JP2004502727A - レトロウイルス感染症を処置するための薬学的組成物および方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、哺乳動物におけるレトロウイルス感染症を処置する医薬品を製造するためのピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジン誘導体の使用を提供する。本発明はまた、レトロウイルス感染症の治療において同時または個別または連続的に使用される混合調製物として、哺乳動物におけるレトロウイルス感染症に対する相乗効果をもたらすためなどにそれぞれの割合で、（ａ）１つ以上のピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジン誘導体と、（ｂ）レトロウイルスの進入および／または複製に関与する１つ以上のレトロウイルスタンパク質または細胞タンパク質に対して効果的な薬物を含む１つ以上の抗レトロウイルス薬とを含有する製造物を提供する。
Description
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、哺乳動物におけるレトロウイルス感染症を処置するための方法およびそのような方法を行うための薬学的組成物に関する。より詳細には、本発明は、哺乳動物におけるレトロウイルス感染症を処置するための医薬品を製造するための、特定のピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジン誘導体の使用に関する。別の実施形態において、本発明は、１つ以上の細胞タンパク質またはレトロウイルスタンパク質を標的とする１つ以上の薬物（例えば、レトロウイルス酵素阻害剤）と組み合わせられたこれらの誘導体の使用に関する。
【０００２】
（発明の背景）
１型ヒト免疫不全症ウイルス（以降、ＨＩＶ−１として示される）の複製は、Ｖａｎｄａｍｍｅ他によりＡｎｔｉｖｉｒａｌ Ｃｈｅｍ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．（１９９８）９：１８７〜２０３に概説されるように、多数のウイルス標的を標的とする強力な抗ウイルス薬を組み合わせることによって感染患者において劇的に低下させることができる。ＨＩＶ感染患者の処置に対して正式に承認されている薬物は、逆転写酵素（ＲＴ）阻害剤（ヌクレオシド系および非ヌクレオシド系）またはプロテアーゼ阻害剤のクラスに属する。多剤混合療法は、ウイルス量を、最も高感度な試験の検出限界よりも低く低下させることができる。それにも関わらず、Ｐｅｒｅｌｓｏｎ他、Ｎａｔｕｒｅ（１９９７）３８７：１２３〜１２４によれば、低いレベルの継続した複製がおそらくは聖域部位で生じ、これにより薬物耐性株の出現をもたらすことが示されている。さらに、Ｓｃｈｍｉｔ他、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．（１９９６）１７４：９６２〜９６８によれば、ＨＩＶは、すべてではないが、ほとんどの現在承認されている抗ウイルス薬に対する耐性を発達させることができる。
【０００３】
ＨＩＶ−１の組込みに必要とされる唯一の酵素は、ＢｒｏｗｎによりＲｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ（１９９７）（Ｃｏｆｆｉｎ、ＨｕｇｈｅｓおよびＶａｒｍｕｓ編（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、米国）、１６１頁〜２０３頁）に概説されるように、ｐｏｌ遺伝子の３’末端にコードされる３２ｋＤａのタンパク質であるインテグラーゼ（以降、ＩＮとして示される）である。この酵素は、ビリオンが成熟化するときにｇａｇ−ｐｏｌ前駆体のプロテアーゼ媒介の切断によって産生される。インテグラーゼは、ウイルスｃＤＮＡの長末端反復（以降、ＬＴＲとして示される）エレメント内の特異的な配列を認識をする。ＬＴＲの末端の１５ｂｐが、部位特異的な切断および組込みのためには必要かつ十分である。切断部位のすぐ上流に位置する高度に保存されたジヌクレオチドＣＡが酵素活性には重要である。３’末端プロセシングと名付けられた組込み反応の第１段階において、２つのヌクレオチドがそれぞれの３’末端から除かれ、新しい３’−ヒドロキシル末端（ＣＡ−３’−ＯＨ）が生じる。この反応は、Ｍｉｌｌｅｒ他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９７）７１：５３８２〜５３９０によれば、細胞質において、前組込み複合体（以降、ＰＩＣとして示される）と呼ばれる大きいウイルス核タンパク質複合体内で生じる。核に進入した後、プロセシングされたウイルス二重鎖ＤＮＡが宿主の標的ＤＮＡに結合する。この結合反応には、標的の宿主ＤＮＡの対形成する５ｂｐの付着性切断、およびプロセシングされたＣＡ−３’−ＯＨのウイルスＤＮＡ末端を標的ＤＮＡの５’−Ｏリン酸エステル末端に連結することが含まれる。残存するギャップの修復が、これは現時点では理解されていないが、宿主細胞のＤＮＡ修復酵素によっておそらくは達成される。しかし、Ｃｈｏｗ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９２）２５５：７２３〜７２６によれば、レトロウイルスの酵素もまた関与することが推定されていた。
【０００４】
部分的なタンパク質分解の実験に基づいて、ＨＩＶ−ＩＮは３つの機能的ドメインに分割することができる。Ｎ末端のドメイン（残基１〜５０を含む）は、ＨＨＣＣ「ジンクフィンガー」様配列を特徴とする（すなわち、Ｚｎ２＋と結合する２つのヒスチジンおよび２つのシステインを含有する）が、その正確な機能は不明のままである。中央のコアドメイン（残基５０〜２１２を含む）は、インテグラーゼスーパーファミリーおよびポリヌクレオチドトランスフェラーゼにおいて高度に保存されており、そして３’−プロセシング活性およびＤＮＡ鎖転移活性の両方に対する触媒作用ドメインを表す３つのアミノ酸残基（Ａｓｐ６４、Ａｓｐ１１６およびＧｌｕ１５２）を特徴とする。この中央のコアドメインは単独で、ＤＮＡ鎖転移反応の明かな逆（いわゆる分解反応）をインビトロで行うことができる。しかし、アミノ末端およびカルボキシ末端の両方のドメインが３’−プロセシングおよび鎖転移の触媒作用には必要である。触媒作用コアドメイン内における一アミノ酸の置換体（Ｆ１８５Ｋ）は、Ｄｙｄａ他によりＳｃｉｅｎｃｅ（１９９４）２６６：１９８１〜１９８６に概説されるように、コアドメインを結晶化させることができ、そしてその三次元（以降、３Ｄとして示される）構造を解明することができる可溶性タンパク質をもたらす。Ｃ末端のドメイン（残基２１２〜２８８を含む）は非特異的なＤＮＡ結合に関与している。短縮化されたＣ末端ドメインの核磁気共鳴（以降、ＮＭＲとして示される）による構造が決定されている。ＩＮタンパク質をこれらの異なるドメインにおいて変異させた相補性研究により、正確な化学量論は不明のままであるが、ＩＮの活性形態はオリゴマーであることが示唆されている。
【０００５】
高処理能のマイクロタイタープレートアッセイを確立し、そしてＨＩＶ−１ＩＮの触媒作用ドメインの３Ｄ構造を解明することによって、ケミカルライブラリーをスクリーニングするか、または構造に基づいて設計することによるＩＮ阻害剤の開発が促進させられた。かなり面倒なＰＩＣアッセイにおけるＩＮ阻害剤の評価が（例えば、Ｆａｒｎｅｔ他によりＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９６）９３：９７４２〜９７４７に）議論されているが、ＩＮの阻害は典型的には、プロセシング反応および結合反応の両方をインビトロで評価するためにＬＴＲ模倣体を使用するオリゴヌクレオチドに基づくアッセイにおいて、すなわち、Ｓｈｅｒｍａｎ他によりＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９０）８７：５１１９〜５１２３に、そしてＢｕｓｈｍａｎ他によりＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９１）８８：１３３９〜１３４３に開示されるようなアッセイにおいて評価される。種々のクラスのＨＩＶ−１ＩＮ阻害剤が、Ｙ．Ｐｏｍｍｉｅｒ他によりＡｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０００）４７：１３９〜１４８に概説されるように報告されており、これらには、（ｉ）モノヌクレオチド、ジヌクレオチド、ｉｓｏ−ヌクレオチドおよびより長いオリゴヌクレオチドならびにそれらのアナログ、（ｉｉ）ヒドロキシル化芳香族化合物、（ｉｉｉ）ＤＮＡインターカーション剤（リガンド）、そして（ｉｖ）ポリペプチドおよび抗体が含まれる。しかし、これらの化合物はほとんどが細胞培養において抗ウイルス活性を示さなかった。細胞培養において抗ウイルス活性を示したＩＮ阻害剤のほとんどについて、組込み段階が標的化されていることは明確には明らかにされなかった。Ｈａｚｕｄａ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０００）２８７：６４６〜６５０によれば、これまでに報告されている真のＩＮ選択的阻害剤はジケト酸誘導体だけである。
【０００６】
３’，５−ジアジド−２’，３’−ジデオキシウリジン５’−モノホスファート（５−Ｎ３−ＡＺＵＭＰとして示される）などのヌクレオチドは、おそらくはヌクレオチド結合部位との相互作用によって、より正確にはＨＩＶ−１コアドメインのα−４へリックスに結合することによってＩＮの酵素活性を妨害する。様々なヌクレオチドアナログの構造−活性研究が報告されている。阻害のために必要とされる濃度（ＩＣ５０＝１５０μＭ）が高かったが、Ｆｕｒｍａｎ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８６）８３：８３３３〜７によれば、１ｍＭまでの濃度の５−Ｎ３−ＡＺＵＭＰが細胞内に蓄積し得るので、ＩＮ阻害がＡＺＴの抗ウイルス効果に寄与し得ることを除外することができない。ジヌクレオチドもまた、５’−Ｏリン酸化がないときでさえ、ＨＩＶ―１ＩＮの強力な阻害剤として報告されていたが、Ｍａｚｕｍｄｅｒ他によりＭｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（１９９７）５１：５６７〜７５に報告されるように、どれも抗ウイルス活性を示さなかった。
【０００７】
四鎖化グアノシン四量体構造を形成するオリゴヌクレオチドは、（Ｏｊｗａｎｇ他、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．（１９９５）３９：２４２６〜２４３５によれば）細胞培養におけるＨＩＶ複製の強力な阻害剤である。しかし、Ｇ四量体はナノモル範囲でＨＩＶのＩＮ活性を阻害するが、細胞培養におけるその抗ウイルス活性は、ＨＩＶのＩＮ活性の阻害ではなく、ウイルス進入の阻害のためであることが、薬剤耐性株の選択および配列決定によって（Ｃｈｅｒｅｐａｎｏｖ他によりＭｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（１９９７）５２：７７１〜７８０に）明瞭に示されている。
【０００８】
多くのポリヒドロキシル化芳香族化合物（フラボン類、チルホスチン類、リグナン類、アントラキノン類およびビスカテコール類を含む；これらはすべて、芳香族環における２つのビシナルヒドロキシル基を特徴とする）がインビトロにおけるＨＩＶ−１ＩＮの阻害剤として報告されている。３つの考えられる作用機構が提案されていた（Ｐｏｍｍｉｅｒ他（前掲）を参照のこと）。カテコール類は、活性部位におけるリン酸転移反応に必要な金属イオンの配位を妨害し得る。カテコール類のインビボでの酸化は反応性のキノン化学種を生じさせることができ、またはヒドロキシル基が、酵素と相互反応するための水素結合ドナーとして機能し得る。オルト位にヒドロキシル基を含まないが、ＩＮ活性を阻害するヒドロキシル化芳香族化合物（クルクミン、クーママイシンおよびビスクマリン類など）もまた報告されている。分子モデリングを使用して、様々なファルマコホアが、Ｎｅａｍａｔｉ他、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（１９９７）５２：１０４１〜１０５５によれば、新規なリード化合物の発見をもたらし得る知られているヒドロキシル化芳香族阻害剤において同定されている。しかし、細胞培養におけるカテコールタイプの阻害剤の抗ウイルス効果は、その固有的な細胞毒性により損なわれている。
【０００９】
ジカフェオイルキナ酸誘導体およびＬ−チコリ酸（Ｌ−ＣＡ）誘導体がインビトロにおけるＨＩＶ−１のＩＮおよび細胞培養におけるＨＩＶ−１の複製を阻害することが、最近、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ他によりＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９６）９３：６３２６〜６３３１に報告された。Ｌ−チコリ酸に対して耐性のＨＩＶ−１株が選択され、変異がＩＮ遺伝子にマッピングされた（Ｇ１４０Ｓ）。本発明者らは、最近、Ｌ−ＣＡに対して耐性であり、かつＩＮ遺伝子の代わりにｇｐ１２０に変異を含む複数のＨＩＶ−１株を選択した。さらに、Ｇ１４０Ｓ変異を有する組換えＩＮは、Ｐｌｕｙｍｅｒｓ他（２０００）によれば、野生型酵素と同程度にＬ−ＣＡによって阻害された。
【００１０】
ジケト酸誘導体は、Ｈａｚｕｄａ他（前掲）により報告されるように、ＤＮＡ鎖転移段階を特異的に阻害することによってＨＩＶ−１の複製をマイクロモル濃度で阻害する。これらの化合物の存在下で選択された耐性のウイルス株はＩＮ遺伝子に様々な変異を有した。これらの変異は、ＩＮに導入されたときに、これらの薬剤に対して部分的な耐性をもたらした。
【００１１】
多くのＤＮＡ結合剤もまた、おそらくは酵素のＤＮＡ結合ドメインとの非特異的な相互作用のためにＨＩＶ−１ＩＮを阻害することが見出されていた。ＤＮＡインターカレーターおよびＤＮＡ溝結合剤（ネトロプシンなど）はこのカテゴリーに属する。例えば、インターカーレーションするオキサゾロピリドカルバゾールに結合することによりＬＴＲの特異的な領域において三重らせんを形成するＤＮＡリガンドは、ＨＩＶ−１ＩＮのＵ３特異的ＬＴＲ結合阻害剤またはＵ５特異的ＬＴＲ結合阻害剤として作用することができる。ＨＩＶ−１ＩＮのアミノ酸１４７〜１７５に対応する３０ｍｅｒのペプチドはまたミリモルの濃度でＩＮ活性を阻害することが示されていた。ＩＮドメインに対する単鎖の可変フラグメントを細胞内で発現させることにより、ウイルス複製サイクルの初期段階が阻害される。リボソーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ）ファミリーのメンバーなどのポリペプチドがＨＩＶ−１ＩＮの強力な阻害剤として記載されていた。しかし、ＩＮとの妨害がその抗ウイルス活性に対する重要な機構であることは明らかにされていなかった。
【００１２】
国際特許出願公開ＷＯ９９／２５７１８には、特に、抗菌活性、（ヘルペス単純ウイルスに対する）抗ウイルス活性、抗クラミジア活性、および（インターフェロン誘導剤のような）免疫刺激活性を有して、薬理学、獣医学および化粧品学において有用であり、そして免疫不全症患者における日和見疾患を処置するために有用であると言われるクラスのピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジン誘導体が開示されている。
【００１３】
まとめると、レトロウイルスのＲＴおよび／またはＩＮを選択的に標的とし、そしてまた抗ウイルス性ある強力な阻害剤が当該分野において依然として強く求められている。従って、本発明の目的は、哺乳動物およびヒトにおけるレトロウイルス感染症（特にレンチウイルス感染症、より具体的にはＨＩＶ感染症）を処置するための効率的かつ有害でない薬学的に活性な成分および成分の組合せを明らかにすることによってこの差し迫った要求を満たすことである。
【００１４】
（発明の要約）
哺乳動物およびヒトにおけるレトロウイルス感染症（特にレンチウイルス感染症、より具体的にはＨＩＶ感染症）の治療を改善し、かつウイルスの複製をさらに低下させ、かつ多数の薬剤に対して耐性であるレトロウイルス株に対処する努力において、第３のウイルス酵素であるインテグラーゼ（ＨＩＶ−ＩＮ）の効果的な阻害剤に対する探索を開始することが望ましかった。この酵素は、ウイルスが複製するために不可欠な段階である、ウイルスｃＤＮＡを宿主細胞染色体に挿入することを担っている。この酵素のヒト対応体はまだ知られていないので、ＨＩＶ組込みプロセスの効果的で、好ましくは選択的な阻害剤を開発することはかなり注目される。
【００１５】
本発明は、特定のピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジン誘導体によってレトロウイルス（特にＨＩＶ−１）のインテグラーゼが阻害されるという予想外の発見に基づいている。ここで、これらの化合物はまた、細胞培養においてＨＩＶの複製からの保護を示し、そして１つ以上の抗レトロウイルス薬、例えば、レトロウイルスの進入および／または複製に関与する１つ以上のレトロウイルスタンパク質または細胞タンパク質に対して効果的な薬物（例えば、下記に示される薬物）と組み合わせて使用されたときに哺乳動物およびヒトの細胞培養においてレトロウイルス感染（特にレンチウイルス感染）に対する相乗効果もまた示すことができる（総説については、Ａｎｔｉｖｉｒａｌｓ ａｇａｉｎｓｔ ＡＩＤＳ（２０００）、Ｍ．Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．を参照のこと）：
・下記に詳述されるようなレトロウイルス酵素阻害剤、
・レトロウイルスの複製に関与するか、またはレトロウイルスの複製に不可欠である（グリコシル化または非グリコシル化）非酵素レトロウイルスタンパク質（例えば、ＨＩＶのｇｐ１２０）に対して効果的な薬物、例えば、Ｎａｔｕｒｅ（２００１）４１０：９６６に議論されるｇｐ１２０エンベロープ抗原に基づく免疫原、および
・レトロウイルスの進入に関与するか、またはレトロウイルスの進入に不可欠であるタンパク質（例えば、受容体または細胞化合物）を阻止する薬物、例えば、ＣＣＲ５阻害剤（例えば、Ｄｒａｇｉｃ他によりＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２０００）９７：５６３９〜４４に開示されるＴＡＫ−７７９分子など）。
そのような生物学的性質または性質の組合せは、すなわち、それらを、ヒトにおけるＨＩＶ感染のいわゆる混合療法において非常に注目される薬学的に活性な成分にする。
【００１６】
従って、そのより広い意味で、本発明は、レトロウイルス感染患者（特にレンチウイルス感染患者、より詳細にはＨＩＶ感染患者）におけるレトロウイルス感染症を処置する医薬品を製造するためのピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジン誘導体の使用に関する。本発明はまた、レトロウイルス酵素（特にインテグラーゼまたは逆転写酵素、より詳細にはＨＩＶ−１のインテグラーゼまたはＨＩＶ−１の逆転写酵素）の阻害剤としてのピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジン誘導体の使用に関する。本発明はまた、レトロウイルス感染患者（特にレンチウイルス感染患者、より詳細にはＨＩＶ感染患者）におけるレトロウイルス感染症を処置するための方法に関し、この方法は、そのような処置を必要とする患者にピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジン誘導体の有効量を投与する工程を含む。
【００１７】
別の実施形態において、本発明はまた、逆転写酵素阻害剤またはプロテアーゼ阻害剤などの１つ以上の抗レトロウイルス薬と組み合わせて使用されたときに、ヒト細胞培養におけるレトロウイルス感染に対する（下記に定義されるような）（亜）相乗効果の予想外の発見に基づいている。このような相乗的性質は、すなわち、それらを、ヒトにおけるＨＩＶ感染のいわゆる混合療法において非常に有用にする。
【００１８】
上記で議論された国際特許出願公開ＷＯ９９／２５７１８は、ＨＩＶに対するこれらの化合物の活性を何ら示唆しないか、またはレトロウイルス酵素の阻害を何ら示唆しておらず、そして免疫不全症そのものを処置することを示唆せず、免疫不全患者におけるその結果のみを示唆するだけであることに注目することは非常に重要である。
【００１９】
（詳細な説明）
本発明は最初に、哺乳動物におけるレトロウイルス感染症（特にレンチウイルス感染症、より詳細にはＨＩＶ感染症）を処置する医薬品を製造するためのピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジン誘導体の使用に関し、そしてそのような感染症にかかりやすい哺乳動物の対応する処置方法に関する。
【００２０】
第２の局面において、本発明は、好ましくは哺乳動物におけるレトロウイルス感染症に対する（またはその処置のための）医薬品として（または医薬品を製造するために）、そしてより好ましくは哺乳動物におけるレトロウイルス感染症に対して（またはその処置において）相乗効果をもたらすためなどにそれぞれの割合で、（ａ）ピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジンの１つ以上の誘導体と、（ｂ）レトロウイルスの進入および／または複製に関与する１つ以上のレトロウイルスタンパク質または細胞タンパク質に対して効果的な薬物を含む１つ以上の抗レトロウイルス薬（例えば、レトロウイルス酵素阻害剤）とを含む組成物の使用を提供する。第３の局面において、本発明は、レトロウイルス感染症の治療において同時または個別または連続的に使用される混合調製物として、哺乳動物におけるレトロウイルス感染症に対する相乗効果をもたらすようにそれぞれの割合で、（ａ）ピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジンの１つ以上の誘導体と、（ｂ）レトロウイルスの進入および／または複製に関与する１つ以上のレトロウイルスタンパク質または細胞タンパク質に対して効果的な薬物を含む１つ以上の抗レトロウイルス薬（例えば、レトロウイルス酵素阻害剤）とを含有する製造物を提供する。第４の局面において、本発明は、哺乳動物におけるレトロウイルス感染症を処置するための方法を提供する。この方法は、レトロウイルス感染に対して相乗効果をもたらすためなどにそれぞれの割合で、（ａ）１つ以上のピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジン誘導体と、（ｂ）レトロウイルスの進入および／または複製に関与する１つ以上のレトロウイルスタンパク質または細胞タンパク質に対して効果的な薬物を含む１つ以上の抗レトロウイルス薬（例えば、レトロウイルス酵素阻害剤）とを含む混合治療用調製物の有効量を、そのような処置を必要とする哺乳動物に同時または別個または連続的に投与する工程を含む。
【００２１】
本発明の様々な局面において、処置されるレトロウイルス感染症は、好ましくはレンチウイルス感染症であり、より好ましくはＨＩＶ感染症である。
【００２２】
本発明の様々な局面において、ピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジン誘導体は、好ましくは、下記の式を有する化合物、その薬学的に受容可能な付加塩または立体化学的異性体であって：
【００２３】
【化６】
【００２４】
式中、
・Ｘは、ヒドロキシ、ハロおよびチオールから選択され、
・Ｙは、ヒドロキシ、メトキシおよびハロから選択され、そして
・Ｚは、水素、ハロおよびニトロから選択される。
このようなピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジン誘導体は、例えば、５，５’−アリーリデンビスバルビツル酸（例えば、ＸおよびＹの両方がヒドロキシであるとき）または５，５’−アリーリデンビス（２−チオ）バルビツル酸（例えば、Ｘがチオールで、Ｙがヒドロキシであるとき）のピリジン塩をオキシ塩化リンＰＯＣｌ３と反応し、その後、酸化リンＰ２Ｏ５と反応することによって、あるいは（例えば、Ｘがヒドロキシで、Ｙがメトキシで、Ｚがｐ−ニトロであるときには）６−メトキシウラシル、ｐ−ニトロベンズアルデヒド、酢酸および無水酢酸を酢酸の沸騰温度に近い温度で反応することによって得ることができる。これらの方法の様々な変形がＷＯ９９／２５７１８に開示されている。この誘導体ファミリーの代表的なものとして、５−（４−ニトロフェニル）−２，８−ジチオール−４，６−ジヒドロキシ−５Ｈ−ピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジンが挙げられる。興味深いことに、この誘導体ファミリーにおいて、スルフヒドリル基を２位および８位に有する分子は、ヒドロキシル置換基を同じ位置に有する対応する化合物よりも顕著な抗ウイルス活性を示す傾向を有することが認められた。
【００２５】
上記で言及された薬学的に受容可能な付加塩は、上記の式を有する化合物が形成することができ、かつそのような化合物の塩基形態を適切な酸で処理することによって都合よく得ることができる治療的に活性な非毒性の酸付加塩形態を包含することが意味される。そのような適切な酸の例には、例えば、ハロゲン化水素酸（例えば、塩化水素酸または臭化水素酸）、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸；または有機酸、例えば、酢酸、プロパン酸、ヒドロキシ酢酸、２−ヒドロキシプロパン酸、２−オキソプロパン酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸（すなわち、エタン二酸）、マロン酸、コハク酸（すなわち、ブタン二酸）、マレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、シクロヘキサンスルファミン酸、サリチル酸（すなわち、２−ヒドロキシ安息香酸）、ｐ−アミノサリチル酸、パモ酸などが含まれる。逆に、塩形態は、適切なアルカリで処理することによって遊離塩基形態に変換することができる。本明細書中で使用される用語「薬学的に受容可能な付加塩」には、上記の式を有する化合物ならびに上記に定義されるようなそれらの塩が形成することができる溶媒和物が含まれ、例えば、水和物、アルコラートなどが含まれる。
【００２６】
本発明において治療活性成分として使用されるピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジン誘導体は好ましくは、それらが意図される治療プログラムを安全に制御するために、実質的に純粋な形態で、すなわち、その製造過程および／または取扱い過程に由来する化学的不純物（副生成物または残留溶媒など）を含まない形態で存在しなければならない。ピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジン誘導体は、それらが不斉炭素原子を少なくとも有するとき、ラセミ混合物として存在し得るか、または模擬移動床技術を含む標準的な分画方法によってラセミ混合物から得られる前記化合物の実質的に純粋な立体異性体もしくはエナンチオマーの形態で存在し得る。
【００２７】
本明細書中前記で使用される用語「立体化学的異性体」により、式（Ｉ）の化合物が有し得る可能な異性体のすべてが定義される。別途示されない限り、化合物の化学的名称は、基本分子構造のすべてのジアステレオマーおよびエナンチオマーを含む、すべての可能な立体化学的異性体の混合物を意味する。より詳細には、立体中心はＲ配置またはＳ配置のいずれかを有し得る。前記化合物の純粋な立体異性体は、同じ基本分子構造の他のエナンチオマー形態またはジアステレオマー形態を実質的に含まない異性体として定義される。特に、用語「立体異性体的に純粋」または用語「キラル純粋」は、立体異性体過剰率が少なくとも８０％であり（すなわち、少なくとも９０％が一方の異性体であり、多くても１０％がそれ以外の可能な異性体であり）、好ましくは少なくと９０％であり、より好ましくは少なくとも９４％であり、最も好ましくは少なくとも９７％である化合物に関する。用語「エナンチオマー的に純粋」および用語「ジアステレオマー的に純粋」は、それぞれ、問題とする混合物のエナンチオマー過剰率、ジアステレオマー過剰率に注目して、同じように理解しなければならない。
【００２８】
従って、エナンチオマーの混合物が調製方法のときに得られる場合には、混合物は、好適なキラル定常相を使用する液体クロマトグラフィーによって分離することができる。好適なキラル定常相には、例えば、多糖が挙げられ、具体的にはセルロース誘導体またはアミロース誘導体がある。市販されている多糖ベースのキラル定常相には、ＣｈｉｒａｌＣｅｌＴＭＣＡ、ＯＡ、ＯＢ、ＯＣ、ＯＤ、ＯＦ、ＯＧ、ＯＪおよびＯＫ、ならびにＣｈｉｒａｌｐａｋＴＭＡＤ、ＡＳ、ＯＰ（＋）およびＯＴ（＋）がある。前記の多糖キラル定常相との組合せで使用される適切な溶出液または移動相には、ヘキサンなどがあり、これらは、エタノール、イソプロパノールなどのアルコールで調節される。
【００２９】
本明細書中前記で使用される用語「実質的に純粋」は、高速液体クロマトグラフィーなどのこの分野で通常的な方法によって測定されたときに、少なくとも約９６％（好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％）の化学的純度を意味する。
【００３０】
本発明の様々な局面において、薬物（ｂ）として使用されるレトロウイルス酵素阻害剤は、この分野で既に知られているカテゴリーに属し得るが、特に下記の阻害剤を含むことができる：
・ＨＩＶ−１のＩＮ阻害剤、例えば、本明細書中上記に概説されるようなＨＩＶ−１ＩＮ阻害剤；
・ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、例えば、ジドブジン、ラミブジン、ジダノシン、スタブジン、ザルシタビンなど；
・非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、例えば、ネビラピン、デラビルジンなど；
・他の逆転写酵素阻害剤、例えば、フォスカルネットナトリウムなど；
・ＨＩＶ−１プロテアーゼ阻害剤、例えば、サキナビル、リトナビル、インジナビル、ネルフィナビルなど。
【００３１】
本発明の第３の局面で提供される製造物は、（ａ）および（ｂ）の少なくとも１つが少なくとも薬学的に受容可能なキャリアと混合されている薬学的調製物または薬学的組成物の形態であり得る。本明細書中で使用される用語「薬学的に受容可能なキャリア」は、例えば、前記組成物の溶解、分散もしくは拡散によって、処置される位置への適用もしくは散布を容易にするために、かつ／またはその有効性を損なうことなくその貯蔵、輸送もしくは取扱いを容易にするために、有効成分（ａ）および有効成分（ｂ）からなる組成物が配合される任意の材料または物質を意味する。薬学的に受容可能なキャリアは固体であってもよく、または液体であってもよく、または液体を形成させるために圧縮されている気体であってもよい。すなわち、本発明の組成物は、高濃度物、エマルション剤、溶液剤、顆粒、粉剤、スプレー剤、エアロゾル剤、ペレットまたは粉末剤として好適に使用することができる。
【００３２】
前記薬学的組成物およびその配合物において使用される好適な薬学的キャリアは当業者には十分に知られており、その選択は本発明では特に制限されない。薬学的キャリアはまた、湿潤化剤、分散剤、増粘剤、接着剤、乳化剤、溶媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤（例えば、フェノール、ソルビン酸、クロロブタノール）、等張剤（糖または塩化ナトリウムなど）などの添加剤を、それらが製薬実施と矛盾しないならば含むことができる。すなわち、哺乳動物に対して永続的な損傷を生じさせないキャリアおよび添加剤を含むことができる。本発明の薬学的組成物は、任意の知られている様式で、例えば、一段階または多段階の方法で、有効成分を、選択されたキャリア物質と、そしてまた、適する場合には、界面活性剤などのそれ以外の添加剤と均質に混合、コーティングおよび／または粉砕することによって調製することができ、そして例えば、約１μｍ〜１０μｍの直径を通常的には有するマイクロスフェアの形態で得るために、すなわち、有効成分を制御放出または持続放出させるためのマイクロカプセルを製造するために、微細化によって調製することができる。
【００３３】
本発明の薬学的組成物において使用される好適な界面活性剤は、良好な乳化性、分散性および／または湿潤化性を有する非イオン性物質、カチオン性物質および／またはアニオン性物質である。好適なアニオン性界面活性剤には、水溶性の石けんおよび水溶性の合成界面活性剤の両方が含まれる。好適な石けんには、高級脂肪酸（Ｃ１０〜Ｃ２２）のアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩、非置換アンモニウム塩または置換アンモニウム塩、例えば、オレイン酸またはステアリン酸のナトリウム塩またはカリウム塩、あるいはココナッツオイルまたはタローオイルから得られる天然脂肪酸混合物のそのような塩が挙げられる。合成界面活性剤には、ポリアクリル酸のナトリウム塩またはカルシウム塩；脂肪スルホン酸塩および脂肪硫酸塩；スルホン酸化ベンゾイミダゾール誘導体およびアルキルアリールスルホン酸塩が含まれる。脂肪スルホン酸塩または脂肪硫酸塩は通常、アルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩、非置換アンモニウム塩、または８個〜２２個の炭素原子を有するアルキル基もしくはアシル基で置換された置換アンモニウム塩の形態であり、例えば、リグノスルホン酸またはドデシルスルホン酸のナトリウム塩またはカルシウム塩、あるいは天然脂肪酸から得られる脂肪アルコール硫酸塩の混合物、硫酸エステルまたはスルホン酸エステルのアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩（ラウリル硫酸ナトリウムなど）、および脂肪アルコール／エチレンオキシド付加物のスルホン酸のアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩である。好適なスルホン酸化ベンゾイミダゾール誘導体は、好ましくは、８個〜２２個の炭素原子を含有する。アルキルアリールスルホン酸塩の例には、ドデシルベンゼンスルホン酸またはジブチルナフタレンスルホン酸またはナフタレンスルホン酸／ホルムアルデヒド縮合生成物のナトリウム塩、カルシウム塩またはアルカノールアミン塩がある。また、対応するリン酸塩（例えば、リン酸エステルの塩）、ならびにｐ−ノニルフェノールとエチレンオキシドおよび／またはプロピレンオキシドとの付加物、またはリン脂質も好適である。この目的のために好適なリン脂質には、セファリンタイプまたはレシチンタイプの天然リン脂質（動物細胞または植物細胞に由来）または合成リン脂質が挙げられ、例えば、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセリン、リソレシチン、カルジオリピン、ジオクタニルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリンおよびそれらの混合物がある。
【００３４】
好適な非イオン性界面活性剤には、少なくとも１２個の炭素原子を分子内に含有するアルキルフェノール、脂肪アルコール、脂肪酸、脂肪族アミンまたは脂肪族アミドのポリエトキシル化誘導体およびポリプロポキシル化誘導体、そしてアルキルアレーンスルホン酸塩およびジアルキルスルホコハク酸塩が含まれ、例えば、脂肪族アルコールおよび脂環式アルコール、飽和および不飽和の脂肪酸およびアルキルフェノールのポリグリコールエーテル誘導体などがある。前記誘導体は、好ましくは、３個〜１０個のグリコールエーテル基および８個〜２０個の炭素原子を（脂肪族）炭化水素部分に含有し、そして６個〜１８個の炭素原子をアルキルフェノールのアルキル成分に含有する。さらなる好適な非イオン性界面活性剤は、ポリエチレンオキシドのポリプロピレングリコールとの水溶性付加物、１個〜１０個の炭素原子をアルキル鎖に含有するエチレンジアミノポリプロピレングリコールである。そのような付加物は、２０個〜２５０個のエチレングリコールエーテル基および／または１０個〜１００個のプロピレングリコールエーテル基を含有する。そのような化合物は、通常、プロピレングリコールユニットあたり１個〜５個のエチレングリコールユニットを含有する。非イオン性界面活性剤の代表的な例には、ノニルフェノール−ポリエトキシエタノール、ひまし油ポリグリコール酸エーテル、ポリプロピレン／ポリエチレンオキシド付加物、トリブチルフェノキシポリエトキシエタノール、ポリエチレングリコールおよびオクチルフェノキシポリエトキシエタノールがある。ポリエチレンソルビタンの脂肪酸エステル（ポリオキシエチレンソルビタントリオレアートなど）、グリセロールの脂肪酸エステル、ソルビタンの脂肪酸エステル、スクロースの脂肪酸エステルおよびペンタエリトリトールの脂肪酸エステルもまた好適な非イオン性界面活性剤である。
【００３５】
好適なカチオン性界面活性剤には、ハロ、フェニル、置換フェニルまたはヒドロキシで必要に応じて置換される４個の炭化水素基を有する四級アンモニウム塩（好ましくはハロゲン化物）が含まれ、例えば、少なくとも１つのＣ８〜Ｃ２２アルキル基（例えば、セチル、ラウリル、パルミチル、ミリスチル、オレイルなど）をＮ置換基として含有し、そしてさらなる置換基として、非置換またはハロゲン化された低級アルキル基、ベンジル基および／またはヒドロキシ低級アルキル基を含有する四級アンモニウム塩が含まれる。
【００３６】
この目的のために好適な界面活性剤のより詳細な記載を、例えば、「ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ’ｓ Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒｓ Ａｎｎｕａｌ」（ＭＣ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｒｏｐ．、Ｒｉｄｇｅｗｏｏｄ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、１９８１）、「Ｔｅｎｓｉｄ−Ｔａｓｃｈｅｎｂｕｃｈ」第２版（Ｈａｎｓｅｒ Ｖｅｒｌａｇ、Ｖｉｅｎｎａ、１９８１）、および「Ｅｎｃｙｃｌｏｐａｅｄｉａ ｏｆ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ」（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８１）に見出すことができる。
【００３７】
さらなる成分を、組成物中の有効成分の作用継続時間を制御するために含めることができる。例えば、制御放出組成物を、例えば、ポリエステル、ポリアミノ酸、ポリビニルピロリドン、エチレン−酢酸ビニルコポリマー、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、硫酸プロタミンなどの適切なポリマーキャリアを選択することによって達成することができる。薬物放出速度および作用継続時間はまた、ヒドロゲル、ポリ乳酸、ヒドロキシメチルセルロース、ポリメタクリル酸メチルおよびその他の上記に記載されたポリマーなどのポリマー物質の粒子（例えば、マイクロカプセル）に有効成分を取り込むことによって制御することができる。そのような方法は、リポソーム、マイクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子、ナノカプセルなどのようなコロイド薬物送達系を含む。投与経路に依存して、薬学的組成物は、保護コーティングが必要になる場合がある。
【００３８】
注射使用に好適な薬学的形態物は、必要に応じてその場でそれらを調製するための無菌の水溶性の溶液または懸濁物および無菌の粉末を含む。従って、この目的のための典型的なキャリアには、生体適合性の水性緩衝剤、エタノール、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど、およびそれらの混合物が含まれる。
【００３９】
成分（ａ）および成分（ｂ）は、処置される哺乳動物において同時に直接、それらの共同的な治療効果を必ずしも発揮しないということを考慮すると、本発明の第３の局面で提供される製造物はまた、別個ではあるが、隣接した形態で２つの成分を含有する医学的なキットまたはパッケージの形態にすることができる。従って、後者に関連して、成分（ａ）および成分（ｂ）のそれぞれを、他方の成分の投与経路とは異なる投与経路に好適な方法で配合することができる。例えば、それらの一方を経口用配合物または非経口用配合物の形態にすることができ、これに対して、もう一方を静脈内注射用のアンプル剤またはエアロゾル剤の形態にすることができる。
【００４０】
本発明の第３の局面である処置方法に従って、
・有効成分（ａ）および有効成分（ｂ）は、処置される哺乳動物（ヒトを含む）に、この分野で十分に知られている任意の手段によって、すなわち、経口的、鼻腔内、皮下、筋肉内、皮内、静脈内、関節内、非経口的に、またはカテーテル投与によって投与することができる。
・（ａ）および（ｂ）の混合調製物の有効量は、好ましくは抗レトロウイルス量であり、例えば、レトロウイルス酵素の阻害量である。より好ましくは、効果的な量は誘導体（ａ）のインテグラーゼ阻害量および薬物（ｂ）のレトロウイルス酵素阻害量である。さらにより好ましくは、前記のレトロウイルス酵素阻害剤薬物（ｂ）がプロテアーゼ阻害剤であるとき、その効果的な量はプロテアーゼ阻害量である。前記のレトロウイルス酵素阻害剤薬物（ｂ）が逆転写酵素阻害剤であるとき、その有効量は逆転写酵素阻害量である。前記のレトロウイルス酵素阻害剤薬物（ｂ）がピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジンの誘導体とは異なるインテグラーゼ阻害剤であるとき、その有効量はインテグラーゼ阻害量である。（ｂ）が、レトロウイルスの複製に関与する（グリコシル化または非グリコシル化）非酵素レトロウイルスタンパク質に対して効果的な薬物（例えば、ＨＩＶｇｐ１２０エンベロープ抗原に基づく免疫原）であるとき、（ｂ）はその通常の有効量で使用されるはずである。（ｂ）がＣＣＲ５阻害剤であるとき、（ｂ）はＣＣＲ５阻害量で使用されるはずである。
・成分（ａ）および成分（ｂ）を同時に投与することができるが、処置される身体においてそれらの機能的融合を達成するために、それらを、例えば、比較的短い期間内で（例えば、約２４時間以内に）別個または連続的に投与することもまた有益であり得る。
【００４１】
下記の実施例は、例示目的のためにだけ示され、本発明の範囲を限定するものとして決して解釈してはならない。
【００４２】
（実施例）
本発明の実施例を行うために、下記の化合物および実験手順を使用した。
【００４３】
ピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジン誘導体は、ＷＯ９９／２５７１８に開示される方法に従って得た。ＡＺＴは、Ｈｏｒｗｉｔｚ他によりＪ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．（１９６４）２９：２０７６〜８に以前に記載されるように合成された。チビラピンおよびロビリドはＪａｎｓｓｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（Ｂｅｅｒｓｅ、ベルギー）から得た。ネビラピンはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ（Ｒｉｄｇｅｆｉｅｌｄ、ＣＮ）から得た。リトナビルはＡｂｂｏｔｔ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）により提供された。分子量が５，０００のデキストラン硫酸をＳｉｇｍａから購入した。ネルフィナビルはＡｇｏｕｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から得た。ビシクラムＡＭＤ３１００はＡｍｏｒｍｅｄから得た。
【００４４】
ＭＴ−４細胞（Ｍｉｙｏｃｈｉ他によりＧａｎｎ．Ｍｏｎｏｇｒａｍ．（１９８２）２８：２１９〜２２８に開示される）およびＣ８１６６細胞（Ｓａｌａｈｕｄｄｉｎ他によりＶｉｒｏｌｏｇｙ（１９８３）１２９：５１〜６４に開示される）を、５％ＣＯ２を有する加湿雰囲気中で増殖させ、そして１０％熱不活化ウシ胎児血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、０．１％重炭酸ナトリウムおよび２０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンが補充されたＲＰＭＩ１６４０培地で維持した。
【００４５】
ＨＩＶ−１（ＩＩＩＢ）ウイルスは、Ｐｏｐｏｖｉｃ他によりＳｃｉｅｎｃｅ（１９８４）２２４：４９７〜５００に記載された。ＨＩＶ−１（ＮＤＫ）もまた、Ｓｐｉｒｅ他によりＧｅｎｅ（１９８９）８１：２７５〜２８４に記載された。ＨＩＶ−１（以降、ＮＬ４．３として示され、Ａｄａｃｈｉ他によりＪ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５９：２８４〜２９１に開示される）は、国立衛生研究所（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）から得られる分子クローンである。１３ＭＢ１（Ｌ１００Ｉ）株および３９ＮＭ１（Ｙ１８１Ｃ）株は、本発明者らの研究室において、それぞれ、チビラピンまたはロビリドの存在下でＭＴ−４細胞においてＨＩＶ−１（ＩＩＩＢ）およびＨＩＶ−１（ＮＤＫ）を連続的に継代した後に単離された。Ｌ１、Ｌ２、Ｌ４およびＬ６は、ジデオキシヌクレオシド（ｄｄＮ）アナログのジドブジン、ジダノシン、ザルシタビン、スタブジンおよびラミブジン、ならびに非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤のロビリドを用いた連続処置の前およびその後の一人の血清陽性患者に由来する臨床単離体である。Ｓｃｈｍｉｄｔ他（前掲）によれば、Ｌ６株は下記の変異を逆転写酵素に含有する：Ｖ７５Ｉ、Ｆ７７Ｌ、Ｋ１０３Ｎ、Ｆ１１６Ｙ、Ｑ１５１ＭおよびＭ１８４Ｖ。ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２（ＲＯＤ）（Ｂａｒｒｅ−Ｓｉｎｏｕｓｓｉ他によりＳｃｉｅｎｃｅ（１９８３）２２０：８６８〜８７１に開示される）およびＨＩＶ−２（ＥＨＯ）（Ｒｅｙ他によりＶｉｒｏｌｏｇｙ（１９８９）１７３：２５８〜２６７に開示される）の保存株を、Ｐａｕｗｅｌｓ他（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９８７）１６：１７１〜１８５）およびＳｃｈｏｌｓ他（Ｊ．ＡＩＤＳ（１９８９）２：１０〜１５）に従って、ＨＩＶ−１感染細胞株またはＨＩＶ−２感染細胞株の培養上清から得た。サル免疫不全症ウイルス［ＳＩＶ（ＭＡＣ２５１）］をＳｍｉｔｈ Ｋｌｉｎｅ（Ｒｉｘｅｎｓａｒｔ、ベルギー）から得て、保存株をＳＩＶ感染ＭＴ−４細胞の上清から調製した。
【００４６】
実施例１ 急性感染の細胞培養モデルにおけるＨＩＶまたはＳＩＶの複製に対するピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジン誘導体の阻害活性。
【００４７】
下記の式を有する一連の５−（４−置換フェニル）−５Ｈ−ピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジンにおける８個の異なる化合物（以降、Ａ〜Ｈとして示される）の阻害活性を、急性感染の細胞培養モデルにおけるＨＩＶまたはＳＩＶの複製を阻害するその能力について試験した：
【００４８】
【化７】
【００４９】
（式中、Ｘ、ＹおよびＺは下記の表１に定義される通りである）
【００５０】
【表１】
【００５１】
選択された化合物を、Ｐａｕｗｅｌｓ他によりＪ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９８８）２０：３０９〜３２１に記載される比色測定試験を使用して、ＨＩＶ−１（ＩＩＩＢ）株、２つのＨＩＶ−２株（ＲＯＤおよびＥＨＯ）、およびＳＩＶ（ＭＡＣ２５１）に対して、ＭＴ−４細胞におけるウイルス誘導による細胞変性の阻害について試験した。評価を感染後５日目に行った。
【００５２】
これらの化合物の細胞傷害性を、モック感染のＭＴ−４細胞またはＣ８１６６細胞の生存性を感染後５日目に測定することによって同時に決定した。少なくとも２つの別個の実験に対する平均値および標準偏差を含む抗ウイルス活性および細胞傷害性のデータを表２に示す。表において、
・ＥＣ５０は５０％有効濃度（すなわち、細胞培養においてウイルスの細胞変性効果を５０％阻害するために必要な濃度）を表す。
・ＣＣ５０は５０％細胞傷害濃度（すなわち、ＭＴ−４細胞の生存性を５０％低下させる濃度）を表す。
【００５３】
【表２】
【００５４】
誘導体Ｃ、Ｅ、ＧおよびＨは、ＨＩＶ−１（ＩＩＩＢ）の複製に対して活性であった。このシリーズの最も活性な化合物Ｈ、すなわち、５−（４−ニトロフェニル）−２，８−ジチオール−４，６−ジヒドロキシ−５Ｈ−ピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジン（すべての添付された図ではＶ−１６５として示される）は、５０％有効濃度（ＥＣ５０）が１１．４μＭと活性であった。Ｈはまた、５．５μＭ〜３０μＭの範囲のＥＣ５０値で、ＨＩＶ−１（ＮＤＫ、ＮＬ４．３およびＬ１）、ＨＩＶ−２（ＲＯＤおよびＥＨＯ）およびＳＩＶ（ＭＡＣ２５１）に対して活性であった。対照的に、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤のネビラピンは、比較として試験されたが、ＭＴ−４細胞において９８μＭで、ＨＩＶ−２（ＲＯＤおよびＥＨＯ）およびＳＩＶ（ＭＡＣ２５１）の複製に対して不活性であった。
【００５５】
実施例２ 薬剤耐性ＨＩＶ−１株に対する特定のピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジン誘導体の阻害活性。
【００５６】
化合物Ｇおよび化合物Ｈの抗ウイルス活性を、実施例１と同じ方法を使用して、様々な薬剤耐性ＨＩＶ−１株に対して試験した。結果を下記の表３に示す。表において、ＥＣ５０は実施例１と同じ意味を有し、ＥＣ５０の増大倍率は、野生型（ＷＴ）株に対する抗ウイルス活性との比較による。化合物Ｈは、ウイルス進入アンタゴニストのデキストラン硫酸またはビシクラムに対して耐性であるＨＩＶ−１株に対して活性であった。非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩ）のチビラピンまたはロビリドに対する耐性のための選択されたＨＩＶ−１株は両方の化合物によって阻害された。
【００５７】
【表３】
【００５８】
さらに、本発明者らは、親株Ｌ１が、ＩＩＩＢよりも、化合物Ｈに対して大きい感受性（ＥＣ５０：３．７±１．８μＭ）を有したことを考慮して、３つの多剤耐性（ＭｄｄＮＲ）ＨＩＶ−１株（Ｌ２、Ｌ４およびＬ６）に対する化合物Ｈの阻害能が最大で１／３に低下していることを認めた。
【００５９】
実施例３ 様々なＨＩＶ−１阻害剤と５−（４−ニトロフェニル）−２，８−ジチオール−４，６−ジヒドロキシ−５Ｈ−ピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジンとの混合阻害効果。
【００６０】
化合物Ｈの抗ウイルス効果を、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤のジドブジン、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤のネビラピン、およびプロテアーゼ阻害剤のネルフィナビルと組み合わせて試験した。
【００６１】
ＨＩＶ−１により誘導される細胞変性効果に対する混合阻害効果を、Ｅｌｉｏｎ他によりＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９５４）２０８：４７７〜４８８に、そしてＢａｂａ他によりＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．（１９８４）２５：５１５〜５１７に以前に記載されるように、アイソボログラム法によって評価した。
【００６２】
前記に定義されるようなＥＣ５０を、阻害濃度分率（以降、ＦＩＣとして示される）を計算するために使用した。組み合わせられた化合物のＦＩＣに対応する最小ＦＩＣ指数（例えば、ＦＩＣｘ＋ＦＩＣｙ）が１．０に等しいとき、その組合せは付加的であると言われる；１．０〜０．５の間であるとき、その組合せは定義により亜相乗的であると言われる；０．５よりも小さいとき、その組合せは、定義により、相乗的であると言われる。最小ＦＩＣ指数が１．０〜２．０の間であるとき、その組合せは、亜アンタゴニスト的であると言われ、２．０を越えるときには、その組合せはアンタゴニスト的であると定義される。
【００６３】
これらの試験の結果は、直線がそれぞれ１．０および０．５に等しいＦＩＣを表す図２〜図４に示されるアイソボログラムで報告される。これらの図は、
【００６４】
【数１】
【００６５】
の合算値が０．５〜１の間に含まれ、そして
【００６６】
【数２】
【００６７】
の合算値が０．５未満であったことを示している。
実施例４ 複製サイクルにおける５−（４−ニトロフェニル）−２，８−ジチオール−４，６−ジヒドロキシ−５Ｈ−ピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジンの介入時期。
【００６８】
添加時期実験を、複製サイクルのどの段階が化合物Ｈによって阻害されるかを調べるために行った。簡単に記載すると、この実験により、抗ＨＩＶ化合物の添加が、ウイルス複製サイクルにおいて、その抗ウイルス活性を失う前に、どのくらい長く延ばされ得るかが決定される。ＭＴ−４細胞に、ウイルス複製のすべての段階を同調させるために０．５の感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ．）でＨＩＶ−１（ＩＩＩＢ）を感染させ、そして様々な抗ウイルス試験化合物を、感染後の（０時間から２６時間までに及ぶ）種々の時間で添加した。ウイルスのｐ２４抗原の産生を（ＨＩＶ−１ｐ２４コアプロフィルＥＬＩＳＡ（ＤｕＰｏｎｔ、Ｄｒｅｉｅｉｃｈ、ドイツ）を使用して）感染後３１時間で測定した。これは、ｐｇ／ｍｌでｐ２４Ａｇ含有量のｌｏｇ１０として表される。作用モードが知られている参照化合物がこの実験には含められた。デキストラン硫酸（ポリアニオン）は、ウイルスが細胞に結合することを妨害する。ヌクレオシドアナログのＡＺＴは逆転写プロセスを阻害する。リトナビルはタンパク質分解的切断阻害剤である。これらの参照化合物（デキストラン硫酸、ＡＺＴおよびリトナビル）は、０．０１のｍ．ｏ．ｉ．で測定されたＥＣ５０値の１００倍に対応する正規化された濃度で添加された。化合物Ｈは２５０μＭで添加された。この実験の結果を示す図１には、下記の記号が使用された：
【００６９】
【数３】
【００７０】
図１により、化合物Ｈの添加は、ウイルス感染後６時間延ばすことができる。このことは、組込み（ＤＮＡ鎖転移）のときにおける相互作用を示唆している。なぜなら、類似する添加時期実験で試験された知られているジケト酸のインテグラーゼ阻害剤は、感染後６時間以上経って添加されたときにその活性を失ったからである。しかし、実験は、ウイルス複製時に標的化される最後の段階を明らかにするだけであるので、この実験からは、化合物Ｈが逆転写酵素とも相互作用することを除外することができない。
【００７１】
実施例５ ５−（４−ニトロフェニル）−２，８−ジチオール−４，６−ジヒドロキシ−５Ｈ−ピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジンによるレンチウイルスベクター媒介形質導入の阻害。
【００７２】
阻害剤がＨＩＶの逆転写段階および／または組込み段階を妨害することを確認するために、２９３Ｔ細胞の１回の感染を、ＶＳＶ−Ｇエンベロープで偽タイプ化され、レポーター遺伝子としてルシフェラーゼを有するＨＩＶ−１由来のベクターを使用して、Ｎａｌｄｉｎｉ他によりＳｃｉｅｎｃｅ（１９９６）２７２：２６３〜７に記載される方法に従って行った。具体的には、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のエンベロープで偽タイプ化されたＨＩＶ−１由来のベクター粒子を、パッケージングプラスミドのｐＣＭＶΔＲ８．２またはｐＣＭＶΔＲ８．９１、水疱性口内炎ウイルスのエンベロープをコードするプラスミド（ｐＭＤＧ）、および２つの長末端反復（ＬＴＲ）が隣接するレポーター遺伝子をコードするプラスミド（ｐＨＲ’−ＣＭＶルシフェラーゼ）の３つのプラスミドで２９３Ｔ細胞をトランスフェクションすることによって作製した。すべてのプラスミドはＥｕｒｏｐｅａｎ Ｇｅｎｅ Ｖｅｃｔｏｒ Ｄａｔａｂａｓｅ ａｎｄ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙから得ることができ、そしてＧｅｎｅｔｈｏｎ ＩＩＩ、ＣＮＲＳ ＵＲＡ、１９２３、Ｅｖｒｙ（フランス）によって、ジュネーブ大学（遺伝学および微生物学学部）（スイス）によって提供された。１０ｃｍディッシュの２９３Ｔ細胞をトランスフェクションするために、３つのプラスミドの７００μｌ混合物を１５０ｍＭのＮａＣｌにおいて作製した（２０μｇのベクタープラスミド、１０μｇのパッケージング構築物および５μｇのエンベローププラスミド）。７００μｌのこのＤＮＡ溶液に、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能）（１５０ｍＭのＮａＣｌにおける１０ｍＭ保存溶液の１１０μｌ）をゆっくり添加した。室温で１５分後、ＤＮＡ−ＰＥＩ複合体を、１％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）が補充されたＤＭＥＭ培地中の２９３Ｔ細胞に滴下して加えた。一晩インキュベーションした後、培地を、１０％ＦＣＳを含有する培地と交換した。上清をトランスフェクション後の２日目〜５日目に集めた。ベクター粒子を、スイング式バケットローター（ＳＷ２７、Ｂｅｃｋｍａｎ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で２５，０００ｒｐｍにおいて４℃で２時間の超遠心分離によって沈降させた。ペレットをＰＢＳに再溶解して、１００倍濃度液を作製した。種々のウイルス保存株をｐ２４抗原含有量に基づいて正規化した（ＨＩＶ−１ｐ２４コアプロフィルＥＬＩＳＡ、これはＤｕＰｏｎｔ（Ｄｒｅｉｅｉｃｈ、ドイツ）から得られる）。阻害剤を９６ウエルプレートにおいて評価した。各ウエルについて、２，０００ｐｇのベクターおよび２μｇ／ｍｌのポリブレンを、１００μｌのＤＭＥＭ／１％ＦＣＳで増殖させた２９３Ｔ細胞のコンフルエントな単層に加えた。阻害剤を種々の濃度でインキュベーションした。トランスフェクションした４８時間後に細胞を溶解して、ルシフェラーゼ活性を、ルシフェラーゼアッセイシステムＴＭ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｅｎｅｌｕｘ、Ｌｅｉｄｅｎ、オランダ）を使用してＬｕｍｉｃｏｕｎｔＴＭ（Ｐａｃｋａｒｄ、Ｍｅｒｉｄｅｎ、Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ）で測定した。細胞数に対する正規化を、ＢＣＡＴＭタンパク質アッセイ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）を使用してタンパク質濃度を測定することによって行った。
【００７３】
このアッセイにおいて、ルシフェラーゼ活性の低下は、初期のＨＩＶ複製段階の阻害に対する尺度である。形質導入の阻害が、１７μＭの平均ＥＣ５０値で、化合物Ｈで得られた。コントロールの逆転写酵素阻害剤であるＡＺＴは、レンチウイルスの形質導入を４９ｎＭのＥＣ５０値で阻害した。ｇｐ１２０がウイルス粒子に存在しないことにより、ＨＩＶタイプのウイルス進入は標的として除外される。化合物Ｈはまた、（Ｚｕｆｆｅｒｅｙ他によりＮａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９７）１５：８７１〜５に記載されるなどの）副因子のｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｒおよびｖｐｕを欠いている次世代ベクターによる形質導入を同じ程度に阻害した。従って、これにより、抗ウイルス機構におけるこれらのＨＩＶタンパク質に対する主要な役割が除外される。これらのアッセイにより、ＨＩＶ−１の逆転写および／または組込みが、細胞培養における本発明の化合物の抗ウイルス効果に対する標的として確認される。
【００７４】
実施例６ 特定のピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジン誘導体によるＨＩＶ逆転写酵素活性の阻害。
【００７５】
ＨＩＶ−１逆転写酵素の酵素活性の阻害を、Ｄｅｂｙｓｅｒ他によりＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９１）８８：１４５１〜５に記載されるように、ビリオンに由来する酵素を得て、逆転写酵素活性についてアッセイするための手順を使用しながら、本発明のいくつかの化合物および参照化合物について評価した。ポリ（ｒＣ）．オリゴ（ｄＧ）およびポリ（ｒＡ）．オリゴ（ｄＴ）をテンプレートプライマーとして使用し、そして８−［３Ｈ］−ｄＧＴＰおよび［３Ｈ］−ｄＴＴＰを放射能標識された基質として使用した。反応混合物における８−［３Ｈ］−ｄＧＴＰおよび［３Ｈ］−ｄＴＴＰの最終濃度は２．５μＭであった。組換えＨＩＶ−１ＲＴ（ＨＸＢ２）を、Ｊｏｎｃｋｈｅｅｒｅ他によりＪ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９９６）６１：１１３〜１２５に記載されるようにして得た。これらの実験の結果を下記の表４に示す。表において、ＩＣ５０は５０％阻害濃度（すなわち、テンプレートプライマーとしてポリ（Ｃ）．オリゴ（ｄＧ）またはポリ（Ａ）．オリゴ（ｄＴ）を使用したときに組換えＨＩＶ−１ＲＴの活性を５０％阻害するために必要な濃度）である。
【００７６】
【表４】
【００７７】
実施例７ 特定のピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジン誘導体によるＨＩＶインテグラーゼ活性の阻害。
【００７８】
３’−プロセシング反応、ＤＮＡ鎖転移反応および全体的な組込み反応の阻害を、下記の方法論を使用して、Ｃｈｅｒｅｐａｎｏｖ他によりＭｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（１９９７）５２：７７１〜７８０に記載されるように、オリゴヌクレオチドに基づくアッセイにおいて測定した。
【００７９】
最初に、組換えＨｉｓ標識ＨＩＶ−１インテグラーゼを、Ｃｈｅｒｅｐａｎｏｖ他（前掲）により記載されるように、ＨＩＶ−１ＩＮ（ＨＴＬＶ ＩＩＩ株）をコードするプラスミドｐＲＰ１０１２（Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）から入手可能）からＥ．ｃｏｌｉ ＰＣ１（ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＬｙｓＳ）ΔｅｎｄＡ：：ＴｃＲ）で産生させ、そしてＮｉ−ニトリロ三酢酸カラム（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ）、次いでＨｉｇｈＴｒａｐ−ヘパリンカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で精製した。
【００８０】
下記の高速液体クロマトグラフィー精製されたデオキシオリゴヌクレオチドをＡｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈから購入した：
ＩＮＴ１、５’−ＴＧＴＧＧＡＡＡＡＴＣＴＣＴＡＧＣＡＧＴ；
ＩＮＴ２、５’−ＡＣＴＧＣＴＡＧＡＧＡＴＴＴＴＣＣＡＣＡ；
Ｔ３５、５’−ＡＣＴＡＴＡＣＣＡＧＡＣＡＡＴＡＡＴＴＧＴＣＴＧＧＣＣＴＧＴＡＣＣＧＴ；
ＳＫ７０、５’−ＡＣＧＧＴＡＣＡＧＧＣＣＡＧＡＣＡＡＴＴＡＴＴＧＴＣＴＧＧＴＡＴＡＧＴ。
【００８１】
オリゴヌクレオチドのＩＮＴ１およびＩＮＴ２はＨＩＶ−１ＬＴＲのＵ５末端に対応する。オリゴヌクレオチドＩＮＴ１を２０％変性ポリアクリルアミド／尿素ゲルで精製し、そしてポリヌクレオチドＴ４キナーゼおよび
【００８２】
【数４】
【００８３】
を使用して５’末端を標識した。インテグラーゼ反応に対するＤＮＡ基質を、ＩＮＴ１およびＩＮＴ２をアニーリングすることによって作製した。１００ｍＭのＮａＣｌが存在する２つのオリゴヌクレオチドの等モル混合物を９５℃で短時間加熱し、そして室温にゆっくり冷却した。同様に、ＳＫ７０およびＴ３５をアニーリングすることにより、標的ＤＮＡ分子として使用される３５ｂｐのｄｓＤＮＡ分子を得た（Ｔ３５／ＳＫ７０）。
【００８４】
３’−プロセシングアッセイ用の最終的な反応混合物は、２０ｍＭの４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（以降、ＨＥＰＥＳとして示される）（ｐＨ７．５）、５ｍＭのジチオスレイトール、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、７５ｍＭのＮａＣｌ、１５％（容量／容量）のポリエチレングリコール（分子量８，０００）、３０ｎＭのオリゴヌクレオチド基質、および２３０ｎＭのＨｉｓ標識インテグラーゼを１０μｌの容量に含有した。反応を酵素の添加によって開始させた。阻害剤を反応成分と短時間インキュベーションし、その後、インテグラーゼを添加した。反応を３７℃で７分間進行させ、そしてホルムアミド負荷緩衝液（９５％ホルムアミド、３０ｍＭエチレンジアミン四酢酸、０．１％キシレンシアノール、０．１％ブロモフェノールブルー、０．１％ジラウリル硫酸ナトリウムＳＤＳ）の添加によって停止させた。全体的な組込みアッセイでは、この反応を６０分間進行させ、その後、ホルムアミド色素を添加した。図５は、化合物Ｈの非存在下（レーン１）または減少量の化合物Ｈの存在下（レーン２〜７）で行われた３’−プロセシング反応の結果を表す。阻害剤の濃度は、２５μＭ（レーン２）、５μＭ（レーン３）、１μＭ（レーン４）、０．２μＭ（レーン５）、０．０４μＭ（レーン６）および０．００８μＭ（レーン７）であった。
【００８５】
鎖の転移は下記の方法でアッセイされた：３０ｎＭのＤＮＡ基質を、切断反応を行わせるために、２３０ｎＭのインテグラーゼと３７℃で５分間プレインキュベーションした。反応混合物の組成は３’−プロセシングアッセイにおける組成と同一であった。５分後に、阻害剤とともに、または阻害剤を伴うことなく、１μｌの過剰な標的ＤＮＡ（２５０ｎＭの最終濃度）を添加して、サンプルを３７℃で１時間インキュベーションした。この過剰な標的ＤＮＡにより、ウイルス基質に対するインテグラーゼのさらなる結合が競合的に阻止される。
【００８６】
反応をホルムアミド色素の添加によって停止させ、生成物を１５％変性ポリアクリルアミド／尿素ゲルで分離した。オートラジオグラフィーを、湿ったゲルをＸ線フィルム（ＣＵＲＩＸ ＲＰ１、Ａｇｆａ−Ｇｅｖａｅｒｔ（ベルギー）から入手可能）に感光させることによって行った。結果の定量を、Ｐｈｏｓｐｈｏｒｌｍａｇｅｒ装置（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用して行った。
【００８７】
これらの実験の結果を下記に表５に示す。上記で定義されるようなＩＣ５０（μＭ）値が得られる。
【００８８】
【表５】
【００８９】
化合物Ｃ、Ｅ、ＧおよびＨが３−プロセシング反応および全体的な組込み反応を阻害した。化合物Ｈはまた、ＤＮＡ鎖転移反応に対する強い阻害効果を有している。細胞培養において認められた抗レトロウイルス活性と、インテグラーゼアッセイにおける阻害活性との強い相関が認められた。最も良い相関が、細胞培養における阻害能と、鎖転移アッセイにおける阻害能との間で得られた（ｒ２＝０．９９８）。
【００９０】
実施例８ ５−（４−ニトロフェニル）−２，８−ジチオール−４，６−ジヒドロキシ−５Ｈ−ピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジンの速度論的切断アッセイ。
【００９１】
２０ｂｐのオリゴヌクレオチド（３０ｎＭ）を２３０ｎＭのインテグラーゼと３分間プレインキュベーションすることにより、初期の安定な複合体（ＩＳＣ）が形成された。反応混合物の組成は実施例７の３’−プロセシング反応の組成と同一であった。５，０００の分子量を有するデキストラン硫酸が０．３μＭの最終濃度で添加されたとき、オリゴヌクレオチドに対するインテグラーゼのさらなる結合が阻止された。しばらくして、５μｌアリコートを採取し、そして５μｌのホルムアミド負荷緩衝液（上記と同じ組成を有する）を使用して、反応を停止させた。切断産物へのＩＳＣの変換に対する速度定数を、式Ａ・Ｂｅ−ｋｔを使用して計算することができる。３’−プロセシングに対する化合物Ｈの阻害効果を調べるために、本発明者らは、（プレインキュベーション後にデキストラン硫酸と一緒に添加された）５０μＭの化合物の存在下で同じ実験を繰り返して、速度定数を比較した。化合物Ｈの非存在下では、速度定数は０．１５２±０．０３８ｍｉｎ−１と計算されたが、その存在下では０．１４７±０．０２５ｍｉｎ−１と計算された。この極めて類似する値により、化合物Ｈが３’−プロセシングの触媒作用に直接影響を及ぼしていることが除かれる。
【００９２】
この実験のさらなる結果が、以下を示す図６に示される。
【００９３】
【数５】
【００９４】
実施例９ ５−（４−ニトロフェニル）−２，８−ジチオール−４，６−ジヒドロキシ−５Ｈ−ピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジンのＨＩＶ−１インテグラーゼ結合アッセイ。
【００９５】
結合実験を、ＢＩＡｃｏｒｅ２０００（Ｂｉａｃｏｒｅ）およびストレプトアビジンが予め固定化されているセンサーチップＳＡＴＭに基づくバイオセンサー技術を使用して行った。結合実験を製造者の手順に従って３７℃で行った。結合緩衝液Ｂ（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５）は、５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２および５ｍＭのＤＴＴを含有した。最初に、３’−ビオチン化オリゴヌクレオチドの５’−ＡＣＴＧＣＴＡＧＡＧＡＴＴＴＴＣＣＡＣＡＣＴＧＡＣＴＡＡＡＡＧＧＧＴＣＡＡＡＡ−３’をセンサーチップに結合させた。続いて、相補的な３５ｍｅｒの５’−ＧＡＣＣＣＴＴＴＴＡＧＴＣＡＧＴＧＴＧＧＡＡＡＡＴＣＴＣＴＡＧＣＡＧＴ−３’を捕捉されたオリゴヌクレオチドにハイブリダイゼーションさせて、インテグラーゼの認識配列を自由端で生じさせた。ＨＩＶ−１インテグラーゼ（３３μＭ溶液の１００μｌ）を希釈緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ．ＨＣｌ（ｐＨ７．５）／７５０ｍＭのＮａＣｌ／１０％グリセロール／１ｍＭのβ−メルカプトエタノール）で１０倍希釈し、そして緩衝液Ｂでさらに１０倍希釈して、１０μｌ／分の流速で、３３０ｎＭの最終濃度で注入し、最初にブランク流路に通し、次いで特異的なオリゴヌクレオチドを有する流路に通した。ブランク流路における特異的な吸収を差し引いた。インテグラーゼを９３μＭの化合物Ｈとプレインキュベーションした後では、ＤＮＡに対するインテグラーゼの結合は完全に破壊されていた。
【００９６】
実施例１０ ５−（４−ニトロフェニル）−２，８−ジチオール−４，６−ジヒドロキシ−５Ｈ−ピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジンは二本鎖ＤＮＡ内にインターカレーションしない。
【００９７】
インターカレーターは、２つの連続した塩基対の間に進入することによって二重らせんを安定化させることが知られているので、本発明者らは、化合物Ｈが二本鎖ＤＮＡにインターカレーションし得るかどうかを確認した。この安定化は、（二本鎖の５０％が２つの一本鎖に解離する温度として定義される）二本鎖の融解温度の上昇によって反映される。本発明者らは、それぞれのオリゴデオキシヌクレオチドについて１μＭの固定された濃度でのインビトロ組込みアッセイから得られる二本鎖ＤＮＡ（ＩＮＴ１−ＩＮＴ２）を使用した。連続希釈した化合物Ｈ（２５μＭ、５μＭ、１μＭ、０．２μＭ、０．０４μＭおよび０μＭ）を、ＩＮＴ１−ＩＮＴ２を含有する種々のキュベットに加え、そして吸光度を２６０ｎｍでモニターしながら、その温度を最初に１５℃から８０℃まで徐々に上昇させ（０．２℃／分）、その後、同じ速度で１５℃に低下させた。融解曲線は、Ｖａｒｉａｎ ＣＡＲＹ３００バイオ分光光度計を用いて決定された。キュベットは、キュベットホルダーを通って循環する水によって温度調節され、そして溶液の温度が、キュベット内に直接浸けられたサーミスターを用いて測定された。温度制御およびデータ取得はＣｏｍｐａｑデスクトップコンピューターを用いて自動的に行われた。サンプルは、０．２℃／分の速度で、最初に加熱され、次いで冷却された。融解曲線は、Ｔｍを示す変曲点を有する一次導関数を採用して評価された。変動性は０．５℃未満であった。
【００９８】
このようにして測定された融点は、様々な濃度の化合物Ｈの存在下で影響を受けず（５９℃で）一定であった。このことは、化合物Ｈがインターカレーションにより二本鎖ＤＮＡを安定化させないことを明瞭に示している。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明で使用されたピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジン誘導体に対する添加時間実験におけるウイルス産生の結果を、他のレトロウイルス剤と比較して表す。
【図２】図２は、ジドブジンおよび本発明で使用されたピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジン誘導体の阻害濃度分率が、ＭＴ−４細胞において誘導されるＨＩＶ−１の細胞変性効果に対するこれらの化合物の混合阻害作用においてプロットされるアイソボログラムを表す。
【図３】図３は、ネルフィナビルおよび本発明で使用されたピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジン誘導体の阻害濃度分率が、ＭＴ−４細胞において誘導されるＨＩＶ−１の細胞変性効果に対するこれらの化合物の混合阻害作用においてプロットされるアイソボログラムを表す。
【図４】図４は、ネビラピンおよび本発明で使用されたピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジン誘導体の阻害濃度分率が、ＭＴ−４細胞において誘導されるＨＩＶ−１の細胞変性効果に対するこれらの化合物の混合阻害作用においてプロットされるアイソボログラムを表す。
【図５】図５は、本発明で使用されたピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジン誘導体によるＨＩＶ−１インテグラーゼ活性の阻害を示す。
【図６】図６は、本発明で使用されたピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジン誘導体の非存在下または存在下における速度論的切断反応の結果を示す。
（発明の分野）
本発明は、哺乳動物におけるレトロウイルス感染症を処置するための方法およびそのような方法を行うための薬学的組成物に関する。より詳細には、本発明は、哺乳動物におけるレトロウイルス感染症を処置するための医薬品を製造するための、特定のピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジン誘導体の使用に関する。別の実施形態において、本発明は、１つ以上の細胞タンパク質またはレトロウイルスタンパク質を標的とする１つ以上の薬物（例えば、レトロウイルス酵素阻害剤）と組み合わせられたこれらの誘導体の使用に関する。
【０００２】
（発明の背景）
１型ヒト免疫不全症ウイルス（以降、ＨＩＶ−１として示される）の複製は、Ｖａｎｄａｍｍｅ他によりＡｎｔｉｖｉｒａｌ Ｃｈｅｍ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．（１９９８）９：１８７〜２０３に概説されるように、多数のウイルス標的を標的とする強力な抗ウイルス薬を組み合わせることによって感染患者において劇的に低下させることができる。ＨＩＶ感染患者の処置に対して正式に承認されている薬物は、逆転写酵素（ＲＴ）阻害剤（ヌクレオシド系および非ヌクレオシド系）またはプロテアーゼ阻害剤のクラスに属する。多剤混合療法は、ウイルス量を、最も高感度な試験の検出限界よりも低く低下させることができる。それにも関わらず、Ｐｅｒｅｌｓｏｎ他、Ｎａｔｕｒｅ（１９９７）３８７：１２３〜１２４によれば、低いレベルの継続した複製がおそらくは聖域部位で生じ、これにより薬物耐性株の出現をもたらすことが示されている。さらに、Ｓｃｈｍｉｔ他、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．（１９９６）１７４：９６２〜９６８によれば、ＨＩＶは、すべてではないが、ほとんどの現在承認されている抗ウイルス薬に対する耐性を発達させることができる。
【０００３】
ＨＩＶ−１の組込みに必要とされる唯一の酵素は、ＢｒｏｗｎによりＲｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ（１９９７）（Ｃｏｆｆｉｎ、ＨｕｇｈｅｓおよびＶａｒｍｕｓ編（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、米国）、１６１頁〜２０３頁）に概説されるように、ｐｏｌ遺伝子の３’末端にコードされる３２ｋＤａのタンパク質であるインテグラーゼ（以降、ＩＮとして示される）である。この酵素は、ビリオンが成熟化するときにｇａｇ−ｐｏｌ前駆体のプロテアーゼ媒介の切断によって産生される。インテグラーゼは、ウイルスｃＤＮＡの長末端反復（以降、ＬＴＲとして示される）エレメント内の特異的な配列を認識をする。ＬＴＲの末端の１５ｂｐが、部位特異的な切断および組込みのためには必要かつ十分である。切断部位のすぐ上流に位置する高度に保存されたジヌクレオチドＣＡが酵素活性には重要である。３’末端プロセシングと名付けられた組込み反応の第１段階において、２つのヌクレオチドがそれぞれの３’末端から除かれ、新しい３’−ヒドロキシル末端（ＣＡ−３’−ＯＨ）が生じる。この反応は、Ｍｉｌｌｅｒ他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９７）７１：５３８２〜５３９０によれば、細胞質において、前組込み複合体（以降、ＰＩＣとして示される）と呼ばれる大きいウイルス核タンパク質複合体内で生じる。核に進入した後、プロセシングされたウイルス二重鎖ＤＮＡが宿主の標的ＤＮＡに結合する。この結合反応には、標的の宿主ＤＮＡの対形成する５ｂｐの付着性切断、およびプロセシングされたＣＡ−３’−ＯＨのウイルスＤＮＡ末端を標的ＤＮＡの５’−Ｏリン酸エステル末端に連結することが含まれる。残存するギャップの修復が、これは現時点では理解されていないが、宿主細胞のＤＮＡ修復酵素によっておそらくは達成される。しかし、Ｃｈｏｗ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９２）２５５：７２３〜７２６によれば、レトロウイルスの酵素もまた関与することが推定されていた。
【０００４】
部分的なタンパク質分解の実験に基づいて、ＨＩＶ−ＩＮは３つの機能的ドメインに分割することができる。Ｎ末端のドメイン（残基１〜５０を含む）は、ＨＨＣＣ「ジンクフィンガー」様配列を特徴とする（すなわち、Ｚｎ２＋と結合する２つのヒスチジンおよび２つのシステインを含有する）が、その正確な機能は不明のままである。中央のコアドメイン（残基５０〜２１２を含む）は、インテグラーゼスーパーファミリーおよびポリヌクレオチドトランスフェラーゼにおいて高度に保存されており、そして３’−プロセシング活性およびＤＮＡ鎖転移活性の両方に対する触媒作用ドメインを表す３つのアミノ酸残基（Ａｓｐ６４、Ａｓｐ１１６およびＧｌｕ１５２）を特徴とする。この中央のコアドメインは単独で、ＤＮＡ鎖転移反応の明かな逆（いわゆる分解反応）をインビトロで行うことができる。しかし、アミノ末端およびカルボキシ末端の両方のドメインが３’−プロセシングおよび鎖転移の触媒作用には必要である。触媒作用コアドメイン内における一アミノ酸の置換体（Ｆ１８５Ｋ）は、Ｄｙｄａ他によりＳｃｉｅｎｃｅ（１９９４）２６６：１９８１〜１９８６に概説されるように、コアドメインを結晶化させることができ、そしてその三次元（以降、３Ｄとして示される）構造を解明することができる可溶性タンパク質をもたらす。Ｃ末端のドメイン（残基２１２〜２８８を含む）は非特異的なＤＮＡ結合に関与している。短縮化されたＣ末端ドメインの核磁気共鳴（以降、ＮＭＲとして示される）による構造が決定されている。ＩＮタンパク質をこれらの異なるドメインにおいて変異させた相補性研究により、正確な化学量論は不明のままであるが、ＩＮの活性形態はオリゴマーであることが示唆されている。
【０００５】
高処理能のマイクロタイタープレートアッセイを確立し、そしてＨＩＶ−１ＩＮの触媒作用ドメインの３Ｄ構造を解明することによって、ケミカルライブラリーをスクリーニングするか、または構造に基づいて設計することによるＩＮ阻害剤の開発が促進させられた。かなり面倒なＰＩＣアッセイにおけるＩＮ阻害剤の評価が（例えば、Ｆａｒｎｅｔ他によりＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９６）９３：９７４２〜９７４７に）議論されているが、ＩＮの阻害は典型的には、プロセシング反応および結合反応の両方をインビトロで評価するためにＬＴＲ模倣体を使用するオリゴヌクレオチドに基づくアッセイにおいて、すなわち、Ｓｈｅｒｍａｎ他によりＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９０）８７：５１１９〜５１２３に、そしてＢｕｓｈｍａｎ他によりＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９１）８８：１３３９〜１３４３に開示されるようなアッセイにおいて評価される。種々のクラスのＨＩＶ−１ＩＮ阻害剤が、Ｙ．Ｐｏｍｍｉｅｒ他によりＡｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０００）４７：１３９〜１４８に概説されるように報告されており、これらには、（ｉ）モノヌクレオチド、ジヌクレオチド、ｉｓｏ−ヌクレオチドおよびより長いオリゴヌクレオチドならびにそれらのアナログ、（ｉｉ）ヒドロキシル化芳香族化合物、（ｉｉｉ）ＤＮＡインターカーション剤（リガンド）、そして（ｉｖ）ポリペプチドおよび抗体が含まれる。しかし、これらの化合物はほとんどが細胞培養において抗ウイルス活性を示さなかった。細胞培養において抗ウイルス活性を示したＩＮ阻害剤のほとんどについて、組込み段階が標的化されていることは明確には明らかにされなかった。Ｈａｚｕｄａ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０００）２８７：６４６〜６５０によれば、これまでに報告されている真のＩＮ選択的阻害剤はジケト酸誘導体だけである。
【０００６】
３’，５−ジアジド−２’，３’−ジデオキシウリジン５’−モノホスファート（５−Ｎ３−ＡＺＵＭＰとして示される）などのヌクレオチドは、おそらくはヌクレオチド結合部位との相互作用によって、より正確にはＨＩＶ−１コアドメインのα−４へリックスに結合することによってＩＮの酵素活性を妨害する。様々なヌクレオチドアナログの構造−活性研究が報告されている。阻害のために必要とされる濃度（ＩＣ５０＝１５０μＭ）が高かったが、Ｆｕｒｍａｎ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８６）８３：８３３３〜７によれば、１ｍＭまでの濃度の５−Ｎ３−ＡＺＵＭＰが細胞内に蓄積し得るので、ＩＮ阻害がＡＺＴの抗ウイルス効果に寄与し得ることを除外することができない。ジヌクレオチドもまた、５’−Ｏリン酸化がないときでさえ、ＨＩＶ―１ＩＮの強力な阻害剤として報告されていたが、Ｍａｚｕｍｄｅｒ他によりＭｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（１９９７）５１：５６７〜７５に報告されるように、どれも抗ウイルス活性を示さなかった。
【０００７】
四鎖化グアノシン四量体構造を形成するオリゴヌクレオチドは、（Ｏｊｗａｎｇ他、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．（１９９５）３９：２４２６〜２４３５によれば）細胞培養におけるＨＩＶ複製の強力な阻害剤である。しかし、Ｇ四量体はナノモル範囲でＨＩＶのＩＮ活性を阻害するが、細胞培養におけるその抗ウイルス活性は、ＨＩＶのＩＮ活性の阻害ではなく、ウイルス進入の阻害のためであることが、薬剤耐性株の選択および配列決定によって（Ｃｈｅｒｅｐａｎｏｖ他によりＭｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（１９９７）５２：７７１〜７８０に）明瞭に示されている。
【０００８】
多くのポリヒドロキシル化芳香族化合物（フラボン類、チルホスチン類、リグナン類、アントラキノン類およびビスカテコール類を含む；これらはすべて、芳香族環における２つのビシナルヒドロキシル基を特徴とする）がインビトロにおけるＨＩＶ−１ＩＮの阻害剤として報告されている。３つの考えられる作用機構が提案されていた（Ｐｏｍｍｉｅｒ他（前掲）を参照のこと）。カテコール類は、活性部位におけるリン酸転移反応に必要な金属イオンの配位を妨害し得る。カテコール類のインビボでの酸化は反応性のキノン化学種を生じさせることができ、またはヒドロキシル基が、酵素と相互反応するための水素結合ドナーとして機能し得る。オルト位にヒドロキシル基を含まないが、ＩＮ活性を阻害するヒドロキシル化芳香族化合物（クルクミン、クーママイシンおよびビスクマリン類など）もまた報告されている。分子モデリングを使用して、様々なファルマコホアが、Ｎｅａｍａｔｉ他、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（１９９７）５２：１０４１〜１０５５によれば、新規なリード化合物の発見をもたらし得る知られているヒドロキシル化芳香族阻害剤において同定されている。しかし、細胞培養におけるカテコールタイプの阻害剤の抗ウイルス効果は、その固有的な細胞毒性により損なわれている。
【０００９】
ジカフェオイルキナ酸誘導体およびＬ−チコリ酸（Ｌ−ＣＡ）誘導体がインビトロにおけるＨＩＶ−１のＩＮおよび細胞培養におけるＨＩＶ−１の複製を阻害することが、最近、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ他によりＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９６）９３：６３２６〜６３３１に報告された。Ｌ−チコリ酸に対して耐性のＨＩＶ−１株が選択され、変異がＩＮ遺伝子にマッピングされた（Ｇ１４０Ｓ）。本発明者らは、最近、Ｌ−ＣＡに対して耐性であり、かつＩＮ遺伝子の代わりにｇｐ１２０に変異を含む複数のＨＩＶ−１株を選択した。さらに、Ｇ１４０Ｓ変異を有する組換えＩＮは、Ｐｌｕｙｍｅｒｓ他（２０００）によれば、野生型酵素と同程度にＬ−ＣＡによって阻害された。
【００１０】
ジケト酸誘導体は、Ｈａｚｕｄａ他（前掲）により報告されるように、ＤＮＡ鎖転移段階を特異的に阻害することによってＨＩＶ−１の複製をマイクロモル濃度で阻害する。これらの化合物の存在下で選択された耐性のウイルス株はＩＮ遺伝子に様々な変異を有した。これらの変異は、ＩＮに導入されたときに、これらの薬剤に対して部分的な耐性をもたらした。
【００１１】
多くのＤＮＡ結合剤もまた、おそらくは酵素のＤＮＡ結合ドメインとの非特異的な相互作用のためにＨＩＶ−１ＩＮを阻害することが見出されていた。ＤＮＡインターカレーターおよびＤＮＡ溝結合剤（ネトロプシンなど）はこのカテゴリーに属する。例えば、インターカーレーションするオキサゾロピリドカルバゾールに結合することによりＬＴＲの特異的な領域において三重らせんを形成するＤＮＡリガンドは、ＨＩＶ−１ＩＮのＵ３特異的ＬＴＲ結合阻害剤またはＵ５特異的ＬＴＲ結合阻害剤として作用することができる。ＨＩＶ−１ＩＮのアミノ酸１４７〜１７５に対応する３０ｍｅｒのペプチドはまたミリモルの濃度でＩＮ活性を阻害することが示されていた。ＩＮドメインに対する単鎖の可変フラグメントを細胞内で発現させることにより、ウイルス複製サイクルの初期段階が阻害される。リボソーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ）ファミリーのメンバーなどのポリペプチドがＨＩＶ−１ＩＮの強力な阻害剤として記載されていた。しかし、ＩＮとの妨害がその抗ウイルス活性に対する重要な機構であることは明らかにされていなかった。
【００１２】
国際特許出願公開ＷＯ９９／２５７１８には、特に、抗菌活性、（ヘルペス単純ウイルスに対する）抗ウイルス活性、抗クラミジア活性、および（インターフェロン誘導剤のような）免疫刺激活性を有して、薬理学、獣医学および化粧品学において有用であり、そして免疫不全症患者における日和見疾患を処置するために有用であると言われるクラスのピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジン誘導体が開示されている。
【００１３】
まとめると、レトロウイルスのＲＴおよび／またはＩＮを選択的に標的とし、そしてまた抗ウイルス性ある強力な阻害剤が当該分野において依然として強く求められている。従って、本発明の目的は、哺乳動物およびヒトにおけるレトロウイルス感染症（特にレンチウイルス感染症、より具体的にはＨＩＶ感染症）を処置するための効率的かつ有害でない薬学的に活性な成分および成分の組合せを明らかにすることによってこの差し迫った要求を満たすことである。
【００１４】
（発明の要約）
哺乳動物およびヒトにおけるレトロウイルス感染症（特にレンチウイルス感染症、より具体的にはＨＩＶ感染症）の治療を改善し、かつウイルスの複製をさらに低下させ、かつ多数の薬剤に対して耐性であるレトロウイルス株に対処する努力において、第３のウイルス酵素であるインテグラーゼ（ＨＩＶ−ＩＮ）の効果的な阻害剤に対する探索を開始することが望ましかった。この酵素は、ウイルスが複製するために不可欠な段階である、ウイルスｃＤＮＡを宿主細胞染色体に挿入することを担っている。この酵素のヒト対応体はまだ知られていないので、ＨＩＶ組込みプロセスの効果的で、好ましくは選択的な阻害剤を開発することはかなり注目される。
【００１５】
本発明は、特定のピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジン誘導体によってレトロウイルス（特にＨＩＶ−１）のインテグラーゼが阻害されるという予想外の発見に基づいている。ここで、これらの化合物はまた、細胞培養においてＨＩＶの複製からの保護を示し、そして１つ以上の抗レトロウイルス薬、例えば、レトロウイルスの進入および／または複製に関与する１つ以上のレトロウイルスタンパク質または細胞タンパク質に対して効果的な薬物（例えば、下記に示される薬物）と組み合わせて使用されたときに哺乳動物およびヒトの細胞培養においてレトロウイルス感染（特にレンチウイルス感染）に対する相乗効果もまた示すことができる（総説については、Ａｎｔｉｖｉｒａｌｓ ａｇａｉｎｓｔ ＡＩＤＳ（２０００）、Ｍ．Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．を参照のこと）：
・下記に詳述されるようなレトロウイルス酵素阻害剤、
・レトロウイルスの複製に関与するか、またはレトロウイルスの複製に不可欠である（グリコシル化または非グリコシル化）非酵素レトロウイルスタンパク質（例えば、ＨＩＶのｇｐ１２０）に対して効果的な薬物、例えば、Ｎａｔｕｒｅ（２００１）４１０：９６６に議論されるｇｐ１２０エンベロープ抗原に基づく免疫原、および
・レトロウイルスの進入に関与するか、またはレトロウイルスの進入に不可欠であるタンパク質（例えば、受容体または細胞化合物）を阻止する薬物、例えば、ＣＣＲ５阻害剤（例えば、Ｄｒａｇｉｃ他によりＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２０００）９７：５６３９〜４４に開示されるＴＡＫ−７７９分子など）。
そのような生物学的性質または性質の組合せは、すなわち、それらを、ヒトにおけるＨＩＶ感染のいわゆる混合療法において非常に注目される薬学的に活性な成分にする。
【００１６】
従って、そのより広い意味で、本発明は、レトロウイルス感染患者（特にレンチウイルス感染患者、より詳細にはＨＩＶ感染患者）におけるレトロウイルス感染症を処置する医薬品を製造するためのピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジン誘導体の使用に関する。本発明はまた、レトロウイルス酵素（特にインテグラーゼまたは逆転写酵素、より詳細にはＨＩＶ−１のインテグラーゼまたはＨＩＶ−１の逆転写酵素）の阻害剤としてのピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジン誘導体の使用に関する。本発明はまた、レトロウイルス感染患者（特にレンチウイルス感染患者、より詳細にはＨＩＶ感染患者）におけるレトロウイルス感染症を処置するための方法に関し、この方法は、そのような処置を必要とする患者にピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジン誘導体の有効量を投与する工程を含む。
【００１７】
別の実施形態において、本発明はまた、逆転写酵素阻害剤またはプロテアーゼ阻害剤などの１つ以上の抗レトロウイルス薬と組み合わせて使用されたときに、ヒト細胞培養におけるレトロウイルス感染に対する（下記に定義されるような）（亜）相乗効果の予想外の発見に基づいている。このような相乗的性質は、すなわち、それらを、ヒトにおけるＨＩＶ感染のいわゆる混合療法において非常に有用にする。
【００１８】
上記で議論された国際特許出願公開ＷＯ９９／２５７１８は、ＨＩＶに対するこれらの化合物の活性を何ら示唆しないか、またはレトロウイルス酵素の阻害を何ら示唆しておらず、そして免疫不全症そのものを処置することを示唆せず、免疫不全患者におけるその結果のみを示唆するだけであることに注目することは非常に重要である。
【００１９】
（詳細な説明）
本発明は最初に、哺乳動物におけるレトロウイルス感染症（特にレンチウイルス感染症、より詳細にはＨＩＶ感染症）を処置する医薬品を製造するためのピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジン誘導体の使用に関し、そしてそのような感染症にかかりやすい哺乳動物の対応する処置方法に関する。
【００２０】
第２の局面において、本発明は、好ましくは哺乳動物におけるレトロウイルス感染症に対する（またはその処置のための）医薬品として（または医薬品を製造するために）、そしてより好ましくは哺乳動物におけるレトロウイルス感染症に対して（またはその処置において）相乗効果をもたらすためなどにそれぞれの割合で、（ａ）ピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジンの１つ以上の誘導体と、（ｂ）レトロウイルスの進入および／または複製に関与する１つ以上のレトロウイルスタンパク質または細胞タンパク質に対して効果的な薬物を含む１つ以上の抗レトロウイルス薬（例えば、レトロウイルス酵素阻害剤）とを含む組成物の使用を提供する。第３の局面において、本発明は、レトロウイルス感染症の治療において同時または個別または連続的に使用される混合調製物として、哺乳動物におけるレトロウイルス感染症に対する相乗効果をもたらすようにそれぞれの割合で、（ａ）ピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジンの１つ以上の誘導体と、（ｂ）レトロウイルスの進入および／または複製に関与する１つ以上のレトロウイルスタンパク質または細胞タンパク質に対して効果的な薬物を含む１つ以上の抗レトロウイルス薬（例えば、レトロウイルス酵素阻害剤）とを含有する製造物を提供する。第４の局面において、本発明は、哺乳動物におけるレトロウイルス感染症を処置するための方法を提供する。この方法は、レトロウイルス感染に対して相乗効果をもたらすためなどにそれぞれの割合で、（ａ）１つ以上のピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジン誘導体と、（ｂ）レトロウイルスの進入および／または複製に関与する１つ以上のレトロウイルスタンパク質または細胞タンパク質に対して効果的な薬物を含む１つ以上の抗レトロウイルス薬（例えば、レトロウイルス酵素阻害剤）とを含む混合治療用調製物の有効量を、そのような処置を必要とする哺乳動物に同時または別個または連続的に投与する工程を含む。
【００２１】
本発明の様々な局面において、処置されるレトロウイルス感染症は、好ましくはレンチウイルス感染症であり、より好ましくはＨＩＶ感染症である。
【００２２】
本発明の様々な局面において、ピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジン誘導体は、好ましくは、下記の式を有する化合物、その薬学的に受容可能な付加塩または立体化学的異性体であって：
【００２３】
【化６】
式中、
・Ｘは、ヒドロキシ、ハロおよびチオールから選択され、
・Ｙは、ヒドロキシ、メトキシおよびハロから選択され、そして
・Ｚは、水素、ハロおよびニトロから選択される。
このようなピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジン誘導体は、例えば、５，５’−アリーリデンビスバルビツル酸（例えば、ＸおよびＹの両方がヒドロキシであるとき）または５，５’−アリーリデンビス（２−チオ）バルビツル酸（例えば、Ｘがチオールで、Ｙがヒドロキシであるとき）のピリジン塩をオキシ塩化リンＰＯＣｌ３と反応し、その後、酸化リンＰ２Ｏ５と反応することによって、あるいは（例えば、Ｘがヒドロキシで、Ｙがメトキシで、Ｚがｐ−ニトロであるときには）６−メトキシウラシル、ｐ−ニトロベンズアルデヒド、酢酸および無水酢酸を酢酸の沸騰温度に近い温度で反応することによって得ることができる。これらの方法の様々な変形がＷＯ９９／２５７１８に開示されている。この誘導体ファミリーの代表的なものとして、５−（４−ニトロフェニル）−２，８−ジチオール−４，６−ジヒドロキシ−５Ｈ−ピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジンが挙げられる。興味深いことに、この誘導体ファミリーにおいて、スルフヒドリル基を２位および８位に有する分子は、ヒドロキシル置換基を同じ位置に有する対応する化合物よりも顕著な抗ウイルス活性を示す傾向を有することが認められた。
【００２５】
上記で言及された薬学的に受容可能な付加塩は、上記の式を有する化合物が形成することができ、かつそのような化合物の塩基形態を適切な酸で処理することによって都合よく得ることができる治療的に活性な非毒性の酸付加塩形態を包含することが意味される。そのような適切な酸の例には、例えば、ハロゲン化水素酸（例えば、塩化水素酸または臭化水素酸）、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸；または有機酸、例えば、酢酸、プロパン酸、ヒドロキシ酢酸、２−ヒドロキシプロパン酸、２−オキソプロパン酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸（すなわち、エタン二酸）、マロン酸、コハク酸（すなわち、ブタン二酸）、マレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、シクロヘキサンスルファミン酸、サリチル酸（すなわち、２−ヒドロキシ安息香酸）、ｐ−アミノサリチル酸、パモ酸などが含まれる。逆に、塩形態は、適切なアルカリで処理することによって遊離塩基形態に変換することができる。本明細書中で使用される用語「薬学的に受容可能な付加塩」には、上記の式を有する化合物ならびに上記に定義されるようなそれらの塩が形成することができる溶媒和物が含まれ、例えば、水和物、アルコラートなどが含まれる。
【００２６】
本発明において治療活性成分として使用されるピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジン誘導体は好ましくは、それらが意図される治療プログラムを安全に制御するために、実質的に純粋な形態で、すなわち、その製造過程および／または取扱い過程に由来する化学的不純物（副生成物または残留溶媒など）を含まない形態で存在しなければならない。ピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジン誘導体は、それらが不斉炭素原子を少なくとも有するとき、ラセミ混合物として存在し得るか、または模擬移動床技術を含む標準的な分画方法によってラセミ混合物から得られる前記化合物の実質的に純粋な立体異性体もしくはエナンチオマーの形態で存在し得る。
【００２７】
本明細書中前記で使用される用語「立体化学的異性体」により、式（Ｉ）の化合物が有し得る可能な異性体のすべてが定義される。別途示されない限り、化合物の化学的名称は、基本分子構造のすべてのジアステレオマーおよびエナンチオマーを含む、すべての可能な立体化学的異性体の混合物を意味する。より詳細には、立体中心はＲ配置またはＳ配置のいずれかを有し得る。前記化合物の純粋な立体異性体は、同じ基本分子構造の他のエナンチオマー形態またはジアステレオマー形態を実質的に含まない異性体として定義される。特に、用語「立体異性体的に純粋」または用語「キラル純粋」は、立体異性体過剰率が少なくとも８０％であり（すなわち、少なくとも９０％が一方の異性体であり、多くても１０％がそれ以外の可能な異性体であり）、好ましくは少なくと９０％であり、より好ましくは少なくとも９４％であり、最も好ましくは少なくとも９７％である化合物に関する。用語「エナンチオマー的に純粋」および用語「ジアステレオマー的に純粋」は、それぞれ、問題とする混合物のエナンチオマー過剰率、ジアステレオマー過剰率に注目して、同じように理解しなければならない。
【００２８】
従って、エナンチオマーの混合物が調製方法のときに得られる場合には、混合物は、好適なキラル定常相を使用する液体クロマトグラフィーによって分離することができる。好適なキラル定常相には、例えば、多糖が挙げられ、具体的にはセルロース誘導体またはアミロース誘導体がある。市販されている多糖ベースのキラル定常相には、ＣｈｉｒａｌＣｅｌＴＭＣＡ、ＯＡ、ＯＢ、ＯＣ、ＯＤ、ＯＦ、ＯＧ、ＯＪおよびＯＫ、ならびにＣｈｉｒａｌｐａｋＴＭＡＤ、ＡＳ、ＯＰ（＋）およびＯＴ（＋）がある。前記の多糖キラル定常相との組合せで使用される適切な溶出液または移動相には、ヘキサンなどがあり、これらは、エタノール、イソプロパノールなどのアルコールで調節される。
【００２９】
本明細書中前記で使用される用語「実質的に純粋」は、高速液体クロマトグラフィーなどのこの分野で通常的な方法によって測定されたときに、少なくとも約９６％（好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％）の化学的純度を意味する。
【００３０】
本発明の様々な局面において、薬物（ｂ）として使用されるレトロウイルス酵素阻害剤は、この分野で既に知られているカテゴリーに属し得るが、特に下記の阻害剤を含むことができる：
・ＨＩＶ−１のＩＮ阻害剤、例えば、本明細書中上記に概説されるようなＨＩＶ−１ＩＮ阻害剤；
・ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、例えば、ジドブジン、ラミブジン、ジダノシン、スタブジン、ザルシタビンなど；
・非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、例えば、ネビラピン、デラビルジンなど；
・他の逆転写酵素阻害剤、例えば、フォスカルネットナトリウムなど；
・ＨＩＶ−１プロテアーゼ阻害剤、例えば、サキナビル、リトナビル、インジナビル、ネルフィナビルなど。
【００３１】
本発明の第３の局面で提供される製造物は、（ａ）および（ｂ）の少なくとも１つが少なくとも薬学的に受容可能なキャリアと混合されている薬学的調製物または薬学的組成物の形態であり得る。本明細書中で使用される用語「薬学的に受容可能なキャリア」は、例えば、前記組成物の溶解、分散もしくは拡散によって、処置される位置への適用もしくは散布を容易にするために、かつ／またはその有効性を損なうことなくその貯蔵、輸送もしくは取扱いを容易にするために、有効成分（ａ）および有効成分（ｂ）からなる組成物が配合される任意の材料または物質を意味する。薬学的に受容可能なキャリアは固体であってもよく、または液体であってもよく、または液体を形成させるために圧縮されている気体であってもよい。すなわち、本発明の組成物は、高濃度物、エマルション剤、溶液剤、顆粒、粉剤、スプレー剤、エアロゾル剤、ペレットまたは粉末剤として好適に使用することができる。
【００３２】
前記薬学的組成物およびその配合物において使用される好適な薬学的キャリアは当業者には十分に知られており、その選択は本発明では特に制限されない。薬学的キャリアはまた、湿潤化剤、分散剤、増粘剤、接着剤、乳化剤、溶媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤（例えば、フェノール、ソルビン酸、クロロブタノール）、等張剤（糖または塩化ナトリウムなど）などの添加剤を、それらが製薬実施と矛盾しないならば含むことができる。すなわち、哺乳動物に対して永続的な損傷を生じさせないキャリアおよび添加剤を含むことができる。本発明の薬学的組成物は、任意の知られている様式で、例えば、一段階または多段階の方法で、有効成分を、選択されたキャリア物質と、そしてまた、適する場合には、界面活性剤などのそれ以外の添加剤と均質に混合、コーティングおよび／または粉砕することによって調製することができ、そして例えば、約１μｍ〜１０μｍの直径を通常的には有するマイクロスフェアの形態で得るために、すなわち、有効成分を制御放出または持続放出させるためのマイクロカプセルを製造するために、微細化によって調製することができる。
【００３３】
本発明の薬学的組成物において使用される好適な界面活性剤は、良好な乳化性、分散性および／または湿潤化性を有する非イオン性物質、カチオン性物質および／またはアニオン性物質である。好適なアニオン性界面活性剤には、水溶性の石けんおよび水溶性の合成界面活性剤の両方が含まれる。好適な石けんには、高級脂肪酸（Ｃ１０〜Ｃ２２）のアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩、非置換アンモニウム塩または置換アンモニウム塩、例えば、オレイン酸またはステアリン酸のナトリウム塩またはカリウム塩、あるいはココナッツオイルまたはタローオイルから得られる天然脂肪酸混合物のそのような塩が挙げられる。合成界面活性剤には、ポリアクリル酸のナトリウム塩またはカルシウム塩；脂肪スルホン酸塩および脂肪硫酸塩；スルホン酸化ベンゾイミダゾール誘導体およびアルキルアリールスルホン酸塩が含まれる。脂肪スルホン酸塩または脂肪硫酸塩は通常、アルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩、非置換アンモニウム塩、または８個〜２２個の炭素原子を有するアルキル基もしくはアシル基で置換された置換アンモニウム塩の形態であり、例えば、リグノスルホン酸またはドデシルスルホン酸のナトリウム塩またはカルシウム塩、あるいは天然脂肪酸から得られる脂肪アルコール硫酸塩の混合物、硫酸エステルまたはスルホン酸エステルのアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩（ラウリル硫酸ナトリウムなど）、および脂肪アルコール／エチレンオキシド付加物のスルホン酸のアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩である。好適なスルホン酸化ベンゾイミダゾール誘導体は、好ましくは、８個〜２２個の炭素原子を含有する。アルキルアリールスルホン酸塩の例には、ドデシルベンゼンスルホン酸またはジブチルナフタレンスルホン酸またはナフタレンスルホン酸／ホルムアルデヒド縮合生成物のナトリウム塩、カルシウム塩またはアルカノールアミン塩がある。また、対応するリン酸塩（例えば、リン酸エステルの塩）、ならびにｐ−ノニルフェノールとエチレンオキシドおよび／またはプロピレンオキシドとの付加物、またはリン脂質も好適である。この目的のために好適なリン脂質には、セファリンタイプまたはレシチンタイプの天然リン脂質（動物細胞または植物細胞に由来）または合成リン脂質が挙げられ、例えば、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセリン、リソレシチン、カルジオリピン、ジオクタニルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリンおよびそれらの混合物がある。
【００３４】
好適な非イオン性界面活性剤には、少なくとも１２個の炭素原子を分子内に含有するアルキルフェノール、脂肪アルコール、脂肪酸、脂肪族アミンまたは脂肪族アミドのポリエトキシル化誘導体およびポリプロポキシル化誘導体、そしてアルキルアレーンスルホン酸塩およびジアルキルスルホコハク酸塩が含まれ、例えば、脂肪族アルコールおよび脂環式アルコール、飽和および不飽和の脂肪酸およびアルキルフェノールのポリグリコールエーテル誘導体などがある。前記誘導体は、好ましくは、３個〜１０個のグリコールエーテル基および８個〜２０個の炭素原子を（脂肪族）炭化水素部分に含有し、そして６個〜１８個の炭素原子をアルキルフェノールのアルキル成分に含有する。さらなる好適な非イオン性界面活性剤は、ポリエチレンオキシドのポリプロピレングリコールとの水溶性付加物、１個〜１０個の炭素原子をアルキル鎖に含有するエチレンジアミノポリプロピレングリコールである。そのような付加物は、２０個〜２５０個のエチレングリコールエーテル基および／または１０個〜１００個のプロピレングリコールエーテル基を含有する。そのような化合物は、通常、プロピレングリコールユニットあたり１個〜５個のエチレングリコールユニットを含有する。非イオン性界面活性剤の代表的な例には、ノニルフェノール−ポリエトキシエタノール、ひまし油ポリグリコール酸エーテル、ポリプロピレン／ポリエチレンオキシド付加物、トリブチルフェノキシポリエトキシエタノール、ポリエチレングリコールおよびオクチルフェノキシポリエトキシエタノールがある。ポリエチレンソルビタンの脂肪酸エステル（ポリオキシエチレンソルビタントリオレアートなど）、グリセロールの脂肪酸エステル、ソルビタンの脂肪酸エステル、スクロースの脂肪酸エステルおよびペンタエリトリトールの脂肪酸エステルもまた好適な非イオン性界面活性剤である。
【００３５】
好適なカチオン性界面活性剤には、ハロ、フェニル、置換フェニルまたはヒドロキシで必要に応じて置換される４個の炭化水素基を有する四級アンモニウム塩（好ましくはハロゲン化物）が含まれ、例えば、少なくとも１つのＣ８〜Ｃ２２アルキル基（例えば、セチル、ラウリル、パルミチル、ミリスチル、オレイルなど）をＮ置換基として含有し、そしてさらなる置換基として、非置換またはハロゲン化された低級アルキル基、ベンジル基および／またはヒドロキシ低級アルキル基を含有する四級アンモニウム塩が含まれる。
【００３６】
この目的のために好適な界面活性剤のより詳細な記載を、例えば、「ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ’ｓ Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒｓ Ａｎｎｕａｌ」（ＭＣ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｒｏｐ．、Ｒｉｄｇｅｗｏｏｄ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、１９８１）、「Ｔｅｎｓｉｄ−Ｔａｓｃｈｅｎｂｕｃｈ」第２版（Ｈａｎｓｅｒ Ｖｅｒｌａｇ、Ｖｉｅｎｎａ、１９８１）、および「Ｅｎｃｙｃｌｏｐａｅｄｉａ ｏｆ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ」（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８１）に見出すことができる。
【００３７】
さらなる成分を、組成物中の有効成分の作用継続時間を制御するために含めることができる。例えば、制御放出組成物を、例えば、ポリエステル、ポリアミノ酸、ポリビニルピロリドン、エチレン−酢酸ビニルコポリマー、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、硫酸プロタミンなどの適切なポリマーキャリアを選択することによって達成することができる。薬物放出速度および作用継続時間はまた、ヒドロゲル、ポリ乳酸、ヒドロキシメチルセルロース、ポリメタクリル酸メチルおよびその他の上記に記載されたポリマーなどのポリマー物質の粒子（例えば、マイクロカプセル）に有効成分を取り込むことによって制御することができる。そのような方法は、リポソーム、マイクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子、ナノカプセルなどのようなコロイド薬物送達系を含む。投与経路に依存して、薬学的組成物は、保護コーティングが必要になる場合がある。
【００３８】
注射使用に好適な薬学的形態物は、必要に応じてその場でそれらを調製するための無菌の水溶性の溶液または懸濁物および無菌の粉末を含む。従って、この目的のための典型的なキャリアには、生体適合性の水性緩衝剤、エタノール、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど、およびそれらの混合物が含まれる。
【００３９】
成分（ａ）および成分（ｂ）は、処置される哺乳動物において同時に直接、それらの共同的な治療効果を必ずしも発揮しないということを考慮すると、本発明の第３の局面で提供される製造物はまた、別個ではあるが、隣接した形態で２つの成分を含有する医学的なキットまたはパッケージの形態にすることができる。従って、後者に関連して、成分（ａ）および成分（ｂ）のそれぞれを、他方の成分の投与経路とは異なる投与経路に好適な方法で配合することができる。例えば、それらの一方を経口用配合物または非経口用配合物の形態にすることができ、これに対して、もう一方を静脈内注射用のアンプル剤またはエアロゾル剤の形態にすることができる。
【００４０】
本発明の第３の局面である処置方法に従って、
・有効成分（ａ）および有効成分（ｂ）は、処置される哺乳動物（ヒトを含む）に、この分野で十分に知られている任意の手段によって、すなわち、経口的、鼻腔内、皮下、筋肉内、皮内、静脈内、関節内、非経口的に、またはカテーテル投与によって投与することができる。
・（ａ）および（ｂ）の混合調製物の有効量は、好ましくは抗レトロウイルス量であり、例えば、レトロウイルス酵素の阻害量である。より好ましくは、効果的な量は誘導体（ａ）のインテグラーゼ阻害量および薬物（ｂ）のレトロウイルス酵素阻害量である。さらにより好ましくは、前記のレトロウイルス酵素阻害剤薬物（ｂ）がプロテアーゼ阻害剤であるとき、その効果的な量はプロテアーゼ阻害量である。前記のレトロウイルス酵素阻害剤薬物（ｂ）が逆転写酵素阻害剤であるとき、その有効量は逆転写酵素阻害量である。前記のレトロウイルス酵素阻害剤薬物（ｂ）がピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジンの誘導体とは異なるインテグラーゼ阻害剤であるとき、その有効量はインテグラーゼ阻害量である。（ｂ）が、レトロウイルスの複製に関与する（グリコシル化または非グリコシル化）非酵素レトロウイルスタンパク質に対して効果的な薬物（例えば、ＨＩＶｇｐ１２０エンベロープ抗原に基づく免疫原）であるとき、（ｂ）はその通常の有効量で使用されるはずである。（ｂ）がＣＣＲ５阻害剤であるとき、（ｂ）はＣＣＲ５阻害量で使用されるはずである。
・成分（ａ）および成分（ｂ）を同時に投与することができるが、処置される身体においてそれらの機能的融合を達成するために、それらを、例えば、比較的短い期間内で（例えば、約２４時間以内に）別個または連続的に投与することもまた有益であり得る。
【００４１】
下記の実施例は、例示目的のためにだけ示され、本発明の範囲を限定するものとして決して解釈してはならない。
【００４２】
（実施例）
本発明の実施例を行うために、下記の化合物および実験手順を使用した。
【００４３】
ピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジン誘導体は、ＷＯ９９／２５７１８に開示される方法に従って得た。ＡＺＴは、Ｈｏｒｗｉｔｚ他によりＪ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．（１９６４）２９：２０７６〜８に以前に記載されるように合成された。チビラピンおよびロビリドはＪａｎｓｓｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（Ｂｅｅｒｓｅ、ベルギー）から得た。ネビラピンはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ（Ｒｉｄｇｅｆｉｅｌｄ、ＣＮ）から得た。リトナビルはＡｂｂｏｔｔ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）により提供された。分子量が５，０００のデキストラン硫酸をＳｉｇｍａから購入した。ネルフィナビルはＡｇｏｕｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から得た。ビシクラムＡＭＤ３１００はＡｍｏｒｍｅｄから得た。
【００４４】
ＭＴ−４細胞（Ｍｉｙｏｃｈｉ他によりＧａｎｎ．Ｍｏｎｏｇｒａｍ．（１９８２）２８：２１９〜２２８に開示される）およびＣ８１６６細胞（Ｓａｌａｈｕｄｄｉｎ他によりＶｉｒｏｌｏｇｙ（１９８３）１２９：５１〜６４に開示される）を、５％ＣＯ２を有する加湿雰囲気中で増殖させ、そして１０％熱不活化ウシ胎児血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、０．１％重炭酸ナトリウムおよび２０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンが補充されたＲＰＭＩ１６４０培地で維持した。
【００４５】
ＨＩＶ−１（ＩＩＩＢ）ウイルスは、Ｐｏｐｏｖｉｃ他によりＳｃｉｅｎｃｅ（１９８４）２２４：４９７〜５００に記載された。ＨＩＶ−１（ＮＤＫ）もまた、Ｓｐｉｒｅ他によりＧｅｎｅ（１９８９）８１：２７５〜２８４に記載された。ＨＩＶ−１（以降、ＮＬ４．３として示され、Ａｄａｃｈｉ他によりＪ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５９：２８４〜２９１に開示される）は、国立衛生研究所（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）から得られる分子クローンである。１３ＭＢ１（Ｌ１００Ｉ）株および３９ＮＭ１（Ｙ１８１Ｃ）株は、本発明者らの研究室において、それぞれ、チビラピンまたはロビリドの存在下でＭＴ−４細胞においてＨＩＶ−１（ＩＩＩＢ）およびＨＩＶ−１（ＮＤＫ）を連続的に継代した後に単離された。Ｌ１、Ｌ２、Ｌ４およびＬ６は、ジデオキシヌクレオシド（ｄｄＮ）アナログのジドブジン、ジダノシン、ザルシタビン、スタブジンおよびラミブジン、ならびに非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤のロビリドを用いた連続処置の前およびその後の一人の血清陽性患者に由来する臨床単離体である。Ｓｃｈｍｉｄｔ他（前掲）によれば、Ｌ６株は下記の変異を逆転写酵素に含有する：Ｖ７５Ｉ、Ｆ７７Ｌ、Ｋ１０３Ｎ、Ｆ１１６Ｙ、Ｑ１５１ＭおよびＭ１８４Ｖ。ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２（ＲＯＤ）（Ｂａｒｒｅ−Ｓｉｎｏｕｓｓｉ他によりＳｃｉｅｎｃｅ（１９８３）２２０：８６８〜８７１に開示される）およびＨＩＶ−２（ＥＨＯ）（Ｒｅｙ他によりＶｉｒｏｌｏｇｙ（１９８９）１７３：２５８〜２６７に開示される）の保存株を、Ｐａｕｗｅｌｓ他（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９８７）１６：１７１〜１８５）およびＳｃｈｏｌｓ他（Ｊ．ＡＩＤＳ（１９８９）２：１０〜１５）に従って、ＨＩＶ−１感染細胞株またはＨＩＶ−２感染細胞株の培養上清から得た。サル免疫不全症ウイルス［ＳＩＶ（ＭＡＣ２５１）］をＳｍｉｔｈ Ｋｌｉｎｅ（Ｒｉｘｅｎｓａｒｔ、ベルギー）から得て、保存株をＳＩＶ感染ＭＴ−４細胞の上清から調製した。
【００４６】
実施例１ 急性感染の細胞培養モデルにおけるＨＩＶまたはＳＩＶの複製に対するピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジン誘導体の阻害活性。
【００４７】
下記の式を有する一連の５−（４−置換フェニル）−５Ｈ−ピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジンにおける８個の異なる化合物（以降、Ａ〜Ｈとして示される）の阻害活性を、急性感染の細胞培養モデルにおけるＨＩＶまたはＳＩＶの複製を阻害するその能力について試験した：
【００４８】
【化７】
（式中、Ｘ、ＹおよびＺは下記の表１に定義される通りである）
【００５０】
【表１】
選択された化合物を、Ｐａｕｗｅｌｓ他によりＪ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９８８）２０：３０９〜３２１に記載される比色測定試験を使用して、ＨＩＶ−１（ＩＩＩＢ）株、２つのＨＩＶ−２株（ＲＯＤおよびＥＨＯ）、およびＳＩＶ（ＭＡＣ２５１）に対して、ＭＴ−４細胞におけるウイルス誘導による細胞変性の阻害について試験した。評価を感染後５日目に行った。
【００５２】
これらの化合物の細胞傷害性を、モック感染のＭＴ−４細胞またはＣ８１６６細胞の生存性を感染後５日目に測定することによって同時に決定した。少なくとも２つの別個の実験に対する平均値および標準偏差を含む抗ウイルス活性および細胞傷害性のデータを表２に示す。表において、
・ＥＣ５０は５０％有効濃度（すなわち、細胞培養においてウイルスの細胞変性効果を５０％阻害するために必要な濃度）を表す。
・ＣＣ５０は５０％細胞傷害濃度（すなわち、ＭＴ−４細胞の生存性を５０％低下させる濃度）を表す。
【００５３】
【表２】
誘導体Ｃ、Ｅ、ＧおよびＨは、ＨＩＶ−１（ＩＩＩＢ）の複製に対して活性であった。このシリーズの最も活性な化合物Ｈ、すなわち、５−（４−ニトロフェニル）−２，８−ジチオール−４，６−ジヒドロキシ−５Ｈ−ピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジン（すべての添付された図ではＶ−１６５として示される）は、５０％有効濃度（ＥＣ５０）が１１．４μＭと活性であった。Ｈはまた、５．５μＭ〜３０μＭの範囲のＥＣ５０値で、ＨＩＶ−１（ＮＤＫ、ＮＬ４．３およびＬ１）、ＨＩＶ−２（ＲＯＤおよびＥＨＯ）およびＳＩＶ（ＭＡＣ２５１）に対して活性であった。対照的に、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤のネビラピンは、比較として試験されたが、ＭＴ−４細胞において９８μＭで、ＨＩＶ−２（ＲＯＤおよびＥＨＯ）およびＳＩＶ（ＭＡＣ２５１）の複製に対して不活性であった。
【００５５】
実施例２ 薬剤耐性ＨＩＶ−１株に対する特定のピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジン誘導体の阻害活性。
【００５６】
化合物Ｇおよび化合物Ｈの抗ウイルス活性を、実施例１と同じ方法を使用して、様々な薬剤耐性ＨＩＶ−１株に対して試験した。結果を下記の表３に示す。表において、ＥＣ５０は実施例１と同じ意味を有し、ＥＣ５０の増大倍率は、野生型（ＷＴ）株に対する抗ウイルス活性との比較による。化合物Ｈは、ウイルス進入アンタゴニストのデキストラン硫酸またはビシクラムに対して耐性であるＨＩＶ−１株に対して活性であった。非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩ）のチビラピンまたはロビリドに対する耐性のための選択されたＨＩＶ−１株は両方の化合物によって阻害された。
【００５７】
【表３】
さらに、本発明者らは、親株Ｌ１が、ＩＩＩＢよりも、化合物Ｈに対して大きい感受性（ＥＣ５０：３．７±１．８μＭ）を有したことを考慮して、３つの多剤耐性（ＭｄｄＮＲ）ＨＩＶ−１株（Ｌ２、Ｌ４およびＬ６）に対する化合物Ｈの阻害能が最大で１／３に低下していることを認めた。
【００５９】
実施例３ 様々なＨＩＶ−１阻害剤と５−（４−ニトロフェニル）−２，８−ジチオール−４，６−ジヒドロキシ−５Ｈ−ピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジンとの混合阻害効果。
【００６０】
化合物Ｈの抗ウイルス効果を、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤のジドブジン、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤のネビラピン、およびプロテアーゼ阻害剤のネルフィナビルと組み合わせて試験した。
【００６１】
ＨＩＶ−１により誘導される細胞変性効果に対する混合阻害効果を、Ｅｌｉｏｎ他によりＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９５４）２０８：４７７〜４８８に、そしてＢａｂａ他によりＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．（１９８４）２５：５１５〜５１７に以前に記載されるように、アイソボログラム法によって評価した。
【００６２】
前記に定義されるようなＥＣ５０を、阻害濃度分率（以降、ＦＩＣとして示される）を計算するために使用した。組み合わせられた化合物のＦＩＣに対応する最小ＦＩＣ指数（例えば、ＦＩＣｘ＋ＦＩＣｙ）が１．０に等しいとき、その組合せは付加的であると言われる；１．０〜０．５の間であるとき、その組合せは定義により亜相乗的であると言われる；０．５よりも小さいとき、その組合せは、定義により、相乗的であると言われる。最小ＦＩＣ指数が１．０〜２．０の間であるとき、その組合せは、亜アンタゴニスト的であると言われ、２．０を越えるときには、その組合せはアンタゴニスト的であると定義される。
【００６３】
これらの試験の結果は、直線がそれぞれ１．０および０．５に等しいＦＩＣを表す図２〜図４に示されるアイソボログラムで報告される。これらの図は、
【００６４】
【数１】
の合算値が０．５〜１の間に含まれ、そして
【００６６】
【数２】
の合算値が０．５未満であったことを示している。
実施例４ 複製サイクルにおける５−（４−ニトロフェニル）−２，８−ジチオール−４，６−ジヒドロキシ−５Ｈ−ピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジンの介入時期。
【００６８】
添加時期実験を、複製サイクルのどの段階が化合物Ｈによって阻害されるかを調べるために行った。簡単に記載すると、この実験により、抗ＨＩＶ化合物の添加が、ウイルス複製サイクルにおいて、その抗ウイルス活性を失う前に、どのくらい長く延ばされ得るかが決定される。ＭＴ−４細胞に、ウイルス複製のすべての段階を同調させるために０．５の感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ．）でＨＩＶ−１（ＩＩＩＢ）を感染させ、そして様々な抗ウイルス試験化合物を、感染後の（０時間から２６時間までに及ぶ）種々の時間で添加した。ウイルスのｐ２４抗原の産生を（ＨＩＶ−１ｐ２４コアプロフィルＥＬＩＳＡ（ＤｕＰｏｎｔ、Ｄｒｅｉｅｉｃｈ、ドイツ）を使用して）感染後３１時間で測定した。これは、ｐｇ／ｍｌでｐ２４Ａｇ含有量のｌｏｇ１０として表される。作用モードが知られている参照化合物がこの実験には含められた。デキストラン硫酸（ポリアニオン）は、ウイルスが細胞に結合することを妨害する。ヌクレオシドアナログのＡＺＴは逆転写プロセスを阻害する。リトナビルはタンパク質分解的切断阻害剤である。これらの参照化合物（デキストラン硫酸、ＡＺＴおよびリトナビル）は、０．０１のｍ．ｏ．ｉ．で測定されたＥＣ５０値の１００倍に対応する正規化された濃度で添加された。化合物Ｈは２５０μＭで添加された。この実験の結果を示す図１には、下記の記号が使用された：
【００６９】
【数３】
図１により、化合物Ｈの添加は、ウイルス感染後６時間延ばすことができる。このことは、組込み（ＤＮＡ鎖転移）のときにおける相互作用を示唆している。なぜなら、類似する添加時期実験で試験された知られているジケト酸のインテグラーゼ阻害剤は、感染後６時間以上経って添加されたときにその活性を失ったからである。しかし、実験は、ウイルス複製時に標的化される最後の段階を明らかにするだけであるので、この実験からは、化合物Ｈが逆転写酵素とも相互作用することを除外することができない。
【００７１】
実施例５ ５−（４−ニトロフェニル）−２，８−ジチオール−４，６−ジヒドロキシ−５Ｈ−ピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジンによるレンチウイルスベクター媒介形質導入の阻害。
【００７２】
阻害剤がＨＩＶの逆転写段階および／または組込み段階を妨害することを確認するために、２９３Ｔ細胞の１回の感染を、ＶＳＶ−Ｇエンベロープで偽タイプ化され、レポーター遺伝子としてルシフェラーゼを有するＨＩＶ−１由来のベクターを使用して、Ｎａｌｄｉｎｉ他によりＳｃｉｅｎｃｅ（１９９６）２７２：２６３〜７に記載される方法に従って行った。具体的には、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のエンベロープで偽タイプ化されたＨＩＶ−１由来のベクター粒子を、パッケージングプラスミドのｐＣＭＶΔＲ８．２またはｐＣＭＶΔＲ８．９１、水疱性口内炎ウイルスのエンベロープをコードするプラスミド（ｐＭＤＧ）、および２つの長末端反復（ＬＴＲ）が隣接するレポーター遺伝子をコードするプラスミド（ｐＨＲ’−ＣＭＶルシフェラーゼ）の３つのプラスミドで２９３Ｔ細胞をトランスフェクションすることによって作製した。すべてのプラスミドはＥｕｒｏｐｅａｎ Ｇｅｎｅ Ｖｅｃｔｏｒ Ｄａｔａｂａｓｅ ａｎｄ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙから得ることができ、そしてＧｅｎｅｔｈｏｎ ＩＩＩ、ＣＮＲＳ ＵＲＡ、１９２３、Ｅｖｒｙ（フランス）によって、ジュネーブ大学（遺伝学および微生物学学部）（スイス）によって提供された。１０ｃｍディッシュの２９３Ｔ細胞をトランスフェクションするために、３つのプラスミドの７００μｌ混合物を１５０ｍＭのＮａＣｌにおいて作製した（２０μｇのベクタープラスミド、１０μｇのパッケージング構築物および５μｇのエンベローププラスミド）。７００μｌのこのＤＮＡ溶液に、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能）（１５０ｍＭのＮａＣｌにおける１０ｍＭ保存溶液の１１０μｌ）をゆっくり添加した。室温で１５分後、ＤＮＡ−ＰＥＩ複合体を、１％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）が補充されたＤＭＥＭ培地中の２９３Ｔ細胞に滴下して加えた。一晩インキュベーションした後、培地を、１０％ＦＣＳを含有する培地と交換した。上清をトランスフェクション後の２日目〜５日目に集めた。ベクター粒子を、スイング式バケットローター（ＳＷ２７、Ｂｅｃｋｍａｎ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で２５，０００ｒｐｍにおいて４℃で２時間の超遠心分離によって沈降させた。ペレットをＰＢＳに再溶解して、１００倍濃度液を作製した。種々のウイルス保存株をｐ２４抗原含有量に基づいて正規化した（ＨＩＶ−１ｐ２４コアプロフィルＥＬＩＳＡ、これはＤｕＰｏｎｔ（Ｄｒｅｉｅｉｃｈ、ドイツ）から得られる）。阻害剤を９６ウエルプレートにおいて評価した。各ウエルについて、２，０００ｐｇのベクターおよび２μｇ／ｍｌのポリブレンを、１００μｌのＤＭＥＭ／１％ＦＣＳで増殖させた２９３Ｔ細胞のコンフルエントな単層に加えた。阻害剤を種々の濃度でインキュベーションした。トランスフェクションした４８時間後に細胞を溶解して、ルシフェラーゼ活性を、ルシフェラーゼアッセイシステムＴＭ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｅｎｅｌｕｘ、Ｌｅｉｄｅｎ、オランダ）を使用してＬｕｍｉｃｏｕｎｔＴＭ（Ｐａｃｋａｒｄ、Ｍｅｒｉｄｅｎ、Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ）で測定した。細胞数に対する正規化を、ＢＣＡＴＭタンパク質アッセイ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）を使用してタンパク質濃度を測定することによって行った。
【００７３】
このアッセイにおいて、ルシフェラーゼ活性の低下は、初期のＨＩＶ複製段階の阻害に対する尺度である。形質導入の阻害が、１７μＭの平均ＥＣ５０値で、化合物Ｈで得られた。コントロールの逆転写酵素阻害剤であるＡＺＴは、レンチウイルスの形質導入を４９ｎＭのＥＣ５０値で阻害した。ｇｐ１２０がウイルス粒子に存在しないことにより、ＨＩＶタイプのウイルス進入は標的として除外される。化合物Ｈはまた、（Ｚｕｆｆｅｒｅｙ他によりＮａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９７）１５：８７１〜５に記載されるなどの）副因子のｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｒおよびｖｐｕを欠いている次世代ベクターによる形質導入を同じ程度に阻害した。従って、これにより、抗ウイルス機構におけるこれらのＨＩＶタンパク質に対する主要な役割が除外される。これらのアッセイにより、ＨＩＶ−１の逆転写および／または組込みが、細胞培養における本発明の化合物の抗ウイルス効果に対する標的として確認される。
【００７４】
実施例６ 特定のピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジン誘導体によるＨＩＶ逆転写酵素活性の阻害。
【００７５】
ＨＩＶ−１逆転写酵素の酵素活性の阻害を、Ｄｅｂｙｓｅｒ他によりＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９１）８８：１４５１〜５に記載されるように、ビリオンに由来する酵素を得て、逆転写酵素活性についてアッセイするための手順を使用しながら、本発明のいくつかの化合物および参照化合物について評価した。ポリ（ｒＣ）．オリゴ（ｄＧ）およびポリ（ｒＡ）．オリゴ（ｄＴ）をテンプレートプライマーとして使用し、そして８−［３Ｈ］−ｄＧＴＰおよび［３Ｈ］−ｄＴＴＰを放射能標識された基質として使用した。反応混合物における８−［３Ｈ］−ｄＧＴＰおよび［３Ｈ］−ｄＴＴＰの最終濃度は２．５μＭであった。組換えＨＩＶ−１ＲＴ（ＨＸＢ２）を、Ｊｏｎｃｋｈｅｅｒｅ他によりＪ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９９６）６１：１１３〜１２５に記載されるようにして得た。これらの実験の結果を下記の表４に示す。表において、ＩＣ５０は５０％阻害濃度（すなわち、テンプレートプライマーとしてポリ（Ｃ）．オリゴ（ｄＧ）またはポリ（Ａ）．オリゴ（ｄＴ）を使用したときに組換えＨＩＶ−１ＲＴの活性を５０％阻害するために必要な濃度）である。
【００７６】
【表４】
実施例７ 特定のピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジン誘導体によるＨＩＶインテグラーゼ活性の阻害。
【００７８】
３’−プロセシング反応、ＤＮＡ鎖転移反応および全体的な組込み反応の阻害を、下記の方法論を使用して、Ｃｈｅｒｅｐａｎｏｖ他によりＭｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（１９９７）５２：７７１〜７８０に記載されるように、オリゴヌクレオチドに基づくアッセイにおいて測定した。
【００７９】
最初に、組換えＨｉｓ標識ＨＩＶ−１インテグラーゼを、Ｃｈｅｒｅｐａｎｏｖ他（前掲）により記載されるように、ＨＩＶ−１ＩＮ（ＨＴＬＶ ＩＩＩ株）をコードするプラスミドｐＲＰ１０１２（Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）から入手可能）からＥ．ｃｏｌｉ ＰＣ１（ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＬｙｓＳ）ΔｅｎｄＡ：：ＴｃＲ）で産生させ、そしてＮｉ−ニトリロ三酢酸カラム（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ）、次いでＨｉｇｈＴｒａｐ−ヘパリンカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で精製した。
【００８０】
下記の高速液体クロマトグラフィー精製されたデオキシオリゴヌクレオチドをＡｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈから購入した：
ＩＮＴ１、５’−ＴＧＴＧＧＡＡＡＡＴＣＴＣＴＡＧＣＡＧＴ；
ＩＮＴ２、５’−ＡＣＴＧＣＴＡＧＡＧＡＴＴＴＴＣＣＡＣＡ；
Ｔ３５、５’−ＡＣＴＡＴＡＣＣＡＧＡＣＡＡＴＡＡＴＴＧＴＣＴＧＧＣＣＴＧＴＡＣＣＧＴ；
ＳＫ７０、５’−ＡＣＧＧＴＡＣＡＧＧＣＣＡＧＡＣＡＡＴＴＡＴＴＧＴＣＴＧＧＴＡＴＡＧＴ。
【００８１】
オリゴヌクレオチドのＩＮＴ１およびＩＮＴ２はＨＩＶ−１ＬＴＲのＵ５末端に対応する。オリゴヌクレオチドＩＮＴ１を２０％変性ポリアクリルアミド／尿素ゲルで精製し、そしてポリヌクレオチドＴ４キナーゼおよび
【００８２】
【数４】
を使用して５’末端を標識した。インテグラーゼ反応に対するＤＮＡ基質を、ＩＮＴ１およびＩＮＴ２をアニーリングすることによって作製した。１００ｍＭのＮａＣｌが存在する２つのオリゴヌクレオチドの等モル混合物を９５℃で短時間加熱し、そして室温にゆっくり冷却した。同様に、ＳＫ７０およびＴ３５をアニーリングすることにより、標的ＤＮＡ分子として使用される３５ｂｐのｄｓＤＮＡ分子を得た（Ｔ３５／ＳＫ７０）。
【００８４】
３’−プロセシングアッセイ用の最終的な反応混合物は、２０ｍＭの４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（以降、ＨＥＰＥＳとして示される）（ｐＨ７．５）、５ｍＭのジチオスレイトール、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、７５ｍＭのＮａＣｌ、１５％（容量／容量）のポリエチレングリコール（分子量８，０００）、３０ｎＭのオリゴヌクレオチド基質、および２３０ｎＭのＨｉｓ標識インテグラーゼを１０μｌの容量に含有した。反応を酵素の添加によって開始させた。阻害剤を反応成分と短時間インキュベーションし、その後、インテグラーゼを添加した。反応を３７℃で７分間進行させ、そしてホルムアミド負荷緩衝液（９５％ホルムアミド、３０ｍＭエチレンジアミン四酢酸、０．１％キシレンシアノール、０．１％ブロモフェノールブルー、０．１％ジラウリル硫酸ナトリウムＳＤＳ）の添加によって停止させた。全体的な組込みアッセイでは、この反応を６０分間進行させ、その後、ホルムアミド色素を添加した。図５は、化合物Ｈの非存在下（レーン１）または減少量の化合物Ｈの存在下（レーン２〜７）で行われた３’−プロセシング反応の結果を表す。阻害剤の濃度は、２５μＭ（レーン２）、５μＭ（レーン３）、１μＭ（レーン４）、０．２μＭ（レーン５）、０．０４μＭ（レーン６）および０．００８μＭ（レーン７）であった。
【００８５】
鎖の転移は下記の方法でアッセイされた：３０ｎＭのＤＮＡ基質を、切断反応を行わせるために、２３０ｎＭのインテグラーゼと３７℃で５分間プレインキュベーションした。反応混合物の組成は３’−プロセシングアッセイにおける組成と同一であった。５分後に、阻害剤とともに、または阻害剤を伴うことなく、１μｌの過剰な標的ＤＮＡ（２５０ｎＭの最終濃度）を添加して、サンプルを３７℃で１時間インキュベーションした。この過剰な標的ＤＮＡにより、ウイルス基質に対するインテグラーゼのさらなる結合が競合的に阻止される。
【００８６】
反応をホルムアミド色素の添加によって停止させ、生成物を１５％変性ポリアクリルアミド／尿素ゲルで分離した。オートラジオグラフィーを、湿ったゲルをＸ線フィルム（ＣＵＲＩＸ ＲＰ１、Ａｇｆａ−Ｇｅｖａｅｒｔ（ベルギー）から入手可能）に感光させることによって行った。結果の定量を、Ｐｈｏｓｐｈｏｒｌｍａｇｅｒ装置（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用して行った。
【００８７】
これらの実験の結果を下記に表５に示す。上記で定義されるようなＩＣ５０（μＭ）値が得られる。
【００８８】
【表５】
化合物Ｃ、Ｅ、ＧおよびＨが３−プロセシング反応および全体的な組込み反応を阻害した。化合物Ｈはまた、ＤＮＡ鎖転移反応に対する強い阻害効果を有している。細胞培養において認められた抗レトロウイルス活性と、インテグラーゼアッセイにおける阻害活性との強い相関が認められた。最も良い相関が、細胞培養における阻害能と、鎖転移アッセイにおける阻害能との間で得られた（ｒ２＝０．９９８）。
【００９０】
実施例８ ５−（４−ニトロフェニル）−２，８−ジチオール−４，６−ジヒドロキシ−５Ｈ−ピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジンの速度論的切断アッセイ。
【００９１】
２０ｂｐのオリゴヌクレオチド（３０ｎＭ）を２３０ｎＭのインテグラーゼと３分間プレインキュベーションすることにより、初期の安定な複合体（ＩＳＣ）が形成された。反応混合物の組成は実施例７の３’−プロセシング反応の組成と同一であった。５，０００の分子量を有するデキストラン硫酸が０．３μＭの最終濃度で添加されたとき、オリゴヌクレオチドに対するインテグラーゼのさらなる結合が阻止された。しばらくして、５μｌアリコートを採取し、そして５μｌのホルムアミド負荷緩衝液（上記と同じ組成を有する）を使用して、反応を停止させた。切断産物へのＩＳＣの変換に対する速度定数を、式Ａ・Ｂｅ−ｋｔを使用して計算することができる。３’−プロセシングに対する化合物Ｈの阻害効果を調べるために、本発明者らは、（プレインキュベーション後にデキストラン硫酸と一緒に添加された）５０μＭの化合物の存在下で同じ実験を繰り返して、速度定数を比較した。化合物Ｈの非存在下では、速度定数は０．１５２±０．０３８ｍｉｎ−１と計算されたが、その存在下では０．１４７±０．０２５ｍｉｎ−１と計算された。この極めて類似する値により、化合物Ｈが３’−プロセシングの触媒作用に直接影響を及ぼしていることが除かれる。
【００９２】
この実験のさらなる結果が、以下を示す図６に示される。
【００９３】
【数５】
実施例９ ５−（４−ニトロフェニル）−２，８−ジチオール−４，６−ジヒドロキシ−５Ｈ−ピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジンのＨＩＶ−１インテグラーゼ結合アッセイ。
【００９５】
結合実験を、ＢＩＡｃｏｒｅ２０００（Ｂｉａｃｏｒｅ）およびストレプトアビジンが予め固定化されているセンサーチップＳＡＴＭに基づくバイオセンサー技術を使用して行った。結合実験を製造者の手順に従って３７℃で行った。結合緩衝液Ｂ（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５）は、５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２および５ｍＭのＤＴＴを含有した。最初に、３’−ビオチン化オリゴヌクレオチドの５’−ＡＣＴＧＣＴＡＧＡＧＡＴＴＴＴＣＣＡＣＡＣＴＧＡＣＴＡＡＡＡＧＧＧＴＣＡＡＡＡ−３’をセンサーチップに結合させた。続いて、相補的な３５ｍｅｒの５’−ＧＡＣＣＣＴＴＴＴＡＧＴＣＡＧＴＧＴＧＧＡＡＡＡＴＣＴＣＴＡＧＣＡＧＴ−３’を捕捉されたオリゴヌクレオチドにハイブリダイゼーションさせて、インテグラーゼの認識配列を自由端で生じさせた。ＨＩＶ−１インテグラーゼ（３３μＭ溶液の１００μｌ）を希釈緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ．ＨＣｌ（ｐＨ７．５）／７５０ｍＭのＮａＣｌ／１０％グリセロール／１ｍＭのβ−メルカプトエタノール）で１０倍希釈し、そして緩衝液Ｂでさらに１０倍希釈して、１０μｌ／分の流速で、３３０ｎＭの最終濃度で注入し、最初にブランク流路に通し、次いで特異的なオリゴヌクレオチドを有する流路に通した。ブランク流路における特異的な吸収を差し引いた。インテグラーゼを９３μＭの化合物Ｈとプレインキュベーションした後では、ＤＮＡに対するインテグラーゼの結合は完全に破壊されていた。
【００９６】
実施例１０ ５−（４−ニトロフェニル）−２，８−ジチオール−４，６−ジヒドロキシ−５Ｈ−ピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジンは二本鎖ＤＮＡ内にインターカレーションしない。
【００９７】
インターカレーターは、２つの連続した塩基対の間に進入することによって二重らせんを安定化させることが知られているので、本発明者らは、化合物Ｈが二本鎖ＤＮＡにインターカレーションし得るかどうかを確認した。この安定化は、（二本鎖の５０％が２つの一本鎖に解離する温度として定義される）二本鎖の融解温度の上昇によって反映される。本発明者らは、それぞれのオリゴデオキシヌクレオチドについて１μＭの固定された濃度でのインビトロ組込みアッセイから得られる二本鎖ＤＮＡ（ＩＮＴ１−ＩＮＴ２）を使用した。連続希釈した化合物Ｈ（２５μＭ、５μＭ、１μＭ、０．２μＭ、０．０４μＭおよび０μＭ）を、ＩＮＴ１−ＩＮＴ２を含有する種々のキュベットに加え、そして吸光度を２６０ｎｍでモニターしながら、その温度を最初に１５℃から８０℃まで徐々に上昇させ（０．２℃／分）、その後、同じ速度で１５℃に低下させた。融解曲線は、Ｖａｒｉａｎ ＣＡＲＹ３００バイオ分光光度計を用いて決定された。キュベットは、キュベットホルダーを通って循環する水によって温度調節され、そして溶液の温度が、キュベット内に直接浸けられたサーミスターを用いて測定された。温度制御およびデータ取得はＣｏｍｐａｑデスクトップコンピューターを用いて自動的に行われた。サンプルは、０．２℃／分の速度で、最初に加熱され、次いで冷却された。融解曲線は、Ｔｍを示す変曲点を有する一次導関数を採用して評価された。変動性は０．５℃未満であった。
【００９８】
このようにして測定された融点は、様々な濃度の化合物Ｈの存在下で影響を受けず（５９℃で）一定であった。このことは、化合物Ｈがインターカレーションにより二本鎖ＤＮＡを安定化させないことを明瞭に示している。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明で使用されたピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジン誘導体に対する添加時間実験におけるウイルス産生の結果を、他のレトロウイルス剤と比較して表す。
【図２】図２は、ジドブジンおよび本発明で使用されたピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジン誘導体の阻害濃度分率が、ＭＴ−４細胞において誘導されるＨＩＶ−１の細胞変性効果に対するこれらの化合物の混合阻害作用においてプロットされるアイソボログラムを表す。
【図３】図３は、ネルフィナビルおよび本発明で使用されたピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジン誘導体の阻害濃度分率が、ＭＴ−４細胞において誘導されるＨＩＶ−１の細胞変性効果に対するこれらの化合物の混合阻害作用においてプロットされるアイソボログラムを表す。
【図４】図４は、ネビラピンおよび本発明で使用されたピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジン誘導体の阻害濃度分率が、ＭＴ−４細胞において誘導されるＨＩＶ−１の細胞変性効果に対するこれらの化合物の混合阻害作用においてプロットされるアイソボログラムを表す。
【図５】図５は、本発明で使用されたピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジン誘導体によるＨＩＶ−１インテグラーゼ活性の阻害を示す。
【図６】図６は、本発明で使用されたピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジン誘導体の非存在下または存在下における速度論的切断反応の結果を示す。
Claims (46)
- 哺乳動物におけるレトロウイルス感染症に対する相乗効果をもたらすためなどにそれぞれの割合で、
（ａ）１つ以上のピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジン誘導体、および
（ｂ）１つ以上の抗レトロウイルス薬
を含む組成物の使用。 - 哺乳動物におけるレトロウイルス感染症を処置するための医薬品を製造するために、前記処置における相乗効果をもたらすためなどにそれぞれの割合で、
（ａ）１つ以上のピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジン誘導体、および
（ｂ）レトロウイルスの進入および／または複製に関与する１つ以上のレトロウイルスタンパク質または細胞タンパク質に対して効果的な１つ以上の薬物
を含む組成物の使用。 - レトロウイルス感染症がレンチウイルス感染症である、請求項１または請求項２に記載の方法。
- レトロウイルス感染症がＨＩＶ感染症である、請求項１または請求項２に記載の方法。
- 前記ピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジン誘導体が、下記の式を有する化合物：
・Ｘは、ヒドロキシ、ハロおよびチオールから選択され、
・Ｙは、ヒドロキシ、メトキシおよびハロから選択され、そして
・Ｚは、水素、ハロおよびニトロから選択される）
その薬学的に受容可能な付加塩または立体化学的異性体である、請求項１〜４のいずれかに記載の使用。 - 前記ピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジン誘導体が５−（４−ニトロフェニル）−２，８−ジチオール−４，６−ジヒドロキシ−５Ｈ−ピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジンである、請求項１〜５のいずれかに記載の使用。
- 前記薬物（ｂ）の１つが逆転写酵素阻害剤である、請求項１〜６のいずれかに記載の使用。
- 前記薬物（ｂ）の１つがプロテアーゼ阻害剤である、請求項１〜７のいずれかに記載の使用。
- 前記薬物（ｂ）の１つがピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジン誘導体とは異なるインテグラーゼ阻害剤である、請求項１〜８のいずれかに記載の使用。
- 医薬品としての、
（ａ）１つ以上のピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジン誘導体、および
（ｂ）レトロウイルスの進入および／または複製に関与する１つ以上のレトロウイルスタンパク質または細胞タンパク質に対して効果的な薬物を含む１つ以上の抗レトロウイルス薬
を含む組成物の使用。 - レトロウイルス感染症の治療において同時または個別または連続的に使用される混合調製物として、哺乳動物におけるレトロウイルス感染症に対する相乗効果をもたらすためなどにそれぞれの割合で、
（ａ）１つ以上のピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジン誘導体、および
（ｂ）レトロウイルスの進入および／または複製に関与する１つ以上のレトロウイルスタンパク質または細胞タンパク質に対して効果的な薬物を含む１つ以上の抗レトロウイルス薬
を含有する製造物。 - 前記薬物（ｂ）の１つがプロテアーゼ阻害剤である、請求項１１に記載の製造物。
- 前記薬物（ｂ）の１つが逆転写酵素阻害剤である、請求項１１または請求項１２に記載の製造物。
- 前記薬物（ｂ）の１つがピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジン誘導体とは異なるインテグラーゼ阻害剤である、請求項１１〜１３のいずれかに記載の製造物。
- レトロウイルス感染症がレンチウイルス感染症である、請求項１１〜１４のいずれかに記載の製造物。
- レトロウイルス感染症がＨＩＶ感染症である、請求項１１〜１４のいずれかに記載の製造物。
- 前記ピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジン誘導体が、下記の式を有する化合物：
・Ｘは、ヒドロキシ、ハロおよびチオールから選択され、
・Ｙは、ヒドロキシ、メトキシおよびハロから選択され、そして
・Ｚは、水素、ハロおよびニトロから選択される）
その薬学的に受容可能な付加塩または立体化学的異性体である、請求項１１〜１６のいずれかに記載の製造物。 - 前記ピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジン誘導体が５−（４−ニトロフェニル）−２，８−ジチオール−４，６−ジヒドロキシ−５Ｈ−ピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジンである、請求項１１〜１７のいずれかに記載の製造物。
- （ａ）および（ｂ）の少なくとも１つが少なくとも薬学的に受容可能なキャリアと混合されている薬学的調製物の形態である、請求項１１〜１８のいずれかに記載の製造物。
- 哺乳動物におけるレトロウイルス感染症を処置するための方法であって、レトロウイルス感染症に対する相乗効果をもたらすためなどにそれぞれの割合で、
（ａ）１つ以上のピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジン誘導体、および
（ｂ）レトロウイルスの進入および／または複製に関与する１つ以上のレトロウイルスタンパク質または細胞タンパク質に対して効果的な薬物を含む１つ以上の抗レトロウイルス薬
を含む混合された治療調製物の効果的な量を、そのような処置を必要とする哺乳動物に同時または別個または連続的に投与することを含む方法。 - レンチウイルス感染症を処置するための請求項２０に記載の方法。
- ＨＩＶ感染症を処置するための請求項２０または請求項２１に記載の方法。
- 治療調製物の効果的な量がレトロウイルス酵素阻害量である、請求項２０〜２２のいずれかに記載の方法。
- 治療調製物の効果的な量が誘導体（ａ）のインテグラーゼ阻害量および薬物（ｂ）のレトロウイルス酵素阻害量である、請求項２０〜２２のいずれかに記載の方法。
- 記薬物（ｂ）の１つがプロテアーゼ阻害剤であり、治療調製物の効果的な量が誘導体（ａ）のインテグラーゼ阻害量および薬物（ｂ）のプロテアーゼ阻害量である、請求項２０〜２２のいずれかに記載の方法。
- 前記薬物（ｂ）の１つが逆転写酵素阻害剤であり、治療調製物の効果的な量が誘導体（ａ）のインテグラーゼ阻害量および薬物（ｂ）の逆転写酵素阻害量である、請求項２０〜２２のいずれかに記載の方法。
- 前記薬物（ｂ）の１つがピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジン誘導体とは異なるインテグラーゼ阻害剤であり、治療調製物の効果的な量が誘導体（ａ）のインテグラーゼ阻害量および薬物（ｂ）のインテグラーゼ阻害量である、請求項２０〜２２のいずれかに記載の方法。
- 前記ピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジン誘導体が、下記の式を有する化合物：
・Ｘは、ヒドロキシ、ハロおよびチオールから選択され、
・Ｙは、ヒドロキシ、メトキシおよびハロから選択され、そして
・Ｚは、水素、ハロおよびニトロから選択される）
その薬学的に受容可能な付加塩または立体化学的異性体である、請求項２０〜２７のいずれかに記載の方法。 - 前記ピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジン誘導体が５−（４−ニトロフェニル）−２，８−ジチオール−４，６−ジヒドロキシ−５Ｈ−ピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジンである、請求項２０〜２８のいずれかに記載の方法。
- 哺乳動物におけるレトロウイルス感染症を処置するための医薬品を製造するための、ピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジン誘導体の使用。
- 医薬品が、レンチウイルス感染症を処置するためのものである、請求項３０に記載の使用。
- 医薬品が、ＨＩＶ感染症を処置するためのものである、請求項３０または請求項３１に記載の使用。
- レトロウイルス酵素の阻害剤としてのピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジン誘導体の使用。
- 前記レトロウイルス酵素がインテグラーゼである、請求項３３に記載の使用。
- 前記レトロウイルス酵素がＨＩＶ−１のインテグラーゼである、請求項３３または請求項３４に記載の使用。
- 前記レトロウイルス酵素が逆転写酵素である、請求項３３に記載の使用。
- 前記レトロウイルス酵素がＨＩＶ−１の逆転写酵素である、請求項３３または請求項３４に記載の使用。
- 前記ピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジン誘導体が、下記の式を有する化合物：
・Ｘは、ヒドロキシ、ハロおよびチオールから選択され、
・Ｙは、ヒドロキシ、メトキシおよびハロから選択され、そして
・Ｚは、水素、ハロおよびニトロから選択される）
その薬学的に受容可能な付加塩または立体化学的異性体である、請求項３０〜３７のいずれかに記載の方法。 - 前記ピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジン誘導体が５−（４−ニトロフェニル）−２，８−ジチオール−４，６−ジヒドロキシ−５Ｈ−ピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジンである、請求項３０〜３８のいずれかに記載の方法。
- 哺乳動物におけるレトロウイルス感染症を処置するための方法であって、そのような処置を必要とする哺乳動物にピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジン誘導体の効果的な量を投与することを含む方法。
- レンチウイルス感染症を処置するための請求項４０に記載の方法。
- ＨＩＶ感染症を処置するための請求項４０または請求項４１に記載の方法。
- 効果的な量がレトロウイルス酵素阻害量である、請求項４０〜４２のいずれかに記載の方法。
- 効果的な量がインテグラーゼ阻害量である、請求項４０〜４２のいずれかに記載の方法。
- 前記ピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジン誘導体が、下記の式を有する化合物：
・Ｘは、ヒドロキシ、ハロおよびチオールから選択され、
・Ｙは、ヒドロキシ、メトキシおよびハロから選択され、そして
・Ｚは、水素、ハロおよびニトロから選択される）
その薬学的に受容可能な付加塩または立体化学的異性体である、請求項４０〜４４のいずれかに記載の方法。 - 前記ピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジン誘導体が５−（４−ニトロフェニル）−２，８−ジチオール−４，６−ジヒドロキシ−５Ｈ−ピラノ［２，３−ｄ：６，５−ｄ’］ジピリミジンである、請求項４０〜４５のいずれかに記載の方法。
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