JP2004503510A - 食用製品を用いたワクチンの経口投与を通した免疫感作 - Google Patents
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Abstract
食用植物及び／又は動物製品中に生産されるワクチン、並びにトランスジェニック植物又は動物中での病原体の少なくとも一つの完全な構造の生産を通した第二世代のワクチン開発方法。好ましくは本発明は複数のタンパク質及び／又はかかるタンパク質の複数の一部の共発現を通して食用食物植物中でのウイルス様粒子の生産を可能にする。ウイルス構造タンパク質の共発現はヒト免疫系に対するウイルス関連抗原の適切な呈示を増大させるにちがいない。
【選択図】図７
【選択図】図７
Description
【０００１】
発明の分野
本発明は食用製品を用いたワクチンの投与を通して病気を引き起こす病原体に対して患者を免疫感作する方法に関し、特に、ワクチンが遺伝的に改変された植物製品を通して投与されるかかる方法に関する。好ましくはワクチンはＡ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）に対して指向されている。
【０００２】
発明の背景
感染症は病的状態及び死亡の世界的な原因である。これらのうちのいくつかは極めて幼い子供の如き弱い免疫系を持つ個体に特に影響を与え、世界ベースでの子供の死亡の主要原因である（Ｔｈｅ Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｒｅｐｏｒｔ １９９７， ＷＨＯ）。旅行及び集団間の他の接触は細菌及びウイルス病原体の蔓延の危険性を増大させ、それにより地域社会の以前よりも高度な保護を必要としている。これらの病気を予防する最も有効かつ効果的な戦略は集団予防接種である（Ｒｅｖｉｅｗ： Ｖａｃｃｉｎｅ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ． Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ４： ４７４−５３４， １９９８）。しかし、バイオテクノロジー遺伝子工学の有意な進歩及びワクチンの多量生産における技術の進展にもかかわらず、これらは費用が高く、実際ベースではしばしば利用することができないままである。現在大部分のワクチンは注射によって非経口的に投与される。さらに、かかるワクチンは投与されるまで冷蔵庫で保存されなければならない。従って、集団予防接種プログラムはワクチンの多大な供給、冷蔵設備の維持、及び滅菌シリンジ及び針の供給を現在要求している。これらの要求はかかるプログラムをいくつかの管区、特に第三世界の国々で行うことを困難又は不可能にしている。
【０００３】
Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）はピコルナヴィリアデ（ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉａｄｅ）ウイルス科内のヘパトヴィルス（Ｈｅｐａｔｏｖｉｒｕｓ）属のメンバーであり、かかる集団予防接種プログラムを通して投与することが現在困難であるワクチンがある病原体の一例である。Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）は糞便−経口ルートで伝達される多くのウイルス病の一つであり、多くの国で初期幼児期の病的状態及び死亡に関連する病気の一例である。胃腸系を通して経口的に体内に侵入した後、ＨＡＶは組織特異的複製のために肝臓に移動し、臨床的肝炎をもたらす。ＨＡＶについての集団予防接種プログラムは企てられたことがない。
【０００４】
ＨＡＶワクチンは低いウイルス力価を作り出す霊長類の組織培養で現在製造されており、それ故高価である。その高価さ及び製造の困難さは現在ＨＡＶワクチンは小規模のプログラムのためにのみ購入することができるような高価さ及び困難さである。それ故、安価で効果的な集団予防接種のための新規な解決策が必要である。単純な方法を通してワクチンを与えることはワクチン摂取及びＨＡＶに対する集団保護を有意に増大させることができるであろう。
【０００５】
最近、サルモネラの如き細菌又はＨＩＶの如きウイルス病原体に対する予防接種は弱毒化された又は殺生された細菌／ウイルスの直腸投与を通して増大させることがたぶんできるということが示されている（例えば“Ｏｒａｌ ａｎｄ ｒｅｃｔａｌ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｕｌｔ ｆｅｍａｌｅ ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ ｗｉｔｈ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ ｖａｃｃｉｎｅ ｓｔｒａｉｎ”； Ｎａｒｄｅｌｌｉ−Ｈａｅｆｌｉｇｅｒ Ｄ， Ｋｒａｅｈｅｎｂｕｈｌ ＪＰ， Ｃｕｒｔｉｓｓ Ｒ ３ｒｄ， Ｓｃｈｏｄｅｌ Ｆ， Ｐｏｔｔｓ Ａ， Ｋｅｌｌｙ Ｓ， Ｄｅ Ｇｒａｎｄｉ Ｐ． Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ． １９９６；６４：５２１９−２４； 及び“Ａ ｒａｔｉｏｎａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｍｕｃｏｓａｌ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ＨＩＶ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ”， Ｌｅｈｎｅｒ Ｔ， Ｂｅｒｇｍｅｉｅｒ Ｌ， Ｗａｎｇ Ｙ， Ｔａｏ Ｌ， Ｍｉｔｃｈｅｌｌ Ｅ． Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ． １９９９；１７０：１８３−９６ を参照されたい）。ワクチンの直腸、鼻又は経口投与は体液性及び細胞性免疫応答の両方を誘発することが示されている。しかし、これらの結果は可変性であった。それにもかかわらず、経口ポリオワクチン（Ｓａｂｉｎのワクチン）は保護的なウイルス中和抗体を生成することに極めて良く成功している。
【０００６】
不運なことにＨＡＶワクチン投与のかかる方法は注射以外の投与ルートを通しては成功していない。それ故、ＨＡＶワクチンは投与することが現在困難であり、従っていかなる集団予防接種プログラムも高価で実行することが困難である。
【０００７】
他の多くのワクチンも経口的に投与されることが最も有用であるだろう。しかし、経口投与形態で利用可能なこれらのワクチンについてすら、ワクチンの保存及び取扱い条件並びにもちろん予防接種費用のために集団予防接種プログラムは行うことが困難である。現在、ワクチンは様々な組織で及び／又は細菌細胞培養から通常製造されており、これは高価で困難な製造方法である。加えて、製造されたワクチンは注意深く取扱われなければならず、冷蔵及び／又は他のタイプの特別な取扱いをしばしば必要とし、これは遠隔地又は技術が未発展の地域では行うことが困難であるか又は不可能であるかもしれない。
【０００８】
最近の研究はワクチンの多量製造及び保存という従来記述されてきた問題を克服する試みにおいて細菌又はウイルスタンパク質を発現することができる遺伝子工学処理された（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）植物を製造している。例えば、コレラ毒素Ｂサブユニットオリゴマーはトランスジェニックジャガイモ植物中で発現された。しかし、生じた植物は免疫原性について試験されていない（Ａｒａｋａｗａ ｅｔ ａｌ．， “Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｏｌｅｒａ Ｔｏｘｉｎ Ｂ Ｓｕｂｕｎｉｔ Ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ ｉｎ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｐｏｔａｔｏ Ｐｌａｎｔｓ”； Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ６：４０３−４１３； １９９７）。同様に、狂犬病ウイルスの糖タンパク質（これはウイルスの外側表面をコートする）がトランスジェニックトマト植物中で発現されている。しかし、生じた植物は免疫原性についてやはり試験されていない（ＭｃＧａｒｖｅｙ ｅｔ ａｌ．， “Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｒａｂｉｅｓ Ｖｉｒｕｓ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｔｏｍａｔｏｅｓ”； Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １３：１４８４−１４８７， １９９５）。また、米国特許第５９１４１２３号は植物中で発現されるワクチンを記述するが、生じた植物物質ワクチンの免疫原性に関するデータは与えられていない。米国特許第５６１２４８７号及び第５４８４７１９号も植物中で発現される抗ウイルスワクチンを記述するが、同様に生じた植物物質ワクチンの免疫原性に関するデータは与えていない。
【０００９】
試験された植物ベースのワクチンがすべて免疫原性であると証明されたわけではない。更に、食物としてのいくつかのワクチン含有植物の摂取、つまり植物製品の通常の経口摂取は動物及びヒトにおいて部分的に保護的な免疫応答しか引き起こさなかった（Ｓａｎｄｈｕ ｅｔ ａｌ， “Ｏｒａｌ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｅ ｗｉｔｈ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｔｏｍａｔｏ ｆｒｕｉｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ−Ｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｄｕｃｅｓ ａ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ”， Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ９： １２７−１３５， ２０００； Ｒｉｃｈｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， “Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｓ ｆｏｒ ｏｒａｌ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ”， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １８：１１６７−１１７１， ２０００； 及び Ｍａｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， “Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｎｏｒｗａｌｋ ｖｉｒｕｓ ｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｔｏｂａｃｃｏ ａｎｄ ｐｏｔａｔｏ ａｎｄ ｉｔｓ ｏｒａｌ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｉｎ ｍｉｃｅ”， ＰＮＡＳ， ９３：５３３５−５３４０， １９９６）。
【００１０】
これらの植物ベースのワクチン、特にある病原体に対する植物ベースのワクチンの低い免疫原性についての部分的な説明は、標的抗原が単離されたタンパク質又はペプチド又はタンパク質の一部のみとして発現され、無傷の病原体の関連で発現されなかったという事実に関する。それ故、これらのタンパク質は免疫系によって認識される正確な三次構造をとることができない。例えば、ＨＡＶキャプシドタンパク質は個別に発現されると中和抗体を誘発することができない。この結果は驚くべきことではない。何故なら初期の研究は他のウイルス及び細菌は全体構造の一部のみが従来のワクチンとして投与されると同様の挙動を示すことを示しているからである（Ａｌｍｏｎｄ ａｎｄ Ｈｅｅｎｅｙ，“ＡＩＤＳ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｉｎ ｐｒｉｍａｔｅ ｍｏｄｅｌｓ”， ＡＩＤＳ １２（ｓｕｐｐｌ Ａ）：Ｓ１３３−１４０， １９９８； Ｍａｙｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｓｅｒｏｔｏｐｅ ５ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｃａｐｓｉｄ ａｎｄ ３Ｃ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｃｏｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ Ｆｏｏｔ−ａｎｄ−Ｍｏｕｔｈ Ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ ａｓ ａ ｖａｃｃｉｎｅ ｃａｎｄｉｄａｔｅ”， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ２６３：４９６−５０６， １９９９； 及び Ｗｉｇｄｏｒｏｖｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，“Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ Ｆｏｏｔ−ａｎｄ−Ｍｏｕｔｈ Ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｍｉｃｅ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｏｒａｌ ｏｒ ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａｌｆａｌｆａ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ ｖｉｒａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ＶＰ１”， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ２５５３：３４７−３５３， １９９９）。
【００１１】
発明の概要
背景技術は病気を引き起こす病原体の少なくとも一つの完全な構造を含有する、規則正しい摂取（つまり経口投与を通した摂取）のための、食用植物及び／又は動物材料によって製造されるワクチンを教示又は示唆していない。背景技術はかかる完全な構造が所望により複数のタンパク質であることができること又は代わりに病原体の構造を模倣する単一分子を含むことができることを教示又は示唆していない。背景技術はＨＡＶの如きウイルスに対する成功的に免疫原性を有するワクチンを教示又は示唆していない。また、背景技術はトランスジェニック植物及び／又は動物中でかかるワクチンを製造する方法を教示又は示唆していない。
【００１２】
従って、病原体がウイルス、細菌又は自然の寄生者であるかにかかわらず、病原体の少なくとも一つの完全な構造の製造を通して、病気を引き起こす病原体に対する保護的な免疫応答を成功的に誘発することができるワクチンに対する要求が存在し、また、かかるワクチンを持つことは有用であるだろう。
【００１３】
本発明はトランスジェニック植物又は動物中で病原体の少なくとも一つの完全な構造を製造することを通して第二世代のワクチン開発の新規な方法を与えることによって、並びにワクチン自体を与えることによって背景技術のこれらの問題を克服し、及び食用植物及び／又は動物製品中にワクチンを製造することについての長い間感じられてきた必要性に対する解決策を与える。好ましくは本発明は複数のタンパク質及び／又は組換えペプチド構造としてのかかるタンパク質の複数の一部の共発現を通して食用植物中でのウイルス様粒子の製造を可能にする。ウイルス構造タンパク質の共発現はヒトの免疫系に対するウイルス関連抗原の適切な提示を増大させるにちがいない。
【００１４】
本発明の操作の好ましい例として、ワクチンはＡ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）に対して製造される。単離されたＨＡＶキャプシドタンパク質を用いて予防接種するという以前の試みは保護的な免疫応答を誘発することに失敗した。何故なら、中和抗体はキャプシドの集合後にのみ生成されるウイルス粒子上の特定構造を認識するからである。この問題を克服するため、好ましくは本発明は植物の安定な形質転換のため５′ＵＴＲを欠く非感染性のＨＡＶゲノムを担持する二つのＨＡＶプラスミドの構築を含む。一つのプラスミド（ｐＧＰＰａｔΩＨＡＶ）においてはＨＡＶの転写はトマト果実中での発現のためのパタティンプロモーターから推進され、第２のプラスミド（ｐＪＤＨＡＶ）においては転写は３５ＳＣａＭＶプロモーターの制御下にあり、トランスジェニック植物の緑色部で発現されるべきである。ＨＡＶトランスジーンに対する免疫応答を評価するため、トランスジェニック植物の作物は実験動物によって摂取された。
【００１５】
本発明の好ましい実施態様によれば、ワクチンに対して開発された技術は遺伝子のビークルとして非感染性ウイルス粒子を含有する食用植物成分の摂取を通して特定の器官に対する遺伝子標的化のために所望により適用されることもでき、これはより好ましいことである。
【００１６】
モデルの病気として、粘膜組織、特に直腸粘膜を通した吸収による患者への規則正しいＨＡＶワクチン投与方法も与えられる。この方法はＨＡＶワクチンが直腸経由で、例えば坐薬として又は他の直腸用量形態で患者に投与されることを可能にし、そしてＨＡＶに対して患者を成功的に免疫感作する。従って、本発明の方法は行うことが困難かつ高価である非経口投与の如き背景技術の投与方法の問題を克服する。
【００１７】
以後、消化系は口、食道、胃、小腸、大腸、及び直腸、又はこれらの一部として規定される。
【００１８】
図面の簡単な説明
上述の及び他の目的、側面及び利点は図面を参照して本発明の好ましい実施態様の以下の詳細な記述からよりよく理解されるであろう。図中、
【００１９】
図１はＨＡＶワクチンの投与後の実験マウスの力価のグラフである；６匹のＢａｌｂ／ｃマウスはＨＡＶワクチンの商業的調製物（ＨＡＶＲＩＸ（商標））を鼻から２０μｌ、直腸から１００μｌ又は腹膜中へ（ＩＰ）１００μｌ投与された。ワクチンは０日及び２１日の２回投与され、最初の予防接種の３５日後に抗ＨＡＶ抗体について試験された（ＨＡＶＡＢ、総抗ＨＡＶ抗体についてのＥＩＡ，Ａｂｂｏｔｔ）。
【００２０】
図２はトランスフェクトされた細胞中のＨＡＶ配列の存在を示す（レーン１−４、レーン５は陰性コントロールでありレーンＰは陽性コントロールである）。配列の存在は果実特異的パタティンプロモーター及びオメガエンハンサー配列の制御下でＨＡＶコーディング配列全体を含有するｐＧ３５ＳΩＨＡＶでトランスフェクトされた細胞についてのウイルスのＶＰ１−ＶＰ３ウイルス構造領域からのプライマーを用いたＰＣＲによって決定された。
【００２１】
図３は１２のトランスジェニックトマト植物葉から生産されたＤＮＡの放射性ラベルされたＨＡＶ ｃＤＮＡのプローブを用いたドットブロット及びハイブリダイゼーションの結果を示す。図からわかる通り、１２の植物は全てＨＡＶ ＤＮＡ配列を含有していた。
【００２２】
図４はＰＣＲによる図３の植物の一部の評価結果を示す。略語は以下の通り：Ｍは分子量サイズマーカーであり；１−６はトマト葉ＤＮＡであり；Ｐは陽性コントロールである。
【００２３】
図５Ａは同様の様式で分析された１７の植物から抽出されたＲＮＡの例を示す。見られる陽性シグナルがＲＮＡサンプル中の残存ＤＮＡによるものであるという可能性を除去するため、トマト果実から抽出されたＲＮＡはＤＮａｓｅ Ｉで処理され、ドットブロット分析が繰返された（図５Ｂ）。略語は以下の通り：（図５Ａ）Ａ１−Ｂ１０はトマト果実ＲＮＡであり；Ｄ１及びＤ３は陰性コントロールであり；Ｄ１０は陽性コントロールである。（図５Ｂ）：Ａ１−８，Ｂ１−２，Ｃ１−８，Ｄ１−２はトマト果実ＲＮＡであり；Ｂ−３はＤＮａｓｅ Ｉで処理された１００ｐｇのＨＡＶプラスミドであり、Ｂ８及びＤ８はＤＮａｓｅ Ｉで処理されていないそれぞれ１００及び２００ｐｇのＨＡＶプラスミドである。
【００２４】
図６はＨＡＶ ＲＮＡ発現を以前に示した四つの異なるトマト系統からのＨＡＶタンパク質の発現を示す。トマト７−１，１２−１，３１−１及び３１−２からのタンパク質抽出物は図６に示す通りウェスタンブロット分析に供された。四つの系統全てから採取されたトマト組織は抗ＨＡＶ抗体を用いて検出されるようなＨＡＶタンパク質（７０Ｓ）を発現するようにみえる。
【００２５】
図７はＨＡＶ又はトランスジェニックトマトＨＡＶワクチンに対するマウスのＩｇＡ応答が評価される第２セットの実験において用いられる免疫感作プロトコールを示すフローチャートである。
【００２６】
好ましい実施態様の記述
本発明は食用植物及び／又は動物製品中に製造されるワクチン、並びにトランスジェニック植物又は動物中の病原体の少なくとも一つの完全な構造の生産を通した第二世代のワクチン開発方法、並びにワクチン自体の提供方法である。好ましくは本発明は複数のタンパク質及び／又は複数のかかるタンパク質の一部の共発現を通して食用食品植物中でのウイルス様粒子の生産を可能にする。「ウイルス様」粒子は従ってここでは共発現される複数のウイルスタンパク質及び／又はかかるタンパク質の一部の群として定義される。ウイルス構造タンパク質の共発現はヒト免疫系に対するウイルス関連抗原の適切な呈示を増大させるにちがいない。
【００２７】
本発明の操作の好ましい例として、ワクチンはＡ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）に対して製造された。単離されたキャプシドタンパク質を用いて予防接種するという以前の試みはＨＡＶについては失敗している。何故なら、それは中和抗体を生産しなかったからである。中和抗体はキャプシドの集合後にのみ生成されるウイルス粒子上の特定構造を認識する。この問題を克服するため、好ましくは本発明は植物の安定な形質転換のため５′ＵＴＲを欠く非感染性のＨＡＶゲノムを担持する二つのＨＡＶプラスミドの構築を含む。一つのプラスミド（ｐＧＰＰａｔΩＨＡＶ）においてはＨＡＶの転写はトマト果実中での発現のためのパタティンプロモーターから推進され、第２のプラスミド（ｐＪＤＨＡＶ）においては転写は３５ＳＣａＭＶプロモーターの制御下にあり、トランスジェニック植物の緑色部で発現されるべきである。ＨＡＶトランスジーンに対する免疫応答を評価するため、トランスジェニック植物の作物は実験動物によって摂取された。
【００２８】
本発明の好ましい実施態様によれば、ワクチンに対して開発された技術は遺伝子のビークルとして非感染性ウイルス粒子を含有する植物の摂取を通して特定の器官に対する遺伝子標的化のために所望により適用されることもでき、これはより好ましいことである。
【００２９】
消化系（口、食道、胃、小腸、大腸、及び直腸）のいかなる部分をも実際攻撃しない病原体に対するいかなる種類のワクチンの経口投与についての比較モデルシステムを与えるため、ＨＡＶに対するワクチンを経口投与する方法が開発された。次に、トランスジェニック植物がモデル病原体としてＨＡＶの外側キャプシドからのタンパク質を用いて構築された。最後にこれらの植物はモデル哺乳動物系としてのマウスにおいて免疫原性応答を誘導することに対するそれらの能力について試験された。これらの段階のそれぞれは以下の個別のセクションにおいて議論される。
【００３０】
セクション１：モデル病原体としてのＨＡＶ
トランスジェニック植物ＨＡＶワクチンは消化系（口、食道、胃、小腸、大腸、及び直腸）のいかなる部分をも実際攻撃しない病原体に対するいかなる種類のワクチンの経口投与についての比較モデルシステムとして開発された。正規のＨＡＶワクチンの開発された経口投与方法はそれ自体新規かつ非自明である。何故ならそれはｉ．ｍ．（筋肉内）注射を通して通常投与されるかかるワクチンの経口投与の最初の成功例だからである。従って、比較モデルシステムは発明的ワクチンでもあり、その投与方法でもあり、本発明の一部である。
【００３１】
胃腸管は有意な健康的負荷を課す多数のウイルスにとっての主要な侵入口である。プラス鎖ＲＮＡウイルスであるＨＡＶはかかる感染性病原体の一つである。ＨＡＶは胃腸系を通してヒト体内に侵入し、組織特異的な複製のために肝臓に移動し、肝臓損傷及び臨床的肝炎をもたらす。
【００３２】
患者をＨＡＶ病に対して免疫感作するため、本発明に対する比較モデルは現在利用可能なＨＡＶワクチンであるＨＡＶＲＩＸ（商標）（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）の如きＨＡＶワクチンの直腸投与を含む。以下の結果に示される通り、免疫系は消化管上皮におけるＭ型細胞又は他の抗原呈示細胞（ＡＰＣ）においてＭＨＣタイプＩ分子によるウイルスペプチドの呈示に続いてウイルスヌクレオキャプシドタンパク質を認識する。ポリオウイルス（ピコルナヴィルス科の他のメンバー）及び他のウイルス病原体についてのワクチンは同一の原理を用いることによって、即ち胃腸管をおおう上皮細胞に対する天然ウイルスの親和性を用いることによって開発することができるであろう。
【００３３】
本発明による好ましい予防接種戦略は、小腸をＨＡＶ関連粒子に対してさらし、それによって抗体免疫応答及びひょっとすると細胞性免疫応答の両方を潜在的に誘発すること（これは最近“Ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ａ ｖａｃｃｉｎｅ ｉｎ ｈｅａｌｔｈｙ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ ｗｉｔｈ ｄｅｌａｙｅｄ ｓｅｒｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ”； １０ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｖｉｒａｌ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ａｔ Ａｔｌａｎｔａ Ｇｅｏｒｇｉａ ９−１３ Ａｐｒｉｌ ２０００ ｂｙ Ｐａｇａｌｉｅｒｏｎｉ ＴＧ ｅｔ ａｌ． Ａｂｓｔｒａｃｔ ０１１ に示されている）、及びＨＡＶ中和抗体を最適に生成させることを含む。
【００３４】
本発明の方法を試験するため、ＨＡＶ関連粒子に対する小腸暴露方法としてＨＡＶＲＩＸ（商標）の直腸投与に続いてｉｎ ｖｉｖｏでの抗ＨＡＶ抗体生産を評価するための動物モデルが開発された。以下の実験プロトコールが用いられた。ＨＡＶワクチンはＢａｌｂ／ｃマウスに０日及び２１日に腹膜内（ｉ．ｐ．）、直腸内（ｉ．ｒ．）又は鼻腔内（ｉ．ｎ．）投与された。各処理について６匹のＢａｌｂ／ｃマウスはＨＡＶワクチンの商業的調製物（ＨＡＶＲＩＸ（商標））を１ｍｌ当たり７２０のＥＬＩＳＡ単位の濃度で鼻腔内については２０マイクロリットル、直腸内については１００マイクロリットル又は腹膜内については１００マイクロリットル受け入れた。
【００３５】
次にマウスは最初の予防接種の３５日後に商業的キット（ＨＡＶＡＢ， Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ， Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ ＩＬ， ＵＳＡ）を用いて特異的ＨＡＶ抗体全体について試験された。
【００３６】
図１において見られる通り、ｉ．ｐ．（陽性コントロール）又はｉ．ｒ．ルートを通してワクチンを受け入れたマウスは抗ＨＡＶ抗体を生産したが、鼻腔内でワクチンを受け入れたマウスは特異的抗体を生産しなかった。単一の仮説に限定されることは望まないがこれらの結果は直腸投与に続いてウイルスキャプシドタンパク質はマウスの免疫系に呈示されたということを示唆する。この呈示はＩｇＧクラスから及びひょっとするとＩｇＡクラスから（これは特異的に試験されたわけではないが）抗ＨＡＶ抗体を生成した。ポリオワクチンの経口投与はＩｇＧ及びＩｇＡクラスの両方の抗体の生成を誘発することが知られている（例えば“Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｃｏｓａｌ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｂｙ ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ ｖａｃｃｉｎｅ ｉｓ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｎ ｐｒｅｖｉｏｕｓ ｍｕｃｏｓａｌ ｃｏｎｔａｃｔ ｗｉｔｈ ｌｉｖｅ ｖｉｒｕｓ”； Ｈｅｒｒｅｍａｎｓ ＴＭ， Ｒｅｉｍｅｒｉｎｋ ＪＨ， Ｂｕｉｓｍａｎ ＡＭ， Ｋｉｍｍａｎ ＴＧ， Ｋｏｏｐｍａｎｓ ＭＰ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９９ １５；１６２：５０１１−８ を参照されたい）。
【００３７】
ウイルスが消化管上皮を通して侵入する場合においては、粘膜のＩｇＡ抗体がウイルスを侵入口で中和する本質的な役割を果たす。何故ならそれらは生産されて消化管内腔に分泌されるからである。
【００３８】
皮内（ｉ．ｄ．）又はｉ．ｍ．ルートを介してのワクチンの全身（非経口）投与は殺生された（Ｓａｌｋ）ポリオワクチンのｉ．ｍ．投与の結果から明らかなようにＩｇＧクラスの抗体のみを通常生ずる。ｉ．ｍ．注射で通常送達される現在のＨＡＶワクチンはＩｇＧクラスの抗体のみを生産すると考えられている。ポリオウイルス及びＨＡＶの如き消化管上皮を介して侵入する病原体に対する成功的な免疫感作は侵入口でのＩｇＡクラスの中和抗体の局部的生産を明らかに必要とする。ｉ．ｄ．又はｉ．ｍ．ルートを介した非経口免疫感作はＩｇＭ及びその後のＩｇＧクラス抗体からなる全身性免疫応答のみを通常生じる。対照的に、経口（ｐ．ｏ．）又は直腸内（ｉ．ｒ．）又は鼻腔内（ｉ．ｎ．）ルートを介した粘膜免疫感作はＩｇＧ及びＩｇＡ抗体の両方からなる局部的（粘膜的）及び全身性免疫応答の両方を誘導する。粘膜（呼吸器、消化管、尿生殖器）ルートを介して侵入する病原体の場合は、後者の種類の免疫応答がホストにとって明らかに一層有利である。
【００３９】
ＨＡＶワクチンが直腸粘膜を通して体に投与される本発明の方法は、ウイルスの侵入口を阻止することによって現在の予防接種プログラムに比べて主要な利点を有することができるであろう。加えて本発明の方法は針又は他の侵入的方法を必要とすることなしにＨＡＶに対する成功的な免疫応答の生成を誘導することを可能にする。
【００４０】
従って、以下でより詳細に記述される実験結果は直腸内ルートがＨＡＶ及び胃腸ルートを通して体に侵入する他のウイルスに対する保護的な予防接種の生成のための好適な方法であるということを明らかに示す。
【００４１】
従って本発明は抗ＨＡＶ免疫応答の生成のためのＨＡＶＲＩＸ（商標）の如きＨＡＶワクチンの直腸投与を可能にし、それによってＨＡＶに対する中和抗体を誘発する。
【００４２】
本発明を限定することは望まないが、ＨＡＶワクチンの好適な用量は好ましくは各投与につき約０．７５から約７５００ＥＬ．Ｕ．の範囲の抗原であり、より好ましくは約７５ＥＬ．Ｕ．の抗原であり、坐薬、クリーム、液体、錠剤又は直腸粘膜に対するＨＡＶ抗原の投与に好適ないかなる他の固型、半固型又は液体用量形態で直腸に適用される。
【００４３】
本発明の方法は所望により及び好ましくは患者の胃腸粘膜、特に直腸粘膜を通した少なくとも一つのウイルスキャプシド包含遺伝子の投与に好適である。この所望のしかし好ましい方法においては、ウイルスキャプシド包含遺伝子は既述したＨＡＶワクチンについての様式と実質的に同様の様式で患者の胃腸粘膜に投与される。従って、本発明は胃腸、特に直腸粘膜を通して患者に一以上のウイルスキャプシド包含遺伝子を投与する方法をも提供する。
【００４４】
セクション２：トランスジェニック植物の構築
少なくとも一つのＨＡＶ構造を担持するトランスジェニック植物が構築された。この例によると、トランスジェニックトマト植物は非感染性ＨＡＶウイルス粒子を生産するために構築された。これらのＨＡＶウイルス粒子はそれらのゲノムがその５′ＮＴＲの約７３０ｎｔを除かれているので非感染性である。この約７３０ｎｔなしではそれらは複製することもそれら自身のタンパク質を発現することもできない。ウイルスゲノムのこの部分の削除はウイルスの外部構造には影響を与えない。従って、これらのトランスジェニックトマトが食されると、ヌクレオキャプシドタンパク質を有する非感染性ウイルス粒子は同様に摂取されるであろう。次に胃腸管におけるウイルスタンパク質の存在は以下のセクション３で示される通りＨＡＶ特異的抗体の生産を誘導する有効な免疫原として作用するにちがいない。
【００４５】
ＨＡＶゲノムを有するプラスミドベクターの構築
ウイルスの５′ＵＴＲ及びＨＡＶ転写開始部位からの追加の１０ｂｐを欠く６．７ｋｂのＸｂａＩ−ＰｍｅＩ ＨＡＶ／７ ｃＤＮＡフラグメントはプラスミドｐＨＡＶ／７から単離された。このフラグメントはＨＡＶ／７の１０個の５′コーディングヌクレオチドを含む改変されたＢＳＫＳプラスミド中に挿入された。更なる遺伝子工学処理により３５ＳＣａＭＶプロモーター及びオメガ（ＴＭＶ）転写−エンハンサーボックスがＨＡＶ／７コーディング領域の手前に挿入され、ｎｏｓターミネーターがこの領域の後ろに挿入された。プロモーター−ＨＡＶ−ターミネーターの組合せはバイナリーベクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍによって媒介される遺伝的形質転換用）ｐＧＰＴＶ−ｋａｎ中に最終的にクローニングされ、ｐＧ３５ＳΩＨＡＶと名付けられた。後者のベクターはヘルパープラスミドを用いてＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａ中に誘導され、ＢＹ−２タバコ細胞がｐＧ３５ＳΩＨＡＶで形質転換された。ＫａｎＲ細胞系が選択され確立された。トランスフェクトされた細胞中のＨＡＶ配列の存在はウイルスのＶＰ１−ＶＰ３ウイルス構造領域からのプライマーを用いたＰＣＲによって決定された（図２）。
【００４６】
ｐＧ３５ＳＨＡＶに類似するベクターが３５Ｓ ＣａＵＶプロモーターの代わりにパタティンプロモータを用いて構築された。このベクターはｐＧＰＰＡＴＨＡＶと名付けられ、トマト植物をＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ形質転換手順により形質転換させてトマト果実にＨＡＶキャプシドコーディング領域の発現を指向させるために用いられた。このＨＡＶ構造物（ｐＧＰＰＡＴＨＡＶ）を用いたトマト組織の遺伝的形質転換の後、１７系統のトランスジェニックトマト植物が誘導された（各系統につき４−６植物）。これらの系統はそれらのゲノムＤＮＡ中のＨＡＶ配列の存在について評価された。図３は１２のトランスジェニックトマト植物葉から生産されたＤＮＡの放射性ラベルされたＨＡＶ ｃＤＮＡプローブを用いたドットブロットハイブリダイゼーション結果を示す。図においてわかるとおり、１２の植物は全てＨＡＶ ＤＮＡ配列を含有していた。いくつかの植物はＨＡＶ特異的配列についてＰＣＲによって更に評価された（図４）。
【００４７】
７２のトランスジェニック植物全てから抽出されたＤＮＡに付随して、ＨＡＶ統合配列の評価のため、陽性植物の果実中のＨＡＶ ＲＮＡ転写物の存在も検出された。トマト植物から抽出された総ＲＮＡはドットブロット及びハイブリダイゼーションアッセイによってＨＡＶ特異的ＲＮＡ配列についてプローブされた（図５Ａ参照）。見られる陽性シグナルがＲＮＡサンプル中の残存ＤＮＡによるものであるという可能性を除去するため、トマト果実から抽出されたＲＮＡはＤＮａｓｅ Ｉで処理され、ドットブロット分析が繰返された（図５Ｂ）。Ａ及びＢの上のサンプルはＤＮａｓｅ Ｉで処理され、一方Ｃ及びＤの上のサンプルはＤＮａｓｅ Ｉで処理されなかった。図において見られる通り、いくつかのＲＮＡサンプルにおいては特異的シグナルはＤＮａｓｅ Ｉ処理が行われた後の方が弱い（例えばＡ１，Ａ２，Ａ５）。しかし、他のサンプル（Ａ３，Ａ５，Ａ６，Ａ８及びＢ１）ではシグナルはコントロールのトマト（Ｂ２）のそれよりも高い。
【００４８】
ＨＡＶ ｍＲＮＡ転写物について陽性と判断された植物は挿入されたＲＮＡの発現について更に試験された。予測されたＨＡＶタンパク質生産物はマウスのモノクローナル抗ＨＡＶを含む特異的抗ＨＡＶ抗体（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｓａｃｏ， Ｍａｉｎｅ， ｃａｔ． Ｎｏ． Ｃ６５８８５Ｍ）及びｉ．ｐ．で与えられた７２ＥＬ．Ｕ．のＨＡＶＲＩＸ（商標）ワクチンで１０日の間隔で２回免疫感作されたＢａｌｂ／ｃマウスから生産された抗血清を用いてウェスタンブロット分析によって検出された。
【００４９】
図６はＨＡＶ ＲＮＡ発現を以前に示した四つの異なるトマト系統からのＨＡＶタンパク質の発現を示す。トマト７−１，１２−１，３１−１及び３１−２から抽出されたタンパク質は示される通りウェスタンブロット分析に供された。
【００５０】
ＨＡＶ関連タンパク質の発現はこれらの四つのトマトトランスジェニック系統において評価された。四つの系統全てから採取されたトマト組織は抗ＨＡＶ抗体（７０Ｓ）を用いて検出される通りＨＡＶタンパク質を発現するように思える。更に、ＨＡＶキャプシドを構成するＨＡＶ関連構造タンパク質の存在は図６に示される通りこの特異的抗体によって検出された。従ってトランスジェニックトマト植物はＨＡＶタンパク質を発現するのみならず、より特異的にはＨＡＶキャプシドタンパク質を発現し、それに対して免疫原性応答が誘導されると予測することができる。
【００５１】
セクション３：粘膜免疫感作戦略の更なる評価及び植物ベースのワクチンのマウスにおける予備試験
ＨＡＶ用のミョウバンに吸着されたＨＡＶＲＩＸ（商標）ワクチンはｉ．ｍ．ルートを介した送達のみが一般に認められており植物ベースのワクチンはウイルス様粒子のみからなるので、実験はアジュバントなしのウイルス粒子として（即ち植物ベースのワクチンに匹敵するフォーマットで）呈示後に消化管においてＨＡＶに対する免疫応答を評価するために設計された。このセクションはＨＡＶウイルスが単独でｉ．ｒ．又はｐ．ｏ．ルートを介して送達される粘膜免疫感作戦略を評価するために行われた様々な試験及び分析を記述する。これらの実験は粘膜免疫の評価方法を開発するために設計され、ＩｇＡ生成細胞及び消化管粘膜におけるＩｇＡ分泌をそれぞれ測定するためのＥＬＩＳｐｏｔ及びＥＬＩＳＡを含み、並びに脾臓及び消化管由来のリンパ球の両方における細胞性免疫応答を測定するためのルーチンの増殖アッセイに適合している。このセクションは経口ルートを介して送達される植物ベースのＨＡＶワクチンの予備試験をも記述する。実験方法及び結果は以下詳細に記述される。
【００５２】
マウスの免疫感作
抗原：実験開始時に４−６週齢のメスのＢａｌｂ／ｃマウスが用いられた。用いられた抗原は半精製されたホルマリンで不活性化されたＨＡＶ（ＨＡＶＲＩＸ（商標）ワクチンにおけるのと同様にＦＲｈＫ４細胞中で増殖された株ＨＭ−１７５）であり、これは商業源（Ｍｉｃｒｏｂｉｘ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．， Ｔｏｒｏｎｔｏ， Ｃａｎａｄａ， ＨＡＶ Ｇｒａｄｅ ２ 抗原、ｃａｔ． Ｎｏ． ＥＬ ２５−０２）から得られ、製造者によって与えられる情報によれば２．２ｍｇ／ｍｌのタンパク質及び約６．０ＥＬ．Ｕ．／ｍｌのＨＡＶ抗原を含有していた。この抗原は二つの異なる呈示形態でマウスを免疫感作するために用いられた。ルーチンのｉ．ｐ．免疫感作のため、抗原は不完全フロインドアジュバント（ＩＦＡ）を用いて１：１に乳化された。ｉ．ｒ．又はｐ．ｏ．ルートを介した免疫感作のため、抗原は滅菌食塩水で１：１に希釈され、ツベルクリンシリンジに取付けられたＮｏ．１外科用カテーテルを用いて送達された。経口抗原は受動的に提供され、侵入性胃管栄養は用いられなかった。このシリーズの実験のすべての免疫感作のためには用量体積は１００マイクロリットルであった（約１１０マイクログラムの総タンパク質又は０．３ＥＬ．Ｕ．のＨＡＶ抗原を含む）。二つのトマト株（２−２１及び３−１２）（これらは両方ともＨＡＶ挿入についてｍＲＮＡを発現することが示された）によって生産されたトランスジェニック植物ＨＡＶワクチンも評価された。免疫感作のため、約０．４ｇの凍結乾燥されたトランスジェニック植物材料は４ｍｌの滅菌食塩水中に懸濁され、１０秒バーストを用いて３分間氷上で超音波分解された。生じた材料は遠心分離され、上澄みはマウスを免疫感作するために用いられ、各マウスに１００マイクロリットルがｐ．ｏ．で与えられた。ＩＦＡで乳化された滅菌食塩水（ｉ．ｐ．注射用）又は単独で与えられた滅菌食塩水（ｉ．ｒ．またはｐ．ｏ．ルート用）は陰性のコントロール抗原として用いられた。
【００５３】
免疫感作プロトコール及びスケジュール：免疫感作プロトコール、スケジュール及び用いられた動物の数は以下の通りである。ｉ．ｐ．又はｉ．ｒ．ルートを介して免疫感作された動物は２用量を１２日の間隔で受け入れ、一方、経口的に免疫感作された動物は４用量を５日の間隔で受け入れた。最終免疫感作の３週間後、約０．５ｍｌの血液が各マウスの尾の血管から得られた。どのマウスが免疫感作に対して応答したかを決定するため、血清が調整され、＜２０ ＷＨＯｍＩＵ／ｍｌの感度でヒト血清中のＨＡＶ特異的ＩｇＧを測定するために設計された商業的な競合的阻害酵素免疫アッセイ（ＥＴＩ−ＡＢ−ＨＡＶＫ−３ ［抗ＨＡＶ］， Ｓｏｒｉｎ ＢｉｏＭｅｄｉｃａ， Ｉｔａｌｙ）を用いて試験された。このアッセイは試験されるべき抗体がキット成分の一つの結合を競合的に阻害する競合的阻害方法であるので、アッセイはマウスのいずれかがアッセイ試薬の結合を阻害することができるＨＡＶ特異的ＩｇＧを生産したかどうかを決定するために用いられた。
【００５４】
試験された動物のいずれもがこの方法によってＨＡＶ特異的ＩｇＧについて明確に陽性であると試験されなかったものの、ｉ．ｐ．ルートを介してＨＡＶ／ＩＦＡで免疫感作された２匹のマウスは特異的ＩｇＧのボーダーラインレベルを有していた。これらの陰性結果はマウスが粘膜免疫区画において応答したという可能性を排除しなかったので、動物は続いて処理間で無作為化され、２群で試験された。一つの群は最終免疫感作の７〜２８日後にわたる期間にわたって６〜８マウスの亜群で殺された。脾臓及びパイエル板は採取され、細胞集団はＨＡＶ又はコントロール抗原（以下参照）を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏでの刺激のために、及びＥＬＩＳｐｏｔ及びＥＬＩＳＡを用いたＨＡＶ特異的ＩｇＡ応答及び以下に詳細に記述される通りＨＡＶ特異的増殖指標の評価のために調製された。第２群のマウスは更に３週間生き延びることを許され、次にＨＡＶ抗原（２７．５ｕｇの総タンパク質又は０．６ＥＬ．Ｕ．）の単一ｉ．ｄ．追加抗原刺激を受けた。これらのマウスは７〜２１日の期間にわたって６〜８匹の群として殺された。この後者の群は細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏでＨＡＶ抗原を用いて再刺激された前者の群と対照して「ｉｎ ｖｉｖｏで追加抗原刺激された」と名付けられた。
【００５５】
脾臓細胞及びパイエル板細胞集団の調製
動物は抱水クロラールの過剰投与によって殺された。血液は心臓穿刺によって採取され、４℃で一晩凝固させられた。血清が調製され、試験されるまで−２０℃で冷凍保存された。脾臓及びパイエル板（動物一匹当たり約４〜８個）は除去されて抗生物質（ペニシリン １００Ｕ／ｍｌ及びストレプトマイシン１００マイクログラム／ｍｌ、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）を含む滅菌されたＲＰＭＩ−１６４０培地（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ， Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ， Ｂｅｉｔ Ｈａｅｍｅｋ， Ｉｓｒａｅｌ）中に移され、更なる処理のために研究室に運ばれた。器官は滅菌ＲＰＭＩで１回洗浄された。脾臓細胞（ＳＰＬＣ）懸濁液は滅菌ピンセットを用いて５ｍｌのＲＰＭＩ＋抗生物質中で脾臓を細かくちぎることによって調製された。懸濁液は滅菌された円錐底１５ｍｌ管に移され、組織の残骸は沈殿させられた。懸濁されたＳＰＬＣを含む上澄みは新しい管に移され、細胞は室温で遠心分離（１５００ｒｐｍ、７分）によってペレット化された。細胞はＲＰＭＩ＋抗生物質を通した遠心分離（１５００ｒｐｍ、５分）によって２回洗浄され、次に生存細胞数はＮｅｕｂａｕｅｒ血球計を用いてＴｒｙｐａｎ Ｂｌｕｅ除外によって決定された。次にＳＰＬＣは続くアッセイで用いるために１×１０６細胞／ｍｌの濃度で１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ， ＨｙＣｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｔａｒｏｍ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｐｅｔａｈ Ｔｉｋｖａｈ， Ｉｓｒａｅｌ）を含む同一培地１０ｍｌ中に再懸濁された。
【００５６】
同様にパイエル板は１．５ｍｇ／ｍｌのジスパーゼ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｉｓｒａｅｌ）を含むＲＰＭＩ＋抗生物質５ｍｌ中で細かくちぎられた。パイエル板細胞（ＰＰＣ）懸濁液は円錐底１５ｍｌ管に移され、組織の繊維構造から細胞を解離させるために３７℃で４５〜６０分間撹拌しつつインキュベートされた。次にＰＰＣは遠心分離によってペレット化され、ＲＰＭＩ＋抗生物質を通して２回洗浄され、生存細胞数は上述の通り決定された。ＰＰＣ数は通常限定されているので、抗生物質及び１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ ４．５ｍｌ中の最終懸濁液（これは１×１０４〜５×１０５細胞／ｍｌの数にわたる）は数の更なる調整なしでアッセイに用いられた。
【００５７】
多量培養中のＳＰＬＣ及びＰＰＣのＩＮ ＶＩＴＲＯ刺激
ミリリットルあたりの細胞の初期数を決定した後、各マウスからのＳＰＬＣ及びＰＰＣ調製物は平底滅菌２４ウェル組織培養プレートの５ウェル中に１ｍｌの少量ずつピペットで注入された。各細胞集団に対し、別個のウェルが以下のものを受け入れた：培地のみ（未刺激の陰性コントロール）；１ｍｌあたり１０マイクログラムの最終濃度のアメリカヤマゴボウマイトジェン（Ｓｉｇｍａ）；及び１ｍｌあたり１１，５．５，２．８及び１．４マイクログラムのウェルあたり最終濃度を与えるように希釈されたＨＡＶ抗原（Ｍｉｃｒｏｂｉｘ）。プレートは３７℃、空気中の５％ＣＯ２で５日間インキュベートされた。この培養期間の終わりに０．７ｍｌの上澄みが各ウェルから除去され、ＥＬＩＳＡによるＨＡＶ特異的ＩｇＡの決定（以下参照）のため−２０℃で貯蔵された。ＨＡＶ特異的ＩｇＡ生成細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激後に評価されるアッセイのため、細胞は以下のように処理された。各ウェルからの細胞は円錐底管に収集され、ＲＰＭＩ＋抗生物質を通した遠心分離により１回洗浄され、抗生物質及び１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ １ｍｌ中に再懸濁された。ｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激後の生存細胞数はＴｒｙｐａｎ Ｂｌｕｅ除外により決定され、初期細胞集団中の細胞密度と関連付けられて刺激指数（ＳＩ）を与える。２．０以上のＳＩは刺激に対する陽性の応答であるとみなされた。細胞集団は（細胞数が許容される限り常に）１×１０６細胞／ｍｌに調整され、以下に記述するようなＨＡＶ特異的ＩｇＡ生成細胞の存在及び数を決定するためのＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおいて用いられた。
【００５８】
増殖アッセイ
ＨＡＶを用いたｉｎ ｖｉｖｏ追加抗原刺激に対する応答が評価される実験のために増殖アッセイが以下のようにして行われた。ＳＰＬＣ及びＰＰＣＣ（十分な量で存在する場合）は抗生物質及び１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ中で１×１０６細胞／ｍｌに調整された。増殖アッセイは平底９６ウェル組織培養プレート中で行われた。各ウェルは１００マイクロリットルの細胞懸濁液、１００マイクロリットルの培地（上述の通り）、及び１０マイクロリットルの以下のもののいずれか一つを受け入れた：培地のみ（未刺激のコントロール）；１ｍｌあたり１０マイクログラムの最終ウェル濃度を与えるように調製されたフィトヘモグルチニン（Ｓｉｇｍａ）；又は１ｍｌあたり１１，５．５，２．８及び１．４マイクログラムの最終ウェル濃度を与えるように希釈されたＨＡＶ抗原（Ｍｉｃｒｏｂｉｘ）。全ての濃度は１ｍｌあたりのタンパク質のマイクログラムとして表される。重複するウェルが各刺激のためにセットアップされた。プレートは３７℃で空気中の５％ＣＯ２で５日間インキュベートされた。細胞増殖の度合いを決定するため、２マイクロＣｉの３Ｈチミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ， Ｉｓｒａｅｌ）が培養の最後の１８〜２４時間の間に各ウェルに加えられた。細胞は低調溶解によって収集され、それらのＤＮＡはガラス繊維フィルター上に収集されて組入れられた放射能活性が液体シンチレーション計数により決定された。刺激指数（ＳＩ）は刺激されたウェルについて得られた平均（重複にわたっての）ｃｐｍを陰性コントロール（培地のみ）ウェルについて得られた平均ｃｐｍで割ることによって決定された。２．０以上のＳＩは陽性であるとみなされた。
【００５９】
ＥＬＩＳｐｏｔ分析
脾臓及びパイエル板の両方において特異的ＩｇＡ抗体を生産する細胞を検出するため、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイが標準プロトコールから適合された（Ｌｅｗｉｓ ＤＪＭ ＆ Ｈａｙｗａｒｄ ＣＭＭ， Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｕｃｏｓａｌ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ． Ｉｎ： Ｖａｃｃｉｎｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ； Ａ． Ｒｏｂｉｎｓｏｎ， ＧＨ Ｆａｒｒａｒ， ＣＮ Ｗｉｂｌｉｎ， Ｅｄｓ．， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｔｏｗａ， ＮＪ， １９９６， ｐｐ １８７−１９５）。このアッセイの原理は、特異的ＩｇＡを生成する細胞はそれを抗原コートされたマイクロプレートウェルの表面に分泌し、従来の酵素結合免疫吸着（ＥＬＩＳＡ）技術により検出することができる「インプリント」を残すであろうということである。９６ウェルのポリスチレン組織培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ ３５９６， Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．， Ｃｏｒｎｉｎｇ， ＮＹ）のウェルは標準ＥＬＩＳＡコーティング緩衝液（ＨＣＯ２ −／ＣＯ３ ２−，ｐＨ９．６）中の１ｍｌあたり２０マイクログラムのタンパク質に希釈されたＨＡＶ抗原（Ｍｉｃｒｏｂｉｘ）又はＦＲｈＫ４溶解物（細胞を凍結解凍し、１５０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離により上澄みを明澄化させることによって調製されたもの）で一晩コートされた。陰性コントロールウェルはコーティング緩衝液のみを受け入れた。コーティング体積は１ウェルあたり１００マイクロリットルであり、重複ウェルは各抗原又はコントロールについてコートされた。翌日、抗原は捨てられ、ウェルは滅菌リン酸緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ，ｐＨ７．４）で４回洗浄された。ウェルは続いて滅菌ＰＢＳ中の５％ＦＣＳ（１ウェルあたり２５０マイクロリットル）を用いて室温で２〜４時間ブロックされた。ブロッキング溶液は捨てられ、ＳＰＬＣ又はＰＰＣ懸濁液がウェルに加えられ、プレートはプレートレベルを保持しつつかつ期間中かきまぜられないように注意して３７℃、空気中の５％ＣＯ２で２４時間インキュベートされた。ＳＰＬＣは１ウェルあたり１００マイクロリットルの体積中１０００００細胞／ウェルの密度でインキュベートされ、一方ＰＰＣはそれらの収率に従って１０００〜５００００細胞／ウェル（１ウェルあたり１００マイクロリットル）の密度で用いられた。インキュベーション期間の終わりに細胞は捨てられ、マイクロプレートは０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で５回洗浄された。
【００６０】
抗原特異的ＩｇＡ生成細胞がそれらの抗体を抗原コートされたマイクロプレートウェル中に分泌したスポットを検出するため、５％正常ウサギ血清（ＮＲＳ， Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ， Ｂｅｉｔ Ｈａｅｍｅｋ， Ｉｓｒａｅｌ）を含むＰＢＳＴ中で１：５００に希釈されたヤギ抗マウスＩｇＡ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｓ ［ＫＰＬ］．， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤからの親和性精製されたもの）が１ウェルあたり１００マイクロリットル加えられ、マイクロプレートは４℃で一晩インキュベートされた。抗体は捨てられ、ウェルはＰＢＳＴで５回洗浄された。次に５％ＮＲＳを含むＰＢＳＴ中で１：１０００に希釈されたアルカリホスファターゼ結合ウサギ抗ヤギＩｇＧ（親和性精製されたもの、ＫＰＬ）が１ウェルあたり１００マイクロリットル加えられ、マイクロプレートは室温で２時間インキュベートされた。抗体溶液は捨てられ、マイクロプレートはＰＢＳＴで５回洗浄された。ＥＬＩｓｐｏｔを検出するため、製造者の指示に従って調製されたアルカリホスファターゼ基質（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ ＳｉｇｍａＦａｓｔ， Ｓｉｇｍａ）が加えられ（１ウェルあたり１００マイクロリットル）、そして酵素反応は室温で暗くして４５分間進行させられ、それからプレートを蒸留水で３回洗浄することによって停止された。プレートはアルミニウム箔でカバーされ、ＥＬＩｓｐｏｔ計数が行われるまで４℃で貯蔵された。ＥＬＩｓｐｏｔは４００倍の倍率の倒立顕微鏡で数えられた。ＥＬＩｓｐｏｔアッセイにおける非特異的背景反応性は固有のものであるので、全てのアッセイはＦＲｈＫ４抗原（元の免疫原中に存在する）との反応性及び他のアッセイ構成成分（コーティング緩衝液コントロール）に対する非特異的結合についてのコントロールを含む。ＨＡＶ及びコントロール抗原についての重複ウェルにおけるＥＬＩｓｐｏｔは計数され、平均化された。ＨＡＶ特異的ＥＬＩｓｐｏｔの正味の数を計算するため、コントロールウェル中のＥＬＩｓｐｏｔの平均数は平均化され、次にこの平均はＨＡＶ抗原でコートされたウェル中で計算されたＥＬＩｓｐｏｔの平均数から差し引かれた。正味のＨＡＶ特異的ＥＬＩｓｐｏｔ数が報告された（データ表）。
【００６１】
ＥＬＩＳＡ
これらの実験過程中、マウス血清中又は組織培養上澄み中のＨＡＶ特異的ＩｇＡ抗体を検出するため酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）の予備開発が行われた。ポリスチレンＥＬＩＳＡマイクロプレート（Ｎｕｎｃ Ｉｍｍｕｎｏｐｏｌｙｓｏｒｐ， Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｉｓｒａｅｌ）のウェルは上述したように炭酸塩／重炭酸塩コーティング中に１ｍｌあたり２０マイクログラムのタンパク質に希釈されたＨＡＶ抗原（Ｍｉｃｒｏｂｉｘ）又はＦＲｈＫ４抗原で４℃で一晩コートされた（１ウェルあたり１００マイクロリットル、重複して）。陰性コントロールはコーティング緩衝液のみを受け取った。抗原又はコントロール溶液は捨てられ、ウェルは０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で３回洗浄された。ウェルは続いて２５０マイクロリットルのブロッキング緩衝液（ＰＢＳＴ中の５％ＮＲＳ）を用いて室温で１時間ブロックされた。ブロッキング溶液は捨てられ、ウェルはＰＢＳＴで５回洗浄された。ＨＡＶ特異的ＩｇＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ生産について試験されるべき組織培養液又は免疫感作されたマウスからのマウス血清の希釈液（ブロッキング緩衝液中１：２０及び１：２００）が続いて添加され（１ウェルあたり１００マイクロリットル、各抗原及び陰性コントロールについて単一の決定）、プレートは４℃で一晩インキュベートされた。これらの溶液は捨てられ、ウェルは上述の通りＰＢＳＴで５回洗浄された。
【００６２】
次に、ブロッキング緩衝液中で１：５００に希釈されたヤギ抗マウスＩｇＡ（ＫＰＬ）が添加され（１ウェルあたり１００マイクロリットル）、プレートは室温で２時間インキュベートされた。ウェルは空にされ、ＰＢＳＴで５回洗浄された。アルカリホスファターゼ（ＡＰ）結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＫＰＬ、ブロッキング緩衝液中で１：１０００希釈、１ウェルあたり１００マイクロリットル）が添加され、プレートは室温でさらに２時間インキュベートされた。ＡＰ結合物を捨ててウェルをＰＢＳＴで５回洗浄した後、ＡＰ基質（ＳｉｇｍａＦａｓｔ ＮＢＴ基質、Ｓｉｇｍａ、製造者の指図に従って調製）を添加し、プレートは室温で１時間インキュベートされた。４０５ｎｍでの吸光度（Ａ４０５）はＥＬＩＳＡマイクロプレート読み取り機（Ｔｅｃａｎ Ｓｐｅｃｔｒａ Ｒａｉｎｂｏｗ）を用いて決定された。各動物及び処理について結果は抗原（ＨＡＶ又はＦＲｈＫ４）を用いて決定されたＡ４０５をコーティング緩衝液のみを受け取ったウェル中で記録されたＡ４０５で割ることによって得られるシグナル対ノイズ（Ｓ／Ｎ）比として表された。２．０以上のＳ／Ｎ比は陽性であるとみなされた。
【００６３】
結果
【表１】
ａ試験前５〜６日間バルク培養中で用いられた免疫感作プロトコール（動物について）及び刺激物（最終濃度）
ｂ刺激指数（ＳＩ）は刺激されたウェル中の１ｍｌあたりの生存細胞数（Ｔｒｙｐａｎ Ｂｌｕｅ除外血球計計数により決定される通りの）を未刺激の（培地のみの）ウェル中の１ｍｌあたりの生存細胞数で割ることによって決定された。２．０以上のＳＩは陽性であるとみなされた。
ｃＨＡＶ特異的ＩｇＡ Ｓ／Ｎ（シグナル：ノイズ比）はＨＡＶ抗原でコートされたウェル中で測定されたＡ４０５ｎｍをコーティング緩衝液のみを受け取ったウェル中で測定されたＡ４０５ｎｍで割ることによってＥＩＡを用いて決定される通りである。２．０以上のＳ／Ｎは陽性であるとみなされた。
ｄ陽性ＥＬＩＳｐｏｔｓの数はＦＲｈＫ４抗原又はコーティング緩衝液のみでコートされたウェル中で計数されたＥＬＩＳｐｏｔｓの平均背景の上のＨＡＶでコートされたウェル中で計数されたＥＬＩＳｐｏｔｓの平均数である。
ｅバルク培養実験においては、マイトジェンはアメリカヤマゴボウのマイトジェン（ＰＷＭ）であった；ＨＡＶの追加のｉ．ｄ．注射によりｉｎ ｖｉｖｏ追加抗原刺激されたマウスに関与する増殖アッセイにおいては、マイトジェンはフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）であった。
ＳＰＬＣ＝脾臓細胞 ＰＰＣ＝パイエル板細胞
【００６４】
【表２】
【００６５】
【表３】
ａ試験前５〜６日間バルク培養中で用いられた免疫感作プロトコール（動物について）及び刺激物（最終濃度）
ｂ刺激指数（ＳＩ）は刺激されたウェル中の１ｍｌあたりの生存細胞数（Ｔｒｙｐａｎ Ｂｌｕｅ除外血球計計数により決定される通りの）を未刺激の（培地のみの）ウェル中の１ｍｌあたりの生存細胞数で割ることによって決定された。２．０以上のＳＩは陽性であるとみなされた。
ｃＨＡＶ特異的ＩｇＡ Ｓ／Ｎ（シグナル：ノイズ比）はＨＡＶ抗原でコートされたウェル中で測定されたＡ４０５ｎｍをコーティング緩衝液のみを受け取ったウェル中で測定されたＡ４０５ｎｍで割ることによってＥＩＡを用いて決定される通りである。２．０以上のＳ／Ｎは陽性であるとみなされた。
ｄ陽性ＥＬＩＳｐｏｔｓの数はＦＲｈＫ４抗原又はコーティング緩衝液のみでコートされたウェル中で計数されたＥＬＩＳｐｏｔｓの平均背景の上のＨＡＶでコートされたウェル中で計数されたＥＬＩＳｐｏｔｓの平均数である。
ｅバルク培養実験においては、マイトジェンはアメリカヤマゴボウのマイトジェン（ＰＷＭ）であった；ＨＡＶの追加のｉ．ｄ．注射によりｉｎ ｖｉｖｏ追加抗原刺激されたマウスに関与する増殖アッセイにおいては、マイトジェンはフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）であった。
【００６６】
【表４】
ａ試験前５〜６日間バルク培養中で用いられた免疫感作プロトコール（動物について）及び刺激物（最終濃度）
ｂ刺激指数（ＳＩ）は刺激されたウェル中の１ｍｌあたりの生存細胞数（Ｔｒｙｐａｎ Ｂｌｕｅ除外血球計計数により決定される通りの）を未刺激の（培地のみの）ウェル中の１ｍｌあたりの生存細胞数で割ることによって決定された。２．０以上のＳＩは陽性であるとみなされた。
ｃＨＡＶ特異的ＩｇＡ Ｓ／Ｎ（シグナル：ノイズ比）はＨＡＶ抗原でコートされたウェル中で測定されたＡ４０５ｎｍをコーティング緩衝液のみを受け取ったウェル中で測定されたＡ４０５ｎｍで割ることによってＥＩＡを用いて決定される通りである。２．０以上のＳ／Ｎは陽性であるとみなされた。
ｄ陽性ＥＬＩＳｐｏｔｓの数はＦＲｈＫ４抗原又はコーティング緩衝液のみでコートされたウェル中で計数されたＥＬＩＳｐｏｔｓの平均背景の上のＨＡＶでコートされたウェル中で計数されたＥＬＩＳｐｏｔｓの平均数である。
ｅバルク培養実験においては、マイトジェンはアメリカヤマゴボウのマイトジェン（ＰＷＭ）であった；ＨＡＶの追加のｉ．ｄ．注射によりｉｎ ｖｉｖｏ追加抗原刺激されたマウスに関与する増殖アッセイにおいては、マイトジェンはフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）であった。
【００６７】
【表５】
ａ動物による免疫感作のプロトコール。動物は試験前１０〜２８日間２７．５ｕｇのＨＡＶタンパク質（Ｍｉｃｒｏｂｉｘ ＨＡＶ抗原）で追加抗原刺激（ｉ．ｄ．）された。
ｂ刺激指数（ＳＩ）は３Ｈ−ＴｄＲ取り込み実験から決定された：刺激されたウェル中の細胞に取り込まれたｃｐｍの数は未刺激の（培地のみの）ウェル中の細胞に取り込まれたｃｐｍの数で割られた。用いられたマイトジェンはＰＨＡであった。２．０以上のＳＩは陽性であるとみなされた。
ｃＨＡＶ特異的ＩｇＡ Ｓ／Ｎ（シグナル：ノイズ比）はＨＡＶ抗原でコートされたウェル中で測定されたＡ４０５ｎｍをコーティング緩衝液のみを受け取ったウェル中で測定されたＡ４０５ｎｍで割ることによってＥＩＡを用いて決定される通りである。用いられたマイトジェンはＰＷＭであった。２．０以上のＳ／Ｎは陽性であるとみなされた。
ｄ陽性ＥＬＩＳｐｏｔｓの数はＦＲｈＫ４抗原又はコーティング緩衝液のみでコートされたウェル中で計数されたＥＬＩＳｐｏｔｓの平均背景の上のＨＡＶでコートされたウェル中で計数されたＥＬＩＳｐｏｔｓの平均数である。
【００６８】
【表６】
【００６９】
【表７】
【００７０】
【表８】
【００７１】
【表９】
ａ動物による免疫感作のプロトコール。動物は試験前１０〜２８日間２７．５ｕｇのＨＡＶタンパク質（Ｍｉｃｒｏｂｉｘ ＨＡＶ抗原）で追加抗原刺激（ｉ．ｄ．）された。
ｂ刺激指数（ＳＩ）は３Ｈ−ＴｄＲ取り込み実験から決定された：刺激されたウェル中の細胞に取り込まれたｃｐｍの数は未刺激の（培地のみの）ウェル中の細胞に取り込まれたｃｐｍの数で割られた。用いられたマイトジェンはＰＨＡであった。２．０以上のＳＩは陽性であるとみなされた。
ｃＨＡＶ特異的ＩｇＡ Ｓ／Ｎ（シグナル：ノイズ比）はＨＡＶ抗原でコートされたウェル中で測定されたＡ４０５ｎｍをコーティング緩衝液のみを受け取ったウェル中で測定されたＡ４０５ｎｍで割ることによってＥＩＡを用いて決定される通りである。用いられたマイトジェンはＰＷＭであった。２．０以上のＳ／Ｎは陽性であるとみなされた。
ｄ陽性ＥＬＩＳｐｏｔｓの数はＦＲｈＫ４抗原又はコーティング緩衝液のみでコートされたウェル中で計数されたＥＬＩＳｐｏｔｓの平均背景の上のＨＡＶでコートされたウェル中で計数されたＥＬＩＳｐｏｔｓの平均数である。
【００７２】
【表１０】
【００７３】
結果の要約
Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）抗原（ＦＲｈＫ４サル腎臓細胞中で増殖された半精製された調製物としてＭｉｃｒｏｂｉｘから購入）は不完全フロインドのアジュバント（ＩＦＡ）で乳化された腹膜内（ｉ．ｐ．）ルートで；直接適用により直腸的に（ｉ．ｒ．）又は受動的摂食により経口的に（ｐ．ｏ．）送達された場合、マウスにおいて免疫原性である。
【００７４】
ｉ．ｐ．，ｉ．ｒ．、又はｐ．ｏ．ルートで与えられたＨＡＶ抗原は脾臓細胞（ＳＰＬＣ）及びパイエル板細胞（ＰＰＣ）集団の両方においてＨＡＶ応答性（記憶）リンパ球を生成し、これはｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖アッセイによって検出することができる。粘膜（ｉ．ｒ．又はｐ．ｏ．）ルートを介して免疫感作されたマウスにおいては増殖的応答はＳＰＬＣ集団よりもＰＰＣ集団において一層優勢でありかつ一層活発であるようにみえる。
【００７５】
ｉ．ｐ．，ｉ．ｒ．又はｐ．ｏ．ルートで与えられたＨＡＶ抗原はＳＰＬＣ及びＰＰＣ集団の両方においてＨＡＶ特異的ＩｇＡ生成細胞をも生じさせ、これはＥＬＩＳｐｏｔアッセイにより直接的に（免疫感作後）又は間接的に（バルク培養におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ追加抗原刺激後）検出されることができる。しかし、ＦＲｈＫ４抗原と反応するＩｇＡを生成する細胞並びに他のアッセイ構成成分もＥＬＩＳｐｏｔアッセイにより検出されうる。従って、結果はこの背景反応性を差し引いた後の陽性（ＨＡＶ特異的）スポットの正味の数として表されている。
【００７６】
ＳＰＬＣ及びＰＰＣ集団中に存在するＨＡＶ特異的細胞はＨＡＶ特異的ＩｇＡを合成して分泌するように誘導されることができ、このＩｇＡは様々な濃度でのＨＡＶ抗原又はアメリカヤマゴボウマイトジェン（ＰＷＭ）でバルク培養をｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激した後に直接酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）によって検出することができる。
【００７７】
ｐ．ｏ．ルートで与えられた二つのトランスジェニックトマトワクチンは脾臓及びパイエル板において免疫学的記憶リンパ球を誘発した（これは増殖アッセイにより検出可能であった）という点において免疫原性であるようにみえた。
【００７８】
セクション４：更なる実行
既に記述したトランスジェニック植物ワクチンは非感染性ウイルス粒子を含む。これらのウイルス粒子は所望によりＨＡＶゲノム又は他のウイルスゲノムに遺伝子工学処理される好適な遺伝子をパッケージするためにも用いることができ、これは続いてトマト又は他の植物に遺伝子工学処理されることができる。この場合、かかるトランスジェニックトマト又は他の植物材料を食べること又はトランスジーンを経口的に及び／又は直腸的に適用することはトランスジーンがＨＡＶウイルスを用いることによって肝臓に又は他のウイルスを用いることによって体内の他の場所（骨髄又は神経系の如き）に特異的に標的化されることを可能とするであろう。単一の仮説に限定されることは望まないが、ＨＡＶを含有するトランスジェニックトマトの摂食に続いて免疫系が腸管上皮中のＭ型細胞又は他のＡＰＣ中のＭＨＣタイプＩ分子によるウイルスペプチドの呈示に続いてウイルスヌクレオキャプシドタンパク質を認識するにちがいないという仮設が立てられる。ポリオウイルス（ピコルナヴイルス科の他のメンバー）に対するワクチン及び他のウイルス剤は同一の原理、即ち胃腸管を被覆する上皮細胞に対する天然ウイルスの親和性を用いて開発することができるであろう。これらのワクチンは現存のワクチンよりも安全で及び／又は投与しやすいであろう。これらのワクチンは比較的単純で製造費用が安価であるだろう。トランスジェニック植物中でのＨＡＶ粒子生産の成功は他の経口的に消費されるウイルス及び細菌ワクチンの生産に対する原理の証拠であるだろう。
【００７９】
胃腸系による効率的なウイルスの取り込みは特定器官へのトランスジーンの標的化のためにも適用することができるであろう。ＨＡＶの天然の親和性は肝臓に対するものであり、これはたぶん肝細胞膜上のウイルス受容体の発現を通したものである。望ましい遺伝子を含む遺伝子処理されたＨＡＶゲノムをＨＡＶヌクレオキャプシド粒子中に包ませることは遺伝子を肝臓に標的化することを可能にするであろう。骨髄又は神経系への遺伝子の同様の標的化は特定の器官に対する天然の親和性を持つ非エンベロップ型ウイルス（又は他の適当な種類のウイルス）を用いた同様の戦略により潜在的に実行可能である。
【００８０】
本発明は限定された数の実施態様に関して記述されてきたが、本発明の多くの変形、修正及び他の適用をなしうることは理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】
ＨＡＶワクチンの投与後の実験マウスの力価のグラフである。
【図２】
トランスフェクトされた細胞中のＨＡＶ配列の存在を示す。
【図３】
１２のトランスジェニックトマト植物葉から生産されたＤＮＡの放射性ラベルされたＨＡＶ ｃＤＮＡのプローブを用いたドットブロット及びハイブリダイゼーションの結果を示す。
【図４】
ＰＣＲによる図３の植物の一部の評価結果を示す。
【図５】
図５Ａ，Ｂは同様の様式で分析された１７の植物から抽出されたＲＮＡの例を示す。
【図６】
ＨＡＶ ＲＮＡ発現を以前に示した四つの異なるトマト系統からのＨＡＶタンパク質の発現を示す。
【図７】
ＨＡＶ又はトランスジェニックトマトＨＡＶワクチンに対するマウスのＩｇＡ応答が評価される第２セットの実験において用いられる免疫感作プロトコールを示すフローチャートである。
発明の分野
本発明は食用製品を用いたワクチンの投与を通して病気を引き起こす病原体に対して患者を免疫感作する方法に関し、特に、ワクチンが遺伝的に改変された植物製品を通して投与されるかかる方法に関する。好ましくはワクチンはＡ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）に対して指向されている。
【０００２】
発明の背景
感染症は病的状態及び死亡の世界的な原因である。これらのうちのいくつかは極めて幼い子供の如き弱い免疫系を持つ個体に特に影響を与え、世界ベースでの子供の死亡の主要原因である（Ｔｈｅ Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｒｅｐｏｒｔ １９９７， ＷＨＯ）。旅行及び集団間の他の接触は細菌及びウイルス病原体の蔓延の危険性を増大させ、それにより地域社会の以前よりも高度な保護を必要としている。これらの病気を予防する最も有効かつ効果的な戦略は集団予防接種である（Ｒｅｖｉｅｗ： Ｖａｃｃｉｎｅ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ． Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ４： ４７４−５３４， １９９８）。しかし、バイオテクノロジー遺伝子工学の有意な進歩及びワクチンの多量生産における技術の進展にもかかわらず、これらは費用が高く、実際ベースではしばしば利用することができないままである。現在大部分のワクチンは注射によって非経口的に投与される。さらに、かかるワクチンは投与されるまで冷蔵庫で保存されなければならない。従って、集団予防接種プログラムはワクチンの多大な供給、冷蔵設備の維持、及び滅菌シリンジ及び針の供給を現在要求している。これらの要求はかかるプログラムをいくつかの管区、特に第三世界の国々で行うことを困難又は不可能にしている。
【０００３】
Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）はピコルナヴィリアデ（ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉａｄｅ）ウイルス科内のヘパトヴィルス（Ｈｅｐａｔｏｖｉｒｕｓ）属のメンバーであり、かかる集団予防接種プログラムを通して投与することが現在困難であるワクチンがある病原体の一例である。Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）は糞便−経口ルートで伝達される多くのウイルス病の一つであり、多くの国で初期幼児期の病的状態及び死亡に関連する病気の一例である。胃腸系を通して経口的に体内に侵入した後、ＨＡＶは組織特異的複製のために肝臓に移動し、臨床的肝炎をもたらす。ＨＡＶについての集団予防接種プログラムは企てられたことがない。
【０００４】
ＨＡＶワクチンは低いウイルス力価を作り出す霊長類の組織培養で現在製造されており、それ故高価である。その高価さ及び製造の困難さは現在ＨＡＶワクチンは小規模のプログラムのためにのみ購入することができるような高価さ及び困難さである。それ故、安価で効果的な集団予防接種のための新規な解決策が必要である。単純な方法を通してワクチンを与えることはワクチン摂取及びＨＡＶに対する集団保護を有意に増大させることができるであろう。
【０００５】
最近、サルモネラの如き細菌又はＨＩＶの如きウイルス病原体に対する予防接種は弱毒化された又は殺生された細菌／ウイルスの直腸投与を通して増大させることがたぶんできるということが示されている（例えば“Ｏｒａｌ ａｎｄ ｒｅｃｔａｌ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｕｌｔ ｆｅｍａｌｅ ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ ｗｉｔｈ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ ｖａｃｃｉｎｅ ｓｔｒａｉｎ”； Ｎａｒｄｅｌｌｉ−Ｈａｅｆｌｉｇｅｒ Ｄ， Ｋｒａｅｈｅｎｂｕｈｌ ＪＰ， Ｃｕｒｔｉｓｓ Ｒ ３ｒｄ， Ｓｃｈｏｄｅｌ Ｆ， Ｐｏｔｔｓ Ａ， Ｋｅｌｌｙ Ｓ， Ｄｅ Ｇｒａｎｄｉ Ｐ． Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ． １９９６；６４：５２１９−２４； 及び“Ａ ｒａｔｉｏｎａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｍｕｃｏｓａｌ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ＨＩＶ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ”， Ｌｅｈｎｅｒ Ｔ， Ｂｅｒｇｍｅｉｅｒ Ｌ， Ｗａｎｇ Ｙ， Ｔａｏ Ｌ， Ｍｉｔｃｈｅｌｌ Ｅ． Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ． １９９９；１７０：１８３−９６ を参照されたい）。ワクチンの直腸、鼻又は経口投与は体液性及び細胞性免疫応答の両方を誘発することが示されている。しかし、これらの結果は可変性であった。それにもかかわらず、経口ポリオワクチン（Ｓａｂｉｎのワクチン）は保護的なウイルス中和抗体を生成することに極めて良く成功している。
【０００６】
不運なことにＨＡＶワクチン投与のかかる方法は注射以外の投与ルートを通しては成功していない。それ故、ＨＡＶワクチンは投与することが現在困難であり、従っていかなる集団予防接種プログラムも高価で実行することが困難である。
【０００７】
他の多くのワクチンも経口的に投与されることが最も有用であるだろう。しかし、経口投与形態で利用可能なこれらのワクチンについてすら、ワクチンの保存及び取扱い条件並びにもちろん予防接種費用のために集団予防接種プログラムは行うことが困難である。現在、ワクチンは様々な組織で及び／又は細菌細胞培養から通常製造されており、これは高価で困難な製造方法である。加えて、製造されたワクチンは注意深く取扱われなければならず、冷蔵及び／又は他のタイプの特別な取扱いをしばしば必要とし、これは遠隔地又は技術が未発展の地域では行うことが困難であるか又は不可能であるかもしれない。
【０００８】
最近の研究はワクチンの多量製造及び保存という従来記述されてきた問題を克服する試みにおいて細菌又はウイルスタンパク質を発現することができる遺伝子工学処理された（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）植物を製造している。例えば、コレラ毒素Ｂサブユニットオリゴマーはトランスジェニックジャガイモ植物中で発現された。しかし、生じた植物は免疫原性について試験されていない（Ａｒａｋａｗａ ｅｔ ａｌ．， “Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｏｌｅｒａ Ｔｏｘｉｎ Ｂ Ｓｕｂｕｎｉｔ Ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ ｉｎ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｐｏｔａｔｏ Ｐｌａｎｔｓ”； Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ６：４０３−４１３； １９９７）。同様に、狂犬病ウイルスの糖タンパク質（これはウイルスの外側表面をコートする）がトランスジェニックトマト植物中で発現されている。しかし、生じた植物は免疫原性についてやはり試験されていない（ＭｃＧａｒｖｅｙ ｅｔ ａｌ．， “Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｒａｂｉｅｓ Ｖｉｒｕｓ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｔｏｍａｔｏｅｓ”； Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １３：１４８４−１４８７， １９９５）。また、米国特許第５９１４１２３号は植物中で発現されるワクチンを記述するが、生じた植物物質ワクチンの免疫原性に関するデータは与えられていない。米国特許第５６１２４８７号及び第５４８４７１９号も植物中で発現される抗ウイルスワクチンを記述するが、同様に生じた植物物質ワクチンの免疫原性に関するデータは与えていない。
【０００９】
試験された植物ベースのワクチンがすべて免疫原性であると証明されたわけではない。更に、食物としてのいくつかのワクチン含有植物の摂取、つまり植物製品の通常の経口摂取は動物及びヒトにおいて部分的に保護的な免疫応答しか引き起こさなかった（Ｓａｎｄｈｕ ｅｔ ａｌ， “Ｏｒａｌ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｅ ｗｉｔｈ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｔｏｍａｔｏ ｆｒｕｉｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ−Ｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｄｕｃｅｓ ａ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ”， Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ９： １２７−１３５， ２０００； Ｒｉｃｈｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， “Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｓ ｆｏｒ ｏｒａｌ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ”， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １８：１１６７−１１７１， ２０００； 及び Ｍａｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， “Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｎｏｒｗａｌｋ ｖｉｒｕｓ ｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｔｏｂａｃｃｏ ａｎｄ ｐｏｔａｔｏ ａｎｄ ｉｔｓ ｏｒａｌ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｉｎ ｍｉｃｅ”， ＰＮＡＳ， ９３：５３３５−５３４０， １９９６）。
【００１０】
これらの植物ベースのワクチン、特にある病原体に対する植物ベースのワクチンの低い免疫原性についての部分的な説明は、標的抗原が単離されたタンパク質又はペプチド又はタンパク質の一部のみとして発現され、無傷の病原体の関連で発現されなかったという事実に関する。それ故、これらのタンパク質は免疫系によって認識される正確な三次構造をとることができない。例えば、ＨＡＶキャプシドタンパク質は個別に発現されると中和抗体を誘発することができない。この結果は驚くべきことではない。何故なら初期の研究は他のウイルス及び細菌は全体構造の一部のみが従来のワクチンとして投与されると同様の挙動を示すことを示しているからである（Ａｌｍｏｎｄ ａｎｄ Ｈｅｅｎｅｙ，“ＡＩＤＳ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｉｎ ｐｒｉｍａｔｅ ｍｏｄｅｌｓ”， ＡＩＤＳ １２（ｓｕｐｐｌ Ａ）：Ｓ１３３−１４０， １９９８； Ｍａｙｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｓｅｒｏｔｏｐｅ ５ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｃａｐｓｉｄ ａｎｄ ３Ｃ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｃｏｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ Ｆｏｏｔ−ａｎｄ−Ｍｏｕｔｈ Ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ ａｓ ａ ｖａｃｃｉｎｅ ｃａｎｄｉｄａｔｅ”， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ２６３：４９６−５０６， １９９９； 及び Ｗｉｇｄｏｒｏｖｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，“Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ Ｆｏｏｔ−ａｎｄ−Ｍｏｕｔｈ Ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｍｉｃｅ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｏｒａｌ ｏｒ ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａｌｆａｌｆａ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ ｖｉｒａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ＶＰ１”， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ２５５３：３４７−３５３， １９９９）。
【００１１】
発明の概要
背景技術は病気を引き起こす病原体の少なくとも一つの完全な構造を含有する、規則正しい摂取（つまり経口投与を通した摂取）のための、食用植物及び／又は動物材料によって製造されるワクチンを教示又は示唆していない。背景技術はかかる完全な構造が所望により複数のタンパク質であることができること又は代わりに病原体の構造を模倣する単一分子を含むことができることを教示又は示唆していない。背景技術はＨＡＶの如きウイルスに対する成功的に免疫原性を有するワクチンを教示又は示唆していない。また、背景技術はトランスジェニック植物及び／又は動物中でかかるワクチンを製造する方法を教示又は示唆していない。
【００１２】
従って、病原体がウイルス、細菌又は自然の寄生者であるかにかかわらず、病原体の少なくとも一つの完全な構造の製造を通して、病気を引き起こす病原体に対する保護的な免疫応答を成功的に誘発することができるワクチンに対する要求が存在し、また、かかるワクチンを持つことは有用であるだろう。
【００１３】
本発明はトランスジェニック植物又は動物中で病原体の少なくとも一つの完全な構造を製造することを通して第二世代のワクチン開発の新規な方法を与えることによって、並びにワクチン自体を与えることによって背景技術のこれらの問題を克服し、及び食用植物及び／又は動物製品中にワクチンを製造することについての長い間感じられてきた必要性に対する解決策を与える。好ましくは本発明は複数のタンパク質及び／又は組換えペプチド構造としてのかかるタンパク質の複数の一部の共発現を通して食用植物中でのウイルス様粒子の製造を可能にする。ウイルス構造タンパク質の共発現はヒトの免疫系に対するウイルス関連抗原の適切な提示を増大させるにちがいない。
【００１４】
本発明の操作の好ましい例として、ワクチンはＡ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）に対して製造される。単離されたＨＡＶキャプシドタンパク質を用いて予防接種するという以前の試みは保護的な免疫応答を誘発することに失敗した。何故なら、中和抗体はキャプシドの集合後にのみ生成されるウイルス粒子上の特定構造を認識するからである。この問題を克服するため、好ましくは本発明は植物の安定な形質転換のため５′ＵＴＲを欠く非感染性のＨＡＶゲノムを担持する二つのＨＡＶプラスミドの構築を含む。一つのプラスミド（ｐＧＰＰａｔΩＨＡＶ）においてはＨＡＶの転写はトマト果実中での発現のためのパタティンプロモーターから推進され、第２のプラスミド（ｐＪＤＨＡＶ）においては転写は３５ＳＣａＭＶプロモーターの制御下にあり、トランスジェニック植物の緑色部で発現されるべきである。ＨＡＶトランスジーンに対する免疫応答を評価するため、トランスジェニック植物の作物は実験動物によって摂取された。
【００１５】
本発明の好ましい実施態様によれば、ワクチンに対して開発された技術は遺伝子のビークルとして非感染性ウイルス粒子を含有する食用植物成分の摂取を通して特定の器官に対する遺伝子標的化のために所望により適用されることもでき、これはより好ましいことである。
【００１６】
モデルの病気として、粘膜組織、特に直腸粘膜を通した吸収による患者への規則正しいＨＡＶワクチン投与方法も与えられる。この方法はＨＡＶワクチンが直腸経由で、例えば坐薬として又は他の直腸用量形態で患者に投与されることを可能にし、そしてＨＡＶに対して患者を成功的に免疫感作する。従って、本発明の方法は行うことが困難かつ高価である非経口投与の如き背景技術の投与方法の問題を克服する。
【００１７】
以後、消化系は口、食道、胃、小腸、大腸、及び直腸、又はこれらの一部として規定される。
【００１８】
図面の簡単な説明
上述の及び他の目的、側面及び利点は図面を参照して本発明の好ましい実施態様の以下の詳細な記述からよりよく理解されるであろう。図中、
【００１９】
図１はＨＡＶワクチンの投与後の実験マウスの力価のグラフである；６匹のＢａｌｂ／ｃマウスはＨＡＶワクチンの商業的調製物（ＨＡＶＲＩＸ（商標））を鼻から２０μｌ、直腸から１００μｌ又は腹膜中へ（ＩＰ）１００μｌ投与された。ワクチンは０日及び２１日の２回投与され、最初の予防接種の３５日後に抗ＨＡＶ抗体について試験された（ＨＡＶＡＢ、総抗ＨＡＶ抗体についてのＥＩＡ，Ａｂｂｏｔｔ）。
【００２０】
図２はトランスフェクトされた細胞中のＨＡＶ配列の存在を示す（レーン１−４、レーン５は陰性コントロールでありレーンＰは陽性コントロールである）。配列の存在は果実特異的パタティンプロモーター及びオメガエンハンサー配列の制御下でＨＡＶコーディング配列全体を含有するｐＧ３５ＳΩＨＡＶでトランスフェクトされた細胞についてのウイルスのＶＰ１−ＶＰ３ウイルス構造領域からのプライマーを用いたＰＣＲによって決定された。
【００２１】
図３は１２のトランスジェニックトマト植物葉から生産されたＤＮＡの放射性ラベルされたＨＡＶ ｃＤＮＡのプローブを用いたドットブロット及びハイブリダイゼーションの結果を示す。図からわかる通り、１２の植物は全てＨＡＶ ＤＮＡ配列を含有していた。
【００２２】
図４はＰＣＲによる図３の植物の一部の評価結果を示す。略語は以下の通り：Ｍは分子量サイズマーカーであり；１−６はトマト葉ＤＮＡであり；Ｐは陽性コントロールである。
【００２３】
図５Ａは同様の様式で分析された１７の植物から抽出されたＲＮＡの例を示す。見られる陽性シグナルがＲＮＡサンプル中の残存ＤＮＡによるものであるという可能性を除去するため、トマト果実から抽出されたＲＮＡはＤＮａｓｅ Ｉで処理され、ドットブロット分析が繰返された（図５Ｂ）。略語は以下の通り：（図５Ａ）Ａ１−Ｂ１０はトマト果実ＲＮＡであり；Ｄ１及びＤ３は陰性コントロールであり；Ｄ１０は陽性コントロールである。（図５Ｂ）：Ａ１−８，Ｂ１−２，Ｃ１−８，Ｄ１−２はトマト果実ＲＮＡであり；Ｂ−３はＤＮａｓｅ Ｉで処理された１００ｐｇのＨＡＶプラスミドであり、Ｂ８及びＤ８はＤＮａｓｅ Ｉで処理されていないそれぞれ１００及び２００ｐｇのＨＡＶプラスミドである。
【００２４】
図６はＨＡＶ ＲＮＡ発現を以前に示した四つの異なるトマト系統からのＨＡＶタンパク質の発現を示す。トマト７−１，１２−１，３１−１及び３１−２からのタンパク質抽出物は図６に示す通りウェスタンブロット分析に供された。四つの系統全てから採取されたトマト組織は抗ＨＡＶ抗体を用いて検出されるようなＨＡＶタンパク質（７０Ｓ）を発現するようにみえる。
【００２５】
図７はＨＡＶ又はトランスジェニックトマトＨＡＶワクチンに対するマウスのＩｇＡ応答が評価される第２セットの実験において用いられる免疫感作プロトコールを示すフローチャートである。
【００２６】
好ましい実施態様の記述
本発明は食用植物及び／又は動物製品中に製造されるワクチン、並びにトランスジェニック植物又は動物中の病原体の少なくとも一つの完全な構造の生産を通した第二世代のワクチン開発方法、並びにワクチン自体の提供方法である。好ましくは本発明は複数のタンパク質及び／又は複数のかかるタンパク質の一部の共発現を通して食用食品植物中でのウイルス様粒子の生産を可能にする。「ウイルス様」粒子は従ってここでは共発現される複数のウイルスタンパク質及び／又はかかるタンパク質の一部の群として定義される。ウイルス構造タンパク質の共発現はヒト免疫系に対するウイルス関連抗原の適切な呈示を増大させるにちがいない。
【００２７】
本発明の操作の好ましい例として、ワクチンはＡ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）に対して製造された。単離されたキャプシドタンパク質を用いて予防接種するという以前の試みはＨＡＶについては失敗している。何故なら、それは中和抗体を生産しなかったからである。中和抗体はキャプシドの集合後にのみ生成されるウイルス粒子上の特定構造を認識する。この問題を克服するため、好ましくは本発明は植物の安定な形質転換のため５′ＵＴＲを欠く非感染性のＨＡＶゲノムを担持する二つのＨＡＶプラスミドの構築を含む。一つのプラスミド（ｐＧＰＰａｔΩＨＡＶ）においてはＨＡＶの転写はトマト果実中での発現のためのパタティンプロモーターから推進され、第２のプラスミド（ｐＪＤＨＡＶ）においては転写は３５ＳＣａＭＶプロモーターの制御下にあり、トランスジェニック植物の緑色部で発現されるべきである。ＨＡＶトランスジーンに対する免疫応答を評価するため、トランスジェニック植物の作物は実験動物によって摂取された。
【００２８】
本発明の好ましい実施態様によれば、ワクチンに対して開発された技術は遺伝子のビークルとして非感染性ウイルス粒子を含有する植物の摂取を通して特定の器官に対する遺伝子標的化のために所望により適用されることもでき、これはより好ましいことである。
【００２９】
消化系（口、食道、胃、小腸、大腸、及び直腸）のいかなる部分をも実際攻撃しない病原体に対するいかなる種類のワクチンの経口投与についての比較モデルシステムを与えるため、ＨＡＶに対するワクチンを経口投与する方法が開発された。次に、トランスジェニック植物がモデル病原体としてＨＡＶの外側キャプシドからのタンパク質を用いて構築された。最後にこれらの植物はモデル哺乳動物系としてのマウスにおいて免疫原性応答を誘導することに対するそれらの能力について試験された。これらの段階のそれぞれは以下の個別のセクションにおいて議論される。
【００３０】
セクション１：モデル病原体としてのＨＡＶ
トランスジェニック植物ＨＡＶワクチンは消化系（口、食道、胃、小腸、大腸、及び直腸）のいかなる部分をも実際攻撃しない病原体に対するいかなる種類のワクチンの経口投与についての比較モデルシステムとして開発された。正規のＨＡＶワクチンの開発された経口投与方法はそれ自体新規かつ非自明である。何故ならそれはｉ．ｍ．（筋肉内）注射を通して通常投与されるかかるワクチンの経口投与の最初の成功例だからである。従って、比較モデルシステムは発明的ワクチンでもあり、その投与方法でもあり、本発明の一部である。
【００３１】
胃腸管は有意な健康的負荷を課す多数のウイルスにとっての主要な侵入口である。プラス鎖ＲＮＡウイルスであるＨＡＶはかかる感染性病原体の一つである。ＨＡＶは胃腸系を通してヒト体内に侵入し、組織特異的な複製のために肝臓に移動し、肝臓損傷及び臨床的肝炎をもたらす。
【００３２】
患者をＨＡＶ病に対して免疫感作するため、本発明に対する比較モデルは現在利用可能なＨＡＶワクチンであるＨＡＶＲＩＸ（商標）（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）の如きＨＡＶワクチンの直腸投与を含む。以下の結果に示される通り、免疫系は消化管上皮におけるＭ型細胞又は他の抗原呈示細胞（ＡＰＣ）においてＭＨＣタイプＩ分子によるウイルスペプチドの呈示に続いてウイルスヌクレオキャプシドタンパク質を認識する。ポリオウイルス（ピコルナヴィルス科の他のメンバー）及び他のウイルス病原体についてのワクチンは同一の原理を用いることによって、即ち胃腸管をおおう上皮細胞に対する天然ウイルスの親和性を用いることによって開発することができるであろう。
【００３３】
本発明による好ましい予防接種戦略は、小腸をＨＡＶ関連粒子に対してさらし、それによって抗体免疫応答及びひょっとすると細胞性免疫応答の両方を潜在的に誘発すること（これは最近“Ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ａ ｖａｃｃｉｎｅ ｉｎ ｈｅａｌｔｈｙ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ ｗｉｔｈ ｄｅｌａｙｅｄ ｓｅｒｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ”； １０ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｖｉｒａｌ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ａｔ Ａｔｌａｎｔａ Ｇｅｏｒｇｉａ ９−１３ Ａｐｒｉｌ ２０００ ｂｙ Ｐａｇａｌｉｅｒｏｎｉ ＴＧ ｅｔ ａｌ． Ａｂｓｔｒａｃｔ ０１１ に示されている）、及びＨＡＶ中和抗体を最適に生成させることを含む。
【００３４】
本発明の方法を試験するため、ＨＡＶ関連粒子に対する小腸暴露方法としてＨＡＶＲＩＸ（商標）の直腸投与に続いてｉｎ ｖｉｖｏでの抗ＨＡＶ抗体生産を評価するための動物モデルが開発された。以下の実験プロトコールが用いられた。ＨＡＶワクチンはＢａｌｂ／ｃマウスに０日及び２１日に腹膜内（ｉ．ｐ．）、直腸内（ｉ．ｒ．）又は鼻腔内（ｉ．ｎ．）投与された。各処理について６匹のＢａｌｂ／ｃマウスはＨＡＶワクチンの商業的調製物（ＨＡＶＲＩＸ（商標））を１ｍｌ当たり７２０のＥＬＩＳＡ単位の濃度で鼻腔内については２０マイクロリットル、直腸内については１００マイクロリットル又は腹膜内については１００マイクロリットル受け入れた。
【００３５】
次にマウスは最初の予防接種の３５日後に商業的キット（ＨＡＶＡＢ， Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ， Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ ＩＬ， ＵＳＡ）を用いて特異的ＨＡＶ抗体全体について試験された。
【００３６】
図１において見られる通り、ｉ．ｐ．（陽性コントロール）又はｉ．ｒ．ルートを通してワクチンを受け入れたマウスは抗ＨＡＶ抗体を生産したが、鼻腔内でワクチンを受け入れたマウスは特異的抗体を生産しなかった。単一の仮説に限定されることは望まないがこれらの結果は直腸投与に続いてウイルスキャプシドタンパク質はマウスの免疫系に呈示されたということを示唆する。この呈示はＩｇＧクラスから及びひょっとするとＩｇＡクラスから（これは特異的に試験されたわけではないが）抗ＨＡＶ抗体を生成した。ポリオワクチンの経口投与はＩｇＧ及びＩｇＡクラスの両方の抗体の生成を誘発することが知られている（例えば“Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｃｏｓａｌ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｂｙ ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ ｖａｃｃｉｎｅ ｉｓ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｎ ｐｒｅｖｉｏｕｓ ｍｕｃｏｓａｌ ｃｏｎｔａｃｔ ｗｉｔｈ ｌｉｖｅ ｖｉｒｕｓ”； Ｈｅｒｒｅｍａｎｓ ＴＭ， Ｒｅｉｍｅｒｉｎｋ ＪＨ， Ｂｕｉｓｍａｎ ＡＭ， Ｋｉｍｍａｎ ＴＧ， Ｋｏｏｐｍａｎｓ ＭＰ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９９ １５；１６２：５０１１−８ を参照されたい）。
【００３７】
ウイルスが消化管上皮を通して侵入する場合においては、粘膜のＩｇＡ抗体がウイルスを侵入口で中和する本質的な役割を果たす。何故ならそれらは生産されて消化管内腔に分泌されるからである。
【００３８】
皮内（ｉ．ｄ．）又はｉ．ｍ．ルートを介してのワクチンの全身（非経口）投与は殺生された（Ｓａｌｋ）ポリオワクチンのｉ．ｍ．投与の結果から明らかなようにＩｇＧクラスの抗体のみを通常生ずる。ｉ．ｍ．注射で通常送達される現在のＨＡＶワクチンはＩｇＧクラスの抗体のみを生産すると考えられている。ポリオウイルス及びＨＡＶの如き消化管上皮を介して侵入する病原体に対する成功的な免疫感作は侵入口でのＩｇＡクラスの中和抗体の局部的生産を明らかに必要とする。ｉ．ｄ．又はｉ．ｍ．ルートを介した非経口免疫感作はＩｇＭ及びその後のＩｇＧクラス抗体からなる全身性免疫応答のみを通常生じる。対照的に、経口（ｐ．ｏ．）又は直腸内（ｉ．ｒ．）又は鼻腔内（ｉ．ｎ．）ルートを介した粘膜免疫感作はＩｇＧ及びＩｇＡ抗体の両方からなる局部的（粘膜的）及び全身性免疫応答の両方を誘導する。粘膜（呼吸器、消化管、尿生殖器）ルートを介して侵入する病原体の場合は、後者の種類の免疫応答がホストにとって明らかに一層有利である。
【００３９】
ＨＡＶワクチンが直腸粘膜を通して体に投与される本発明の方法は、ウイルスの侵入口を阻止することによって現在の予防接種プログラムに比べて主要な利点を有することができるであろう。加えて本発明の方法は針又は他の侵入的方法を必要とすることなしにＨＡＶに対する成功的な免疫応答の生成を誘導することを可能にする。
【００４０】
従って、以下でより詳細に記述される実験結果は直腸内ルートがＨＡＶ及び胃腸ルートを通して体に侵入する他のウイルスに対する保護的な予防接種の生成のための好適な方法であるということを明らかに示す。
【００４１】
従って本発明は抗ＨＡＶ免疫応答の生成のためのＨＡＶＲＩＸ（商標）の如きＨＡＶワクチンの直腸投与を可能にし、それによってＨＡＶに対する中和抗体を誘発する。
【００４２】
本発明を限定することは望まないが、ＨＡＶワクチンの好適な用量は好ましくは各投与につき約０．７５から約７５００ＥＬ．Ｕ．の範囲の抗原であり、より好ましくは約７５ＥＬ．Ｕ．の抗原であり、坐薬、クリーム、液体、錠剤又は直腸粘膜に対するＨＡＶ抗原の投与に好適ないかなる他の固型、半固型又は液体用量形態で直腸に適用される。
【００４３】
本発明の方法は所望により及び好ましくは患者の胃腸粘膜、特に直腸粘膜を通した少なくとも一つのウイルスキャプシド包含遺伝子の投与に好適である。この所望のしかし好ましい方法においては、ウイルスキャプシド包含遺伝子は既述したＨＡＶワクチンについての様式と実質的に同様の様式で患者の胃腸粘膜に投与される。従って、本発明は胃腸、特に直腸粘膜を通して患者に一以上のウイルスキャプシド包含遺伝子を投与する方法をも提供する。
【００４４】
セクション２：トランスジェニック植物の構築
少なくとも一つのＨＡＶ構造を担持するトランスジェニック植物が構築された。この例によると、トランスジェニックトマト植物は非感染性ＨＡＶウイルス粒子を生産するために構築された。これらのＨＡＶウイルス粒子はそれらのゲノムがその５′ＮＴＲの約７３０ｎｔを除かれているので非感染性である。この約７３０ｎｔなしではそれらは複製することもそれら自身のタンパク質を発現することもできない。ウイルスゲノムのこの部分の削除はウイルスの外部構造には影響を与えない。従って、これらのトランスジェニックトマトが食されると、ヌクレオキャプシドタンパク質を有する非感染性ウイルス粒子は同様に摂取されるであろう。次に胃腸管におけるウイルスタンパク質の存在は以下のセクション３で示される通りＨＡＶ特異的抗体の生産を誘導する有効な免疫原として作用するにちがいない。
【００４５】
ＨＡＶゲノムを有するプラスミドベクターの構築
ウイルスの５′ＵＴＲ及びＨＡＶ転写開始部位からの追加の１０ｂｐを欠く６．７ｋｂのＸｂａＩ−ＰｍｅＩ ＨＡＶ／７ ｃＤＮＡフラグメントはプラスミドｐＨＡＶ／７から単離された。このフラグメントはＨＡＶ／７の１０個の５′コーディングヌクレオチドを含む改変されたＢＳＫＳプラスミド中に挿入された。更なる遺伝子工学処理により３５ＳＣａＭＶプロモーター及びオメガ（ＴＭＶ）転写−エンハンサーボックスがＨＡＶ／７コーディング領域の手前に挿入され、ｎｏｓターミネーターがこの領域の後ろに挿入された。プロモーター−ＨＡＶ−ターミネーターの組合せはバイナリーベクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍによって媒介される遺伝的形質転換用）ｐＧＰＴＶ−ｋａｎ中に最終的にクローニングされ、ｐＧ３５ＳΩＨＡＶと名付けられた。後者のベクターはヘルパープラスミドを用いてＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａ中に誘導され、ＢＹ−２タバコ細胞がｐＧ３５ＳΩＨＡＶで形質転換された。ＫａｎＲ細胞系が選択され確立された。トランスフェクトされた細胞中のＨＡＶ配列の存在はウイルスのＶＰ１−ＶＰ３ウイルス構造領域からのプライマーを用いたＰＣＲによって決定された（図２）。
【００４６】
ｐＧ３５ＳＨＡＶに類似するベクターが３５Ｓ ＣａＵＶプロモーターの代わりにパタティンプロモータを用いて構築された。このベクターはｐＧＰＰＡＴＨＡＶと名付けられ、トマト植物をＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ形質転換手順により形質転換させてトマト果実にＨＡＶキャプシドコーディング領域の発現を指向させるために用いられた。このＨＡＶ構造物（ｐＧＰＰＡＴＨＡＶ）を用いたトマト組織の遺伝的形質転換の後、１７系統のトランスジェニックトマト植物が誘導された（各系統につき４−６植物）。これらの系統はそれらのゲノムＤＮＡ中のＨＡＶ配列の存在について評価された。図３は１２のトランスジェニックトマト植物葉から生産されたＤＮＡの放射性ラベルされたＨＡＶ ｃＤＮＡプローブを用いたドットブロットハイブリダイゼーション結果を示す。図においてわかるとおり、１２の植物は全てＨＡＶ ＤＮＡ配列を含有していた。いくつかの植物はＨＡＶ特異的配列についてＰＣＲによって更に評価された（図４）。
【００４７】
７２のトランスジェニック植物全てから抽出されたＤＮＡに付随して、ＨＡＶ統合配列の評価のため、陽性植物の果実中のＨＡＶ ＲＮＡ転写物の存在も検出された。トマト植物から抽出された総ＲＮＡはドットブロット及びハイブリダイゼーションアッセイによってＨＡＶ特異的ＲＮＡ配列についてプローブされた（図５Ａ参照）。見られる陽性シグナルがＲＮＡサンプル中の残存ＤＮＡによるものであるという可能性を除去するため、トマト果実から抽出されたＲＮＡはＤＮａｓｅ Ｉで処理され、ドットブロット分析が繰返された（図５Ｂ）。Ａ及びＢの上のサンプルはＤＮａｓｅ Ｉで処理され、一方Ｃ及びＤの上のサンプルはＤＮａｓｅ Ｉで処理されなかった。図において見られる通り、いくつかのＲＮＡサンプルにおいては特異的シグナルはＤＮａｓｅ Ｉ処理が行われた後の方が弱い（例えばＡ１，Ａ２，Ａ５）。しかし、他のサンプル（Ａ３，Ａ５，Ａ６，Ａ８及びＢ１）ではシグナルはコントロールのトマト（Ｂ２）のそれよりも高い。
【００４８】
ＨＡＶ ｍＲＮＡ転写物について陽性と判断された植物は挿入されたＲＮＡの発現について更に試験された。予測されたＨＡＶタンパク質生産物はマウスのモノクローナル抗ＨＡＶを含む特異的抗ＨＡＶ抗体（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｓａｃｏ， Ｍａｉｎｅ， ｃａｔ． Ｎｏ． Ｃ６５８８５Ｍ）及びｉ．ｐ．で与えられた７２ＥＬ．Ｕ．のＨＡＶＲＩＸ（商標）ワクチンで１０日の間隔で２回免疫感作されたＢａｌｂ／ｃマウスから生産された抗血清を用いてウェスタンブロット分析によって検出された。
【００４９】
図６はＨＡＶ ＲＮＡ発現を以前に示した四つの異なるトマト系統からのＨＡＶタンパク質の発現を示す。トマト７−１，１２−１，３１−１及び３１−２から抽出されたタンパク質は示される通りウェスタンブロット分析に供された。
【００５０】
ＨＡＶ関連タンパク質の発現はこれらの四つのトマトトランスジェニック系統において評価された。四つの系統全てから採取されたトマト組織は抗ＨＡＶ抗体（７０Ｓ）を用いて検出される通りＨＡＶタンパク質を発現するように思える。更に、ＨＡＶキャプシドを構成するＨＡＶ関連構造タンパク質の存在は図６に示される通りこの特異的抗体によって検出された。従ってトランスジェニックトマト植物はＨＡＶタンパク質を発現するのみならず、より特異的にはＨＡＶキャプシドタンパク質を発現し、それに対して免疫原性応答が誘導されると予測することができる。
【００５１】
セクション３：粘膜免疫感作戦略の更なる評価及び植物ベースのワクチンのマウスにおける予備試験
ＨＡＶ用のミョウバンに吸着されたＨＡＶＲＩＸ（商標）ワクチンはｉ．ｍ．ルートを介した送達のみが一般に認められており植物ベースのワクチンはウイルス様粒子のみからなるので、実験はアジュバントなしのウイルス粒子として（即ち植物ベースのワクチンに匹敵するフォーマットで）呈示後に消化管においてＨＡＶに対する免疫応答を評価するために設計された。このセクションはＨＡＶウイルスが単独でｉ．ｒ．又はｐ．ｏ．ルートを介して送達される粘膜免疫感作戦略を評価するために行われた様々な試験及び分析を記述する。これらの実験は粘膜免疫の評価方法を開発するために設計され、ＩｇＡ生成細胞及び消化管粘膜におけるＩｇＡ分泌をそれぞれ測定するためのＥＬＩＳｐｏｔ及びＥＬＩＳＡを含み、並びに脾臓及び消化管由来のリンパ球の両方における細胞性免疫応答を測定するためのルーチンの増殖アッセイに適合している。このセクションは経口ルートを介して送達される植物ベースのＨＡＶワクチンの予備試験をも記述する。実験方法及び結果は以下詳細に記述される。
【００５２】
マウスの免疫感作
抗原：実験開始時に４−６週齢のメスのＢａｌｂ／ｃマウスが用いられた。用いられた抗原は半精製されたホルマリンで不活性化されたＨＡＶ（ＨＡＶＲＩＸ（商標）ワクチンにおけるのと同様にＦＲｈＫ４細胞中で増殖された株ＨＭ−１７５）であり、これは商業源（Ｍｉｃｒｏｂｉｘ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．， Ｔｏｒｏｎｔｏ， Ｃａｎａｄａ， ＨＡＶ Ｇｒａｄｅ ２ 抗原、ｃａｔ． Ｎｏ． ＥＬ ２５−０２）から得られ、製造者によって与えられる情報によれば２．２ｍｇ／ｍｌのタンパク質及び約６．０ＥＬ．Ｕ．／ｍｌのＨＡＶ抗原を含有していた。この抗原は二つの異なる呈示形態でマウスを免疫感作するために用いられた。ルーチンのｉ．ｐ．免疫感作のため、抗原は不完全フロインドアジュバント（ＩＦＡ）を用いて１：１に乳化された。ｉ．ｒ．又はｐ．ｏ．ルートを介した免疫感作のため、抗原は滅菌食塩水で１：１に希釈され、ツベルクリンシリンジに取付けられたＮｏ．１外科用カテーテルを用いて送達された。経口抗原は受動的に提供され、侵入性胃管栄養は用いられなかった。このシリーズの実験のすべての免疫感作のためには用量体積は１００マイクロリットルであった（約１１０マイクログラムの総タンパク質又は０．３ＥＬ．Ｕ．のＨＡＶ抗原を含む）。二つのトマト株（２−２１及び３−１２）（これらは両方ともＨＡＶ挿入についてｍＲＮＡを発現することが示された）によって生産されたトランスジェニック植物ＨＡＶワクチンも評価された。免疫感作のため、約０．４ｇの凍結乾燥されたトランスジェニック植物材料は４ｍｌの滅菌食塩水中に懸濁され、１０秒バーストを用いて３分間氷上で超音波分解された。生じた材料は遠心分離され、上澄みはマウスを免疫感作するために用いられ、各マウスに１００マイクロリットルがｐ．ｏ．で与えられた。ＩＦＡで乳化された滅菌食塩水（ｉ．ｐ．注射用）又は単独で与えられた滅菌食塩水（ｉ．ｒ．またはｐ．ｏ．ルート用）は陰性のコントロール抗原として用いられた。
【００５３】
免疫感作プロトコール及びスケジュール：免疫感作プロトコール、スケジュール及び用いられた動物の数は以下の通りである。ｉ．ｐ．又はｉ．ｒ．ルートを介して免疫感作された動物は２用量を１２日の間隔で受け入れ、一方、経口的に免疫感作された動物は４用量を５日の間隔で受け入れた。最終免疫感作の３週間後、約０．５ｍｌの血液が各マウスの尾の血管から得られた。どのマウスが免疫感作に対して応答したかを決定するため、血清が調整され、＜２０ ＷＨＯｍＩＵ／ｍｌの感度でヒト血清中のＨＡＶ特異的ＩｇＧを測定するために設計された商業的な競合的阻害酵素免疫アッセイ（ＥＴＩ−ＡＢ−ＨＡＶＫ−３ ［抗ＨＡＶ］， Ｓｏｒｉｎ ＢｉｏＭｅｄｉｃａ， Ｉｔａｌｙ）を用いて試験された。このアッセイは試験されるべき抗体がキット成分の一つの結合を競合的に阻害する競合的阻害方法であるので、アッセイはマウスのいずれかがアッセイ試薬の結合を阻害することができるＨＡＶ特異的ＩｇＧを生産したかどうかを決定するために用いられた。
【００５４】
試験された動物のいずれもがこの方法によってＨＡＶ特異的ＩｇＧについて明確に陽性であると試験されなかったものの、ｉ．ｐ．ルートを介してＨＡＶ／ＩＦＡで免疫感作された２匹のマウスは特異的ＩｇＧのボーダーラインレベルを有していた。これらの陰性結果はマウスが粘膜免疫区画において応答したという可能性を排除しなかったので、動物は続いて処理間で無作為化され、２群で試験された。一つの群は最終免疫感作の７〜２８日後にわたる期間にわたって６〜８マウスの亜群で殺された。脾臓及びパイエル板は採取され、細胞集団はＨＡＶ又はコントロール抗原（以下参照）を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏでの刺激のために、及びＥＬＩＳｐｏｔ及びＥＬＩＳＡを用いたＨＡＶ特異的ＩｇＡ応答及び以下に詳細に記述される通りＨＡＶ特異的増殖指標の評価のために調製された。第２群のマウスは更に３週間生き延びることを許され、次にＨＡＶ抗原（２７．５ｕｇの総タンパク質又は０．６ＥＬ．Ｕ．）の単一ｉ．ｄ．追加抗原刺激を受けた。これらのマウスは７〜２１日の期間にわたって６〜８匹の群として殺された。この後者の群は細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏでＨＡＶ抗原を用いて再刺激された前者の群と対照して「ｉｎ ｖｉｖｏで追加抗原刺激された」と名付けられた。
【００５５】
脾臓細胞及びパイエル板細胞集団の調製
動物は抱水クロラールの過剰投与によって殺された。血液は心臓穿刺によって採取され、４℃で一晩凝固させられた。血清が調製され、試験されるまで−２０℃で冷凍保存された。脾臓及びパイエル板（動物一匹当たり約４〜８個）は除去されて抗生物質（ペニシリン １００Ｕ／ｍｌ及びストレプトマイシン１００マイクログラム／ｍｌ、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）を含む滅菌されたＲＰＭＩ−１６４０培地（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ， Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ， Ｂｅｉｔ Ｈａｅｍｅｋ， Ｉｓｒａｅｌ）中に移され、更なる処理のために研究室に運ばれた。器官は滅菌ＲＰＭＩで１回洗浄された。脾臓細胞（ＳＰＬＣ）懸濁液は滅菌ピンセットを用いて５ｍｌのＲＰＭＩ＋抗生物質中で脾臓を細かくちぎることによって調製された。懸濁液は滅菌された円錐底１５ｍｌ管に移され、組織の残骸は沈殿させられた。懸濁されたＳＰＬＣを含む上澄みは新しい管に移され、細胞は室温で遠心分離（１５００ｒｐｍ、７分）によってペレット化された。細胞はＲＰＭＩ＋抗生物質を通した遠心分離（１５００ｒｐｍ、５分）によって２回洗浄され、次に生存細胞数はＮｅｕｂａｕｅｒ血球計を用いてＴｒｙｐａｎ Ｂｌｕｅ除外によって決定された。次にＳＰＬＣは続くアッセイで用いるために１×１０６細胞／ｍｌの濃度で１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ， ＨｙＣｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｔａｒｏｍ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｐｅｔａｈ Ｔｉｋｖａｈ， Ｉｓｒａｅｌ）を含む同一培地１０ｍｌ中に再懸濁された。
【００５６】
同様にパイエル板は１．５ｍｇ／ｍｌのジスパーゼ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｉｓｒａｅｌ）を含むＲＰＭＩ＋抗生物質５ｍｌ中で細かくちぎられた。パイエル板細胞（ＰＰＣ）懸濁液は円錐底１５ｍｌ管に移され、組織の繊維構造から細胞を解離させるために３７℃で４５〜６０分間撹拌しつつインキュベートされた。次にＰＰＣは遠心分離によってペレット化され、ＲＰＭＩ＋抗生物質を通して２回洗浄され、生存細胞数は上述の通り決定された。ＰＰＣ数は通常限定されているので、抗生物質及び１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ ４．５ｍｌ中の最終懸濁液（これは１×１０４〜５×１０５細胞／ｍｌの数にわたる）は数の更なる調整なしでアッセイに用いられた。
【００５７】
多量培養中のＳＰＬＣ及びＰＰＣのＩＮ ＶＩＴＲＯ刺激
ミリリットルあたりの細胞の初期数を決定した後、各マウスからのＳＰＬＣ及びＰＰＣ調製物は平底滅菌２４ウェル組織培養プレートの５ウェル中に１ｍｌの少量ずつピペットで注入された。各細胞集団に対し、別個のウェルが以下のものを受け入れた：培地のみ（未刺激の陰性コントロール）；１ｍｌあたり１０マイクログラムの最終濃度のアメリカヤマゴボウマイトジェン（Ｓｉｇｍａ）；及び１ｍｌあたり１１，５．５，２．８及び１．４マイクログラムのウェルあたり最終濃度を与えるように希釈されたＨＡＶ抗原（Ｍｉｃｒｏｂｉｘ）。プレートは３７℃、空気中の５％ＣＯ２で５日間インキュベートされた。この培養期間の終わりに０．７ｍｌの上澄みが各ウェルから除去され、ＥＬＩＳＡによるＨＡＶ特異的ＩｇＡの決定（以下参照）のため−２０℃で貯蔵された。ＨＡＶ特異的ＩｇＡ生成細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激後に評価されるアッセイのため、細胞は以下のように処理された。各ウェルからの細胞は円錐底管に収集され、ＲＰＭＩ＋抗生物質を通した遠心分離により１回洗浄され、抗生物質及び１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ １ｍｌ中に再懸濁された。ｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激後の生存細胞数はＴｒｙｐａｎ Ｂｌｕｅ除外により決定され、初期細胞集団中の細胞密度と関連付けられて刺激指数（ＳＩ）を与える。２．０以上のＳＩは刺激に対する陽性の応答であるとみなされた。細胞集団は（細胞数が許容される限り常に）１×１０６細胞／ｍｌに調整され、以下に記述するようなＨＡＶ特異的ＩｇＡ生成細胞の存在及び数を決定するためのＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおいて用いられた。
【００５８】
増殖アッセイ
ＨＡＶを用いたｉｎ ｖｉｖｏ追加抗原刺激に対する応答が評価される実験のために増殖アッセイが以下のようにして行われた。ＳＰＬＣ及びＰＰＣＣ（十分な量で存在する場合）は抗生物質及び１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ中で１×１０６細胞／ｍｌに調整された。増殖アッセイは平底９６ウェル組織培養プレート中で行われた。各ウェルは１００マイクロリットルの細胞懸濁液、１００マイクロリットルの培地（上述の通り）、及び１０マイクロリットルの以下のもののいずれか一つを受け入れた：培地のみ（未刺激のコントロール）；１ｍｌあたり１０マイクログラムの最終ウェル濃度を与えるように調製されたフィトヘモグルチニン（Ｓｉｇｍａ）；又は１ｍｌあたり１１，５．５，２．８及び１．４マイクログラムの最終ウェル濃度を与えるように希釈されたＨＡＶ抗原（Ｍｉｃｒｏｂｉｘ）。全ての濃度は１ｍｌあたりのタンパク質のマイクログラムとして表される。重複するウェルが各刺激のためにセットアップされた。プレートは３７℃で空気中の５％ＣＯ２で５日間インキュベートされた。細胞増殖の度合いを決定するため、２マイクロＣｉの３Ｈチミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ， Ｉｓｒａｅｌ）が培養の最後の１８〜２４時間の間に各ウェルに加えられた。細胞は低調溶解によって収集され、それらのＤＮＡはガラス繊維フィルター上に収集されて組入れられた放射能活性が液体シンチレーション計数により決定された。刺激指数（ＳＩ）は刺激されたウェルについて得られた平均（重複にわたっての）ｃｐｍを陰性コントロール（培地のみ）ウェルについて得られた平均ｃｐｍで割ることによって決定された。２．０以上のＳＩは陽性であるとみなされた。
【００５９】
ＥＬＩＳｐｏｔ分析
脾臓及びパイエル板の両方において特異的ＩｇＡ抗体を生産する細胞を検出するため、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイが標準プロトコールから適合された（Ｌｅｗｉｓ ＤＪＭ ＆ Ｈａｙｗａｒｄ ＣＭＭ， Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｕｃｏｓａｌ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ． Ｉｎ： Ｖａｃｃｉｎｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ； Ａ． Ｒｏｂｉｎｓｏｎ， ＧＨ Ｆａｒｒａｒ， ＣＮ Ｗｉｂｌｉｎ， Ｅｄｓ．， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｔｏｗａ， ＮＪ， １９９６， ｐｐ １８７−１９５）。このアッセイの原理は、特異的ＩｇＡを生成する細胞はそれを抗原コートされたマイクロプレートウェルの表面に分泌し、従来の酵素結合免疫吸着（ＥＬＩＳＡ）技術により検出することができる「インプリント」を残すであろうということである。９６ウェルのポリスチレン組織培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ ３５９６， Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．， Ｃｏｒｎｉｎｇ， ＮＹ）のウェルは標準ＥＬＩＳＡコーティング緩衝液（ＨＣＯ２ −／ＣＯ３ ２−，ｐＨ９．６）中の１ｍｌあたり２０マイクログラムのタンパク質に希釈されたＨＡＶ抗原（Ｍｉｃｒｏｂｉｘ）又はＦＲｈＫ４溶解物（細胞を凍結解凍し、１５０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離により上澄みを明澄化させることによって調製されたもの）で一晩コートされた。陰性コントロールウェルはコーティング緩衝液のみを受け入れた。コーティング体積は１ウェルあたり１００マイクロリットルであり、重複ウェルは各抗原又はコントロールについてコートされた。翌日、抗原は捨てられ、ウェルは滅菌リン酸緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ，ｐＨ７．４）で４回洗浄された。ウェルは続いて滅菌ＰＢＳ中の５％ＦＣＳ（１ウェルあたり２５０マイクロリットル）を用いて室温で２〜４時間ブロックされた。ブロッキング溶液は捨てられ、ＳＰＬＣ又はＰＰＣ懸濁液がウェルに加えられ、プレートはプレートレベルを保持しつつかつ期間中かきまぜられないように注意して３７℃、空気中の５％ＣＯ２で２４時間インキュベートされた。ＳＰＬＣは１ウェルあたり１００マイクロリットルの体積中１０００００細胞／ウェルの密度でインキュベートされ、一方ＰＰＣはそれらの収率に従って１０００〜５００００細胞／ウェル（１ウェルあたり１００マイクロリットル）の密度で用いられた。インキュベーション期間の終わりに細胞は捨てられ、マイクロプレートは０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で５回洗浄された。
【００６０】
抗原特異的ＩｇＡ生成細胞がそれらの抗体を抗原コートされたマイクロプレートウェル中に分泌したスポットを検出するため、５％正常ウサギ血清（ＮＲＳ， Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ， Ｂｅｉｔ Ｈａｅｍｅｋ， Ｉｓｒａｅｌ）を含むＰＢＳＴ中で１：５００に希釈されたヤギ抗マウスＩｇＡ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｓ ［ＫＰＬ］．， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤからの親和性精製されたもの）が１ウェルあたり１００マイクロリットル加えられ、マイクロプレートは４℃で一晩インキュベートされた。抗体は捨てられ、ウェルはＰＢＳＴで５回洗浄された。次に５％ＮＲＳを含むＰＢＳＴ中で１：１０００に希釈されたアルカリホスファターゼ結合ウサギ抗ヤギＩｇＧ（親和性精製されたもの、ＫＰＬ）が１ウェルあたり１００マイクロリットル加えられ、マイクロプレートは室温で２時間インキュベートされた。抗体溶液は捨てられ、マイクロプレートはＰＢＳＴで５回洗浄された。ＥＬＩｓｐｏｔを検出するため、製造者の指示に従って調製されたアルカリホスファターゼ基質（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ ＳｉｇｍａＦａｓｔ， Ｓｉｇｍａ）が加えられ（１ウェルあたり１００マイクロリットル）、そして酵素反応は室温で暗くして４５分間進行させられ、それからプレートを蒸留水で３回洗浄することによって停止された。プレートはアルミニウム箔でカバーされ、ＥＬＩｓｐｏｔ計数が行われるまで４℃で貯蔵された。ＥＬＩｓｐｏｔは４００倍の倍率の倒立顕微鏡で数えられた。ＥＬＩｓｐｏｔアッセイにおける非特異的背景反応性は固有のものであるので、全てのアッセイはＦＲｈＫ４抗原（元の免疫原中に存在する）との反応性及び他のアッセイ構成成分（コーティング緩衝液コントロール）に対する非特異的結合についてのコントロールを含む。ＨＡＶ及びコントロール抗原についての重複ウェルにおけるＥＬＩｓｐｏｔは計数され、平均化された。ＨＡＶ特異的ＥＬＩｓｐｏｔの正味の数を計算するため、コントロールウェル中のＥＬＩｓｐｏｔの平均数は平均化され、次にこの平均はＨＡＶ抗原でコートされたウェル中で計算されたＥＬＩｓｐｏｔの平均数から差し引かれた。正味のＨＡＶ特異的ＥＬＩｓｐｏｔ数が報告された（データ表）。
【００６１】
ＥＬＩＳＡ
これらの実験過程中、マウス血清中又は組織培養上澄み中のＨＡＶ特異的ＩｇＡ抗体を検出するため酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）の予備開発が行われた。ポリスチレンＥＬＩＳＡマイクロプレート（Ｎｕｎｃ Ｉｍｍｕｎｏｐｏｌｙｓｏｒｐ， Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｉｓｒａｅｌ）のウェルは上述したように炭酸塩／重炭酸塩コーティング中に１ｍｌあたり２０マイクログラムのタンパク質に希釈されたＨＡＶ抗原（Ｍｉｃｒｏｂｉｘ）又はＦＲｈＫ４抗原で４℃で一晩コートされた（１ウェルあたり１００マイクロリットル、重複して）。陰性コントロールはコーティング緩衝液のみを受け取った。抗原又はコントロール溶液は捨てられ、ウェルは０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で３回洗浄された。ウェルは続いて２５０マイクロリットルのブロッキング緩衝液（ＰＢＳＴ中の５％ＮＲＳ）を用いて室温で１時間ブロックされた。ブロッキング溶液は捨てられ、ウェルはＰＢＳＴで５回洗浄された。ＨＡＶ特異的ＩｇＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ生産について試験されるべき組織培養液又は免疫感作されたマウスからのマウス血清の希釈液（ブロッキング緩衝液中１：２０及び１：２００）が続いて添加され（１ウェルあたり１００マイクロリットル、各抗原及び陰性コントロールについて単一の決定）、プレートは４℃で一晩インキュベートされた。これらの溶液は捨てられ、ウェルは上述の通りＰＢＳＴで５回洗浄された。
【００６２】
次に、ブロッキング緩衝液中で１：５００に希釈されたヤギ抗マウスＩｇＡ（ＫＰＬ）が添加され（１ウェルあたり１００マイクロリットル）、プレートは室温で２時間インキュベートされた。ウェルは空にされ、ＰＢＳＴで５回洗浄された。アルカリホスファターゼ（ＡＰ）結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＫＰＬ、ブロッキング緩衝液中で１：１０００希釈、１ウェルあたり１００マイクロリットル）が添加され、プレートは室温でさらに２時間インキュベートされた。ＡＰ結合物を捨ててウェルをＰＢＳＴで５回洗浄した後、ＡＰ基質（ＳｉｇｍａＦａｓｔ ＮＢＴ基質、Ｓｉｇｍａ、製造者の指図に従って調製）を添加し、プレートは室温で１時間インキュベートされた。４０５ｎｍでの吸光度（Ａ４０５）はＥＬＩＳＡマイクロプレート読み取り機（Ｔｅｃａｎ Ｓｐｅｃｔｒａ Ｒａｉｎｂｏｗ）を用いて決定された。各動物及び処理について結果は抗原（ＨＡＶ又はＦＲｈＫ４）を用いて決定されたＡ４０５をコーティング緩衝液のみを受け取ったウェル中で記録されたＡ４０５で割ることによって得られるシグナル対ノイズ（Ｓ／Ｎ）比として表された。２．０以上のＳ／Ｎ比は陽性であるとみなされた。
【００６３】
結果
【表１】
ｂ刺激指数（ＳＩ）は刺激されたウェル中の１ｍｌあたりの生存細胞数（Ｔｒｙｐａｎ Ｂｌｕｅ除外血球計計数により決定される通りの）を未刺激の（培地のみの）ウェル中の１ｍｌあたりの生存細胞数で割ることによって決定された。２．０以上のＳＩは陽性であるとみなされた。
ｃＨＡＶ特異的ＩｇＡ Ｓ／Ｎ（シグナル：ノイズ比）はＨＡＶ抗原でコートされたウェル中で測定されたＡ４０５ｎｍをコーティング緩衝液のみを受け取ったウェル中で測定されたＡ４０５ｎｍで割ることによってＥＩＡを用いて決定される通りである。２．０以上のＳ／Ｎは陽性であるとみなされた。
ｄ陽性ＥＬＩＳｐｏｔｓの数はＦＲｈＫ４抗原又はコーティング緩衝液のみでコートされたウェル中で計数されたＥＬＩＳｐｏｔｓの平均背景の上のＨＡＶでコートされたウェル中で計数されたＥＬＩＳｐｏｔｓの平均数である。
ｅバルク培養実験においては、マイトジェンはアメリカヤマゴボウのマイトジェン（ＰＷＭ）であった；ＨＡＶの追加のｉ．ｄ．注射によりｉｎ ｖｉｖｏ追加抗原刺激されたマウスに関与する増殖アッセイにおいては、マイトジェンはフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）であった。
ＳＰＬＣ＝脾臓細胞 ＰＰＣ＝パイエル板細胞
【００６４】
【表２】
【表３】
ｂ刺激指数（ＳＩ）は刺激されたウェル中の１ｍｌあたりの生存細胞数（Ｔｒｙｐａｎ Ｂｌｕｅ除外血球計計数により決定される通りの）を未刺激の（培地のみの）ウェル中の１ｍｌあたりの生存細胞数で割ることによって決定された。２．０以上のＳＩは陽性であるとみなされた。
ｃＨＡＶ特異的ＩｇＡ Ｓ／Ｎ（シグナル：ノイズ比）はＨＡＶ抗原でコートされたウェル中で測定されたＡ４０５ｎｍをコーティング緩衝液のみを受け取ったウェル中で測定されたＡ４０５ｎｍで割ることによってＥＩＡを用いて決定される通りである。２．０以上のＳ／Ｎは陽性であるとみなされた。
ｄ陽性ＥＬＩＳｐｏｔｓの数はＦＲｈＫ４抗原又はコーティング緩衝液のみでコートされたウェル中で計数されたＥＬＩＳｐｏｔｓの平均背景の上のＨＡＶでコートされたウェル中で計数されたＥＬＩＳｐｏｔｓの平均数である。
ｅバルク培養実験においては、マイトジェンはアメリカヤマゴボウのマイトジェン（ＰＷＭ）であった；ＨＡＶの追加のｉ．ｄ．注射によりｉｎ ｖｉｖｏ追加抗原刺激されたマウスに関与する増殖アッセイにおいては、マイトジェンはフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）であった。
【００６６】
【表４】
ｂ刺激指数（ＳＩ）は刺激されたウェル中の１ｍｌあたりの生存細胞数（Ｔｒｙｐａｎ Ｂｌｕｅ除外血球計計数により決定される通りの）を未刺激の（培地のみの）ウェル中の１ｍｌあたりの生存細胞数で割ることによって決定された。２．０以上のＳＩは陽性であるとみなされた。
ｃＨＡＶ特異的ＩｇＡ Ｓ／Ｎ（シグナル：ノイズ比）はＨＡＶ抗原でコートされたウェル中で測定されたＡ４０５ｎｍをコーティング緩衝液のみを受け取ったウェル中で測定されたＡ４０５ｎｍで割ることによってＥＩＡを用いて決定される通りである。２．０以上のＳ／Ｎは陽性であるとみなされた。
ｄ陽性ＥＬＩＳｐｏｔｓの数はＦＲｈＫ４抗原又はコーティング緩衝液のみでコートされたウェル中で計数されたＥＬＩＳｐｏｔｓの平均背景の上のＨＡＶでコートされたウェル中で計数されたＥＬＩＳｐｏｔｓの平均数である。
ｅバルク培養実験においては、マイトジェンはアメリカヤマゴボウのマイトジェン（ＰＷＭ）であった；ＨＡＶの追加のｉ．ｄ．注射によりｉｎ ｖｉｖｏ追加抗原刺激されたマウスに関与する増殖アッセイにおいては、マイトジェンはフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）であった。
【００６７】
【表５】
ｂ刺激指数（ＳＩ）は３Ｈ−ＴｄＲ取り込み実験から決定された：刺激されたウェル中の細胞に取り込まれたｃｐｍの数は未刺激の（培地のみの）ウェル中の細胞に取り込まれたｃｐｍの数で割られた。用いられたマイトジェンはＰＨＡであった。２．０以上のＳＩは陽性であるとみなされた。
ｃＨＡＶ特異的ＩｇＡ Ｓ／Ｎ（シグナル：ノイズ比）はＨＡＶ抗原でコートされたウェル中で測定されたＡ４０５ｎｍをコーティング緩衝液のみを受け取ったウェル中で測定されたＡ４０５ｎｍで割ることによってＥＩＡを用いて決定される通りである。用いられたマイトジェンはＰＷＭであった。２．０以上のＳ／Ｎは陽性であるとみなされた。
ｄ陽性ＥＬＩＳｐｏｔｓの数はＦＲｈＫ４抗原又はコーティング緩衝液のみでコートされたウェル中で計数されたＥＬＩＳｐｏｔｓの平均背景の上のＨＡＶでコートされたウェル中で計数されたＥＬＩＳｐｏｔｓの平均数である。
【００６８】
【表６】
【表７】
【表８】
【表９】
ｂ刺激指数（ＳＩ）は３Ｈ−ＴｄＲ取り込み実験から決定された：刺激されたウェル中の細胞に取り込まれたｃｐｍの数は未刺激の（培地のみの）ウェル中の細胞に取り込まれたｃｐｍの数で割られた。用いられたマイトジェンはＰＨＡであった。２．０以上のＳＩは陽性であるとみなされた。
ｃＨＡＶ特異的ＩｇＡ Ｓ／Ｎ（シグナル：ノイズ比）はＨＡＶ抗原でコートされたウェル中で測定されたＡ４０５ｎｍをコーティング緩衝液のみを受け取ったウェル中で測定されたＡ４０５ｎｍで割ることによってＥＩＡを用いて決定される通りである。用いられたマイトジェンはＰＷＭであった。２．０以上のＳ／Ｎは陽性であるとみなされた。
ｄ陽性ＥＬＩＳｐｏｔｓの数はＦＲｈＫ４抗原又はコーティング緩衝液のみでコートされたウェル中で計数されたＥＬＩＳｐｏｔｓの平均背景の上のＨＡＶでコートされたウェル中で計数されたＥＬＩＳｐｏｔｓの平均数である。
【００７２】
【表１０】
結果の要約
Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）抗原（ＦＲｈＫ４サル腎臓細胞中で増殖された半精製された調製物としてＭｉｃｒｏｂｉｘから購入）は不完全フロインドのアジュバント（ＩＦＡ）で乳化された腹膜内（ｉ．ｐ．）ルートで；直接適用により直腸的に（ｉ．ｒ．）又は受動的摂食により経口的に（ｐ．ｏ．）送達された場合、マウスにおいて免疫原性である。
【００７４】
ｉ．ｐ．，ｉ．ｒ．、又はｐ．ｏ．ルートで与えられたＨＡＶ抗原は脾臓細胞（ＳＰＬＣ）及びパイエル板細胞（ＰＰＣ）集団の両方においてＨＡＶ応答性（記憶）リンパ球を生成し、これはｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖アッセイによって検出することができる。粘膜（ｉ．ｒ．又はｐ．ｏ．）ルートを介して免疫感作されたマウスにおいては増殖的応答はＳＰＬＣ集団よりもＰＰＣ集団において一層優勢でありかつ一層活発であるようにみえる。
【００７５】
ｉ．ｐ．，ｉ．ｒ．又はｐ．ｏ．ルートで与えられたＨＡＶ抗原はＳＰＬＣ及びＰＰＣ集団の両方においてＨＡＶ特異的ＩｇＡ生成細胞をも生じさせ、これはＥＬＩＳｐｏｔアッセイにより直接的に（免疫感作後）又は間接的に（バルク培養におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ追加抗原刺激後）検出されることができる。しかし、ＦＲｈＫ４抗原と反応するＩｇＡを生成する細胞並びに他のアッセイ構成成分もＥＬＩＳｐｏｔアッセイにより検出されうる。従って、結果はこの背景反応性を差し引いた後の陽性（ＨＡＶ特異的）スポットの正味の数として表されている。
【００７６】
ＳＰＬＣ及びＰＰＣ集団中に存在するＨＡＶ特異的細胞はＨＡＶ特異的ＩｇＡを合成して分泌するように誘導されることができ、このＩｇＡは様々な濃度でのＨＡＶ抗原又はアメリカヤマゴボウマイトジェン（ＰＷＭ）でバルク培養をｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激した後に直接酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）によって検出することができる。
【００７７】
ｐ．ｏ．ルートで与えられた二つのトランスジェニックトマトワクチンは脾臓及びパイエル板において免疫学的記憶リンパ球を誘発した（これは増殖アッセイにより検出可能であった）という点において免疫原性であるようにみえた。
【００７８】
セクション４：更なる実行
既に記述したトランスジェニック植物ワクチンは非感染性ウイルス粒子を含む。これらのウイルス粒子は所望によりＨＡＶゲノム又は他のウイルスゲノムに遺伝子工学処理される好適な遺伝子をパッケージするためにも用いることができ、これは続いてトマト又は他の植物に遺伝子工学処理されることができる。この場合、かかるトランスジェニックトマト又は他の植物材料を食べること又はトランスジーンを経口的に及び／又は直腸的に適用することはトランスジーンがＨＡＶウイルスを用いることによって肝臓に又は他のウイルスを用いることによって体内の他の場所（骨髄又は神経系の如き）に特異的に標的化されることを可能とするであろう。単一の仮説に限定されることは望まないが、ＨＡＶを含有するトランスジェニックトマトの摂食に続いて免疫系が腸管上皮中のＭ型細胞又は他のＡＰＣ中のＭＨＣタイプＩ分子によるウイルスペプチドの呈示に続いてウイルスヌクレオキャプシドタンパク質を認識するにちがいないという仮設が立てられる。ポリオウイルス（ピコルナヴイルス科の他のメンバー）に対するワクチン及び他のウイルス剤は同一の原理、即ち胃腸管を被覆する上皮細胞に対する天然ウイルスの親和性を用いて開発することができるであろう。これらのワクチンは現存のワクチンよりも安全で及び／又は投与しやすいであろう。これらのワクチンは比較的単純で製造費用が安価であるだろう。トランスジェニック植物中でのＨＡＶ粒子生産の成功は他の経口的に消費されるウイルス及び細菌ワクチンの生産に対する原理の証拠であるだろう。
【００７９】
胃腸系による効率的なウイルスの取り込みは特定器官へのトランスジーンの標的化のためにも適用することができるであろう。ＨＡＶの天然の親和性は肝臓に対するものであり、これはたぶん肝細胞膜上のウイルス受容体の発現を通したものである。望ましい遺伝子を含む遺伝子処理されたＨＡＶゲノムをＨＡＶヌクレオキャプシド粒子中に包ませることは遺伝子を肝臓に標的化することを可能にするであろう。骨髄又は神経系への遺伝子の同様の標的化は特定の器官に対する天然の親和性を持つ非エンベロップ型ウイルス（又は他の適当な種類のウイルス）を用いた同様の戦略により潜在的に実行可能である。
【００８０】
本発明は限定された数の実施態様に関して記述されてきたが、本発明の多くの変形、修正及び他の適用をなしうることは理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】
ＨＡＶワクチンの投与後の実験マウスの力価のグラフである。
【図２】
トランスフェクトされた細胞中のＨＡＶ配列の存在を示す。
【図３】
１２のトランスジェニックトマト植物葉から生産されたＤＮＡの放射性ラベルされたＨＡＶ ｃＤＮＡのプローブを用いたドットブロット及びハイブリダイゼーションの結果を示す。
【図４】
ＰＣＲによる図３の植物の一部の評価結果を示す。
【図５】
図５Ａ，Ｂは同様の様式で分析された１７の植物から抽出されたＲＮＡの例を示す。
【図６】
ＨＡＶ ＲＮＡ発現を以前に示した四つの異なるトマト系統からのＨＡＶタンパク質の発現を示す。
【図７】
ＨＡＶ又はトランスジェニックトマトＨＡＶワクチンに対するマウスのＩｇＡ応答が評価される第２セットの実験において用いられる免疫感作プロトコールを示すフローチャートである。
Claims (60)
- 患者にウイルスワクチンを投与する方法であって、ウイルスワクチンが胃腸粘膜を通して患者に侵入するウイルスに対するものであり、ウイルスの標的器官が腸ではない場合であって、前記方法が患者の胃腸粘膜にウイルスワクチンを投与することを含む方法。
- 胃腸粘膜が直腸粘膜であり、かくしてウイルスワクチンが患者の直腸粘膜に投与される請求項１記載の方法。
- ウイルスワクチンが坐薬の形態である請求項２記載の方法。
- ウイルスがＨＡＶ（Ａ型肝炎ウイルス）である請求項２記載の方法。
- ウイルスワクチンが約０．７５から約７５００ＥＬ．Ｕ．の範囲の濃度の抗原を含む請求項４記載の方法。
- 患者が下等哺乳動物である請求項１記載の方法。
- 患者がヒトである請求項１記載の方法。
- ウイルスワクチンが患者に注射によって元来投与される商業的に利用可能なワクチンである請求項１記載の方法。
- ウイルスワクチンがウイルス様粒子を含有する食用材料を含む請求項１記載の方法。
- ウイルスワクチンが複数の共発現されるウイルスタンパク質又はその一部を含有する食用材料を含む請求項１記載の方法。
- 前記食用材料が食用植物材料である請求項９又は１０記載の方法。
- 前記食用材料が抗原として少なくとも一つの完全なウイルス構造を含有する請求項９〜１１のいずれか一項記載の方法。
- 前記少なくとも一つの完全なウイルス構造がウイルスキャプシド構造である請求項１２記載の方法。
- 前記ウイルスキャプシド構造が外側キャプシドである請求項１３記載の方法。
- ウイルスがＨＡＶ（Ａ型肝炎ウイルス）である請求項９〜１４のいずれか一項記載の方法。
- 患者の胃腸粘膜を通して少なくとも一つのウイルスキャプシド包含遺伝子を送達する方法であって、患者の胃腸粘膜に少なくとも一つのウイルスキャプシド包含遺伝子を投与することを含む方法。
- 少なくとも一つのウイルスキャプシド包含遺伝子が胃腸粘膜を通して患者に感染するウイルスについてのものである請求項１６記載の方法。
- 胃腸粘膜が直腸粘膜であり、かくしてウイルスワクチンが患者の直腸粘膜に投与される請求項１７記載の方法。
- ウイルスワクチンが坐薬の形態である請求項１８記載の方法。
- 患者が下等哺乳動物である請求項１６記載の方法。
- 患者がヒトである請求項１６記載の方法。
- 少なくとも一つのウイルスキャプシド包含遺伝子が食用材料中に存在するウイルス様粒子中に呈示される請求項１６記載の方法。
- 少なくとも一つのウイルスキャプシド包含遺伝子が食用材料中に存在する複数の共発現されるウイルスタンパク質又はその一部中に包含されている請求項１６記載の方法。
- 前記食用材料が食用植物材料である請求項２２又は２３記載の方法。
- 前記食用材料が抗原として少なくとも一つの完全なウイルス構造を含有する請求項２２〜２４のいずれか一項記載の方法。
- 前記少なくとも一つの完全なウイルス構造がウイルスキャプシド構造である請求項２５記載の方法。
- 前記ウイルスキャプシド構造が外側キャプシドである請求項２６記載の方法。
- 少なくとも一つのウイルスキャプシド包含遺伝子がＨＡＶ（Ａ型肝炎ウイルス）中に包含されている請求項２２〜２７のいずれか一項記載の方法。
- 少なくとも一つのウイルスキャプシド包含遺伝子がＨＡＶ（Ａ型肝炎ウイルス）からのものである請求項２８記載の方法。
- 患者にＡ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）に対するウイルスワクチンを投与する方法であって、ＨＡＶの標的器官が肝臓である場合であって、前記方法が患者の胃腸粘膜にＨＡＶに対するウイルスワクチンを投与することを含む方法。
- ウイルスワクチンがＨＡＶについての少なくとも一つのウイルスキャプシド包含遺伝子を含む請求項３０記載の方法。
- ウイルスワクチンが弱毒化され殺生されたウイルスから本質的になる請求項３０記載の方法。
- ウイルスワクチンが弱毒化され殺生されたウイルスを追加のアジュバントなしで含む請求項３０記載の方法。
- ウイルスワクチンがＨＡＶ関連粒子から本質的になる請求項３０記載の方法。
- ウイルスワクチンがＨＡＶＲＩＸ（商標）（ＨＡＶワクチン）である請求項３０記載の方法。
- 胃腸粘膜が直腸粘膜であり、かくしてウイルスワクチンが患者の直腸粘膜に投与される請求項３０記載の方法。
- 患者に投与するための病気を引き起こす病原体に対するワクチンであって、前記ワクチンが病気を引き起こす病原体の生物学的に有意な構造の全体を含み、前記生物学的に有意な構造の前記全体が食用植物材料によって発現されるワクチン。
- 前記生物学的に有意な構造が前記食用植物材料によって共発現される複数のタンパク質である請求項３７記載のワクチン。
- 前記複数のタンパク質の遺伝子が前記食用植物材料に導入される請求項３８記載のワクチン。
- 前記食用植物材料が前記遺伝子に関してトランスジェニックであり、かくして前記遺伝子が前記食用植物材料のゲノム中に安定に挿入される請求項３９記載のワクチン。
- 病気を引き起こす病原体がＨＡＶ（Ａ型肝炎ウイルス）であり、従って前記遺伝子がＨＡＶ遺伝子である請求項４０記載のワクチン。
- 前記食用植物材料が患者によって食されることによって患者に投与される請求項３７記載のワクチン。
- 患者がヒトである請求項４２記載のワクチン。
- 前記生物学的に有意な構造が複数のタンパク質である請求項３７のワクチンの製造方法であって、前記方法が前記複数のタンパク質に対応する遺伝子を得て、そして前記遺伝子を前記食用植物材料中に挿入することを含む方法。
- 食用材料中に含有されるワクチンを提供し、そして経口投与を通して患者にワクチンを投与することを含む、ウイルスに対するワクチンで患者を治療する方法。
- 前記食用材料がウイルス様粒子を含有する請求項４５記載の方法。
- 前記食用材料が複数の共発現されるウイルスタンパク質又はその一部を含有する請求項４５記載の方法。
- 前記食用材料が食用植物材料である請求項４６又は４７記載の方法。
- 前記食用材料が抗原として少なくとも一つの完全なウイルス構造を含有する請求項４６〜４８のいずれか一項記載の方法。
- 前記少なくとも一つの完全なウイルス構造がウイルスキャプシド構造である請求項４９記載の方法。
- 前記ウイルスキャプシド構造が外側キャプシドである請求項５０記載の方法。
- ウイルスがＨＡＶ（Ａ型肝炎ウイルス）である請求項４６〜５１のいずれか一項記載の方法。
- 患者に経口投与してウイルスに対して患者を保護するための、食用材料に含有されるウイルスに対するワクチンの使用。
- 前記食用材料がウイルス様粒子を含有する請求項５３記載の使用。
- 前記食用材料が複数の共発現されるウイルスタンパク質又はその一部を含有する請求項５４記載の使用。
- 前記食用材料が食用植物材料である請求項５４又は５５記載の使用。
- 前記食用材料が抗原として少なくとも一つの完全なウイルス構造を含有する請求項５４〜５６のいずれか一項記載の使用。
- 前記少なくとも一つの完全なウイルス構造がウイルスキャプシド構造である請求項５７記載の使用。
- 前記ウイルスキャプシド構造が外側キャプシドである請求項５８記載の使用。
- ウイルスがＨＡＶ（Ａ型肝炎ウイルス）である請求項５４〜５９のいずれか一項記載の使用。
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