DE60114844T2

DE60114844T2 - Pharmazeutische zusammensetzung und verfahren zur behandlung von retroviralen infektionen

Info

Publication number: DE60114844T2
Application number: DE60114844T
Authority: DE
Inventors: Erik De Clercq; Zeger Debyser; Willem Plymers; Christophe Pannecouque; Myriam Witvrouw
Original assignee: Stichting Rega VZW
Current assignee: Stichting Rega VZW
Priority date: 2000-07-07
Filing date: 2001-07-09
Publication date: 2006-07-27
Anticipated expiration: 2021-07-10
Also published as: EP1309349B1; DE60114844D1; WO2002003971A3; WO2002003971A2; JP2004502727A; CA2414455A1; ATE308995T1; AU2001278475A1; ES2253407T3; EP1309349A2

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft pharmazeutische Zusammensetzungen und ihre Anwendung zur Behandlung von retroviralen Infektionen in Säugetieren. Sie betrifft insbesondere die Verwendung bestimmter Pyrano[2,3-d:6,5-d']dipyrimidinderivate zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von retroviralen Infektionen in Säugetieren. Sie betrifft in einer weiteren Ausführungsform die Verwendung dieser Derivate in Kombination mit einem oder mehreren Arzneistoffen, die gegen ein oder mehrere zelluläre oder retrovirale Proteine wirksam sind, beispielsweise retrovirale Enzyminhibitoren.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Replikation des humanen Immundeffizienzvirustyp 1 (hierin als HIV-1 bezeichnet) kann in infizierten Patienten durch Kombinieren wirkungsvoller antiviraler Arzneistoffe reduziert werden, die gegen viele virale Ziele wirksam sind, wie es von Vandamme et al. in Antiviral Chem. Chemother. (1998) 9: 187–203 zusammengefaßt ist. Arzneistoffe, die formal zur Behandlung von HIV-infizierten Patienten zugelassen wurden, gehören zur Klasse der reverse Transkriptase(RT)-Inhibitoren (Nukleoside und Nicht-Nukleoside) oder der Proteaseinhibitoren. Multiple-Arzneistoffkombinationsvorschriften können die Virusbelastung auf unterhalb der Nachweisgrenze der empfindlichsten Tests reduzieren. Nichtsdestotrotz tritt eine anhaltende Replikation auf niedrigem Niveau, möglicherweise an Zufluchtsorten, ein, was zur Entstehung arzneistoffresistenter Stämme führt, siehe Perelson et al. in Nature (1997) 387: 12–124. Darüber hinaus kann HIV eine Resistenz gegenüber den meisten, wenn nicht allen, gegenwärtig zugelassenen antiviralen Arzneistoffen entwickeln, siehe Schmit et al. in J. Infect. Dis. (1996) 174: 962–968.
Das einzige Enzym, das zur HIV-1 Integration erforderlich ist, ist Integrase (hierin nachstehend als IN bezeichnet), ein Protein von 32' kDa, das am 3'-Ende pol-Gens kodiert ist, zusammengefaßt von Brown in Retroviruses (1997), Coffin, Hughes und Varmus, Herausgeber (Cold Spring Harbor Laboratory Press USA), Seiten 161–203. Das Enzym wird durch eine Protease-vermittelte Spaltung des gag-pol Vorläufers während der Virion-Reifung erzeugt. Die Integrase erkennt spezifische Sequenzen in der langen terminalen Wiederholungs(hierin als LTR bezeichnet)-Elementen der viralen cDNA. Die terminalen 15 bp des LTRs sind für eine ortsspezifische Spaltung und Integration notwendig und ausreichend.
Das hochkonservierte Dinukleotid CA, das sich ummittelbar stromaufwärts der Spaltstelle befindet, ist für die Enzymaktivität entscheidend. Im ersten Schritt der Integrationsreaktion, die 3'-Endprozessierung genannt wird, werden zwei Nukleotide von jedem 3'-Ende entfernt, so daß neue 3'-Hydroxylenden erzeugt werden (CA-3'-OH). Diese Reaktion tritt im Cytoplasma in einem großen viralen Nukleoproteinkomplex auf, der als Pre-Integrationskomplex (hierin nachstehend als PIC bezeichnet) bezeichnet wird, siehe Miller et al. in J. Virol. (1997) 71: 5382–5390. Nach Eindringen in den Kern wird die prozessierte virale doppelsträngige DNA an die Wirtsziel-DNA gebunden. Die Bindungsreaktion schließt eine gekoppelte 5 bp Staffelspaltung der Zielwirts-DNA und die Ligation der prozessierten CA-3'-OH viralen DNA-Enden an die 5'-O-Phosphatenden der Ziel-DNA ein. Die Reparatur der verbleibenden Lücken wird, obwohl dies zum gegenwärtigen Zeitpunkt nicht voll verstanden wird, wahrscheinlich durch Wirtszell-DNA Reparaturenzyme erreicht, obwohl retrovirale Enzyme angenommenerweise mit verwickelt sind, siehe Chow et al. in Science (1992) 255: 723–726.
Auf Grundlage von Teilproteolyseexperimenten kann HIV-IN in drei funktionelle Domänen unterteilt werden. Die N-terminale Domäne (die die Reste 1 bis 50 umfaßt), ist durch eine HHCC „Zinkfinger"-artige Sequenz charakterisiert (d. h. enthält 2 Histidine und 2 Cysteine, die Zn²⁺ binden), ihre exakte Funktion bleibt jedoch unbekannt. Die zentrale Kerndomäne (die die Reste 50 bis 212 umfaßt) ist durch drei Aminosäurereste (Asp64, Asp116 und Glu152) charakterisiert, die in der Integrasesuperfamilie und in den Polynukleotidtransferasen hochkonserviert sind und die die katalytische Domäne sowohl für die 3'-Prozessierung als auch die DNA Strang-Transferaktivitäten repräsentieren. Die zentrale Kerndomäne alleine kann eine scheinbare Umkehrung der DNA Strang-Transferreaktion in vitro, die sogenannte Desintegrationsreaktion, durchführen. Jedoch sind sowohl die amino- als auch die carboxyterminalen Domänen für die Katalyse einer 3'-Prozessierung und eines Strangtransfers notwendig. Eine einzelne Aminosäuresubstitution (F185K) innerhalb der katalytischen Kerndomäne erzeugt ein lösliches Protein, das es der Kerndomäne ermöglicht hat, zu kristallisieren und die dreidimensionale Struktur (hierin als 3D-Struktur bezeichnet) zu lösen, siehe Dyda et al. in Science (1994) 266: 1981–1986. Die C-terminale Domäne (die die Reste 212 bis 288 umfaßt) ist in eine unspezifische DNA-Bindung involviert. Kernmagnetresonanz(hierin als NMR bezeichnet)-Strukturen einer trunkierten C-terminalen Domäne wurden bestimmt. Komplementierungsstudien mit IN Proteinen, die in den unterschiedlichen Domänen mutiert waren, legen nahe, daß die aktive Form von IN ein Oligomer ist, obwohl die exakte Stöchiometrie unbekannt bleibt.
Die Etablierung von high-throughput Mikrotiterplattenassays und die Erklärung der 3D-Struktur der katalytischen Domäne von HIV-1 IN ermöglichten die Entwicklung von IN Inhibitoren durch Screening chemischer Bibliotheken oder durch strukturbasiertes Design. Obwohl die Auswertung von IN Inhibitoren in ziemlich schwerfälligen PIC Assays diskutiert wurde (beispielsweise von Farnet et al. in Proc. Natl. Acad. Sci USA (1996) 93: 9742–9747), wird die IN Hemmung typischerweise in oligonukleotidbasierten Assays unter Verwendung von LTR Mimetica festgestellt, um sowohl die Prozessierungs- als auch die Bindungsreaktionen in vitro zu evaluieren, wie es beispielsweise von Sherman et al. in Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990) 87: 5119–5123 und Bushman et al. in Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991) 88: 1339–1343, offenbart ist. Es wurde von unterschiedlichen Klassen von HIV-1 IN Inhibitoren berichtet, siehe Y. Pommier et al. in Antiviral Research (2000) 47: 139–148 und diese schließen (i) mono-, di-, iso- und längere Oligonukleotide und Analoge hiervon, (ii) hydroxylierte aromatische Verbindungen, (iii) mit der DNA interagierende Mittel (Liganden) und (iv) Polypeptide und Antikörper ein. Jedoch zeigten die meisten dieser Verbindungen in Zellkultur keine antivirale Aktivität. Für die meisten der IN Inhibitoren, die eine antivirale Aktivität in einer Zellkultur zeigten, wurde nicht unzweifelhaft demonstriert, daß der Integrationsschritt zielgerichtet erfolgte. Die einzigen authentischen IN selektiven Inhibitoren, von denen bisher berichtet wurde, sind Diketosäure-Derivate, gemäß Hazuda et al. in Science (2000) 287: 646–650.
Nukleotide, wie beispielsweise 3',5-Diazido-2',3'-didesoxyuridin-5'-monophosphat (bezeichnet al 5-N₃-AZUMP) stören die enzymatische Aktivität von IN wahrscheinlich durch eine Interaktion mit der Nukleotidbindungsstelle, insbesondere durch Bindung an die α-4 Helix der HIV-1 Kerndomäne. Struktur-Aktivitätsstudien verschiedener Nukleotidanaloga wurden berichtet. Obwohl die zur Hemmung erforderliche Konzentration hoch war (IC₅₀ = 150 μm) konnte nicht ausgeschlossen werden, daß die IN-Hemmung zur antiviralen Wirkung von AZT beitragen kann, weil Konzentrationen von bis zu 1 mM 5-N₃-AZUMP in Zellen akkumulieren können, siehe Furman et al. in Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) 83: 8333–7.
Es wurde ebenfalls von Dinukleotiden als wirkungsvollen Inhibitoren von HIV-1 IN berichtet, sogar in Abwesenheit von 5'-O-Phosphorylierung, jedoch zeigte keines eine antivirale Wirkung, wie von Mazumder et al. in Mol. Pharmacol. (1997) 51: 567–75 berichtet wurde.
Oligonukleotide, die vier-strängige Guanosin-Quartettstrukturen bilden, sind wirkungsvolle Inhibitoren der HIV Replikation in Zellkultur (gemäß Ojwang et al. in Antimicrob. Agents Chemother. (1995) 39: 2426–2435), jedoch wurde durch Selektieren und Sequenzieren von arzneistoffresistenten Stämmen (von Cherepanov et al. in Mol. Pharmacol. (1997) 52: 771–780) klar gezeigt, obwohl G-Quartette die HIV IN Aktivität im nanomolaren Bereich hemmen, dass deren antivirale Wirksamkeit in Zellkultur auf die Hemmung des Eintritts von Viren eher als auf eine HIV IN Aktivität zurückzuführen ist.
Viele polyhydroxylierte aromatische Verbindungen (einschließlich von Flavonen, Tyrphostinen, Lignanen, Anthrachinonen und Biscatecholen, die alle durch zwei benachbarte Hydroxylgruppen am aromatischen Ring gekennzeichnet sind), wurden als Inhibitoren von HIV-1 IN in vitro bezeichnet. Drei mögliche Wirkmechanismen wurden vorgeschlagen (siehe Pommier et al. oben erwähnt). Catechole können die Koordination von Metallionen, die für die Phosphoryltransfer-Reaktionen im aktiven Zentrum bzw. aktiven Ort erforderlich sind, stören. Die Oxidation von Catecholen in vivo können reaktive Chinon-Spezies ergeben oder die Hydroxylgruppen können als Wasserstoffbrücken-Spender zur Interaktion mit dem Enzym dienen. Von hydroxylierten Aromatika, die keine Orthohydroxylgruppen enthalten, wie beispielsweise Curcumin, Coumermycin und Bis-Cumarine, jedoch die IN-Aktivität hemmen, wurde ebenfalls berichtet. Unter Verwendung einer Molekülmodellierung wurden Pharmacophore unter den bekannten hydroxylierten aromatischen Inhibitoren identifiziert, die zur Entdeckung neuer Leitverbindungen führen können, siehe Neamati et al. in Mol. Pharmacol. (1997) 53: 1041–1055. Jedoch wird die antivirale Wirksamkeit der Inhibitoren vom Catechol-Typ in Zellkultur durch eine inhärente zelluläre Toxizität verschlechtert.
Es wurde kürzlich von Robinson et al. in Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996) 93: 6326–6331 berichtet, daß Dicaffeoylchininsäure und L-Chicorsäure (L-CA) Derivate die HIV-1 IN in vitro und HIV-1 Replikation in Zellkultur hemmen. Ein HIV-1 Stamm, der gegenüber L-Chicorsäure resistent ist, wurde ausgewählt und eine Mutation wurde auf das IN-Gen (G140S) kartiert. Wir haben kürzlich HIV-1 Stämme ausgewählt, die gegenüber L-CA resistent sind und Mutationen in gp120 anstelle des IN Genes enthalten. Darüber hinaus wurde rekombinantes IN, das die G140S Mutation trug, im selben Umfang von L-CA als das Wildtypenzym gemäß Pluymers et al. (2000) gehemmt.
Dieketosäurederivate hemmen die HIV-1 Replikation in mikromolaren Konzentrationen durch eine spezifische Hemmung des DNA Strang-Transferschrittes, wie es von Hazuda et al. (oben erwähnt) berichtet wurde. Resistente Virusstämme, die in Gegenwart dieser Verbindungen selektiert wurden, trugen Mutation im IN Gen. Wenn diese in IN eingebracht wurden, verliehen diese Mutationen eine Teilresistenz gegenüber den Arzneistoffen.
Viele DNA Bindungsmittel bzw. bindende Mittel erwiesen sich ebenfalls als Hemmer von HIV-1 IN, vermutlich aufgrund einer unspezifischen Interaktion mit der DNA Bindungsdomäne des Enzyms. DNA Interkalatoren und DNA-Rinnenbinder, wie beispielsweise Netropsin, gehören zu dieser Kategorie. DNA Liganden, die Dreifachhelices in speziellen Regionen des LTR bilden, beispielsweise durch Bindung an ein interkalierendes Oxazolopyridoncarbazol können als U3-spezifische oder U5-spezifische LTR Bindungsinhibitoren von HIV-1 IN dienen. Eine 30-mer Peptid, das den Aminosäuren 147–175 von HIV-1 IN entspricht, zeigte sich ebenfalls als Hemmer der IN-Aktivität in minimolaren Konzentration. Die intrazelluläre Expression von einkettigen variablen Fragmenten gegen IN-Domänen hemmt frühe Stadien des viralen Replikationszyklus. Polypeptide, wie beispielsweise Elemente der Familie der Ribosomen inaktivierenden Proteine (RIPs) wurden als potente Inhibitoren von HIV-1 IN beschrieben, es wurde jedoch nicht gezeigt, daß die Interferenz mit IN der Schlüsselmechanismus für ihre antivirale Aktivität ist.
Die Internationale Patentveröffentlichung WO 99/25718 offenbart eine Klasse von Derivaten von Pyrano[2,3-d:6,5-d']dipyrimidin, von denen angenommen wird, daß sie in Pharmakologie, in der Veterinärwissenschaft der Kosmetologie von Nutzen sind, und die insbesondere antimikrobielle, antivirale (bezüglich Herpes Simplexvirus), antichlamydiale und immunstimulierende (als Induktoren von Interferon) Aktivitäten aufweisen und die zur Behandlung opportunistischer Erkrankungen bei Patienten, die unter einem Immunmangel leiden, von Nutzen sind.
Als Zusammenfassung besteht nach wie vor ein dringender Bedarf im Stand der Technik nach wirkungsvollen Inhibitoren, die selektiv retrovirale RT und/oder IN als Ziel definieren und die ebenfalls antiviral sind. Deswegen ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, diesem dringenden Bedarf durch Identifizieren effizienter und harmloser pharmazeutisch aktiver Inhaltsstoffe und einer Kombination von Inhaltsstoffen zur Behandlung von retroviralen Infektionen, insbesondere lentiviralen Infektionen und insbesondere HIV-Infektionen in Säugetieren und in Menschen, entgegenzukommen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Im Bestreben, die Therapie retroviraler Infektionen zu verbessern, insbesondere von lentiviralen Infektionen und insbesondere von HIV-Infektionen bei Säugetieren und bei Menschen, um die virale Replikation noch weiter zu reduzieren und um auch retrovirale Stämme zu bewältigen, die gegenüber multiplen Arzneistoffen resistent sind, war es wünschenswert, eine Suche nach effektiven Inhibitoren des dritten viralen Enzyms, der Integrase (HIV-IN), zu starten. Dieses Enzym ist für die Einfügung der viralen cDNA in das Wirtszellchromosom verantwortlich, ein essentieller Schritt für die Replikation des Virus. Dieses Enzym ist für die Einfügung der viralen cDNA in das Wirtszellchromosom verantwortlich und ist ein essentieller Schritt für die Replikation des Virus. Weil kein humanes Gegenstück des Enzyms bis jetzt bekannt ist, besteht ein beträchtliches Interesse an der Entwicklung wirksamer und vorzugsweise selektiver Inhibitoren des HIV-Integrationsprozesses.
Die vorliegende Erfindung basiert auf der unerwarteten Entdeckung der Hemmung der retroviralen, insbesondere HIV-1 Integraseaktivität durch bestimmte Derivate von Pyrano[2,3-d:6,5-d']dipyrimidin, wobei diese Verbindungen ebenfalls einen Schutz gegen eine Replikation von HIV in Zellkultur zeigen, und ebenfalls dazu in der Lage sind, eine synergistische Wirkung gegen eine retrovirale Infektion zu zeigen (insbesondere eine lentivirale Infektion) in Säugetier und humanen Zellkulturen, wenn sie in Verbindung mit einem oder mehreren antiretroviralen Arzneistoffen verwendet werden, beispielsweise Arzneistoffe, die gegen ein oder mehrere retrovirale oder zelluläre Proteine wirksam sind, die in das Eindringen und/oder die Replikation von Retroviren involviert sind (bezüglich eines Überblicks siehe Antivirals against AIDS (2000), M. Dekker, Inc.), wie beispielsweise:

– retrovirale Enzyminhibitoren, wie hierin nachstehend ausgeführt werden wird,
– Arzneistoffe, die gegen nichtenzymatische, retrovirale Proteine wirksam sind (glycosyliert oder nicht), die in die Replikation eines Retrovirus involviert sind oder für diese essentiell sind (beispielsweise HIV gp120), beispielsweise das Immunogen auf Grundlage des gp120 Hüllantigens, diskutiert in Nature (2001) 410: 966, und
– Arzneistoffe, die ein Protein blockieren (beispielsweise einen Rezeptor oder eine zelluläre Verbindung), das in das Eindringen eines Retrovirus involviert ist oder für dieses essentiell ist, beispielsweise CCR5 Inhibitoren (wie beispielsweise das TAK-779 Molekül, offenbart von Dragic et al. in Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97: 5639–44).

Derartige biologische Eigenschaften oder eine Kombination von Eigenschaften machen diese zu einem besonders attraktiven, pharmazeutisch aktiven Inhaltsstoff, nämlich in der sogenannten Kombinationstherapie von HIV-Infektionen bei Menschen.
Deswegen betrifft die vorliegende Erfindung in ihrer weiteren Bedeutung die Verwendung eines Derivates eines Pyrano[2,3-d:6,5-d']dipyrimidins zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung einer retroviralen Infektion in retrovirusinfizierten Patienten, insbesondere lentivirusinfizierten Patienten und insbesondere von HIV-infizierten Patienten.
In einer weiteren Ausführungsform basiert die vorliegende Erfindung ebenfalls auf der unerwarteten Entdeckung einer (sub)synergistischen Wirkung (wie sie hierin nachstehend definiert wird) gegen retrovirale Infektionen in humaner Zellkultur, wenn sie in Kombination mit einem oder mehreren antiretroviralen Arzneistoffen, wie beispielsweise Inhibitoren der reversen Transkriptase oder von Proteaseinhibitoren verwendet werden. Die synergistischen Eigenschaften machen diese insbesondere in der sogenannten Kombinationstherapie von HIV-Infektionen in Menschen besonders nützlich.
Es ist von Bedeutung zu erwähnen, daß die internationale Patentveröffentlichung WO 99/25781, die oben diskutiert wurde, keine Wirksamkeit bzw. Aktivität dieser Verbindungen gegen HIV oder irgendeine retrovirale Enzymhemmung nahelegt und die Behandlung einer Immundeffizienz selbst nicht nahelegt, sondern nur die Folgen hiervon bei immundefizienten Patienten.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 repräsentiert das Ergebnis der Virusproduktion in einem Zeit-des-Zusatzes-Experimentes für ein Derivat von Pyrano[2,3-d:6,5-d']dipyrimidin, das in dieser Erfindung verwendet wurde, im Vergleich mit anderen retroviralen Mitteln.
2 repräsentiert eine Isobologramm-Plotting der Franktions-Hemmkonzentrationen von Zidovudin und eines Derivates von Pyrano[2,3-d:6,5-d']dipyrimidin, das in dieser Erfindung verwendet wird, in der kombinierten Hemmwirkung dieser Erfindungen auf die cytopathische Wirkung von HIV-1, die in MT-4 Zellen induziert wurde.
3 repräsentiert ein Isobologramm-Plotting der Fraktionshemmkonzentrationen von Nelfinavir und eines Derivates von Pyrano[2,3-d:6,5-d']dipyrimidin, das in dieser Erfindung in der kombinierten Hemmaktion dieser Verbindungen auf die cytopathische Wirkung von HIV-1, die in MT-4 Zellen induziert wurde, verwendet wurde.
4 repräsentiert ein Isobologramm-Plotting der Fraktionshemmkonzentrationen von Nevirapin und eines Derivates von Pyrano[2,3-d:6,5-d']dipyrimidin, das in dieser Erfindung in der kombinierten Hemmwirkung dieser Verbindungen auf die cytopathische Wirkung von HIV-1, induziert in MT-4 Zellen, verwendet wurde.
5 zeigt die Hemmung der HIV-1 Integraseaktivität mittels eines Derivates von Pyrano[2,3-d:6,5-d']dipyrimidin, das in dieser Erfindung verwendet wurde.
6 zeigt die Ergebnisse einer kinetischen Spaltreaktion in Abwesenheit oder Anwesenheit eines Derivates von Pyran[2,3-d:6,5-d']dipyrimidin, das in dieser Erfindung verwendet wurde.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines Derivates eines Pyrano[2,3-d:6,5-d']dipyrimidins zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung einer retroviralen Infektion, insbesondere einer lentiviralen Infektion und insbesondere einer HIV-Infektion bei einem Säugetier.
Gemäß einem zweiten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung einer Zusammensetzung bereit, die (a) ein oder mehrere Derivate von Pyrano[2,3-d:6,5-d']dipyrimidin und (b) ein oder mehrere antiretrovirale Mittel umfaßt, einschließlich von Arzneistoffen, die gegen ein oder mehrere retrovirale oder zelluläre Proteine wirksam sind, die in das Eindringen und/oder die Replikation eines Retrovirus (beispielsweise von retroviralen Enzyminhibitoren) als Medikament (oder zur Herstellung eines Medikamentes) involviert sind, vorzugsweise gegen (oder zur Behandlung von) eine(r) retroviralen Infektion in einem Säugetier und insbesondere in jeweiligen Anteilen, um eine synergistische Wirkung gegen (oder in der Behandlung von) einer retroviralen Infektion in einem Säugetier bereitzustellen. Gemäß eines dritten Aspektes betrifft die vorliegende Erfindung ein Produkt, das (a) ein oder mehrere Derivate von Pyrano[2,3-d:6,5-d']dipyrimidin und (b) ein oder mehrere antiretrovirale Arzneistoffe enthält, einschließlich von Arzneistoffen, die gegen ein oder mehrere retrovirale oder zelluläre Proteine wirksam sind, die in das Eindringen und/oder die Replikation eines Retrovirus (beispielsweise von retroviralen Enzyminhibitoren) involviert sind, vorzugsweise in solchen Anteilen, dass eine synergistische Wirkung gegen eine retrovirale Infektion in einem Säugetier bereitgestellt wird, als Kombinationszubereitung zur simultanen, getrennten oder aufeinanderfolgenden Anwendung in der retroviralen Infektionstherapie. Gemäß eines vierten Aspektes stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung einer wirksamen Menge einer kombinierten therapeutischen Zubereitung, die (a) ein oder mehrere Derivate von Pyrano[2,3-d:6,5-d']dipyrimidin und (b) ein oder mehrere antiretrovirale Arzneistoffe umfaßt, einschließlich von Arzneistoffen, die gegen ein oder mehrere retrovirale oder zelluläre Proteine wirksam sind, die in das Eintreten und/oder die Replikation eines Retrovirus (beispielsweise von retroviralen Enzyminhibitoren) in jeweiligen Anteilen einschließen, so daß eine synergistische Wirkung gegen eine retrovirale Infektion bereitgestellt wird, zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung einer retroviralen Infektion in einem Säugetier bereit, was eine simultane, getrennte oder aufeinanderfolgende Verabreichung an das Säugetier, das einer solchen Behandlung bedarf, einschliesst.
In den verschiedenen Aspekten der vorliegenden Erfindung ist die retrovirale Infektion, die behandelt werden soll, vorzugsweise eine lentivirale und besonders bevorzugt eine HIV-Infektion.
In den verschiedenen Aspekten der vorliegenden Erfindung ist das Pyrano[2,3-d:6,5-d']dipyrimidinderivat vorzugsweise eine Verbindung mit der Formel
wobei:

– X aus Hydroxy, Halo und Thiol ausgewählt ist,
– Y aus Hydroxy, Methoxy und Halo ausgewählt ist und
– Z aus Wasserstoff, Halo und Nitro ausgewählt ist,

₃

₂

₅

Die pharmazeutisch verträglichen Additionssalze, wie hierin oben erwähnt, sollen die therapeutisch aktiven untoxischen Säureadditionssalzformen einschließen, die die Verbindung mit der obigen Formel zu bilden in der Lage sind und die üblicherweise durch Behandeln der Basenform solcher Verbindung mit einer geeigneten Säure gewonnen werden können.
Beispiele für geeignete Säuren schließen beispielsweise anorganische Säuren, wie beispielsweise Halogenwasserstoffsäuren, beispielsweise Chlorwasserstoffsäure bzw. Salzsäure oder Hydrobromsäure bzw. Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure, Phosphorsäure und dergleichen ein; oder organische Säuren, wie beispielsweise Essigsäure, Propionsäure, Hydroxyessigsäure, 2-Hydroxypropionsäure, 2-Oxopropionsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure, Oxalsäure (d. h. Ethandisäure), Malonsäure, Bernsteinsäure (d. h. Butandisäure), Maleinsäure, Fumarsäure, Apfelsäure, Weinsäure, Citronensäure, Methansulfonsäure, Ethansulfonsäure, Benzolsulfonsäure, p-Toluolsulfonsäure, Cyclohexansulfaminsäure, Salicylsäure (d. h. 2-Hydroxybenzoisäure), p-Aminosalicylsäure, Pamoasäure und dergleichen. Umgekehrt kann die Salzform durch Behandlung mit einem geeigneten alkalischen Mittel in die freie Basen-Form umgewandelt werden. Der Begriff „pharmazeutisch verträgliches Additionssalz", wie hierin verwendet, schließt die Solvate ein, die die Verbindungen mit der obigen Formel ebenso wie ihre Salze wie oben definiert zur Bildung in der Lage sind, siehe beispielsweise Hydrate, Alkoholate und dergleichen.
Die Pyrano[2,3-d:6,5-d']dipyrimidinderivate, die als therapeutisch aktive Inhaltsstoffe in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sollten vorzugsweise in einer im wesentlichen reinen Form vorliegen, d. h. frei von chemischen Verunreinigungen (wie beispielsweise Coprodukte bzw. Nebenprodukte oder restliches Lösungsmittel), das sich aus ihren Herstellungs- und/oder Handhabungsprozessen im Hinblick auf die sichere Kontrolle des therapeutischen Programms, für das sie vorgesehen sind, ergeben. Sie können vorliegen, wenn sie zumindest ein asymmetrisches Kohlenstoffatom besitzen, entweder als racemisches Gemisch oder in Form eines im wesentlichen reinen Stereoisomers oder Enantiomers dieser Verbindung, die aus dem racemischen Gemisch durch Standardherstellungsverfahren gewonnen wurden, einschließlich einer simulierten Fließbettechnologie.
Der Begriff „stereochemisch isomere Formen", wie hierin vorstehend verwendet, definiert alle möglichen isomeren Formen, die die Verbindungen der Formel (I) besitzen können. Soweit nichts anderes angegeben ist, bezeichnet die chemische Bezeichnung der Verbindungen das Gemisch aller möglicher stereochemischen isomeren Formen, wobei diese Gemische alle Diastereomeren und Enantiomeren der grundlegenden Molekülstruktur enthalten. Insbesondere können stereogene Zentren entweder die R- oder S-Konfiguration aufweisen. Reine stereoisomere Formen dieser Verbindungen sind als Isomere definiert, die im wesentlichen frei von anderen enantiomeren oder diastereomeren Formen der gleichen grundlegenden Molekülstruktur sind. Insbesondere betrifft der Begriff „stereochemisch rein" oder „chiral rein" Verbindungen mit einem Stereoisomeren-Überschuß von zumindest 80% (d. h. zumindest 90% eines Isomers und maximal 10% der anderen möglichen Isomere), vorzugsweise zumindest 90%, besonders bevorzugt zumindest 94% und am meisten bevorzugt zumindest 97%. Die Begriffe „enantiomer rein" und „diastereomer rein" sollen auf einer ähnlichen Art und Weise verstanden werden bezüglich des Enantiomeren-Überschusses, bzw. des Diastereomeren-Überschusses des fraglichen Gemisches.
Wenn ein Gemisch aus Enantiomeren während des Herstellungsverfahrens gewonnen wird, kann dieses folglich durch Flüssigkeitschromatographie unter Verwendung einer geeigneten chiralen stationären Phase aufgetrennt werden. Geeignete chirale stationäre Phasen sind beispielsweise Polysaccharide, insbesondere Cellulose oder Amylosederivate. Kommerziell erhältliche polysaccharidbasierte, chirale, stationäre Phasen sind ChiralCel^TM CA, OA, OB, OC, OD, OF, OG, OJ und OK, und Chiralpak^TM AD, AS, OP(+) und OT(+). Geeignete Eluenten bzw. Elutionsmittel oder mobile Phasen zur Verwendung in Kombination mit diesen chiralen stationären Polysaccharid-Phasen sind Hexan und dergleichen, modifiziert mit einem Alkohol, wie beispielsweise Ethanol, Isopropanol und dergleichen.
Der Begriff „im wesentlichen rein", wie hierin vorstehend verwendet, bedeutet ein chemische Reinheit, wie sie durch Verfahren bestimmt wird, die in der Technik üblich sind, wie beispielsweise Hochleistungsflüssigkeitschromatographie, von zumindest ungefähr 96%, vorzugsweise zumindest 98% und besonders bevorzugt zumindest 99%.
In den verschiedenen Aspekten der vorliegenden Erfindung können die retroviralen Enzyminhibitoren, die als Arzneistoffe (b) verwendet werden, zu den in der Technik bereits bekannten Kategorien gehören und schließen unter anderem folgende ein:

– HIV-1 IN Inhibitoren, wie sie hierin vorstehend in dieser Beschreibung dargestellt wurden
– Nukleosid-reverse Transkriptaseinhibitoren, wie beispielsweise Zidovudin, Lamivudin, Didanosin, Stavudin, Zalictabin und dergleichen,
– nicht-Nukleosid-reverse Transkriptaseinhibitoren, beispielsweise Nevirapin, Delavirdin und dergleichen,
– andere reverse Transkriptaseinhibitoren, wie beispielsweise Foscarnet-Natrium und dergleichen,
– HIV-1 Proteaseinhibitoren, wie beispielsweise Saquinavir, Ritonavir, Indinavir, Nelfinavir und dergleichen.

Das im dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung bereitgestellte Produkt kann in Form einer pharmazeutischen Zubereitung oder Zusammensetzung vorliegen, bei der zumindest eines von (a) und (b) in Mischung mit zumindest einem pharmazeutisch verträglichen Träger vorliegt. Der Begriff „pharmazeutisch akzeptabler Träger", wie hierin verwendet, bedeutet jedes Material oder Substanz, mit dem die Zusammensetzung von aktiven Inhaltsstoffen (a) und (b) formuliert wird, um dessen Verabreichung oder Verteilung an den zu behandelnden Ort zu erleichtern, beispielsweise durch Lösen, Dispergieren oder Diffundieren dieser Zusammensetzung und/oder dessen Lagerung, Transport oder Handhabung ohne Verschlechterung seiner Wirksamkeit zu erleichtern. Der pharmazeutisch verträgliche Träger kann ein Feststoff oder eine Flüssigkeit oder ein Gas sein, das zur Bildung einer Flüssigkeit komprimiert wurde, d. h. die Zusammensetzung in dieser Erfindung können in geeigneter Weise als Konzentrate, Emulsionen, Lösungen, Granulate, Nebel, Sprays, Aerosole, Pellets oder Pulver verwendet werden.
Geeignete pharmazeutische Träger zur Verwendung in diesen pharmazeutischen Zusammensetzungen und zu ihrer Formulierung sind dem Fachmann auf dem Gebiet wohlbekannt und es existiert keine spezielle Einschränkung bezüglich ihrer Auswahl innerhalb der vorliegenden Erfindung. Sie können ebenfalls Additive, wie beispielsweise Benetzungsmittel, Dispergiermittel, Klebemittel, Klebstoffe, Emulgatoren, Lösungsmittel, Beschichtungen, antibakterielle und antimykotische Mittel (beispielsweise Phenol, Sorbinsäure, Chlorbutanol), isotonische Mittel (wie beispielsweise Zucker oder Natriumchlorid) und dergleichen einschließen, vorausgesetzt, daß sie mit der pharmazeutischen Praxis übereinstimmen, d. h. Träger und Additive, die keine dauerhafte Schädigung für Säugetiere darstellen. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können auf jeder bekannten Art und Weise hergestellt werden, beispielsweise durch homogenes Mischen, Beschichten und/oder Vermahlen der aktiven Inhaltsstoffe in einem einstufigen oder in vielstufigen Verfahren mit dem ausgewählten Trägermaterial und, wo dies angezeigt ist, können andere Additive, wie beispielsweise oberflächenaktive Mittel, ebenfalls durch Mikronisierung vorbereitet werden, beispielsweise im Hinblick darauf, diese in Form von Mikrosphären zu gewinnen, die üblicherweise einen Durchmesser von ungefähr 1 bis 10 μm aufweisen, nämlich zur Herstellung von Mikrokapseln zur kontrollierten oder verzögerten Freisetzung der aktiven Inhaltsstoffe.
Geeignete oberflächenaktive Mittel, die in den pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind nichtionisch, kationische und/oder anionische Materialien mit guten Emulgier-, Dispergier- und/oder Benetzungseigenschaften. Geeignete anionische oberflächenaktive Stoffe schließen sowohl wasserlösliche Seifen, als auch wasserlösliche, synthetische oberflächenaktive Mittel ein. Geeignete Seifen sind Alkali- oder Erdalkalimetallsalze, unsubstituierte oder substituierte Ammoniumsalze von höheren Fettsäuren (C₁₀-C₂₂), beispielsweise die Natrium- oder Kaliumsalze von Ölsäure oder Stearinsäure, oder die natürlichen Fettsäuregemische, die aus Kokosnußöl oder Talköl gewinnbar sind. Synthetische oberflächenaktive Stoffe schließen Natrium- oder Kaliumsalze von Polyacrylsäuren; Fettsulfonate und Sulfate; sulfonierte Benzimidazol-Derivate und Alkylarylsulfonate ein. Fettsulfonate oder Sulfate liegen üblicherweise in Form von Alkali- oder Erdalkalimetallsalzen, unsubstituierten Ammoniumsalzen oder Ammoniumsalzen vor, die mit einem Alkyl- oder Acyl-Radikal mit von 8 bis 22 Kohlenstoffatomen substituiert sind, beispielsweise das Natrium- oder Kalziumsalz der Lignosulfonsäure oder Dodecylsulphonsäure oder ein Gemisch von Fettalkoholsufaten, die aus natürlichen Fettsäuren gewonnen werden, Alkali- oder Erdalkalimetallsalze oder Schwefel- oder Sulfonsäureesther (wie beispielsweise Natriumlaurylsulfat) und Sulfonsäuren von Fettalkohol/Ethylenoxid-Addukten. Geeignete sulfonierte Benzimidazolderivate enthalten vorzugsweise 8 bis 22 Kohlenstoffatome. Beispiele für Alkylarylsulfonate sind die Natrium-, Kalzium- oder Alkanolamin-Salze von Dodecylbenzolsulfonsäure oder Dibutyl-Naphtalinsulfonsäure oder ein Naphtalin-Sulfonsäure/Formaldehydkondensationsprodukt. Ebenfalls geeignet sind die entsprechenden Phosphate, beispielsweise Salze des Phosphorsäureesters und eines Adduktes von p-Nonylphenol mit Ethylen- und/oder Propylenoxid oder Phospholipiden. Geeignete Phospholipide für diesen Zweck sind die natürlichen (die aus Tier- oder Pflanzenzellen stammen) oder synthetischen Phospholipide des Cephalin- oder Lecithintypes, wie beispielsweise Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylserin, Phosphatidylglycerin, Lysolecithin, Cadiolipin, Dioctanylphosphatidyl-Cholin, Dipalmitoylphosphatidyl-Cholin und deren Gemische.
Geeignete nichtionische oberflächenaktive Stoffe schließen polyethoxylierte und polypropoxylierte Derivate von Alkylphenolen, Fettalkoholen, Fettsäuren, aliphatische Amine oder Amide ein, die zumindest 12 Kohlenstoffatome im Molekül tragen, Alkylarensulfonate und Dialkylsulfosuccinate, wie beispielsweise Polyglycoletherderivate von aliphatischen und cycloaliphatischen Alkoholen, gesättigte und ungesättigte Fettsäuren und Alkylphenole, wobei die Derivate vorzugsweise 3 bis 10 Glycolethergruppen und 8 bis 20 Kohlenstoffatome im (aliphatischen) Kohlenwasserstoffanteil tragen und 6 bis 18 Kohlenstoffatome in der Alkylkomponente des Alkylphenols. Weitere geeignete nichtionische oberflächenaktive Stoffe sind wasserlösliche Addukte von Polyethylenoxid mit Polypropylenglycol, Ethylendiaminpolypropylenglycol, das 1 bis 10 Kohlenstoffatome in der Alkylkette trägt, wobei die Addukte 20 bis 250 Ethylenglycolethergruppen enthalten und/oder 10 bis 100 Propylenglycolethergruppen. Derartige Verbindungen enthalten üblicherweise von 1 bis 5 Ethylenglycoleinheiten pro Propylenglycoleinheit. Repräsentative Beispiele von nichtionischen oberflächenaktiven Stoffen sind Nonylphenolpolyethoxyethanol, Rizinusölpolyglycolether, Polypropylen/Polyethylenoxid-Addukte, Tributylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylenglycol und Octylphenoxypolyethoxyethanol. Fettsäureester von Polyethylensorbitan (beispielsweise Polyoxyethylensorbitantrioleat), Glycerol, Sorbitan, Saccharose und Pentaerythritol sind ebenfalls geeignete nicht ionische oberflächenaktive Stoffe.
Geeignete kationische oberflächenaktive Stoffe schließen quartäre Ammoniumsalze, vorzugsweise Halogenide, mit 4 Kohlenwasserstoffradikalen ein, die wahlweise mit einem Halo, Phenyl, substituierten Phenyl oder Hydroxy substituiert sind; beispielsweise quartäre Ammoniumsalze, die als N-Substituenten zumindest ein C₈-C₂₂ Alkylradikal (beispielsweise Cetyl, Lauryl, Palmityl, Myristyl, Oleyl und dergleichen) enthalten und als weitere Substituenten, unsubstituierte oder halogenierte Niederalkyl, Benzyl und/oder Hydroxy-Niederalkylradikale.
Eine ausführlichere Beschreibung oberflächenaktiver Mittel, die für diesen Zweck geeignet sind, sind beispielsweise in „McCutcheon's Detergents and Emulsifiers Annual" (MC Publishing Crop., Ridgewood, New Jersey, 1981), dem „Tensid-Taschenbuch", 2. Ausgabe (Hanser Verlag, Wien, 1981) und in der „Encyclopaedia of Surfactants" (Chemical Publishing Co., New York, 1981) zu finden.
Zusätzliche Inhaltsstoffe können enthalten sein, um die Dauer der Wirkung des aktiven Inhaltsstoffes in der Zusammensetzung zu steuern. Zusammensetzungen mit gesteuerter Freisetzung können somit durch Auswählen geeigneter Polymerträger erreicht werden, wie beispielsweise Polyestern, Polyaminosäuren, Polyvinylpyrrolidon, Ethylenvinylacetatcopolymeren, Methylcellulose, Carboxymethylcellulose, Protaminsulfat und dergleichen. Die Geschwindigkeit der Arzneistofffreisetzung und die Wirkdauer können ebenfalls durch Einbauen der aktiven Inhaltsstoffe in Teilchen kontrolliert werden, beispielsweise in Mikrokapseln einer Polymersubstanz, wie beispielsweise Hydrogelen, Polymilchsäure, Hydroxymethylcellulose, Polymethylmethacrylat und die anderen oben beschriebenen Polymere. Solche Verfahren schließen kolloidale Arzneistoffabgabesysteme, wie Liposome, Microsphären, Microemulsionen, Nanopartikel, Nanokapseln usw. ein. Abhängig vom Verabreichungsweg kann die pharmazeutische Zusammensetzung eine Schutzbeschichtung erfordern.
Pharmazeutische Formen, die zur injizierbaren Anwendung geeignet sind, schließen sterile wäßrige Lösungen oder Dispersionen und sterile Pulver für die sofortige Zubereitung hiervon ein. Typische Träger für diesen Zweck schließen deswegen biokompatible wäßrige Puffer, Ethanol, Glycerol, Propylenglycol, Polyethylenglycol und dergleichen und Gemische hiervon ein.
Im Hinblick auf die Tatsache, daß die Inhaltsstoffe (a) und (b) nicht notwendigerweise einen gemeinsamen therapeutischen Effekt direkt zum selben Zeitpunkt im zu behandelnden Säugetier mit sich bringen, kann das im dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung bereitgestellte Produkt ebenfalls in Form eines medizinischen Kits (bzw. Bausatzes) oder Pakets vorliegen, das die beiden Inhaltsstoffe in getrennter, jedoch benachbarter Form enthält. Im letzteren Kontext kann jeder der Inhaltsstoffe (a) und (b) deswegen in einer Art und Weise formuliert werden, die für einen Verabreichungsweg geeignet ist, der sich von dem des anderen Inhaltsstoffes unterscheidet, beispielsweise kann einer von diesen in Form einer oralen oder parenteralen Formulierung vorliegen, wohingegen der andere in Form einer Ampulle zur intravenösen Injektion oder als Aerosol vorliegt.
Gemäß des Produktes, das den dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung darstellt:

– können die aktiven Inhaltsstoffe (a) und (b) dem Säugetier (einschließlich einem Menschen), das (der) behandelt werden soll, mittels Maßnahmen, die in der Technik wohlbekannt sind, verabreicht werden, d. h. oral, intranasal, subcutan, intramuskulär, intradermal, intravenös, intraarteriell, parenteral und durch Catheterisierung
– die wirksame Menge der kombinierten Zubereitung aus (a) und (b) ist vorzugsweise eine antiretrovirale Menge, beispielsweise eine Menge, die ein retrovirales Enzym hemmt. Besonders bevorzugt ist eine integrasehemmende Menge eines Derivates (a) und eine retrovirale enzymhemmende Menge an Arzneistoff (b). Noch mehr bevorzugt ist, wenn der retrovirale Enzyminhibitorarzneistoff (b) ein Proteaseinhibitor ist, dessen wirksame Menge eine proteasehemmende Menge. Wenn der retrovirale Enzyminhibitorarzneistoff (b) ein reverser Transkriptaseinhibitor ist, ist dessen wirksame Menge eine reverse transkriptasehemmende Menge. Wenn der retrovirale Enzyminhibitorarzneistoff (b) ein Integraseinhibitor ist, der ein anderer ist als ein Derivat von Pyrano[2,3-d:6,5-d']dipyrimidin, ist seine wirksame Menge eine integrasehemmende Menge. Wenn (b) ein Arzneistoff ist, der gegen ein nichtenzymatische retrovirales Protein wirksam ist (glycosyliert oder nicht), das in die Replikation eines Retrovirus involviert ist (beispielsweise das Immunogen, basierend auf dem HIV gp120 Hüllantigen), sollte es ebenfalls in seiner üblichen wirksamen Menge verwendet werden. Wenn (b) ein CCR5 Inhibitor ist, sollte es in einer CCR5 hemmenden Menge verwendet werden.
– Die Inhaltsstoffe (a) und (b) können gleichzeitig verabreicht werden, es kann jedoch von Vorteil sein, diese getrennt oder aufeinanderfolgend zu verabreichen, beispielsweise innerhalb einer relativ kurzen Zeitspanne (beispielsweise innerhalb ungefähr von 24 Stunden), um ihre funktionelle Funktion im zu behandelnden Körper zu erreichen.

Die nachfolgenden Beispiele sind lediglich zu Veranschaulichungs-Zwecken dargeboten und sollten keinesfalls als den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung einschränkend interpretiert werden.
BEISPIELE
Zur Durchführung der Arbeitsbeispiele dieser Erfindung wurden die folgenden Verbindung und experimentellen Verfahren angewendet.
Pyrano[2,3-d:6,5-d']dipyrimidinderivate wurden gemäß des in WO 99/25718 offenbarten Verfahrens gewonnen. AZT wurde, wie früher von Horwitz et al. in J. Org. Chem. (1964) 29: 2076–8 beschrieben, synthetisiert. Tivirapin und Lovirid wurden von Janssen Research Foundation (Beerse, Belgien) bezogen. Nevirapin wurde von Boehringer Ingelheim (Ridgefield, CN) gewonnen. Retonavir wurde von Abbott Laboratories (Abbott Park, Illinois) bereitgestellt. Dextransulfat mit einem Molekulargewicht von 5000 wurde von Sigma bezogen. Nelfinavir wurde von Agouron Pharmaceuticals (La Jolla, Kalifornien) erhalten. Bicyclam AMD3100 wurde von Amormed bezogen.
MT-4 (offenbart von Miyochi et al. in Gann, Monogram. (1982) 28: 219–228) und C8166 (offenbart von Salahuddin et al. in Virology (1983) 129: 51–64) Zellen wurden in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO₂ gezüchtet und in RPMI 1640 Medium gehalten, das mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Kalbsserum, 2 mM L-Glutamin, 0,1% Natriumhydrogencarbonat und 20 μg/ml Gentamycin ergänzt war.
Das HIV-1 (III_B) Virus wurde von Popovic et al. in Science (1984) 224: 497–500 beschrieben. HIV-1 (NDK) wurde ebenfalls von Spire et al. in Gene (1989) 81: 275–284 beschrieben. HIV-1 (hierin nachstehend als NL 4.3 bezeichnet und von Adachi et al. in J. Virol. (1986) 59: 284–291 offenbart) ist ein molekularer Klon, der vom National Institute of Health (Bethesda, Maryland) bezogen wurde. Die Stämme 13MB1 (L1001) und 39MN1 (Y181C) wurden in unserem Labor nach seriellen Passagen von HIV-1 (III_B) und HIV-1 (NDK) in MT-4 Zellen in Gegenwart von Tivirapin oder Lovirid jeweils isoliert. L1, L2, L4 und L6 sind klinische Isolate von einzelnen seropositiven Patienten vor und nach einer sequentiellen Behandlung mit dem Didesoxynucleosiden(ddN)analogen Zidovudin, Didanosin, Zalcitabin, Stavudin und Lamivudin und dem nicht-Nukleosid-reversen Transkriptaseinhibitor Lovirid. Gemäß Schmidt et al. (oben erwähnt) enthält der Stamm L6 die folgenden Mutationen in der reversen Transkriptase: V75I, F77L, K103N, F116Y, Q151M und M184V. HIV-1 oder HIV-2 (ROD) (offenbart von Barré-Sinoussi et al. in Science (1983) 220: 868–871) und HIV-2 (EHO) (offenbart von Rey et al. in Virology (1989) 173: 258–267)-Ansätze wurden aus dem Kulturüberstand von HIV-1 oder HIV-2 infizierten Zelllinien gemäß Pauwels et al. in J. Virol. Methods (1987) 16: 171–185 und Schols et al. in J. AIDS (1989) 2: 10–15 gewonnen. Das Affenimmundeffizienzvirus (Simian immundeficiency virus (SIV(MAC251)) wurde von (Smith Kline, Rixensart, Belgien) bezogen, wobei Stämme aus dem Überstand von SIV-infizierten MT-4 Zellen hergestellt wurden.
BEISPIEL 1 – inhibitorische Wirkung von Pyrano[2,3-d:6,5-d']dipyrimidinderivaten gegen die Replikation von HIV oder SIV in einem Zellkulturmodell für eine akute Infektion
Die inhibitorische Wirkung von 8 unterschiedlichen Verbindungen (hierin nachstehend als A bis H bezeichnet) in einer Reihe von 5-(4-substituierten Phenyl)-5H-pyrano[2,3-d:6,5-d']dipyrimidinen mit der Formel:
wobei X, Y und Z wie in der nachfolgenden Tabelle 1 definiert sind, wurde bezüglich ihres Potentials getestet, die Replikation von HIV und SIV in einem Zellkulturmodell für eine akute Infektion zu hemmen.
Tabelle 1
Ausgewählte Verbindungen wurden gegen HIV-1 (III_B), zwei HIV-2 Stämme (ROD und EHO) und SIV (MAC251) zur Hemmung einer virusinduzierten Cytopathie in MT-4 Zellen getestet unter Verwendung des colorimetrischen Tests, der von Pauwels et al. in J. Virol. Methods (1988) 20: 309–321 beschrieben wurde, wobei die Auswertung 5 Tage nach der Infektion durchgeführt wurde.
Die Cytotoxität dieser Verbindungen wurde parallel durch Messen der Lebensfähigkeit von scheininfizierten MT-4 oder C8166 Zellen 5 Tage nach der Infektion bestimmt. Die antivirale Wirksamkeit und die Cytotoxizitätsdaten, die Durchschnittswerte und Standardabweichungen für zumindest zwei getrennte Experimente einschlossen, sind in Tabelle 2 dargestellt, wobei:

– EC₅₀ die 50%-ige effektive Konzentration darstellt, d. h. die Konzentration, die zur Hemmung eines viralen cytopathischen Effektes um 50% in Zellkultur erforderlich ist, und
– CC₅₀ die 50%-ige toxische Konzentration repräsentiert, d. h. die Konzentration, die die Lebensfähigkeit von MT-4 Zellen um 50% reduziert.

Tabelle 2
Die Derivate C, E, G und H waren gegen die Replikation von HIV-1 (III_B) wirksam. Die aktivste Verbindung in dieser Reihe, H oder 5-(4-Nitrophenyl)-2,8-dithiol-4,6-dihydroxy-5H-pyrano[2,3-d:6,5-d']dipyrimidin (in allen beigefügten Figuren V-165 genannt) war bei einer 50%-igen wirksamen Konzentration (EC₅₀) von 11,4 μM wirksam. H war ebenfalls gegen HIV-1 (NDK, NL4.3 und L1), HIV-2 (ROD und EHO) und SIV (MAC251) bei den EC₅₀ Werten wirksam, die sich von 5,5 bis 30 μM bewegen. Im Gegensatz hierzu war der nicht-Nukleosid-reverse Transkriptaseinhibitor Nevirapin, getestet mittels eines Vergleichs gegen die Replikation von HIV-2 (ROD und EHO) und SIV (MAC251) bei 98 μM in MT-4 Zellen inaktiv.
BEISPIEL 2 – Hemmwirkung bestimmter Pyrano[2,3-d:6,5-d']dipyrimidinderivate gegen arzneistoffresistente HIV-1 Stämme
Die antivirale Wirksamkeit der Verbindungen G und H wurde unter Verwendung desselben Verfahrens wie in Beispiel 1 gegen verschiedene arzneistoffresistente HIV-1 Stämme getestet. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 3 dargestellt, wobei EC₅₀ dieselbe Bedeutung wie in Beispiel 1 hat und die Zunahme des EC₅₀ ist durch Vergleich mit der antiviralen Aktivität gegen Wildtyp (WT) Stamm dargestellt. Die Verbindung H waren gegen HIV-1 Stämme aktiv, die gegen die viralen Eintrittsantagonisten Dextransulfat oder Bicyclam resistent sind. HIV-1 Stämme, die bezüglich ihrer Resistenz gegen die nicht-Nukleosid-reverse Transkriptaseinhibitoren (NNRTIs) Tivirapin oder Lovirid ausgewählt wurden, wurden durch beide Verbindungen gehemmt.
Tabelle 3
Zusätzlich beobachteten wir eine maximal dreifache Reduktion der inhibitorischen Wirkstärke von Verbindung H gegen die drei multiarzneistoffresistenten (MddNR) HIV-1 Stämme L2, L4 und L6, wobei mitberücksichtigt wurde, daß der parentale Stamm L1 für Verbindung H empfindlicher war (EC₅₀: 3.7 ± 1.8 μM) als III_B.
BEISPIEL 3 – Kombinierte Hemmwirkungen von 5-(4-Nitrophenyl)-2,8-dithiol-4,6-dihydroxy-5H-pyranol[2,3-d:6,5-d']dipyrimidin mit verschiedenen HIV-1 Inhibitoren.
Die antivirale Wirkung von Verbindung H wurde in Kombination mit dem Nukleosid-reverse Transkriptaseinhibitor Zidovudin, dem nicht-Nukleosid-reverse Transkriptaseinhibitor Nevirapin und dem Proteaseinhibitor Nelfinavir getestet.
Die kombinierte inhibitorische Wirkung auf dem HIV-1 induzierten cytopathischen Effekt wurde durch das Isobologramm-Verfahren ausgewertet, wie es kürzlich von Elion et al. in J. Biol. Chem. (1954) 208: 477–488 und von Baba et al. in Antimicrob. Agents Chemother. (1984) 25: 515–517 beschrieben wurde.
Der EC₅₀, wie er hierin vorstehend definiert wurde, wurde zur Berechnung der fraktionellen inhibitorischen Konzentration verwendet (hierin nachstehend als FIC bezeichnet). Wenn der minimale FIC Index, entsprechend dem FIC kombinierter Verbindungen (beispielsweise FIC_X + FIC_Y) gleich 1,0 ist, wird davon ausgegangen, daß die Kombination additiv ist; wenn sie sich zwischen 1,0 und 0,5 befindet, ist die Kombination per Definition subsynergistisch und wenn sie kleiner 0,5 ist, ist die Kombination per Definition synergistisch. Wenn der minimale FIC Index zwischen 1,0 und 2,0 ist, ist die Kombination subantagonistisch und wenn sie größer 2,0 ist, ist die Kombination als antagonistisch definiert.
Die Ergebnisse dieser Tests sind in den Isobologrammen dargestellt, die in den 2 bis 4 vorgesehen sind, wobei die Linien einen FIC gleich 1,0 bzw. 0,5 repräsentieren, was zeigt, daß die zugesetzten Werte FIC_Zidovudin + FIC_V-165 und FIC_Nelfinavir + FIC_V-165 zwischen 0,5 und 1 fallen und die zugesetzten Werte FIC_Nevirapin + FIC_V-165 unter 0,5 fallen.
BEISPIEL 4 – Interventionszeitpunkt von 5-(4-Nitrophenyl)-2,8-dithiol-4,6-dihydroxy-5H-pyrano[2,3-d:6,5-d']dipyrimidin im Replikationszyklus
Ein Zusatzexperiment wurde durchgeführt, um zu untersuchen, welcher Schritt des Replikationszyklus durch Verbindung H gehemmt wurde. Kurz gesagt, bestimmt dieses Experiment, wie lange der Zusatz eine Anti-HIV-Verbindung verzögert werden kann, bevor sie ihre antivirale Aktivität im viralen Replikationszyklus verliert. MT-4 Zellen wurden mit HIV-1 (III_B) bei einer Infektionsmultiplizität (m.o.i.) von 0,5 infiziert, um alle Schritte der viralen Replikation zu synchronisieren und die verschiedenen antiviralen Testverbindungen wurden zu unterschiedlichen Zeitpunkten zugesetzt (im Bereich von 0 bis zu 26 Stunden) nach der Infektion. Die virale p24 Antigenproduktion wurde 31 Stunden nach der Infektion bestimmt (unter Verwendung von HIV-1 p24 Core Profile ELISA, Du Pont, Dreieich, Deutschland) und ist als der log₁₀ des p24 Ag Gehaltes in pg/ml ausgedrückt. Referenzverbindungen mit einer bekannten Wirkweise wurden in dieses Experiment miteingeschlossen. Dextransulfat, ein Polyanion, stört die Bindung des Virus an die Zelle. Das Nukleotidanalogon AZT hemmt den reversen Transkriptionsprozeß. Ritonavir ist ein protolytischer Spaltinhibitor. Die Referenzverbindungen (Dextransulfat, AZT und Ritonvair) wurden in einer standardisierten Konzentration zugesetzt, die zu 100 mal dem EC₅₀ Wert entsprechen, bestimmt bei einer m.o.i. von 0,01. Verbindung H wurde zu 250 μM zugesetzt. In 1, die die Ergebnisse dieses Experiments darstellt, wurden die folgenden Symbole verwendet: (•) für die Kontrolle, (
) für Dextransulfat (20 μM), (
) für AZT (1,9 μM), (
) für Ritonavir (2,8 μM) und (*) für Verbindung H (250 μM).
Gemäß 1 kann der Zusatz von Verbindung H für 6 Stunden nach der Virusinfektion hinausgezögert werden, was eine Interaktion im Integrationsmoment (DNA Strangtransfer) nahelegt, weil ein bekannter Diketosäureintegraseinhibitor, der in einer ähnlichen Zeit des Zusetzen-Experimentes getestet wurde, seine Aktivität verlor, wenn er mehr als 6 Stunden nach der Infektion zugesetzt wurde. Jedoch kann dieses Experiment nicht ausschließen, daß Verbindung H ebenso mit der reversen Transkription interagieren würde, weil das Experiment lediglich den letzten Schritt zeigt, der während der Virusreplikation ins Ziel gefaßt wurde.
BEISPIEL 5 – Hemmung einer lentiviralen vektor-vermittelten Transduktion durch 5-(4-Nitrophenyl)-2,8-dithiol-4,6-dihydroxy-5H-pyrano[2,3-d:6,5-d']dipyrimidin
Um die Interferenz des Inhibitors mit der HIV reversen Transkription und/oder Integrationsschritten zu bekräftigen, wurden Einrunden-Infektionen von 293T-Zellen unter Verwendung von HIV-1 abgeleiteten Vektoren durchgeführt, die mit der VSV-G Hülle pseudotypisiert wurden und die Luciferase als Reportergen trugen, gemäß des Verfahrens, beschrieben von Naldini et al. in Science (1996) 272: 263–7. Speziell wurden HIV-1 abgeleitete Vektorpartikel, pseudogetyped mit der Hülle des vesiculären Stomatitisvirus (VSV) durch Transfizieren von 293T-Zellen mit drei Plasmiden erzeugt: ein Verpackungsplasmid pCMVΔR8.2 oder pCMVΔ8.91, ein Plasmid, das die Hülle des vesiculären Stomatitisvirus (pMDG) codiert, und ein Plasmid, das ein Reportergen codiert, flankiert von zwei langen terminalen Wiederholungen (LTRs) (pHR'-CMVLuciferase). Alle Plasmide waren durch die European Gene Vector Database and Repository erhältlich und wurden von Genethon III, CNRS URA 1923, Evry (Frankreich) und von der Universität Genf, Abteilung für Genetik und Mikrobiologie (Schweiz) bereitgestellt. Für eine Transfektion einer 10 cm Schale von 293T-Zellen wurden ein 700 μl Gemisch dreier Plasmide in 150 mM NaCl (20 μg Vektorplasmid, 10 μg Verpackungskonstrukt und 5 μg Hüllplasmid) hergestellt. Zu dieser DNA Lösung wurden 700 μl Polyethylenimin (PEI) (erhältlich von Aldrich) (110 μl einer 10 mM Stammlösung in 150 mM NaCl) langsam zugesetzt. Nach 15 Minuten bei Raumtemperatur wurde der DNA-PEI Komplex tropfenweise den 293T-Zellen in einem DMEM Medium zugesetzt, das mit 1% fötalem Kalbserum (FCS) ergänzt war. Nach Übernachtinkubation wurde das Medium durch ein Medium ersetzt, das 10% FCS enthielt. Überstände wurden aus Tag zwei bis fünf nach der Transfektion gesammelt. Die Vektorteilchen wurden durch Ultrazentrifugation in einem Rotor mit schwingendem Behälter (SW27 Beckman, Palo Alto, Kalifornien) bei 25.000 UpM für zwei Stunden bei 4°C sedimentiert. Die Pellets wurden erneut in PBS gelöst, was eine 100-fache Konzentration zur Folge hatte. Unterschiedliche Virenstämme wurden auf Grundlage des p24 Antigengehalts normalisiert (HIV-1 p24 Core Profile ELISA von Du Pont, Dreieich, Deutschland). Die Inhibitoren wurden in 96 Wellplatten ausgewertet. Für jedes Well wurden 2.000 pg Vektor und 2 μg/ml Polybren einer konfluenten Monoschicht von 293T-Zellen zugesetzt, die in 100 μl DMEM/1% FCS gezüchtet wurden. Inhibitoren bei unterschiedlichen Konzentrationen wurden eingeschlossen. 48 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen lysiert und die Luciferaseaktivität wurde im Limicount^TM (Packard, Meriden, Connecticut) unter Verwendung des Luciferase Assay System^TM (Promega Benelux, Leiden, Niederlande) gemessen. Die Normalisierung bezüglich der Zellzahl wurde durch Bestimmung der Proteinkonzentration unter Verwendung eines BCA^TM Protein Assay Reagent (Pierce, Illinois) durchgeführt.
In diesem Assay ist eine Abnahme der Luciferaseaktivität ein Maß für die Hemmung der frühen HIV Replikationsschritte. Die Hemmung der Transduktion wurde mit Verbindung H bei einem durchschnittlichen EC₅₀ Wert von 17 μM erreicht. Der kontrollreverse Transkriptaseinhibitor AZT hemmte die lentivirale Transduktion bei einem EC₅₀ Wert von 49 nM. Das Fehlen von gp120 im Virusteilchen schließt eine HIV-Typ Viruseindringen als Ziel aus. Verbindung H hemmte ebenfalls die Transduktion durch einen zweiten Generations-Vektor, den die akzessorischen Faktoren nef, vif, vpr und vpu fehlten (beispielsweise von Zufferey et al. in Nature Biotechnol. (1997) 15: 871–5 beschrieben) im selben Ausmaß, was somit eine wichtigere Rolle für diese HIV-Proteine im antiviralen Mechanismus ausschließt. Diese Assays bekräftigen die HIV-1 reverse Transkription und/oder Integration als Ziele für die antivirale Wirkung der Verbindung der Erfindung in Zellkultur.
BEISPIEL 6 – Hemmung der HIV reversen Transkriptaseaktivität durch bestimmte Pyrano[2,3-d:6,5-d']dipyrimidinderivate.
Die Hemmung der HIV1 reversen Transkriptaseenzymaktivität wurde für einige Verbindungen der Erfindung und einige Referenzverbindungen ausgewertet, während die Verfahren zur Gewinnung des Virion-abgeleiteten Enzyms und für ein Assay für die reverse Transkriptaseaktivität verwendet wurden, wie es von Debyser et al. in Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991) 88: 1451–5 beschrieben wurde. Poly(rC).oligo(dG) und Poly(rA).oligo(dT) wurden als Matrizen-Primer verwendet und 8-(³H)-dGTP und (³H)-dTTP wurden als radiomarkierte Substrate verwendet. Die endgültigen 8-(³H)-dGTP und (³H)-dTTP Konzentrationen im Reaktionsgemisch betrugen 2,5 μM. Rekombinantes HIV-1 RT (HXB2) wurden wie von Jonckheere et al. in J. Virol. Methods (1996) 61: 113–125 beschrieben, gewonnen. Die Ergebnisse dieser Experimente sind in Tabelle 4 unten dargestellt, wobei der IC₅₀ die 50%-ige Hemmkonzentration ist, d. h. die Konzentration, die erforderlich ist, um eine HIV-1 RT Aktivität um 50% durch Verwendung von Poly(C).oligo(dG) oder Poly(A).oligo(dT) als Matrizen-Primer zu hemmen.
Tabelle 4
BEISPIEL 7 – Hemmung der HIV Integraseaktivität durch bestimmte Pyran[2,3-d:6,5-d']dipyrimidinderivate
Die Hemmung einer 3'-Prozessierung, der DNA Strangtransfer und die Gesamtintegrationsreaktion wurden in oligonukleotidbasierten Assays gemessen, wie von Cherepanov et al. in Mol. Pharmacol. (1997) 52: 771–780 unter Verwendung der nachfolgenden Methodik beschrieben.
Zunächst wurde rekombinante His-markierte HIV-1 Integrase aus dem Plasmid pRP1012 (erhältlich von Netherlands Cancer Institute, Amsterdam), das HIV-1 IN (Stamm HTLV III) codierte, in E. coli PC1 (BL21(DE3)(pLysS)ΔendA::Tc^R) erzeugt und auf einer Niitrilotriessigsäuresäule aufgereinigt (Qiagen, Hilden, Deutschland), gefolgt von einer HighTrap-Heparinsäule (Pharmacia) wie von Cherepanov et al. (oben erwähnt) beschrieben wurde.
Die nachfolgenden Hochleistungsflüssigchromatographie-aufgereinigten Desoxyoligonukleotide wurden von Amersham-Pharmacia Biotech bezogen:
Die Oligonukleotide INT1 und INT2 entsprechen dem US Ende des HIV-1 LTRs. Das Oligonukleotid INT1 wurde durch ein 20%-iges denaturierendes Polyacrylamid/Ureagel aufgereinigt und war 5'-endmarkiert unter Verwendung einer Polynukleotid 74 Kinase und (☐-³²P)ATP (erhältlich von Amersham-Pharmacia Biotech). Das DNA Substrat für die Integrasereaktionen wurde durch Annealing von INT1 und INT2 hergestellt. Ein equimolares Gemisch der beiden Oligonukleotide in Gegenwart von 100 mM NaCl wurde kurz auf 95°C erhitzt und langsam auf Raumtemperatur abkühlen gelassen. Desgleichen hatte ein Annealing von SK70 und T35 ein 35-bp dsDNA Molekül zur Folge, das als Target DNA Molekül verwendet wurde (T35/SK70).
Das endgültige Reaktionsgemisch für den 3'-Prozessierungsassay enthielt 20 mM 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure (hierin als HEPES bezeichnet), pH 7,5, 5 mM Dithiothreitol, 10 mM MgCl₂, 75 mM NaCl, 15% (V/V) Polyethylenglycol mit einem Molekulargewicht von 8.000, 30 mM des Oligonukleotidsubstrates und 230 mM der His-markierten Integrase in einem Volumen von 10 μl. Die Reaktionen wurden durch Zusatz des Enzyms gestartet. Die Inhibitoren wurden kurz mit den Reaktionskomponenten vor dem Zusatz der Integrase inkubiert. Die Reaktionen ließ man für 7 Minuten bei 37°C fortlaufen und wurden durch Zusatz von Formamidbeladungspuffer (95% Formamid, 30 mM Ethylendiamintetraessigsäure, 0,1% Xylolcyanol, 0,1% Bromphenolblau, 0,1% Natriumdilaurylsulfat SDAS) gestoppt. Im gesamten Integrationsassay ließ man diese Reaktion für 60 Minuten ablaufen, bevor der Formamidfarbstoff zugesetzt wurde. 5 repräsentiert das Ergebnis der 3'-Prozessierungsreaktion, die in Abwesenheit (Bahn 1) oder in Anwesenheit von abnehmenden Mengen von Verbindung H (Bahnen 2 bis 7) durchgeführt wurden. Die Konzentrationen des Inhibitors waren 25 μM (Bahn 2), 5 μM (Bahn 3), 1 μM (Bahn 4), 0,2 μM (Bahn 5), 0,04 μM (Bahn 6) und 0,008 μM (Bahn 7).
Ein Strangtransfer wurde in der folgenden Art und Weise untersucht: 30 nM DNA Substrat wurden mit 230 nM Integrase bei 37°C für 5 Minuten preinkubiert, um das Auftreten einer Spaltreaktion zuzulassen. Die Zusammensetzung des Reaktionsgemisches war derjenigen beim 3'-Prozessierungsassay identisch. Nach 5 Minuten wurden 1 μl überschüssige Ziel-DNA (Endkonzentration 250 nM) mit oder ohne Inhibitor zugesetzt und die Proben wurden bei 37°C für eine Stunde inkubiert. Diese überschüssige Target DNA blockiert eine weitere Bindung von Integrase an das virale Substrat kompetitiv.
Reaktionen wurden durch Zusatz eines Formamidfarbstoffes gestoppt und die Produkte wurden in einem 15%-igen Denaturierungspolyacrylamid/Ureagel aufgetrennt. Eine Autoradiographie wurde durch Exponieren des feuchten Gels gegenüber Röntgenfilm (CURIX RP1, erhältlich von Agfa-Gevaert, Belgien) durchgeführt. Eine Quantifizierung der Ergebnisse wurde unter Verwendung einer Phosphorimager-Vorrichtung (Molecular Dynamics, Sunnyvale, Kalifornien) durchgeführt.
Ergebnisse dieser Experimente sind in Tabelle 5 unten dargestellt, die IC₅₀ (μM) Werte wie oben definiert, bereitstellt.
Tabelle 5
Die Verbindungen C, E, G und H hemmten die 3'-Prozessierung und die gesamte Integrationsreaktion. Die Verbindung H wies ebenfalls eine starke inhibitorische Wirkung auf die DNA Strangtransferreaktion auf. Eine starke Korrelation zwischen der antiretroviralen Aktivität, beobachtet in der Zellkultur und der inhibitorischen Aktivität in den Integraseassays wurde beobachtet. Die beste Korrelation wurde zwischen der inhibitorischen Wirkstärke in der Zellkultur und im Strangtransferassay (r² = 0,998) erzielt.
BEISPIEL 8 – kinetischer Spaltungsassay von 5-(4-Nitrophenyl)-2,8-dithiol-4,6-dihydroxy-5H-pyrano[2,3-d:6,5-d']dipyrimidin
Eine Preinkubation des 20 bp Oligonukleotids (30 nM) mit 230 nM Integrase für 3 Minuten hatte die Bildung eines initial stabilen Komplexes (ISC) zur Folge. Die Zusammensetzung des Reaktionsgemisches war mit derjenigen der 3'-Prozessierungsreaktion aus Beispiel 7 identisch. Wenn Dextransulfat mit einem Molekulargewicht von 5.000 in einer Endkonzentration von 0,3 μM zugesetzt wurde, wurde eine weitere Bindung der Integrase an das Oligonukleotid blockiert. Zu mehreren Zeitspannen wurden 5 μl Teilmengen entnommen und die Reaktion wurde unter Verwendung von 5 μl Formamid Beladungspuffer (mit derselben Zusammensetzung wie oben) gestopft. Die Ratenkonstante bzw. Geschwindigkeitskonstante für die Umwandlung von ISC in das gespaltene Produkt kann unter Verwendung der folgenden Formel berechnet werden: A-Be^–kt. Um die inhibitorische Wirkung der Verbindung H auf die 3'-Prozessierung zu überprüfen, wiederholten wir dasselbe Experiment in Gegenwart von 50 μM Verbindung (zugesetzt nach Preinkubation zusammen mit Dextransulfat) und verglichen die Ratenkonstanten: sie wurde in Abwesenheit von Verbindung H als 0,152 ± 0,038 Min^–1 berechnet in seiner Gegenwart zu 0,147 ± 0,025 Min^–1. Dieser ziemlich ähnliche Wert schließt aus, daß Verbindung H die Katalyse der 3'-Prozessierung direkt beeinträchtigt.
Zusätzliche Ergebnisse dieses Experiments sind in 6 dargestellt, die folgendes zeigt:

– im oberen Teil ist die Bildungskinetik des Spaltproduktes in Abwesenheit (•) oder in Anwesenheit (♦) von 50 μM Verbindung H gezeigt, und
– im unteren Abschnitt ist das denaturierende Gel nach 0,5 bis 50 Minuten gezeigt, einschließlich der Kontrollen C1 (kein zugesetztes Enzym), C2 (Dextransulfat 5.000 vor der Preinkubation zugesetzt) und C3 (keine Inkubation).

BEISPIEL 9 – HIV-1 Integrasebindungsassay von 5-(4-Nitrophenyl)-2,8-dithiol-4,6-dihydroxy-5H-pyrano[2,3-d:6,5-d']dipyrimidin
Bindungsexperimente wurden unter Verwendung der Biosensortechnologie auf BIAcore2000 (Biacore) und Sensorchips SA^TM mit preimmobilisiertem Streptavidin durchgeführt. Das Bindungsexperiment wurde bei 37°C unter Befolgung der Verfahren des Herstellers durchgeführt. Der Bindungspuffer B (20 mM HEPES bei pH 7,5) enthielt 50 mM NaCl, 10 mM MgCl₂ und 5 mM DTT. Zunächst wurde das 3'-biotinylierte Oligonukleotid
an den Sensorchip gebunden. Anschließend wurde das komplementäre 35-mer
an das eingefangene Oligonukleotid hybridisiert, was eine Integraseerkennungssequenz am freien Ende zur Folge hatte. HIV-1 Integrase (100 μl einer 33 μM Lösung) verdünnt 10-fach in Lösungspuffer (10 mM Tris·HCl, pH 7,5/750 mM NaCl/10% Glycerol/1 mM β-Mercaptoethanol) und weiterhin 10-fach in Puffer B, wurde in einer Endkonzentration von 330 nM mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 10 μl/Minute injiziert, indem zunächst ein leerer Kanal und danach der Kanal mit dem spezifischen Oligonukleotid passiert wurde. Eine spezifische Adsorption im leeren Kanal wurde subtrahiert. Nach Preinkubation der Integrase mit 93 μM Verbindung H, war die Verbindung der Integrase an die DNA vollständig beseitigt.
BEISPIEL 10 – Fehlen einer Interkalation von 4-(4-Nitrophenyl)-2,8-dithiol-4,6-dihydroxy-5H-pyrano[2,3-d:6,5-d']dipyrimidin in doppelsträngige DNA
Wir verifizierten, ob Verbindung H in doppelsträngige DNA interkalieren könnte, weil bekannt ist, daß Interkalatoren die Doppelhelix durch Insertion zwischen zwei aufeinanderfolgende Basenpaare stabilisieren. Diese Stabilisierung wird durch eine Zunahme der Schmelztemperatur des Doppelstranges (definiert als Temperatur, bei der 50% des Doppelstranges in zwei einzelnen Strängen dissoziiert sind) wiedergespiegelt. Wir verwendeten die doppelsträngige DNA aus dem in vitro Integrationsassay (INT1–INT2) in einer festgelegten Konzentration von 1 μM für jedes Oligodesoxynukleotid. Eine Reihenverdünnung von Verbindung H (25, 5, 1, 0,2, 0,04 und 0 μM) wurde unterschiedlichen Küvetten zugesetzt, die INT1–INT2 enthielten, wobei die Temperatur hiervon zunächst Schrittweise erhöht wurde (0,2°C/Minute) von 15°C bis 80°C und danach in derselben Geschwindigkeit nach unten auf 15°C gesenkt wurde, während die Extinktion bei 260 nm überwacht wurde. Die Schmelzkurven wurden mit einem Varian CARY 300 Bio Spectrophotometer bestimmt. Die Küvetten wurden mit Wasser, das durch den Küvettenhalter zirkulierte, thermostatisiert und die Temperatur der Lösung wurde mit einem Thermostat gemessen, das direkt in die Küvette eingetaucht war. Die Temperaturkontrolle und Datenaquisition wurde automatisch mit einem Compaq Deskpro Computer durchgeführt. Die Proben wurden zunächst erhitzt und danach bei einer Geschwindigkeit von 0,2°C pro Minute abgekühlt. Die Schmelzkurven wurden evaluiert, indem zunächst das erste Derivat mit dem Beugungspunkt, der die Tm anzeigt, entnommen wurde. Die Variabilität war weniger als 0,5°C.
Die so bestimmten Schmelzpunkte blieben in Gegenwart verschiedener Konzentrationen von Verbindung H unverändert (bei 59°C). Dies ist ein klarer Hinweis, daß Verbindung H doppelsträngige DNA durch Interkalation nicht stabilisiert.

Claims

Verwendung einer Zusammensetzung, die folgendes umfaßt: (a) ein oder mehrere Derivate eines Pyrano[2,3-d:6,5-d']dipyrimidins und (b) ein oder mehrere antiretrovirale Arzneistoffe zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer retroviralen Infektion in einem Säugetier, wobei (a) und (b) jeweils in solchen Anteilen vorliegen, daß eine synergistische Wirkung gegen die retrovirale Infektion erzielt wird.
Verwendung einer Zusammensetzung, die folgendes umfaßt: (a) ein oder mehrere Derivate eines Pyrano[2,3-d:6,5-d']dipyrimidins und (b) ein oder mehrere Arzneistoffe, die gegen ein oder mehrere retrovirale oder zelluläre Proteine wirksam sind, die in das Eindringen und/oder die Replikation eines Retrovirus involviert sind, zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung einer retroviralen Infektion in einem Säugetier jeweils in solchen Anteilen, daß eine synergistische Wirkung bei der Behandlung erzielt wird.
Verwendung einer Zusammensetzung, die folgendes umfaßt: (a) ein oder mehrere Derivate eines Pyrano[2,3-d:6,5-d']dipyrimidins und (b) ein oder mehrere antiretrovirale Arzneistoffe, einschließlich von Arzneistoffen, die gegen ein oder mehrere retrovirale oder zelluläre Proteine wirksam sind, die in das Eindringen und/oder die Replikation eines Retrovirus involviert sind, zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung einer retroviralen Infektion in einem Säugetier.
Produkt, das folgendes enthält: (a) ein oder mehrere Derivate eines Pyrano[2,3-d:6,5-d']dipyrimidins und (b) ein oder mehrere antiretrovirale Arzneistoffe, einschließlich von Arzneistoffen, die gegen ein oder mehrere retrovirale oder zelluläre Proteine wirksam sind, die in das Eindringen und/oder die Replikation eines Retrovirus involviert sind, jeweils in solchen Verhältnissen, um eine synergistische Wirkung gegen eine retrovirale Infektion in einem Säugetier zu erzielen, als Kombinationspräparat zur simultanen, getrennten oder aufeinanderfolgenden Verwendung in der retroviralen Infektionstherapie.
Produkt nach Anspruch 4, wobei der antiretrovirale Arzneistoff (b) ein Proteaseinhibitor ist.
Produkt nach Anspruch 4, wobei der antiretrovirale Arzneistoff (b) ein Inhibitor der reversen Transkriptase ist.
Produkt nach Anspruch 4, wobei der antiretrovirale Arzneistoff (b) ein anderer Integrase-Inhibitor als ein Derivat eines Pyrano[2,3-d:6,5-d']dipyrimidins ist.
Produkt nach einem der Ansprüche 4 bis 7 in Form einer pharmazeutischen Zubereitung, wobei zumindest eines von (a) und (b) in Mischung mit zumindest einem pharmazeutisch verträglichen Träger vorliegt.
Verwendung eines Derivats eines Pyrano[2,3-d:6,5-d']dipyrimidins zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung einer retroviralen Infektion in einem Säugetier.
Verwendung nach Anspruch 9, wobei die Behandlung die Hemmung eines retroviralen Enzyms umfaßt.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei das retrovirale Enzym eine Integrase ist.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei das retrovirale Enzym eine reverse Transkriptase ist.
Produkt nach einem der Ansprüche 4 bis 8, wobei die retrovirale Infektion eine lentivirale Infektion ist.
Produkt nach einem der Ansprüche 4 bis 8, wobei die retrovirale Infektion eine HIV-Infektion ist.
Produkt nach einem der Ansprüche 4 bis 8, wobei das Derivat von Pyrano[2,3-d:6,5-d']dipyrimidin ein 5-(4-substituiertes Phenyl)-5H-pyrano[2,3-d:6,5-d']dipyrimidin mit der folgenden Formel:
wobei: – X aus Hydroxy, Halo und Thiol ausgewählt ist, – Y aus Hydroxy, Methoxy und Halo ausgewählt ist und – Z aus Wasserstoff, Halo und Nitro ausgewählt ist, ein pharmazeutisch verträgliches Additionssalz oder eine stereochemisch isomere Form hiervon ist.
Produkt nach einem der Ansprüche 4 bis 8, wobei das Derivat von Pyrano[2,3-d:6,5-d']dipyrimidin 5-(4-Nitrophenyl)-2,8-dithiol-4,6-dihydroxy-5H-pyrano[2,3-d:6,5-d']dipyrimidin ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1–3, wobei der antiretrovirale Arzneistoff (b) ein Proteaseinhibitor ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1–3, wobei der antiretrovirale Arzneistoff (b) ein reverser Transkriptase-Inhibitor ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1–3, wobei der antiretrovirale Arzneistoff (b) ein anderer Integraseinhibitor als ein Derivat eines Pyrano[2,3-d:6,5-d']dipyrimidins ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1–3 und 9–12, wobei die retrovirale Infektion eine lentivirale Infektion ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1–3 und 9–12, wobei die retrovirale Infektion eine HIV-Infektion ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1–3 und 9–12, wobei das Derivat eines Pyrano[2,3-d:6,5-d']dipyrimidins ein 5-(4-substituiertes Phenyl)-5H-pyrano[2,3-d:6,5-d']dipyrimidin mit der folgenden Formel:
wobei: – X aus Hydroxy, Halo und Thiol ausgewählt ist, – Y aus Hydroxy, Methoxy und Halo ausgewählt ist und – Z aus Wasserstoff, Halo und Nitro ausgewählt ist, ein pharmazeutisch verträgliches Additionssalz oder eine stereochemisch isomere Form hiervon ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1–3 und 9–12, wobei das Derivat eines Pyrano[2,3-d:6,5-d']dipyrimidins 5-(4-substituiertes Nitrophenyl)-2,8-dithiol-4,6-dihydroxy-5H-pyrano[2,3-d:6,5-d']dipyrimidin ist.