JP2004503203A5

JP2004503203A5 - 細胞内におけるｓｓＤＮＡの産生

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Publication number: JP2004503203A5
Application number: JP2000576005A
Authority: JP
Filing date: 1999-10-12
Publication date: 2007-03-01

Description

これまで知られている限り、一本鎖デオキシリボ核酸(ｓｓＤＮＡ)種を介在および／もしくはフランキングベクター配列を含有しない真核細胞中で産生する方法は無い。科学及び特許の文献はｃＤＮＡ産生ベクターの開示を含むが(A. Ohshima等、89 Proc. Natl. Acd. Sci. USA (1992)；S. Inoue等、3 Current Opin. Develop. 713-718 (1993)；O. Mirochnitchenko等、269 J. Biol. Chem. 2380-2383 (1994)；J.R. Mao等、270 J. Biol. Chem. 19684-19687 (1995)；ならびに米国特許第５，４３６，１４１号および５，７１４，３２３号を参照)、しかしこれらの参考文献に開示されたシステムは、ｓｓＤＮＡ産物の意図する機能と干渉できるベクター配列を介在しないでｓｓＤＮＡを真核細胞中で産生する能力を実証しているようには見えない。

好ましくは、逆方向縦列型反復配列はシス−配向様式で作用する。
プライマー結合部位は内因性逆転写酵素に対して特異的であり得る(例えば、ヒト免疫不全症ウイルスもしくはサル免疫不全症ウイルスで感染された細胞の場合に)。

図８Ａは、本発明に従って構築されたプラスミドｐｓｓＤＮＡ―エクスプレス−Ａの概略地図である。図８Ｂは、プラスミドｐＢＫ−ＲＳＶ−ＲＴ−（ｄｅｌ）−Ｈｉｎｄ／Ｘｂａ（ＸｍａＩおよびＳａｃ IIで消化することによりＭｂｏ II遺伝子を欠失した後のプラスミドｐｓｓＤＮＡ―エクスプレス−Ａ）の概略地図である。

図１３は、本発明に従って構築されたプラスミドｐＴｅｌｏで形質転換したＨｅＬａ細胞系の抽出物からの一本鎖ＤＮＡのＰＣＲ増幅を示すゲルである。ＲＮＡ／ｓｓＤＮＡ標本をトランスフェクション後３６時間に、トランスフェクションされた細胞培地から収穫し、そして予期したｓｓＤＮＡ産物に特異的なプライマーを用いるＰＣＲ反応における鋳型として用いた。２５ｂｐレーンマーカーを用いた。ＨｅＬａ細胞系Ａ１２からの単離を有すレーン１−５、(１)全ＲＮＡ／ｓｓＤＮＡ画分、(２)Ｓ１ヌクレアーゼで処理した全ＲＮＡ、(３)ＲＮＡｓｅＡで処理した全ＲＮＡ、(４)陰性コントロール、(５)陽性コントロールテロメアＲＮＡプラスミド。レーン６−９：Ｂ１２細胞系からの単離したＲＮＡ、(６)全ＲＮＡ／ｓｓＤＮＡ画分、(７)Ｓ１ヌクレアーゼで処理した全ＲＮＡ、(８)ＲＮＡｓｅＡで処理した全ＲＮＡ、(９)陰性コントロール、(１０)陽性コントロールテロメアＲＮＡプラスミド。陰性コントロールは示していない。４５Ｖ、２０分間における８％アクリルアミドゲル。

ここに記述したベクターシステムの最初の態様において、ベクターは二つのプラスミドシステムより成り、かつ、この第一のプラスミドは、ヒスチジン−プロリンリンカーで制限エンドヌクレアーゼ遺伝子に連結した、ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ(逆転写酵素)遺伝子およびＲＮＡｓｅＨ遺伝子を含む。この中にこれらの遺伝子が挿入されたプラスミドは、ポリアデニル化テーリング配列と共にこれらの遺伝子に必要な転写的および翻訳的制御要素を含む。このプラスミドはここでは“Ａ”プラスミドと呼ばれる(ここに記述される好ましい態様の一つにおいて図４に示されたｐｓｓＤＮＡ―エクスプレス−Ａ)。第二の“Ｂ”プラスミドが構築されたが、これは、ここに記述される態様において、三つの上掲の要素、すなわち、逆転写酵素にマッチしたプライマー結合部位(ＰＲＳ)、興味ある配列、および逆方向縦列型反復配列より成るカセットを含む。ここに記述される二つの態様(ｐＭＮ−新−リンクおよびｐｓｓＤＮＡ―エクスプレス−４Ｂ、後者は図７Ｂに示されている)において、興味ある配列は逆方向縦列型反復配列の間もしくはプライマー結合部位(ＰＲＳ)に対して(ｍＲＮＡ転写体に関して)５'位に位置し、このＰＢＳはｍＲＮＡ転写体の最も３'側に位置する。換言すれば、興味ある配列は、(１)逆方向反復配列の間に(２)逆方向縦列型反復配列およびＰＢＳの間に、および／もしくは(３)逆方向反復配列の間にならびに逆方向反復配列およびＰＢＳの間の両方に位置する。プラスミドＡのように、プラスミドＢはまた転写的制御要素の組み合わせを含む。しかしながら、ここに記述される好ましい態様の一つにおいて、タンパク質はこの構成体からなにも産生しないので、Ｂプラスミドは翻訳的制御要素を含む(要求する)ものでない。

上述のように、本発明の遺伝子要素のセットの一つの要素から成るカセットはオプションとしてまた触媒活性を持つＤＮＡ配列を含む。カセット中にいわゆる“ＤＮＡ酵素”を包含するので、そして具体的には、ＤＮＡ酵素は興味ある配列内に位置すると考えられるので、興味ある配列がアンチセンス配列である阻害性核酸の合成用の鋳型として役立つとき、本発明は特に有利に使用される。その理由のために、ここで詳述する実施例は、図１０に詳述するように四つの興味あるアンチセンス配列の産生を記述し、それぞれが，ｃ−ｒａｆキナーゼを含む、ｍＲＮＡに対する酵素活性を有する配列，ｈ−ｒａｓアンチセンス配列、血管新生因子プレイオトロフィンへのアンチセンス配列、またはサル免疫不全症ウイルス(ＳＩＶ)のｔａｔ領域を含む。当業者は、然しながら、本発明はアンチセンス配列だけに限定されないことおよび阻害性核酸はまた、上述の他のタイプの阻害性核酸配列のどれであってもよいことを認識するであろう。

本発明の遺伝子要素のセットを構成する要素をベクターに組み込むときには、ベクターを保有する細胞の確認を容易にするために、および／もしくはカセットの発現レベルを増大させるために、ベクターが他の特化された遺伝子要素を含んでいることが好ましい。特化された遺伝子要素には、ベクターが原核細胞系に形質転換し増幅できるように選択マーカー遺伝子が含まれる。例えば、最も一般的に使用される選択マーカーは、細菌(例、E. coli)にアンピシリン、クロラムフェニコール、カナマイシン(ネオマイシン)、もしくはテトラサイクリンのような抗生物質に対する抵抗性を付与する遺伝子である。ベクターが以後の真核細胞へのトランスフェクション、確認および発現のための特化された遺伝子要素を含むこともまた好ましい。真核細胞(例、チャイニーズ・ハムスター卵母細胞：ＣＨＯ)での発現には、細胞に抗生物質もしくは他の薬剤に対する抵抗性を付与するか、もしくは形態学的変化、接触阻害の消失、または増殖速度増加のような細胞の表現形を変える多重選択ストラテジーを使用してもよい。真核細胞系で使用される選択マーカーは、ゼオシンのための抵抗性マーカー、Ｇ４１８に対する抵抗性、アミドグリコシド抗生物質に対する抵抗性、またはβ−ｇａｌもしくは緑色蛍光蛋白のような形質選択マーカーを含むが、これらに限定されるものではない。

実施例１．ｓｓ−ＤＮＡのインビトロ合成
逆方向縦列反復間に興味の対象である配列として挿入されたランダムヌクレオチド配列構成のいわゆる「スタッファー」領域を伴う逆方向縦列反復構造を含むように、４つの合成１本鎖ＯＤＮ(１２９、１２１、１１１および１０３塩基長、各々配列番号４、５、１５および１６)が設計された(表１における配列リスト参照)。逆方向縦列反復は、反復内に一対の制限エンドヌクレアーゼ認識切断部位を有するように(図２)設計された。ＮｏｔＩおよびＦｏｋＩに関して設計された切断部位(各々、II型およびIIＳ型制限エンドヌクレアーゼ認識切断)は、１１１(配列番号１５)および１０３(配列番号１６)塩基長オリゴヌクレオチドであり、ＮｏｔＩおよびＭｂｏ IIに関して設計された制限エンドヌクレアーゼ切断部位は、１２９(配列番号４)および１２１(配列番号５)塩基長のオリゴヌクレオチドであった。さらに、逆転写酵素のプライマーが認識するｔＲＮＡプライマー結合配列(ＰＢＳ)がこれらのオリゴヌクレオチド中へ設計された。ＰＢＳは逆方向縦列反復から３'下流に位置していた。

ｐｓｓＤＮＡ−エクスプレス−Ｂの構造は図５に示されている。プラスミドを含む哺乳類細胞は、抗生物質ゼオシンにより選択可能である。挿入体のキー領域の位置および全般的配置は図５Ａに示されており、挿入体の配列の具体的配置は図５Ｂに示されている。構造的特徴を有する正確な位置は図５Ｃに示されている。挿入領域の転写は、サイトメガロウイルスプロモーターにより駆動され、ＢＧＨポリＡ領域で終結される。ＲＮＡ転写物は、このプロモーターの幾つかのフランキング領域と一緒にＭｏＭｕＬＶコアプロモーターを含み、それらの位置は図５Ｂに示されている。逆転写酵素は、コアプロモーターの位置から始まり、プライマーとしてｔＲＮＡｐｒｏを用いて、１コピーの(＋)(トップ)鎖を合成する。リボヌクレアーゼＨでＲＮＡ鎖を消化することにより、相補的逆方向反復ＩＲ−ＬおよびＩＲ−Ｒを含む１本鎖ＤＮＡ配列が解離される(図１)。図２に示された、これらの反復による二重らせん形成により、ループに興味の対象である配列を伴うステム−ループが作成される。ステムは、ＧＡＡＧＡ認識部位に対し８／７塩基３'を開裂する酵素がフランキングベクター配列から興味の対象である配列を解離するように位置した、ＭｂｏIIの認識／切断部位ＧＡＡＧＡ（Ｎ）８ ^▽を含む。

組織培養試験。製造会社添付の使用説明書を用いてリポフェクタント(ベーリンガー・マンハイム・コーポレーション)を使用することにより、安定した一時的トランスフェクションを実施した。プラスミド構築物を全てヒーラセルラインへトランスフェクションした。トランスフェクションの２４−４８時間後ＰＣＲおよびドットブロット分析によりｓｓＤＮＡに関する検定を遂行した。ｐｓｓＤＮＡ−エクスプレス−Ａプラスミド(図１１、パネルＡ)によるトランスフェクション後、Silver,J.ら(２１ Nucleic Acids Res. ３５９３−３５９４(１９９３))により開発されたＲＴ−ＰＣＲ検定法を用いて逆転写酵素活性を検定した。さらに、安定置換されたヒーラセルライン(Ａ１２およびＢ１２)の個々のコロニー分離株をＲＴ活性について検定した(図１１Ｂ)。４８−７２時間早くトランスフェクションした細胞からｓｓ−ｃＤＮＡを分離した。上述したところによると、ｓｓ−ｃＤＮＡはＲＮＡと共局在しており、トリゾール試薬(ギブコ・ライフ・テクノロジーズ、ガイザーズバーグ、メリーランド)を用いて単離された。特異的ｓｓ−ｃＤＮＡ種に関する検定は、内部フラグメントに関するＰＣＲに基く検定法(ｐＴｅｓｔについては図１２およびｐＴｅｌｏについては図１３)および変性一本鎖ゲル電気泳動および後続のナイロンブロッティングおよび内部ビオチン標識プローブによるプロービングの両方法により実施された。

Ｃプラスミドの構築。上述した通り、本発明ベクター系はまた単一プラスミド形態をとり得る。単一「Ｃ」プラスミドベクターシステムを製造するため、プラスミドｐｓｓＤＮＡ−エクスプレス−ＡをＳａｃＩおよびＸｍａＩで消化することによりＭｂｏII遺伝子を除去し、ｐＢＫ−ＲＳＶ−ＲＴ−（ｄｅｌ）−Ｈｉｎｄ／Ｘｂａを作成した(図８Ｂ)。７０℃で１５分間アニーリングさせ、ゆっくりと室温に冷却したオリゴヌクレオチド５'−(リンク)２−Ｈｉｎｄ／Ｘｂａおよび３'−(リンク)２−Ｈｉｎｄ／Ｘｂａ(表１)により構成されるリンカー領域を、標準条件下で消化後プラスミドへ連結した。陽性クローンを採取し、配列決定することにより、リンカー置換を立証し、次いでこのプラスミドをＸｂａおよびＨｉｎｄIIIで消化した。次いで、プラスミドｐｓｓＤＮＡ−エクスプレス−ＢをＨｉｎｄIIIおよびＸｂａで消化し、前述の逆方向縦列反復、多重クローニング部位およびＰＢＳを含む対応する３００塩基対ＤＮＡフラグメントを、消化されたプラスミドへクローン化することにより、ｐｓｓＤＮＡ−エクスプレス−Ｃ(図９Ａ)が得られた。標準連結反応を遂行し、シュアII細胞(ストラタジーン、インコーポレイテッド)へ形質転換した。形質転換陽性コロニーを採取し、陽性クローンを制限分析により同定した。