JP2004506086A5

JP2004506086A5 -

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Publication number: JP2004506086A5
Application number: JP2002521535A
Authority: JP
Filing date: 2001-08-27
Publication date: 2008-10-16

Description

【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の構造［ＩＩ］：
【化１】

〔Ｒ^１は水素、β−Ｄ−Ｇｌｃｐ（１→４）、またはＰＣｈｏ→６）−β−Ｄ−Ｇｌｃｐ（１→４）であり；
Ｒ^２はリン酸基（Ｐ）またはピロホスホエタノールアミン（Ｐ−ＰＥｔｎ）であり；
Ｒ^３は水素、β−Ｄ−Ｇｌｃｐまたはβ−Ｄ−Ｇａｌｐであり、Ｒ^１が水素またはβ−Ｄ−Ｇｌｃｐ（１→４）である場合には、Ｒ^３はさらに、
β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→４）−β−Ｄ−Ｇｌｃｐ、
α−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→４）−β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→４）−β−Ｄ−Ｇｌｃｐ、
β−Ｄ−ＧａｌｐＮＡｃ−（１→３）−α−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→４）−β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→４）−β−Ｄ−Ｇｌｃｐ、または
α−ＮｅｕＡｃ（２→３）−β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→４）−β−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→３）
であってもよく、Ｒ^３はＨｅｐＩＩＩのＯ−３位またはＯ−２位に結合しており；
Ｋｄｏは３−デオキシ−Ｄ−マンノ−２−オクツロソン酸であり；
リピドＡは解毒されている〕
を有するトリヘプトシル内部コア部分から本質的になる、単離されたリポ多糖部分。
【請求項２】
請求項１に記載のリポ多糖部分を、医薬上許容される担体とともに含んでなる、組成物。
【請求項３】
医薬上許容される担体が免疫原性である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
請求項１に記載のリポ多糖部分に特異的に結合する、抗体。
【請求項５】
保存されたトリヘプトシル内部コア部分に結合するモノクローナル抗体である、請求項４に記載の抗体。
【請求項６】
インフルエンザ菌の感染に起因する疾病を治療する方法であって、このような治療を必要とする被験体に、請求項２に記載の組成物を投与することを含んでなる、方法。
【請求項７】
インフルエンザ菌が非定型インフルエンザ菌である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記疾病が、中耳炎、髄膜炎、肺炎および気道感染症からなる群から選択されるものである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
受託番号ＩＤＡＣ２５０８０１−１として寄託されている、インフルエンザ菌Ｒｄｌｉｃ１ｌｐｓＡ株。
【請求項１０】
受託番号ＩＤＡＣ２５０８０１−２として寄託されている、インフルエンザ菌１００３ｌｉｃ１ｌｐｓＡ株。
【請求項１１】
以下の構造［ＩＩ］：
【化２】

〔Ｒ^１は水素、β−Ｄ−Ｇｌｃｐ（１→４）、またはＰＣｈｏ→６）−β−Ｄ−Ｇｌｃｐ（１→４）であり；
Ｒ^２はリン酸基（Ｐ）またはピロホスホエタノールアミン（Ｐ−ＰＥｔｎ）であり；
Ｒ^３は水素、β−Ｄ−Ｇｌｃｐ、β−Ｄ−Ｇａｌｐ、β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→４）−β−Ｄ−Ｇｌｃｐ、またはα−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→４）−β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→４）−β−Ｄ−Ｇｌｃｐであり、Ｒ^１が水素またはβ−Ｄ−Ｇｌｃｐ（１→４）である場合には、Ｒ^３はさらに、
β−Ｄ−ＧａｌｐＮＡｃ−（１→３）−α−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→４）−β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→４）−β−Ｄ−Ｇｌｃｐ、または
α−ＮｅｕＡｃ（２→３）−β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→４）−β−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→３）
であってもよく、Ｒ^３はＨｅｐＩＩＩのＯ−３位またはＯ−２位に結合しており；
Ｋｄｏは３−デオキシ−Ｄ−マンノ−２−オクツロソン酸である〕
を有する保存されたトリヘプトシル内部コア部分から本質的になるリポ多糖部分を製造する方法であって、
−ｌｐｓＡ、ｌｉｃ１、ｌｉｃ２、ｌｉｃ２Ａ、ｌｉｃ２ｏｒｆ３、ｌｉｃ２Ｂ、ｌｉｃ３Ａ、ｌｇｔＣ、ｌｇｔＤおよびｌｇｔＦからなる群から選択される１以上の不活性化された遺伝子で、インフルエンザ菌株を形質転換すること；
−形質転換されたインフルエンザ菌株を、前記リポ多糖部分の発現に適した条件下で培養すること；
−前記リポ多糖部分を単離すること；ならびに
−前記リポ多糖部分のリピドＡ部分を解毒すること
を含んでなる、方法。
【請求項１２】
インフルエンザ菌が非定型インフルエンザ菌である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ｌｐｓＡ、ｌｉｃ１、ｌｉｃ２、ｌｉｃ２Ａ、ｌｉｃ２ｏｒｆ３、ｌｉｃ２Ｂ、ｌｉｃ３Ａ、ｌｇｔＣ、ｌｇｔＤ、ｌｇｔＦ、ｒｆａＦおよびｏｒｆＨからなる群から選択される１以上の遺伝子の不活性化の後に発現したエピトープに特異的なモノクローナル抗体に、前記リポ多糖部分を接触させることにより、前記リポ多糖部分を同定することをさらに含んでなる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記モノクローナル抗体が、請求項１に記載の保存されたトリヘプトシル内部コア部分に結合するものである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１に記載のリポ多糖部分、および該リポ多糖部分に架橋した免疫原性担体を含んでなる、糖結合体。
【請求項１６】
前記リポ多糖部分と前記免疫原性担体がリンカー分子で架橋されている、請求項１５に記載の糖結合体。
【請求項１７】
前記リンカー分子が、アジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）、ε−アミノヘキサン酸、クロロヘキサノールジメチルアセタール、Ｄ−グルクロノラクトンおよびｐ−ニトロフェニルアミンからなる群から選択されるものである、請求項１６に記載の糖結合体。
【請求項１８】
前記担体が、破傷風トキソイド（ＴＴ）または非定型インフルエンザ菌高分子量タンパク質（ＮＴＨｉＨＭＰ）である、請求項１５に記載の糖結合体。
【請求項１９】
請求項１５に記載の１以上の糖結合体およびアジュバントを含んでなる、被験体において非定型インフルエンザ菌感染に対する免疫応答を引き起こすための免疫原組成物。
【請求項２０】
リポソームとして製剤化されている、請求項１９に記載の免疫原組成物。

他の態様によれば、本発明により、以下の構造［Ｉ］：

〔Ｒは水素またはホスホエタノールアミンであり、ＧｌｃはＤ−グルコピラノースであり、Ｋｄｏは３−デオキシ−Ｄ−マンノ−２−オクツロソン酸である〕
を有するインフルエンザ菌リポ多糖のトリヘプトシル内部コア部分を含んでなるリポ多糖部分が提供される。

他の態様によれば、本発明により、以下の構造［ＩＩ］：

〔Ｒ^１は水素、β−Ｄ−Ｇｌｃｐ（１→４）、またはＰＣｈｏ→６）−β−Ｄ−Ｇｌｃｐ（１→４）であり；
Ｒ^２はリン酸基（Ｐ）またはピロホスホエタノールアミン（Ｐ−ＰＥｔｎ）であり；
Ｒ^３は水素、β−Ｄ−Ｇｌｃｐまたはβ−Ｄ−Ｇａｌｐであり、Ｒ^１が水素またはβ−Ｄ−Ｇｌｃｐ（１→４）である場合には、Ｒ^３はさらに、
β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→４）−β−Ｄ−Ｇｌｃｐ、
α−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→４）−β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→４）−β−Ｄ−Ｇｌｃｐ、
β−Ｄ−ＧａｌｐＮＡｃ−（１→３）−α−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→４）−β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→４）−β−Ｄ−Ｇｌｃｐ、または
α−ＮｅｕＡｃ（２→３）−β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→４）−β−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→３）
であってもよく、Ｒ^３はＨｅｐＩＩＩのＯ−３位またはＯ−２位に結合しており；
Ｋｄｏは３−デオキシ−Ｄ−マンノ−２−オクツロソン酸であり；
リピドＡは解毒されている〕
を有するインフルエンザ菌リポ多糖のトリヘプトシル内部コア部分から本質的になる単離されたリポ多糖部分が提供される。

他の態様によれば、本発明により、本明細書に記載のいずれかのリポ多糖部分を含んでなる、動物宿主においてインフルエンザ菌により引き起こされる疾病に対する防御を与えるための免疫原組成物が提供される。

他の態様によれば、本発明により、本明細書に記載のいずれかのリポ多糖部分、および該リポ多糖部分に架橋した免疫原性担体を含んでなる、糖結合体が提供される。

他の態様によれば、本発明により、本明細書に記載のいずれかのリポ多糖部分を含んでなるインフルエンザ菌株を得るための、インフルエンザ菌においてリポ多糖を産生する生合成経路中の少なくとも一つの遺伝子の使用が提供される。

他の態様によれば、本発明により、以下の構造［ＩＩ］：

〔Ｒ^１は水素、β−Ｄ−Ｇｌｃｐ（１→４）、またはＰＣｈｏ→６）−β−Ｄ−Ｇｌｃｐ（１→４）であり；
Ｒ^２はリン酸基（Ｐ）またはピロホスホエタノールアミン（Ｐ−ＰＥｔｎ）であり；
Ｒ^３は水素、β−Ｄ−Ｇｌｃｐ、β−Ｄ−Ｇａｌｐ、β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→４）−β−Ｄ−Ｇｌｃｐ、またはα−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→４）−β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→４）−β−Ｄ−Ｇｌｃｐであり、Ｒ^１が水素またはβ−Ｄ−Ｇｌｃｐ（１→４）である場合には、Ｒ^３はさらに、
β−Ｄ−ＧａｌｐＮＡｃ−（１→３）−α−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→４）−β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→４）−β−Ｄ−Ｇｌｃｐ、または
α−ＮｅｕＡｃ（２→３）−β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→４）−β−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→３）
であってもよく、Ｒ^３はＨｅｐＩＩＩのＯ−３位またはＯ−２位に結合しており；
Ｋｄｏは３−デオキシ−Ｄ−マンノ−２−オクツロソン酸である〕
を有する保存されたトリヘプトシル内部コア部分から本質的になるリポ多糖部分を製造する方法が提供され、該方法は、
−ｌｐｓＡ、ｌｉｃ１、ｌｉｃ２、ｌｉｃ２Ａ、ｌｉｃ２ｏｒｆ３、ｌｉｃ２Ｂ、ｌｉｃ３Ａ、ｌｇｔＣ、ｌｇｔＤおよびｌｇｔＦからなる群から選択される１以上の不活性化された遺伝子で、インフルエンザ菌株を形質転換すること；
−形質転換されたインフルエンザ菌株を、前記リポ多糖部分の発現に適した条件下で培養すること；
−前記リポ多糖部分を単離すること；ならびに
−前記リポ多糖部分のリピドＡ部分を解毒すること
を含んでなる。

他の態様によれば、本発明により、インフルエンザ菌に対する機能性交差反応性抗体を誘導するための、本明細書に記載のいずれかのリポ多糖部分を含んでなる少なくとも一つの免疫原性エピトープの使用が提供される。
他の態様によれば、本発明により、インフルエンザ菌との交差反応性を有し、かつ本明細書に記載のいずれかのリポ多糖部分によって誘導される機能性抗体が提供される。
他の態様によれば、本発明により、インフルエンザ菌に対する機能性交差反応性抗体を製造する方法であって、（ａ）上記のいずれかのリポ多糖部分に対する抗体を作製し、（ｂ）複数のインフルエンザ菌株に対して前記抗体を試験し、そして（ｃ）交差反応性を有する抗体を選択することを含んでなる方法が提供される。
他の態様によれば、本発明により、インフルエンザ菌の感染に起因する疾病に対して宿主を免疫化する方法であって、免疫上有効量の上記免疫原組成物を宿主に投与することを含んでなる方法が提供される。

インフルエンザＬＰＳ分子の炭水化物領域は、宿主免疫応答により認識される標的となる。特定のオリゴ糖エピトープの発現は、インフルエンザ菌感染の病因に関与することが分かっている。インフルエンザ菌ＬＰＳの生物学的性質および細菌毒性におけるその役割を理解するには、構造の決定が重要である。インフルエンザ菌ＬＰＳは、可変オリゴ糖部分と膜固定リピドＡ成分からなる異種分子混合物を含んでなる(Zamze, S.E., and Moxon, E.R. (1987) J. Gen. Microbiol. 133, 1433-1451)。本明細書に記載の実験をもとに、リン酸化されたケトデオキシオクトン酸残基を介してリピドＡ成分と結合している保存されたトリヘプトシル内部コア部分からなるインフルエンザ菌ＬＰＳの構造モデルを作成した。本発明者らがこれまでに検討した総ての株において、このトリヘプトシル部分は以下の構造要素：
Ｌ−α−Ｄ−Ｈｅｐｐ−（１→２）−Ｌ−α−Ｄ−Ｈｅｐｐ−［β−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→４）］−（１→３）−Ｌ−α−Ｄ−Ｈｅｐｐ−（１→５）−Ｋｄｏ
から構成されていた。さらに、本発明者らがこれまでに検討した総ての株では、この１，２−結合したヘプトース残基（ＨｅｐII）は、６位においてホスホエタノールアミン部分で置換されている。

内部コア領域内のヘプトース残基の各々は、ヘキソース含有オリゴ糖鎖の伸長または非炭水化物置換基の結合のための部位となりうる。公表されているデータ(Masoud et al., Biochem. 36: 2091-2103, 1997; Risberg et al-, Eur. J. Biochem. 261: 171-180, 1999）によれば、この保存された内部コア部分の末端のヘプトース残基（ＨｅｐIII）がＯ−２位でβ−Ｄ−Ｇｌｃｐ残基またはβ−Ｄ−Ｇａｌｐ残基により置換されうることが示されている。また、ＨｅｐIIも置換されることがあり、特に、その３位においてα−Ｄ−グルコース残基または置換されたα−Ｄ−グルコース残基によって置換されることがある。隣接ヘプトース残基（ＨｅｐI）と１，４−結合しているβ−Ｄ−グルコース残基は、それ自体、β−Ｄ−グルコース、β−Ｄ−ガラクトース、ヘプトース（例えば、Ｌ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトースおよびＤ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトースなど）またはこれらのオリゴ糖により、さらに置換されることがある。これらの糖残基の他、オリゴ糖鎖伸長部はβ−Ｄ−ガラクトース、β−Ｄ−グルコサミン、β−Ｄ−ガラクトサミン、および５−Ｎ−アセチルノイライミン酸(acetlyneuraminic acid)（シアル酸）を含むこともある。

ｂ型ＲＭ７００４株の所定の変異体(Schweda, E.K.M., Hegedus, O.E., Borrelli, S., Lindberg, A.A., Weiser, J.W., Maskell, D.J., and Moxon, E.R. (1993) Carbohydr. Res. 246, 319-330; Schweda, E.K.H., Jansson, P.-E., Moxon, E.R., and Lindberg, A.A. (1995) Carbohydr. Res. 272, 213-224)では、ｂ型ＲＭ１１８株由来の形質転換変異体(Risberg, A-., Schweda, E.K.H., and Jansson, P.-E. (1997) Eur. J. Biochem. 243, 701-707; Risberg, A., Alvelius, G., and Schweda, E.K.H. (1999) Eur. J. Biochem. 265, 1067-1074), およびｂ型Ａ２株のトランスポゾン変異体(Phillips, N.J., McLaughlin, R., Miller, T.J., Apicella, M.A., and Gibson, B.W. (1996) Biochem. 35, 5937-5947) 、に由来するＬＰＳの詳細な構造研究により、インフルエンザ菌ＬＰＳに共通するヘプトース含有三糖内部コア部分が存在するというさらなる証拠が提示されている。本発明者ら(Risberg et al., Eur. J. Biochem. 261:171-180, 1999)は、インフルエンザ菌株ＲＭ１１８(Risberg, A.,Masoud,.H.,.Martin,..'A.';..Richards, J.C., Moxon, E.R., and Schweda, E.K.H. (1999) Eur. J. Biochem. 261,171-180)、完全なゲノム配列が決定されている株（Ｒｄ）(Fleischmann, R.D., Adams,. M.D., White, O., Clayton, R.A., Kirkness, E.F., Kerlavage, A.R., Butt, C.J, -Tomb, J-F., Dougherty, B.A., Merrick, J.M., McKenney, K., Sutton, G., FitzHugh, W., Fields, C., Gocayne, J.D., Scott, J.,Shirley, R., Liu, L- I., Glodek, A., Kelley, J.M., Weidman, J.F., Phillips, C.A., Sprigs, T., Hedblom, E., Cotton, M.D., Utterback, T.R., Hanna, M.C., Nguyen, D.T., Saudek, D.M., Brandon, R.C., Fine, L.D., Fritchman, J.L., Fuhrmann, J.L., Geoghagen, N.S.M., Gnehm, C.L., McDonald, L.A., Small, K.V., Fraser, C.M., Smith, H.O., and Venter, J.G. (1995) Science 269, 496-512)に由来する、グロボテトラオース（β−Ｄ−ＧａｌｐＮＡｃ−（１→３）−α−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→４）−β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→４）−β−Ｄ−Ｇｌｃｐ）含有ＬＰＳの構造を報告している。この研究では、３つの主要なＬＰＳグリコフォーム集団が同定され、これらは総てＫｄｏ部分と結合しているＨｅｐ（ＨｅｐI）のＰＣｈｏ→６）−β−Ｄ−Ｇｌｃｐ基を含んでいたが、内部コア成分の末端Ｈｅｐ（ＨｅｐIII）のオリゴ糖鎖の長さは異なっていた。組立の完全なグロボテトラオース側鎖を発現するＬＰＳのグリコフォームの他、グロボシド（α−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→４）−β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→４）−β−Ｄ−Ｇｌｃｐ）およびラクトース（β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→４）−β−Ｄ−Ｇｌｃｐ）を含む、順次末端切断されたグリコフォームも同定された(Risberg, A., Masoud, H., Martin, A., Richards, J.C., Moxon, E.R., and Schweda, E.K.H. (1999) Eur. J. Biochem. 261, 171-180)。

実施例に記載のように、本発明者らは、構造フィンガープリント法を用い、インフルエンザ菌株ＲＭ１１８のＬＰＳ生合成遺伝子の一連の規定された変異体から得られたＬＰＳの構造を決定し、比較した（ＲＭ１１８株についての説明はRisberg et al., 1999, 上記を参照）。特定の遺伝子を不活性化した株に由来するＬＰＳを調べることにより、本発明者らは、ＬＰＳ分子の内部コア領域の生合成に関与するグリコシルトランスフェラーゼの同定につながる決定的な証拠を提示する。本発明者らはまた、さらに後述するように、シアリル化ラクトース側鎖の構築に関与する遺伝子も同定した。さらにまた、それぞれグロボトリオース構造およびグロボテトラオース構造を与えるためのα−２，３−結合Ｎｅｕ５Ａｃ（ｌｉｃ３Ａ）、α−１，４−結合Ｇａｌｐ（ｌｇｔＣ）およびβ−１，３−結合ＧａｌｐＮＡｃ（ｌｇｔＤ）の付加に関与する遺伝子のトランスフェラーゼ機能を、合成アクセプターを用いた酵素アッセイにより明確に決定した。これはインフルエンザ菌株のＬＰＳオリゴ糖部分の生合成に関する遺伝的青写真を特定するはじめての研究である。

これらの結果は、ｌｐｓＡ遺伝子の産物がＨｅｐIIIからのオリゴ糖鎖伸長の制御において一定の役割を果たしていることを示す。ｌｐｓＡ遺伝子の突然変異により、ＨｅｐIIIのオリゴ糖鎖伸長部を欠いている末端切断型ＬＰＳがもたらされる。ＲＭ１１８ｌｐｓＡに由来するＯ−脱アシル化ＬＰＳのＥＳＩ−ＭＳ分析では、主なＬＰＳ種（構造２）としての単一のヘキソース残基を含むＰｃｈｏ含有グリコフォームを示し、これにより、ＨｅｐIは、ＨｅｐIIIからのヘキソース伸長がなくとも置換可能であることが確認された。機能的ｌｐｓＡ遺伝子を含むｌｉｃ２Ａ、ｌｇｃＣおよびｌｇｃＤ変異体は、β−Ｄ−Ｇｌｃｐ残基を１，２−結合で付加してＨｅｐIIIからの鎖の伸長を開始させることができる（表４）。ｌｐｓＡは、パスツレラ・ヘモリチカ(Pasteurella haemolytica)のグリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の相同体であり(Potter, M.D. and Lo, R.Y. (1995) FEMS Microbiol. Lett. 129, 75-81)、このタンパク質はそれぞれヘモフィルス属およびナイセリア属のＬｉｃ２ＡおよびＬｇｔＢに分類されるガラクトシルトランスフェラーゼ群と相同性を有する。ＲＭ１５３株では、ｌｐｓＡ変異体由来のＬＰＳが第三のヘプトースからの鎖の伸長を欠いていることも分かった(Hood, D.W., Deadman, M.E., Allen, T., Masoud, H., Martin, A., Brisson, J.R., Fleischmann, R., Venter, J.C., Richards, J.C., and Moxon, E.R. (1996) Mol. Microbiol. 22, 951-965)。さらに、本発明者らは、数種のＮＴＨｉ株におけるＬｐｓＡ変異体がＨｅｐIIIからの鎖の伸長を欠いていることを確認した。このように、ＬｐｓＡはインフルエンザ菌ＬＰＳの生合成においてＨｅｐIIIに最初の糖を付加するためのトランスフェラーゼである。

ＲＭ１１８ｌｉｃ２Ａ変異体は主要なＬＰＳ種としてのＰｃｈｏ含有Ｈｅｘ２グリコフォーム（構造４；表１）を示し、機能的ｌｉｃ２Ａ遺伝子を含むＲＭ１１８ｌｇｔＣはＨｅｐIIIにラクトース側鎖を含むＬＰＳ（構造５；表１）を合成する。このことは、ＨｅｐIIIに結合している末端β−Ｄ−Ｇｌｃｐ残基へβ−Ｄ−Ｇａｌｐ単位を１，４結合で付加することに対するｌｉｃ２Ａ遺伝子の関与と一致する。ｂ型株、ＲＭ１５３およびＲＭ７００４のｌｉｃ２Ａ相同体は、ジガラクトシド含有Ｐ^Ｋエピトープ（構造α−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→４）−β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→４）−β−Ｄ−Ｇｌｃｐを有するグロボシド三糖）の発現に関与することが示されている。このエピトープの相変異発現におけるｌｉｃ２Ａの役割が既に実証されている(High, N.J., Deadman, M.E., and-Moxon, E.R. (1993) Mol. Microbiol. 9,1275-1282)。他のデータバンクの配列との相同性比較によれば、Ｌｉｃ２Ａのβ−ガラクトシルトランスフェラーゼとしての機能が支持される。重要なことは、それがナイセリアのＬｇｔＢおよびＬｇｔＥタンパク質（いずれもガラクトシルトランスフェラーゼ）と有意な相同性を有するということである(Wakarshuk, W., Martin, A., Jennings, M.P., Moxon, E.R., and Richards, J.C. (1996) J.Biol. Chem.271, 19166-1917)。

ｌｇｔＣに変異を有するＲＭ１１８株由来のＬＰＳの構造解析により、この遺伝子のα−ガラクトシルトランスフェラーゼ機能を裏付けるα−Ｄ−Ｇａｌｐの欠損が確認された。髄膜炎菌(N. meningitidis)におけるこの遺伝子の相同体がα−ガラクトシルトランスフェラーゼであることが実証されている(Gotschlich, E.C. (1994) J. Exp. Hed. 180, 2181-2190; White, K.A., and Raetz, C.R.H. (1998) FASEB J. 12, L44; Wakarchuk, W.W., Cunningham, A.M., Watson, D.C., and. Young, N.M. 1998, Role of paired basic residues in the expression of active recombinant galactosyltransferases from the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, Protein Eng. 11: 295-302; Wakarchuk et al.1998, Protein Engineering)。インフルエンザ菌のｌｇｔＣは、ちょうどリーディングフレーム（４４）の５’末端内に会合したテトラヌクレオチドリピート（５’−ＧＡＣＡ−３’）を有することから、ＲＭ１１８ＬＰＳにおけるオリゴ糖の変異表現型に関与している。これに対応して、機能的ｌｇｔＣ遺伝子を含むｌｇｔＤ変異体およびその親株は、ラクトースエピトープの末端β−Ｄ−Ｇａｌｐに１，４結合でα−Ｄ−Ｇａｌｐを付加することができる（構造６；表１）。ＬｇｔＣの機能は、組換え型ＬｇｔＣタンパク質と合成ＦＣＨＡＳＥ−Ｌａｃアクセプターを用いてα−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を実証することにより確認されている。その結果、ｌｇｔＣ遺伝子は、ＲＭ１１８Ｈｅｘ４ＬＰＳグリコフォームのα−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→４）−β−Ｄ−Ｇａｌｐ合成の特異的α−ガラクトシルトランスフェラーゼをコードすることになる。

インフルエンザ菌ｌｇｔＤ遺伝子は、２つのナイセリア遺伝子、ｌｇｔＡおよびｌｇｔＤの相同体であり、これらのナイセリア遺伝子は淋菌(N. gonorrhoeae)ＬＰＳにそれぞれＧｌｃＮＡｃおよびＧａｌＮＡｃを付加する(Gotschlich, E.C. (1994) J. Exp. Med. 180, 2181-2190)。ｌｇｔＡ遺伝子産物は髄膜炎菌のグリコシルトランスフェラーゼであることが実証されている(Wakarchuk, W., Martin, A., Jennings, M.P., Moxon, E.R., and Richards, J.C. (1996) J. Biol. Chem. 271, 19166-1917)。ナイセリアのｌｇｔＡとｌｇｔＤ遺伝子間には有意な相同性があり、ＲＭ１１８ＨＩ１５７８はデータベースにおいて淋菌のｌｇｔＤ遺伝子と最良の一致を示す。ＲＭ１１８およびＲＭ１１８ｌｇｔＤ変異体の抽出物を用いた酵素アッセイでは、β−Ｄ−ＧａｌｐＮＡｃトランスフェラーゼ活性の存在が確認された。機能的ｌｇｔＤを含む親株ＲＭ１１８は完全なグロボテトラオース単位を合成することができ、このことは末端β−Ｄ−ＧａｌｐＮＡｃの付加におけるその役割を示している。このｌｇｔＤ遺伝子はこれまでにも研究されているが（６ではｌｇｔＡと呼ばれる）、ｂ型株ＲＭ１５３およびＲＭ７００４に存在するということは見出されていない。これに対応して、ＲＭ１５３株によって合成されるＬＰＳはＧａｌＮＡｃ部分を含まない(Masoud, H., Moxon, E.R., Martin, A., Krajcarski, D., and Richars, J.C. (1996) Biochem. 36, 2091-2103)。多くのＮＴＨｉ株はＬｇｔＤ遺伝子を含むことが分かっており、これらの株のＬＰＳオリゴ糖側鎖はＧａｌＮＡｃ部分を含むことが分かっている。

ＲＭ１１８ＬＰＳ生合成の研究に利用できる最初の遺伝子セットおよび変異株を特定しても、ＨｅｐIへのβ−Ｄ−Ｇｌｃｐ単位の付加を担う明らかな候補は得られなかった。他の生物のＬＰＳにおいてヘプトース残基にヘキソース糖を付加する遺伝子との相同性の低い一致についても、Ｒｄ株ゲノム配列を検索することによりさらなる候補ＬＰＳ遺伝子を調べた。検索配列は、ヘプトースへのヘキソース残基の付加に関与する遺伝子であるナイセリア属のｒｆａＫおよびｌｇｔＦ遺伝子(Kahler, C.M., Carlson, R.W., Rahman, M.M., Martin, L.E., and Stephens, D.S. (1996) J. Bacteriol. 178, 6677-6684)を含むものとした。ＲＭ１１８株でｌｇｔＦ相同体が確認され、この遺伝子に変異を有する株由来のＬＰＳの分析により、ＨｅｐIからの鎖の伸長におけるＬｇｔＦの役割が示された。ＥＳＩ−ＭＳでは、ＨｅｐIにおいてＰｃｈｏ→６）−β−Ｄ−Ｇｌｃｐを欠き、トリヘプトシル内部コア部分のＨｅｐIIIからの鎖伸長を有するグリコフォームの混合物に相当する分子イオンが示された（図６）。

ｌｇｔＦおよびｌｐｓＡ遺伝子はＲＭ１１８ＬＰＳのヘプトース含有内部コア単位からのヘキソース伸長にとって重要なものであり、それぞれＨｅｐIおよびＨｅｐIIIへの最初のグリコースの付加を担うグリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする。ＨｅｐIおよびＨｅｐIIIからの鎖伸長のプロセスは、ＲＭ１１８株のＬＰＳにおいて大きく独立したものであるようである。変異株ＲＭ１１８ｌｐｓＡは、ＨｅｐI由来のβ−Ｄ−Ｇｌｃｐ部分を含むＬＰＳを産生する。ＲＭ１１８ｌｇｔＦ株は、ラクトースおよびグロボテトラオース鎖を含むＨｅｐIIIからのオリゴ糖伸長を含む不均質なＬＰＳを産生する。ＲＭ１５３株では、ｌｐｓＡは明らかに第三のヘプトースから単一の伸長部としてガラクトースの付加を担う若干異なる役割を果たす(Hood, D.W., Deadman, M.E., Allen, T., Masoud, H., Martin, A.,Brisson, J.R., Fleischmann, R., Venter, J.C., Richards, J.C., and Moxon, E.R. (1996) Mol. Microbiol. 22, 951-965)。驚くべきことに、ある種の非定型株ではｌｐｓＡはＯ−２位の代わりにＯ−３位でグルコースまたはガラクトースのいずれかを付加しうることが判明した。

インフルエンザ菌のＬＰＳ構造の不均質性は、部分的には、総ての分子が完全に合成されるわけではないという複雑な構造の生合成における固有の多様性によるものに違いない。しかし、認められた多様性の多くは、発現が変動しうる（相変異）特定のＬＰＳ生合成遺伝子によるものであると思われる。野生型および変異型ＲＭ１１８株由来のＬＰＳの構造解析により、本発明者らは、はじめてインフルエンザ菌ＬＰＳジガラクトシドの重要な相変異型エピトープの合成に関与する遺伝子を確認することができた。ＲＭ１１８株では、Ｌｉｃ２ＡがＨｅｐIIIからのオリゴ糖伸長部分としてのジガラクトシド（α−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→４）−β−Ｄ−Ｇａｌｐ）へ隣接β−Ｄ−Ｇａｌｐを、ＬｇｔＣは末端α−Ｄ−Ｇａｌｐを付加するが、ｂ型ＲＭ１５３株ではこの同じエピトープが第二のヘプトースからの末端伸長として発現する(Masoud, H., Moxon, E.R., Martin, A., Krajcarski, D., and Richards, J.C. (1996) Biochem. 36, 2091-2103)。ｌｉｃ２ＡおよびｌｇｔＣはいずれも相変異性遺伝子であり、生物内および生物間で極めて変化に富んだエピトープを発現させる。ジガラクトシドエピトープは、本明細書に開示されるＮＴＨｉ株の多くのＬＰＳにおいて、また、ナイセリア属をはじめとする関連の細菌において発現する(Virji, M., Weiser, J.N., Lindberg, A.A., and Moxon, E.R. (1990) Microb. Pathogen. 9, 441-450)。このエピトープは、免疫優性である可能性があり、その存在は宿主構造の分子模倣の可能性を与え、実験系においてインフルエンザ菌の生存に影響を及ぼしうることから、病因論上興味深いことである(Weiser, J.N., and Pan, N. (1998) Mol. Microbiol. 30, 767-775; Hood, D.W., Deadman, M.E., Jennings, M.P., Bisceric, M., Fleischmann, R.D., Venter, J.C., and Moxon, E.R. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 9
3, 11121-11125)。

シアリル化されたオリゴ糖は哺乳類組織でよく見られることから、オリゴ糖のシアリル化はヒト組織構造の模倣性を高めるものと考えられている修飾の一つである。実施例に記載のように、本発明者らは、ＮＴＨｉ３７５株、４８６株およびＲＤ株においてシアリル化されたＬＰＳを確認し、ＬＰＳ合成におけるｌｉｃ３Ａの役割を解明した(D.W. Hood et al., Mol. Microbiol. 39:341-350, 2001)。種の多様性の代表的なものとして２５株のＮＴＨｉを調べたところ、一つを除いて総てがシアリル化されたＬＰＳオリゴ糖鎖伸長と確認された。ＮＴＨｉ４８６などのいくつかのＮＴＨｉ株におけるｌｉｃ３Ａの突然変異は、正常なヒト血清の殺菌作用への耐性に大きな影響を持つことが実証されている。ＮＴＨｉ４８６とそのｌｉｃ３Ａ変異体に由来するＬＰＳ構造の比較からはシアリル化グリコフォーム（シアリル−ラクトース）が親株にしか存在しないことが明らかとなり、このことは、この株における血清耐性にとってのＬｉｃ３Ａの重要性を示している。インフルエンザ菌におけるＬＰＳへの荷電シアル酸残基の付加は、ＬＰＳエピトープの抗原模倣を調節するものと思われる。

図７は、同定されたインフルエンザ菌ＲｄにおけるＬＰＳの主要なグロボテトラオース含有オリゴ糖の生合成に関与する遺伝子をまとめたものである。本発明者らは、ＨｅｐI（ｌｇｔＦ）およびＨｅｐIII（ｌｐｓＡ）からの鎖伸長を担う遺伝子を同定した。さらに、インフルエンザ菌のいくつかの株（例えば、ＥａｇａｎおよびＲＭ７００４）は、ＨｅｐIIからの鎖伸長を示しうるＬＰＳを合成する。本発明者らは、ｌｉｃ２遺伝子座にある遺伝子（ｏｒｆ３）がＨｅｐIIからの鎖伸長を開始させることを示した。これらの遺伝子の示差的な発現は、保存されたトリヘプトシル内部コア部分から発する多様な可変オリゴ糖エピトープをもたらしうる。これらの遺伝子の所定の突然変異によって、本発明者らは、特定のインフルエンザ菌株が表す複雑性の程度のみならず、結果として生じるＬＰＳのコア領域で利用できるエピトープも制御することができる。このように、その生合成機構に所定の突然変異を有するインフルエンザ菌株のＬＰＳにより、ＬＰＳを基にした広域ワクチンを開発するための好適な候補が提供された。本発明者らは、これまでにＬＰＳの変異性を示してワクチン開発を阻んでいた非定型株を含む種々の病原インフルエンザ菌株に対して交差反応性をもたらすことから、この手法がワクチンの設計に有用であるものと判断した。

ＮＴＨｉ株コレクションからのＬＰＳの遺伝解析および表現型解析に基づき、本発明者らははじめて、Ｏ−２の代わりにＨｅｐIIIのＯ−３から鎖が伸長しているもう一つの内部コア構造を有するＬＰＳを発現するインフルエンザ菌株を確認した。相同なｌｐｓＡ遺伝子は、株によって異なるが、ＨｅｐIIIのＯ−２またはＯ−３位へのβ−Ｄ−Ｇａｌまたはβ−Ｄ−Ｇｌｃの特異的付加を媒介する。さらに、ＨｅｐIIIがオリゴ糖鎖によって置換されていないＬＰＳを発現するインフルエンザ菌株もいくつかある。これらの発見は実施例で詳細に示す。

実施例の結果により、ＮＴＨｉに保存された内部コア成分が存在することが確認される。これらの結果はまた、新たな構造モチーフ、すなわちＨｅｐIII上の別の置換部位の証拠をはじめて提供するものである。ＨｅｐIIIはＯ−２位のヘキソース残基により置換されていることは早くに分かっており、ＮＴＨｉ、例えば２８５株および１１５８株の場合にそうであることが分かっている。他のＮＴＨｉ株、例えば１７６株および４８６株では、この置換パターンは見られていない。これに対し、ＨｅｐIIIのＯ−３位において置換が見られる。驚くべきことに、ｌｐｓＡ遺伝子は、いくつかの株ではβ−Ｄ−Ｇｌｃｐを（ＲＤ株、図９）、あるいは他の株では（−Ｄ−Ｇａｌｐを（ｂ型、例えばＥａｇａｎ株）、１，２−結合で付加してＨｅｐIIIから鎖伸長を開始させうることが示された。本発明者らは、ｌｐｓＡの相同体が、ＨｅｐIIIへのβ−Ｄ−Ｇｌｃｐ残基またはβ−Ｄ−Ｇａｌｐ残基の１，３−結合での付加を担うことを見出した。

内部コア領域の他の有用な修飾は、ＰＣｈｏエピトープに関するものである。これはインフルエンザ菌をはじめとするヒト気道に存在する病原体の表面構造の一般的な特徴である。インフルエンザ菌Ｒｄ株では、ＰＣｈｏはＨｅｐIの末端β−Ｄ−Ｇｌｃｐ残基のＯ−６と結合している（ＰＣｈｏ→６）−β−Ｄ−Ｇｌｃｐ）。他のインフルエンザ菌株、例えばｂ型株Ｅａｇａｎでは、ＰＣｈｏはＨｅｐIIIの末端β−Ｄ−Ｇａｌｐ残基のＯ−６と結合している（ＰＣｈｏ→６）−β−Ｄ−Ｇａｌｐ）(E.K.H. Schweda et al. Eur. J. Biochem., 267 (2000) 3902-3913)。これらの置換パターンはいずれもＮＴＨｉ株で見出されている。さらに、ＰＣｈｏは末端α−Ｄ−Ｇｌｃｐ残基でも見出された（ＰＣｈｏ→６）−α−Ｄ−Ｇｌｃｐ）。インフルエンザ菌ＬＰＳにおけるＰＣｈｏエピトープの発現および相変異には、ｌｉｃ１遺伝子座の４つの遺伝子が必要である(J.N. Weiser et al. Infec. Immun., 65 (1997) 943-950)。これらの遺伝子は、検討した総てのＮＴＨｉ株で認められた。本発明者らは、ｌｉｃＤ遺伝子の多形性がＰＣｈｏが付加される部位に影響することを突きとめた。

トリヘプトシル内部コア部分に対する置換パターンの性質は、内部コアエピトープが免疫系に提示され、モノクローナル抗体によって認識される方法と関連がある。例えば、本発明者らは、ネズミＩｇＧ２ａモノクローナル抗体（Ｌ６Ａ９）がＨｅｐIIIのＯ−２にβ−Ｄ−Ｇａｌｐ残基を含む株のＬＰＳ内部コアオリゴ糖エピトープを認識するが、β−Ｄ−Ｇａｌｐ残基が存在しないか、あるいはＯ−３位に結合している場合には認識しないことを見出している。高分子量型の構造確認図は図１に示されている。

上述のように、インフルエンザ菌ＬＰＳ発現に関与する重要な生合成遺伝子が同定された。これにより、本発明者らは、保存された内部コア部分を含むが、ヒト組織構造を模倣するオリゴ糖伸長部を含まないインフルエンザ菌変異株を構築することができるようになった。実施例はこの方法の結果を示している。

本発明者らは、当業者に公知の方法（Guの特許、上記）を用いて、例えばタンパク質結合体として製剤化することにより、インフルエンザ菌ＬＰＳの保存されたトリヘプトシル内部コア部分を含むオリゴ糖は免疫原性を示すことを見出した。例えば、本発明者らは、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と結合させたＨｉ株Ｒｄｌｉｃ１ｌｐｓＡのＯ−脱アシル化ＬＰＳからなるオリゴ糖−タンパク質結合体をマウスに感作させると、遺伝的に多様なＮＴＨｉ株のセットに由来するＬＰＳサンプルの多数と交差反応性のある免疫血清が生じることを示した（表３）。ＬＰＳのＯ−脱アシル化は無水ヒドラジンを用いて達成される。これには、次のタンパク質とのコンジュゲーション反応のためにＬＰＳオリゴ糖を可溶化する作用があり、リピドＡ成分の著しい解毒をもたらす（Guの特許、上記）。このＯ−脱アシル化ＬＰＳは、当業者に公知の方法（Guの特許、上記）に従い、Ｋｄｏ部分のカルボキシル基を介して結合する。最後に、マウスにＨｉ株１００３ｌｉｃ１ｌｐｓＡのＯ−脱アシル化ＬＰＳを腹腔内追加投与した（実施例参照）。この実験で得られたマウス免疫血清は、内部コアからの複数の鎖伸長を有するＮＴＨｉ株由来のＬＰＳと反応した。

Ｒｄｌｉｃ１ｌｐｓＡＬＰＳは、保存されたトリヘプトシル内部コア部分の典型となるＬＰＳを生産し、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）含有オリゴ糖鎖伸長を有する少量のグリコフォームを含む。このことは、ＬＬＡ５との反応性から明らかである（表４）。Ｒｄｌｉｃ１ｌｐｓＡＯ−脱アシル化ＬＰＳ−ＢＳＡ結合体はまた、ＭａｂＬＬＡ５ならびに内部コアＭａｂ、ＬＬＡ４との反応性も示した。ＮＴＨｉ株１００３はＬＮｎＴを含むオリゴ糖鎖を有するＬＰＳを合成しない。本発明者らは、構造解析、遺伝解析および免疫化学分析によってこのことを突きとめた。この株のＬＰＳはＬＬＡ５とは反応せず、ｒｆｂ遺伝子座を含まない。二重突然変異１００３ｌｉｃ１ｌｐｓＡは、鎖伸長のない保存された内部コア部分を有するＬＰＳを発現する。これはＭａｂＬＬＡ４によって認識される。

本発明による結合ワクチンは、可溶形態であっても微粒子形態であってもよく、あるいはリポソームなどのマイクロスフェアまたはマイクロ小胞中に配合してもよい。例えば、筋肉内、皮下、腹腔内および動脈内をはじめ、種々のワクチン投与経路が考えられるが、好ましい経路は筋肉内投与である。好ましい実施態様によれば、投与する結合体の用量は約１０μｇ〜約５０μｇの範囲である。より好ましい実施態様によれば、投与する量は約２０μｇ〜約４０μｇの間である。最も好ましい実施態様によれば、投与する量は約２５μｇである。体重をもとにそれ以上の用量を投与してもよい。厳密な用量は、当業者に公知の通常の用量／応答プロトコールによって決定することができる。

本発明によるワクチンは、いずれの齢の温血哺乳類に投与してもよく、幼哺乳類、特にヒトにおいてＮＴＨｉにより引き起こされる中耳炎および呼吸器感染症に対して能動免疫を誘導するように適合させてある。小児用ワクチンとしては、本結合体を約２〜４ヶ月齢で投与する。典型的には、最初の注射から約２ヶ月、さらに約１３ヶ月後に約１０μｇ〜約２５μｇの２回の追加注射を行う。あるいは、最初の注射から２ヶ月、４ヶ月および１６ヶ月後に３回の追加注射を行う。

実施例はＮＴＨｉＲｄｌｉｃ１ｌｐｓＡを用いた結合ワクチンについて記載している。他のＮＴＨｉ株からのワクチンも本発明の範囲内にあり、同じ技術を用いて製造される。ＮＴＨｉ株Ｒｄｌｉｃ１ｌｐｓＡ。ｄＬＰＳ−担体結合ワクチンの製造のためのｄＬＰＳの供給源として考えられる他の臨床関連のＮＴＨｉ株としては、９２７４、２０１９、１４７９、５６７５および７５０２株（それぞれIII型、II型、I型、IＶ型およびＶ型）、ならびに本明細書に記載のFinnish Collecitonからの株が挙げられる。これらの株ならびに２０１９株は、Campagnari et al. (Infect.,Immun., 55:882-887, 1987)およびPatrick et al. (Infect Immun., 55:2902-2911, 1987), and Hood et al. (Mol. Microbiol 33:679-692, 1999により報告されており、通常は研究機関から入手することができる。

陽イオン脂質もまた当技術分野で知られている。かかる脂質としては、ＤＯＴＭＡ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）としても知られてるリポフェクチン（商標）、ＤＯＴＡＰ（１，２−ビス（オレイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン）、ＤＤＡＢ（ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド）、ＤＯＧＳ（ジオクタデシルアミドログリシルスペルミン）、およびＤＣ−Ｃｈｏｌ（３−β−（Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノメタン）−カルバモイル）コレステロール）などのコレステロール誘導体が挙げられる。これらの陽イオン脂質についての説明は、ＥＰ１８７，７０２、ＷＯ９０／１１０９２、米国特許第５，２８３，１８５号明細書、ＷＯ９１／１５５０１、ＷＯ９５／２６３５６および米国特許第５，５２７，９２８号明細書に見出される。

粘膜および非経口投与の双方に有用なアジュバントとしては、ポリホスファゼン（ＷＯ９５／０２４１５）、ＤＣ−Ｃｈｏｌ（３β−（Ｎ−（Ｎ’−Ｎ’−ジメチルアミノメタン）−カルバモイル）コレステロール（米国特許第５，２８３，１８５号明細書およびＷＯ９６／１４８３１）およびＱＳ−２１（ＷＯ８８／０９３３６）が挙げられる。

リポ多糖を含有する本発明による医薬組成物または本発明による抗体はいずれも、常法にて製造される。特に、医薬上許容される希釈剤または担体、例えば、水またはリン酸緩衝生理食塩水などの生理食塩水を用いて製剤化する。一般に、希釈剤または担体は、投与様式および投与経路、ならびに標準的な製薬上の運用に基づいて選択される。好適な医薬担体または希釈剤、ならびに医薬製剤におけるそれらの使用に関する医薬上の必要条件は、この分野およびＵＳＰ／ＮＦ（National Formulary）における標準的な教本であるRemington's Pharmaceutical Sciencesに記載されている。

実施例１
ＨｉＬＰＳ変異株
細菌株および培養条件
インフルエンザ菌Ｒｄ株は、もともと、HerriotによりAlexander and Leidy (Alexander, H.E., andLeidy, G. (1951) J. Exp. Med. 93, 345-359) から入手したものである。H.O. Smithがこれを譲り受け、ＫＷ−２０と名付け、ゲノムシーケンシングプロジェクトに用いた(Fleischmann, R.D., Adams, M.D., White, O., Clayton, R.A., Kirkness, E,F., Kerlavage, A.R., Butt, C.J., Tomb, J-E., Dougherty, B.A., Merrick, J.M., McKenney, K., Sutton, G., FitzHugh, W., Fields, C., Gocayne, J.D., Scott, J., Shirley, R., Liu, L-I., Glodek, A., Kelley, J.M., Weidman, J.F., Phillips, C.A., Spriggs T., Hedblom, E., Cotton, M.D., Utterback, T.R., Hanna, M.C., Nguyen, D.T., Saudek, D.M., Brandon, R.C., Fine, L.D., Fritchman, J.L., Fuhrmann, J.L., Geoghagen, N.S.M., Gnehm, C.L., McDonald, L.A., Small, K.V., Fraser, C.M., Smith, H.O., and Venter, J.C., (1995) Science 269, 496-512)。Smith研究室から入手した同株を本発明者らが用いた（ＲＭ１１８）。この株から得られた変異体の遺伝子型は表２に示されている。インフルエンザ菌株は３７℃にてヘミン１０μｇ／ｍｌおよびＮＡＤ２μｇ／ｍｌを添加した。ブレイン・ハート・インフュージョン（ＢＨＩ）ブロス中で増殖させた。形質転換後の選択に関してはカナマイシン１０μｇ／ｍｌをこの増殖培地に添加した。

大腸菌ＤＨ５α株を用いてクローンニングしたＰＣＲ産物および遺伝子構築物を増やし、３７℃にて、必要に応じてアンピシリン１００μｇ／ｍｌまたはカナマイシン５０μｇ／ｍｌを添加したLuria-Bertani(LB)ブロス中で増殖させた(Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T. (1989) Molecular coloning; A laboratory manual. 2^nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)。

ｌｇｔＦの他、推定されるインフルエンザ菌ＬＰＳ生合成遺伝子をこれまでに報告されているようにクローニングして変異誘発した(Hood, D.W.,'Deadman, M. E., Allen, T., Masoud, H., Martin, A., Brisson, J.R., Fleischmann, R., Venter, J.C., Richards, J.C., and. Moxon, E.R. (1996) Mol. Microbiol. 22,951-965)。ｌｇｔＦ遺伝子については、Ｒｄ株のゲノム配列からオリゴヌクレオチドプライマーｌｇｔＦａ（５’−ＴＧＧＴＧＧＴＧＧＧＣＡＡＧＡＣＧＣ−３’）およびｌｇｔＦｂ（５’−ＡＧＣＣＴＧＡＡＴＴＣＧＡＣＡＧＣＣ−３’）を設計し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりＨＩ０６５３を含む１４６１ｂｐの断片を増幅した。ＰＣＲ条件は、変性９４℃１分、アニーリング５０℃および重合７２℃３０分とした。ＰＣＲ産物の１μｌを５０ｎｇのプラスミドｐＴ７Ｂｌｕｅ(Novagen)と連結し、大腸菌ＤＨ５株へ形質転換した。次に形質転換体から組換えプラスミドを調製し、制限エンドヌクレアーゼ消化およびプラスミド特異的プライマーの配列決定により確認した(Hood, D.W., Deadman, M.E., Allen,T., Masoud, H., Martin, A., Brisson, J.R., Fleischmann, R., Venter, J.C., Richards, J.C., and Moxon, E.R. (1996) Mol. Microbiol. 22, 951-965)。ｌｇｔＦ遺伝子はカナマイシン耐性カセット（ｐＵＣ４Ｋａｎ, Pharmacia由来のＥｃｏＲＩでの消化により遊離させる）をＨＩ０６５３の５’末端から２５７ｂｐ内側のＭｕｎＩ制限部位へ挿入することで不活性し、プラスミドｐＤＱ１を得た。

変異株の構築
変異型ＬＰＳ生合成遺伝子を含む線状プラスミド２〜３μｇを用い、ＭＩＶ法(Herriot, R.M., Meyer,E.M., and Vogt, M.J. (1970) J. Bacteriol. 101, 517-524)によりインフルエンザ菌ＲＭ１１８株を形質転換し、形質転換体をカナマイシンで選択した。ＲＭ１１８ｌｉｃ１株を構築するため、対応するＲＭ１５３変異体から単離した剪断染色体ＤＮＡ５μｇでＲＭ１１８を形質転換した。ＲＭ１１８ｌｉｃ２Ａ株は、ＲＭ１５３ｌｉｃ２Ａから増幅した、ｌｉｃ２Ａおよび隣接する遺伝子ｋｓｇＡを含むＰＣＲ産物１μｇでＲＭ１１８を形質転換することで構築した。ＰＣＲでは上記のような条件下でプライマーＬ２Ａ：５’−ＣＴＣＣＡＴＡＴＴＡＣＡＴＡＡＴ−３’およびＬ２Ｄ：５’−ＡＡＡＣＡＣＴＴＡＧＧＣＣＡＴＡＣＧ−３’を用いた。総ての形質転換体を適当なＢＨＩ／抗生物質プレートで再培養することで確認し、その後エンドヌクレアーゼ消化した染色体ＤＮＡのＰＣＲ増幅および／またはサザンブロッティング／ハイブリダイゼーション解析により変異体としての確認を行った。

リポ多糖の構造フィンガープリンティング
１０Ｌのバッチ培養（１Ｌ１０ロット）からの細胞を一晩増殖させた後に収穫し、ホットフェノール−水法(Westphal, O. and Jann, K. (1965) Meth. Carbohydr. Chem. 5, 83-91)の後に、Thibault, and Richards (Thibault, P. and Richards, J.C. (2000) ????)により記載されているようにエタノール沈殿させることによりＬＰＳを抽出した。ＬＰＳを超遠心分離（１０５０００ｇ、４℃、２×５時間）を繰り返すことで精製し、サンプルをそれらのＯ−脱アシル化誘導体（ＬＰＳ−ＯＨ）として分析した。Ｏ−脱アシル化はこれまでに記載のように(Holst, O., Broer, W., Thomas-Oates, J.E., Mamat, U., and Brade, H. (1993) Eur. J. Biochem. 214, 703-710)、３７℃で１時間、ＬＰＳ（１〜１０ｍｇ）と無水ヒドラジン（０．２〜１．０ｍｌ）とを混合することにより行った。糖類はこれまでに記載のように(Jarosik, G.P., and Hansen, E.J. (1994) Infect. Immun. 62, 4861-4867)、ガス液体クロマトグラフィー−質量分析（ＧＬＣ−ＭＳ）によりそれらの酢酸アルジトールとして同定した。結合分析は室温で２４時間、無水酢酸（０．５ｍｌ）および４−ジメチルアミノピリジン（０．５ｍｇ）でオリゴ糖をアセチル化した後に行った。次にペルアセチル化材料をリチウムメチルスルフィニルメタニドの存在下でジメチルスルホキシド中ヨウ化メチルで処理してメチル化オリゴ糖を得、これをＳｅｐＰａｋ^ＴＭＣ１８カートリッジを用いて回収し、糖分席を行った (Blakeney, A.B. and Stone, B.A. (1985) Coabohydr. Res. 140, 319-324)。糖およびメチル化分析で得られた種々の酢酸アルジトールと部分的メチル化酢酸アルジトールの相対的割合をＧＬＣ−ＭＳの検出器の応答から測定し、補正は行わなかった。ＧＬＣ−ＭＳはＮＥＲＭＡＧＲ１０−１０Ｈ^ＴＭ四極質量分析計またはＶａｒｉａｎＩｎｏｎｔｒａｐ^ＴＭシステムを備えたＤｅｌｓｉＤｉ２００^ＴＭクロマトグラフにて、ＤＢ−５融合シリカキャピラリーカラム（２５ｍ×０．２５ｍｍ×０．２５μｍ）および１６０℃１分、３℃／分にて２５０℃までの温度勾配を用いて行った。エレクトロスプレーイオン化−質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）はＶＧＱｕａｔｔｒｏ^ＴＭ質量分析計(Micromass, Manchester, UK)の陰イオンモードで行った。サンプルを水に溶解した後、１％酢酸を含有する５０％アセトニトリル水溶液と１：１の比率で混合した。サンプル溶液をシリンジポンプから流速５μＬ／分のＨ_２Ｏ：ＣＨ_３ＣＮ（１：１）の移動相にインジェクトした。１Ｄ ^１ＨＮＭＲスペクトルは、Ｄ_２Ｏで数回凍結乾燥させた後、ＢｒｕｋｅｒＡＭＸ５００^ＴＭ分光光度計にて、酸化ジューテリウム溶液について２２℃、５００ＭＨｚで記録した。スペクトル分解能を高めるため、Ｄ_２Ｏ溶液にペルジューテロ−ＥＤＴＡ（２ｍＭ）およびペルジューテロ−ＳＤＳ（１０ｍｇ／ｍｌ）を加えた(Risberg, A., Schweda, E.K.H., and Jansson, P.-E. (1997) Eur. J. Biochem. 243, 701-707)。内部アセトンのメチルプロトン共鳴（δ：２．２２５ｐｐｍ）に対する化学シフトを調べた。

ＬｇｔＣおよびＬｇｔＤからの酵素活性の分析
ｌｇｔＤにコードされている酵素を、生成物の検出にキャピラリー電気泳動を用い、合成アクセプターＦＣＨＡＳＥ−Ｐ^ｋでアッセイした。キャピラリー電気泳動は実質的にこれまでに記載のようにして行った(Wakarchuk, W., Martin, A., Jennings, M.P., Moxon, E.R., and Richards, J.C. (1996) J. Biol. Chem. 271,19166-1917)。ＦＣＨＡＳＥ−Ｐ^ｋはこれまでに記載のように(Wakarchuk, W.W., et al., Protein Eng. 11: 295-302, 1998)、髄膜炎菌ＬｇｔＣ酵素を用いてＦＣＨＡＳＥ−Ｌａｃから合成した。反応条件は０．５ｍＭアクセプター、１ｍＭＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ、５０ｍＭＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨｐＨ７．０、１０ｍＭＭｇＣｌ_２、１０ｍＭＭｎＣｌ_２とした。抽出は、細胞を音波処理した後、１００，０００×ｇ３０分間の遠心分離により膜画分を回収することで行った。ＲＭ１１８および変異体ＲＭ１１８：ｌｇｔＤの双方を分析した。少量の生成物をこれまでに記載のように(Wakarchuk, W., Martin,. A., Jennings, M.P., Moxon, E.R., and Richards, J.C. (1996) J. Biol. Chem. 271, 19166-1917)、ＴＬＣにより単離した。生成物への変換が少ないことから、いくらかの出発材料もそれとともに単離された。回収した混合物を二等分した後、酵素供給者（ＮＥＢ）が奨励するようにβ−ヘキソサミニダーゼで処理した。ＬｇｔＤの産物はβ−ヘキソサミニダーゼ消化によりβ−アノマー特異性を有することが示された。

変異株の構築およびスクリーニング
上記のように作製した変異体セットを用い、完全なゲノム配列が得られている指標株であるインフルエンザ菌ＲＭ１１８株のＬＰＤＳのオリゴ糖部分の生合成の遺伝的基礎を詳細に調べた。表２は発明者らが調べた遺伝子の一覧である。これら遺伝子の大部分を変異させるために用いたＤＮＡ構築物はこれまでに報告されている(Hood,. D.W., Deadman, M.E., Allen, T., Masoud, H., Martin, A., Brisson,J.R., Fleischmann, R., Venter, J.C., Richards, J.C., and Moxon, E.R. (1996) Mol. Microbiol. 22, 951-965)。各構築物は推定ＬＰＳ遺伝子が推定されるリーディングフレームの５’末端（１／３）内に挿入されたカナマイシン耐性遺伝子とともにクローニングされているプラスミドベクターからなった。最初のヘプトース（ＨｅｐI）にグルコースを付加することを担う明らかな候補遺伝子は見られなかった。Ｒｄゲノム配列データベースをナイセリア属由来のｌｇｔＦ配列を用いて検索したことろリーディングフレームＨＩ０６５３に対して一致が認められた（２４７個のアミノ酸にわたって３１％の同一性）。ｌｇｔＦはＲＭ１１８およびＲＭ１５３株の染色体ＤＮＡからＰＣＲによって増幅した。ＲＭ１１８株由来のクローニング産物はカナマイシンカセットを挿入することで不活性化してプラスミドｐＤＱ１を得、インフルエンザ菌株の形質転換に用いた。ｌｉｃ１およびｌｉｃ２Ａは相変異ＬＰＳ生合成遺伝子座である(High, N.J., Deadman, M.E., and Moxon, E.R. (1993) Mol. Microbiol. 9,1275-1282; Weiser, J.N., Love, J.M., and Moxon, E.R. (1989) Cell 59, 657-665)。ｌｉｃ１はインフルエンザ菌ＬＰＳへのＰＣｈｏ基の付加に関与することが示されている(Weiser, J.N., Shchepetov, M., and Chong, S.T.H. (1997) Infect. Immun. 65,943-950)。各遺伝子座に関して、ＲＭ１１８株を変異させた遺伝子構築物（１０〜１０^５形質転換体／投入ＤＮＡμｇ）を用いて形質転換した。大部分の遺伝子座ではＲＭ１１８はクローニングされたＤＮＡの供給源であったが、いくつかの例ではＲＭ１５３株由来のＤＮＡをドナーとして用い、形質転換効率に違いはなかった。リピドＡに付加された最初の糖Ｋｄｏの合成を担う遺伝子（ｋｄｓＡ、ｋｄｓＢ）およびＫｄｏトランスフェラーゼ（ｋｄｔＡ）は遺伝子配列から同定した(Fleischmann, R.D., Adams, M.D., White, O., Clayton, R.A., Kirkness, E.F., Kerlavage, A.R., Butt, C.J., Tomb, J-F., Dougherty, B.A., Merrick, J.M., McKenney, K., Sutton, G., FitzHugh, W., Fields, C., Gocayne, J.D., Scott, J., Shirley, R., Liu, L-I., Glodek, A., Kelley, J.M., Weidman, J.F.,Phillips, C.A., Spriggs, T., Hedblom, E., Cotton, M.D., Utterback, T.R., Hanna, M.C., Nguyen, D.T., Saudek, D.M., Brandon, R.C., Fine, L.D., Fritchman, J.L., Fuhrmann, J.L., Geoghagen,N.S.M., Gnehm, C.L., McDonald, L.A., Small, K.V., Fraser, C.M., Smith, H.O., and Venter, J.C. (1995) Science 269, 496-512)。種々のプラスミド構築物を用いてｋｄｔＡ遺伝子に変異を有する株を構築する試みからは形質転換体を作出することができなかった。これはｂ型株での知見と同様であり(Hood, D.W., Deadman, M.E., Allen, T., Masoud, H., Martin, A., Brisson, J.R., Fleischmann, R., Venter, J.C., Richards, J.C., and Moxon, E.R. (1996) Mol. Microbiol. 22, 951-965)、この変異体が不活性であるためと思われる。ＲＭ１１８および同型の変異株から単離したＬＰＳをＴ−ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した（データは示されていない）。ＲＭ１１８オリゴ糖合成に関するグリコシルトランスフェラーゼをコードする可能性が最も高い遺伝子に変異を有し、Ｔ−ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより野生型と比較した場合（図２）にＬＰＳバンドに異なるパターンを示す株を、以下に記載のようにそれらのＰＬＳの詳細な構造解析のために選択した。また、ｌｉｃ１遺伝子座が不活性化されている変異体についても検討した。

ＬＰＳの構造決定
Ｔ−ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるＲＭ１１８株のＬＰＳの解析から、リピドＡおよび結合している糖残基の数が異なるオリゴ糖成分からなる低分子量ＬＰＳ集団の電気泳動移動度に相当するヘテロなバンドパターンを示した（図２）。本発明者らはこれまでに、同じ条件下で増殖させたＲＭ１１８株が共通の内部コア要素に結合した３〜５個のグリコース残基を含むＬＰＳの集団を発現することを示している(Risberg, A., Mascud, H., Martin, A., Richards, J.C., Moxon, E.R., and, Schweda, E.K.H. (1999) Eur J. Biochem. 261, 171-180)。ｌｉｃ１、ｌｇｔＦ、およびｌｇｔＤに突然変異を有する株のＬＰは同じような複雑なバンドパターンを示したが、ｌｇｔＣ、ｌｉｃ２Ａ、ｌｐｓＡ、ｏｒｆＨ、ｒｆａＦおよびｏｐｓＸに突然変異を有する株のＬＰＳは一連の糖欠損と一致する一貫して移動度の速いバンドを含む複雑でないパターンを示した。変異株由来のＬＰＳサンプルにおける糖欠損の性質および位置の同定は比較構造解析によって行った。ＲＭ１１８株の同系変異体から液体培養で増殖させた後にＬＰＳを抽出した。構造フィンガープリンティングは、無水ヒドラジン処理後に得られたＯ−脱アシル化ＬＰＳ（ＬＰＳ−ＯＨ）サンプルのＥＳＩ−ＭＳおよび１Ｄ ^１Ｈ−ＮＭＲ分析を用いて行った。さらにまた、グリコースおよび結合分析は無処理のＬＰＳサンプルについて行った。特異的に不活性化された推定グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子を含む変異株から得られたデータをグロボテトラオースを含有するＲＭ１１８ＬＰＳの構造モデル(Risberg, A., Masoud, H., Martin, A., Richards, J.C., Moxon, E.R., and Schweda, E.K.H. (1999) Eur. J. Biochem. 261, 171-180) のものと比較したところ、変化したＬＰＳグリコフォームの重要な構造的特徴が確定された。ＥＳＩ−ＭＳは低分子量ＬＰＳの構造組成を探査する有効な手段を提供する(Gibson, B.W., Melaugh, W., Phillips, N.J., Apicella, M.A., Campagnari, A.A.
, and Griffiss, J.M. (1993) J. Bacteriol. 175, 2702-2712; Masoud, H., Moxon, E.R., Martin, A., Krajcarski, D., and Richards, J.C. (1996) Biochem. 36, 2091-2103; Risberg, A., Masoud, H., Martin, A., Richards, J.C., Moxon, E.R., and Schweda, E.K.H. (1999) Eur. J. Biochem. 261, 171-180; Risberg, A., Schweda, E.K.H., and Jansson P.-E. (1997) Eur. J. Biochem. 243, 701-707; Phillips, N.J., McLaughlin, R., Miller, T.J., Apicella, M.A., and Gibson, B.W. (1996) Biochem. 35, 5937-5947)。Ｏ−脱アシル化ＬＰＳサンプルについて陰イオンモードで得られたＥＳＩ−ＭＳデータは表５に示されている。変異株由来のＬＰＳ−ＯＨサンプルでは、ヘプトース、ヘキソースおよびホスフェート含有置換基の数が異なる共通のＯ−脱アシル化リピドＡ部分にＫｄｏ−４−ホスフェートを介して結合しているオリゴ糖の存在と一致するデータが得られた(Phillips, N.J., Apicella, M.A., Griffiss, J.M., and Gibson, B.W. (1992) Biochem. 31, 4515-4526 Masoud, H., Moxon, E.R., Martin, A., Krajcarski, D., and Richards, J.C. (1996) Biochem. 36, 2091-2103; Risberg, A., Masoud, H., Martin, A., Richards, J.C., Moxon, E.R., and Schweda, E.K.H.(1999) Eur. J. Biochem. 261, 171-180; Schweda, E.K.M., Hegedus, O.E., Borrel
li, S., Lindberg, A.A., Weiser, J.W., Maskell, D.J., and Moxon, E.R. (1993). Carbohydr. Res. 246, 319-330; Schweda, E.K.H., Jansson, P.-E., Moxon, E.R., and Lindberg, A.A. (1995) Carbohydr. Res. 272, 213-224; Risberg, A., Schweda, E.K.H., and Jansson, P.-E. (1997) Eur. J. Biochem. 243, 701-707; Phillips, N.J., McLaughlin, R., Miller, T.J., Apicella, M.A., and Gibson, B.W. (1996) Biochm.35, 5937-5947)。

ｏｐｓＸ変異体ｏｐｓを不活性化すると、ヘプトースまたはヘキソース残基を欠き、リピドＡ部分と結合したリン酸化Ｋｄｏしか含有しない凹凸の深いＬＰＳが生じた（表５）。発明者らはこれまでに、インフルエンザ菌ｂ型ＲＭ１５３株のｏｐｓＸ遺伝子が突然変異した結果、ＨｅｐIとＫｄｏの間でＬＰＳが切断されることを示している(Hood, D.W., Deadman, M.E., Allen, T., Masoud, H., Martin, A., Brisson, J.R., Fleischmann,. R., Venter, J.C., Richards, J.C., and Moxon, E.R., (1996) Mol. microbiol. 22, 951-965)。二価分子イオンの低エネルギー衝突活性によるＬＰＳ−ＯＨサンプルのＭＳ−ＭＳ分析（ｍ／ｚ６２５）では、Ｋｄｏ−β−Ｄ−グルコサミンバンドの切断によって生じるｍ／ｚ９５１における主要なフラグメントイオン（リピドＡ−ＯＨ）が得られた（データは示されていない）。このフラグメントイオンの質量はインフルエンザ菌リピドＡ−ＯＨの期待値と一致する(Helander, I.M., Lindner, B., Brade, H., Altmann, K., Lindberg, K.K., Rietschel, E.T., and Zahringer, U. (1988) Eur. J. Biochem. 177, 483-492)。ＲＭ１１８およびＲＭ１５３ｏｐｓＸ変異体は、これまでに同定されているＲｄｉｓｎ（Ｉ６９）変異株由来のものと同じＬＰＳを発現することが明らかである(Helander, I.M, Lindner, B., Brade, H.,Altmann;K., Lindberg, K.K., Rietschel, E.T., and Zahringer, U. (1988) Eur. J. Biochem. 177, 483-492; Preston, A., Maskell, D., Johnson, A., and Moxon, E.R. (1996) J. Bacteriol. 178, 396-402)。Ｉ６９ＬＰＳ表現型はヘプトース生合成遺伝子ｇｍｈＡの突然変異により生じたものであり(Brook, J.S., and Valvan M.A. (1996) J. Bacteriol. 178, 3339-3341)、これによりこの変異株はそのＬＰＳにヘプトースを付加できなくなる。

ｒｆａＦ変異体リピドＡのα−結合型グルコサミン残基からの^１Ｈ共鳴期待値の他、ＲＭ１１８ｒｆａＦ由来のＬＰＳ−ＯＨの^１ＨＮＭＲ分析も一つのヘプトース単位由来の低電場領域でのアノマープロトン共鳴（〜５．１９ｐｐｍ）を示した。糖分析によれば、このＨｅｐ残基がＬ−グリセロ−Ｄ−マンノヘプトースであることが確認された。これに応じて、ＥＳＩ−ＭＳスペクトルは構造Ｈｅｐ１−Ｋｄｏ−リピドＡ−ＯＨに一致するｍ／ｚ７２１．６における単一の豊富な二価イオンによって占められていた（表５）。

ｏｒｆＨ変異体ｏｒｆＨ遺伝子が不活性化されている生物は、ＥＳＩ−ＭＳデータから明らかなように、各々２つのＨｅｐ残基を含有するＬＰＳグリコフォームの混合物を生じた（表５）。ＲＭ１１８ｒｆａＦＬＰＳに比べ、付加的なＨｅｐ残基、すなわちＨｅｐ_２・ＰＥｔｎ_０−２・Ｋｄｏ−リピドＡ−ＯＨを含有する主なグリコフォーム集団に加え、Ｈｅｘ−ＰＣｈｏ単位を含有する種であった。糖分析によれば、Ｄ−グルコースおよびＰＣｈｏメチルプロトンの存在が^１ＨＮＭＲ３．２４ｐｐｍに強いシグナルを与えることが示された。期待されたように、この株由来のＬＰＳは免疫ブロット実験においてＰＣｈｏ特異的モノクローナル抗体（Ｍａｂ）であるＴＥＰＣ−１５(Weiser, J.N., Shchepetov,M., and Chong, S.T.H. (1997) Infect. Immun. 65, 943-950)と反応した。結合分析では、末端Ｈｅｐ、３−置換Ｈｅｐおよび３，４−二置換Ｈｅｐ残基の存在が明らかになった（表６）。親株の構造を基にすれば、このデータは２つの主要なグリコフォーム構造１および２を発現するＬＰＳを合成する能力を有するＲＭ１１８ｏｒｆＨと一致する（なお、ＰＥｔｎは部分置換を示す）。

構造１：Ｒ^１＝Ｈ
構造２：Ｒ^１＝ＰＣｈｏ→６）−β−Ｄ−Ｇｌｃｐ

Ｔ−ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した際のＲＭ１１８ｏｒｆＨのＬＰＳでの２つのバンドの存在（図２）はこの結果に一致する。

ｌｐｓＡ変異体ＲＭ１１８ｌｐｓＡ由来のＬＰＳ−ＯＨのＥＳＩ−ＭＳ分析によれば、ＲＭ１１８ｏｒｆＨと比較した場合、付加的なＨｅｐ残基を有するグリコフォームを含むことが示され（表５）、Ｈｅｘ１グリコフォームを含有するホスホコリンが主要なＬＰＳ種である（図３）。結合分析は構造２の末端Ｈｅｐへのヘプトースの一連の付加と一致していた（表６）。これに応じ、このＯ−脱アシル化ＬＰＳサンプルの^１ＨＮＭＲスペクトルはインフルエンザ菌のＬＰＳトリヘプトース内部コア要素の低電場領域（５．０〜６．０ｐｐｍ）において特徴的なパターン（ＨｅｐII，５．７６ｐｐｍ；ＨｅｐI／ＨｅｐIII，５．１６／５．１５ｐｐｍ）を示した（図４）(Risberg, A., Masoud, H., Martin, A.,Richards,'J.C., Moxon, E.R., and Schweda, E.K.H. (1999) Eur. J. Biochem. 261, 171-180)。このデータは構造３を有するＲＭ１１８ｌｐｓＡ由来ＬＰＳに一致している（図３、表１）。

ｌｉｃ２Ａ変異体ＲＭ１１８ｌｉｃ２Ａ株由来のＯ−脱アシル化ＬＰＳのＥＳＩ−ＭＳ分析から、主要なＬＰＳ種としてのＨｅｘ２グリコフォームの存在が明らかになった（表５）。ＲＭ１１８ｌｉｃ２ＡＬＰＳの組成分析では、唯一の中性ヘキソースとしてＤ−グルコースが存在することが示され、結合分析ではそれが末端残基であることが示された（表６）。結合分析ではまた、相当な割合の２−結合ヘプトース残基が明らかになった。ｌｐｓＡ変異体由来のＬＰＳサンプルでは２−置換ヘプトース残基は、その残基がその結合分析法で用いられる加水分解条件下では容易に切断されないＰＥｔｎ基（図３中の構造３参照）で置換されているために検出されなかったということは注目に値する。これらの発見によれば、ｌｉｃ２Ａ変異体由来のＬＰＳはｌｐｓＡ変異体のものとは、構造４に示されているように（表１）ＨｅｐIIIの２位にグルコース残基を有する点で異なっているものと結論付けることができる。４．６５ｐｐｍに付加的な^１ＨＮＭＲシグナルが存在することは、この末端Ｄ−Ｇｌｃｐが、非置換類似体の場合と比べてＨｅｐII共鳴値がアップフィールド側にシフトした（５．５８ｐｐｍ）β構造を有することを示し、５．７６ｐｐｍはＨｅｐIIIへの１，２−結合（構造４；表１）を示す(Masoud, H., Moxon, E.R.,Martin, A., Krajcarski, D., and Richards, J.C. (1996) Biochem. 36, 2091-2103; Schweda, E.K.M., Hegedus,,O.E., Borrelli, S., Lindberg, A.A., Weiser, J.W., Maskell, D.J., and Moxon, E.R.(1993) Carbohydr. Res. 246, 319-330; Schweda, E.K.H., Jansson, P.-E., Moxon, E.R., and Lindberg, A.A. (1995) Carbohydr. Res. 272, 213-224)。

ｌｇｔＣ変異体ＲＭ１１８ｌｇｔＣ変異体では、Ｏ−脱アシル化ＬＰＳサンプルのＥＳＩ−ＭＳ分析からＨｅｘ３グリコフォームの存在が明らかになった。糖分析ではｌｇｔＣ変異体由来のＬＰＳがＤ−ガラクトースを含むことが示され、結合分析によればこれは末端残基として存在することが分かった（表６）。結合分析ではまた、４−結合Ｄ−Ｇｌｃｐ残基はＨｅｐIIIのラクトース部分により置換されている（構造５；表１）主要なＨｅｘ３グリコフォーム（表６）と一致する。ＬＰＳ−ＯＨの^１ＨＮＭＲスペクトルは発明者らがこれまでに親株に存在しているラクトース含有Ｈｅｘ３ＬＰＳグリコフォームに関して報告しているものと同じである(Risberg, A., Masoud, H., Martin, A., Richards, J.C., Moxon, E.R., and Schweda, E.K.H. (1999) Eur. J. Biochem. 261, 171-180)。髄膜炎菌において、ｌｇｔＣ遺伝子は１，４−α−ガラクトシルトランスフェラーゼをコードしていることが示されている(Wakarchuk, W.W., Cunningham, A.M., Watson, D.C., and Young, N.M. 1998)。ＲＭ１１８由来のｌｇｔＣに関して同様の機能が、組換え酵素のトランスフェラーゼ活性を調べることで、またＲＭ１１８ｌｇｔＣ変異体由来のＬＰＳの分析によって示されている。

ｌｇｔＤ変異体ｌｇｔＤ遺伝子が不活性かされているインフルエンザ菌ＲＭ１１８株ではＨｅｘ３とＨｅｘ４ＬＰＳグリコフォームの混合物が合成された（表５）。それに応じてＬＰＳのＴ−ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析では２つのバンドが確認され、ｌｇｔＣ変異体由来のものの電気泳動移動度に相当するものとそれより遅く移動するバンドであった（図２）。この変異株由来のＬＰＳは末端および４−結合Ｄ−Ｇａｌｐ残基を含んでいた（表６）。親株とそのｌｇｔｃ変異体の１Ｄ ^１ＨＮＭＲスペクトルを比較したところ、Ｈｅｘ４グリコフォームにα−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→４）−β−Ｄ−Ｇａｌｐ単位が存在することが示され、５．０１ｐｐｍにおけるシグナルは末端（−Ｄ−Ｇａｌｐ残基（構造６；表１）を示す。このｌｇｔＤ遺伝子産物を合成アクセプターＦＣＨＡＳＥ−Ｐ^ｋによるグリコシルトランスフェラーゼ活性に関して調べた。ＣＥアッセイにおいて親株ＲＭ１１８とｌｇｔＤ変異株を比較したところ、変異株でβ−ＧａｌｐＮＡｃトランスフェラーゼ活性が欠損していることが示されされた（図５）。

ｌｇｔＦ変異体インフルエンザ菌におけるｌｇｔＦ遺伝子の突然変異によりＬＰＳがＭａｂＴＥＰＣ−１５とも反応しないし（データは示されていない）、それらの^１ＨＮＭＲにおいて特徴的なＰＣｈｏメチルプロトンシグナル（３．２４ｐｐｍ）も示さない株が生じた。結合分析では、このＬＰＳが末端β−Ｄ−Ｇｌｃｐ残基を欠き、モノ−３−置換ＨｅｐI残基だけを含むことが示された（表６）。ｌｇｔＦ変異体由来のＬＰＳ−ＯＨではそのＥＳＩ−ＭＳにおいて、親株のＬＰＳで見られるものと同じ、ＨｅｐIIIからのオリゴ糖の長さが異なるグリコフォームの分布が見られた（表５）。ＨｅｐIIIからのグロボテトラオース単位の完全な伸長はＨｅｐIにβ−Ｄ−Ｇｌｃｐ残基が存在しても存在しなくとも起こるということは注目に値する（図６）。本発明者らは親株がＬＰＳグリコフォームの混合集団を合成することができ、そこではグロボテトラオース単位β−Ｄ−ＧａｌｐＮＡｃ−（１→３）−α−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→４）−β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→４）−β−Ｄ−Ｇｌｃｐを与える末端β−Ｄ−ＧａｌｐＮＡｃ残基を付加することでガラビオース単位が伸長することを示した(Risberg, A., Masoud, H., Martin, A., Richards, J.C, Moxon, E.R., and Schweda, E.K.H. (1999) Eur. J. Biochem. 261, 171-180)。

ｌｉｃ１変異体ｌｉｃ１変異体由来のＯ−脱アシル化ＬＰＳのＥＳＩ−ＭＳ分析では、ＰＣｈｏ置換が存在しないこと以外は親株に見られるもの(Risberg, A.,Masoud, H., Martin, A., Richards, J.C.,Moxon, E.R., and Schweda, E.K.H. (1999). Eur. J. Biochem. 261, 171-180)と同じヘテロなグリコフォーム混合物（表５）が示された。ＲＭ１１８においてｌｉｃ１遺伝子座は、３，４−二置換ヘプトース（ＨｅｐI）に結合したβ−Ｄ−Ｇｌｃｐ６位におけるＰＣｈｏ置換基の発現を担う遺伝子を含むことが示されている(Risberg, A., Masoud, H., Martin, A., Richards, J.C., Moxon, E.R., and Schweda, E.K.H. (1999) Eur. J. Biochem. 261, 171-180; Weiser, J.N., Shchepetov, M., and Chong, S.T.H. (1997) Infect. Immun. 65, 943-950)。ＲＭ１１８ｌｉｃ１Ｏ−脱アシル化ＬＰＳの^１ＨＮＭＲスペクトルを調べたところ、３．２４ｐｐｍにおいて特徴的なＰＣｈｏメチルプロトンシグナルが存在しないことが明らかになった。さらにこのｌｉｃ１変異体由来のＬＰＳは予測されたように（３４）ＭａｂＴＥＰＣ−１５とは反応しなかった（データは示されていない）。

実施例２
内部コア部分の置換および修飾
ＮＴＨｉ２０１９株では、ＨｅｐIがラクトースで置換されている（Ｒ_１＝β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→４）−β−Ｄ−Ｇｌｃｐ；Ｒ_２／Ｒ_３＝Ｈ）(N.J. Phillips et al. Biochemistry, 31 (1992) 4515-4526)。ＮＴＨｉ３７５株では、ＨｅｐIIIが小数のグリコフォーム集団でシアリル化ラクトースで置換されている（Ｒ_１＝β−Ｄ−Ｇａｌｐ、Ｒ_２＝Ｈ、Ｒ_３＝Ｎｅｕ５Ａｃ−β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→４）−β−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→２））(D.W. Hood et al. Mol. Micro., 33 (1999) 679-692)。本実施例では、メチル化分析、エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）およびＮＭＰを用いることで４つのＮＴＨｉ株由来のＬＰＳの構造研究の結果をまとめる。

インフルエンザ菌非定型株４８６、１７６、２８５および１１５９はEskola教授の株コレクションからFinnish otitis media cohort studyの一環として入手し（Hood, 上記参照）、内耳からの単離物も得た。細菌は３７℃にてニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）２μｇ／ｍＬ、ヘミン１０μｇ／ｍＬ、およびノイラミン酸（ＮｅｕＡｃ）５０μｇ／ｍＬを含有するブレイン・ハート・インフュージョン（ＢＨＩ）ブロス（Difco^ＴＭ）３．７％Ｗ／Ｖ中で増殖させた。ＬＰＳは凍結乾燥菌から、フェノール−クロロホルム−石油エーテル法の後、超遠心分離を行うことで得た(A. Risberg et al. Eur. J. Biochem., 261 (1999) 171-180)。無水ヒドラジンでのＯ−脱アシル化（３７℃、１時間）または薄い酢酸水溶液でのＫｄｏケトシド結合の切断（１００℃、２時間）のいずれかによってＬＰＳサンプルから得たオリゴ糖サンプルに対してＭＳに基づく方法および高電場ＮＭＲ法を用いて詳細な構造研究を行った。

ＬＰＳ−ＯＨサンプルのＥＳＩ−ＭＳでは、総ての株でヘテロなグリコフォーム混合物が示された。ＮＴＨｉ４８６由来のＬＰＳ−ＯＨのＥＳＩ−ＭＳスペクトルの部分が図１０に示されている。これらのＮＴＨｉ株の主要ＬＰＳグリコフォームの提案される組成は表７に示されている。総てのグリコフォームは、推定されるＯ−脱アシル化リピドＡ（リピドＡ−ＯＨ）とリン酸化Ｋｄｏリンカーを介して結合した保存されたＰＥｔｎ置換トリヘプトシル内部コア部分を含む。

ＬＰＳサンプルのメチル化分析が表８に示されている。１７６および４８６株ではこれまでに発表されているインフルエンザ菌構造の必須成分である２−置換Ｈｅｐの痕跡だけが検出できたことは注目に値する。その代わりに相当量の３−置換Ｈｅｐが検出されたが、これはインフルエンザ菌ＬＰＳの共通のＬ−α−Ｄ−Ｈｅｐｐ−（１→２）−Ｌ−α−Ｄ−Ｈｅｐｐ−（１→３）−［β−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→４）−］−Ｌ−（−Ｄ−Ｈｅｐｐ−（１→５）−α−Ｋｄｏｐ内部コア要素の新しい置換パターンを示すものである。１７６および４８６株における主要グリコフォームの完全構造をＮＭＲにより決定したが、その結果を図１１にまとめる。２８５株のメチル化分析ではとりわけ３，４−二置換Ｈｅｐの他、多量の末端Ｌ、Ｄ−Ｈｅｐが明らかになったが、これはトリヘプトシル内部コア部分のＨｅｐIIおよびＨｅｐIIIに置換が存在しない（すなわち、Ｒ_２およびＲ_３＝Ｈ）ことを示すものであった。この株のＨｅｘ１グリコフォームの完全な構造（図１２）をＬＰＳ−ＯＨに対するＮＭＲにより求めた（データは示されていない）。１１５８株のメチル化分析ではとりわけ、ＮＭＲによって明らかな（データは示されていない）構造要素Ｄ−α−Ｄ−Ｈｅｐｐ−（１→６）−β−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→４）−Ｌ−α−Ｄ−Ｈｅｐｐと結合可能な６−置換Ｄ−Ｇｌｃおよび末端Ｄ，Ｄ−Ｈｅｐが示された。主要なＬＰＳグリコフォームはＨｅｐII（α−Ｄ−Ｇｌｃｐ）およびＨｅｐIII（ＰＣｈｏ→６）−β−Ｄ−Ｇｌｃｐ）において置換されていることが分かった。ＮＴＨｉ１１５８の主要なグリコフォームの仮の構造が図１３に示されている。

ＮＴＨｉ１７６の詳細構造薄い酢酸でＬＰＳを部分酸加水分解したところ、可溶性リピドＡとコアオリゴ糖画分が得られ、コアオリゴ糖画分をＧＰＣで分離すると（図１４）、フラクション１、フラクション２およびフラクション３が得られた。これらのフラクションのメチル化分析データは表８に示されている。フラクション１における３−および６−置換Ｇａｌおよび４−置換ＧｌｃＮの存在はこのオリゴ糖について新規な構造特徴が存在することを示している。フラクション１についてのＣＥ−ＥＳＩ−ＭＳではとりわけｍ／ｚ１２１４．０における主要な二価イオンが明らかになり、これはフラクション２およびフラクション３で見られるものよりもこのフラクションでかなり高い分子量のグリコフォーム（ＨＭＧ）を示す。ＮＴＨｉ２８５についても同様の結果が得られた（下記参照）。フラクション２に関するＥＳＩ−ＭＳスペクトル（データは示されていない）からは、主要なグリコフォームが組成ＰＣｈｏ_１・Ｈｅｘ_２・Ｈｅｐ_３・ＰＥｔｎ・ＡｎＫｄｏ−ｏｌおよびＰＣｈｏ_１・Ｈｅｘ_３・Ｈｅｐ_３・ＰＥｔｎ・ＡｎＫｄｏ−ｏｌを有することが示された。フラクション３に関するＥＳＩ−ＭＳ（データは示されていない）からは、それぞれ組成Ｈｅｘ_３・Ｈｅｐ_３・ＰＥｔｎ・ＡｎＫｄｏ−ｏｌおよびＨｅｘ_４・Ｈｅｐ_３・ＰＥｔｎ・ＡｎＫｄｏ−ｏｌを有するグリコフォームが示された。

フラクション２のＨｅｘ３グリコフォームの構造は詳細な^１ＨＮＭＲ分析により決定することができた。フラクション２の^１ＨＮＭＲスペクトルは図１１ａに示されている。ＰＣｈｏのメチル基に特徴的なシグナルはδ３．２４に見られた。ＨｅｐI−ＨｅｐIIIのアノマー共鳴はそれぞれ５．０３−５．１３、５．８３および５．２６で確認された。ＧｌｃＩ、ＧｌｃIIおよびＧａｌに相当するスペクトルはそれぞれδ４．５６、４．６２および４．６４における２ＤＣＯＳＹおよびＴＯＣＳＹスペクトルで確認された。化学シフトデータもメチル化分析と一致してＧｌｃIIとＧａｌが末端残基であることを示す。δ４．３においてＧｌｃIのＨ−６，６’の値がダウンフィールド側にシフトしていることは、この残基がこの位置でＰＣｈｏで置換されていることを示す。プロトン対ＧｌｃII Ｈ−１／ＧｌｃＩＨ−４、ＧｌｃＩＨ−１／ＨｅｐＩＨ−４，６間の内部残基ＮＯＥの連結性（図１５）により、二糖単位の配列およびそのＨｅｐIとの結合点をβ−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→４）−［ＰＣｈｏ→６］−β−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→４）−Ｌ−α−Ｄ−Ｈｅｐｐ−（１→として確定された。ＧａｌのＨ−１とＨｅｐIIIのＨ−３／Ｈ−２の間の内部残基ＮＥＯは、β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→３）−Ｌ−α−Ｄ−Ｈｅｐｐ−（１→単位の証拠となった。これらのデータを考え合わせると、ＰＣｈｏ置換Ｈｅｘ３グリコフォームは構造２を有するものと結論付けることができた。フラクション２のメチル化分析では相当量の末端Ｈｅｐが示され、ＥＳＩ−ＭＳスペクトルで見られたＰＣｈｏ置換Ｈｅｘ２グリコフォームは構造３を有するものと結論付けることができた。

フラクション３の^１ＨＮＭＲスペクトルは図１１ｂに示されている。ＥＳＩ−ＭＳデータと一致して、ＰＣｈｏのメチルプロトンのシグナル強度は低いことから、フラクション２についてはＰＣｈｏは高い程度では発現しないのは明らかである。ＨｅｐIIIのアノマープロトンのシグナルはほぼフラクション２の対応するものと同じ化学シフトで共鳴する。δ５．２６においてα結合の末端Ｇｌｃ残基（ＧｌｃIII）のアノマー共鳴が見られた。β結合ヘキソースのアノマー領域はフラクション２よりもよりヘテロなものであった。２Ｄスペクトルでは末端Ｇｌｃ残基のスピン系がδ４．５０および４．４５で見られた。４−置換Ｇｌｃおよび２つの末端Ｇａｌ残基はδ４．５６、４．６１および４．５４で確認された。ＮＯＥデータからは、構造要素Ｇｌｃｐ−（１→４）−β−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→４）−Ｌ−α−Ｄ−Ｈｅｐｐ−（１→・・・ならびにＨｅｐIIIに結合したＧａｌが確認された。さらにＮＯＥ結合性から、α結合ＧｌｃがＨｅｐIIの３位に結合していることが確認された。これらの証拠を考え合わせると構造４に示されているようなＨｅｘ４グリコフォームの構造が得られる。２−置換Ｈｅｐおよび末端Ｈｅｐを示すメチル化分析に一致して、Ｈｅｘ３グリコフォームは構造５および６を有するものと結論付けられる。

ＮＴＨｉ４８６の詳細構造弱い酸加水分解の後に得られたＬＰＳ−ＯＨおよびオリゴ糖材料（ＯＳ−１）に対してＥＳＩ−ＭＳ、ＮＭＲおよびメチル化分析を集中的に使用した後、グリコフォームＮＴＨｉ４８６の主要なＬＰＳの構造が確立された（図１７）。１７６株については、ＨｅｐIIIはＯ−３位で置換されているが、この場合にはグルコース残基による置換である。ＮＴＨｉ４８６ＬＰＳはラクトース部分の末端β−ガラクトースと結合したＮｅｕ５Ａｃで著しくシアリル化されている。

ＬＰＳ−ＯＨの^１ＨＮＭＲスペクトルでは、δ５．８と５．０の間のほぼ同じ領域に５つの別個のシグナルが見られた。これらのシグナルのうち３つが内部コア領域の３つのヘプトース残基（ＨｅｐI−ＨｅｐIII）のＨ−１シグナルに相当していた。α結合グルコース残基（ＧｌｃI）のアノマーシグナルはδ５．２８（Ｊ３．８Ｈｚ）に確認され、β結合ヘキソースに相当するアノマーシグナルはδ４．５２と４．４２の間に確認された。ＯＳ−１の^１ＨＮＭＲスペクトルでは、ヘプトースのアノマー共鳴ならびに一つのアセチル化部位がδ５．８３−５．７５（１Ｈ、分離していない）およびδ５．１４−５．０４（３Ｈ、分離していない）で見られた。一つのＯ−アセチル基のメチルプロトンに相当する強いシグナルがδ２．１７で見られ、これはＨＳＱＣスペクトルのδ２１．０における^１３Ｃシグナルに相当するものであった。内部コア領域内のグリコースの配列は、隣接する残基上のアノマープロトンおよびアグリコンプロトンを結びつけるトランスグリコシドのＮＯＥ結合性から確定した。ＰＣｈｏのメチルプロトンのシグナルはδ３．２１（ＬＰＳ−ＯＨ）およびδ３．２３（ＯＳ−１）で見られ、この結果から、またＰＥｔｎからのエチレンプロトンのスピン系は以前に得られたものと同じであった(A. Risberg et al. Eur. J. Biochem., 261 (1999) 171-180)。ＬＰＳ−ＯＨおよびＯＳ−１の^１Ｈ−^３１ｐＮＭＲ相関研究では、ＰＣｈｏおよびＰＥｔｎがそれぞれＧｌｃIおよびＨｅｐII残基と結合していることが示された。シアル酸のＨ−３メチレンプロトン由来の特徴的なシグナルはＬＰＳ−ＯＨの^１ＨＮＭＲスペクトルにおけるδ１．７９（Ｈ−_３ａｘ，Ｊ_{３ａｘ,３ｅｑ}＝１２．３Ｈｚ）およびδ２．７３（Ｈ−３_ｅｑ，Ｊ３_ｅｑ，４＝４．３Ｈｚ）に見られた。Ｎｅｕ５ＡｃのＨ−３ａｘとＧａｌ残基のＨ−３の間の内部残基ＮＯＥにより、メチル化分析によって示されているように、シアル酸がガラクトースと２，３−結合していることが確認されたα−Ｄ−Ｎｅｕ５Ａｃ−（２→３）−β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→。ＯＳ−１のＨｅｐIIIにおける核の数に関するいくつかの化学シフト値はＬＰＳ−ＯＨにおける対応する化学シフトとはかなり異なっていた。ダウンフィールドシフトはＯＳ−１におけるＨｅｐIIIのＨ−２（＋０．９９ｐｐｍ）、Ｈ−１（＋０．０３ｐｐｍ）、Ｈ−３（＋０．２２ｐｐｍ）、およびＣ−２（＋１．２ｐｐｍ）で見られ、一方、Ｃ−１（−３．３ｐｐｍ）およびＣ−３（−２．５ｐｐｍ）はアップフィールド側へシフトした。よって、ＨｅｐIIIはＯ−２位でアセチル化していることが示された。このアセチル化部位はＨＭＢＣ実験でもさらに支持され、カルボニル炭素（δ１７４．０）とＨｅｐIIのＨ−２の間で相関性が見られた。さらにまた、カルボニル炭素とＯ−アセチル基のメチルプロトンの間でもクロスピークが見られ、これにより置換基の存在が確認された。

ＮＴＨｉ４８６のｌｐｓＡ変異体由来のＬＰＳのＥＳＩ−ＭＳおよびメチル化分析ではＨｅｐIIIから鎖が伸長していないことが示された。Ｏ−脱アシル化材料のメチル化分析では、末端Ｇｌｃ、末端Ｈｅｐ、３，４−二置換Ｈｅｐ、２，３−二置換Ｈｅｐおよび６−置換ＧｌｃＮが相対比３４：３９：２０：３：４で示された。ＬＰＳ−ＯＨのＥＳＩ−ＭＳスペクトルでは、ｍ／ｚ８１２．９／８５３．９で２つの主要な三価イオンが見られ、ＰＣｈｏ・Ｈｅｘ_２・Ｈｅｐ_３・ＰＥｔｎ_１−２・Ｐ_１・Ｋｄｏ_１・リピドＡ−ＯＨに相当した。

ＮＴＨｉ１７６および２８５における高分子量グリコフォームＮＴＨｉ２８５由来のＬＰＳに対して弱い酸加水分解を行った後にゲル濾過を行ったところ、図１２に示されているグリコフォームを含んだ主要画分とともにそれより大きな分子量をのグリコフォームを含有する少量の画分が示された。この高分子量（ＨＭＷ）画分の糖分析ではＤ−Ｇｌｃ、Ｄ−Ｇａｌ、Ｄ−ＧｌｃＮＡｃおよびＬ，Ｄ−Ｈｅｐが示され、メチル化分析では末端Ｇａｌ、３−置換Ｇａｌ、６−置換Ｇａｌ、４−置換ＧｌｃＮＡｃ、末端Ｈｅｐ、および３，４−二置換Ｈｅｐを示した。ＣＥ−ＥＳＩ−ＭＳではとりわけｍ／ｚ１０５２に主要な二価イオンが示された。このイオンに対するＭＳ／ＭＳによれば、ＮＴＨｉ１７６のＨＭＷ（上記参照）で見られたｍ／ｚ１２１４と同様のフラグメンテーションパターンを示した。特に娘イオンがｍ／ｚ６９２に見られ、組成物ＰｃｈｏＨｅｘ−Ｈｅｘ−ＨｅｘＮＡｃに相当した。

間接的ＥＬＩＳＡ培養上清および腹水を９６ウェルNunc Maxisorp EIAプレートで精製ＬＰＳに対してアッセイした。３７℃で３時間、０．０２ＭＭｇＣｌ_２を含有する０．０５Ｍ炭酸バッファー（ｐＨ９．８）１００μＬ中１．０μｇのＬＰＳでウェルを被覆した後、室温にて１時間、１％ＢＳＡ−ＰＢＳ２００μＬでブロッキングした。ＰＢＳ−Ｔ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄した後、培養上清および腹水のサンプルを１％ＢＳＡ−ＰＢＳで連続希釈したものを加え、室温で１〜３時間インキュベートした。次にこれらのプレートを洗浄し、アルカリ性ホスファターゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ(Cedarlane Laboratories, Hornby, ON)を１％ＢＳＡ−ＰＢＳ中に１：３０００希釈したものを室温にて１時間加えた。これらのプレートをｐ−ＮＰＰリン酸基質系(Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaitherberg, MD)で顕色させた。３０〜６０分後、Dynatech EIAプレートリーダー４１０ｎｍにてプレートを走査した。

実施例４
ＨｉＲｄｌｉｃ１ｌｐｓＡＬＰＳ−ＯＨ−ＢＳＡ結合体の作製
これまでに記載されている手順に従い、インフルエンザ菌二重変異株Ｒｄｌｉｃ１ｌｐｓＡ由来のＬＰＳを単離し、フェノール−水抽出プロトコールにより精製し、無水ヒドラジン処理によりＯ−脱アシル化した。糖分析では、ＬＰＳ−ＯＨのオリゴ糖部分がＬ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトースおよび唯一検出可能なアルドースとしてのグルコースを含んでいることが示された。ＬＰＳ−ＯＨのＥＳＩ−ＭＳによれば、分子量２１１４．９Ｄａに相当するｍ／ｚ１０５６．５に二価イオンが見られ、これはＧｌｃ（ＨｅｐIII・ＰＥｔｎ・Ｋｄｏ・Ｐ−リピドＡ−ＯＨ（１）の予測組成と一致するものである。^１ＨＮＭＲは明らかにＲｄｌｐｓＡ単一変異体で見られたＬＰＳ−ＯＨのものと同じ保存されたトリヘプトシル部分に関する、５．１６（ＨｅｐI）、５．１５（ＨｅｐIII）および５．７６（ＨｅｐII）おけるヘプトース残基の十分定義されるアノマーシグナルを示した。Ｐｃｈｏメチル共鳴によるシグナル(Risberg et al., Eur. J. Biochem. 261:171-180, 1999)はこの^１ＨＮＭＲでは検出されなかった。

実施例５
炭水化物（ＣＨＯ）−ＢＳＡ結合体、その後の非結合ＣＨＯでの感作
これまでの例からのＬＰＳ−ＯＨはGu et al., Infect. Immun. 64:4047-4053, 1996に記載の方法に従ってＢＳＡを結合させることができる。あるいは図８に記載のようにカナダのNAtional Research CouncilのWei Zouが開発した手法に従い、Ｋｄｏカルボキシル基を介してＢＳＡをＭ_２Ｃ_２Ｈ（４（４−Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン１−カルボキシルヒドラジド１／２ジオキサンと結合させることもできる。要するに、上記スキームに示されているリンカー戦略を用い、ＬＰＳ−ＯＨはＥＤＣによるＫｄｏカルボキシル基の選択的活性化を介してＢＳＡと結合させたのである。

６〜８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスにＲｄｌｉｃ１ｌｐｓＡｏｄＡＬＰＳ−ＢＳＡ結合体を腹腔内感作させた。各マウスには一回の注射当たり０．２ｍｌ Ribis完全アジュバント(Cadarlane Laboratories Ltd, Hornby, ON)中２μｇの炭水化物を与えた。２１日目と４２日目に同量の結合ワクチンでマウスに追加抗原投与を行った。１３７日目にマウスに、Ribi中に１０μｇの１００３ｌｉｃ１ｌｐｓＡｏｄＡＬＰＳを含有する最後の腹腔内注射を行い、１４７日目に血清を採取した。

ＬＬＡ４は同種株に存在する内部コアエピトープを認識することが分かった。ＥＬＩＳＡ試験では、ＬＬＡ５は遺伝的に多様な培養コレクションの多数の株から精製したＬＰＳ（２５種のうち１４の非定型株ＬＰＳ）と交差反応を示した（表３）。ＭａｂＬＬＡ５によって認識されるエピトープはＲｄｌｐｓＡ単一変異体に、また、ＨｅｐIII残基を欠いたさらに末端切断されたＲｄｌｉｃ１ｌｐｓＡ二重変異体に存在した（表４）。ＬＬＡ５エピトープは単一変異体ＲｄｌｇｔＦのＬＰＳには存在しない。上で述べたように、ｌｇｔＦ遺伝子はＨｅｐIの４位にβ−Ｄ−Ｇｌｃ残基を付加するのに必要とされる。

この２５株由来のＬＰＳを当技術分野で公知の構造解析技術によって比較したところ、驚くべきことに、ＭａｂＬＬＡ５が内部コア部分のＨｅｐI単位から鎖伸長を生じるラクト−Ｎ−ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）含有オリゴ糖エピトープを検出していた。ＭａｂＬＬＡ５によっては認識されない株はＬＮｎＴを含む鎖の伸長がないことを特徴とした。ＬＮｎＴを含む鎖伸長を発現するインフルエンザ菌株は標準的な実験室増殖条件下では低い程度でしかそれを発現しない。それはこれまでには発現レベルが低いためにＲｄ株では同定されていない(Risberg et al., Eur. J. Biochem.,261:717-180, 1999)。これが今般、図１４と同様に、当業者に公知の手法である弱い酸加水分解およびバイオゲルＰ−４でのゲル浸透クロマトグラフィーによる分離によってＲｄ株（ＲＭ１１８）のＬＰＳから各オリゴ糖を遊離させることにより単離および同定された。このＬＮｎＴ含有コアオリゴ糖画分は少量の高分子量成分で標識された「ＨＭＷ画分」として溶出する。これはＲｄ株で同定されている主要なグリコフォーム(Risberg et al., 1999, 上記)からなる大きなピーク（４００を中心とする）と比べると少量成分である。Ｒｄ株由来のＨＭＷコアオリゴ糖はタンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）技術(Thibault and Richards, In methods in Molecular Biology, Vol 145,: Bacterial toxins: Methods and Protocols(Holst, O., ed.) pp 327-344, Human a Press, 1999 およびその中の参照文献)によりＨｅｐIからＬＮｎＴ含有鎖の伸長を有するものとして特徴付けられた。ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳにおけるフラグメンテーションパターンは配列Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ−Ｇｌｃを有し、末端糖単位Ｐｅｔｎ−ＧａｌＮＡｃでキャップされたＬＮｎＴオリゴ糖鎖伸長が存在することを示した（図１）。

Ｒｄ株をシアル酸を含有する培地で増殖させると、シアリル化オリゴ糖を含有するＬＰＳグリコフォームが発現する。本発明者らはＨｅｐIIIからのオリゴ糖伸長として結合している構造α−Ｎｅｕ５Ａｃ（２→３）−β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→４）−β−Ｄ−Ｇｌｃを有するシアラリルラクトースを見出した。さらにまた、このオリゴ糖伸長はいくつかのＮＴＨｉ株でも確認された。相変異遺伝子ｌｉｃ３ＡはラクトースアクセプターにＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃを付加するシアリルトランスフェラーゼをコードしている。Ｒｄ株を記載の条件下で増殖させた場合、この生物のＬＰＳでＬＮｎＴ鎖伸長部のシアリル化類似体が検出される。構造α−Ｎｅｕ５Ａｃ（２→３）−β−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→４）−β−Ｄ−ＧｌｃｐＮＡｃ−（１→３）−、β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→４）−、β−Ｄ−Ｇａｌｐを有する内部コアＬＰＳからのシアリル化ＬＮｎＴオリゴ糖鎖伸長はＯ−脱アシル化ＬＰＳのＥＳ−ＭＳによりＲｄｌｇｔＣｌｉｃ３Ａ二重変異体で容易に検出される。発明者らはＭＳ／ＭＳ技術、高電界核磁気共鳴技術、およびメチル化分析（いずれも当業者に公知の構造解析法）を用い、保存された内部コアにおけるＬＰＳの構造がシアリル化ＬＮｎＴ含有鎖の伸長を有することを確認した。発明者らはインフルエンザ菌がｒｆｂ遺伝子座の遺伝子を含む、ＬＮｎＴ含有オリゴ糖鎖伸長部を付加するための一連の機構を用いていることを見出した。検討した総てのＨｉ株で、ｒｆｂ遺伝子の存在とＬＮｎＴの形成の間には絶対的な相関がある。

また、ＭａｂＬＬＡ５と反応性があるＮＴＨｉ株由来のＬＰＳは弱い酸加水分解の後のゲル浸透クロマトグラフィーで高分子量（ＨＭＷ）画分を示す。例えばＮＴＨｉ２８５株のＬＰＳは、図１に示したのと同様に、ＬＮｎＴを含有し、また、Ｐｅｔｎ−ＧａｌＮＡｃ単位によってキャップされている鎖伸長の存在がＭＳ／ＭＳフラグメンテーションパターンから同定される少量のＨＭＷ画分を示す。このＬＮｎＴ含有オリゴ糖鎖伸長はＭＳ／ＭＳ／ＭＳ実験からさらに確認された。ＬＩＡ５反応性のない株、例えばＮＴＨｉ１２４７株の弱い酸加水分解では検出可能なＨＭＷ画分は見られない。

【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、高分子量型ＲＭ１１８の構造確認図である。
【図２】
図２は、ＲＭ１１８野生型および推定されるグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子に変異を有する株から精製したＬＰＳのＴ−ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後の電気泳動移動パターンである。ＲＭ１１８は野生型のＬＰＳに相当し、同系変異体は関連のＬＰＳ遺伝子で示されている。
【図３】
図３は、主要なＨｅｘ１グリコフォーム（表１、構造３）由来の二価および三価イオンを示す、インフルエンザ菌ＲＭ１１８株のｌｐｓＡ変異体由来のＯ−脱アシル化ＬＰＳの陰イオンＥＳＩ−ＭＳである。
【図４】
図４は、５．０と６．０ｐｐｍの間にα−アノマープロトン領域を示す、インフルエンザ菌ＲＭ１１８株のｌｐｓＡ変異体由来のＯ−脱アシル化ＬＰＳの^１ＨＮＭＲスペクトルである。３，４−二置換Ｈｅｐ（ＨｅｐＩ）、６−ＰＥｔｎ置換Ｈｅｐ（ＨｅｐII）、末端Ｈｅｐ（ＨｅｐIII）およびリピドＡ領域のリン酸化α−ＧｌｃＮに相当するアノマー共鳴が示されている。
【図５】
図５は、インフルエンザ菌ＲＭ１１８株のＬｇｔＤ活性のキャピラリー電気泳動分析である。パネルＡ／トレース１は音波処理物の１００，０００ｘｇペレットを酵素源として用いた完全反応混合物であり；トレース２はＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを除いたこと以外は１の反応混合物と同じであり；トレース３は変異体ＲＭ１１８：ｌｇｔＤからの完全反応混合物であり；トレース４はＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを除いたこと以外はトレース３と同じである。ピークＡはＦＣＨＡＳＥ−Ｐ^ｋ製剤中の不純物であり、ピークｂはＦＣＨＡＳＥ−グロボテトラオースであり、ピークｃはＦＣＨＡＳＥ−Ｐ^ｋである。パネルＢ／トレース１はパネルＡトレース１で記載した反応から得られたＴＣＬ精製産物である。トレース２はβ−ヘキソサミニダーゼで処理したこと以外はトレース１と同じ材料である。
【図６】
図６は、インフルエンザ菌ＲＭ１１８株のｌｇｔＦ変異体由来のＯ−脱アシル化ＬＰＳの三価分子イオン領域の陰イオンＥＳＩ−ＭＳである。Ｈｅｘ２（β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→４）−β−Ｄ−Ｇｌｃｐ）、Ｈｅｘ３（α−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→４）−β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→４）−β−Ｄ−Ｇｌｃｐ）およびＨｅｘ３・ＨｅｘＮＡｃ（β−Ｄ−ＧａｌｐＮＡｃ−（１→３）−α−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→４）−β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→４）−β−Ｄ−Ｇｌｃｐ）から生じたピークが示されている。
【図７】
図７は、Risberg et al., (16)の分析の結果に基づいたインフルエンザ菌ＲＭ１１８株由来のＬＰＳの構造の模式図である。この実験で同定された遺伝子座のＬＰＳ生合成において提案される作用部位を示し、関連の糖結合に矢印で結ばれている。相変異遺伝子座は下線で示されている。ＬＰＳ構造においては、ＫＤＯは２−ケト−３−デオキシオクツロソン酸を、ＨｅｐはＬ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトースを、ＧｌｃはＤ−グルコースを、ＧａｌはＤ−ガラクトースを、ＧａｌＮＡｃはＮ−アセチルガラクトサミンを、ＰＥｔｎはホスホエタノールアミンを、Ｐはリン酸を、Ｐｃｈｏはホスホコリンを表す。ヘプトース残基については上から下に、ヘプトースＩ、ヘプトースII、次にヘプトースIIIである。
【図８】
図８は、インフルエンザ菌Ｒｄｌｉｃ１ｌｐｓＡ株ＬＰＳ−ＯＨと担体タンパク質（この例ではＢＳＡ）とのコンジュゲーションのスキームである。
【図９】
図９は、インフルエンザ菌Ｒｄ株のＬＰＳ内部コアからの鎖伸張に関与する遺伝子を示す図である。ｂ型株ではｌｉｃ２遺伝子座の遺伝子ｏｒｆ３およびｌｉｃ２ｂがＨｅｐＩＩからの鎖の伸長を制御する。これらの遺伝子はＲｄ ⁻ 株には存在しない。ｌｉｃ１はＰＣｈｏの組み込みを制御する。
【図１０】
図１０は、ＮＴＨｉ４８６株由来のＯ−脱アシル化ＬＰＳの陰イオンＥＳＩ−ＭＳスペクトルの一部を示す図である。主要なグリコフォームの提案される組成が示されている。ナトリウム化付加物がアステリスク（ ^＊）で示されている。
【図１１】
図１１は、ＮＴＨｉ１７６由来のフラクション２（ａ）およびフラクション３（ｂ）の２７０ＭＨｚ ^１ＨＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図１２】
図１２は、ＮＴＨｉ２８５で見られた主要なＨｅｘ１ＬＰＳグリコフォームの構造を示す図である。
【図１３】
図１３は、ＮＴＨｉ１１５８の主要なＬＰＳグリコフォームの仮構造を示す図である。
【図１４】
図１４は、弱い酸加水分解後のＮＴＨｉ１７６のＬＰＳ（１００ｍｇ）のバイオゲルＰ−４クロマトグラムを示す図である。
【図１５】
図１５は、ＮＴＨｉ１７６のフラクション２の５００ＭＨｚ２ＤＮＯＥＳＹスペクトルの一部を示す図である。
【図１６】
図１６は、ＮＴＨｉ１７６ＬＰＳ由来のオリゴ糖の構造を示す図である。
【図１７】
図１７は、ＮＴＨｉ４８６の主要なＮｅｕＡｃ含有ＬＰＳグリコフォームの構造を示す図である。