ＴＲＰ８阻害剤は、苦味の知覚を減少または除去することによって、食品、飲料、または医薬品における風味強化剤として用いることができる。
【００１１】
本発明は部分的に、味覚受容細胞において高レベルに発現するチャネルタンパク質の発見に基づいている。味覚変換において、苦味化合物は、ガストデューシンなどのＧタンパク質を経て作用し、次いでセカンドメッセンジャー系を調節すると考えられている。味覚受容細胞の１つのサブセットに対するα−ガストデューシン、γ−ガストデューシン、ホスホリパーゼＣβ２（ＰＬＣβ２）、およびＴＲＰ８の共局在は、それらが同一の変換経路で機能する可能性のあることを示している。ＴＲＰ８はイノシトール三リン酸（ＩＰ３）／ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）の産生を誘発する味覚物質に応答し、細胞外カルシウムで味覚細胞を充填し、カルシウム依存下流メッセンジャーを活性化することによって伝達物質のシナプスへの放出、および求心性味覚神経の活性化をもたらすと考えられている。
【００１２】
３．１．定義
本明細書では、イタリック化されていないＴＲＰ８によって示されるコードタンパク質生成物とは対照的に、ＴＲＰ８のイタリック体はＴＲＰ８遺伝子を示すものとする。たとえば、「ＴＲＰ８」はＴＲＰ８遺伝子を示し、「ＴＲＰ８」はＴＲＰ８遺伝子のタンパク質産物を示す。
【００１３】
（５．発明の詳細な説明）
ＴＲＰ８は、受容体媒介味覚シグナル変換に関係し、一過性受容体電位チャネルとして知られるカルシウムチャネルタンパク質のファミリーに属するチャネルタンパク質である（Ｍｏｎｔｅｌｌ Ｃ．、１９９７、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５２：７５５〜７６３）。本発明は、ＴＲＰ８ヌクレオチド、ＴＲＰ８タンパク質およびペプチド、ならびにＴＲＰ８タンパク質に対する抗体を包含する。本発明はまた、ＴＲＰ８チャネルを発現するために、または動物の内因性ＴＲＰ８の発現を阻害もしくは「ノックアウト」するために遺伝子的に操作された宿主細胞、または動物に関する。
【００１４】
本発明はさらに、ＴＲＰ８活性のモジュレーター、たとえばアゴニストおよびアンタゴニストなどを同定するために設計されたスクリーニングアッセイを提供する。ＴＲＰ８を自然に発現する宿主細胞、または遺伝子操作された宿主細胞および／または動物の使用は、そのような系がＴＲＰ８タンパク質によって変換されたシグナルに影響を及ぼす化合物を同定することを可能にするという利点を提供する。
【００１５】
本発明の様々な態様を、以下の項目に詳しく記載する。
【００１６】
５．１．ＴＲＰ８遺伝子
マウスＴＲＰ８のｃＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列を、図１、および図２にそれぞれ示す。ヒトＴＲＰ８のｃＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列を、図３、および図４にそれぞれ示す。
【００１７】
本発明のＴＲＰ８ヌクレオチド配列には、（ａ）図１または３に示したＤＮＡ配列、あるいは米国菌株保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に寄託された（ＡＴＣＣ受入れ番号 ）大腸菌株ＸＬ１０Ｇｏｌｄ内のｃＤＮＡクローンｐＭＲ２４に含有されるＤＮＡ配列、（ｂ）図２または４に示したアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、あるいはＡＴＣＣに寄託されたｃＤＮＡクローンｐＭＲ２４によってコードされたＴＲＰ８アミノ酸配列、（ｃ）（ｉ）厳格な条件下で（ａ）または（ｂ）に示したヌクレオチド配列にハイブリッド形成する、たとえば０．５ＭのＮａＨＰＯ４、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭのＥＤＴＡ中、６５℃でフィルタ結合ＤＮＡにハイブリッド形成し、０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中、６８℃で洗浄する（Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ｍ．等編、１９８９、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１巻、Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．、およびＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ｐ２．１０．３）、および（ｉｉ）機能的に同等な遺伝子生成物をコードする任意のヌクレオチド配列、ならびに（ｄ）図１または３に示したアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列、またはＡＴＣＣに寄託されたｃＤＮＡクローンｐＭＲ２４に含有される配列に、厳格さの低い条件下、たとえば０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中、４２℃で洗浄するといった適度に厳格な条件下などで（前述のＡｕｓｕｂｅｌ等、１９８９）ハイブリッド形成し、さらに機能的に同等なＴＲＰ８遺伝子生成物をコードする任意のヌクレオチド配列が含まれる。ＴＲＰ８タンパク質の機能的同等物には、マウスおよびヒト以外の種に存在する天然ＴＲＰ８が含まれる。本発明はさらに、配列（ａ）から（ｄ）の配列の同義性変異型を含む。本発明はさらに、たとえばＴＲＰ８遺伝子調節に有用な（ＴＲＰ８遺伝子核酸配列の増幅反応におけるアンチセンスプライマーのために、および／またはプライマーとして）、ＴＲＰ８アンチセンス分子をコードすることのできる、あるいはＴＲＰ８アンチセンス分子として作用することのできる核酸分子を含む。
【００１８】
上述のＴＲＰ８ヌクレオチド配列に加えて、他の種に存在するＴＲＰ８遺伝子の相同体も、当分野でよく知られる分子生物学の技法によって、過度の実験を行うことなく同定し、容易に単離することができる。たとえば、対象の生体から得られたｃＤＮＡライブラリー、またはゲノムＤＮＡライブラリーは、ハイブリッド形成または増幅プローブとして本明細書に記載のヌクレオチドを用いてハイブリッド形成することによってスクリーニングできる。
【００１９】
本発明はさらに、突然変異ＴＲＰ８、ＴＲＰ８のペプチド断片、切断ＴＲＰ８、およびＴＲＰ８融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を包含する。これらには、ＴＲＰ８のＴＭ（膜貫通）および／またはＣＤ（細胞質）領域、またはそれらの領域の部分に対応するポリペプチドまたはペプチドをコードするヌクレオチド配列、領域の１つまたは２つを欠いた切断ＴＲＰ８、たとえばＣＤ領域のすべて、または一部分を欠いた機能ＴＲＰ８含むが、これに限定するものではない。これらの切断または突然変異ＴＲＰ８タンパク質のいくつかは、自然ＴＲＰ８タンパク質の優性−ネガティブ阻害剤として作用することができる。融合タンパク質コードヌクレオチドには、これに限定されるものではないが、完全長ＴＲＰ８、切断ＴＲＰ８、またはマーカとして用いることのできる、たとえば酵素、蛍光タンパク質、ルミネセンスタンパク質などの関連のないタンパク質またはペプチドに融合したＴＲＰ８のペプチド断片を含むことができる。
【００２０】
ＴＲＰ８ヌクレオチド配列は、当分野の技術者に知られる多様な方法を用いて単離することができる。たとえば、ＴＲＰ８を発現することが知られる組織由来のＲＮＡを用いて構築されたｃＤＮＡライブラリーは、標識ＴＲＰ８プローブを用いてスクリーニングすることができる。あるいは、ゲノムライブラリーは、ＴＲＰ８チャネルタンパク質をコードする核酸分子を誘導するためにスクリーニングすることができる。さらに、ＴＲＰ８核酸配列は、本明細書に開示のＴＲＰ８ヌクレオチド配列に基づいて設計された２つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲを行うことによって誘導することができる。この反応の鋳型は、ＴＲＰ８を発現することが知られている細胞系、または組織から調製されたｍＲＮＡの逆転写によって得られるｃＤＮＡであってよい。
【００２１】
本発明はさらに、（ａ）前述の任意のＴＲＰ８配列および／またはそれらの補体（すなわち、アンチセンス）を含有するＤＮＡベクター、（ｂ）配列をコードするＴＲＰ８の発現を対象とする調節因子に効力的に関連する前述の任意のＴＲＰ８配列を含有するＤＮＡ発現ベクター、（ｃ）宿主細胞の配列をコードするＴＲＰ８の発現を対象とする調節因子に効力的に関連する任意の前述のＴＲＰ８配列を含有する遺伝子操作宿主細胞、および（ｄ）任意の前述のＴＲＰ８配列を含有するトランスジェニックマウスまたは他の生物を包含する。本明細書では、調節因子にはこれに限定されるものではないが、誘導または非誘導プロモーター、エンハンサ、オペレータ、および発現を駆動および調節する当分野の技術者に知られている他の因子が含まれる。
【００２２】
５．２．ＴＲＰ８タンパク質およびポリペプチド
ＴＲＰ８タンパク質、ポリペプチドおよびペプチド断片、ＴＲＰ８の突然変異、切断、または欠失形態および／またはＴＲＰ８融合タンパク質は、多様な使用目的のために調製することができ、これに限定されるものではないが、抗体の産生、ＴＲＰ８媒介の味覚知覚の調節に関わる他の細胞遺伝子生成物の同定、ならびに苦味遮断剤、食味改質剤など味覚知覚を調節するために用いることのできる化合物のスクリーニングが含まれる。
【００２３】
図２および４は、マウスおよびヒトＴＲＰ８タンパク質の推定アミノ酸配列をそれぞれ示す。本発明のＴＲＰ８アミノ酸配列には、図２または図４に示したアミノ酸配列、またはＡＴＣＣに寄託されたｃＤＮＡクローンｐＭＲ２４によってコードされたアミノ酸配列が含まれる。さらに、他の種のＴＲＰ８も本発明によって包含される。実際、５．１．項に記載のＴＲＰ８ヌクレオチド配列によってコードされた任意のＴＲＰ８タンパク質が本発明の範囲内である。
【００２４】
本発明はさらに、これに限定されるものではないが、苦味物質が細胞外カルシウム貯蔵体から前記タンパク質を発現する味覚受容細胞へのカルシウム流入を開始し、味覚受容細胞からシナプスに伝達物質を放出し、求心性神経を活性化する能力を含むいくつかの基準から判断される、５．１．項に記載のヌクレオチド配列によってコードされたＴＲＰ８に機能的に同等であるタンパク質を包含する。そのような機能的に同等なＴＲＰ８タンパク質には、これに限定されるものではないが、上の５．１．項に記載のＴＲＰ８ヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列内にアミノ酸残基の添加または置換を有するタンパク質が含まれるが、しかしながらこれはサイレント変化をもたらし、機能的に同等な遺伝子生成物を生成する。
【００２５】
ならびにＴＲＰ８の１つまたは複数の領域（たとえば、膜貫通（ＴＭ）または細胞領域（ＣＤ））に対応するペプチド、切断または欠失ＴＲＰ８（たとえば、ＴＭおよび／またはＣＤが欠けたＴＲＰ８）、完全長ＴＲＰ８、ＴＲＰ８ペプチド、または切断ＴＲＰ８が関連のないタンパク質に融合している融合タンパク質も本発明の範囲内であり、本明細書に開示したＴＲＰ８ヌクレオチドおよびＴＲＰ８アミノ酸配列に基づいて設計することができる。そのような融合タンパク質には、マーカ機能を提供する酵素、蛍光タンパク質、またはルミネセンスタンパク質の融合物が含まれる。
【００２６】
ＴＲＰ８ポリペプチドおよびペプチドは化学的に合成することができるが（たとえば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、１９８３、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．、Ｎ．Ｙ．を参照）、ＴＲＰ８由来の大きなポリペプチドおよび完全長ＴＲＰ８自体を、ＴＲＰ８遺伝子配列および／またはコード配列を含有する核酸を発現するための当分野でよく知られる技法を用いて組換えＤＮＡ技術によって有利に生成することができる。そのような方法は、５．１．項に記載のＴＲＰ８ヌクレオチド配列、ならびに適切な転写および翻訳対照シグナルを含有する発現ベクターを構築するために用いることができる。これらの方法には、たとえばｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技法、合成技法、およびｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子組換えが含まれる（たとえば、前述のＳａｍｂｒｏｏｋ等、１９８９、および前述のＡｕｓｕｂｅｌ等、１９８９に記載の技法を参照）。
【００２７】
本発明のＴＲＰ８ヌクレオチド配列を発現させるために、多様な宿主発現ベクター系を用いることができる。ＴＲＰ８ペプチドまたはポリペプチドが可溶性誘導体として発現し（たとえば、ＴＭおよび／またはＣＤに対応するペプチド）、分泌されない場合、そのペプチドまたはポリペプチドは宿主細胞から回収することができる。あるいは、ＴＲＰ８ペプチドまたはポリペプチドが分泌される場合、そのペプチドまたはポリペプチドは培地から回収することができる。しかしながら、この発現系はさらに、細胞膜に固定されたＴＲＰ８または機能的同等物を発現する操作宿主細胞を含む。そのような発現系からのＴＲＰ８の精製または濃縮は、適切な洗浄剤および脂質ミセルを用い、当分野の技術者によく知られている方法を用いて行うことができる。そのような操作宿主細胞自体を、ＴＲＰ８の構造的および機能的特性を保持するだけでなく、生物活性を評価する、すなわち薬剤スクリーニングアッセイにおいて評価することが重要であるような状態において用いることができる。
【００２８】
本発明の目的のために用いることのできる発現系には、これに限定されるものではないが、微生物、たとえばＴＲＰ８ヌクレオチド配列を含有する組換えバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで転換された細菌、ＴＲＰ８ヌクレオチド配列を含有する組換え酵母発現ベクターで転換された酵母、哺乳動物細胞のゲノムまたは哺乳動物ウイルス由来のプロモーターを含有する組換え発現構成体を持つ哺乳動物細胞系などが含まれる。
【００２９】
適切な発現系は、正しい修飾、プロセシング、ＴＲＰ８チャネルタンパク質の細胞内局在が確実に起こるように選択することができる。この目的のためには、ＴＲＰ８チャネルタンパク質を適切に修飾およびプロセシングできる能力を有する真核生物宿主細胞が好ましい。たとえばスクリーニング用の細胞系統を生じるために望まれるような、長期、高収率の組換えＴＲＰ８チャネルタンパク質を生成するために、安定な発現が好ましい。複製起点を含有する発現ベクターを用いるのではなく、宿主細胞は選択可能なマーカ遺伝子、すなわちいくつか名前を挙げるとｔｋ、ｈｇｐｒｔ、ｄｈｆｒ、ｎｅｏ、およびｈｙｇｒｏ遺伝子、ならびに適切な発現制御因子によって制御されたＤＮＡで転換することができる。異種ＤＮＡの導入に続いて、操作細胞は富化培地で１〜２日間成長させ、その後、選択培地に切り替えることができる。そのような操作細胞系統は、ＴＲＰ８遺伝子生成物の内因性活性を調節する化合物をスクリーニングおよび評価するのに特に有用である可能性がある。
【００３０】
５．３．トランスジェニック動物
ＴＲＰ８遺伝子生成物はトランスジェニック動物に発現することもできる。これに限定するものではないが、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ブタ、小型ブタ、ヤギ、ならびに非ヒト霊長類、たとえばヒヒ、サル、およびチンパンジーを含む任意の種の動物を、ＴＲＰ８トランスジェニック動物を産生するために用いることができる。
【００３１】
ＴＲＰ８トランスジーンを動物に導入して、トランスジェニック動物の初代系を生成するために、当分野で知られている任意の技法を用いることができる。そのような技法には、これに限定するものではないが、前核微量注入（Ｈｏｐｐｅ，Ｐ．Ｃ．およびＷａｇｎｅｒ，Ｔ．Ｅ．、１９８９、米国特許第４８７３１９１号）、生殖細胞系へのレトロウイルス媒介遺伝子転移（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔｔｅｎ等、１９８５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：６１４８〜６１５２）、胚性幹細胞における遺伝子ターゲッティング（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ等、１９８９、Ｃｅｌｌ、５６：３１３〜３２１）、胚の電気穿孔法（Ｌｏ、１９８３、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：１８０３〜１８１４）、および精子媒介遺伝子転移（Ｌａｖｉｔｒａｎｏ等、１９８９、Ｃｅｌｌ５７：７１７〜７２３）などが含まれる。そのような技法の概説としては、その全体を参照により本明細書の一部とする、Ｇｏｒｄｏｎ、１９８９、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｎｉｍａｌｓ、Ｉｎｔｌ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．１１５：１７１〜２２９を参照されたい。
【００３２】
本発明は、そのすべての細胞においてＴＲＰ８トランスジーンを有するトランスジェニック動物、ならびにすべてではなく、一部の細胞においてトランスジーンを有する動物、すなわちモザイク動物を提供する。このトランスジーンは、たとえばＬａｓｋｏ等の教示に従って（Ｌａｓｋｏ，Ｍ．等、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：６２３２〜６２３６）、選択的に導入し、特定の細胞型で活性化することもできる。そのような細胞型特異活性化に必要とされる調節配列は、対象となる特定の細胞型に応じて異なり、当分野の技術者に明白であろう。ＴＲＰ８トランスジーンを内因性ＴＲＰ８遺伝子の染色体部位に組み込むことが望まれるときには、遺伝子ターゲッティングが好ましい。簡単に言うと、そのような技法を用いるとき、内因性ＴＲＰ８遺伝子に相同性のいくつかのヌクレオチド配列を含有するベクターは、染色体配列による相同組換えを経て組み込まれ、内因性ＴＲＰ８遺伝子のヌクレオチド配列の機能を崩壊する目的で設計される。
【００３３】
ひとたびトランスジェニック動物が産生されたら、組換えＴＲＰ８遺伝子の発現は標準的な技法を用いて検定することができる。初回スクリーニングは、サザンブロット分析またはＰＣＲ技法によって動物組織を分析し、トランスジーンの組み込みが行われたかどうか検定することによって達成することができる。トランスジェニック動物の組織におけるトランスジーンのｍＲＮＡ発現のレベルもまた、これに限定されるものではないが、動物から得られた組織サンプルのノーザンブロット分析、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成分析、およびＲＴ−ＰＣＲを含む技法を用いて評価することができる。ＴＲＰ８遺伝子発現組織のサンプルはまた、ＴＲＰ８トランスジーン生成物に特異的な抗体を用いて免疫細胞化学的に評価することができる。
【００３４】
５．４．ＴＲＰ８タンパク質の抗体
１つまたは複数のＴＲＰ８のエピトープ、またはＴＲＰ８の保存変異型のエピトープ、あるいはＴＲＰ８のペプチド断片もまた本発明に包含される。そのような抗体には、これに限定されるものではないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ヒト化またはキメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ発現ライブラリーによって生成された断片、抗イディオタイプ（ａｎｔｉ−Ｉｄ）抗体、および上記のいずれかのエピトープ結合断片が含まれる。
【００３５】
本発明の抗体は、以下の５．５．項に記載の化合物スクリーニングスキームと共に、ＴＲＰ８遺伝子生成物の発現および／または活性に関する試験化合物の効果を評価するために用いることができる。
【００３６】
抗体を生成するために、ＴＲＰ８タンパク質、またはＴＲＰ８ペプチドを注入することによって様々な宿主動物を免疫化することができる。そのような宿主動物には、これに限定されるものではないが、いくつか名前を挙げるとウサギ、マウス、およびラットが含まれる。免疫反応を高めるために、宿主の種に応じて様々なアジュバントを用いることができ、これに限定されるものではないが、フロイントアジュバント（完全および不完全）、鉱物ゲル、たとえば水酸化アルミニウムなど、界面活性物質、たとえばリゾレシチンなど、プルロニックポリオール、多価アニオン、ペプチド、油乳濁液、キーホールリムペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにＢＣＧ（カルメット−ゲラン杆菌）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ（挫瘡プロピオンバクテリウム）などの潜在的に有用なヒトアジュバントが含まれる。
【００３７】
抗体分子のヘテロ個体集団を含むポリクローナル抗体は、免疫化動物の血清から得ることができる。モノクローナル抗体は、培養の連続細胞系によって抗体分子を生成する任意の技法によって得ることができる。その技法には、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎのハイブリドーマ技法（１９７５、Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５〜４９７、および米国特許第４３７６１１０号）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法（Ｋｏｓｂｏｒ等、１９８３、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ４：７２、Ｃｏｌｅ等、１９８３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８０：２０２６〜２０３０）、およびＥＢＶハイブリドーマ技法（Ｃｏｌｅ等、１９８５、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、７７〜９６頁）が含まれるが、これに限定されるものではない。そのような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤを含む任意の免疫グロブリンクラス、およびそれらの任意のサブクラスであることができる。本発明のｍＡｂを生成するハイブリドーマは、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで培養することができる。ｉｎ ｖｉｖｏにおける高力価でのＭａｂの生成により、これは現時点で好ましい生成方法となっている。
【００３８】
さらに、適切な抗原特異性を有するマウス抗体分子の遺伝子を適切な生物活性を有するヒト抗体分子の遺伝子と共にスプライシングする、「キメラ抗体」を生成するために開発された技法を用いることができる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ等、１９８４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８１：６８５１〜６８５５、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ等、１９８４、Ｎａｔｕｒｅ、３１２：６０４〜６０８、Ｔａｋｅｄａ等、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ３１４：４５２〜４５４）。あるいは、ヒト化抗体（米国特許第５５８５０８９号）、または一本鎖抗体（米国特許第４９４６７７８号、Ｂｉｒｄ、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３〜４２６、Ｈｕｓｔｏｎ等、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ、８５：５８７９〜５８８３、およびＷａｒｄ等、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ３３４：５４４〜５４６）を生成するために開発された技法を、ＴＲＰ８の１つまたは複数のエピトープを特異的に認識する抗体を生成するために用いることができる。
【００３９】
５．５．味知覚の調節に有用な薬剤および他の化合物のスクリーニングアッセイ
本発明は、ＴＲＰ８活性またはＴＲＰ８遺伝子発現をモジュレートし、したがって、苦味知覚のモジュレーションに有用な可能性のある化合物または組成物を同定するために設計されたスクリーニングアッセイ系に関する。
【００４０】
本発明により、細胞に基づくアッセイ系はＴＲＰ８の活性をモジュレートし、それによって苦味知覚をモジュレートする化合物をスクリーニングするために用いることができる。この目的のために、内因的にＴＲＰ８を発現する細胞を、化合物のスクリーニングに用いることができる。あるいは、ＴＲＰ８を発現するように遺伝子操作された細胞系、たとえば２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、線維芽細胞などを、スクリーニングの目的のために用いることができる。好ましくは、機能ＴＲＰ８を発現するように遺伝子操作された宿主細胞は、苦味物質による活性化に応答するものであり、たとえば味覚応答細胞などである。さらに、ＴＲＰ８チャネルタンパク質を発現するように操作された卵母細胞またはリポソームを、ＴＲＰ８活性のモジュレーターを同定するアッセイに用いることができる。
【００４１】
本発明は、（ｉ）ＴＲＰ８チャネルタンパク質を発現する細胞を試験化合物に接触させ、ＴＲＰ８の活性化レベルを測定する段階、（ｉｉ）別の実験において、（ｉ）と本質的に同じ条件で、ＴＲＰ８チャネルタンパク質を発現する細胞を対照媒体に接触させ、ＴＲＰ８の活性化レベルを測定する段階、次いで（ｉｉｉ）（ｉ）で測定したＴＲＰ８活性化レベルを（ｉｉ）のＴＲＰ８活性化レベルと比較する段階を含み、試験化合物の存在下における活性化ＴＲＰ８レベルの増加は、試験化合物がＴＲＰ８活性化剤であることを示す、苦味の知覚を誘発する化合物（「苦味活性化剤」）を同定する方法を提供する。
【００４２】
本発明はまた、（ｉ）ＴＲＰ８チャネルタンパク質を発現する細胞を、苦味物質の存在下で試験化合物に接触させ、ＴＲＰ８の活性化レベルを測定する段階、（ｉｉ）別の実験において、（ｉ）と本質的に同じ条件で、ＴＲＰ８チャネルタンパク質を発現する細胞を苦味物質に接触させ、ＴＲＰ８の活性化レベルを測定する段階、次いで（ｉｉｉ）（ｉ）で測定したＴＲＰ８活性化レベルを（ｉｉ）のＴＲＰ８活性化レベルと比較する段階を含み、試験化合物の存在下における活性化ＴＲＰ８レベルの減少は、試験化合物がＴＲＰ８阻害剤であることを示す、苦味の知覚を阻害する化合物（「苦味阻害剤」）を同定する方法を提供する。
【００４３】
本明細書において「苦味物質」とは、対象において苦味の知覚を誘発する化合物または分子複合体である。特に、苦味物質は、ＴＲＰ８チャネルタンパク質の活性化を引き起こし、細胞へのＣａ２＋の流入をもたらす物質である。苦味物質の例には、これに限定されるものではないが、安息香酸デナトニウム（「デナトニウム」；「ＤＥＮ」とも称する）、塩酸キニーネ（「キニーネ」；「ＱＵＩ」とも称する）、塩酸ストリキニン（「ストリキニン」；「ＳＴＲ」とも称する）、ヘミ硫酸ニコチン（「ニコチン」；「ＮＩＣ」とも称する）、塩酸アトロピン（「アトロピン」；「ＡＴＲ」とも称する）、スパルテイン、ナリンギン、コーヒー酸（「カフェイン」；「ＣＡＦ」とも称する）、キナクリン、およびエピカテキンが含まれる。参照により本明細書の一部とするＭｉｎｇ等、１９９９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９６：９９０３〜９９０８を参照されたい。
【００４４】
そのような細胞系の利用において、ＴＲＰ８チャネルタンパク質を発現する細胞は、試験化合物、または対照媒体（たとえば、プラシーボ）に暴露される。暴露後、その細胞を検定して、ＴＲＰ８遺伝子のシグナル変換経路成分の発現および／または活性を測定することができ、あるいはシグナル変換経路自体の活性を検定することができる。
【００４５】
ＴＲＰ８の活性をモジュレートする試験分子の能力は、標準的な生化学および生理学の技法を用いて測定することができる。触媒活性の活性化または抑制、ＴＲＰ８および／または他のタンパク質のリン酸化または脱リン酸、セカンドメッセンジャー生成物の活性化またはモジュレーション、細胞イオンレベルの変化、シグナル分子の会合、解離、または転位、あるいは特定の遺伝子の転写または翻訳などの反応をモニターすることができる。本発明の非限定的な実施形態において、細胞内Ｃａ２＋レベルの変化は、ｉｎｄｏ、ｆｕｒａなどの指示色素の蛍光によってモニターすることができる。ＴＲＰ８シグナル変換をモジュレートする化合物を同定するために、サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼの活性化に加えて、アデニレートシクラーゼ、ホスホリパーゼ、ＡＴＰアーゼ、および神経伝達物質のＣａ２＋感受性放出を測定することができる。さらに、ＴＲＰ８チャネルタンパク質のモジュレーションにより生じる膜電位の変化は、電位固定、またはパッチ記録法を用いて測定することができる。
【００４６】
たとえば、試験化合物への暴露後、細胞溶解産物は、Ｃａ２＋の細胞内レベルの上昇、およびホスホジエステラーゼ、ホスホリパーゼ、ＡＴＰアーゼ、またはｃＡＭＰなどの下流メッセンジャー依存カルシウムの活性化に関して検定することができる。対照媒体で処理した細胞に見出されるレベルと比較して、試験化合物がＣａ２＋の細胞内レベルを上昇させる能力、およびホスホジエステラーゼを活性化する、またはｃＡＭＰのレベルを低減する能力は、その試験化合物がアゴニストとして作用し（すなわち、ＴＲＰ８活性化剤である）、宿主細胞により発現したＴＲＰ８媒介のシグナル変換を誘発することを示す。対照媒体の場合に見出されるレベルと比較して、試験化合物が苦味物質の誘発するカルシウム流入を阻害する能力、およびホスホジエステラーゼを阻害する、またはｃＡＭＰのレベルを上昇させる能力は、その試験化合物がアンタゴニストとして作用し（すなわち、ＴＲＰ８阻害剤である）、ＴＲＰ８媒介のシグナル変換を阻害することを示す。
【００４７】
本発明の特定の実施形態において、ｃＡＭＰのレベルは、多様な異なるレポーター遺伝子のいずれかに結合したｃＡＭＰを含有する構成体を用いて測定することができる。そのようなレポーター遺伝子には、これに限定されるものではないが、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、成長ホルモン、または胎盤アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）を含むことができる。そのような構成体を、ＴＲＰ８チャネルタンパク質を発現する細胞に導入し、それによってＴＲＰ８活性のモジュレーターを同定するために設計されたスクリーニングアッセイに有用な組換え細胞を提供する。
【００４８】
細胞の試験化合物への暴露に続いて、ＴＲＰ８活性を調節する試験化合物の能力を判定するために、レポーター遺伝子発現のレベルを定量することができる。アルカリホスファターゼは細胞から分泌されるので、アルカリホスファターゼ検定は、本発明の実施において特に有用である。したがって、組織培養の上澄みを、分泌アルカリホスファターゼに関して検定することができる。さらに、アルカリホスファターゼ活性は、Ｂｒｏｎｓｔｅｉｎ，Ｉ．等（１９９４、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１７：１７２〜１７７）に記載されているような、熱量計、生物発光、または化学発光検定によって測定することができる。そのようなアッセイは、医薬品のスクリーニングに関して、簡単で高感度な容易に自動化可能な検出システムを提供する。
【００４９】
さらに、細胞内ｃＡＭＰの濃度を求めるために、シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）を用いることができる（ＳＰＡキットはＡｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓから提供される）。このアッセイは、１２５Ｉ標識ｃＡＭＰ、抗ｃＡＭＰ抗体、および二次抗体で被覆されたシンチラント組込み微小球を用いる。標識ｃＡＭＰ−抗体複合体を通して微小球に近接すると、１２５Ｉはシンチラントを励起して光を放射する。細胞から抽出された非標識ｃＡＭＰは、抗体との結合に関して１２５Ｉ標識ｃＡＭＰと競合し、それによってシンチレーションを減少する。このアッセイは高処理量のスクリーニングを可能にするために、９６ウェルプレートで行うことができ、読み出しのために、Ｗａｌｌａｃ、またはＰａｃｋａｒｄで製造されたもののような９６ウェルベースのシンチレーション計数装置を用いることができる。
【００５０】
本発明の他の実施形態において、細胞内Ｃａ２＋のレベルは、ＫｏｍｕｒｏおよびＲａｋｉｃ、１９９８のＴｈｅ Ｎｅｕｒｏｎ ｉｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ、Ｌ．Ｗ．Ｈａｙｍｅｓ編、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載されているような方法を用い、たとえばＦｌｕｏ−３およびＦｕｒａ−ＲｅｄなどのＣａ２＋指示色素を用いてモニターすることができる。
【００５１】
上述の任意の方法によって同定された、ＴＲＰ８の活性を活性化する試験活性化剤は、苦味知覚を誘発する能力を確認するために、さらなる試験に供することができる。上述の任意の方法によって同定された、苦味物質によってＴＲＰ８の活性化を阻害する試験阻害剤は、その阻害活性を確認するために、さらなる試験に供することができる。ＴＲＰ８受容体の活性をモジュレートする試験化合物の能力は、行動学的方法、生理学的方法、またはｉｎ ｖｉｔｒｏ法によって評価することができる。
【００５２】
たとえば、行動学的研究は、ＴＲＰ８阻害剤と推定されるものを含む組成物、およびその化合物を含まない同一の組成物を消費する選択を試験動物が与えられている状態で行うことができる。たとえば、より多い消費によって示される試験化合物を含む組成物に対する嗜好は、ＴＲＰ８阻害活性と正の相関を有するものであろう。さらに、試験動物によるＴＲＰ８の推定活性化剤を含む食品の忌避は、苦味活性化剤の同定と正の相関を有するものであろう。
【００５３】
ＴＲＰ８と相互に作用する、たとえば結合する化合物を同定するために、細胞に基づくアッセイに加えて、細胞に基づかないアッセイ系を用いることができる。そのような化合物は、ＴＲＰ８活性のアンタゴニストまたはアゴニストとして作用する可能性があり、苦味知覚を調節するために用いることができる。
【００５４】
この目的のために、可溶性ＴＲＰ８を組換えにより発現させ、ＴＲＰ８と結合する化合物を同定するために、細胞に基づかないアッセイにおいて用いることができる。以下の５．２．項に記載のとおり調製された、１つまたは複数のＴＲＰ８領域を含有する組換え発現ＴＲＰ８ポリペプチドまたは融合タンパク質を、細胞に基づかないスクリーニングアッセイに用いることができる。たとえば、ＴＲＰ８の１つまたは複数の細胞質または膜貫通領域に対応するペプチド、またはＴＲＰ８の１つまたは複数の細胞質または膜貫通領域を含有する融合タンパク質は、ＴＲＰ８の細胞質部分に結合する化合物を同定するために用いることができ、そのような化合物は、ＴＲＰ８のシグナル変換経路をモジュレートするのに有用である可能性がある。細胞に基づかないアッセイにおいて、組換え発現ＴＲＰ８は、当分野の技術者によく知られている方法によって、試験管、マイクロタイターウェル、またはカラムなどの固体支持層に付着させることができる（上述のＡｕｓｕｂｅｌ等を参照のこと）。次いでこの試験化合物を、ＴＲＰ８に結合する能力に関して検定する。
【００５５】
ＴＲＰ８チャネルタンパク質は、他の分子から完全に、または部分的に単離されたものであることができ、あるいは粗抽出物または半精製抽出物の一部として存在することができる。非限定的な例として、ＴＲＰ８チャネルタンパク質は、味覚受容細胞膜の試料に存在することができる。本発明の特定の実施形態において、そのような味覚受容細胞膜は、参照により本明細書の一部とするＭｉｎｇ，Ｄ．等、１９９８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：８９３３〜８９３８に記載のとおり調製することができる。詳細には、ウシの有郭乳頭（味覚受容細胞を含む「味覚組織」）を用手的に切開し、液体窒素中で凍結、使用まで−８０℃で貯蔵することができる。集めた組織は、次いでＰｏｌｙｔｒｏｎホモジナイザー（２５０００ＲＰＭ、各２０秒の３サイクル）を用いて、ｐＨ７．５、１０ｍＭのＴｒｉｓ、１０％ｖ／ｖグリセロール、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、１０μｇ／μｌペプスタチンＡ、１０μｇ／μｌロイペプチン、１０μｇ／μｌアプロチニン、および１００μＭの４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオリド塩酸塩を含有する緩衝液で均質化することができる。１５００×ｇ、１０分間の遠心分離によって微粒子を除去した後、味覚膜を４５０００×ｇ、６０分間の遠心分離によって集めることができる。次いで、ペレット化した膜を２度洗浄し、プロテアーゼ阻害剤を含まない均質化緩衝液に再懸濁し、２５ゲージの針中に２０回通すことによってさらに均質化することができる。その後、アリコートを瞬間凍結するか、あるいは使用まで氷上で保存することができる。他の非限定的な例として、味覚受容体は組換えクローンから得ることができる（Ｈｏｏｎ，Ｍ．Ｒ．等、１９９９、Ｃｅｌｌ９６：５４１〜５５１を参照のこと）。
【００５６】
転写または翻訳レベルでＴＲＰ８発現を調節する化合物をスクリーニングするように、アッセイを設計することもできる。一実施形態において、ＴＲＰ８遺伝子の発現をモジュレートする化合物を同定するために、レポーター分子をコードするＤＮＡをＴＲＰ８遺伝子の調節因子に結合させ、適切な完全細胞、細胞抽出物、または溶解産物中で用いることができる。適切な細胞または細胞抽出物は、通常ＴＲＰ８遺伝子を発現し、それによってその細胞抽出物がｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏの転写に必要とされる転写因子を含有することを確実にするような任意の細胞型から調製される。このスクリーニングは、レポーター構成体の発現をモジュレートする化合物を同定するために用いることができる。そのようなスクリーニングにおいて、レポーター遺伝子の発現レベルは試験化合物の存在下で求められ、試験化合物非存在下での発現レベルと比較される。
【００５７】
ＴＲＰ８の翻訳を調節する化合物を同定するために、ＴＲＰ８ｍＲＮＡの翻訳をモジュレートする能力に関して、ＴＲＰ８トランスクリプトを含有する細胞またはｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞溶解産物を試験することができる。ＴＲＰ８翻訳の阻害剤を検定するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＴＲＰ８ｍＲＮＡの翻訳をモジュレートする能力に関して、試験化合物を検定する。
【００５８】
さらに、ＴＲＰ８活性を調節する化合物は、動物モデルを用いて同定することができる。ＴＲＰ８の活性化が起こっているかどうかを判定するために、行動学的、生理学的、または生化学的方法を用いることができる。行動学的方法、および生理学的方法は、ｉｎ ｖｉｖｏで実施することができる。行動学的測定の一例として、試験阻害剤の存在下、または非存在下で、試験動物が苦味物質を含む組成物を自発的に消費する傾向を測定することができる。動物体内で苦味物質がＴＲＰ８を活性化する場合、その動物は苦味を体験することが予測され、それによって動物はその組成物をさらに消費することを思いとどまるであろう。苦味物質のみを含有する組成物（活性化ＴＲＰ８を伴う）か、あるいは苦味阻害剤と共に苦味物質を含有する組成物（低レベルの活性化ＴＲＰ８）を消費する選択が動物に与えられている場合、苦味阻害剤を含有する組成物の消費を好むことが予測される。したがって、動物によって実証された相対的な嗜好は、ＴＲＰ８チャネルの活性化と逆相関する。
【００５９】
生理学的方法には神経応答の研究が含まれ、この研究は味覚受容細胞を含有する組織と機能可能に連結している神経を用いて、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで実施することができる。ＴＲＰ８の活性化を起こす苦味物質への暴露によって味覚受容細胞に活動電位がもたらされ、次いでそれが末梢神経を通じて伝えられるので、苦味物質に対する神経応答を測定することは、特にＴＲＰ８活性化の間接的な測定となる。舌咽神経を用いて実施された神経応答の研究の一例は、Ｎｉｎｏｍｉｙａ，Ｙ等、１９９７、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（Ｌｏｎｄｏｎ）２７２：Ｒ１００２〜Ｒ１００６に記載されている。
【００６０】
上に記載したアッセイによって、ＴＲＰ８活性をモジュレートする化合物を同定することができる。たとえば、ＴＲＰ８活性に影響を及ぼす化合物には、これに限定されるものではないが、ＴＲＰ８に結合し、シグナル変換を活性化するか（アゴニスト）、あるいは活性化を阻止する（アンタゴニスト）化合物が含まれる。ＴＲＰ８遺伝子の活性に影響を及ぼす化合物も（ＴＲＰ８遺伝子の発現に影響を及ぼすことによるものであって、分子、たとえばタンパク質、または有機小分子を含み、それらが転写に影響を及ぼすか、あるいはスプライシングを妨げることによって、ＴＲＰ８の完全長または切断形態の発現をモジュレートすることができる）、本発明のスクリーニングを用いて同定することができる。しかしながら、記載のアッセイはさらに、ＴＲＰ８シグナル変換をモジュレートする化合物も同定できることに留意されたい（たとえば、下流のシグナル化に影響を及ぼす化合物であって、たとえばそれらの受容体に結合する味覚物質によって活性化されたシグナルの変換に関わる、Ｇタンパク質活性の阻害剤または強化剤である）。ＴＲＰ８の下流のシグナル化に影響を及ぼし、それによって味知覚へのＴＲＰ８の作用をモジュレートする、そのような化合物の同定および使用は、本発明の範囲内である。
【００６１】
本発明によってスクリーニングすることのできる化合物には、これに限定されるものではないが、ＴＲＰ８に結合して、天然味覚物質リガンドによって引き起こされた活性を模倣するか（すなわち、アゴニスト）、あるいは天然リガンドによって引き起こされた活性を阻害する（すなわち、アンタゴニスト）有機または無機小化合物、ペプチド、抗体、およびそれらの断片、ならびに他の有機化合物（たとえば、ペプチド類似作用物質）が含まれる。
【００６２】
化合物には、これに限定されるものではないが、ペプチド、たとえばこれに限定されるものではないがランダムペプチドライブラリーの構成体を含む可溶性ペプチドなど（たとえば、Ｌａｍ，Ｋ．Ｓ．等、Ｎａｔｕｒｅ３５４：８２〜８４、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．等、１９９１、Ｎａｔｕｒｅ３５４：８４〜８６を参照）、Ｄ−および／またはＬ−配置のアミノ酸によるコンビナトリアルケミストリ由来分子ライブラリー、ホスホペプチド（これに限定するものではないが、ランダムまたは部分変性定方向ホスホペプチドライブラリーの構成体を含む）（Ｓｏｎｇｙａｎｇ，Ｚ等、１９９３、Ｃｅｌｌ７２：７６７〜７７８）、抗体（これに限定されるものではないが、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、抗イディオタイプ、キメラ、または一本鎖抗体、ならびにＦＡｂ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦＡｂ発現ライブラリー断片、ならびにそれらのエピトープ結合断片を含む）、および有機または無機小分子が含まれる。
【００６３】
本発明によってスクリーニングすることのできる他の化合物には、これに限定されるものではないが、ＴＲＰ８のシグナル変換経路に関わるＴＲＰ８遺伝子または他の一部の遺伝子の発現に影響を及ぼす有機小分子（たとえば、遺伝子発現に関わる転写因子または調節領域と相互に作用することによる）、ＴＲＰ８の活性に影響を及ぼすか、あるいはたとえばＴＲＰ８関連Ｇタンパク質など、ＴＲＰ８シグナル変換経路に関わる他の一部の細胞内因子の活性に影響を及ぼすような化合物が含まれる。
【００６４】
５．６．ＴＲＰ８のモジュレーターを含有する組成物およびその使用
本発明は、有効量のＴＲＰ８阻害剤、たとえば上の５．５．項に記載したようにＴＲＰ８の活性化を測定することによって同定されたＴＲＰ８阻害剤などを対象に投与することを含む、対象の味覚組織に苦味物質が接触することによって生じる苦味を阻害する方法を提供する。本発明はまた、有効量のＴＲＰ８阻害剤を組成物に配合することを含む、組成物の苦味を阻害する方法を提供する。ＴＲＰ８阻害剤の「有効量」とは、苦味の知覚を主観的に減少させる、かつ／または上述のアッセイの１つによって測定されるＴＲＰ８活性化の検出可能な減少を伴う量である。
【００６５】
本発明はさらに、上の５．５．項に記載したとおりに同定された苦味活性化剤などの、ＴＲＰ８活性を活性化する化合物を含む組成物を対象に投与することを含む、対象による苦味の知覚を生じさせる方法を提供する。この組成物は、対象によって苦味として認識される味覚を生じるのに有効な量の活性化剤を含むことができる。
【００６６】
したがって本発明は、苦味活性化剤、および苦味阻害剤を含む組成物を提供する。そのような組成物は、対象の味覚組織に接触する可能性のある任意の物質を含み、これに限定されるものではないが、食品、飲料、医薬品、歯科製品、化粧品、ならびに封筒および切手に用いられる湿潤接着剤が含まれる。
【００６７】
一連の実施形態において、共存する苦味物質に関連する苦味の知覚を中和するために、苦味阻害剤が用いられる。これらの実施形態において、本発明の組成物は、苦味物質、および苦味阻害剤を含み、苦味阻害剤は苦味の知覚を阻害する濃度で存在する。たとえば、組成物中の苦味物質の濃度、および組成物中の苦味組成物の濃度を上の５．１．項に記載のアッセイに供するとき、苦味阻害剤は苦味物質によるＴＲＰ８の活性化を阻害する。
【００６８】
本発明は、苦味物質の嫌悪効果を低減または除去することによって食品の味覚を向上させるために用いることができる。苦味物質が食品保存剤である場合、本発明のＴＲＰ８阻害剤は、食品への保存剤の配合を可能、あるいは容易にし、それによって食品の安全性を向上させる。栄養補助剤として投与される食品の場合、本発明のＴＲＰ８阻害剤の配合は、消費を促進し、それによってこれらの組成物が栄養または熱量を対象に供給する効果を高めることができる。
【００６９】
本発明のＴＲＰ８阻害剤は、医療および／または歯科用組成物に配合することができる。診断処置に用いられるある種の組成物は、造影剤、および口腔局所麻酔薬など、不快な味を有するものがある。組成物の味を改善することによって、そのような処置を受ける対象の快適性を向上させるために、本発明のＴＲＰ８阻害剤を用いることができる。さらに、本発明のＴＲＰ８阻害剤は、風味を改善し、患者のコンプライアンスを向上させるために（特に患者が子供、または非ヒト動物である場合）、錠剤および液体を含む薬剤組成物に配合することができる。
【００７０】
本発明のＴＲＰ８阻害剤は、味の特徴を改善するために、化粧品に含有させることができる。たとえば、これに限定されるものではないが、本発明のＴＲＰ８阻害剤は、顔用クリーム、および口紅に配合することができる。さらに、本発明のＴＲＰ８阻害剤は、慣例的な食品、飲料、医薬品、または化粧品ではないが、味覚膜に接触する可能性のある組成物に配合することができる。これに限定されるものではないが、その例には、石鹸、シャンプー、練り歯磨き、義歯接着剤、切手および封筒表面の接着剤、ならびに害虫防除に用いられる毒性組成物（たとえば、ネズミ、またはゴキブリ用毒薬）が含まれる。
【００７１】
６．実施例：ＴＲＰ８遺伝子のクローニングおよび特性決定
以下の項は、ＴＲＰ８と称する一過性受容体タンパク質チャネルの単離、および特性決定を記載する。ＴＲＰ８の推定アミノ酸配列は、他のＴＲＰタンパク質との相同性を示している。ノーザンブロット分析は、味覚受容細胞におけるＴＲＰ８ＲＮＡの高レベルの発現を示す。
【００７２】
６．１．材料および方法
６．１．１．ＴＲＰ８遺伝子のクローニング
Ｇタンパク質ガストデューシンの発現にポジティブである、味覚受容細胞のサブセットに特異的または選択的に発現する遺伝子をクローニングするために、単一細胞逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、およびディフェレンシャルスクリーニングを用いた。個々のガストデューシンポジティブ細胞を、マウスの有郭乳頭から単離した（Ｈｕａｎｇ等、１９９９、Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ２：１０５５〜１０６２）。個々の細胞由来のｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、次いでＰＣＲ増幅した。増幅ｃＤＮＡをバクテリオファージベクターにサブクローニングすることによって、単一味覚受容細胞からの複数のｃＤＮＡライブラリーを構築した。このｃＤＮＡライブラリーを、自己プローブ（同一細胞のＰ３２標識増幅ｃＤＮＡ）および非自己プローブ（他の味覚細胞のＰ３２標識増幅ｃＤＮＡ）を用いて、ディフェレンシャルスクリーニングによって分析した。１％ウシ血清アルブミン、および４％ＳＤＳを含有する０．５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．３）中、６５℃、２０時間、ハイブリッド形成を行った。膜を０．１％ＳＤＳ、０、５×ＳＳＣ中、６５℃で２０分間、２回洗浄し、０．１％ＳＤＳ、０、１×ＳＳＣ中、６５℃で１５分間、１回洗浄した。増感スクリーンを用い、膜を−８０℃で３日間、Ｘ線フィルムに暴露した。非自己プローブより自己プローブに強くハイブリッド形成したクローンを単離し、その挿入部を配列決定した。
【００７３】
このクローンをプローブとして用い（ＬＱＳＥＱ９１）、上記と同じハイブリッド形成条件で、マウス味覚組織ｃＤＮＡライブラリーを完全長クローンに関してスクリーニングした。最長の挿入物を含有するクローンの配列決定によって、一過性受容体電位（ＴＲＰ）チャネルとして知られるカルシウムチャネルタンパク質のファミリーに最大の類似性を有する完全長クローンを生成した。
【００７４】
以下のマウス組織から、チオシアン酸グアニジウム／フェノール／クロロホルム抽出によって、トータルＲＮＡ２５μｇを単離した（Ｐ．ＣｈｒｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＮ．Ｓａｃｃｈｉ、１９８７、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２：１５６）。上皮富化味蕾、非味覚舌上皮、脳、網膜、嗅上皮、胃、小腸、肝臓、脾臓、腎臓、肺、心臓、胸腺、子宮、精巣、および骨格筋である。ＲＮＡを、６．７％ホルムアルデヒドを含有する１．５％アガロースゲルで電気泳動し、ＵＶ照射によってナイロン膜に移行、固定した。このブロットを、（α−３２Ｐ）−ｄＣＴＰの存在下、Ｅｘｏ（−）Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼを用いてランダムプライミングによって、マウスＴＲＰ８ｃＤＮＡの３’末端から産生した放射性標識１．７ｋｂ断片でハイブリッド形成した。ハイブリッド形成は、７％ＳＤＳを含有する０．２５Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）中、６５℃で２４時間、攪拌しながら行った。膜を、５％ＳＤＳを含有する２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）中、６５℃で４０分間、２回洗浄し、１％ＳＤＳを含有する同じ緩衝液中、６５℃で４０分間、２回洗浄した。このブロットを、増感スクリーンを用い、−８０℃で５日間、Ｘ線フィルムに暴露した。
【００７５】
ヒト高処理量ＤＮＡ配列およびゲノム配列のＢＬＡＳＴ検索を、参照としてマウスＴＲＰ８配列を用いて行った。この検索によって、ＢＡＣクローンは完全なヒトＴＲＰ８遺伝子を含有することが同定された。次いでＧｅｎｓｃａｎプログラムを用いて、ヒトＴＲＰ８遺伝子の予測されたタンパク質コードエキソンを同定した。この領域をマウスＴＲＰ８ｃＤＮＡと整列させ、予測されたヒトＴＲＰ８コード領域の全体を推定した。
【００７６】
６．１．２．ノーザンハイブリッド形成
いくつかのマウス組織から、Ｔｒｉｚｏｌ試薬を用いてトータルＲＮＡを単離し、ＲＮＡ各２５μｇを、６．７％ホルムアルデヒドを含有する１．５％アガロースゲル上のレーンごとに電気泳動した。このサンプルを、ＵＶ照射を用いてナイロン膜に移行、固定した。このブロットを、７％ＳＤＳ、および４０μｇ／ｍｌのニシン精子ＤＮＡを含有する０．２５Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）中、６５℃で５時間、攪拌しながら前ハイブリッド形成を行い、同じ溶液中、３２Ｐ放射性標識マウスＴＲＰ８プローブを用いて２０時間ハイブリッド形成を行った。膜を、５％ＳＤＳを含有する２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）中、６５℃で４０分間、２回洗浄し、１％ＳＤＳを含有する同じ緩衝液中、６５℃で４０分間、２回洗浄、さらに０．１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中、７０℃で３０分間、１回洗浄した。このブロットを、増感スクリーンを用い、−８０℃で３日間、Ｘ線フィルムに暴露した。３２Ｐ標識ＴＲＰ８プローブは、（α−３２Ｐ）−ｄＣＴＰの存在下、Ｅｘｏ（−）Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼを用い、３’−ＵＴＲに対応するＴＲＰ８の．４８ｋｂｃＤＮＡのランダムノナマープライミングによって産生した。
【００７７】
６．１．３．ｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成
３３Ｐ標識ＲＮＡプローブ［ＴＲＰ８（１．７ｋｂ）およびα−ガストデューシン（１ｋｂ）］を、マウス舌組織の凍結切片（１０μｍ）のｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成に用いた。ハイブリッド形成および洗浄は、（Ａｓａｎｏ、Ｍｉｙｏｓｈｉ等、２０００、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｌｅｔｔ２８３：６１〜６４）に記載のとおりに行った。スライドはＫｏｄａｋ ＮＴＢ−２核トラック乳剤で被覆し、４℃で３週間暴露、その後、展開、固定した。
【００７８】
６．１．４．免疫細胞学
キーホールリンペットヘモシアニン複合ＴＲＰ８ペプチド（ａａ１０２８〜１０４９）に対するポリクローナル抗血清を、ウサギ内で生育した。このＰＬＣβ２抗体は、Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから得た。抗α−ガストデューシンおよび抗Ｇγ１３抗体は、（Ｒｕｉｚ−Ａｖｉｌａ等、１９９５、Ｎａｔｕｒｅ３７６：８０〜８５、Ｈｕａｎｇ等、１９９９、Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ２：１０５５〜６２）に記載のとおりであった。マウス舌組織の厚さ１０ミクロンの凍結切片（あらかじめ４％のパラホルムアルデヒドに固定、２０％スクロース中で凍結保護）を、ＰＢＳ中の３％ＢＳＡ、０．３％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、２％ヤギ精子、および０．１％Ｎａアジド中、室温で１時間阻止し、その後、α−ガストデューシンに対する精製抗体、またはＴＲＰ８に対する抗血清を用い（１：８００）、４℃で８時間インキュベートした。二次抗体は、Ｃｙ３−対ＴＲＰ８抗ウサギＩｇヤギ抗体コンジュゲート、およびフルオレセイン−対ＰＬＣβ２抗ウサギＩｇヤギ抗体コンジュゲート、α−ガストデューシン、またはＧγ１３であった。ＴＲＰ８の免疫反応性は、免疫化ペプチド２０μＭを用いた抗血清の前保温によって阻止された。前免疫血清は、どのような免疫反応性も示さなかった。切片は、ＴＲＰ８と、以下の抗体、抗ＰＬＣβ２、抗α−ガストデューシン、または抗Ｇγ１３の１種とによって二重免疫染色した。切片は連続的に、各ステップの間に断続洗浄をして、ＴＲＰ８抗血清、抗ウサギＩｇ−Ｃｙ３コンジュゲート、通常の抗ウサギＩｇ、抗ＰＬＣβ２（あるいは抗α−ガストデューシン、または抗Ｇγ１３）抗体、および最後に抗ウサギＩｇ−ＦＩＴＣコンジュゲートでインキュベートした。抗ＰＬＣβ２（あるいは抗α−ガストデューシン、または抗Ｇγ１３）抗体を除く上記のすべての抗体を用いてインキュベートしたコントロール切片は、グリーンチャネルで蛍光を示さなかった。
【００７９】
６．１．５．遺伝子発現プロファイルの作成
単一味覚受容細胞ＲＴ−ＰＣＲ生成物（５μｌ）を、１．６％アガロースゲル上でサイズによって分別し、ナイロン膜上に移行した。単離細胞の発現パターンは、マウスＴＲＰ８、α−ガストデューシン、Ｇβ３、Ｇγ１３、ＰＬＣβ２、およびＧ３ＰＤＨに関して３’末端ｃＤＮＡプローブを用いて、サザンハイブリッド形成によって求めた。ブロットは、５時間、−８０℃で暴露した。単一有郭乳頭、および類似したサイズの非味覚上皮片由来のトータルＲＮＡも単離し、逆転写、増幅して、個々の細胞に関して分析した。
【００８０】
６．１．６．異種発現
卵母細胞に、５０ｎｇのＴＲＰ８ｃＲＮＡを注入した。注入から４８時間後、卵母細胞をタプシガーギン（２μＭ）、およびＸ−Ｒｈｏｄ−１−ＡＭ（Ｃａ＋＋検出色素）中、室温で３時間インキュベートした。
【００８１】
６．２．結果
６．２．１．味覚細胞における新規なＴＲＰチャネルの同定
単一細胞逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応を用いてクローンを単離したが、これはガストデューシンポジティブの細胞に発現し、ガストデューシンネガティブの細胞には存在しない。発現配列タグ（ＥＳＴ）ｄｂｅｓｔデータベースの検索によってマッチ部分は見出されず、これは発現したクローンのパターンが、味覚組織など、ＥＳＴデータベースに通常は見出されない組織に非常に限定的なものであることを示唆している。
【００８２】
このクローンをプローブとして用いて、マウス味覚組織ｃＤＮＡライブラリーを、完全長に関してスクリーニングした。最長の挿入部を含有するクローンの配列は、図１に示した配列を有する完全長のクローンを生成した。ｃＤＮＡクローンの推定アミノ酸配列を図２に示す。
【００８３】
単離されたｃＤＮＡは、一過性受容体電位（ＴＲＰ）チャネルとして知られるカルシウムチャネルタンパク質のファミリーに対して最大の類似性を示した。このタンパク質ファミリーに対する単離クローンの類似性は、ＴＲＰチャネルが同定されたことを示した。現在のところ、７種のＴＲＰチャネルの存在が知られているので、このクローンは８番目の構成体となり、慣例によりＴＲＰ８と称する。マウスＴＲＰ８（ＴＲＰ８）は、ＴＲＰ７と４０％のアミノ酸レベルが一致しており、ＴＲＰ７ともっとも密接に関連している。細胞膜に挿入されたＴＲＰ８チャネルの予測トポグラフィを図６Ａ〜Ｃに示す。
【００８４】
マウスクローンと、ＢＡＣクローンに含有されるヒト染色体１１ｐ１５．５の領域（遺伝子バンク＃ＡＣ００３６９３）との相同性に基づいて、ヒトＴＲＰ８オーソログが同定された。ヒトＴＲＰ８遺伝子のヌクレオチド配列、ならびに推定アミノ酸配列を、それぞれ図３Ａ〜Ｂ、および図４に記載する。マウスとヒトのＴＲＰ８タンパク質の比較を図５に示す。ヒト染色体１１ｐ１５．５領域は、マウス染色体７の末端領域とシンテニーを示す。いずれの場合も、ＴＲＰ８およびｈＴＲＰ８は、Ｋｖｌｑｔ１およびＴＳＳＣ４の遺伝子の間に位置を決定する。
【００８５】
６．２．２．ＴＲＰ８は味覚組織に選択的に発現する
ＴＲＰ８はα−ガストデューシンポジティブ（＋）ＴＲＣ対α−ガストデューシン（−）ＴＲＣのディフェレンシャルスクリーニングにおいて同定されたが、他の味覚細胞および／または組織に、より広範囲にＴＲＰ８が発現する可能性も考えられた。ＴＲＰ８ｍＲＮＡの組織分布を求めるために、複数のマウス組織を用いてノーザンブロットを行った。ＴＲＰ８の３’−ＵＴＲプローブは、味覚組織の４．５ｋｂトランスクリプトに主としてハイブリッド形成し、コントロールの非味覚組織に検出可能な発現はなかった。胃、および小腸において中程度の発現が検出され、子宮、および精巣に弱い発現が認められた（図７Ａ）。これは、Ｅｎｋｌａａｒ等（２０００、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ６７：１７９〜１８７）の結果と対照的である。ＴＲＰ８’コード領域の３’部分を増幅するように設計されたＲＴ−ＰＣＲ生成プローブを用いて、Ｅｎｋｌａａｒ等は、肝臓においてもっとも高い発現を検出し、他の周辺組織（たとえば、心臓、脳、腎臓、および精巣）において低いレベルの発現を検出した。Ｅｎｋｌａａｒ等のＲＴ−ＰＣＲプローブは、他のＴＲＰ８ｍＲＮＡ、または本発明の３’−ＵＴＲプローブに存在するものとは異なる３’末端を有するスプライシングされたｍＲＮＡのクロスハイブリッド形成による検出の可能性がある。ＴＲＰ８の発現の独立した測定として、本出願人等は、抗ＴＲＰ８抗体を用いてウエスタンブロットを行った（図７Ｂ）。予測された分子量（〜１３０ｋＤａ）のＴＲＰ８タンパク質が、胃、および小腸で検出された。予測分子量より大きい種が、肝臓、および腎臓で同定され、ＴＲＰ８関連タンパク質、またはスプライシングされたメッセージ由来のＴＲＰ８生成物を表す可能性がある。
【００８６】
６．２．３．ＴＲＰ８は特に味覚受容細胞のサブセットに発現する
マウスＴＲＣにおけるＴＲＰ８発現の細胞パターンを求めるために、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成を用いた。有郭乳頭および葉状乳頭のＴＲＣにおいてＴＲＰ８ｍＲＮＡが認められたが、周囲の非味覚上皮では認められなかった（図８）。ＴＲＰ８＋ＴＲＣは味蕾の大部分に存在したが、すべてのＴＲＣがポジティブというわけではなく、これはＴＲＣサブセットへの限定された発現を示唆している。ＴＲＰ８発現の一般的なパターンは、α−ガストデューシンのパターンに類似していたが、α−ガストデューシンのシグナルのほうがいくぶん強力であった（図８Ｄ）。センスプローブ用いたコントロールは、ＴＲＰ８プローブ（図８Ｂ）またはα−ガストデューシンプローブ（図８Ｅ）を用いた場合の、味覚組織への最少の非特異的ハイブリッド形成を示した。
【００８７】
ＴＲＰ８がＴＲＣにおいて、その活性化に関わる可能性のあるシグナル変換因子と共発現するかどうかを判定するために、本出願人等は、組織部分を含有するＴＲＣの一重および二重免疫組織化学法を行った。ＴＲＰ８タンパク質は、絶対的に、Ｇγ１３（図９ＡＢＣ）およびＰＬＣβ２（図９ＧＨＩ）と共発現し、これらの３種の分子が共通のシグナル変換経路の一部である可能性を示唆した。ＴＲＰ８は、絶対的にではないが、主として、α−ガストデューシン（図９ＤＥＦ）と共発現した。ＴＲＰ８＋ＴＲＣのサブセットは、α−ガストデューシンに関してネガティブであったが、α−ｇｕｓ＋ＴＲＣはすべて、ＴＲＰ８に関してポジティブであった。α−ｇｕｓ＋ＴＲＣは、Ｇγ１３、Ｇβ１、ＰＬＣβ２、およびＩＰ３Ｒ３に関してポジティブなＴＲＣサブセットを構成するという本出願人等の所見に、このパターンは一致する（Ｈｕａｎｇ等、１９９９）。異なる分子間の細胞レベルの分布におけるわずかな相違は、各タンパク質の示す異なるトポロジーによって説明できる。ＴＲＰ８は内在性膜タンパク質であり、一方、α−ガストデューシンおよびＰＬＣβ２は膜結合タンパク質である。ヒト茸状味蕾におけるヒトＴＲＰ８（ｈＴＲＰ８）の発現も確認された。
【００８８】
ＴＲＰ８のＴＲＣにおける上述のシグナル変換因子、ならびにＧβ１およびＧβ３との共発現を個別にモニターするために、単一細胞発現プロファイルの作成を行った（Ｈｕａｎｇ等、１９９９、Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ２：１０５５〜６２）。α−ガストデューシン、Ｇβ１、Ｇβ３、Ｇγ１３、ＰＬＣβ２、およびＴＲＰ８の発現は、味覚組織に限定されており（図１０、左図）、一連の２４個のＴＲＣにおいて、ＴＲＰ８は絶対的にα−ガストデューシン、Ｇβ３、Ｇγ１３、ＰＬＣβ２と共発現し（図１０、右図）、さらにＴＲＰ８の発現は大部分がＧβ１の発現と重複している（ＴＲＰ８＋細胞の１９個のうち１５個はさらにＧβ１＋であった）ことが、この方法において求められた。これらの様々なシグナル変換分子のＴＲＰ８との同時発現は、ヘテロ三量体ガストデューシン（すなわち、α−ガストデューシン／β３／γ１３）または他のＧα／β１、β３／γ１３含有ヘテロ三量体に結合したＧＰＣＲがβγを放出して、ＰＬＣβ２を活性化する可能性のあるシグナル経路によって生成されたＩＰ３（ＩＰ３受容体の活性化）またはＤＡＧ（ＴＲＰ８の直接活性化）によるＴＲＰ８の活性化に関して物理的機会を提供することができる。ＴＲＣにおいてＩＰ３受容体サブタイプＩＩＩ（ＩＰ３Ｒ３）が最近同定されたこと、ならびにＩＰ３Ｒ３は主としてα−ガストデューシン、Ｇγ１３、およびＰＬＣβ２と共局在することの実証も、これと矛盾しない。
【００８９】
６．２．４．他のＴＲＰファミリー構成体は味覚組織において検出可能な発現をしない
天然のＴＲＰチャネルは、ホモおよびヘテロ多量体を形成すると考えられている。ＴＲＣにおけるＴＲＰ８の潜在的なパートナーを同定するために、ＰＣＲを用いて、マウスＴＲＰチャネル１〜６（ＴＲＰ１〜６）が味覚組織で発現されるかどうかを判定した（脳組織が正の対照を提供した）。脳ｃＤＮＡを鋳型として用いたとき（図１１、下図）、ＴＲＰ１〜６に特異的なプライマー対を用いるＰＣＲによる増幅によって、６種すべてのＴＲＰファミリー構成体に関して正しいサイズの生成物が同定され、これらの生成物のＤＮＡ配列決定によって６種すべてのＴＲＰファミリー構成体の増幅が確認された。ＴＲＰ８は、脳ｃＤＮＡが鋳型であるとき増幅されなかったが（図１１、下図）、味覚ｃＤＮＡが鋳型を提供したときには増幅された（図１１、上図）（ＴＲＰ８の増幅はＤＮＡ配列決定によって確認された）。他の６種のＴＲＰファミリー構成体は、味覚組織ｃＤＮＡを鋳型して用いたときいずれも増幅されず（図１１、上図）、ＴＲＣにおいて発現するにしても、高度には発現しないことを示唆した。ＴＲＰ７に特異的なプライマーを用いる別の実験において、ＴＲＰ７は脳ｃＤＮＡにおいてＰＣＲによって検出されたが、味覚ｃＤＮＡでは検出されなかった。これらの７種の構成体以外の新規なＴＲＰチャネルがＴＲＣで発現する可能性があるが、現在のところ、ＴＲＰ８が、味覚組織において高度に発現し、上に示したようにＴＲＣにおいて高度に発現する唯一の既知のＴＲＰであると思われる。
【００９０】
６．２．５．発現ＴＲＰ８は貯蔵体作動性チャネルとして作用する
ＴＲＰ８がカルシウムチャネルとして機能できるかどうかを判定するために、ＴＲＰ８をアフリカツメガエルの卵母細胞に発現した。この卵母細胞は、ＴＲＰファミリーに属する貯蔵体作動性Ｃａ＋＋チャネルの活性化によるＣａ＋＋流入をモニターするために用いることのできる内因性カルシウム活性化クロライド電流（ＩＣｌＣａ）を有する。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写によって得られたＴＲＰ８ＲＮＡを、アフリカツメガエルの卵母細胞に注入し、２日後に二極電圧固定記録法を行った。内部Ｃａ＋＋貯蔵体の枯渇を誘発するために、記録前に、２μＭのタプシガーギン（ＴＰＮ）、筋小胞体（ｓａｒｃｏ（ｅｎｄｏ）ｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ）Ｃａ＋＋−ＡＴＰアーゼ（ＳＥＲＣＡ）の不可逆性阻害剤中で、卵母細胞を２時間インキュベートした。
【００９１】
ＴＲＰ８ＲＮＡを注入し、ＴＰＮで処理した卵母細胞の代表的な記録トレースは、外部浴にＣａ＋＋を添加することによって誘発された強く明瞭な内向き電流を実証した（図１２Ａ）。これらのトレースは、水を注入した対照卵母細胞のトレース（図１２Ｂ）と劇的に異なり、これによって、内部Ｃａ＋＋貯蔵体の充填状態にその活性化が依存し（図１２のＡとＢを比較のこと）、その機能が外部Ｃａ＋＋の入手可能性に依存する機能性Ｃａ＋＋チャネルをＴＲＰ８がコードすることが示された。対照卵母細胞は、ＴＰＮ処理によって活性化することのできる、内因性ＴＲＰチャネル（ＸＴｒｐ）を発現する（Ｂｏｂａｎｏｖｉｃ等、１９９９、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．３４０：５９３〜５３９）（図１２Ｂ）。細胞外媒質にＣａ＋＋が存在する条件下で発生した総内向き電流の分析は（図１２Ｄ）、ＴＲＰ８発現の効果を明らかに実証した。ＴＲＰ８タンパク質が実際に卵母細胞に発現したことを確認するために、本出願人等は抗ＴＲＰ８抗体を用いて、ＴＲＰ８ＲＮＡ注入卵母細胞由来の膜タンパク質のウエスタンブロットを行い、予期されたサイズの１３０ｋＤａのタンパク質が検出された。
【００９２】
本発明は、本明細書に記載した特定の実施形態によって範囲が限定されるものではない。さらに、本明細書に記載されたものに加えて様々な本発明の変更が、上述の説明および添付の図面から当分野の技術者に明らかとなるであろう。そのような変更は、添付の請求の範囲内である。本明細書には様々な参照文献が挙げられており、その開示の全体を参照により本明細書の一部とする。
【図面の簡単な説明】
【図１】マウスＴＲＰ８コードマウスＴＲＰ８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す図である。
【図２】マウスＴＲＰ８一過性受容体電位チャネルの推定アミノ酸配列を示す図である。
【図３Ａ〜Ｂ】ヒトＴＲＰ８コードヒトＴＲＰ８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す図である。
【図４】ヒトＴＲＰ８タンパク質一過性受容体電位チャネルの推定アミノ酸配列を示す図である。
【図５】マウスＴＲＰ８（上段）対ヒトＴＲＰ８（下段）のアミノ酸配列を示す図である。段の各対は、予測されるマウス／ヒトのエクソンに相当する。
【図６Ａ〜Ｃ】膜におけるＴＲＰ８タンパク質一過性受容体電位チャネルの予測トポグラフィを示す図である。
【図７】マウス組織におけるＴＲＰ８ｍＲＮＡおよびタンパク質の分布を示す図である。（ａ）ＴＲＰ８ｃＤＮＡプローブを用いてハイブリッド形成したノーザンブロットのオートラジオグラフ。各レーンは、以下のマウス組織から単離したトータルＲＮＡ２５μｇを含有していた。有郭乳頭および葉状乳頭富化味覚組織（味覚組織）、味蕾を欠いた舌組織（非味覚）、脳、網膜、嗅上皮（Ｏｌｆ．Ｅｐｉ）、胃、小腸（Ｓｍａｌｌ Ｉｎｔ．）、胸腺、心臓、肺、脾臓、骨格筋（Ｓｋｅｌｅ．Ｍｕｓ．）、肝臓、腎臓、子宮、および精巣である。４．５ｋｂのトランスクリプトが味覚組織、胃、および小腸において検出され、子宮、および精巣では、はるかに少量で検出された。ｍＲＮＡ量を制御するために、同一のブロットをストリップし、β−アクチンｃＤＮＡプローブで再プローブした（下図）。ＲＮＡマーカのキロベース（ｋｂ）の大きさを右側に示す。（ｂ）抗ＴＲＰ８抗体を用いてプローブしたウエスタンブロットのオートジオグラフ。記載のマウス組織から調製したタンパク質抽出物（５０μｇ）を電気泳動し、ニトロセルロース膜に移し、次いでブロットをＴＲＰ８のカルボキシル末端に対する抗体でインキュベートした。ＴＲＰ８の予測分子量である〜１３０ｋＤの免疫反応性タンパク質が胃、および小腸で検出され、より大きい分子量種が肝臓、および腎臓で確認された。分子量マーカはキロダルトンで示す。
【図８】味覚受容細胞に発現するＴＲＰ８ｍＲＮＡを示す図である。有郭乳頭および葉状乳頭を含有するマウス舌上皮部を、ＴＲＰ８（ａ、ｃ）、およびα−ガストデューシン（ｄ）に関して３３Ｐ標識アンチセンスＲＮＡプローブを用いてハイブリッド形成し、オートラジオグラフィにかけた。アンチセンスＴＲＰ８プローブにハイブリッド形成した有郭乳頭（ａ）および葉状乳頭（ｂ）の顕微鏡写真は、ＴＲＣのサブセットにおけるＴＲＰ８の発現を実証する。（ｄ）は葉状乳頭に対するα−ガストデューシンアンチセンスプローブのハイブリッド形成を示す。センスプローブを用いたハイブリッド形成対照は、ＴＲＰ８プローブ（ｂ）、またはα−ガストデューシンプローブ（ｅ）の非特異的結合がないことを示した。
【図９】ＴＲＰ８、および他のシグナル変換因子のＴＲＣにおける共局在を示す図である。マウス味覚乳頭部の同一縦断面におけるＧγ１３（ａ）およびＴＲＰ８（ｂ）の免疫蛍光検査であり、（ｃ）はａおよびｂを重ねたものである。同一部におけるＴＲＰ８（ｄ）およびα−ガストデューシン（ｅ）の免疫蛍光検査であり、（ｆ）はｄおよびｅを重ねたものである。同一部におけるＰＬＣβ２（ｇ）およびＴＲＰ８（ｈ）の免疫蛍光検査であり、（ｉ）はｇおよびｈを重ねたものである。
【図１０】味覚組織および味覚細胞におけるＴＲＰ８、α−ガストデューシン、Ｇβ１、Ｇβ３、Ｇγ１３、およびＰＬＣβ２の発現パターンのプロファイルの作成を示す図である。左図は、マウス味覚組織（Ｔ）、および対照非味覚舌組織（Ｎ）由来のＲＴ−ＰＣＲ生成物に対するサザンハイブリッド形成である。ＴＲＰ８、α−ガストデューシン（Ｇｕｓｔ）、Ｇβ１、Ｇβ３、Ｇγ１３、ＰＬＣβ２、およびグリセルアルデヒド三リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）の３’位プローブを、ブロットをプローブするために用いた。ＴＲＰ８、α−ガストデューシン、Ｇβ１、Ｇβ３、Ｇγ１３、およびＰＬＣβ２はすべて味覚組織に発現したが、非味覚組織には発現しなかったことに留意されたい。右図は、ガストデューシンプロモーターの緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するトランスジェニックマウス由来の、個々に増幅された２４の味覚受容細胞のＲＴ−ＰＣＲ生成物に対するサザンハイブリッド形成である。１９個の細胞がＧＦＰポジティブ（＋）であり、５個の細胞がＧＦＰネガティブ（−）であった。ＴＲＰ８、α−ガストデューシン、Ｇβ３、Ｇγ１３、およびＰＬＣβ２の発現は、完全に一致していた。１９のＧＦＰ８ポジティブ細胞のうち１５は、Ｇβ１に対してもポジティブであった。Ｇ３ＰＤＨは正の対照としての役割を果たし、生成物の増幅が成功したことを実証した。
【図１１】味覚組織において、ＰＣＲによってＴＲＰ８が検出され、ｍＴｒｐ１〜７が検出されないことを示す図である。ＴＲＰ８およびｍＴｒｐ１〜７のＰＣＲ増幅は、各Ｔｒｐファミリー構成体に特異的な非同義性プライマーを用いて行った。味覚ｃＤＮＡ（上図）および脳ｃＤＮＡ（下図）は増幅の鋳型を提供した。増幅された材料を、１．２％アガロースゲルに溶解した。予測される分子量のバンドを配列して、増幅されたＴｒｐチャネルを同定した。正（Ｇ３ＰＤＨプライマー）および負（プライマーなし）の対照を示す（右図）。
【図１２】ＴＲＰ８の異種発現を示す図である。アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞に、ＴＲＰ８ｃＲＮＡ（ａ）５０ｎｇ、または水（ｂ）５０ｎｌを注入した。注入から２日後、卵母細胞をタプシガーギン（ｔｈａｐｓｉｇａｒｇｉｎ）（２μＭ）で処理し、次いで示したとおり（矢印）Ｃａ＋＋（１０ｍＭ）またはＥＧＴＡを添加した。このトレースは負の膜電位において誘発された電流を表す（コマンド電位−８０ｍＶ）。（ｃ）ＴＲＰ８ｃＲＮＡまたは水を注入した卵母細胞のＩ−Ｖ曲線は、内因性カルシウム活性化塩素イオンコンダクタンス（ＩＣｌＣａ）のＣａ＋＋活性化に一致する逆転電位を実証する。（ｄ）ＴＲＰ８ｃＲＮＡまたは水を注入した卵母細胞に関して、浴媒質に存在する外部Ｃａ＋＋に誘発された最大内向き電流である（対照）。
【図１３】Ｃａ＋＋チャネルとしてのＴＲＰ８機能を示す図である。アフリカツメガエル卵母細胞に、ＴＲＰ８ｃＲＮＡ（右図）５０ｎｇ、または水（左図）５０ｎｌを注入した。注入から２日後、卵母細胞をタプシガーギン（２μＭ）で処理し、次いでＣａ＋＋（１０ｍＭ）を添加した。
【図１４】ＴＲＰ８を用いる、ＴＲＣにおける電位シグナル変換経路を示す図である。デナトニウムなどの苦味化合物に対する応答は、Ｔ２Ｒ／ＴＢＲファミリーの１つまたは複数のガストデューシン結合受容体への結合によって開始される。ガストデューシンへテロ三量体の活性化によって、ＰＬＣβ２を誘発するそのβγ部分（たとえばＧβ３／Ｇγ１３）が放出され、ＩＰ３およびＤＡＧが生成される。ＩＰ３はたとえばＩＰ３Ｒ３などの受容体に結合して、細胞内貯蔵体からのＣａ＋＋の放出をもたらし、ＴＲＰ８チャネルの活性化を起こし、最終的にはＴＲＰ８チャネルを経るＣａ＋＋の流入に至る。ＤＡＧはＴＲＰ８に直接作用し、Ｃａ＋＋の流入に至る可能性がある。人口甘味料は類似の変換経路に依存する可能性があるが、甘味応答受容体、たとえばＴ１Ｒ３がガストデューシンまたは他のＧタンパク質と結合することにより、ＩＰ３およびＤＡＧの生成、およびＴＲＰ８の刺激に至るシグナルを開始する。
（１．緒言）
本発明は、味覚受容細胞に発現し、苦味および甘味の知覚に関連する、本明細書でＴＲＰ８と称する一過性受容体電位チャネルの発見、同定、および特性決定に関する。本発明は、ＴＲＰ８ヌクレオチド、宿主細胞発現系、ＴＲＰ８タンパク質、融合タンパク質、ポリペプチドおよびペプチド、ＴＲＰ８タンパク質に対する抗体、ＴＲＰ８トランスジーンを発現するトランスジェニック動物、ならびにＴＲＰ８を発現しない組換え「ノックアウト」動物を包含する。本発明はさらに、ＴＲＰ８媒介味覚応答のモジュレーターを同定する方法、および苦味または甘味の知覚を阻害または促進するためのそのようなモジュレーターの使用に関する。このＴＲＰ８活性のモジュレーターは、食品、飲料、および医薬品の風味強化剤として用いることができる。
【０００２】
（２．発明の背景）
哺乳動物は一般に５つの基本的な味覚のカテゴリー、塩味、酸味、甘味、苦味、および旨味（グルタミン酸ナトリウム）を有すると考えられている（概説として、Ｌｉｎｄｅｍａｎｎ、１９９６、Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ、７６：７１９〜７６６、ＨｅｒｎｅｓｓおよびＧｉｌｂｅｒｔｓｏｎ、１９９９、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、６１：８７３〜９００を参照のこと）。味覚シグナルは、味蕾に組織される特殊化された味覚受容細胞（ＴＲＣ）によって感知される。それぞれの味蕾は、直径２０から４０ミクロンのクラスタに集合した約５０から１００個の細胞を含む。神経線維が味蕾の基底から入り、いくつかの味覚受容細胞上にシナプスを形成している。典型的に、単一のＴＲＣはいくつかの知覚神経線維に接しており、各知覚神経線維は同一味蕾内のいくつかのＴＲＣに神経を分布している（前述のＬｉｎｄｅｍａｎｎ）。
【０００３】
すべてではないとしても、たいていの脊椎動物種のＴＲＣは、ニューロンのチャネルと類似の特性を備えた電位型ナトリウム、カリウム、およびカルシウムイオンチャネルを有する（Ｋｉｎｎａｍｏｎ，Ｓ．Ｃ．およびＭａｒｇｏｌｓｋｅｅ，Ｒ．Ｆ．、１９９６、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．６：５０６〜５１３）。異なる類型の一次味覚は異なる類型の変換機構を用いると思われ、ある類型の味覚は、種のなかでの多様な栄養必須物を反映しうる複数の機構を用いる可能性がある（前述のＫｉｎｎａｍｏｎおよびＭａｒｇｏｌｓｋｅｅ）。
【０００４】
苦味および甘味の味覚変換には、ｃＡＭＰおよびＩＰ３が関係していると考えられている（前述のＫｉｎｎａｍｏｎおよびＭａｒｇｏｌｓｋｅｅ）。苦味物質デナトニウムは、ラットのＴＲＣからカルシウムイオンを放出し、齧歯動物味覚組織においてＩＰ３レベルの急激な上昇をもたらす（同上の論文に引用されたＢｅｒｎｈａｒｄｔ，ＳＪ．等、１９９６、Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（Ｌｏｎｄｏｎ）４９０：３２５〜３３６、およびＡｋａｂａｓ，Ｍ．Ｈ．等、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：１０４７〜１０５０）。デナトニウムは細胞膜を通過することができないので、Ｇタンパク質結合受容体を活性化し、それによってαおよび／またはβγＧタンパク質サブユニットがホスホリパーゼＣを活性化して、ＩＰ３の産生、およびカルシウムイオンの放出をもたらす可能性があると考えられてきた（前述のＫｉｎｎａｍｏｎおよびＭａｒｇｏｌｓｋｅｅ）。
【０００５】
近年、網膜Ｇタンパク質のトランスデューシンと相同性のある「ガストデューシン」と呼ばれる味覚特異Ｇタンパク質がクローン化され、特性決定された（同上の論文に引用されたＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ，Ｓ．等、１９９２、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３５７：５６３〜５６９）。ガストデューシンは、苦味および甘味両方の変換において直接的な役割を果たしていると考えられている。たとえば、ガストデューシンおよびサブユニット（α−ガストデューシン）消失（ノックアウト）マウスは、苦味化合物に対する嫌悪性が低減した。意外なことに、このマウスはまた甘味化合物に対して嗜好性を示し、ガストデューシンが甘味変換に関係していることを示した。
【０００６】
最近の生化学の実験は、味覚受容体製剤がデナトニウムおよび他の苦味化合物に応答してトランスデューシンおよびガストデューシンを活性化することを実証した（Ｍｉｎｇ等、１９９８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：８９３３〜８９３８）。
【０００７】
味覚感覚の基礎をなす分子機構を完全に理解するために、味覚シグナル変換経路における各分子成分を同定することが重要である。本発明は、味覚変換に関係すると考えられており、苦味知覚に関わる細胞内カルシウムイオンの変化に関係する可能性のあるイオンチャネル、ＴＲＰ８（一過性受容体電位チャネル８）のクローニングに関する。
【０００８】
（３．発明の概要）
本発明は、味覚シグナル変換経路に関係する、以下でＴＲＰ８と称する一過性受容体電位（ＴＲＰ）チャネルの発見、同定、および特性決定に関する。ＴＲＰ８は、一過性受容体電位チャネルとして知られるカルシウムチャネルタンパク質のファミリーと構造上、高い類似性を有するチャネルタンパク質である。ノーザンブロット分析によって実証されたように、ＴＲＰ８トランスクリプトの発現は厳しく調整されており、味覚組織においてもっとも高いレベルの遺伝子発現が見出され、胃および小腸においては中程度の発現、子宮および精巣においては非常に低いレベルの発現が見出されている。ｉｎ ｓｉｔｕのハイブリッド形成は、有郭乳頭および葉状乳頭におけるＴＲＰ８の発現を示したが、周辺の非味覚上皮では発現を示さなかった。さらに、ＴＲＰ８発現の一般的なパターンは、α−ガストデューシンのパターンに類似するものであったが、α−ガストデューシンのシグナルは多少強度が高かった。
【０００９】
本発明は、ＴＲＰ８ヌクレオチド、そのようなヌクレオチドを発現する宿主、およびそのようなヌクレオチドの発現産物を包含する。本発明は、ＴＲＰ８タンパク質、ＴＲＰ８融合タンパク質、ＴＲＰ８チャネルタンパク質に対する抗体、およびＴＲＰ８トランスジーンを発現するトランスジェニック動物、またはＴＲＰ８タンパク質を発現しない組換え「ノックアウト」動物を包含する。
【００１０】
さらに本発明はまた、ＴＲＰ８活性および／または発現をモジュレートする、すなわちアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する化合物を同定の標的として、ＴＲＰ８遺伝子および／またはＴＲＰ８遺伝子産物を用いるスクリーニング方法に関する。苦味物質に類似の味覚応答を刺激する化合物は、所望の嫌悪応答を引き起こす、たとえば小児または動物にそれらの化合物を含有する組成物の消費を思いとどまらせる添加剤として用いることができる。ＴＲＰ８チャネルの活性を阻害する化合物は、苦味の知覚を阻止するために用いることができる。ＴＲＰ８阻害剤は、苦味の知覚を減少または除去することによって、食品、飲料、または医薬品における風味強化剤として用いることができる。
【００１１】
本発明は部分的に、味覚受容細胞において高レベルに発現するチャネルタンパク質の発見に基づいている。味覚変換において、苦味化合物は、ガストデューシンなどのＧタンパク質を経て作用し、次いでセカンドメッセンジャー系を調節すると考えられている。味覚受容細胞の１つのサブセットに対するα−ガストデューシン、γ−ガストデューシン、ホスホリパーゼＣβ２（ＰＬＣβ２）、およびＴＲＰ８の共局在は、それらが同一の変換経路で機能する可能性のあることを示している。ＴＲＰ８はイノシトール三リン酸（ＩＰ３）／ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）の産生を誘発する味覚物質に応答し、細胞外カルシウムで味覚細胞を充填し、カルシウム依存下流メッセンジャーを活性化することによって伝達物質のシナプスへの放出、および求心性味覚神経の活性化をもたらすと考えられている。
【００１２】
３．１．定義
本明細書では、イタリック化されていないＴＲＰ８によって示されるコードタンパク質生成物とは対照的に、ＴＲＰ８のイタリック体はＴＲＰ８遺伝子を示すものとする。たとえば、「ＴＲＰ８」はＴＲＰ８遺伝子を示し、「ＴＲＰ８」はＴＲＰ８遺伝子のタンパク質産物を示す。
【００１３】
（５．発明の詳細な説明）
ＴＲＰ８は、受容体媒介味覚シグナル変換に関係し、一過性受容体電位チャネルとして知られるカルシウムチャネルタンパク質のファミリーに属するチャネルタンパク質である（Ｍｏｎｔｅｌｌ Ｃ．、１９９７、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５２：７５５〜７６３）。本発明は、ＴＲＰ８ヌクレオチド、ＴＲＰ８タンパク質およびペプチド、ならびにＴＲＰ８タンパク質に対する抗体を包含する。本発明はまた、ＴＲＰ８チャネルを発現するために、または動物の内因性ＴＲＰ８の発現を阻害もしくは「ノックアウト」するために遺伝子的に操作された宿主細胞、または動物に関する。
【００１４】
本発明はさらに、ＴＲＰ８活性のモジュレーター、たとえばアゴニストおよびアンタゴニストなどを同定するために設計されたスクリーニングアッセイを提供する。ＴＲＰ８を自然に発現する宿主細胞、または遺伝子操作された宿主細胞および／または動物の使用は、そのような系がＴＲＰ８タンパク質によって変換されたシグナルに影響を及ぼす化合物を同定することを可能にするという利点を提供する。
【００１５】
本発明の様々な態様を、以下の項目に詳しく記載する。
【００１６】
５．１．ＴＲＰ８遺伝子
マウスＴＲＰ８のｃＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列を、図１、および図２にそれぞれ示す。ヒトＴＲＰ８のｃＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列を、図３、および図４にそれぞれ示す。
【００１７】
本発明のＴＲＰ８ヌクレオチド配列には、（ａ）図１または３に示したＤＮＡ配列、あるいは米国菌株保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に寄託された（ＡＴＣＣ受入れ番号 ）大腸菌株ＸＬ１０Ｇｏｌｄ内のｃＤＮＡクローンｐＭＲ２４に含有されるＤＮＡ配列、（ｂ）図２または４に示したアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、あるいはＡＴＣＣに寄託されたｃＤＮＡクローンｐＭＲ２４によってコードされたＴＲＰ８アミノ酸配列、（ｃ）（ｉ）厳格な条件下で（ａ）または（ｂ）に示したヌクレオチド配列にハイブリッド形成する、たとえば０．５ＭのＮａＨＰＯ４、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭのＥＤＴＡ中、６５℃でフィルタ結合ＤＮＡにハイブリッド形成し、０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中、６８℃で洗浄する（Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ｍ．等編、１９８９、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１巻、Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．、およびＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ｐ２．１０．３）、および（ｉｉ）機能的に同等な遺伝子生成物をコードする任意のヌクレオチド配列、ならびに（ｄ）図１または３に示したアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列、またはＡＴＣＣに寄託されたｃＤＮＡクローンｐＭＲ２４に含有される配列に、厳格さの低い条件下、たとえば０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中、４２℃で洗浄するといった適度に厳格な条件下などで（前述のＡｕｓｕｂｅｌ等、１９８９）ハイブリッド形成し、さらに機能的に同等なＴＲＰ８遺伝子生成物をコードする任意のヌクレオチド配列が含まれる。ＴＲＰ８タンパク質の機能的同等物には、マウスおよびヒト以外の種に存在する天然ＴＲＰ８が含まれる。本発明はさらに、配列（ａ）から（ｄ）の配列の同義性変異型を含む。本発明はさらに、たとえばＴＲＰ８遺伝子調節に有用な（ＴＲＰ８遺伝子核酸配列の増幅反応におけるアンチセンスプライマーのために、および／またはプライマーとして）、ＴＲＰ８アンチセンス分子をコードすることのできる、あるいはＴＲＰ８アンチセンス分子として作用することのできる核酸分子を含む。
【００１８】
上述のＴＲＰ８ヌクレオチド配列に加えて、他の種に存在するＴＲＰ８遺伝子の相同体も、当分野でよく知られる分子生物学の技法によって、過度の実験を行うことなく同定し、容易に単離することができる。たとえば、対象の生体から得られたｃＤＮＡライブラリー、またはゲノムＤＮＡライブラリーは、ハイブリッド形成または増幅プローブとして本明細書に記載のヌクレオチドを用いてハイブリッド形成することによってスクリーニングできる。
【００１９】
本発明はさらに、突然変異ＴＲＰ８、ＴＲＰ８のペプチド断片、切断ＴＲＰ８、およびＴＲＰ８融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を包含する。これらには、ＴＲＰ８のＴＭ（膜貫通）および／またはＣＤ（細胞質）領域、またはそれらの領域の部分に対応するポリペプチドまたはペプチドをコードするヌクレオチド配列、領域の１つまたは２つを欠いた切断ＴＲＰ８、たとえばＣＤ領域のすべて、または一部分を欠いた機能ＴＲＰ８含むが、これに限定するものではない。これらの切断または突然変異ＴＲＰ８タンパク質のいくつかは、自然ＴＲＰ８タンパク質の優性−ネガティブ阻害剤として作用することができる。融合タンパク質コードヌクレオチドには、これに限定されるものではないが、完全長ＴＲＰ８、切断ＴＲＰ８、またはマーカとして用いることのできる、たとえば酵素、蛍光タンパク質、ルミネセンスタンパク質などの関連のないタンパク質またはペプチドに融合したＴＲＰ８のペプチド断片を含むことができる。
【００２０】
ＴＲＰ８ヌクレオチド配列は、当分野の技術者に知られる多様な方法を用いて単離することができる。たとえば、ＴＲＰ８を発現することが知られる組織由来のＲＮＡを用いて構築されたｃＤＮＡライブラリーは、標識ＴＲＰ８プローブを用いてスクリーニングすることができる。あるいは、ゲノムライブラリーは、ＴＲＰ８チャネルタンパク質をコードする核酸分子を誘導するためにスクリーニングすることができる。さらに、ＴＲＰ８核酸配列は、本明細書に開示のＴＲＰ８ヌクレオチド配列に基づいて設計された２つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲを行うことによって誘導することができる。この反応の鋳型は、ＴＲＰ８を発現することが知られている細胞系、または組織から調製されたｍＲＮＡの逆転写によって得られるｃＤＮＡであってよい。
【００２１】
本発明はさらに、（ａ）前述の任意のＴＲＰ８配列および／またはそれらの補体（すなわち、アンチセンス）を含有するＤＮＡベクター、（ｂ）配列をコードするＴＲＰ８の発現を対象とする調節因子に効力的に関連する前述の任意のＴＲＰ８配列を含有するＤＮＡ発現ベクター、（ｃ）宿主細胞の配列をコードするＴＲＰ８の発現を対象とする調節因子に効力的に関連する任意の前述のＴＲＰ８配列を含有する遺伝子操作宿主細胞、および（ｄ）任意の前述のＴＲＰ８配列を含有するトランスジェニックマウスまたは他の生物を包含する。本明細書では、調節因子にはこれに限定されるものではないが、誘導または非誘導プロモーター、エンハンサ、オペレータ、および発現を駆動および調節する当分野の技術者に知られている他の因子が含まれる。
【００２２】
５．２．ＴＲＰ８タンパク質およびポリペプチド
ＴＲＰ８タンパク質、ポリペプチドおよびペプチド断片、ＴＲＰ８の突然変異、切断、または欠失形態および／またはＴＲＰ８融合タンパク質は、多様な使用目的のために調製することができ、これに限定されるものではないが、抗体の産生、ＴＲＰ８媒介の味覚知覚の調節に関わる他の細胞遺伝子生成物の同定、ならびに苦味遮断剤、食味改質剤など味覚知覚を調節するために用いることのできる化合物のスクリーニングが含まれる。
【００２３】
図２および４は、マウスおよびヒトＴＲＰ８タンパク質の推定アミノ酸配列をそれぞれ示す。本発明のＴＲＰ８アミノ酸配列には、図２または図４に示したアミノ酸配列、またはＡＴＣＣに寄託されたｃＤＮＡクローンｐＭＲ２４によってコードされたアミノ酸配列が含まれる。さらに、他の種のＴＲＰ８も本発明によって包含される。実際、５．１．項に記載のＴＲＰ８ヌクレオチド配列によってコードされた任意のＴＲＰ８タンパク質が本発明の範囲内である。
【００２４】
本発明はさらに、これに限定されるものではないが、苦味物質が細胞外カルシウム貯蔵体から前記タンパク質を発現する味覚受容細胞へのカルシウム流入を開始し、味覚受容細胞からシナプスに伝達物質を放出し、求心性神経を活性化する能力を含むいくつかの基準から判断される、５．１．項に記載のヌクレオチド配列によってコードされたＴＲＰ８に機能的に同等であるタンパク質を包含する。そのような機能的に同等なＴＲＰ８タンパク質には、これに限定されるものではないが、上の５．１．項に記載のＴＲＰ８ヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列内にアミノ酸残基の添加または置換を有するタンパク質が含まれるが、しかしながらこれはサイレント変化をもたらし、機能的に同等な遺伝子生成物を生成する。
【００２５】
ならびにＴＲＰ８の１つまたは複数の領域（たとえば、膜貫通（ＴＭ）または細胞領域（ＣＤ））に対応するペプチド、切断または欠失ＴＲＰ８（たとえば、ＴＭおよび／またはＣＤが欠けたＴＲＰ８）、完全長ＴＲＰ８、ＴＲＰ８ペプチド、または切断ＴＲＰ８が関連のないタンパク質に融合している融合タンパク質も本発明の範囲内であり、本明細書に開示したＴＲＰ８ヌクレオチドおよびＴＲＰ８アミノ酸配列に基づいて設計することができる。そのような融合タンパク質には、マーカ機能を提供する酵素、蛍光タンパク質、またはルミネセンスタンパク質の融合物が含まれる。
【００２６】
ＴＲＰ８ポリペプチドおよびペプチドは化学的に合成することができるが（たとえば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、１９８３、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．、Ｎ．Ｙ．を参照）、ＴＲＰ８由来の大きなポリペプチドおよび完全長ＴＲＰ８自体を、ＴＲＰ８遺伝子配列および／またはコード配列を含有する核酸を発現するための当分野でよく知られる技法を用いて組換えＤＮＡ技術によって有利に生成することができる。そのような方法は、５．１．項に記載のＴＲＰ８ヌクレオチド配列、ならびに適切な転写および翻訳対照シグナルを含有する発現ベクターを構築するために用いることができる。これらの方法には、たとえばｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技法、合成技法、およびｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子組換えが含まれる（たとえば、前述のＳａｍｂｒｏｏｋ等、１９８９、および前述のＡｕｓｕｂｅｌ等、１９８９に記載の技法を参照）。
【００２７】
本発明のＴＲＰ８ヌクレオチド配列を発現させるために、多様な宿主発現ベクター系を用いることができる。ＴＲＰ８ペプチドまたはポリペプチドが可溶性誘導体として発現し（たとえば、ＴＭおよび／またはＣＤに対応するペプチド）、分泌されない場合、そのペプチドまたはポリペプチドは宿主細胞から回収することができる。あるいは、ＴＲＰ８ペプチドまたはポリペプチドが分泌される場合、そのペプチドまたはポリペプチドは培地から回収することができる。しかしながら、この発現系はさらに、細胞膜に固定されたＴＲＰ８または機能的同等物を発現する操作宿主細胞を含む。そのような発現系からのＴＲＰ８の精製または濃縮は、適切な洗浄剤および脂質ミセルを用い、当分野の技術者によく知られている方法を用いて行うことができる。そのような操作宿主細胞自体を、ＴＲＰ８の構造的および機能的特性を保持するだけでなく、生物活性を評価する、すなわち薬剤スクリーニングアッセイにおいて評価することが重要であるような状態において用いることができる。
【００２８】
本発明の目的のために用いることのできる発現系には、これに限定されるものではないが、微生物、たとえばＴＲＰ８ヌクレオチド配列を含有する組換えバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで転換された細菌、ＴＲＰ８ヌクレオチド配列を含有する組換え酵母発現ベクターで転換された酵母、哺乳動物細胞のゲノムまたは哺乳動物ウイルス由来のプロモーターを含有する組換え発現構成体を持つ哺乳動物細胞系などが含まれる。
【００２９】
適切な発現系は、正しい修飾、プロセシング、ＴＲＰ８チャネルタンパク質の細胞内局在が確実に起こるように選択することができる。この目的のためには、ＴＲＰ８チャネルタンパク質を適切に修飾およびプロセシングできる能力を有する真核生物宿主細胞が好ましい。たとえばスクリーニング用の細胞系統を生じるために望まれるような、長期、高収率の組換えＴＲＰ８チャネルタンパク質を生成するために、安定な発現が好ましい。複製起点を含有する発現ベクターを用いるのではなく、宿主細胞は選択可能なマーカ遺伝子、すなわちいくつか名前を挙げるとｔｋ、ｈｇｐｒｔ、ｄｈｆｒ、ｎｅｏ、およびｈｙｇｒｏ遺伝子、ならびに適切な発現制御因子によって制御されたＤＮＡで転換することができる。異種ＤＮＡの導入に続いて、操作細胞は富化培地で１〜２日間成長させ、その後、選択培地に切り替えることができる。そのような操作細胞系統は、ＴＲＰ８遺伝子生成物の内因性活性を調節する化合物をスクリーニングおよび評価するのに特に有用である可能性がある。
【００３０】
５．３．トランスジェニック動物
ＴＲＰ８遺伝子生成物はトランスジェニック動物に発現することもできる。これに限定するものではないが、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ブタ、小型ブタ、ヤギ、ならびに非ヒト霊長類、たとえばヒヒ、サル、およびチンパンジーを含む任意の種の動物を、ＴＲＰ８トランスジェニック動物を産生するために用いることができる。
【００３１】
ＴＲＰ８トランスジーンを動物に導入して、トランスジェニック動物の初代系を生成するために、当分野で知られている任意の技法を用いることができる。そのような技法には、これに限定するものではないが、前核微量注入（Ｈｏｐｐｅ，Ｐ．Ｃ．およびＷａｇｎｅｒ，Ｔ．Ｅ．、１９８９、米国特許第４８７３１９１号）、生殖細胞系へのレトロウイルス媒介遺伝子転移（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔｔｅｎ等、１９８５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：６１４８〜６１５２）、胚性幹細胞における遺伝子ターゲッティング（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ等、１９８９、Ｃｅｌｌ、５６：３１３〜３２１）、胚の電気穿孔法（Ｌｏ、１９８３、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：１８０３〜１８１４）、および精子媒介遺伝子転移（Ｌａｖｉｔｒａｎｏ等、１９８９、Ｃｅｌｌ５７：７１７〜７２３）などが含まれる。そのような技法の概説としては、その全体を参照により本明細書の一部とする、Ｇｏｒｄｏｎ、１９８９、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｎｉｍａｌｓ、Ｉｎｔｌ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．１１５：１７１〜２２９を参照されたい。
【００３２】
本発明は、そのすべての細胞においてＴＲＰ８トランスジーンを有するトランスジェニック動物、ならびにすべてではなく、一部の細胞においてトランスジーンを有する動物、すなわちモザイク動物を提供する。このトランスジーンは、たとえばＬａｓｋｏ等の教示に従って（Ｌａｓｋｏ，Ｍ．等、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：６２３２〜６２３６）、選択的に導入し、特定の細胞型で活性化することもできる。そのような細胞型特異活性化に必要とされる調節配列は、対象となる特定の細胞型に応じて異なり、当分野の技術者に明白であろう。ＴＲＰ８トランスジーンを内因性ＴＲＰ８遺伝子の染色体部位に組み込むことが望まれるときには、遺伝子ターゲッティングが好ましい。簡単に言うと、そのような技法を用いるとき、内因性ＴＲＰ８遺伝子に相同性のいくつかのヌクレオチド配列を含有するベクターは、染色体配列による相同組換えを経て組み込まれ、内因性ＴＲＰ８遺伝子のヌクレオチド配列の機能を崩壊する目的で設計される。
【００３３】
ひとたびトランスジェニック動物が産生されたら、組換えＴＲＰ８遺伝子の発現は標準的な技法を用いて検定することができる。初回スクリーニングは、サザンブロット分析またはＰＣＲ技法によって動物組織を分析し、トランスジーンの組み込みが行われたかどうか検定することによって達成することができる。トランスジェニック動物の組織におけるトランスジーンのｍＲＮＡ発現のレベルもまた、これに限定されるものではないが、動物から得られた組織サンプルのノーザンブロット分析、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成分析、およびＲＴ−ＰＣＲを含む技法を用いて評価することができる。ＴＲＰ８遺伝子発現組織のサンプルはまた、ＴＲＰ８トランスジーン生成物に特異的な抗体を用いて免疫細胞化学的に評価することができる。
【００３４】
５．４．ＴＲＰ８タンパク質の抗体
１つまたは複数のＴＲＰ８のエピトープ、またはＴＲＰ８の保存変異型のエピトープ、あるいはＴＲＰ８のペプチド断片もまた本発明に包含される。そのような抗体には、これに限定されるものではないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ヒト化またはキメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ発現ライブラリーによって生成された断片、抗イディオタイプ（ａｎｔｉ−Ｉｄ）抗体、および上記のいずれかのエピトープ結合断片が含まれる。
【００３５】
本発明の抗体は、以下の５．５．項に記載の化合物スクリーニングスキームと共に、ＴＲＰ８遺伝子生成物の発現および／または活性に関する試験化合物の効果を評価するために用いることができる。
【００３６】
抗体を生成するために、ＴＲＰ８タンパク質、またはＴＲＰ８ペプチドを注入することによって様々な宿主動物を免疫化することができる。そのような宿主動物には、これに限定されるものではないが、いくつか名前を挙げるとウサギ、マウス、およびラットが含まれる。免疫反応を高めるために、宿主の種に応じて様々なアジュバントを用いることができ、これに限定されるものではないが、フロイントアジュバント（完全および不完全）、鉱物ゲル、たとえば水酸化アルミニウムなど、界面活性物質、たとえばリゾレシチンなど、プルロニックポリオール、多価アニオン、ペプチド、油乳濁液、キーホールリムペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにＢＣＧ（カルメット−ゲラン杆菌）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ（挫瘡プロピオンバクテリウム）などの潜在的に有用なヒトアジュバントが含まれる。
【００３７】
抗体分子のヘテロ個体集団を含むポリクローナル抗体は、免疫化動物の血清から得ることができる。モノクローナル抗体は、培養の連続細胞系によって抗体分子を生成する任意の技法によって得ることができる。その技法には、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎのハイブリドーマ技法（１９７５、Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５〜４９７、および米国特許第４３７６１１０号）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法（Ｋｏｓｂｏｒ等、１９８３、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ４：７２、Ｃｏｌｅ等、１９８３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８０：２０２６〜２０３０）、およびＥＢＶハイブリドーマ技法（Ｃｏｌｅ等、１９８５、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、７７〜９６頁）が含まれるが、これに限定されるものではない。そのような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤを含む任意の免疫グロブリンクラス、およびそれらの任意のサブクラスであることができる。本発明のｍＡｂを生成するハイブリドーマは、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで培養することができる。ｉｎ ｖｉｖｏにおける高力価でのＭａｂの生成により、これは現時点で好ましい生成方法となっている。
【００３８】
さらに、適切な抗原特異性を有するマウス抗体分子の遺伝子を適切な生物活性を有するヒト抗体分子の遺伝子と共にスプライシングする、「キメラ抗体」を生成するために開発された技法を用いることができる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ等、１９８４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８１：６８５１〜６８５５、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ等、１９８４、Ｎａｔｕｒｅ、３１２：６０４〜６０８、Ｔａｋｅｄａ等、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ３１４：４５２〜４５４）。あるいは、ヒト化抗体（米国特許第５５８５０８９号）、または一本鎖抗体（米国特許第４９４６７７８号、Ｂｉｒｄ、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３〜４２６、Ｈｕｓｔｏｎ等、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ、８５：５８７９〜５８８３、およびＷａｒｄ等、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ３３４：５４４〜５４６）を生成するために開発された技法を、ＴＲＰ８の１つまたは複数のエピトープを特異的に認識する抗体を生成するために用いることができる。
【００３９】
５．５．味知覚の調節に有用な薬剤および他の化合物のスクリーニングアッセイ
本発明は、ＴＲＰ８活性またはＴＲＰ８遺伝子発現をモジュレートし、したがって、苦味知覚のモジュレーションに有用な可能性のある化合物または組成物を同定するために設計されたスクリーニングアッセイ系に関する。
【００４０】
本発明により、細胞に基づくアッセイ系はＴＲＰ８の活性をモジュレートし、それによって苦味知覚をモジュレートする化合物をスクリーニングするために用いることができる。この目的のために、内因的にＴＲＰ８を発現する細胞を、化合物のスクリーニングに用いることができる。あるいは、ＴＲＰ８を発現するように遺伝子操作された細胞系、たとえば２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、線維芽細胞などを、スクリーニングの目的のために用いることができる。好ましくは、機能ＴＲＰ８を発現するように遺伝子操作された宿主細胞は、苦味物質による活性化に応答するものであり、たとえば味覚応答細胞などである。さらに、ＴＲＰ８チャネルタンパク質を発現するように操作された卵母細胞またはリポソームを、ＴＲＰ８活性のモジュレーターを同定するアッセイに用いることができる。
【００４１】
本発明は、（ｉ）ＴＲＰ８チャネルタンパク質を発現する細胞を試験化合物に接触させ、ＴＲＰ８の活性化レベルを測定する段階、（ｉｉ）別の実験において、（ｉ）と本質的に同じ条件で、ＴＲＰ８チャネルタンパク質を発現する細胞を対照媒体に接触させ、ＴＲＰ８の活性化レベルを測定する段階、次いで（ｉｉｉ）（ｉ）で測定したＴＲＰ８活性化レベルを（ｉｉ）のＴＲＰ８活性化レベルと比較する段階を含み、試験化合物の存在下における活性化ＴＲＰ８レベルの増加は、試験化合物がＴＲＰ８活性化剤であることを示す、苦味の知覚を誘発する化合物（「苦味活性化剤」）を同定する方法を提供する。
【００４２】
本発明はまた、（ｉ）ＴＲＰ８チャネルタンパク質を発現する細胞を、苦味物質の存在下で試験化合物に接触させ、ＴＲＰ８の活性化レベルを測定する段階、（ｉｉ）別の実験において、（ｉ）と本質的に同じ条件で、ＴＲＰ８チャネルタンパク質を発現する細胞を苦味物質に接触させ、ＴＲＰ８の活性化レベルを測定する段階、次いで（ｉｉｉ）（ｉ）で測定したＴＲＰ８活性化レベルを（ｉｉ）のＴＲＰ８活性化レベルと比較する段階を含み、試験化合物の存在下における活性化ＴＲＰ８レベルの減少は、試験化合物がＴＲＰ８阻害剤であることを示す、苦味の知覚を阻害する化合物（「苦味阻害剤」）を同定する方法を提供する。
【００４３】
本明細書において「苦味物質」とは、対象において苦味の知覚を誘発する化合物または分子複合体である。特に、苦味物質は、ＴＲＰ８チャネルタンパク質の活性化を引き起こし、細胞へのＣａ２＋の流入をもたらす物質である。苦味物質の例には、これに限定されるものではないが、安息香酸デナトニウム（「デナトニウム」；「ＤＥＮ」とも称する）、塩酸キニーネ（「キニーネ」；「ＱＵＩ」とも称する）、塩酸ストリキニン（「ストリキニン」；「ＳＴＲ」とも称する）、ヘミ硫酸ニコチン（「ニコチン」；「ＮＩＣ」とも称する）、塩酸アトロピン（「アトロピン」；「ＡＴＲ」とも称する）、スパルテイン、ナリンギン、コーヒー酸（「カフェイン」；「ＣＡＦ」とも称する）、キナクリン、およびエピカテキンが含まれる。参照により本明細書の一部とするＭｉｎｇ等、１９９９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９６：９９０３〜９９０８を参照されたい。
【００４４】
そのような細胞系の利用において、ＴＲＰ８チャネルタンパク質を発現する細胞は、試験化合物、または対照媒体（たとえば、プラシーボ）に暴露される。暴露後、その細胞を検定して、ＴＲＰ８遺伝子のシグナル変換経路成分の発現および／または活性を測定することができ、あるいはシグナル変換経路自体の活性を検定することができる。
【００４５】
ＴＲＰ８の活性をモジュレートする試験分子の能力は、標準的な生化学および生理学の技法を用いて測定することができる。触媒活性の活性化または抑制、ＴＲＰ８および／または他のタンパク質のリン酸化または脱リン酸、セカンドメッセンジャー生成物の活性化またはモジュレーション、細胞イオンレベルの変化、シグナル分子の会合、解離、または転位、あるいは特定の遺伝子の転写または翻訳などの反応をモニターすることができる。本発明の非限定的な実施形態において、細胞内Ｃａ２＋レベルの変化は、ｉｎｄｏ、ｆｕｒａなどの指示色素の蛍光によってモニターすることができる。ＴＲＰ８シグナル変換をモジュレートする化合物を同定するために、サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼの活性化に加えて、アデニレートシクラーゼ、ホスホリパーゼ、ＡＴＰアーゼ、および神経伝達物質のＣａ２＋感受性放出を測定することができる。さらに、ＴＲＰ８チャネルタンパク質のモジュレーションにより生じる膜電位の変化は、電位固定、またはパッチ記録法を用いて測定することができる。
【００４６】
たとえば、試験化合物への暴露後、細胞溶解産物は、Ｃａ２＋の細胞内レベルの上昇、およびホスホジエステラーゼ、ホスホリパーゼ、ＡＴＰアーゼ、またはｃＡＭＰなどの下流メッセンジャー依存カルシウムの活性化に関して検定することができる。対照媒体で処理した細胞に見出されるレベルと比較して、試験化合物がＣａ２＋の細胞内レベルを上昇させる能力、およびホスホジエステラーゼを活性化する、またはｃＡＭＰのレベルを低減する能力は、その試験化合物がアゴニストとして作用し（すなわち、ＴＲＰ８活性化剤である）、宿主細胞により発現したＴＲＰ８媒介のシグナル変換を誘発することを示す。対照媒体の場合に見出されるレベルと比較して、試験化合物が苦味物質の誘発するカルシウム流入を阻害する能力、およびホスホジエステラーゼを阻害する、またはｃＡＭＰのレベルを上昇させる能力は、その試験化合物がアンタゴニストとして作用し（すなわち、ＴＲＰ８阻害剤である）、ＴＲＰ８媒介のシグナル変換を阻害することを示す。
【００４７】
本発明の特定の実施形態において、ｃＡＭＰのレベルは、多様な異なるレポーター遺伝子のいずれかに結合したｃＡＭＰを含有する構成体を用いて測定することができる。そのようなレポーター遺伝子には、これに限定されるものではないが、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、成長ホルモン、または胎盤アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）を含むことができる。そのような構成体を、ＴＲＰ８チャネルタンパク質を発現する細胞に導入し、それによってＴＲＰ８活性のモジュレーターを同定するために設計されたスクリーニングアッセイに有用な組換え細胞を提供する。
【００４８】
細胞の試験化合物への暴露に続いて、ＴＲＰ８活性を調節する試験化合物の能力を判定するために、レポーター遺伝子発現のレベルを定量することができる。アルカリホスファターゼは細胞から分泌されるので、アルカリホスファターゼ検定は、本発明の実施において特に有用である。したがって、組織培養の上澄みを、分泌アルカリホスファターゼに関して検定することができる。さらに、アルカリホスファターゼ活性は、Ｂｒｏｎｓｔｅｉｎ，Ｉ．等（１９９４、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１７：１７２〜１７７）に記載されているような、熱量計、生物発光、または化学発光検定によって測定することができる。そのようなアッセイは、医薬品のスクリーニングに関して、簡単で高感度な容易に自動化可能な検出システムを提供する。
【００４９】
さらに、細胞内ｃＡＭＰの濃度を求めるために、シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）を用いることができる（ＳＰＡキットはＡｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓから提供される）。このアッセイは、１２５Ｉ標識ｃＡＭＰ、抗ｃＡＭＰ抗体、および二次抗体で被覆されたシンチラント組込み微小球を用いる。標識ｃＡＭＰ−抗体複合体を通して微小球に近接すると、１２５Ｉはシンチラントを励起して光を放射する。細胞から抽出された非標識ｃＡＭＰは、抗体との結合に関して１２５Ｉ標識ｃＡＭＰと競合し、それによってシンチレーションを減少する。このアッセイは高処理量のスクリーニングを可能にするために、９６ウェルプレートで行うことができ、読み出しのために、Ｗａｌｌａｃ、またはＰａｃｋａｒｄで製造されたもののような９６ウェルベースのシンチレーション計数装置を用いることができる。
【００５０】
本発明の他の実施形態において、細胞内Ｃａ２＋のレベルは、ＫｏｍｕｒｏおよびＲａｋｉｃ、１９９８のＴｈｅ Ｎｅｕｒｏｎ ｉｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ、Ｌ．Ｗ．Ｈａｙｍｅｓ編、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載されているような方法を用い、たとえばＦｌｕｏ−３およびＦｕｒａ−ＲｅｄなどのＣａ２＋指示色素を用いてモニターすることができる。
【００５１】
上述の任意の方法によって同定された、ＴＲＰ８の活性を活性化する試験活性化剤は、苦味知覚を誘発する能力を確認するために、さらなる試験に供することができる。上述の任意の方法によって同定された、苦味物質によってＴＲＰ８の活性化を阻害する試験阻害剤は、その阻害活性を確認するために、さらなる試験に供することができる。ＴＲＰ８受容体の活性をモジュレートする試験化合物の能力は、行動学的方法、生理学的方法、またはｉｎ ｖｉｔｒｏ法によって評価することができる。
【００５２】
たとえば、行動学的研究は、ＴＲＰ８阻害剤と推定されるものを含む組成物、およびその化合物を含まない同一の組成物を消費する選択を試験動物が与えられている状態で行うことができる。たとえば、より多い消費によって示される試験化合物を含む組成物に対する嗜好は、ＴＲＰ８阻害活性と正の相関を有するものであろう。さらに、試験動物によるＴＲＰ８の推定活性化剤を含む食品の忌避は、苦味活性化剤の同定と正の相関を有するものであろう。
【００５３】
ＴＲＰ８と相互に作用する、たとえば結合する化合物を同定するために、細胞に基づくアッセイに加えて、細胞に基づかないアッセイ系を用いることができる。そのような化合物は、ＴＲＰ８活性のアンタゴニストまたはアゴニストとして作用する可能性があり、苦味知覚を調節するために用いることができる。
【００５４】
この目的のために、可溶性ＴＲＰ８を組換えにより発現させ、ＴＲＰ８と結合する化合物を同定するために、細胞に基づかないアッセイにおいて用いることができる。以下の５．２．項に記載のとおり調製された、１つまたは複数のＴＲＰ８領域を含有する組換え発現ＴＲＰ８ポリペプチドまたは融合タンパク質を、細胞に基づかないスクリーニングアッセイに用いることができる。たとえば、ＴＲＰ８の１つまたは複数の細胞質または膜貫通領域に対応するペプチド、またはＴＲＰ８の１つまたは複数の細胞質または膜貫通領域を含有する融合タンパク質は、ＴＲＰ８の細胞質部分に結合する化合物を同定するために用いることができ、そのような化合物は、ＴＲＰ８のシグナル変換経路をモジュレートするのに有用である可能性がある。細胞に基づかないアッセイにおいて、組換え発現ＴＲＰ８は、当分野の技術者によく知られている方法によって、試験管、マイクロタイターウェル、またはカラムなどの固体支持層に付着させることができる（上述のＡｕｓｕｂｅｌ等を参照のこと）。次いでこの試験化合物を、ＴＲＰ８に結合する能力に関して検定する。
【００５５】
ＴＲＰ８チャネルタンパク質は、他の分子から完全に、または部分的に単離されたものであることができ、あるいは粗抽出物または半精製抽出物の一部として存在することができる。非限定的な例として、ＴＲＰ８チャネルタンパク質は、味覚受容細胞膜の試料に存在することができる。本発明の特定の実施形態において、そのような味覚受容細胞膜は、参照により本明細書の一部とするＭｉｎｇ，Ｄ．等、１９９８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：８９３３〜８９３８に記載のとおり調製することができる。詳細には、ウシの有郭乳頭（味覚受容細胞を含む「味覚組織」）を用手的に切開し、液体窒素中で凍結、使用まで−８０℃で貯蔵することができる。集めた組織は、次いでＰｏｌｙｔｒｏｎホモジナイザー（２５０００ＲＰＭ、各２０秒の３サイクル）を用いて、ｐＨ７．５、１０ｍＭのＴｒｉｓ、１０％ｖ／ｖグリセロール、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、１０μｇ／μｌペプスタチンＡ、１０μｇ／μｌロイペプチン、１０μｇ／μｌアプロチニン、および１００μＭの４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオリド塩酸塩を含有する緩衝液で均質化することができる。１５００×ｇ、１０分間の遠心分離によって微粒子を除去した後、味覚膜を４５０００×ｇ、６０分間の遠心分離によって集めることができる。次いで、ペレット化した膜を２度洗浄し、プロテアーゼ阻害剤を含まない均質化緩衝液に再懸濁し、２５ゲージの針中に２０回通すことによってさらに均質化することができる。その後、アリコートを瞬間凍結するか、あるいは使用まで氷上で保存することができる。他の非限定的な例として、味覚受容体は組換えクローンから得ることができる（Ｈｏｏｎ，Ｍ．Ｒ．等、１９９９、Ｃｅｌｌ９６：５４１〜５５１を参照のこと）。
【００５６】
転写または翻訳レベルでＴＲＰ８発現を調節する化合物をスクリーニングするように、アッセイを設計することもできる。一実施形態において、ＴＲＰ８遺伝子の発現をモジュレートする化合物を同定するために、レポーター分子をコードするＤＮＡをＴＲＰ８遺伝子の調節因子に結合させ、適切な完全細胞、細胞抽出物、または溶解産物中で用いることができる。適切な細胞または細胞抽出物は、通常ＴＲＰ８遺伝子を発現し、それによってその細胞抽出物がｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏの転写に必要とされる転写因子を含有することを確実にするような任意の細胞型から調製される。このスクリーニングは、レポーター構成体の発現をモジュレートする化合物を同定するために用いることができる。そのようなスクリーニングにおいて、レポーター遺伝子の発現レベルは試験化合物の存在下で求められ、試験化合物非存在下での発現レベルと比較される。
【００５７】
ＴＲＰ８の翻訳を調節する化合物を同定するために、ＴＲＰ８ｍＲＮＡの翻訳をモジュレートする能力に関して、ＴＲＰ８トランスクリプトを含有する細胞またはｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞溶解産物を試験することができる。ＴＲＰ８翻訳の阻害剤を検定するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＴＲＰ８ｍＲＮＡの翻訳をモジュレートする能力に関して、試験化合物を検定する。
【００５８】
さらに、ＴＲＰ８活性を調節する化合物は、動物モデルを用いて同定することができる。ＴＲＰ８の活性化が起こっているかどうかを判定するために、行動学的、生理学的、または生化学的方法を用いることができる。行動学的方法、および生理学的方法は、ｉｎ ｖｉｖｏで実施することができる。行動学的測定の一例として、試験阻害剤の存在下、または非存在下で、試験動物が苦味物質を含む組成物を自発的に消費する傾向を測定することができる。動物体内で苦味物質がＴＲＰ８を活性化する場合、その動物は苦味を体験することが予測され、それによって動物はその組成物をさらに消費することを思いとどまるであろう。苦味物質のみを含有する組成物（活性化ＴＲＰ８を伴う）か、あるいは苦味阻害剤と共に苦味物質を含有する組成物（低レベルの活性化ＴＲＰ８）を消費する選択が動物に与えられている場合、苦味阻害剤を含有する組成物の消費を好むことが予測される。したがって、動物によって実証された相対的な嗜好は、ＴＲＰ８チャネルの活性化と逆相関する。
【００５９】
生理学的方法には神経応答の研究が含まれ、この研究は味覚受容細胞を含有する組織と機能可能に連結している神経を用いて、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで実施することができる。ＴＲＰ８の活性化を起こす苦味物質への暴露によって味覚受容細胞に活動電位がもたらされ、次いでそれが末梢神経を通じて伝えられるので、苦味物質に対する神経応答を測定することは、特にＴＲＰ８活性化の間接的な測定となる。舌咽神経を用いて実施された神経応答の研究の一例は、Ｎｉｎｏｍｉｙａ，Ｙ等、１９９７、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（Ｌｏｎｄｏｎ）２７２：Ｒ１００２〜Ｒ１００６に記載されている。
【００６０】
上に記載したアッセイによって、ＴＲＰ８活性をモジュレートする化合物を同定することができる。たとえば、ＴＲＰ８活性に影響を及ぼす化合物には、これに限定されるものではないが、ＴＲＰ８に結合し、シグナル変換を活性化するか（アゴニスト）、あるいは活性化を阻止する（アンタゴニスト）化合物が含まれる。ＴＲＰ８遺伝子の活性に影響を及ぼす化合物も（ＴＲＰ８遺伝子の発現に影響を及ぼすことによるものであって、分子、たとえばタンパク質、または有機小分子を含み、それらが転写に影響を及ぼすか、あるいはスプライシングを妨げることによって、ＴＲＰ８の完全長または切断形態の発現をモジュレートすることができる）、本発明のスクリーニングを用いて同定することができる。しかしながら、記載のアッセイはさらに、ＴＲＰ８シグナル変換をモジュレートする化合物も同定できることに留意されたい（たとえば、下流のシグナル化に影響を及ぼす化合物であって、たとえばそれらの受容体に結合する味覚物質によって活性化されたシグナルの変換に関わる、Ｇタンパク質活性の阻害剤または強化剤である）。ＴＲＰ８の下流のシグナル化に影響を及ぼし、それによって味知覚へのＴＲＰ８の作用をモジュレートする、そのような化合物の同定および使用は、本発明の範囲内である。
【００６１】
本発明によってスクリーニングすることのできる化合物には、これに限定されるものではないが、ＴＲＰ８に結合して、天然味覚物質リガンドによって引き起こされた活性を模倣するか（すなわち、アゴニスト）、あるいは天然リガンドによって引き起こされた活性を阻害する（すなわち、アンタゴニスト）有機または無機小化合物、ペプチド、抗体、およびそれらの断片、ならびに他の有機化合物（たとえば、ペプチド類似作用物質）が含まれる。
【００６２】
化合物には、これに限定されるものではないが、ペプチド、たとえばこれに限定されるものではないがランダムペプチドライブラリーの構成体を含む可溶性ペプチドなど（たとえば、Ｌａｍ，Ｋ．Ｓ．等、Ｎａｔｕｒｅ３５４：８２〜８４、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．等、１９９１、Ｎａｔｕｒｅ３５４：８４〜８６を参照）、Ｄ−および／またはＬ−配置のアミノ酸によるコンビナトリアルケミストリ由来分子ライブラリー、ホスホペプチド（これに限定するものではないが、ランダムまたは部分変性定方向ホスホペプチドライブラリーの構成体を含む）（Ｓｏｎｇｙａｎｇ，Ｚ等、１９９３、Ｃｅｌｌ７２：７６７〜７７８）、抗体（これに限定されるものではないが、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、抗イディオタイプ、キメラ、または一本鎖抗体、ならびにＦＡｂ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦＡｂ発現ライブラリー断片、ならびにそれらのエピトープ結合断片を含む）、および有機または無機小分子が含まれる。
【００６３】
本発明によってスクリーニングすることのできる他の化合物には、これに限定されるものではないが、ＴＲＰ８のシグナル変換経路に関わるＴＲＰ８遺伝子または他の一部の遺伝子の発現に影響を及ぼす有機小分子（たとえば、遺伝子発現に関わる転写因子または調節領域と相互に作用することによる）、ＴＲＰ８の活性に影響を及ぼすか、あるいはたとえばＴＲＰ８関連Ｇタンパク質など、ＴＲＰ８シグナル変換経路に関わる他の一部の細胞内因子の活性に影響を及ぼすような化合物が含まれる。
【００６４】
５．６．ＴＲＰ８のモジュレーターを含有する組成物およびその使用
本発明は、有効量のＴＲＰ８阻害剤、たとえば上の５．５．項に記載したようにＴＲＰ８の活性化を測定することによって同定されたＴＲＰ８阻害剤などを対象に投与することを含む、対象の味覚組織に苦味物質が接触することによって生じる苦味を阻害する方法を提供する。本発明はまた、有効量のＴＲＰ８阻害剤を組成物に配合することを含む、組成物の苦味を阻害する方法を提供する。ＴＲＰ８阻害剤の「有効量」とは、苦味の知覚を主観的に減少させる、かつ／または上述のアッセイの１つによって測定されるＴＲＰ８活性化の検出可能な減少を伴う量である。
【００６５】
本発明はさらに、上の５．５．項に記載したとおりに同定された苦味活性化剤などの、ＴＲＰ８活性を活性化する化合物を含む組成物を対象に投与することを含む、対象による苦味の知覚を生じさせる方法を提供する。この組成物は、対象によって苦味として認識される味覚を生じるのに有効な量の活性化剤を含むことができる。
【００６６】
したがって本発明は、苦味活性化剤、および苦味阻害剤を含む組成物を提供する。そのような組成物は、対象の味覚組織に接触する可能性のある任意の物質を含み、これに限定されるものではないが、食品、飲料、医薬品、歯科製品、化粧品、ならびに封筒および切手に用いられる湿潤接着剤が含まれる。
【００６７】
一連の実施形態において、共存する苦味物質に関連する苦味の知覚を中和するために、苦味阻害剤が用いられる。これらの実施形態において、本発明の組成物は、苦味物質、および苦味阻害剤を含み、苦味阻害剤は苦味の知覚を阻害する濃度で存在する。たとえば、組成物中の苦味物質の濃度、および組成物中の苦味組成物の濃度を上の５．１．項に記載のアッセイに供するとき、苦味阻害剤は苦味物質によるＴＲＰ８の活性化を阻害する。
【００６８】
本発明は、苦味物質の嫌悪効果を低減または除去することによって食品の味覚を向上させるために用いることができる。苦味物質が食品保存剤である場合、本発明のＴＲＰ８阻害剤は、食品への保存剤の配合を可能、あるいは容易にし、それによって食品の安全性を向上させる。栄養補助剤として投与される食品の場合、本発明のＴＲＰ８阻害剤の配合は、消費を促進し、それによってこれらの組成物が栄養または熱量を対象に供給する効果を高めることができる。
【００６９】
本発明のＴＲＰ８阻害剤は、医療および／または歯科用組成物に配合することができる。診断処置に用いられるある種の組成物は、造影剤、および口腔局所麻酔薬など、不快な味を有するものがある。組成物の味を改善することによって、そのような処置を受ける対象の快適性を向上させるために、本発明のＴＲＰ８阻害剤を用いることができる。さらに、本発明のＴＲＰ８阻害剤は、風味を改善し、患者のコンプライアンスを向上させるために（特に患者が子供、または非ヒト動物である場合）、錠剤および液体を含む薬剤組成物に配合することができる。
【００７０】
本発明のＴＲＰ８阻害剤は、味の特徴を改善するために、化粧品に含有させることができる。たとえば、これに限定されるものではないが、本発明のＴＲＰ８阻害剤は、顔用クリーム、および口紅に配合することができる。さらに、本発明のＴＲＰ８阻害剤は、慣例的な食品、飲料、医薬品、または化粧品ではないが、味覚膜に接触する可能性のある組成物に配合することができる。これに限定されるものではないが、その例には、石鹸、シャンプー、練り歯磨き、義歯接着剤、切手および封筒表面の接着剤、ならびに害虫防除に用いられる毒性組成物（たとえば、ネズミ、またはゴキブリ用毒薬）が含まれる。
【００７１】
６．実施例：ＴＲＰ８遺伝子のクローニングおよび特性決定
以下の項は、ＴＲＰ８と称する一過性受容体タンパク質チャネルの単離、および特性決定を記載する。ＴＲＰ８の推定アミノ酸配列は、他のＴＲＰタンパク質との相同性を示している。ノーザンブロット分析は、味覚受容細胞におけるＴＲＰ８ＲＮＡの高レベルの発現を示す。
【００７２】
６．１．材料および方法
６．１．１．ＴＲＰ８遺伝子のクローニング
Ｇタンパク質ガストデューシンの発現にポジティブである、味覚受容細胞のサブセットに特異的または選択的に発現する遺伝子をクローニングするために、単一細胞逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、およびディフェレンシャルスクリーニングを用いた。個々のガストデューシンポジティブ細胞を、マウスの有郭乳頭から単離した（Ｈｕａｎｇ等、１９９９、Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ２：１０５５〜１０６２）。個々の細胞由来のｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、次いでＰＣＲ増幅した。増幅ｃＤＮＡをバクテリオファージベクターにサブクローニングすることによって、単一味覚受容細胞からの複数のｃＤＮＡライブラリーを構築した。このｃＤＮＡライブラリーを、自己プローブ（同一細胞のＰ３２標識増幅ｃＤＮＡ）および非自己プローブ（他の味覚細胞のＰ３２標識増幅ｃＤＮＡ）を用いて、ディフェレンシャルスクリーニングによって分析した。１％ウシ血清アルブミン、および４％ＳＤＳを含有する０．５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．３）中、６５℃、２０時間、ハイブリッド形成を行った。膜を０．１％ＳＤＳ、０、５×ＳＳＣ中、６５℃で２０分間、２回洗浄し、０．１％ＳＤＳ、０、１×ＳＳＣ中、６５℃で１５分間、１回洗浄した。増感スクリーンを用い、膜を−８０℃で３日間、Ｘ線フィルムに暴露した。非自己プローブより自己プローブに強くハイブリッド形成したクローンを単離し、その挿入部を配列決定した。
【００７３】
このクローンをプローブとして用い（ＬＱＳＥＱ９１）、上記と同じハイブリッド形成条件で、マウス味覚組織ｃＤＮＡライブラリーを完全長クローンに関してスクリーニングした。最長の挿入物を含有するクローンの配列決定によって、一過性受容体電位（ＴＲＰ）チャネルとして知られるカルシウムチャネルタンパク質のファミリーに最大の類似性を有する完全長クローンを生成した。
【００７４】
以下のマウス組織から、チオシアン酸グアニジウム／フェノール／クロロホルム抽出によって、トータルＲＮＡ２５μｇを単離した（Ｐ．ＣｈｒｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＮ．Ｓａｃｃｈｉ、１９８７、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２：１５６）。上皮富化味蕾、非味覚舌上皮、脳、網膜、嗅上皮、胃、小腸、肝臓、脾臓、腎臓、肺、心臓、胸腺、子宮、精巣、および骨格筋である。ＲＮＡを、６．７％ホルムアルデヒドを含有する１．５％アガロースゲルで電気泳動し、ＵＶ照射によってナイロン膜に移行、固定した。このブロットを、（α−３２Ｐ）−ｄＣＴＰの存在下、Ｅｘｏ（−）Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼを用いてランダムプライミングによって、マウスＴＲＰ８ｃＤＮＡの３’末端から産生した放射性標識１．７ｋｂ断片でハイブリッド形成した。ハイブリッド形成は、７％ＳＤＳを含有する０．２５Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）中、６５℃で２４時間、攪拌しながら行った。膜を、５％ＳＤＳを含有する２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）中、６５℃で４０分間、２回洗浄し、１％ＳＤＳを含有する同じ緩衝液中、６５℃で４０分間、２回洗浄した。このブロットを、増感スクリーンを用い、−８０℃で５日間、Ｘ線フィルムに暴露した。
【００７５】
ヒト高処理量ＤＮＡ配列およびゲノム配列のＢＬＡＳＴ検索を、参照としてマウスＴＲＰ８配列を用いて行った。この検索によって、ＢＡＣクローンは完全なヒトＴＲＰ８遺伝子を含有することが同定された。次いでＧｅｎｓｃａｎプログラムを用いて、ヒトＴＲＰ８遺伝子の予測されたタンパク質コードエキソンを同定した。この領域をマウスＴＲＰ８ｃＤＮＡと整列させ、予測されたヒトＴＲＰ８コード領域の全体を推定した。
【００７６】
６．１．２．ノーザンハイブリッド形成
いくつかのマウス組織から、Ｔｒｉｚｏｌ試薬を用いてトータルＲＮＡを単離し、ＲＮＡ各２５μｇを、６．７％ホルムアルデヒドを含有する１．５％アガロースゲル上のレーンごとに電気泳動した。このサンプルを、ＵＶ照射を用いてナイロン膜に移行、固定した。このブロットを、７％ＳＤＳ、および４０μｇ／ｍｌのニシン精子ＤＮＡを含有する０．２５Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）中、６５℃で５時間、攪拌しながら前ハイブリッド形成を行い、同じ溶液中、３２Ｐ放射性標識マウスＴＲＰ８プローブを用いて２０時間ハイブリッド形成を行った。膜を、５％ＳＤＳを含有する２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）中、６５℃で４０分間、２回洗浄し、１％ＳＤＳを含有する同じ緩衝液中、６５℃で４０分間、２回洗浄、さらに０．１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中、７０℃で３０分間、１回洗浄した。このブロットを、増感スクリーンを用い、−８０℃で３日間、Ｘ線フィルムに暴露した。３２Ｐ標識ＴＲＰ８プローブは、（α−３２Ｐ）−ｄＣＴＰの存在下、Ｅｘｏ（−）Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼを用い、３’−ＵＴＲに対応するＴＲＰ８の．４８ｋｂｃＤＮＡのランダムノナマープライミングによって産生した。
【００７７】
６．１．３．ｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成
３３Ｐ標識ＲＮＡプローブ［ＴＲＰ８（１．７ｋｂ）およびα−ガストデューシン（１ｋｂ）］を、マウス舌組織の凍結切片（１０μｍ）のｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成に用いた。ハイブリッド形成および洗浄は、（Ａｓａｎｏ、Ｍｉｙｏｓｈｉ等、２０００、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｌｅｔｔ２８３：６１〜６４）に記載のとおりに行った。スライドはＫｏｄａｋ ＮＴＢ−２核トラック乳剤で被覆し、４℃で３週間暴露、その後、展開、固定した。
【００７８】
６．１．４．免疫細胞学
キーホールリンペットヘモシアニン複合ＴＲＰ８ペプチド（ａａ１０２８〜１０４９）に対するポリクローナル抗血清を、ウサギ内で生育した。このＰＬＣβ２抗体は、Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから得た。抗α−ガストデューシンおよび抗Ｇγ１３抗体は、（Ｒｕｉｚ−Ａｖｉｌａ等、１９９５、Ｎａｔｕｒｅ３７６：８０〜８５、Ｈｕａｎｇ等、１９９９、Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ２：１０５５〜６２）に記載のとおりであった。マウス舌組織の厚さ１０ミクロンの凍結切片（あらかじめ４％のパラホルムアルデヒドに固定、２０％スクロース中で凍結保護）を、ＰＢＳ中の３％ＢＳＡ、０．３％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、２％ヤギ精子、および０．１％Ｎａアジド中、室温で１時間阻止し、その後、α−ガストデューシンに対する精製抗体、またはＴＲＰ８に対する抗血清を用い（１：８００）、４℃で８時間インキュベートした。二次抗体は、Ｃｙ３−対ＴＲＰ８抗ウサギＩｇヤギ抗体コンジュゲート、およびフルオレセイン−対ＰＬＣβ２抗ウサギＩｇヤギ抗体コンジュゲート、α−ガストデューシン、またはＧγ１３であった。ＴＲＰ８の免疫反応性は、免疫化ペプチド２０μＭを用いた抗血清の前保温によって阻止された。前免疫血清は、どのような免疫反応性も示さなかった。切片は、ＴＲＰ８と、以下の抗体、抗ＰＬＣβ２、抗α−ガストデューシン、または抗Ｇγ１３の１種とによって二重免疫染色した。切片は連続的に、各ステップの間に断続洗浄をして、ＴＲＰ８抗血清、抗ウサギＩｇ−Ｃｙ３コンジュゲート、通常の抗ウサギＩｇ、抗ＰＬＣβ２（あるいは抗α−ガストデューシン、または抗Ｇγ１３）抗体、および最後に抗ウサギＩｇ−ＦＩＴＣコンジュゲートでインキュベートした。抗ＰＬＣβ２（あるいは抗α−ガストデューシン、または抗Ｇγ１３）抗体を除く上記のすべての抗体を用いてインキュベートしたコントロール切片は、グリーンチャネルで蛍光を示さなかった。
【００７９】
６．１．５．遺伝子発現プロファイルの作成
単一味覚受容細胞ＲＴ−ＰＣＲ生成物（５μｌ）を、１．６％アガロースゲル上でサイズによって分別し、ナイロン膜上に移行した。単離細胞の発現パターンは、マウスＴＲＰ８、α−ガストデューシン、Ｇβ３、Ｇγ１３、ＰＬＣβ２、およびＧ３ＰＤＨに関して３’末端ｃＤＮＡプローブを用いて、サザンハイブリッド形成によって求めた。ブロットは、５時間、−８０℃で暴露した。単一有郭乳頭、および類似したサイズの非味覚上皮片由来のトータルＲＮＡも単離し、逆転写、増幅して、個々の細胞に関して分析した。
【００８０】
６．１．６．異種発現
卵母細胞に、５０ｎｇのＴＲＰ８ｃＲＮＡを注入した。注入から４８時間後、卵母細胞をタプシガーギン（２μＭ）、およびＸ−Ｒｈｏｄ−１−ＡＭ（Ｃａ＋＋検出色素）中、室温で３時間インキュベートした。
【００８１】
６．２．結果
６．２．１．味覚細胞における新規なＴＲＰチャネルの同定
単一細胞逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応を用いてクローンを単離したが、これはガストデューシンポジティブの細胞に発現し、ガストデューシンネガティブの細胞には存在しない。発現配列タグ（ＥＳＴ）ｄｂｅｓｔデータベースの検索によってマッチ部分は見出されず、これは発現したクローンのパターンが、味覚組織など、ＥＳＴデータベースに通常は見出されない組織に非常に限定的なものであることを示唆している。
【００８２】
このクローンをプローブとして用いて、マウス味覚組織ｃＤＮＡライブラリーを、完全長に関してスクリーニングした。最長の挿入部を含有するクローンの配列は、図１に示した配列を有する完全長のクローンを生成した。ｃＤＮＡクローンの推定アミノ酸配列を図２に示す。
【００８３】
単離されたｃＤＮＡは、一過性受容体電位（ＴＲＰ）チャネルとして知られるカルシウムチャネルタンパク質のファミリーに対して最大の類似性を示した。このタンパク質ファミリーに対する単離クローンの類似性は、ＴＲＰチャネルが同定されたことを示した。現在のところ、７種のＴＲＰチャネルの存在が知られているので、このクローンは８番目の構成体となり、慣例によりＴＲＰ８と称する。マウスＴＲＰ８（ＴＲＰ８）は、ＴＲＰ７と４０％のアミノ酸レベルが一致しており、ＴＲＰ７ともっとも密接に関連している。細胞膜に挿入されたＴＲＰ８チャネルの予測トポグラフィを図６Ａ〜Ｃに示す。
【００８４】
マウスクローンと、ＢＡＣクローンに含有されるヒト染色体１１ｐ１５．５の領域（遺伝子バンク＃ＡＣ００３６９３）との相同性に基づいて、ヒトＴＲＰ８オーソログが同定された。ヒトＴＲＰ８遺伝子のヌクレオチド配列、ならびに推定アミノ酸配列を、それぞれ図３Ａ〜Ｂ、および図４に記載する。マウスとヒトのＴＲＰ８タンパク質の比較を図５に示す。ヒト染色体１１ｐ１５．５領域は、マウス染色体７の末端領域とシンテニーを示す。いずれの場合も、ＴＲＰ８およびｈＴＲＰ８は、Ｋｖｌｑｔ１およびＴＳＳＣ４の遺伝子の間に位置を決定する。
【００８５】
６．２．２．ＴＲＰ８は味覚組織に選択的に発現する
ＴＲＰ８はα−ガストデューシンポジティブ（＋）ＴＲＣ対α−ガストデューシン（−）ＴＲＣのディフェレンシャルスクリーニングにおいて同定されたが、他の味覚細胞および／または組織に、より広範囲にＴＲＰ８が発現する可能性も考えられた。ＴＲＰ８ｍＲＮＡの組織分布を求めるために、複数のマウス組織を用いてノーザンブロットを行った。ＴＲＰ８の３’−ＵＴＲプローブは、味覚組織の４．５ｋｂトランスクリプトに主としてハイブリッド形成し、コントロールの非味覚組織に検出可能な発現はなかった。胃、および小腸において中程度の発現が検出され、子宮、および精巣に弱い発現が認められた（図７Ａ）。これは、Ｅｎｋｌａａｒ等（２０００、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ６７：１７９〜１８７）の結果と対照的である。ＴＲＰ８’コード領域の３’部分を増幅するように設計されたＲＴ−ＰＣＲ生成プローブを用いて、Ｅｎｋｌａａｒ等は、肝臓においてもっとも高い発現を検出し、他の周辺組織（たとえば、心臓、脳、腎臓、および精巣）において低いレベルの発現を検出した。Ｅｎｋｌａａｒ等のＲＴ−ＰＣＲプローブは、他のＴＲＰ８ｍＲＮＡ、または本発明の３’−ＵＴＲプローブに存在するものとは異なる３’末端を有するスプライシングされたｍＲＮＡのクロスハイブリッド形成による検出の可能性がある。ＴＲＰ８の発現の独立した測定として、本出願人等は、抗ＴＲＰ８抗体を用いてウエスタンブロットを行った（図７Ｂ）。予測された分子量（〜１３０ｋＤａ）のＴＲＰ８タンパク質が、胃、および小腸で検出された。予測分子量より大きい種が、肝臓、および腎臓で同定され、ＴＲＰ８関連タンパク質、またはスプライシングされたメッセージ由来のＴＲＰ８生成物を表す可能性がある。
【００８６】
６．２．３．ＴＲＰ８は特に味覚受容細胞のサブセットに発現する
マウスＴＲＣにおけるＴＲＰ８発現の細胞パターンを求めるために、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成を用いた。有郭乳頭および葉状乳頭のＴＲＣにおいてＴＲＰ８ｍＲＮＡが認められたが、周囲の非味覚上皮では認められなかった（図８）。ＴＲＰ８＋ＴＲＣは味蕾の大部分に存在したが、すべてのＴＲＣがポジティブというわけではなく、これはＴＲＣサブセットへの限定された発現を示唆している。ＴＲＰ８発現の一般的なパターンは、α−ガストデューシンのパターンに類似していたが、α−ガストデューシンのシグナルのほうがいくぶん強力であった（図８Ｄ）。センスプローブ用いたコントロールは、ＴＲＰ８プローブ（図８Ｂ）またはα−ガストデューシンプローブ（図８Ｅ）を用いた場合の、味覚組織への最少の非特異的ハイブリッド形成を示した。
【００８７】
ＴＲＰ８がＴＲＣにおいて、その活性化に関わる可能性のあるシグナル変換因子と共発現するかどうかを判定するために、本出願人等は、組織部分を含有するＴＲＣの一重および二重免疫組織化学法を行った。ＴＲＰ８タンパク質は、絶対的に、Ｇγ１３（図９ＡＢＣ）およびＰＬＣβ２（図９ＧＨＩ）と共発現し、これらの３種の分子が共通のシグナル変換経路の一部である可能性を示唆した。ＴＲＰ８は、絶対的にではないが、主として、α−ガストデューシン（図９ＤＥＦ）と共発現した。ＴＲＰ８＋ＴＲＣのサブセットは、α−ガストデューシンに関してネガティブであったが、α−ｇｕｓ＋ＴＲＣはすべて、ＴＲＰ８に関してポジティブであった。α−ｇｕｓ＋ＴＲＣは、Ｇγ１３、Ｇβ１、ＰＬＣβ２、およびＩＰ３Ｒ３に関してポジティブなＴＲＣサブセットを構成するという本出願人等の所見に、このパターンは一致する（Ｈｕａｎｇ等、１９９９）。異なる分子間の細胞レベルの分布におけるわずかな相違は、各タンパク質の示す異なるトポロジーによって説明できる。ＴＲＰ８は内在性膜タンパク質であり、一方、α−ガストデューシンおよびＰＬＣβ２は膜結合タンパク質である。ヒト茸状味蕾におけるヒトＴＲＰ８（ｈＴＲＰ８）の発現も確認された。
【００８８】
ＴＲＰ８のＴＲＣにおける上述のシグナル変換因子、ならびにＧβ１およびＧβ３との共発現を個別にモニターするために、単一細胞発現プロファイルの作成を行った（Ｈｕａｎｇ等、１９９９、Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ２：１０５５〜６２）。α−ガストデューシン、Ｇβ１、Ｇβ３、Ｇγ１３、ＰＬＣβ２、およびＴＲＰ８の発現は、味覚組織に限定されており（図１０、左図）、一連の２４個のＴＲＣにおいて、ＴＲＰ８は絶対的にα−ガストデューシン、Ｇβ３、Ｇγ１３、ＰＬＣβ２と共発現し（図１０、右図）、さらにＴＲＰ８の発現は大部分がＧβ１の発現と重複している（ＴＲＰ８＋細胞の１９個のうち１５個はさらにＧβ１＋であった）ことが、この方法において求められた。これらの様々なシグナル変換分子のＴＲＰ８との同時発現は、ヘテロ三量体ガストデューシン（すなわち、α−ガストデューシン／β３／γ１３）または他のＧα／β１、β３／γ１３含有ヘテロ三量体に結合したＧＰＣＲがβγを放出して、ＰＬＣβ２を活性化する可能性のあるシグナル経路によって生成されたＩＰ３（ＩＰ３受容体の活性化）またはＤＡＧ（ＴＲＰ８の直接活性化）によるＴＲＰ８の活性化に関して物理的機会を提供することができる。ＴＲＣにおいてＩＰ３受容体サブタイプＩＩＩ（ＩＰ３Ｒ３）が最近同定されたこと、ならびにＩＰ３Ｒ３は主としてα−ガストデューシン、Ｇγ１３、およびＰＬＣβ２と共局在することの実証も、これと矛盾しない。
【００８９】
６．２．４．他のＴＲＰファミリー構成体は味覚組織において検出可能な発現をしない
天然のＴＲＰチャネルは、ホモおよびヘテロ多量体を形成すると考えられている。ＴＲＣにおけるＴＲＰ８の潜在的なパートナーを同定するために、ＰＣＲを用いて、マウスＴＲＰチャネル１〜６（ＴＲＰ１〜６）が味覚組織で発現されるかどうかを判定した（脳組織が正の対照を提供した）。脳ｃＤＮＡを鋳型として用いたとき（図１１、下図）、ＴＲＰ１〜６に特異的なプライマー対を用いるＰＣＲによる増幅によって、６種すべてのＴＲＰファミリー構成体に関して正しいサイズの生成物が同定され、これらの生成物のＤＮＡ配列決定によって６種すべてのＴＲＰファミリー構成体の増幅が確認された。ＴＲＰ８は、脳ｃＤＮＡが鋳型であるとき増幅されなかったが（図１１、下図）、味覚ｃＤＮＡが鋳型を提供したときには増幅された（図１１、上図）（ＴＲＰ８の増幅はＤＮＡ配列決定によって確認された）。他の６種のＴＲＰファミリー構成体は、味覚組織ｃＤＮＡを鋳型して用いたときいずれも増幅されず（図１１、上図）、ＴＲＣにおいて発現するにしても、高度には発現しないことを示唆した。ＴＲＰ７に特異的なプライマーを用いる別の実験において、ＴＲＰ７は脳ｃＤＮＡにおいてＰＣＲによって検出されたが、味覚ｃＤＮＡでは検出されなかった。これらの７種の構成体以外の新規なＴＲＰチャネルがＴＲＣで発現する可能性があるが、現在のところ、ＴＲＰ８が、味覚組織において高度に発現し、上に示したようにＴＲＣにおいて高度に発現する唯一の既知のＴＲＰであると思われる。
【００９０】
６．２．５．発現ＴＲＰ８は貯蔵体作動性チャネルとして作用する
ＴＲＰ８がカルシウムチャネルとして機能できるかどうかを判定するために、ＴＲＰ８をアフリカツメガエルの卵母細胞に発現した。この卵母細胞は、ＴＲＰファミリーに属する貯蔵体作動性Ｃａ＋＋チャネルの活性化によるＣａ＋＋流入をモニターするために用いることのできる内因性カルシウム活性化クロライド電流（ＩＣｌＣａ）を有する。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写によって得られたＴＲＰ８ＲＮＡを、アフリカツメガエルの卵母細胞に注入し、２日後に二極電圧固定記録法を行った。内部Ｃａ＋＋貯蔵体の枯渇を誘発するために、記録前に、２μＭのタプシガーギン（ＴＰＮ）、筋小胞体（ｓａｒｃｏ（ｅｎｄｏ）ｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ）Ｃａ＋＋−ＡＴＰアーゼ（ＳＥＲＣＡ）の不可逆性阻害剤中で、卵母細胞を２時間インキュベートした。
【００９１】
ＴＲＰ８ＲＮＡを注入し、ＴＰＮで処理した卵母細胞の代表的な記録トレースは、外部浴にＣａ＋＋を添加することによって誘発された強く明瞭な内向き電流を実証した（図１２Ａ）。これらのトレースは、水を注入した対照卵母細胞のトレース（図１２Ｂ）と劇的に異なり、これによって、内部Ｃａ＋＋貯蔵体の充填状態にその活性化が依存し（図１２のＡとＢを比較のこと）、その機能が外部Ｃａ＋＋の入手可能性に依存する機能性Ｃａ＋＋チャネルをＴＲＰ８がコードすることが示された。対照卵母細胞は、ＴＰＮ処理によって活性化することのできる、内因性ＴＲＰチャネル（ＸＴｒｐ）を発現する（Ｂｏｂａｎｏｖｉｃ等、１９９９、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．３４０：５９３〜５３９）（図１２Ｂ）。細胞外媒質にＣａ＋＋が存在する条件下で発生した総内向き電流の分析は（図１２Ｄ）、ＴＲＰ８発現の効果を明らかに実証した。ＴＲＰ８タンパク質が実際に卵母細胞に発現したことを確認するために、本出願人等は抗ＴＲＰ８抗体を用いて、ＴＲＰ８ＲＮＡ注入卵母細胞由来の膜タンパク質のウエスタンブロットを行い、予期されたサイズの１３０ｋＤａのタンパク質が検出された。
【００９２】
本発明は、本明細書に記載した特定の実施形態によって範囲が限定されるものではない。さらに、本明細書に記載されたものに加えて様々な本発明の変更が、上述の説明および添付の図面から当分野の技術者に明らかとなるであろう。そのような変更は、添付の請求の範囲内である。本明細書には様々な参照文献が挙げられており、その開示の全体を参照により本明細書の一部とする。
【図面の簡単な説明】
【図１】マウスＴＲＰ８コードマウスＴＲＰ８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す図である。
【図２】マウスＴＲＰ８一過性受容体電位チャネルの推定アミノ酸配列を示す図である。
【図３Ａ〜Ｂ】ヒトＴＲＰ８コードヒトＴＲＰ８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す図である。
【図４】ヒトＴＲＰ８タンパク質一過性受容体電位チャネルの推定アミノ酸配列を示す図である。
【図５】マウスＴＲＰ８（上段）対ヒトＴＲＰ８（下段）のアミノ酸配列を示す図である。段の各対は、予測されるマウス／ヒトのエクソンに相当する。
【図６Ａ〜Ｃ】膜におけるＴＲＰ８タンパク質一過性受容体電位チャネルの予測トポグラフィを示す図である。
【図７】マウス組織におけるＴＲＰ８ｍＲＮＡおよびタンパク質の分布を示す図である。（ａ）ＴＲＰ８ｃＤＮＡプローブを用いてハイブリッド形成したノーザンブロットのオートラジオグラフ。各レーンは、以下のマウス組織から単離したトータルＲＮＡ２５μｇを含有していた。有郭乳頭および葉状乳頭富化味覚組織（味覚組織）、味蕾を欠いた舌組織（非味覚）、脳、網膜、嗅上皮（Ｏｌｆ．Ｅｐｉ）、胃、小腸（Ｓｍａｌｌ Ｉｎｔ．）、胸腺、心臓、肺、脾臓、骨格筋（Ｓｋｅｌｅ．Ｍｕｓ．）、肝臓、腎臓、子宮、および精巣である。４．５ｋｂのトランスクリプトが味覚組織、胃、および小腸において検出され、子宮、および精巣では、はるかに少量で検出された。ｍＲＮＡ量を制御するために、同一のブロットをストリップし、β−アクチンｃＤＮＡプローブで再プローブした（下図）。ＲＮＡマーカのキロベース（ｋｂ）の大きさを右側に示す。（ｂ）抗ＴＲＰ８抗体を用いてプローブしたウエスタンブロットのオートジオグラフ。記載のマウス組織から調製したタンパク質抽出物（５０μｇ）を電気泳動し、ニトロセルロース膜に移し、次いでブロットをＴＲＰ８のカルボキシル末端に対する抗体でインキュベートした。ＴＲＰ８の予測分子量である〜１３０ｋＤの免疫反応性タンパク質が胃、および小腸で検出され、より大きい分子量種が肝臓、および腎臓で確認された。分子量マーカはキロダルトンで示す。
【図８】味覚受容細胞に発現するＴＲＰ８ｍＲＮＡを示す図である。有郭乳頭および葉状乳頭を含有するマウス舌上皮部を、ＴＲＰ８（ａ、ｃ）、およびα−ガストデューシン（ｄ）に関して３３Ｐ標識アンチセンスＲＮＡプローブを用いてハイブリッド形成し、オートラジオグラフィにかけた。アンチセンスＴＲＰ８プローブにハイブリッド形成した有郭乳頭（ａ）および葉状乳頭（ｂ）の顕微鏡写真は、ＴＲＣのサブセットにおけるＴＲＰ８の発現を実証する。（ｄ）は葉状乳頭に対するα−ガストデューシンアンチセンスプローブのハイブリッド形成を示す。センスプローブを用いたハイブリッド形成対照は、ＴＲＰ８プローブ（ｂ）、またはα−ガストデューシンプローブ（ｅ）の非特異的結合がないことを示した。
【図９】ＴＲＰ８、および他のシグナル変換因子のＴＲＣにおける共局在を示す図である。マウス味覚乳頭部の同一縦断面におけるＧγ１３（ａ）およびＴＲＰ８（ｂ）の免疫蛍光検査であり、（ｃ）はａおよびｂを重ねたものである。同一部におけるＴＲＰ８（ｄ）およびα−ガストデューシン（ｅ）の免疫蛍光検査であり、（ｆ）はｄおよびｅを重ねたものである。同一部におけるＰＬＣβ２（ｇ）およびＴＲＰ８（ｈ）の免疫蛍光検査であり、（ｉ）はｇおよびｈを重ねたものである。
【図１０】味覚組織および味覚細胞におけるＴＲＰ８、α−ガストデューシン、Ｇβ１、Ｇβ３、Ｇγ１３、およびＰＬＣβ２の発現パターンのプロファイルの作成を示す図である。左図は、マウス味覚組織（Ｔ）、および対照非味覚舌組織（Ｎ）由来のＲＴ−ＰＣＲ生成物に対するサザンハイブリッド形成である。ＴＲＰ８、α−ガストデューシン（Ｇｕｓｔ）、Ｇβ１、Ｇβ３、Ｇγ１３、ＰＬＣβ２、およびグリセルアルデヒド三リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）の３’位プローブを、ブロットをプローブするために用いた。ＴＲＰ８、α−ガストデューシン、Ｇβ１、Ｇβ３、Ｇγ１３、およびＰＬＣβ２はすべて味覚組織に発現したが、非味覚組織には発現しなかったことに留意されたい。右図は、ガストデューシンプロモーターの緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するトランスジェニックマウス由来の、個々に増幅された２４の味覚受容細胞のＲＴ−ＰＣＲ生成物に対するサザンハイブリッド形成である。１９個の細胞がＧＦＰポジティブ（＋）であり、５個の細胞がＧＦＰネガティブ（−）であった。ＴＲＰ８、α−ガストデューシン、Ｇβ３、Ｇγ１３、およびＰＬＣβ２の発現は、完全に一致していた。１９のＧＦＰ８ポジティブ細胞のうち１５は、Ｇβ１に対してもポジティブであった。Ｇ３ＰＤＨは正の対照としての役割を果たし、生成物の増幅が成功したことを実証した。
【図１１】味覚組織において、ＰＣＲによってＴＲＰ８が検出され、ｍＴｒｐ１〜７が検出されないことを示す図である。ＴＲＰ８およびｍＴｒｐ１〜７のＰＣＲ増幅は、各Ｔｒｐファミリー構成体に特異的な非同義性プライマーを用いて行った。味覚ｃＤＮＡ（上図）および脳ｃＤＮＡ（下図）は増幅の鋳型を提供した。増幅された材料を、１．２％アガロースゲルに溶解した。予測される分子量のバンドを配列して、増幅されたＴｒｐチャネルを同定した。正（Ｇ３ＰＤＨプライマー）および負（プライマーなし）の対照を示す（右図）。
【図１２】ＴＲＰ８の異種発現を示す図である。アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞に、ＴＲＰ８ｃＲＮＡ（ａ）５０ｎｇ、または水（ｂ）５０ｎｌを注入した。注入から２日後、卵母細胞をタプシガーギン（ｔｈａｐｓｉｇａｒｇｉｎ）（２μＭ）で処理し、次いで示したとおり（矢印）Ｃａ＋＋（１０ｍＭ）またはＥＧＴＡを添加した。このトレースは負の膜電位において誘発された電流を表す（コマンド電位−８０ｍＶ）。（ｃ）ＴＲＰ８ｃＲＮＡまたは水を注入した卵母細胞のＩ−Ｖ曲線は、内因性カルシウム活性化塩素イオンコンダクタンス（ＩＣｌＣａ）のＣａ＋＋活性化に一致する逆転電位を実証する。（ｄ）ＴＲＰ８ｃＲＮＡまたは水を注入した卵母細胞に関して、浴媒質に存在する外部Ｃａ＋＋に誘発された最大内向き電流である（対照）。
【図１３】Ｃａ＋＋チャネルとしてのＴＲＰ８機能を示す図である。アフリカツメガエル卵母細胞に、ＴＲＰ８ｃＲＮＡ（右図）５０ｎｇ、または水（左図）５０ｎｌを注入した。注入から２日後、卵母細胞をタプシガーギン（２μＭ）で処理し、次いでＣａ＋＋（１０ｍＭ）を添加した。
【図１４】ＴＲＰ８を用いる、ＴＲＣにおける電位シグナル変換経路を示す図である。デナトニウムなどの苦味化合物に対する応答は、Ｔ２Ｒ／ＴＢＲファミリーの１つまたは複数のガストデューシン結合受容体への結合によって開始される。ガストデューシンへテロ三量体の活性化によって、ＰＬＣβ２を誘発するそのβγ部分（たとえばＧβ３／Ｇγ１３）が放出され、ＩＰ３およびＤＡＧが生成される。ＩＰ３はたとえばＩＰ３Ｒ３などの受容体に結合して、細胞内貯蔵体からのＣａ＋＋の放出をもたらし、ＴＲＰ８チャネルの活性化を起こし、最終的にはＴＲＰ８チャネルを経るＣａ＋＋の流入に至る。ＤＡＧはＴＲＰ８に直接作用し、Ｃａ＋＋の流入に至る可能性がある。人口甘味料は類似の変換経路に依存する可能性があるが、甘味応答受容体、たとえばＴ１Ｒ３がガストデューシンまたは他のＧタンパク質と結合することにより、ＩＰ３およびＤＡＧの生成、およびＴＲＰ８の刺激に至るシグナルを開始する。
Claims (23)
- 図２に示したアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子。
- 図１のＤＮＡ配列を含む請求項１に記載の単離核酸分子。
- 図３のＤＮＡ配列を含む単離核酸分子。
- 図４に示したアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む請求項３に記載の単離核酸分子。
- ストリンジェント（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ）な条件下で請求項１または３に記載のヌクレオチド配列にハイブリッド形成し、機能的に同等な遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子。
- 適度にストリンジェントな条件下で請求項１または３に記載の核酸にハイブリッド形成し、機能的に同等なＴＲＰ８遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子。
- ＴＲＰ８アンチセンス分子である単離核酸分子。
- 図２のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド。
- 図４のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド。
- ストリンジェントな条件下で請求項１または３に記載のヌクレオチド配列にハイブリッド形成し、機能的に同等な遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド。
- 適度にストリンジェントな条件下で請求項１または３に記載のヌクレオチド配列にハイブリッド形成し、機能的に同等な遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド。
- 膜貫通領域、および細胞質領域からなるグループから選択されたＴＲＰ８タンパク質の領域を含むＴＲＰ８タンパク質の精製断片。
- 共有結合を経て第２のタンパク質のアミノ酸配列に融合した少なくとも６つのアミノ酸からなるＴＲＰ８タンパク質断片を含み、その第２のタンパク質がＴＲＰ８タンパク質ではないキメラタンパク質。
- ＴＲＰ８タンパク質を結合することのできる抗体。
- 請求項５または６に記載の核酸を含有する組換え細胞。
- コードされたＴＲＰ８タンパク質がその細胞によって発現されるように請求項５または６に記載の核酸を含有する組換え細胞を生育する段階、および発現したＴＲＰ８タンパク質を回収する段階を含むＴＲＰ８を生成する方法。
- 苦味の知覚を誘発する化合物を同定する方法であって、
（ｉ）ＴＲＰ８チャネルタンパク質を発現する細胞を試験化合物に接触させ、ＴＲＰ８の活性化レベルを測定する段階、
（ｉｉ）別の実験において、（ｉ）と本質的に同じ条件で、ＴＲＰ８チャネルタンパク質を発現する細胞を対照媒体に接触させ、ＴＲＰ８の活性化レベルを測定する段階、および
（ｉｉｉ）（ｉ）で測定したＴＲＰ８活性化レベルを（ｉｉ）のＴＲＰ８活性化レベルと比較する段階
を含み、試験化合物の存在下における活性化ＴＲＰ８レベルの増加は、試験化合物がＴＲＰ８誘発剤であることを示す方法。 - 苦味の知覚を阻害する、かつ／または甘味の知覚を促進する化合物を同定する方法であって、
（ｉ）ＴＲＰ８チャネルタンパク質を発現する細胞を、苦味物質の存在下で試験化合物に接触させ、ＴＲＰ８の活性化レベルを測定する段階、
（ｉｉ）別の実験において、（ｉ）と本質的に同じ条件で、ＴＲＰ８チャネルタンパク質を発現する細胞を苦味物質に接触させ、ＴＲＰ８の活性化のレベルを測定する段階、および
（ｉｉｉ）（ｉ）で測定したＴＲＰ８活性化レベルを（ｉｉ）のＴＲＰ８活性化レベルと比較する段階
を含み、試験化合物の存在下におけるＴＲＰ８の活性化レベルの減少は、試験化合物がＴＲＰ８阻害剤であることを示す方法。 - ｉｎ ｖｉｖｏにおいて苦味阻害剤を同定する方法であって、
（ｉ）試験動物に（ａ）苦味物質を含む組成物、または（ｂ）苦味物質ならびに試験阻害剤を含む組成物を消費する選択を提供する段階、および
（ｉｉ）（ａ）または（ｂ）の組成物の消費量を比較する段階
を含み、（ｂ）による組成物がより多く消費されることと、味覚物質に関連する苦味の知覚を阻害する試験阻害剤の能力とが正の相関を有する方法。 - ｉｎ ｖｉｖｏにおいて苦味活性化剤を同定する方法であって、
（ｉ）試験動物に（ａ）対照組成物、または（ｂ）試験活性化剤を含む組成物を消費する選択を提供する段階、および
（ｉｉ）（ａ）または（ｂ）の組成物の消費量を比較する段階
を含み、（ａ）による組成物がより多く消費されることと、苦味の知覚を活性化する試験活性化剤の能力とが正の相関を有する方法。 - 被験体の味覚組織に苦味物質を接触させることによって生じる苦味を阻害する方法であって、有効量の苦味阻害剤を被験体に投与することを含む方法。
- 被験体による甘味の知覚を生じさせる方法であって、甘味を誘発することに加えて、苦味阻害剤として作用する化合物を含む組成物を被験体に投与することを含む方法。
- 被験体による苦味の知覚を生じさせる方法であって、苦味活性化剤として作用する化合物を含む組成物を被験体に投与することを含む方法。
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