JP2004500886A - 植物リパーゼをコードするｄｎａ、遺伝子導入植物および植物における老化を制御するための方法 - Google Patents
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Abstract
老化発現の調節は、老化誘導リパーゼをコードする遺伝子または遺伝子断片をアンチセンス方向に植物ゲノム中に組み込むことにより達成される。老化誘導リパーゼをコードするカーネーションおよびシロイヌナズナ遺伝子は識別され、ヌクレオチド配列は遺伝子導入植物における老化を修正するために用いられる。
Description
【０００１】
発明の分野
本発明は、植物ポリペプチドをコードし、老化誘導発現を示すポリヌクレオチド、アンチセンス方向にポリヌクレオチドを含有する遺伝子導入植物および植物における老化を制御するための方法に関する。さらに詳細には、本発明は、それらの発現が老化の開始により誘導される植物リパーゼ遺伝子、および植物における老化を制御するためのリパーゼ遺伝子の使用に関する。
【０００２】
従来技術の説明
老化は植物生命の生物学的生育の終末過程である。それは死の前兆となり、全植物、器官、花および果実、組織および個々の細胞を含む種々のレベルの生物学的組織で起こる。
【０００３】
細胞膜劣化は老化の初期のおよび基本的な態様である。脂質、特に膜脂質の代謝は、細胞老化におけるいくつかの生物学的兆候の内の一つである。バラの花弁は、例えば、老化が進むにつれて、膜機能の損失に付随して起こるアシル加水分解酵素活性の増加を持続する（Ｂｏｒｏｃｈｏｖ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１９８２，６９，２９６〜２９９）。細胞膜劣化は、透過性の増加、イオン勾配の損失およびイオンポンプなどの鍵になる膜タンパク質の機能低下を生み出す老化の初期の特徴的な態様である（Ｂｒｏｗｎ， ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．：Ａ Ｔｒｅａｔｉｓｅ， Ｖｏｌ． Ｘ． Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９１，ｐｐ． ２２７〜２７５）。
【０００４】
膜構造および機能の完全性の減損の多くは、リパーゼ介在リン脂質代謝に帰することができる。リン酸脂質の損失は、花弁、葉、子葉および熟成果実を老化させることを実証してきた（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｅ．，Ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ Ａｇｉｎｇ ｉｎ Ｐｌａｎｔｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９８８，ｐｐ．５１〜８３）し、且つ、これは細胞機能の減損を招く進行性老化を伴う二分子膜の分子組織に大きな変更をもたらすように見える。特に、多くの老化植物組織による研究において、二分子膜における脂質代謝産物の集積に起因すると思われる膜中の脂質相分離に対する証拠が提供されてきた（ＭｃＫｅｒｓｉｅ ａｎｄ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，１９７９， Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，５０８： １９７〜２１２；Ｃｈｉａ，ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙ ｓｉｏｌ．， ６７：４１５〜４２０）。老化組織における脂質代謝の多くは、遺伝子発現での老化特有の変化を通して実現されるという証拠が増えてきている（Ｂｕｃｈａｎａｎ− Ｗｏｌｌａｓｔｏｎ，Ｖ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｏｔ．，１９９７，３０７：１８１〜１９９）。
【０００５】
老化の開始は内部、および外部両方の各種因子により誘発することができる。例えば、エチレンは種子発芽、苗成長、果実熟成および花老化などの多様な植物生育過程において多くの植物で役割を果たす。植物におけるエチレン産生は、また、機械的創傷、化学薬品、ストレス（温度および水量変化により生み出されるような）、および疾病により引き起こされる外傷と結びつけることができる。エチレンは多くの植物における葉の老化の調節にかかわってきたが、しかし、遺伝子導入植物およびエチレン反応突然変異体により得られる証拠によって、エチレンは老化に対する影響を有するが過程の本質的な調節物ではないことが示されてきた。
【０００６】
多くの植物において、エチレンは果実成熟または老化では役割を全く持っていないように見える。例えば、イチゴなどの非クライマクテリック植物の果実の成熟、ヤブカンゾウなどの一部の花の老化、およびシロイヌナズナなどの一部の植物および特に単子葉植物における葉の老化において、エチレン信号に対する要求は全くない（Ｓｍａｒｔ，Ｃ．Ｍ．， １９９４，Ｎｅｗ Ｐｈｙｔｏｌｏｇｙ，１２６：４１９〜４４８；Ｖａｌｐｕｅｓｔａ，ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２８：５７５〜５８２）。
【０００７】
老化の早期開始を誘発する外部因子には、温度、日照り、乏しい光または栄養供給量、および病原体攻撃などの環境ストレスが挙げられる。自然の（年齢に関係する）老化の場合におけるように、環境ストレス誘発老化は細胞膜の完全性の損失を特徴とする。特に、環境ストレスへの暴露は、これらすべてがリパーゼの作用に帰することができる膜損傷を示す電解質漏れ（Ｓｈａｒｏｍ，ｅｔ ａｌ．，１９９４， ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．，１０５：３０５〜３０８；Ｗｒｉｇｈｔ，Ｍ．，１９７４，Ｐｌａｎｔａ，１２０：６３〜６９；ａｎｄ Ｅｚｅ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉａ Ｐｌａｎｔａｒｕｍ，６８：３２３〜３２８）、膜リン脂質レベルの低下（Ｗｒｉｇｈｔ，Ｍ．，１９７４，Ｐｌａｎｔａ，１２０：６３〜６９）および脂質相遷移（Ｓｈａｒａｍ，ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．， １０５：３０５〜３０８）を誘発する。
【０００８】
環境ストレスに暴露された植物組織は、また、通常ストレスエチレンとして知られるエチレンを産生する（Ｂｕｃｈａｎａｎ− Ｗｏｌｌａｓｔｏｎ，Ｖ．，１９９７，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｏｔａｎｙ．，４８：１８１〜１９９；Ｗｒｉｇｈｔ，Ｍ．，１９７４，Ｐｌａｎｔａ，１２０：６３〜６９）。上述のように、エチレンは一部の植物において老化を引き起こすとして知られる。漏れを引き起こす膜劣化は、また、種子老化の種子の態様であり、これはまた膜リン脂質からの脂肪酸の脱エステル化を示すという証拠がある（ＭｃＫｅｒｓｉｅ， Ｂ．Ｄ．， Ｓｅｎａｒａｔａ，Ｔ．，Ｗａｌｋｅｒ，Ｍ．Ａ．，Ｋｅｎｄａｌｌ，Ｅ．Ｊ．ａｎｄ Ｈｅｔｈｅｒｉｎｇｔｏｎ，Ｐ．Ｒ．Ｉｎ： Ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ Ａｇｉｎｇ ｉｎ Ｐｌａｎｔｓ， Ｅｄ． Ｌ．Ｄ． Ｎｏｏｄｅｎ ａｎｄ Ａ．Ｃ． Ｌｅｏｏｐｏｉｄ，ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８８．ｐｐ ４４１〜４６４）。
【０００９】
内部または外部例えば環境ストレスいずれかの因子により生じる老化の開始を制御するための広く適用可能な方法は、現在、全くない。現在、果実、花および野菜などの新鮮な腐りやすい植物農産物の老化を制御し、保存寿命を増大させるための技術は、主としてエチレン生合成の減少に依存している。例えば、米国特許第５，８２４，８７５号には、アンチセンス方向における３種の１−アミノ−シクロプロパン−１−カルボン酸塩（ＡＣＣ）シンターゼ遺伝子の内の一つの発現から得られるエチレンレベルの減少のせいで長くなった保存寿命を示す遺伝子導入ゼラニウム植物が開示されている。結局、この技術はエチレン感受性である限定された範囲の植物だけに適用可能である。
【００１０】
一部の果実の保存寿命は、また、熟成を一層緩やかに起こさせるようにするエチレン生合成の減少により延ばされる。これら果実の老化は熟成後に誘発されるので、保存寿命に及ぼす減少エチレン生合成の影響は間接的である。果実熟成を遅らせるために用いられる別の方法は、熟成の初期段階の間に合成されるポリガラクツロナーゼ、細胞壁軟化酵素の細胞レベルを変更することによるものである。この方法は、それがまた間接的にのみ老化に影響し、再度狭い範囲の植物だけに適用可能である点において、エチレン生合成の制御に類似している。
【００１１】
このように、多様な植物に適用可能である植物の老化を制御する方法に対する必要性がある。従って、エチレン感受性に関係なくすべてのタイプの植物に適用可能である老化調節技術を開発することに興味がおかれる。
【００１２】
発明の概要
本発明は、カーネーション老化誘導リパーゼをコードする全長ｃＤＮＡクローン、およびシロイヌナズナ老化誘導リパーゼをコードする全長ｃＤＮＡクローンの発見およびクローン作成に基づく。老化誘導リパーゼ遺伝子のためのヌクレオチド配列および対応アミノ酸配列は、本明細書において開示される。カーネーション老化誘導リパーゼ遺伝子のヌクレオチド配列は、同様に制御されるいくつかの植物における対応遺伝子またはＲＮＡ転写体を検出するための異種プローブとして良好に用いられてきた。
【００１３】
本発明は、植物の遺伝子組み換えが年齢関与の老化または環境ストレス誘発老化いずれかの老化の開始を制御する方法を提供する。本発明の老化誘導リパーゼヌクレオチド配列、それらの断片、またはこうした断片の組合せは、内生老化誘導リパーゼ遺伝子の発現を抑制するために逆方向に植物細胞中に導入され、それによって、内生老化誘導リパーゼのレベルを低下させ、形質転換植物における老化を変更する。
【００１４】
本発明の方法を用いて遺伝子導入植物を生成し、生育および発達を監視する。老化誘導リパーゼのレベル低下のせいで植物の生育、開花期に関して長期化した寿命または保存期間、果実損傷の減少、種子熟成の減少および／または葉の黄変の減少を示す植物および植物の分離部分（例えば、挿し木、花、野菜、果実、種子または葉）は、葉の黄変減少、花弁離脱減少、出荷および貯蔵の間の果実損傷の減少を含む改善された特性を有する望ましい産物として選択される。これらの優れた植物は繁殖される。同様に、環境ストレスに対する耐性の増加、例えば、低温度（凍るような）、日照り、感染、などに対する感受性の低減を示す植物は、優れた産物として選択される。
【００１５】
一つの態様において、本発明は、ＤＮＡ分子が配列番号：１とハイブリダイズする老化誘導リパーゼをコードする単離されたＤＮＡ分子、または配列番号：１とハイブリダイズする単離されたＤＮＡ分子の機能誘導体を目指す。本発明の一つの実施形態において、単離されたＤＮＡ分子は、配列番号：１のヌクレオチド配列、すなわち、配列番号：１に対して１００％の相補性（配列同一性）を有する。本発明におけるこの態様の別の実施形態において、単離されたＤＮＡ分子は配列番号：４のヌクレオチド配列を含有する。
【００１６】
本発明は、また、ＤＮＡ分子が配列番号：１８とハイブリダイズする老化誘導リパーゼをコードする単離されたＤＮＡ分子、または配列番号：１８とハイブリダイズする単離されたＤＮＡ分子の機能誘導体を目指す。本発明におけるこの態様の一つの実施形態において、単離されたＤＮＡ分子は、配列番号：１８のヌクレオチド配列、すなわち、配列番号：１８に対して１００％の相補性（配列同一性）を有する。本発明におけるこの態様の別の実施形態において、単離されたＤＮＡ分子は配列番号：１９のヌクレオチド配列を含有する。
【００１７】
本発明の別の実施形態において、本明細書において上述したようにＤＮＡ分子によりコードされる単離されたタンパク質、またはその機能誘導体が提供される。好ましいタンパク質は配列番号：２のアミノ酸配列を有するか、または、その機能誘導体である。
【００１８】
また、本明細書において、ＲＮＡ分子が内生老化誘導リパーゼの発現を変更するようにＲＮＡ転写体とハイブリダイズする、本明細書において上述したＤＮＡ分子のＲＮＡ転写体の少なくとも一部に相補的であるＲＮＡ分子をコードするアンチセンス・オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが提供される。アンチセンス・オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは全長であり得るか、または、好ましくは、約６〜約１００のヌクレオチドを有する。
【００１９】
アンチセンス・オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、老化誘導リパーゼをコードするＤＮＡ分子が配列番号：１、配列番号：１８または両方とハイブリダイズするか、または老化誘導リパーゼをコードする単離されたＤＮＡ分子によりコードされるＲＮＡ配列の対応部分に実質的に相補的である、老化誘導リパーゼをコードするＤＮＡ分子の一つの鎖の対応部分に対して実質的に相補的である。本発明の一つの実施形態において、アンチセンス・オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、配列番号：１、配列番号：１８または両方または配列番号：１によりコードされるＲＮＡ転写体の一つの鎖の対応部分に対して実質的に相補的である。
【００２０】
別の実施形態において、アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ分子が配列番号：１、配列番号：１８または両方とハイブリダイズする老化誘導リパーゼをコードするＤＮＡ分子の、一つの鎖の５’非コード部分または３’末端部分の約１００〜約２００ヌクレオチドの対応部分に実質的に相補的である。別の実施形態において、アンチセンス・オリゴ−またはポリヌクレオチドは、ヌクレオチド配列番号：４または配列番号：４によりコードされるＲＮＡ転写体の一つの鎖の読取り枠の対応部分に対して実質的に相補的である。
【００２１】
本発明は、さらに、以下を含む植物細胞形質転換のためのベクターを目指す：
（ａ） （１）配列番号：１、配列番号：１８または両方とハイブリダイズする、老化誘導リパーゼをコードするＤＮＡ分子の一つの鎖の対応部分、または（２）老化誘導リパーゼをコードするＤＮＡ分子によりコードされるＲＮＡ配列の対応部分に対して実質的に相補的なアンチセンス・ヌクレオチド配列；および
（ｂ） アンチセンス・ヌクレオチド配列が、形質転換される植物細胞中に発現されるように、アンチセンス・ヌクレオチド配列に作用可能に連結された制御配列。
【００２２】
制御配列には、誘導的または構成的であり得る、形質転換植物細胞中で機能的なプロモーターが挙げられる。場合により、制御配列はポリアデニル化信号を含む。
本発明は、また、上述のようなベクターにより形質転換される植物細胞、こうした細胞から生成される苗または成熟植物、またはこうした苗または植物の植物部分を提供する。
【００２３】
本発明は、さらに、以下を含む、非形質転換植物に比べて老化誘導リパーゼの減少したレベルを有する植物を生産する方法を目指す：
（１）上述のようにベクターにより植物を形質転換し、
（２）植物が少なくとも苗の段階まで成長することを可能とし、
（３）変更された老化誘導リパーゼ活性および／または変更された老化および／または変更された環境ストレス誘発老化および／またはエチレン誘発老化に対する形質転換植物または苗を検定し、そして
（４）非形質転換植物に比べて変更された老化誘導リパーゼ活性および／または変更された老化および／または変更された環境ストレス誘発老化またはエチレン誘発老化を有する植物を選択し繁殖させる。
【００２４】
上述のように生産された植物、またはその系統、ハイブリッド体、クローン体または植物部分は、好ましくは、減少した老化誘導リパーゼ発現および遅延化した老化および／または遅延化した環境ストレス誘発老化またはエチレン誘発老化を示す。
【００２５】
本発明は、さらに、植物細胞中の内生老化誘導リパーゼの発現を抑制する方法を目指し、
（１）（Ａ）（ｉ）配列番号：１、配列番号：１８または両方とハイブリダイズする、内生老化誘導リパーゼをコードするＤＮＡ分子の一つの鎖の対応部分、または（ｉｉ）内生老化誘導リパーゼ遺伝子によりコードされるＲＮＡ配列の対応部分に対して相補的なアンチセンス・ヌクレオチド配列；および
（Ｂ）アンチセンス・ヌクレオチド配列が発現されるように、アンチセンス・ヌクレオチド配列に作用可能に連結された制御配列、
を含むベクターを植物のゲノム中に組み込むこと、および
（２）前記植物を成長させ、それによって前記アンチセンス・ヌクレオチド配列が転写され、転写体が前記内生ＲＮＡに結合し、それによって前記老化誘導リパーゼ遺伝子の発現が抑制されること、
を含む。
【００２６】
本発明の詳細な説明
方法および組成物は、植物細胞における老化誘導リパーゼ遺伝子（複数を含む）の発現を変更するために提供される。植物における老化誘導リパーゼ遺伝子（複数を含む）の発現の変更は、老化開始の遅延化および環境ストレスに対する耐性の改善をもたらし、その結果、植物の保存寿命および／または成長期間を延長させる。
【００２７】
老化誘導発現を示すカーネーションリパーゼ遺伝子をコードする全長ｃＤＮＡ配列は、カーネーション（ナデシコ科ナデシコ属）花の老化花弁のＲＮＡから作製されるｃＤＮＡライブラリーから単離された。単離カーネーション花リパーゼｃＤＮＡ配列の選択領域およびカーネーションリパーゼｃＤＮＡに対応するポリヌクレオチドプローブは、老化カーネーションの葉、成熟トマト果実および老化グリーン・ビーンズの葉、ならびに環境ストレス下の（冷却した）トマトの葉におけるリパーゼ遺伝子をコードするｍ ＲＮＡの存在を測定するために用いられた。カーネーションリパーゼｃＤＮＡから設計されるプライマーは、鋳型としてトマト葉のゲノムＤＮＡを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を生み出すために用いられた。ＰＣＲ産物は、保存リパーゼ共通モチーフ、ＩＴＦＴＧＨＳＬＧＡ（配列番号：３）を含む部分タンパク質配列をコードする部分読取り枠を含有する。
トマトヌクレオチド配列は、カーネーション老化誘導リパーゼ配列と５３．４％の配列同一性およびシロイヌナズナリパーゼ配列と４３．５％の同一性を有する。シロイヌナズナリパーゼ配列は、カーネーションヌクレオチド配列と４４．３％同一性を有する。
【００２８】
本発明のカーネーション老化誘導リパーゼ遺伝子は、カーネーションリパーゼ源、細胞質ゾルの脂質タンパク質粒子に対して引き起こされる抗体により老化カーネーション花弁から調製されるｃＤＮＡ発現ライブラリーを選別することにより単離された。カーネーション老化誘導リパーゼ遺伝子に対応する正の全長ｃＤＮＡクローンが得られ、配列された。老化誘導リパーゼｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列は配列番号：１に示される。ｃＤＮＡクローンは、計算分子質量５０．２ｋＤａを有する４４７アミノ酸ポリペプチド（配列番号：２）をコードする。アシル加水分解酵素活性を示す所期の分子量のタンパク質、すなわち、発現タンパク質を生成する大腸菌中のｃＤＮＡクローンの発現は、パルミチン酸ｐ−ニトロフェニル、リン脂質およびトリアシルグリセロールを加水分解する。それは、生育中のカーネーション花における酵素の発現パターンおよびタンパク質の活性に基づき、老化に関与する。
【００２９】
本発明のシロイヌナズナ老化誘導リパーゼ遺伝子は、また、反応において鋳型として老化シロイヌナズナ葉のｃＤＮＡライブラリーを用いるＰＣＲにより単離された。シロイヌナズナ老化誘導リパーゼ遺伝子のヌクレオチドおよび誘導アミノ酸配列は図１４に示される（配列番号：１８）。それは、生育中の植物におけるリパーゼ遺伝子の発現パターンに基づき、老化に関与する。
【００３０】
全長カーネーションｃＤＮＡによりプローブされたカーネーション花弁全ＲＮＡのノーザンブロットは、老化誘導リパーゼ遺伝子の発現が自然の老化の開始直前に有意に誘発されることを示す（図４）。ノーザンブロット分析は、また、環境ストレスに反応して生成されることが知られる老化誘導リパーゼ遺伝子が環境ストレス条件、例えば、冷却（図１２）およびエチレン（図４および９）により誘発されることを実証する。ノーザンブロット分析は、また、カーネーション老化誘導リパーゼｍＲＮＡの存在が若年段階Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩのカーネーション花弁におけるよりも老年期（生育段階ＩＶ）において有意により高くあることを示す。さらに、エチレン刺激段階ＩＩの花は、また、より高い老化誘導リパーゼ遺伝子発現を示す。同様に、冷却温度にさらされ室温に戻された植物は、また、冷却損傷症状（例えば、洩れ）の進展と一致する老化誘導リパーゼ遺伝子の誘発発現を示す（図１１および１２）。
【００３１】
シロイヌナズナ老化誘導リパーゼ遺伝子の発現は同様に調節される。種々の生育段階におけるシロイヌナズナ植物の葉からの全ＲＮＡのノーザンブロット分析は、リパーゼ遺伝子が葉の老化の開始と一致して上方調節されることを示す（図１５）。また、カーネーション老化誘導リパーゼ遺伝子のように、シロイヌナズナ老化誘導リパーゼ遺伝子はエチレン、葉の老化を誘発する植物ホルモンでの処理により上方調節される（図１６）。
【００３２】
種々の植物、例えば、カーネーション、グリーン・ビーンズ、トマト、シロイヌナズナ、および種々の植物組織、例えば、葉、果実および花における遺伝子発現の総合パターンにより、本発明のリパーゼ遺伝子がこれらの植物および植物組織における老化の開始に関与していることが実証される。従って、植物組織における老化誘導リパーゼ遺伝子の発現を実質的に抑制するかまたは変更することにより、生の果実、花および野菜の保存寿命を増大させて、老化、劣化および損傷を遅延させ得ることが期待される。これは、好ましくは、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターなどの構成的プロモーターを用いるか、または組織特定的または老化誘導性プロモーターを用いて、リパーゼｃＤＮＡまたはそのオリゴヌクレオチド断片が中で果実、花、野菜、農作物植物および森林種においてアンチセンス構造で発現される遺伝子導入植物を作製することにより達成することができる。
【００３３】
カーネーション老化誘導リパーゼ遺伝子は単一複製遺伝子である。老化誘導リパーゼｃＤＮＡの読取り枠内の配列を認識しない種々の制限酵素により切断されたカーネーションゲノムＤＮＡのサザーンブロット分析を行った。制限酵素消化ゲノムＤＮＡを３２Ｐ−ｄＣＴＰ標識全長ｃＤＮＡ（配列番号：１）によりプローブした。高度に厳しいハイブリダイズ条件下で、ただ一つだけの制限断片がｃＤＮＡクローンに対してハイブリダイズする（ハイブリダイズおよび洗浄の両方に対して６８℃；洗浄緩衝液：０．２％ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）。従って、カーネーション老化誘導リパーゼ遺伝子は単一複製遺伝子である（図６）。この遺伝子はカーネーションにおける多遺伝子系の一員ではないという事実が、それが他植物における単一複製遺伝子であることを強く示唆している。
【００３４】
カーネーション老化誘導リパーゼ遺伝子またはシロイヌナズナ老化誘導リパーゼ遺伝子の完全なヌクレオチド配列の知識は、種々の他植物種から老化誘導リパーゼ遺伝子（複数を含む）を単離することには十分である。実際、本明細書において実証されるように、カーネーションｃＤＮＡ配列に基づくオリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型としてトマトの葉のゲノムＤＮＡを用いるポリメラーゼ連鎖反応によりトマトの葉の老化誘導リパーゼ遺伝子断片を生成するために良好に用いられてきた。
【００３５】
クローン化老化誘導リパーゼ遺伝子（複数を含む）またはその（それらの）断片（複数を含む）は、単独でまたは組合せて、イチジクイボのモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、カリフラワーモザイクウイルスプロモーターＣａＭＶ３５ＳまたはＭＡＳプロモーターなどの構成的プロモーターの制御下で逆方向（アンチセンス）に導入される場合、遺伝子的に植物を組み換え、組み換え植物において老化を変更するために用いることができる。
【００３６】
カーネーション老化誘導リパーゼ遺伝子との十分な配列同一性を共有する他の植物からの選択されたアンチセンス配列は、類似の遺伝子組み換えを達成するために用いることができる。遺伝子組み換えの一つの結果は、内生の翻訳可能な老化誘導リパーゼコードｍＲＮＡの量の減少である。結局、植物細胞中に作製された老化誘導リパーゼの量は減少し、それによって、細胞膜損傷および細胞漏れ、例えば、高齢化または環境ストレスのせいで減退した葉、果実および／または花の老化および損傷の量を減少させる。
【００３７】
例えば、アンチセンス方向の全長シロイヌナズナ老化誘導リパーゼ遺伝子を発現するベクターにより形質転換されるシロイヌナズナ植物は、二重３５Ｓプロモーターの調節下において、図１７および１８に示されるように野生型植物に比べてより大きな葉のサイズと全体的により大きな植物成長を見せる。これらの植物は、また、図１９に示されるように遅延化した葉の老化を実証する。
【００３８】
遺伝子導入シロイヌナズナ植物におけるアンチセンス方向の全長リパーゼ遺伝子を発現することによりもたらされる老化誘導リパーゼ遺伝子の減退発現の効果は、また、形質転換植物における種子収量の増加として見られる。全長老化誘導リパーゼ遺伝子を発現するシロイヌナズナ植物株は、野生型植物よりも約２〜３倍多い種子を生産する（図２０）。
【００３９】
生物体量、葉の老化および種子収量に関して遺伝子導入植物に見られる効果が、これら植物における老化誘導リパーゼの減少のせいであることは、図２１に示される。本発明の遺伝子導入植物は、野生型植物に比べて有意に減少した老化誘導リパーゼの発現を示す。
従って、本発明の方法および手順は、葉または果実損失を含む植物損失を遅延化させ、且つ植物生物体量および種子収量を増加させるために用いることができると共に、一般に、植物における老化を変更することができる。
【００４０】
本発明の単離ヌクレオチド配列は、実質的に相補的な老化誘導リパーゼヌクレオチド配列を他の植物または器官から単離するために用いることができる。これらの配列は、次に、植物を形質転換し、それによって、本明細書において示される単離ヌクレオチド配列の使用で示されるのと同じやり方において形質転換された植物の老化を変更するために用いることができる。
【００４１】
老化誘導リパーゼ、その機能性断片またはそれらの組合せを持つ植物の形質転換により見られる遺伝子組み換えは、植物における老化誘導リパーゼのレベルの恒久的な変化をもたらすことができると共に、自殖または他の繁殖機構により子孫植物に増殖させることができる。遺伝子的に変更された植物は、変更が世代間に着実に伝播される植物の新株を生み出すために用いられる。本発明は、広範囲にわたる各種植物における老化の安定な遺伝子組み換えを達成するために用いることが可能である適切なＤＮＡ配列を、初めて、提供する。
【００４２】
老化誘導リパーゼ遺伝子の識別および単離のために、一般に、プラスミドＤＮＡ、制限酵素消化、ＤＮＡのアガロースゲル電気泳動、タンパク質のポリアクリルアミドゲル電気泳動、サザーンブロット、ノーザンブロット、ＤＮＡライゲーションおよび細菌形質転換を、技術上周知の従来の方法を用いて行った。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９を参照すること。核酸ハイブリダイズの技術はＳａｍｂｒｏｏｋ（上記）により開示されている。
【００４３】
本明細書において用いられる、用語「植物」又は「植物」は、全体植物、植物部分、植物細胞または植物細胞の一群を指す。本発明の方法において用いることができる植物のタイプには、例えば、エチレン感受性およびエチレン非感受性植物；アンズ、リンゴ、オレンジ、バナナ、グレープフルーツ、ナシ、トマト、イチゴ、アボカド、などの果実担持植物；ニンジン、えんどう豆、レタス、キャベツ、カブ、ポテト、ブロッコリ、アスパラガス、などの野菜；カーネーション、バラ、キクなどの花；および、一般に、本発明のＤＮＡ分子を取り上げ、発現することができるあらゆる植物が挙げられるがそれらに限定されない。それは、半数体、２倍体、４倍体および倍数体を含む多様な倍数レベルの植物を包含することが可能である。
【００４４】
遺伝子導入植物は、本明細書において、異種または相同老化誘導リパーゼＤＮＡまたは組み換えＤＮＡ、または異種老化誘導リパーゼＤＮＡまたは相同老化誘導リパーゼＤＮＡの一部をそのゲノム中に組み込んだ植物に限定されないがそれらを含み、何らかの方法で遺伝子的に形質転換される植物として定義される。変更された遺伝子材料は、タンパク質をコードし、調節または制御配列を含むことが可能であるか、または、アンチセンス配列であるかまたはそれを含むか、あるいは、植物の内生老化誘導リパーゼＤＮＡまたはｍ ＲＮＡ配列またはその部分に対してアンチセンスであるアンチセンスＲＮＡをコードすることが可能である。「導入遺伝子」または「遺伝子導入配列」は、遺伝子導入植物中に組み込まれた外部遺伝子または部分配列として定義される。
【００４５】
本明細書において用いられる用語「ハイブリダイズ」は、一般に、プローブ配列および標的配列の性質に応じて決まる当業者にとって容易に明白であるような適切な厳格（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）条件での核酸のハイブリダイズを意味するために用いられる。ハイブリダイズおよび洗浄の条件は技術上周知であり、培養時間、温度および／または溶液のイオン強度を変動させることによる所期の厳しさに応じて決まる条件の調整は、容易に達成される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９を参照すること。条件の選択は、ハイブリダイズされる配列の長さ、特に、プローブ配列の長さ、核酸の相対的なＧ−Ｃ含量および許容される不適正塩基対の量により決定される。
【００４６】
低緊縮条件は、より少ない程度の相補性を有する鎖間の部分ハイブリダイズが望まれる場合に好ましい。完全なまたはほぼ完全な相補性が望まれる場合には、高緊縮条件が好ましい。一般的な高緊縮条件として、ハイブリダイズ溶液は６ｘＳ．Ｓ．Ｃ．、０．０１ＭＥＤＴＡ、１ｘデンハルト溶液および０．５％ＳＤＳを含有する。ハイブリダイズは、約６８℃でクローン化ＤＮＡの断片に対して約３〜約４時間にわたり、全真核ＤＮＡに対して約１２〜約１６時間にわたり行われる。低緊縮条件として、ハイブリダイズ温度は二重体の融点（ＴＭ）の約１２℃下に下げられる。ＴＭはＧ−Ｃ含量および二重体の長さならびに溶液のイオン強度の関数であることが知られている。
【００４７】
本明細書において用いられる、用語「実質的な配列同一性」または「実質的な相同性」は、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列が別のヌクレオチドまたはアミノ酸配列と実質的な構造および機能同等性を現すことを示すために用いられる。実質的な配列同一性または実質的な相同性を有する配列間のあらゆる構造または機能差異は僅少である；すなわち、それらは所期の適用において示されるように機能する配列の能力に影響を及ぼさない。差異は、例えば、異なる種の中でのコドン使用頻度における固有偏差のせいであり得る。構造差異は、２以上の異なる配列間の配列の重なりまたは類似性の有意な量がある場合、またはたとえ配列が長さまたは構造において異なる場合でも、僅少と考えられる。こうした特性には、例えば、確定された条件下でハイブリッドを形成する能力、またはタンパク質の場合における免疫学的交差反応性、類似の酵素反応性、などが挙げられる。
【００４８】
加えて、２ヌクレオチド配列は、それらの間での配列が少なくとも約４０％、さらに好ましくは少なくとも約６０％、および最も好ましくは約９０％の配列類似性を有する場合に、「実質的に相補的」である。２アミノ酸配列は、それらがポリペプチドの活性部分間での少なくとも４０％、好ましくは７０％の類似性を有する場合に、実質的に相同である。
【００４９】
本明細書において用いられる、用語ＤＮＡまたはＲＮＡ分子の「対応部分に対してハイブリダイズする」は、例えば、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、またはあらゆるヌクレオチド配列（センスまたはアンチセンス方向における）とハイブリダイズする分子が、ほぼ同じサイズであり適切な条件下でハイブリダイズをもたらすに十分なそれに対する配列類似性を有する別の核酸分子における配列を認識し、それにハイブリダイズすることを意味する。
【００５０】
例えば、カーネーションリパーゼの３’コードまたは非コード領域からの１００ヌクレオチド長アンチセンス分子は、２配列間の約７０％ 以上の配列類似性がある限り、シロイヌナズナ老化誘導リパーゼ遺伝子またはあらゆる他の植物老化誘導リパーゼ遺伝子それぞれの３’コードまたは非コード領域内のヌクレオチド配列の約１００ヌクレオチド部分を認識し、それにハイブリダイズする。「対応部分」のサイズは、「対応部分」が例えば２０〜３０％より大きいかまたはより小さいか、好ましくは約１２〜１５％未満でより大きいかまたはより小さいかでそれにハイブリダイズする分子に比べて、より小さいかまたはより大きくあることが可能であるように、ハイブリダイズにおける一部の不適正塩基対を可能とさせることは理解できる。
【００５１】
用語、核酸（またはポリ−またはオリゴヌクレオチド）の「機能誘導体」は、本明細書において、老化誘導リパーゼをコードする遺伝子またはヌクレオチド配列の断片、変異体、相同体、または類似物を意味するために用いられる。機能誘導体は、本発明によるその効用を可能とするＤＮＡをコードする老化誘導リパーゼの機能の少なくとも一部を保持することが可能である。こうした機能には、自然カーネーション老化誘導リパーゼまたは老化誘導リパーゼをコードする別の植物からの実質的に相同なＤＮＡと、またはそのｍＲＮＡ転写体とハイブリダイズするか、またはアンチセンス方向において、植物老化誘導リパーゼｍＲＮＡの転写および／または翻訳などを抑制する能力を挙げることが可能である。
【００５２】
遺伝子またはＤＮＡ配列の「断片」は分子のあらゆる部分、例えば、より短いポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを指す。「変異体」は、１以上の置換ヌクレオチドを有するヌクレオチド置換変異体などの、全体遺伝子またはその断片のいずれかに実質的に類似の分子を指すが、しかし、これは特定の遺伝子とハイブリダイズするか、または自然のＤＮＡとハイブリダイズするｍＲＮＡをコードする能力を維持する。「相同体」は異なる植物属または種からの断片または変異体配列を指す。「類似物」は、全体分子、変異体またはその断片のいずれかに実質的に類似か、またはそれに関して機能する非自然分子を指す。
【００５３】
遺伝子、例えば老化誘導リパーゼ遺伝子の「変更された発現」または「組み換え発現」とは、それによって、遺伝子の通常の発現、例えば、非組み換えカーネーションまたは他の植物に起こるその発現が何らかの方法で変更されるあらゆる方法または結果を意味する。本明細書において意図されるように、遺伝子発現における変更は、老化誘導リパーゼ遺伝子の発現を完全にまたは部分的に減少させるが、しかし、また、発現時期の変更、または老化誘導リパーゼ遺伝子の発現が非組み換え植物または品種において最も自然に起こりやすいであろうものと異なる別の状態を含むことが可能である。好ましい変更は、非組み換え植物における産物に比較して植物による老化誘導リパーゼ産物の減少をもたらす。
【００５４】
本発明による遺伝子的に変更された植物を生産することにおいて、所期の形質、一般的に減少した老化誘導リパーゼ発現または生産量によって、個々の苗または植物を選択することは好ましい。老化誘導リパーゼの発現は、例えば、本明細書において記載される特定の抗体を用いる従来の免疫検定法で定量化することができる。また、老化誘導リパーゼの酵素活性は、本明細書において記載される生化学的方法を用いて測定することができる。
【００５５】
新規に挿入された遺伝子またはＤＮＡ配列が、それがコードするタンパク質の産生をもたらして発現するか、またはアンチセンスＤＮＡの場合、アンチセンスＲＮＡ分子をもたらして転写されるために、適正な調節要素は、遺伝子またはＤＮＡ配列に関して適正な位置および方向に存在することが好ましい。調節領域は、プロモーター、５’−非翻訳リーダー配列および３’−ポリアデニル化配列、ならびにエンハンサーおよび他の調節配列を含むことが可能である。
【００５６】
遺伝子のセンスまたはアンチセンス転写体を生み出すために老化誘導リパーゼ遺伝子と組合せて有用であるプロモーター調節要素には、一般にあらゆる植物プロモーター、さらに詳細には、イチジクイボモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、二重３５Ｓプロモーター、カリフラワーモザイクウイルスプロモーター、ＣａＭＶ３５ｓプロモーター、またはＭＡＳプロモーターなどの構成的プロモーター、あるいはカーネーション花弁ＧＳＴ１プロモーターまたはシロイヌナズナＳＡＧ１２プロモーターなどの組織特定または老化誘導プロモーターが挙げられる（例えば、本明細書において参考のために包含する Ｊ．Ｃ．Ｐａｌａｑｕｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１１２：１４４７〜１４５６（１９９６）；Ｍｏｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ，１：１２３〜１３２（１９９５）；Ｆｏｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ，６：５６７〜５７７（１９９４）；ａｎｄ Ｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．， １１３：３１３（１９９７）を参照すること）。好ましくは、本発明において用いられるプロモーターは構成的プロモーターである。
【００５７】
本発明に対して有用であるプロモーターからの発現レベルは、従来の発現系を用いて、例えば、レポーター遺伝子産物、例えば、プロモーター／レポーターが中に導入される遺伝子導入植物の葉、花、果実または他の組織の抽出物中のタンパク質またはｍＲＮＡのレベルを測定することにより検査することができる。
【００５８】
本発明は、カーネーション老化誘導リパーゼをコードする遺伝子に相補的な、シロイヌナズナ老化誘導リパーゼをコードする遺伝子に相補的な、または緩いまたは高緊縮条件下でカーネーションまたはシロイヌナズナ老化誘導リパーゼ遺伝子とハイブリダイズする別の植物からの遺伝子または遺伝子断片に相補的なアンチセンス・オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドを提供する。
【００５９】
こうしたアンチセンス・オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイズの最小の特異性を提供するために少なくとも約６のヌクレオチド長であることが好ましく、老化誘導リパーゼをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡまたはその部分の一つの鎖に対して、あるいは老化誘導リパーゼ遺伝子発現を調節することに関与するゲノムＤＮＡの側面配列に対して相補的であることが可能である。アンチセンス・オリゴヌクレオチドは１００ヌクレオチドの大きさであることが可能であり、それがアンチセンスにある全長コード配列まで、およびそれを超えての長さにまで延長することが可能である。アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡまたはＤＮＡおよびＲＮＡのキメラ混合物またはそれらの誘導体または組み換え変形体であることができる。
【００６０】
アンチセンス・オリゴヌクレオチドの作用は、細胞中の老化誘導リパーゼ遺伝子発現の変更、主として抑制をもたらすことが可能である。アンチセンスの一般的な検討に関しては、Ａｌｂｅｒｔｓ，ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９、特に本明細書において参考として包含されるページ１９５〜１９６）を参照すること。
【００６１】
アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、老化誘導リパーゼ遺伝子のあらゆる部分に相補的であることが可能である。一つの実施形態において、アンチセンス・オリゴヌクレオチドは６〜１００ヌクレオチド長の間であることが可能であり、例えば、老化誘導リパーゼ配列の５’−非コード配列または３’末端に相補的であることが可能である。主として５’−非コード配列に相補的なアンチセンス・オリゴヌクレオチドは、転写因子をコードする遺伝子の発現の有効な阻害剤であることが知られる。Ｂｒａｎｃｈ，Ｍ．Ａ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１３： ４２８４〜４２９０（１９９３）を参照すること。
【００６２】
好ましいアンチセンス・オリゴヌクレオチドは、老化誘導リパーゼをコードするｍＲＮＡの対応部分に対して実質的に相補的である。例えば、植物中へのアンチセンス方向の老化誘導リパーゼをコードする全長ｃＤＮＡクローンの導入は、良好に変更された老化誘導リパーゼ遺伝子発現をもたらすことが期待される。さらに、老化誘導リパーゼ遺伝子の特定部分を標的にした部分配列の導入は、同等に効果的であることが可能である。
【００６３】
本発明により必要とされる相同性の最小量は、他のＲＮＡまたはＤＮＡ分子の機能および他遺伝子の発現に影響を及ぼさない一方で、特定標的ＲＮＡまたはＤＮＡ分子の認識およびその翻訳または機能の抑制または減少を提供するために十分な相補性をもたらすに十分なものである。本発明のアンチセンス・オリゴヌクレオチドが老化誘導リパーゼ遺伝子のＲＮＡ転写体の少なくとも一部に対して相補的な配列を含む一方で、絶対的な相補性は好ましいが必要とされない。ハイブリッドを形成する能力は、アンチセンス・オリゴヌクレオチドの長さおよび相補性の程度に応じて決めることが可能である。一般に、ハイブリダイズ核酸が長いほど、より多い老化誘導リパーゼ標的配列との不適正塩基対をそれは含有するが、なお安定な二重体を形成することが可能である。当業者は、標準手順の使用により不適正塩基対の許容可能な程度を確認して、例えば、ハイブリダイズ複合体の融点を測定することができる。
【００６４】
アンチセンス・ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、外生導入核酸配列からの転写により細胞内に生み出すことが可能である。アンチセンス分子は、プロモーターを含む適切な調節要素に作用可能に連結される、アンチセンス老化誘導リパーゼ配列をコードするＤＮＡが中に組み込まれるプラスミドまたはウイルスなどのベクターでの形質転換またはトランスフェクションまたは感染により細胞に送達させることが可能である。細胞内で、外生ＤＮＡ配列は老化誘導リパーゼ遺伝子のアンチセンスＲＮＡを生成して発現する。
【００６５】
ベクターは、好ましくは、プラスミドであることができるか、または、植物細胞または細菌細胞においてその上にコードされる遺伝子を複製し発現することが技術上知られるウイルス性または他のベクターであることが可能である。ベクターは、それが転写されて所期のアンチセンス老化誘導リパーゼＲＮＡを生み出すことができるように、染色体的に統合されることになる。こうしたプラスミドまたはウイルス性ベクターは、技術上標準的である組み換えＤＮＡ技術により構築することができる。
【００６６】
例えば、ベクターは、本発明による原核宿主およびアンチセンス・オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドにおいて機能的な複製システムを含有するプラスミドベクターであることが可能である。あるいは、ベクターは、本発明によるアグロバクテリウムおよびアンチセンス・オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドにおいて機能的な複製システムを含有するプラスミドであることが可能である。アグロバクテリウムにおいて複製することができるプラスミドは、技術上周知である。Ｍｉｋｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｆｏｒ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｆｏｒｅｉｇｎ ＤＮＡ Ｉｎｔｏ Ｐｌａｎｔｓ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，， Ｅｄｓ． Ｂ．Ｒ．Ｇｌｉｃｋ ａｎｄ Ｊ．Ｅ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ．ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（１９９３），ＰＰ．６７〜８３を参照すること。
【００６７】
カーネーションリパーゼ遺伝子を、以下のやり方でプラスミドベクター中にアンチセンス方向にクローン化した。カーネーションリパーゼ遺伝子をクローン化するために、ｐＵＣ１８バックボーンから構築され、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）からの３５Ｓプロモーター次に多クローン化部位およびオクタピンシンターゼ停止配列を含有するｐＣＤプラスミドを用いた。ｐＣｄのＨｉｎｄ３部位およびＥｃｏＲ１部位中に全長カーネーションリパーゼ遺伝子をアンチセンス方向にサブクローン化することにより、ｐＣｄ−リパーゼ（アンチセンス）プラスミドを構築した。
【００６８】
同様に、ｐＣｄベクターのＢａｍＨ１およびＳａｌ１部位中にカーネーショングルタチオンＳ−トランスフェラーゼ１（ＧＳＴ１）プロモーターのＰＣＲ増幅断片（−７０３〜＋１９ｂｐ）を最初にサブクローン化することにより、ｐＣＤΔ３５Ｓ−ＧＳＴ１−リパーゼ（アンチセンス）プラスミドを構築した。次に、全長カーネーションリパーゼ遺伝子を構築物のＨｉｎｄ３およびＥｃｏＲ１部位中にアンチセンス方向にサブクローン化した。ｐＣｄベクターのＢａｍＨ１およびＳａｌ１部位中にカーネーショングルタチオンＳ−トランスフェラーゼ１（ＧＳＴ１）プロモーターのＰＣＲ増幅断片（−７０３〜＋１９ｂｐ）を最初にサブクローン化することにより、別のプラスミド、ｐＧｄΔ３５Ｓ−ＧＳＴ１−ＧＵＳプラスミドを構築した。
【００６９】
次に、レポーター遺伝子ベータ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）を構築物のＳａｌ１およびＥｃｏＲ１部位中にサブクローン化した。ｐＣｄベクターのＳｍａ１およびＨｉｎｄ３部位中に二重３５Ｓプロモーター（タンデム形態でＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの２複製を含有する）を最初にサブクローン化することにより、ｐＣＤ−３５Ｓ２−リパーゼ（アンチセンス）プラスミドを構築した。次に、全長カーネーションリパーゼ遺伝子を構築物のＨｉｎｄ３およびＥｃｏＲ１部位中にアンチセンス方向にサブクローン化した。
【００７０】
好ましくは約６〜約１００ヌクレオチド長間の、および老化誘導リパーゼの標的配列に相補的なオリゴヌクレオチドは、組み換えヌクレオチド技術により調製することが可能であるか、または、例えば、モノヌクレオチドまたはより短いオリゴヌクレオチドから合成することが可能である。自動化合成器は、本発明のオリゴ−およびポリヌクレオチドの化学合成に適用可能である。本発明による組み換えヌクレオチド分子を構築するための手順は、本明細書においてその全体を包含するＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９に開示されている。
【００７１】
老化誘導リパーゼ配列に相補的なアンチセンスＲＮＡをコードするオリゴヌクレオチドは、当業者に周知の手順を用いて調製することができる。こうした手順に関する詳細は、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｅｄｓ．，Ｎｉｅｒｌｉｃｈ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ， Ｎ．Ｙ．（１９７６）に提供されている。
【００７２】
本発明の代替実施形態において、内生植物老化誘導リパーゼ発現の抑制は、植物細胞中に導入される外生老化誘導リパーゼ遺伝子または遺伝子断片の過剰発現を通しての共抑制の結果である。本発明のこの実施形態において、センス方向の老化誘導リパーゼをコードするベクターは、本明細書においてアンチセンス分子用に記載されたのと同じやり方で細胞中に導入される。好ましくは、老化誘導リパーゼは、例えば、イチジクイボモザイクウイルスプロモーターまたはＣａＭＶ３５Ｓなどの強構成的プロモーターに作用可能に連結される。
【００７３】
本発明により作製される遺伝子導入植物は、技術上公知の植物形質転換のあらゆる方法を用いるＤＮＡ形質転換によって調製することが可能である。植物形質転換法には、アグロバクテリウムツメファシエンスとの植物、組織または細胞の直接共栽培または直接感染（Ｍｉｋｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．ｉｎ ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，（１９９３），ｐ．６７〜８８）；プロトプラストまたはプロトプラスト取り込み体中への直接遺伝子導入（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ，ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１２：２７１７（１９８４））；電気穿孔法（Ｆｒｏｍｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１９：７１９（１９８６））；粒子衝突（Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：５５９〜５６３（１９８８））；苗および植物の分裂組織中への注入（Ｄｅ ＬａＰｅｎａ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ， ３２５：２７４〜２７６（１９８７））；培養細胞および組織のプロトプラスト中への注入（Ｒｅｉｃｈ，ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，４：１００１〜１００４（１９８６））が挙げられる。
【００７４】
一般に、完全な植物は形質転換法から得られる。植物はプロトプラスト、カルス、組織部分または外植体、などから再生される。葉、花、果実および種子などの、老化誘導リパーゼの発現が中で変更される再生植物から得られる植物部分は、本明細書において用いられる「植物」の定義に含まれる。再生植物の子孫、変異体および突然変異体も、また、「植物」の定義に含まれる。
【００７５】
本発明は、また、本発明のｃＤＮＡ分子によりコードされるカーネーションまたはシロイヌナズナ老化誘導リパーゼタンパク質、およびカーネーションまたはシロイヌナズナタンパク質に対する抗体と交差反応するタンパク質を提供する。こうしたタンパク質は図１に見られる配列番号：２に示されるアミノ酸配列を有するか、配列番号：２に示されるタンパク質に対する抗体との交差反応性を共有するか、配列番号：１９（図１４に見られる）に示されるアミノ酸配列を有するか、または配列番号：１９に示されるタンパク質に対する抗体との交差反応性を共有する。
【００７６】
カーネーションまたはシロイヌナズナ老化誘導リパーゼタンパク質またはその機能誘導体は、好ましくは、場合により化学合成法と組合せた組み換え技術によって生産される。本発明の一つの実施形態において、老化誘導リパーゼは、マルトース結合タンパク質と融合した老化誘導リパーゼからなる融合タンパク質として発現する。組み換え融合タンパク質をコードするクローンの発現は、リパーゼ活性の指標であり、パルミチン酸ｐ−ニトロフェニル、リン脂質およびトリアシルグリセロールを加水分解する所期の分子量の融合タンパク質を生成する。組み換え老化誘導リパーゼタンパク質は、カーネーション老化誘導リパーゼに対する抗体による免疫ブロット法後にウエスタンブロット分析において顕著なバンドを示す。
【００７７】
プロテアーゼ、活性型第Ｘ因子による融合タンパク質の処理によって放出される遊離型老化誘導リパーゼ（５０．２Ｋｄａ）も、また、ウエスタンブロット分析において老化誘導リパーゼ抗体と反応する（図３）。老化誘導リパーゼアミノ酸配列のモチーフの探索により、アミド結合を介するミリスチン酸塩の共有結合のための潜在的なＮ−ミリストイル化部位の存在が示される（図１）（Ｊｏｈｎｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６３：８６９〜９１４（１９９４）；Ｔｏｗｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ５７：６７〜９９（１９８８）；ａｎｄ Ｒ．Ｊ．Ａ．Ｇｒａｎｄ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２５８：６２５〜６３８（１９８９）を参照すること）。タンパク質のモチーフの探索により、カーネーション老化誘導リパーゼが保存されたリパーゼに共通の配列である配列、ＩＴＦＡＧＨＳＬＧＡ （配列番号：４）を含有することも示された。多様な植物からの保存リパーゼ共通配列を以下の表に示す。
【表１】
【００７８】
本発明の老化誘導リパーゼタンパク質は、生体外および原位置両方の検定においてリパーゼ活性を有することが示された。生体外測定のために、パルミチン酸ｐ−ニトロフェニルおよび大豆リン脂質（４０％ホスファチジルコリンおよび６０％他のリン脂質）を基質として用い、反応の産物、ｐ−ニトロフェノールおよび遊離脂肪酸をそれぞれ分光光度法により測定した（Ｐｅｎｃｒｅａｃ’ｈ ａｎｄ Ｂａｒａｔｔｉ，１９９６； Ｎｉｘｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｎ，１９７９；Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３）。リパーゼ活性を、また、Ｎｉｘｏｎ およびＣｈａｎ（１９７９）およびＬｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９８３）により記載されている方法の修正法を用いてガスクロマトグラフィーによって生体外で測定した。
【００７９】
反応混合物は、最終体積１００μｌにおいて、１００ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２．５ｍＭ基質（トリリノレイン、大豆リン脂質またはジリノレイルホスファチジルコリン）および酵素タンパク質（１００μｇ）を含有した。基質を反応混合物に添加する前に５％アラビアゴム中に乳化させた。これを達成するために、基質をクロロホルム中に溶解し、アラビアゴム溶液中に添加し、３０秒間の音波処理により乳化した。乳化後、クロロホルムをＮ２流により蒸発させた。２５℃で２時間までの変動時間にわたり反応を行った。次に、反応混合物を脂質抽出し、遊離脂肪酸をＴＬＣにより精製し、ＧＣにより誘導し定量化した（ＭｃＫｅｇｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。
【００８０】
脂質分解性アシル加水分解酵素活性を、Ｆｕｒｕｋａｗａ ｅｔ ａｌ．（１９８３）により記載されＴｓｕｂｏｉ ｅｔ ａｌ．（１９９６）により修正されたように現場で測定した。この後者のアッセイにおいて、老化誘導リパーゼをコードする全長ｃＤＮＡクローンにより形質転換された大腸菌を、唯一の炭素源として両方共に長鎖脂肪酸エステルであるツイーン（Ｔｗｅｅｎ）４０またはツイーン（Ｔｗｅｅｎ）６０で補完された最小の塩培地中において増殖させた。従って、細菌増殖用炭素は、脂肪酸エステルがリパーゼにより加水分解される場合のみに利用可能であった。
【００８１】
老化誘導リパーゼｃＤＮＡにより形質転換された大腸菌が当初の誘導期後ツイーン４０−およびツイーン６０−基礎培地中で増殖し、一方で形質転換されない大腸菌の対照培養物が増殖しないという発見は、コードされた組み換えタンパク質のリパーゼ活性を確認するものである（図５）。すなわち、老化誘導リパーゼは、増殖のために必要な炭素を得るためにステアリン酸塩（ツイーン６０）およびパルミチン酸塩（ツイーン４０）を放出する。
【００８２】
本明細書において記載される老化誘導リパーゼタンパク質の「機能誘導体」は、老化誘導リパーゼ活性の少なくとも一部、または老化誘導リパーゼに対する特定の抗体との免疫学的交差反応性を保持する老化誘導リパーゼの断片、変異体、類似物、または化学誘導体である。老化誘導リパーゼタンパク質の断片はあらゆる分子の部分を指す。変種ペプチドは、例えば、技術上周知の方法を用いて直接化学合成により生産することが可能である。老化誘導リパーゼの類似物は、全体タンパク質またはその断片のいずれかに実質的に類似の非自然タンパク質を指す。老化誘導リパーゼの化学誘導体は、通常ペプチドＧ３８の一部またはペプチド断片でない追加の化学部分を含有する。組み換えは、ペプチドの標的アミノ酸残基を、選択された側鎖または末端基と反応することができる有機誘導剤と反応させることにより、老化誘導リパーゼペプチドまたはその断片中に導入することが可能である。
【００８３】
本発明による老化誘導リパーゼタンパク質またはペプチドは、本発明のヌクレオチド配列（センス方向における）により形質転換された細胞を培養し、細胞がタンパク質を合成することを可能とし、次に、用いたクローン化プロトコルに応じてタンパク質を遊離タンパク質または融合タンパク質としてのいずれかで分離することによって、培養培地または細胞抽出物のいずれかから生産することが可能である。あるいは、タンパク質は細胞なしの系において生産することができる。Ｒａｎｕ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，６０：４５９〜４８４，（１９７９）を参照すること。
【００８４】
今、一般的に本発明を説明してきたが、同じことが、説明の目的で提供され本発明を限定しようとしては意図されていない以下の実施例を参照することを通して、さらに容易に理解されるであろう。
【００８５】
実施例
実施例 １．カーネーションリパーゼ ｃＤＮＡ を単離するために用いた植物材料
温室で生育し維持されたカーネーション植物（ナデシコ科ナデシコ属改良白色シム）を、老化誘導リパーゼ遺伝子に対応するヌクレオチド配列を単離するために用いた。老化花弁（異なる生育段階からの）の形態にある花組織を、使用するまで緩衝液中に収集しておくかまたは−７０℃で保存した。
【００８６】
細胞質ゾル脂質粒子を、老化開始直前に採取したカーネーション花弁から単離した。カーネーション花弁（２５ｇ／１５０ｍｌ緩衝液）を、４℃で均質化緩衝液（５０ｍＭＥｐｐｓ− ０．２５ＭソルビトールｐＨ７．４、１０ｍｍＥＤＴＡ、２ｍＭＥＧＴＡ、１ｍＭＰＭＳＦ、１ｍＭベンズアマジン、１０ｍｍアミノ−ｎ−カプロン酸および４％ポリビニルポリピロリドン）中において４５秒間にわたりオムニマイザー（Ｏｍｎｉｍｉｚｅｒ）で、さらに１分間にわたりポリトロン（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ）ホモジナイザーで均質化した。４層のチーズクロスを通してホモジェネートを濾過し、濾液を４℃で２０分間にわたり１０，０００ｇで遠心分離した。
【００８７】
ミクロソーム膜を単離するために２５０，０００ｇで１時間にわたり上澄みを遠心分離した。Ｈｕｄａｋ ａｎｄ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，（１９９７），Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．，１１４：７０５〜７１３の方法により浮上分離遠心分離後の粒子を収集することによって、ミクロソーム後の上澄みから脂質粒子を得た。上澄みを蔗糖により１０％（ｗ／ｖ）とし、２３ｍｌの上澄みを６０Ｔｉベックマン遠心分離管中に注ぎ、１．５ｍｌ単離緩衝液でかぶせ、４℃で１２時間にわたり３０５，０００ｇで遠心分離した。パスツールピペットにより粒子を単離緩衝液重複層から除去した。
【００８８】
滅菌ＰＢＳ（１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．５プラス０．８５％塩化ナトリウム）と平衡させたセファローズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）Ｇ−２５カラム上に粒子懸濁液の３ｍｌを担持させ、懸濁液を滅菌ＰＢＳにより溶出させた。粒子を含有する空隙体積を溶出させ、セントリコン（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）−１０濾過器（アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）から市販されている）を用いてタンパク質濃度６００μｇに濃縮した。次に、３００μｇの粒子を接種したラビット中に抗体を産生するために脂質粒子を用いた。ウエスタンブロット分析により血液のＩｇＧ滴定量を検査した。
【００８９】
メッセンジャー ＲＮＡ （ ｍＲＮＡ ）単離
本質的にＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ ａｎｄ Ｓａｃｈｉ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６２：１５６〜１５９（１９８７）に記載されているように段階Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶのカーネーション花の花弁から全体ＲＮＡを単離した。簡単に、１５ｇの花弁組織を液体窒素中で凍結させ、４Ｍチオシアン酸グアニジニウム、２５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、０．５％サルコシル（ｓａｒｋｏｓｙｌ）および０．１Ｍ β−メルカプトエタノールを含有する緩衝液中で３０秒間にわたり均質化した。
【００９０】
１５０ｍｌ水飽和フェノール、３０ｍｌのクロロホルムおよび１５ｍｌの２ＭＮａＯＡｃ、ｐＨ４．０を均質化試料に添加した。試料を１０分間にわたり１０，０００ｇで遠心分離し、水相を除去し、そこから核酸を１５０ｍｌイソプロパノールにより沈殿させた。試料を５，０００ｇで１０分間にわたり遠心分離し、ペレットを３０ｍｌの４ＭＬｉＣｌで１回洗浄し、３０ｍｌのクロロホルムにより抽出し、０．２ＭＮａＯＡｃ、ｐＨ５．０を含有する３０ｍｌイソプロパノールにより沈殿させた。ＲＮＡをＤＥＰＣ処理水中に溶解し、−７０℃で保存した。
【００９１】
プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）から市販されているＰｏｌｙＡ＋区域ｍＲＮＡ単離システムを用いて全体ＲＮＡから、ＰｏｌｙＡ＋ｍＲＮＡを単離した。ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）（カリフオルニア州、ラ・ホーヤ）から市販されているＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）ｃＤＮＡ合成システムを使用するｃＤＮＡ合成のための鋳型としてＰｏｌｙＡ＋ｍＲＮＡを用いた。
【００９２】
カーネーション花弁の ｃＤＮＡ ライブラリー選別
段階ＩＶのカーネーション花弁から単離されたｍＲＮＡを用いて作製されたｃＤＮＡライブラリーを約５ｘ１０６ＰＦＵ／ｍｌに希釈し、脂質粒子抗血清により免疫選別した。ＥｘＡｓｓｉｓｔ（登録商標）ＨｅｌｐｅｒＰｈａｇｅ／ ＳＯＬＲ菌株システムを用いて陽性ｃＤＮＡクローンを回収し、ｐブルースクリプト（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）（登録商標）ファージミド（ストラタジーン）において再円形化した。また、段階ＩＩＩのカーネーション花弁のｃＤＮＡライブラリーを、３２Ｐ標識１９塩基対プローブ（５’− ＡＣＣＴＡＣＴＡＧ ＧＴＴＣＣＧ ＣＧＴＣ−３’）（配列番号：５）を用いて選別した。陽性ｃＤＮＡクローンをファージから切り取り、製造業者の指示書にある方法を用いてＰＢＫ−ＣＭＶ（登録商標）（ストラトジーン）ファージミド中に再円形化した。全長ｃ ＤＮＡ（１．５３ｋｂ断片）をＰＢＫ−ＣＭＶベクター中に挿入した。
【００９３】
シロイヌナズナ葉の ｃＤＮＡ ライブラリー選別
シロイヌナズナからの老化誘導リパーゼ遺伝子の全長ｃＤＮＡクローン（１３３８ｂｐ）を、シロイヌナズナ老化葉ｃＤＮＡライブラリーを選別することにより単離した。ライブラリーを選別するために用いられるプローブを、老化葉ライブラリーを鋳型として用いるＰＣＲにより得た。ＰＣＲプライマーをゲンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）に存在するゲノム配列（Ｕ９３２１５）から設計した。順方向プライマーは配列５’ ＡＴＧ ＴＣＴ ＡＧＡ ＧＡＡ ＧＡＴ ＡＴＴ ＧＣＧ ＣＧＧ ＣＧＡ ３’（配列番号：２０）を有し、逆方向プライマーは配列５’ ＧＡＴ ＧＡＧ ＣＴＣ ＧＡＣ ＧＧＡ ＧＣＴ ＧＡＧ ＡＧＡ ＧＡＴ Ｇ ３’（配列番号：２１）を有した。ＰＣＲ産物を配列決定のためにブルースクリプト中にサブクローン化した。用いられたＰＣＲ産物のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図１４に示す。
【００９４】
プラスミド ＤＮＡ 単離、 ＤＮＡ 配列決定
プラスミドＤＮＡを単離するために、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，（上述）により記載されているアルカリ溶解法を用いた。ジデオキシ塩基配列決定法を用いて全長陽性ｃＤＮＡクローンを配列決定した。Ｓａｎｇｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４：５４６３〜５４６７を参照すること。読取り枠を編集し、ＢＬＡＳＴ検索（メリーランド州、ベテスダのゲンバンク）を用いて分析し、コードされた遺伝子の誘導アミノ酸配列を持つ最も相同な５タンパク質の配置構造をＢＣＭサーチランチャー：多配列配置構造パターン誘導多配置法を用いて完成させた（Ｆ． Ｃｏｒｐｅｔ，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１６：１０８８１〜１０８９０，（１９８７）を参照すること）。
誘導アミノ酸配列中に存在する機能モチーフをマルチファインダー（ＭｕｌｔｉＦｉｎｄｅｒ）により識別した。
【００９５】
融合タンパク質としてのリパーゼの発現
全長カーネーション老化誘導リパーゼを含有するファージミドｐＢＫ−ＣＭＶを、ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ消化融合ベクター、ｐＭａｌｃ（ニュー・イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ））中にサブクローン化される１．５３Ｋｂリパーゼ断片を放出するＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩにより消化した。大腸菌ＢＬ−２１（ＤＥ３）細胞を形質転換するために、ｐＭＬｉｐと表される老化誘導リパーゼを含有するｐＭａｌｃベクターを用いた。
【００９６】
ｐＭＬｉｐによりコードされた融合タンパク質（老化誘導リパーゼとマルトース結合性タンパク質の融合）を、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．（上述）およびＡｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９８７），１６．４．１〜１６．４．３に記載されているように単離し、精製した。簡単に、ｐＭＬｉｐにより形質転換された大腸菌ＢＬ−２１細胞を、細胞グラム当り８μｌの５０ｍＭ ＰＭＳＦおよび８０μｌの２０ｍｇ／ｍｌリゾチームを含有する３ｍｇ／ｇ溶解物緩衝液（５０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、１００ｍＭＮａＣｌおよび１ｍＭＥＤＴＡ）中に再懸濁し、室温で２０分間にわたり振盪しながら培養した。
【００９７】
次に、８０μｌの５％デオキシコール酸および４０単位のＤＮＡｓｅ Ｉを添加し、細胞が完全に溶解するまで室温で細胞を振盪した。細胞破片を遠心分離によりペレット化し、２ボリュームの溶解物緩衝液プラス８Ｍ尿素および０．１ｍＭＰＭＳＦ中に再懸濁した。１時間後、懸濁液を中性化するために７ボリュームの緩衝液（５０ｍＭＫＨ２ＰＯ４、１ｍＭＥＤＴＡおよび５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．０）を添加した。細胞懸濁液のｐＨをＨＣｌによりｐＨ８．０に調節し、細胞破片をペレット化した。上澄みを、４℃で一夜にわたり、２０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ８．０、１００ｍＭＮａＣｌおよび１ｍＭＥＤＴＡに対して透析した。
【００９８】
マルトース結合性タンパク質−リパーゼ融合産物（Ｍａｌｉｐ）を、アミロースカラム（ニュー・イングランド・バイオラブズから市販されている）を用いて精製した。融合タンパク質を含有する部分をプロテアーゼ活性型第Ｘ因子（１μｇ／１００μｇ融合タンパク質）により分割して、融合タンパク質からリパーゼを分離した。融合タンパク質および分割リパーゼの両方を、ＳＤＳ ＰＡＧＥ電気泳動法およびウエスタンブロット法により分析した。ｐＭａｌｃによりコードされたマルトース結合性タンパク質を対照として用いた。結果を図３に示す。
【００９９】
カーネーション ＲＮＡ のノーザンブロットハイブリダイズ
段階Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶの花から単離された全体ＲＮＡの１０μｇを、１％変性ホルムアルデヒド・アガロース・ゲル上に分離し、ナイロン膜上に固定した。ランダムプライマーキット（ベーリンガー・マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ））を用いて３２Ｐ−ｄＣＰＴにより標識化された１．５３Ｋｂ ＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩリパーゼ断片を、濾材（７ｘ１０７ ｃｐｍ）をプローブするために用いた。濾材を室温で１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにより１回、６５℃で０．２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにより３回洗浄した。濾材を乾燥し、−７０℃で一夜にわたりＸ線フィルムにさらした。結果を図４に示す。
【０１００】
シロイヌナズナ ＲＮＡ のノーザンブロットハイブリダイズ
生育２、３、４、５および６週間でのシロイヌナズナ葉から単離された全体ＲＮＡの１０μｇを、１％変性ホルムアルデヒド・アガロース・ゲル上に分離し、ナイロン膜上に固定した。ランダムプライマーキット（ベーリンガー・マンハイム）を用いて３２Ｐ−ｄＣＰＴにより標識化された全長シロイヌナズナ老化誘導リパーゼ遺伝子を、濾材（７ｘ１０７ ｃｐｍ）をプローブするために用いた。濾材を室温で１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにより１回、６５℃で０．２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにより３回洗浄した。濾材を乾燥し、−７０℃で一夜にわたりＸ線フィルムにさらした。
【０１０１】
ゲノム ＤＮＡ 単離およびサザーンブロットハイブリダイズ
新しく切断されたカーネーション花弁を液体窒素中で冷凍し、粉末に砕き、ゲノムＤＮＡを単離するために抽出緩衝液（０．１Ｍトリス、ｐＨ８．２、５０ｍＭＥＤＴＡ、０．１ＭＮａＣｌ、２％ＳＤＳ、および０．１ｍｇ／ｍｌプロティナーゼＫ）により均質化した（２ｍｌ／ｇ）。均質化材料を３７℃で１０分間にわたり培養し、フェノール−クロロホルム−イソアミルアルコール（２５：２４：１）を用いて抽出した。ＤＮＡをＮａＯＡｃおよびイソプロパノールにより沈殿させた。ＤＮＡペレットを１ｘＴＥ、ｐＨ８．０中に溶解し、フェノールで再抽出し、再度沈殿させ、１ｘＴＥ、ｐＨ８．０中に再懸濁した。
【０１０２】
ゲノムＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼ（ＢａｍＨ１、ＸｂａＩ、ＸｈｏＩ、 ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｌ１）により別々に消化し、消化されたＤＮＡを１％アガロースゲル上で分別した。分離されたＤＮＡをナイロン膜上ににじませ、３２Ｐ−ｄＣＰＴ−標識化１．５３Ｋｂリパーゼ断片を用いてハイブリダイズを行った。ハイブリダイズおよび洗浄を、高緊縮条件（６８℃）（６ＸＳＳＣ、２Ｘデンハルト試薬、０．１％ＳＤＳ）および低緊縮条件（ハイブリダイズおよび洗浄、４２℃）（６ＸＳＳＣ、５Ｘデンハルト試薬、０．１％ＳＤＳ）下で行った。結果を図６に示す。見ることができるように、リパーゼｃＤＮＡプローブは、カーネーションリパーゼ遺伝子が単一の複製遺伝子であることを示すただ一つのゲノム断片を検出する。
【０１０３】
リパーゼ酵素アッセイ
精製リパーゼ融合タンパク質の脂質分解性アシル加水分解酵素を、パルミチン酸ｐ−ニトロフェニルおよび大豆リン脂質を外生基質として用いて分光光度法で検定した。対照として機能するマルトース結合性タンパク質単独に対して、基質としてのリン脂質とのリパーゼ反応性は全く検出されなかった（表２）。パルミチン酸ｐ−ニトロフェニルをマルトース結合性タンパク質単独と合わせて基質として用いる場合、少量のｐ−ニトロフェノール、リパーゼ反応の所期産物は、パルミチン酸ｐ−ニトロフェニルの商業用製剤におけるｐ−ニトロフェノールの検出可能な反射背景強度であった（表２）。しかし、精製リパーゼ融合タンパク質の存在下では、リン脂質からの遊離脂肪酸およびパルミチン酸ｐ−ニトロフェニルからのｐ−ニトロフェノールの放出として明示される強度のリパーゼ活性が明白であった（表２）。
【０１０４】
表２
大腸菌に発現しアミロースカラムクロマトグラフィーにより精製されたマルトース結合性タンパク質およびリパーゼ融合タンパク質の脂質分解性アシル加水分解酵素活性の分光光度測定。
２基質、パルミチン酸ｐ−ニトロフェニルおよび大豆リン脂質を用いた。
活性は形成された生成物（パルミチン酸ｐ−ニトロフェニルからのｐ−ニトロフェノールおよび大豆リン脂質からの遊離脂肪酸）の量で表される。
Ｎ＝３複製に対する平均値±ＳＥで示す。
【表２】
【０１０５】
他の実験において、リパーゼ融合タンパク質の酵素活性をガスクロマトグラフィー、基質から放出された遊離脂肪酸の計量および識別を可能とする技術により検定した。トリリノレイン、大豆リン脂質およびジリノレイルホスファチジンコリンを基質として用い、脱エステル化脂肪酸を、ガスクロマトグラフィーにより分析される前に薄層クロマトグラフィーによって精製した。分光光度アッセイ（表２）に沿って、マルトース結合性タンパク質単独と大豆リン脂質またはジリノレイルホスファチジンコリンのいずれかと一緒の場合にリパーゼ活性は全く検出されず、これらの基質は本質的に脱エステル化脂肪酸がないことを示した（表３）。
【０１０６】
しかし、リパーゼ融合タンパク質を酵素源として用いる場合、パルミチン酸、ステアリン酸およびリノール酸が大豆リン脂質抽出物から脱エステル化され、リノール酸はジリノレイルホスファチジンコリンから脱エステル化された（表３）。リン脂質基質に比べて、遊離リノール酸の検出可能レベルはトリリノレインにおいて存在するが、しかし、遊離リノール酸のレベルはリパーゼ融合タンパク質の存在下で有意に増大し、リパーゼがまたトリアシルグリセロールから脂肪酸を脱エステル化することができることを示した（表３）。
【０１０７】
表３
大腸菌に発現しアミロースカラムクロマトグラフィーにより精製されたマルトース結合性タンパク質およびリパーゼ融合タンパク質の脂質分解性アシル加水分解酵素活性のＧＣ測定。
【表３】
【０１０８】
大腸菌におけるリパーゼｃＤＮＡの発現により得られるタンパク質のリパーゼ活性を、Ｔｓｕｂｏｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６４：２９３６〜２９４０ （１９９６）；Ｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ．， ９：７４１〜７４６（１９９５）；およびＧ． Ｓｉｅｒｒａ，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ａｎｄ Ｓｅｒｏｌ．，２３：１５〜２２（１９５７）に記載されているように生体内で測定した。ｐＭａｌにより形質転換された大腸菌 ＢＬ−２１細胞の単一コロニーおよびｐＭＬｉｐにより形質転換された別の大腸菌ＢＬ−２１コロニーを、以下（ｇ／Ｌ）： Ｋ２ＨＰＯ４（４．３）、ＫＨ２ＰＯ４（３．４）、（ＮＨ４）ＳＯ４（２．０）、ＭｇＣｌ２（０．１６）、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ（０．００１）、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（０．０００６）、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（０．０２６）、およびＮａＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ（０．００２）を含有する基礎塩培地（ｐＨ７．０）中に接種した。
【０１０９】
基質、ツイーン４０（モノパルミチン酸ポリオキシエチレンソルビタン）またはツイーン６０（モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン）を、濃度１％で添加した。振盪を伴う３７℃での細菌細胞の増殖を、６００ｎｍでの吸収値を測定することにより監視した（図５）。図５において見ることができるように、ｐＭＬｉｐにより形質転換された大腸菌細胞は、初期誘導期間後、ツイーン４０／ツイーン６０−補完基礎培地中で増殖することができた。しかし、ｐＭａｌにより形質転換された大腸菌細胞はツイーン補完培地中で増殖しなかった。
【０１１０】
実施例 ２．カーネーション老化誘導リパーゼ遺伝子のエチレン誘発
段階ＩＩカーネーション花およびカーネーション切り枝を、１５時間にわたり密閉室の中で０．５ｐｐｍエチレンにより処理した。エチレン処理段階ＩＩ花弁から、および処理された切り枝の葉から、ならびに以下に記載されるような非処理カーネーション花および切り枝の花および葉から、ＲＮＡを抽出した。
シロイヌナズナを１、２または３日間にわたり密閉室の中で５０μＭエテフォンにより処理した。ＲＮＡを以下のように植物のエテフォン処理葉から抽出した。
【０１１１】
花および葉（花１または葉５ｇ）を液体窒素中で砕いた。粉砕された粉末を、３０ｍｌのグアニジニウム緩衝液（４Ｍイソチオシアン酸グアニジニウム、２．５ｍＭＮａＯＡｃ ｐＨ８．５、０．８％β−メルカプトエタノール）と混合した。混合物を４層のチーズクロスを通して濾過し、４℃で３０分間にわたり１０，０００ｇで遠心分離した。次に、上澄みを２６，０００ｇで２０時間にわたり塩化セシウム濃度勾配遠心分離にかけた。ペレット化ＲＮＡを７５％エタノールですすぎ洗いをし、６００μｌＤＥＰＣ−処理水中に再懸濁し、そのＲＮＡを−７０℃で０．７５ｍｌの９５％エタノールおよび３０μｌの３ＭＮａＯＡｃにより沈殿させた。
【０１１２】
カーネーションまたはシロイヌナズナいずれかの１０μｇを１．２％変性ホルムアルデヒド・アガロース・ゲル上に分別し、ナイロン膜に移した。無作為に準備した３２Ｐ−ｄＣＰＴ−標識化全長カーネーションリパーゼｃＤＮＡ（配列番号：１）を、４２℃で一夜にわたりカーネーションＲＮＡを含有する膜をプローブするために用いた。無作為に準備した３２Ｐ−ｄＣＰＴ−標識化全長シロイヌナズナリパーゼｃＤＮＡを、４２℃で一夜にわたりシロイヌナズナＲＮＡを含有する膜をプローブするために用いた。次に、膜を室温で１５分間にわたり０．１％ＳＤＳを含有する１ＸＳＳＣ中で１回、それぞれ６５℃で１５分間にわたり０．１％ＳＤＳを含有する０．２ＸＳＳＣ中で３回洗浄した。膜を−７０℃で一夜にわたりＸ線フィルムにさらした。
【０１１３】
結果を図９（カーネーション）および図１６（シロイヌナズナ；レーン１、１日処理；レーン２、２日処理；レーン３、３日処理）に示す。見ることができるように、カーネーションリパーゼおよびシロイヌナズナリパーゼの転写がエチレンにより花および／または葉において誘発される。
【０１１４】
実施例 ３．カーネーションリパーゼプライマーを用いるトマト ＰＣＲ 産物の生成
トマト葉から得られるトマトゲノムＤＮＡからの部分長老化誘導リパーゼ配列を、カーネーション老化誘導リパーゼ配列から設計された一対のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてネスト状のＰＣＲにより生成した。５’プライマーは配列５’−ＣＴＣＴＡＧＡＣＴＡＴＧＡ ＧＴＧＧＧＴ（配列番号：７）を有する１９−ｍｅｒであり；３’プライマーは配列ＣＧＡＣＴＧＧＣＡＣＡＡＣＣＴＣＣＡ−３’（配列番号：８）を有する１８−ｍｅｒである。ゲノムトマトＤＮＡを用いるポリメラーゼ連鎖反応を以下のように行った：
【０１１５】
反応成分：
ゲノムＤＮＡ １００ ｎｇ
ｄＮＴＰ（それぞれ１０ｍＭ） １ μｌ
ＭｇＣｌ２（５ｍＭ）＋１０ｘ緩衝液 ５ μｌ
プライマー１および２（それぞれ２０μＭ） ０．５ μｌ
Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ １．２５ Ｕ
反応体積 ５０ μｌ
反応変数：
９４℃ ３分間
９４℃／１分、４８℃／１分、７２℃／２分、 ４５サイクルに対して
７２℃ １５分間
【０１１６】
ＰＣＲにより得られたトマト部分長配列は、ヌクレオチド配列、配列番号：６（図１０）および図１０に示されるような推論アミノ酸配列を有する。部分長配列は、２コード配列間に散らばったイントロン（図１０、下側の文字）を含有する。トマト配列は保存リパーゼの共通配列、ＩＴＦＴＧＨＳＬＧＡ（配列番号：３）を含有する。
【０１１７】
トマト配列は、カーネーション老化誘導リパーゼ配列との５３．４％配列同一性およびシロイヌナズナリパーゼとの４３．５％配列同一性を有し、この内後者はカーネーション配列との４４．３％配列同一性を有する。
【０１１８】
実施例 ４．トマト植物における細胞膜の完全性への冷却の影響
トマト植物を７℃〜８℃で４８時間にわたり冷却した。葉への冷却の影響を電解質洩れの量（μＭｈｏｓ）を測定することにより評価した。
特に、１ｇの葉組織を切って５０ｍｌ管に入れ、蒸留水により急速リンスを行い、４０ｍｌの脱イオン水を添加した。管に蓋をし、室温で２４時間にわたり回転させた。電解質漏れを反映させる伝導度（μＭｈｏ）読取り値を、対照および冷却損傷葉組織に対して６および２４時間間隔で取り込んだ。膜損傷を反映させる電解質漏れが冷却損傷葉組織における再加温期間の間に起こることは図１１から明白である。
【０１１９】
冷却トマト葉から得られた ＲＮＡ のノーザンブロット分析
非冷却トマト植物（対照）および０、６および２４時間にわたり室温に戻した冷却トマト植物の葉１５ｇから全体ＲＮＡを単離した。ＲＮＡ抽出を実施例３において記載するように実施した。各試料からの１０μｇのＲＮＡを、１．２％変性ホルムアルデヒド・ゲル上に分別し、ナイロン膜に移した。膜を３２Ｐ−ｄＣＰＴ標識化プローブ（配列番号：３）により探知し、次に、実施例３に記載したものと同じ条件下で洗浄した。結果を図１２に示す。
【０１２０】
オートラジオグラフ（図１２Ｂ）から見ることができるように、トマトリパーゼ遺伝子発現は冷却により誘発され、遺伝子誘発のパターンは冷却損傷葉における電解質漏れの増加に相関する（図１１）。
【０１２１】
実施例 ５．アンチセンス方向に老化誘導リパーゼ遺伝子を発現する遺伝子導入植物の生成
二重３５Ｓプロモーターの調節下アンチセンス方向に発現した全長シロイヌナズナ老化誘導リパーゼ遺伝子バイナリーベクター、ｐＫＹＬＸ７１により、アグロバクテリアを形質転換した。シロイヌナズナ植物をこれらのアグロバクテリアにより真空濾過を用いて形質転換し、得られるＴ０植物から形質転換された種子をアンピシリンで選択した。
【０１２２】
Ｔ１植物を温室条件下で野生型シロイヌナズナ植物と並べて育成した。遺伝子導入および野生型植物間の、葉のサイズ、全体の植物サイズ、種子収量および葉の老化における差異を長期にわたり観察した。差異は図１７、１８、１９、および２０に示される。
【０１２３】
実施例 ６．遺伝子導入植物における老化誘導リパーゼ減少生成物
４週齢シロイヌナズナ野生型、および実施例５におけるように作製された対応遺伝子導入植物の葉から単離された全体タンパク質をナイロン膜に移し、シロイヌナズナ老化誘導リパーゼタンパク質に対して引き起こされた抗体によりプローブした。ウエスタンブロットを図２１に示す（レーン１および２は９μｇのタンパク質を担持し、レーン３および４は１８μｇのタンパク質を担持した）。老化誘導リパーゼの発現は遺伝子植物において減少した。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、カーネーション花ｃＤＮＡライブラリーから得られた老化誘導リパーゼｃＤＮＡクローンによりコードされる誘導アミノ酸配列（配列番号：２）を示す。アミノ酸配列内の共通モチーフは以下の通りである：単一下線、アミド化部位；点線下線、タンパク質キナーゼＣリン酸化部位；二重下線、Ｎ−ミリストイル化部位；箱型、ｃＡＭＰリン酸化部位；影箱型、カゼインキナーゼＩＩリン酸化部位；交差斜線箱型、リパーゼ系の共通配列；および点線箱型、Ｎ−グリコシル化部位。
【図２】
図２は、リパーゼ様タンパク質の部分配列と一直線上になる誘導全長カーネーション花弁老化誘導リパーゼアミノ酸配列（配列番号：２）を示す：カーリップ（ｃａｒｌｉｐ）、カーネーション花弁老化誘導リパーゼの全長配列（配列番号：１１）；アーリップ（ａｒｌｉｐ）、シロイヌナズナ（Ｇｅｎ Ｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＬ０２１７１０）からのリパーゼ様タンパク質の部分配列（配列番号：１２）；イポリップ（ｉｐｏｌｉｐ）、イポメア（Ｇｅｎ Ｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｕ５５８６７）からのリパーゼ様配列の部分配列（配列番号：１３）；アーリピ（ａｒｌｉｐｉ）、シロイヌナズナ（Ｇｅｎ Ｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｕ９３２１５）からのリパーゼ様タンパク質の部分配列（配列番号：１４）。３または４配列間の同一アミノ酸は箱型に示す。
【図３】
図３は、大腸菌中に発現するカーネーションリパーゼｃＤＮＡから得られた融合タンパク質発現産物のウエスタンブロット分析を示す。ウエスタンブロットは老化誘導リパーゼタンパク質に対する抗体によりプローブされた：レーン１、マルトース結合タンパク質；レーン２、タンパク質分解（活性型第Ｘ因子）開裂部位を通してマルトース結合タンパク質ｃＤＮＡに融合したカーネーションリパーゼからなる融合タンパク質；レーン３、活性型第Ｘ因子により、遊離型リパーゼタンパク質（５０．２ｋＤａ）および遊離型マルトース結合タンパク質中に部分的に開裂した融合タンパク質。
【図４】
図４は、異なる生育段階のカーネーション花弁から単離されたＲＮＡのノーザンブロット分析である。図４Ａは全ＲＮＡの臭化エチジウム染色ゲルである。各レーンは１０μｇ ＲＮＡを含有した。図４Ｂは３２Ｐ−ｄＣＴＰ標識全長カーネーション老化誘導リパーゼｃＤＮＡによりプローブされたノーザンブロットのオートラジオグラフである。
【図５】
図５は、脂質分解性アシル加水分解酵素、すなわち、大腸菌中でのカーネーション老化誘導リパーゼｃＤＮＡの過剰発現により得られるタンパク質産物のリパーゼ活性の原位置での実証値である。Ｍａｌ、基礎塩培地中でマルトース結合タンパク質単独を含有する大腸菌細胞；ｍＬｉｐ、基礎塩培地中でマルトース結合タンパク質と融合したカーネーション老化誘導リパーゼからなる融合タンパク質を含有する大腸菌細胞；４０ｍａｌ／４０ｍＬｉｐ、ツイーン４０により補完された基礎塩培地中でマルトース結合タンパク質単独［ｍａｌ］か、またはリパーゼ−マルトース結合タンパク質融合産物［ｍＬｉｐ］を含有する大腸菌細胞；６０ｍａｌ／６０ｍＬｉｐ、ツイーン６０により補完された基礎塩培地中でマルトース結合タンパク質単独［ｍａｌ］か、またはリパーゼ−マルトース結合タンパク質融合産物［ｍＬｉｐ］を含有する大腸菌細胞。
【図６Ａ】
図６Ａは、カーネーション老化誘導リパーゼの読取り枠の制限酵素マップを示す。数字は読取り枠中のヌクレオチド数を指す。
【図６Ｂ】
図６Ｂは、種々の制限酵素により消化され、カーネーション老化誘導リパーゼｃＤＮＡによりプローブされたカーネーションゲノムＤＮＡのサザーンブロット分析である。
【図７】
図７は、カーネーション老化誘導リパーゼｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列（配列番号：１）である。実線下線、老化誘導リパーゼｃＤＮＡの非コード配列；下線のない配列部分は読取り枠である。
【図８】
図８は、カーネーション老化誘導リパーゼｃＤＮＡのアミノ酸配列（配列番号：２）である。
【図９】
図９Ａは１５時間にわたり０．５ｐｐｍエチレンに暴露された段階ＩＩの花弁におけるカーネーションリパーゼの発現を示すノーザンブロットである。図９Ａはそれぞれのレーンが一定量のカーネーションＲＮＡを担持していることを示す臭化エチジウム染色ゲルである（花弁：レーン１および２；葉：レーン３および４；＋、エチレン処理；−、非処理）。図９Ｂは標識化全長カーネーション花弁老化誘導リパーゼｃＤＮＡによりプローブされた図９Ａにおけるゲルのノーザンブロットのオートラジオグラムである。
【図１０】
図１０は、トマトの葉のゲノム老化誘導リパーゼの部分ヌクレオチド配列（配列番号：６）および対応する推論アミノ酸配列（配列番号：１７）である。保存されたリパーゼ共通モチーフは影を付けられている；ゲノム断片を生成するために用いられるプライマーの配列はそれぞれ下線が記されている。
【図１１】
図１１は、膜漏れへの冷却効果を示す棒グラフである。トマト植物を８℃で４８時間にわたり冷却した。冷却しなかった対照植物、ならびに６および２４時間にわたって冷却した植物に対して、リーフディスクからの拡散気体漏れ（μＭｈｏｓ）を測定した。
【図１２】
図１２は、８℃で４８時間にわたり冷却し、２４時間にわたり再度室温に暖めた植物から単離したトマトの葉ＲＮＡのノーザンブロット分析である。図１２Ｂは３２Ｐ−ｄＣＴＰ標識全長カーネーション老化誘導リパーゼｃＤＮＡによりプローブされたノーザンブロットのオートラジオグラフである。
【図１３】
図１３は、６４アミノ酸領域にわたってカーネーション老化誘導リパーゼと５５．５％同一であるシロイヌナズナＥＳＴ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ＃：Ｎ３８２２７）の部分ヌクレオチド配列（配列番号：１５）および対応推論アミノ酸配列（配列番号：１６）である。保存されたリパーゼ共通モチーフは影を付けられている。
【図１４】
図１４は、全長シロイヌナズナ老化誘導リパーゼ遺伝子のヌクレオチド配列（上側）（配列番号：１８）および誘導アミノ酸配列（下側）（配列番号：１９）である。
【図１５】
図１５は、３２Ｐ−ｄＣＴＰ標識全長シロイヌナズナ老化誘導リパーゼによりプローブされた種々の段階（レーン１、２週齢植物；レーン２、３週齢植物；レーン３、４週齢植物；レーン４、５週齢植物；レーン５、６週齢植物）でのシロイヌナズナ植物の葉から単離した全ＲＮＡのノーザンブロットである。オートラジオグラフは上側（１５Ａ）であり、臭化エチジウム染色ゲルは下側（１５Ｂ）である。
【図１６】
図１６は、５０μＭエテフォン（エチレン源）で処理した３週齢シロイヌナズナ植物の葉から単離し、３２Ｐ−ｄＣＴＰ標識全長シロイヌナズナ老化誘導リパーゼによりプローブされた全ＲＮＡのノーザンブロットである。オートラジオグラフは上側（１６Ａ）であり、臭化エチジウム染色ゲルは下側（１６Ｂ）である。
【図１７】
図１７は、４．６週齢シロイヌナズナ野生型植物（左側）および全長シロイヌナズナ老化誘導リパーゼ遺伝子をアンチセンス方向に発現する遺伝子導入植物（右側）の写真であり、遺伝子導入植物において増大した葉のサイズが見られる。
【図１８】
図１８は、６．３週齢シロイヌナズナ野生型植物（左側）および全長シロイヌナズナ老化誘導リパーゼ遺伝子をアンチセンス方向に発現する遺伝子導入植物（右側）の写真であり、遺伝子導入植物において増大した葉のサイズおよび遅延した葉の老化が見られる。
【図１９】
図１９は、７週齢シロイヌナズナ野生型植物（左側）および全長シロイヌナズナ老化誘導リパーゼ遺伝子をアンチセンス方向に発現する遺伝子導入植物（右側）の写真であり、遺伝子植物において増大した葉のサイズが見られる。
【図２０】
図２０は、老化誘導リパーゼ遺伝子をアンチセンス方向に発現する３種のＴ１遺伝子導入シロイヌナズナ植物株において種子収穫高の増大が見られるグラフである。Ｎ＝３０に対するＳＥは野生型植物に見られる。
【図２１】
図２１は、４週齢シロイヌナズナ野生型植物、および全長老化誘導リパーゼ遺伝子をアンチセンス方向に発現する対応遺伝子導入植物の葉から単離した全タンパク質のウエスタンブロットである。（レーン１および２は９μｇのタンパク質を担持し、レーン３および４は１８μｇのタンパク質を担持した）。ブロットはシロイヌナズナ老化誘導リパーゼタンパク質に対して引き起こされる抗体によりプローブされた。老化誘導リパーゼの発現はすべての遺伝子導入植物において減少する。
発明の分野
本発明は、植物ポリペプチドをコードし、老化誘導発現を示すポリヌクレオチド、アンチセンス方向にポリヌクレオチドを含有する遺伝子導入植物および植物における老化を制御するための方法に関する。さらに詳細には、本発明は、それらの発現が老化の開始により誘導される植物リパーゼ遺伝子、および植物における老化を制御するためのリパーゼ遺伝子の使用に関する。
【０００２】
従来技術の説明
老化は植物生命の生物学的生育の終末過程である。それは死の前兆となり、全植物、器官、花および果実、組織および個々の細胞を含む種々のレベルの生物学的組織で起こる。
【０００３】
細胞膜劣化は老化の初期のおよび基本的な態様である。脂質、特に膜脂質の代謝は、細胞老化におけるいくつかの生物学的兆候の内の一つである。バラの花弁は、例えば、老化が進むにつれて、膜機能の損失に付随して起こるアシル加水分解酵素活性の増加を持続する（Ｂｏｒｏｃｈｏｖ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１９８２，６９，２９６〜２９９）。細胞膜劣化は、透過性の増加、イオン勾配の損失およびイオンポンプなどの鍵になる膜タンパク質の機能低下を生み出す老化の初期の特徴的な態様である（Ｂｒｏｗｎ， ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．：Ａ Ｔｒｅａｔｉｓｅ， Ｖｏｌ． Ｘ． Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９１，ｐｐ． ２２７〜２７５）。
【０００４】
膜構造および機能の完全性の減損の多くは、リパーゼ介在リン脂質代謝に帰することができる。リン酸脂質の損失は、花弁、葉、子葉および熟成果実を老化させることを実証してきた（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｅ．，Ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ Ａｇｉｎｇ ｉｎ Ｐｌａｎｔｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９８８，ｐｐ．５１〜８３）し、且つ、これは細胞機能の減損を招く進行性老化を伴う二分子膜の分子組織に大きな変更をもたらすように見える。特に、多くの老化植物組織による研究において、二分子膜における脂質代謝産物の集積に起因すると思われる膜中の脂質相分離に対する証拠が提供されてきた（ＭｃＫｅｒｓｉｅ ａｎｄ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，１９７９， Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，５０８： １９７〜２１２；Ｃｈｉａ，ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙ ｓｉｏｌ．， ６７：４１５〜４２０）。老化組織における脂質代謝の多くは、遺伝子発現での老化特有の変化を通して実現されるという証拠が増えてきている（Ｂｕｃｈａｎａｎ− Ｗｏｌｌａｓｔｏｎ，Ｖ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｏｔ．，１９９７，３０７：１８１〜１９９）。
【０００５】
老化の開始は内部、および外部両方の各種因子により誘発することができる。例えば、エチレンは種子発芽、苗成長、果実熟成および花老化などの多様な植物生育過程において多くの植物で役割を果たす。植物におけるエチレン産生は、また、機械的創傷、化学薬品、ストレス（温度および水量変化により生み出されるような）、および疾病により引き起こされる外傷と結びつけることができる。エチレンは多くの植物における葉の老化の調節にかかわってきたが、しかし、遺伝子導入植物およびエチレン反応突然変異体により得られる証拠によって、エチレンは老化に対する影響を有するが過程の本質的な調節物ではないことが示されてきた。
【０００６】
多くの植物において、エチレンは果実成熟または老化では役割を全く持っていないように見える。例えば、イチゴなどの非クライマクテリック植物の果実の成熟、ヤブカンゾウなどの一部の花の老化、およびシロイヌナズナなどの一部の植物および特に単子葉植物における葉の老化において、エチレン信号に対する要求は全くない（Ｓｍａｒｔ，Ｃ．Ｍ．， １９９４，Ｎｅｗ Ｐｈｙｔｏｌｏｇｙ，１２６：４１９〜４４８；Ｖａｌｐｕｅｓｔａ，ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２８：５７５〜５８２）。
【０００７】
老化の早期開始を誘発する外部因子には、温度、日照り、乏しい光または栄養供給量、および病原体攻撃などの環境ストレスが挙げられる。自然の（年齢に関係する）老化の場合におけるように、環境ストレス誘発老化は細胞膜の完全性の損失を特徴とする。特に、環境ストレスへの暴露は、これらすべてがリパーゼの作用に帰することができる膜損傷を示す電解質漏れ（Ｓｈａｒｏｍ，ｅｔ ａｌ．，１９９４， ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．，１０５：３０５〜３０８；Ｗｒｉｇｈｔ，Ｍ．，１９７４，Ｐｌａｎｔａ，１２０：６３〜６９；ａｎｄ Ｅｚｅ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉａ Ｐｌａｎｔａｒｕｍ，６８：３２３〜３２８）、膜リン脂質レベルの低下（Ｗｒｉｇｈｔ，Ｍ．，１９７４，Ｐｌａｎｔａ，１２０：６３〜６９）および脂質相遷移（Ｓｈａｒａｍ，ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．， １０５：３０５〜３０８）を誘発する。
【０００８】
環境ストレスに暴露された植物組織は、また、通常ストレスエチレンとして知られるエチレンを産生する（Ｂｕｃｈａｎａｎ− Ｗｏｌｌａｓｔｏｎ，Ｖ．，１９９７，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｏｔａｎｙ．，４８：１８１〜１９９；Ｗｒｉｇｈｔ，Ｍ．，１９７４，Ｐｌａｎｔａ，１２０：６３〜６９）。上述のように、エチレンは一部の植物において老化を引き起こすとして知られる。漏れを引き起こす膜劣化は、また、種子老化の種子の態様であり、これはまた膜リン脂質からの脂肪酸の脱エステル化を示すという証拠がある（ＭｃＫｅｒｓｉｅ， Ｂ．Ｄ．， Ｓｅｎａｒａｔａ，Ｔ．，Ｗａｌｋｅｒ，Ｍ．Ａ．，Ｋｅｎｄａｌｌ，Ｅ．Ｊ．ａｎｄ Ｈｅｔｈｅｒｉｎｇｔｏｎ，Ｐ．Ｒ．Ｉｎ： Ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ Ａｇｉｎｇ ｉｎ Ｐｌａｎｔｓ， Ｅｄ． Ｌ．Ｄ． Ｎｏｏｄｅｎ ａｎｄ Ａ．Ｃ． Ｌｅｏｏｐｏｉｄ，ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８８．ｐｐ ４４１〜４６４）。
【０００９】
内部または外部例えば環境ストレスいずれかの因子により生じる老化の開始を制御するための広く適用可能な方法は、現在、全くない。現在、果実、花および野菜などの新鮮な腐りやすい植物農産物の老化を制御し、保存寿命を増大させるための技術は、主としてエチレン生合成の減少に依存している。例えば、米国特許第５，８２４，８７５号には、アンチセンス方向における３種の１−アミノ−シクロプロパン−１−カルボン酸塩（ＡＣＣ）シンターゼ遺伝子の内の一つの発現から得られるエチレンレベルの減少のせいで長くなった保存寿命を示す遺伝子導入ゼラニウム植物が開示されている。結局、この技術はエチレン感受性である限定された範囲の植物だけに適用可能である。
【００１０】
一部の果実の保存寿命は、また、熟成を一層緩やかに起こさせるようにするエチレン生合成の減少により延ばされる。これら果実の老化は熟成後に誘発されるので、保存寿命に及ぼす減少エチレン生合成の影響は間接的である。果実熟成を遅らせるために用いられる別の方法は、熟成の初期段階の間に合成されるポリガラクツロナーゼ、細胞壁軟化酵素の細胞レベルを変更することによるものである。この方法は、それがまた間接的にのみ老化に影響し、再度狭い範囲の植物だけに適用可能である点において、エチレン生合成の制御に類似している。
【００１１】
このように、多様な植物に適用可能である植物の老化を制御する方法に対する必要性がある。従って、エチレン感受性に関係なくすべてのタイプの植物に適用可能である老化調節技術を開発することに興味がおかれる。
【００１２】
発明の概要
本発明は、カーネーション老化誘導リパーゼをコードする全長ｃＤＮＡクローン、およびシロイヌナズナ老化誘導リパーゼをコードする全長ｃＤＮＡクローンの発見およびクローン作成に基づく。老化誘導リパーゼ遺伝子のためのヌクレオチド配列および対応アミノ酸配列は、本明細書において開示される。カーネーション老化誘導リパーゼ遺伝子のヌクレオチド配列は、同様に制御されるいくつかの植物における対応遺伝子またはＲＮＡ転写体を検出するための異種プローブとして良好に用いられてきた。
【００１３】
本発明は、植物の遺伝子組み換えが年齢関与の老化または環境ストレス誘発老化いずれかの老化の開始を制御する方法を提供する。本発明の老化誘導リパーゼヌクレオチド配列、それらの断片、またはこうした断片の組合せは、内生老化誘導リパーゼ遺伝子の発現を抑制するために逆方向に植物細胞中に導入され、それによって、内生老化誘導リパーゼのレベルを低下させ、形質転換植物における老化を変更する。
【００１４】
本発明の方法を用いて遺伝子導入植物を生成し、生育および発達を監視する。老化誘導リパーゼのレベル低下のせいで植物の生育、開花期に関して長期化した寿命または保存期間、果実損傷の減少、種子熟成の減少および／または葉の黄変の減少を示す植物および植物の分離部分（例えば、挿し木、花、野菜、果実、種子または葉）は、葉の黄変減少、花弁離脱減少、出荷および貯蔵の間の果実損傷の減少を含む改善された特性を有する望ましい産物として選択される。これらの優れた植物は繁殖される。同様に、環境ストレスに対する耐性の増加、例えば、低温度（凍るような）、日照り、感染、などに対する感受性の低減を示す植物は、優れた産物として選択される。
【００１５】
一つの態様において、本発明は、ＤＮＡ分子が配列番号：１とハイブリダイズする老化誘導リパーゼをコードする単離されたＤＮＡ分子、または配列番号：１とハイブリダイズする単離されたＤＮＡ分子の機能誘導体を目指す。本発明の一つの実施形態において、単離されたＤＮＡ分子は、配列番号：１のヌクレオチド配列、すなわち、配列番号：１に対して１００％の相補性（配列同一性）を有する。本発明におけるこの態様の別の実施形態において、単離されたＤＮＡ分子は配列番号：４のヌクレオチド配列を含有する。
【００１６】
本発明は、また、ＤＮＡ分子が配列番号：１８とハイブリダイズする老化誘導リパーゼをコードする単離されたＤＮＡ分子、または配列番号：１８とハイブリダイズする単離されたＤＮＡ分子の機能誘導体を目指す。本発明におけるこの態様の一つの実施形態において、単離されたＤＮＡ分子は、配列番号：１８のヌクレオチド配列、すなわち、配列番号：１８に対して１００％の相補性（配列同一性）を有する。本発明におけるこの態様の別の実施形態において、単離されたＤＮＡ分子は配列番号：１９のヌクレオチド配列を含有する。
【００１７】
本発明の別の実施形態において、本明細書において上述したようにＤＮＡ分子によりコードされる単離されたタンパク質、またはその機能誘導体が提供される。好ましいタンパク質は配列番号：２のアミノ酸配列を有するか、または、その機能誘導体である。
【００１８】
また、本明細書において、ＲＮＡ分子が内生老化誘導リパーゼの発現を変更するようにＲＮＡ転写体とハイブリダイズする、本明細書において上述したＤＮＡ分子のＲＮＡ転写体の少なくとも一部に相補的であるＲＮＡ分子をコードするアンチセンス・オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが提供される。アンチセンス・オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは全長であり得るか、または、好ましくは、約６〜約１００のヌクレオチドを有する。
【００１９】
アンチセンス・オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、老化誘導リパーゼをコードするＤＮＡ分子が配列番号：１、配列番号：１８または両方とハイブリダイズするか、または老化誘導リパーゼをコードする単離されたＤＮＡ分子によりコードされるＲＮＡ配列の対応部分に実質的に相補的である、老化誘導リパーゼをコードするＤＮＡ分子の一つの鎖の対応部分に対して実質的に相補的である。本発明の一つの実施形態において、アンチセンス・オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、配列番号：１、配列番号：１８または両方または配列番号：１によりコードされるＲＮＡ転写体の一つの鎖の対応部分に対して実質的に相補的である。
【００２０】
別の実施形態において、アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ分子が配列番号：１、配列番号：１８または両方とハイブリダイズする老化誘導リパーゼをコードするＤＮＡ分子の、一つの鎖の５’非コード部分または３’末端部分の約１００〜約２００ヌクレオチドの対応部分に実質的に相補的である。別の実施形態において、アンチセンス・オリゴ−またはポリヌクレオチドは、ヌクレオチド配列番号：４または配列番号：４によりコードされるＲＮＡ転写体の一つの鎖の読取り枠の対応部分に対して実質的に相補的である。
【００２１】
本発明は、さらに、以下を含む植物細胞形質転換のためのベクターを目指す：
（ａ） （１）配列番号：１、配列番号：１８または両方とハイブリダイズする、老化誘導リパーゼをコードするＤＮＡ分子の一つの鎖の対応部分、または（２）老化誘導リパーゼをコードするＤＮＡ分子によりコードされるＲＮＡ配列の対応部分に対して実質的に相補的なアンチセンス・ヌクレオチド配列；および
（ｂ） アンチセンス・ヌクレオチド配列が、形質転換される植物細胞中に発現されるように、アンチセンス・ヌクレオチド配列に作用可能に連結された制御配列。
【００２２】
制御配列には、誘導的または構成的であり得る、形質転換植物細胞中で機能的なプロモーターが挙げられる。場合により、制御配列はポリアデニル化信号を含む。
本発明は、また、上述のようなベクターにより形質転換される植物細胞、こうした細胞から生成される苗または成熟植物、またはこうした苗または植物の植物部分を提供する。
【００２３】
本発明は、さらに、以下を含む、非形質転換植物に比べて老化誘導リパーゼの減少したレベルを有する植物を生産する方法を目指す：
（１）上述のようにベクターにより植物を形質転換し、
（２）植物が少なくとも苗の段階まで成長することを可能とし、
（３）変更された老化誘導リパーゼ活性および／または変更された老化および／または変更された環境ストレス誘発老化および／またはエチレン誘発老化に対する形質転換植物または苗を検定し、そして
（４）非形質転換植物に比べて変更された老化誘導リパーゼ活性および／または変更された老化および／または変更された環境ストレス誘発老化またはエチレン誘発老化を有する植物を選択し繁殖させる。
【００２４】
上述のように生産された植物、またはその系統、ハイブリッド体、クローン体または植物部分は、好ましくは、減少した老化誘導リパーゼ発現および遅延化した老化および／または遅延化した環境ストレス誘発老化またはエチレン誘発老化を示す。
【００２５】
本発明は、さらに、植物細胞中の内生老化誘導リパーゼの発現を抑制する方法を目指し、
（１）（Ａ）（ｉ）配列番号：１、配列番号：１８または両方とハイブリダイズする、内生老化誘導リパーゼをコードするＤＮＡ分子の一つの鎖の対応部分、または（ｉｉ）内生老化誘導リパーゼ遺伝子によりコードされるＲＮＡ配列の対応部分に対して相補的なアンチセンス・ヌクレオチド配列；および
（Ｂ）アンチセンス・ヌクレオチド配列が発現されるように、アンチセンス・ヌクレオチド配列に作用可能に連結された制御配列、
を含むベクターを植物のゲノム中に組み込むこと、および
（２）前記植物を成長させ、それによって前記アンチセンス・ヌクレオチド配列が転写され、転写体が前記内生ＲＮＡに結合し、それによって前記老化誘導リパーゼ遺伝子の発現が抑制されること、
を含む。
【００２６】
本発明の詳細な説明
方法および組成物は、植物細胞における老化誘導リパーゼ遺伝子（複数を含む）の発現を変更するために提供される。植物における老化誘導リパーゼ遺伝子（複数を含む）の発現の変更は、老化開始の遅延化および環境ストレスに対する耐性の改善をもたらし、その結果、植物の保存寿命および／または成長期間を延長させる。
【００２７】
老化誘導発現を示すカーネーションリパーゼ遺伝子をコードする全長ｃＤＮＡ配列は、カーネーション（ナデシコ科ナデシコ属）花の老化花弁のＲＮＡから作製されるｃＤＮＡライブラリーから単離された。単離カーネーション花リパーゼｃＤＮＡ配列の選択領域およびカーネーションリパーゼｃＤＮＡに対応するポリヌクレオチドプローブは、老化カーネーションの葉、成熟トマト果実および老化グリーン・ビーンズの葉、ならびに環境ストレス下の（冷却した）トマトの葉におけるリパーゼ遺伝子をコードするｍ ＲＮＡの存在を測定するために用いられた。カーネーションリパーゼｃＤＮＡから設計されるプライマーは、鋳型としてトマト葉のゲノムＤＮＡを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を生み出すために用いられた。ＰＣＲ産物は、保存リパーゼ共通モチーフ、ＩＴＦＴＧＨＳＬＧＡ（配列番号：３）を含む部分タンパク質配列をコードする部分読取り枠を含有する。
トマトヌクレオチド配列は、カーネーション老化誘導リパーゼ配列と５３．４％の配列同一性およびシロイヌナズナリパーゼ配列と４３．５％の同一性を有する。シロイヌナズナリパーゼ配列は、カーネーションヌクレオチド配列と４４．３％同一性を有する。
【００２８】
本発明のカーネーション老化誘導リパーゼ遺伝子は、カーネーションリパーゼ源、細胞質ゾルの脂質タンパク質粒子に対して引き起こされる抗体により老化カーネーション花弁から調製されるｃＤＮＡ発現ライブラリーを選別することにより単離された。カーネーション老化誘導リパーゼ遺伝子に対応する正の全長ｃＤＮＡクローンが得られ、配列された。老化誘導リパーゼｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列は配列番号：１に示される。ｃＤＮＡクローンは、計算分子質量５０．２ｋＤａを有する４４７アミノ酸ポリペプチド（配列番号：２）をコードする。アシル加水分解酵素活性を示す所期の分子量のタンパク質、すなわち、発現タンパク質を生成する大腸菌中のｃＤＮＡクローンの発現は、パルミチン酸ｐ−ニトロフェニル、リン脂質およびトリアシルグリセロールを加水分解する。それは、生育中のカーネーション花における酵素の発現パターンおよびタンパク質の活性に基づき、老化に関与する。
【００２９】
本発明のシロイヌナズナ老化誘導リパーゼ遺伝子は、また、反応において鋳型として老化シロイヌナズナ葉のｃＤＮＡライブラリーを用いるＰＣＲにより単離された。シロイヌナズナ老化誘導リパーゼ遺伝子のヌクレオチドおよび誘導アミノ酸配列は図１４に示される（配列番号：１８）。それは、生育中の植物におけるリパーゼ遺伝子の発現パターンに基づき、老化に関与する。
【００３０】
全長カーネーションｃＤＮＡによりプローブされたカーネーション花弁全ＲＮＡのノーザンブロットは、老化誘導リパーゼ遺伝子の発現が自然の老化の開始直前に有意に誘発されることを示す（図４）。ノーザンブロット分析は、また、環境ストレスに反応して生成されることが知られる老化誘導リパーゼ遺伝子が環境ストレス条件、例えば、冷却（図１２）およびエチレン（図４および９）により誘発されることを実証する。ノーザンブロット分析は、また、カーネーション老化誘導リパーゼｍＲＮＡの存在が若年段階Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩのカーネーション花弁におけるよりも老年期（生育段階ＩＶ）において有意により高くあることを示す。さらに、エチレン刺激段階ＩＩの花は、また、より高い老化誘導リパーゼ遺伝子発現を示す。同様に、冷却温度にさらされ室温に戻された植物は、また、冷却損傷症状（例えば、洩れ）の進展と一致する老化誘導リパーゼ遺伝子の誘発発現を示す（図１１および１２）。
【００３１】
シロイヌナズナ老化誘導リパーゼ遺伝子の発現は同様に調節される。種々の生育段階におけるシロイヌナズナ植物の葉からの全ＲＮＡのノーザンブロット分析は、リパーゼ遺伝子が葉の老化の開始と一致して上方調節されることを示す（図１５）。また、カーネーション老化誘導リパーゼ遺伝子のように、シロイヌナズナ老化誘導リパーゼ遺伝子はエチレン、葉の老化を誘発する植物ホルモンでの処理により上方調節される（図１６）。
【００３２】
種々の植物、例えば、カーネーション、グリーン・ビーンズ、トマト、シロイヌナズナ、および種々の植物組織、例えば、葉、果実および花における遺伝子発現の総合パターンにより、本発明のリパーゼ遺伝子がこれらの植物および植物組織における老化の開始に関与していることが実証される。従って、植物組織における老化誘導リパーゼ遺伝子の発現を実質的に抑制するかまたは変更することにより、生の果実、花および野菜の保存寿命を増大させて、老化、劣化および損傷を遅延させ得ることが期待される。これは、好ましくは、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターなどの構成的プロモーターを用いるか、または組織特定的または老化誘導性プロモーターを用いて、リパーゼｃＤＮＡまたはそのオリゴヌクレオチド断片が中で果実、花、野菜、農作物植物および森林種においてアンチセンス構造で発現される遺伝子導入植物を作製することにより達成することができる。
【００３３】
カーネーション老化誘導リパーゼ遺伝子は単一複製遺伝子である。老化誘導リパーゼｃＤＮＡの読取り枠内の配列を認識しない種々の制限酵素により切断されたカーネーションゲノムＤＮＡのサザーンブロット分析を行った。制限酵素消化ゲノムＤＮＡを３２Ｐ−ｄＣＴＰ標識全長ｃＤＮＡ（配列番号：１）によりプローブした。高度に厳しいハイブリダイズ条件下で、ただ一つだけの制限断片がｃＤＮＡクローンに対してハイブリダイズする（ハイブリダイズおよび洗浄の両方に対して６８℃；洗浄緩衝液：０．２％ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）。従って、カーネーション老化誘導リパーゼ遺伝子は単一複製遺伝子である（図６）。この遺伝子はカーネーションにおける多遺伝子系の一員ではないという事実が、それが他植物における単一複製遺伝子であることを強く示唆している。
【００３４】
カーネーション老化誘導リパーゼ遺伝子またはシロイヌナズナ老化誘導リパーゼ遺伝子の完全なヌクレオチド配列の知識は、種々の他植物種から老化誘導リパーゼ遺伝子（複数を含む）を単離することには十分である。実際、本明細書において実証されるように、カーネーションｃＤＮＡ配列に基づくオリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型としてトマトの葉のゲノムＤＮＡを用いるポリメラーゼ連鎖反応によりトマトの葉の老化誘導リパーゼ遺伝子断片を生成するために良好に用いられてきた。
【００３５】
クローン化老化誘導リパーゼ遺伝子（複数を含む）またはその（それらの）断片（複数を含む）は、単独でまたは組合せて、イチジクイボのモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、カリフラワーモザイクウイルスプロモーターＣａＭＶ３５ＳまたはＭＡＳプロモーターなどの構成的プロモーターの制御下で逆方向（アンチセンス）に導入される場合、遺伝子的に植物を組み換え、組み換え植物において老化を変更するために用いることができる。
【００３６】
カーネーション老化誘導リパーゼ遺伝子との十分な配列同一性を共有する他の植物からの選択されたアンチセンス配列は、類似の遺伝子組み換えを達成するために用いることができる。遺伝子組み換えの一つの結果は、内生の翻訳可能な老化誘導リパーゼコードｍＲＮＡの量の減少である。結局、植物細胞中に作製された老化誘導リパーゼの量は減少し、それによって、細胞膜損傷および細胞漏れ、例えば、高齢化または環境ストレスのせいで減退した葉、果実および／または花の老化および損傷の量を減少させる。
【００３７】
例えば、アンチセンス方向の全長シロイヌナズナ老化誘導リパーゼ遺伝子を発現するベクターにより形質転換されるシロイヌナズナ植物は、二重３５Ｓプロモーターの調節下において、図１７および１８に示されるように野生型植物に比べてより大きな葉のサイズと全体的により大きな植物成長を見せる。これらの植物は、また、図１９に示されるように遅延化した葉の老化を実証する。
【００３８】
遺伝子導入シロイヌナズナ植物におけるアンチセンス方向の全長リパーゼ遺伝子を発現することによりもたらされる老化誘導リパーゼ遺伝子の減退発現の効果は、また、形質転換植物における種子収量の増加として見られる。全長老化誘導リパーゼ遺伝子を発現するシロイヌナズナ植物株は、野生型植物よりも約２〜３倍多い種子を生産する（図２０）。
【００３９】
生物体量、葉の老化および種子収量に関して遺伝子導入植物に見られる効果が、これら植物における老化誘導リパーゼの減少のせいであることは、図２１に示される。本発明の遺伝子導入植物は、野生型植物に比べて有意に減少した老化誘導リパーゼの発現を示す。
従って、本発明の方法および手順は、葉または果実損失を含む植物損失を遅延化させ、且つ植物生物体量および種子収量を増加させるために用いることができると共に、一般に、植物における老化を変更することができる。
【００４０】
本発明の単離ヌクレオチド配列は、実質的に相補的な老化誘導リパーゼヌクレオチド配列を他の植物または器官から単離するために用いることができる。これらの配列は、次に、植物を形質転換し、それによって、本明細書において示される単離ヌクレオチド配列の使用で示されるのと同じやり方において形質転換された植物の老化を変更するために用いることができる。
【００４１】
老化誘導リパーゼ、その機能性断片またはそれらの組合せを持つ植物の形質転換により見られる遺伝子組み換えは、植物における老化誘導リパーゼのレベルの恒久的な変化をもたらすことができると共に、自殖または他の繁殖機構により子孫植物に増殖させることができる。遺伝子的に変更された植物は、変更が世代間に着実に伝播される植物の新株を生み出すために用いられる。本発明は、広範囲にわたる各種植物における老化の安定な遺伝子組み換えを達成するために用いることが可能である適切なＤＮＡ配列を、初めて、提供する。
【００４２】
老化誘導リパーゼ遺伝子の識別および単離のために、一般に、プラスミドＤＮＡ、制限酵素消化、ＤＮＡのアガロースゲル電気泳動、タンパク質のポリアクリルアミドゲル電気泳動、サザーンブロット、ノーザンブロット、ＤＮＡライゲーションおよび細菌形質転換を、技術上周知の従来の方法を用いて行った。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９を参照すること。核酸ハイブリダイズの技術はＳａｍｂｒｏｏｋ（上記）により開示されている。
【００４３】
本明細書において用いられる、用語「植物」又は「植物」は、全体植物、植物部分、植物細胞または植物細胞の一群を指す。本発明の方法において用いることができる植物のタイプには、例えば、エチレン感受性およびエチレン非感受性植物；アンズ、リンゴ、オレンジ、バナナ、グレープフルーツ、ナシ、トマト、イチゴ、アボカド、などの果実担持植物；ニンジン、えんどう豆、レタス、キャベツ、カブ、ポテト、ブロッコリ、アスパラガス、などの野菜；カーネーション、バラ、キクなどの花；および、一般に、本発明のＤＮＡ分子を取り上げ、発現することができるあらゆる植物が挙げられるがそれらに限定されない。それは、半数体、２倍体、４倍体および倍数体を含む多様な倍数レベルの植物を包含することが可能である。
【００４４】
遺伝子導入植物は、本明細書において、異種または相同老化誘導リパーゼＤＮＡまたは組み換えＤＮＡ、または異種老化誘導リパーゼＤＮＡまたは相同老化誘導リパーゼＤＮＡの一部をそのゲノム中に組み込んだ植物に限定されないがそれらを含み、何らかの方法で遺伝子的に形質転換される植物として定義される。変更された遺伝子材料は、タンパク質をコードし、調節または制御配列を含むことが可能であるか、または、アンチセンス配列であるかまたはそれを含むか、あるいは、植物の内生老化誘導リパーゼＤＮＡまたはｍ ＲＮＡ配列またはその部分に対してアンチセンスであるアンチセンスＲＮＡをコードすることが可能である。「導入遺伝子」または「遺伝子導入配列」は、遺伝子導入植物中に組み込まれた外部遺伝子または部分配列として定義される。
【００４５】
本明細書において用いられる用語「ハイブリダイズ」は、一般に、プローブ配列および標的配列の性質に応じて決まる当業者にとって容易に明白であるような適切な厳格（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）条件での核酸のハイブリダイズを意味するために用いられる。ハイブリダイズおよび洗浄の条件は技術上周知であり、培養時間、温度および／または溶液のイオン強度を変動させることによる所期の厳しさに応じて決まる条件の調整は、容易に達成される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９を参照すること。条件の選択は、ハイブリダイズされる配列の長さ、特に、プローブ配列の長さ、核酸の相対的なＧ−Ｃ含量および許容される不適正塩基対の量により決定される。
【００４６】
低緊縮条件は、より少ない程度の相補性を有する鎖間の部分ハイブリダイズが望まれる場合に好ましい。完全なまたはほぼ完全な相補性が望まれる場合には、高緊縮条件が好ましい。一般的な高緊縮条件として、ハイブリダイズ溶液は６ｘＳ．Ｓ．Ｃ．、０．０１ＭＥＤＴＡ、１ｘデンハルト溶液および０．５％ＳＤＳを含有する。ハイブリダイズは、約６８℃でクローン化ＤＮＡの断片に対して約３〜約４時間にわたり、全真核ＤＮＡに対して約１２〜約１６時間にわたり行われる。低緊縮条件として、ハイブリダイズ温度は二重体の融点（ＴＭ）の約１２℃下に下げられる。ＴＭはＧ−Ｃ含量および二重体の長さならびに溶液のイオン強度の関数であることが知られている。
【００４７】
本明細書において用いられる、用語「実質的な配列同一性」または「実質的な相同性」は、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列が別のヌクレオチドまたはアミノ酸配列と実質的な構造および機能同等性を現すことを示すために用いられる。実質的な配列同一性または実質的な相同性を有する配列間のあらゆる構造または機能差異は僅少である；すなわち、それらは所期の適用において示されるように機能する配列の能力に影響を及ぼさない。差異は、例えば、異なる種の中でのコドン使用頻度における固有偏差のせいであり得る。構造差異は、２以上の異なる配列間の配列の重なりまたは類似性の有意な量がある場合、またはたとえ配列が長さまたは構造において異なる場合でも、僅少と考えられる。こうした特性には、例えば、確定された条件下でハイブリッドを形成する能力、またはタンパク質の場合における免疫学的交差反応性、類似の酵素反応性、などが挙げられる。
【００４８】
加えて、２ヌクレオチド配列は、それらの間での配列が少なくとも約４０％、さらに好ましくは少なくとも約６０％、および最も好ましくは約９０％の配列類似性を有する場合に、「実質的に相補的」である。２アミノ酸配列は、それらがポリペプチドの活性部分間での少なくとも４０％、好ましくは７０％の類似性を有する場合に、実質的に相同である。
【００４９】
本明細書において用いられる、用語ＤＮＡまたはＲＮＡ分子の「対応部分に対してハイブリダイズする」は、例えば、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、またはあらゆるヌクレオチド配列（センスまたはアンチセンス方向における）とハイブリダイズする分子が、ほぼ同じサイズであり適切な条件下でハイブリダイズをもたらすに十分なそれに対する配列類似性を有する別の核酸分子における配列を認識し、それにハイブリダイズすることを意味する。
【００５０】
例えば、カーネーションリパーゼの３’コードまたは非コード領域からの１００ヌクレオチド長アンチセンス分子は、２配列間の約７０％ 以上の配列類似性がある限り、シロイヌナズナ老化誘導リパーゼ遺伝子またはあらゆる他の植物老化誘導リパーゼ遺伝子それぞれの３’コードまたは非コード領域内のヌクレオチド配列の約１００ヌクレオチド部分を認識し、それにハイブリダイズする。「対応部分」のサイズは、「対応部分」が例えば２０〜３０％より大きいかまたはより小さいか、好ましくは約１２〜１５％未満でより大きいかまたはより小さいかでそれにハイブリダイズする分子に比べて、より小さいかまたはより大きくあることが可能であるように、ハイブリダイズにおける一部の不適正塩基対を可能とさせることは理解できる。
【００５１】
用語、核酸（またはポリ−またはオリゴヌクレオチド）の「機能誘導体」は、本明細書において、老化誘導リパーゼをコードする遺伝子またはヌクレオチド配列の断片、変異体、相同体、または類似物を意味するために用いられる。機能誘導体は、本発明によるその効用を可能とするＤＮＡをコードする老化誘導リパーゼの機能の少なくとも一部を保持することが可能である。こうした機能には、自然カーネーション老化誘導リパーゼまたは老化誘導リパーゼをコードする別の植物からの実質的に相同なＤＮＡと、またはそのｍＲＮＡ転写体とハイブリダイズするか、またはアンチセンス方向において、植物老化誘導リパーゼｍＲＮＡの転写および／または翻訳などを抑制する能力を挙げることが可能である。
【００５２】
遺伝子またはＤＮＡ配列の「断片」は分子のあらゆる部分、例えば、より短いポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを指す。「変異体」は、１以上の置換ヌクレオチドを有するヌクレオチド置換変異体などの、全体遺伝子またはその断片のいずれかに実質的に類似の分子を指すが、しかし、これは特定の遺伝子とハイブリダイズするか、または自然のＤＮＡとハイブリダイズするｍＲＮＡをコードする能力を維持する。「相同体」は異なる植物属または種からの断片または変異体配列を指す。「類似物」は、全体分子、変異体またはその断片のいずれかに実質的に類似か、またはそれに関して機能する非自然分子を指す。
【００５３】
遺伝子、例えば老化誘導リパーゼ遺伝子の「変更された発現」または「組み換え発現」とは、それによって、遺伝子の通常の発現、例えば、非組み換えカーネーションまたは他の植物に起こるその発現が何らかの方法で変更されるあらゆる方法または結果を意味する。本明細書において意図されるように、遺伝子発現における変更は、老化誘導リパーゼ遺伝子の発現を完全にまたは部分的に減少させるが、しかし、また、発現時期の変更、または老化誘導リパーゼ遺伝子の発現が非組み換え植物または品種において最も自然に起こりやすいであろうものと異なる別の状態を含むことが可能である。好ましい変更は、非組み換え植物における産物に比較して植物による老化誘導リパーゼ産物の減少をもたらす。
【００５４】
本発明による遺伝子的に変更された植物を生産することにおいて、所期の形質、一般的に減少した老化誘導リパーゼ発現または生産量によって、個々の苗または植物を選択することは好ましい。老化誘導リパーゼの発現は、例えば、本明細書において記載される特定の抗体を用いる従来の免疫検定法で定量化することができる。また、老化誘導リパーゼの酵素活性は、本明細書において記載される生化学的方法を用いて測定することができる。
【００５５】
新規に挿入された遺伝子またはＤＮＡ配列が、それがコードするタンパク質の産生をもたらして発現するか、またはアンチセンスＤＮＡの場合、アンチセンスＲＮＡ分子をもたらして転写されるために、適正な調節要素は、遺伝子またはＤＮＡ配列に関して適正な位置および方向に存在することが好ましい。調節領域は、プロモーター、５’−非翻訳リーダー配列および３’−ポリアデニル化配列、ならびにエンハンサーおよび他の調節配列を含むことが可能である。
【００５６】
遺伝子のセンスまたはアンチセンス転写体を生み出すために老化誘導リパーゼ遺伝子と組合せて有用であるプロモーター調節要素には、一般にあらゆる植物プロモーター、さらに詳細には、イチジクイボモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、二重３５Ｓプロモーター、カリフラワーモザイクウイルスプロモーター、ＣａＭＶ３５ｓプロモーター、またはＭＡＳプロモーターなどの構成的プロモーター、あるいはカーネーション花弁ＧＳＴ１プロモーターまたはシロイヌナズナＳＡＧ１２プロモーターなどの組織特定または老化誘導プロモーターが挙げられる（例えば、本明細書において参考のために包含する Ｊ．Ｃ．Ｐａｌａｑｕｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１１２：１４４７〜１４５６（１９９６）；Ｍｏｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ，１：１２３〜１３２（１９９５）；Ｆｏｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ，６：５６７〜５７７（１９９４）；ａｎｄ Ｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．， １１３：３１３（１９９７）を参照すること）。好ましくは、本発明において用いられるプロモーターは構成的プロモーターである。
【００５７】
本発明に対して有用であるプロモーターからの発現レベルは、従来の発現系を用いて、例えば、レポーター遺伝子産物、例えば、プロモーター／レポーターが中に導入される遺伝子導入植物の葉、花、果実または他の組織の抽出物中のタンパク質またはｍＲＮＡのレベルを測定することにより検査することができる。
【００５８】
本発明は、カーネーション老化誘導リパーゼをコードする遺伝子に相補的な、シロイヌナズナ老化誘導リパーゼをコードする遺伝子に相補的な、または緩いまたは高緊縮条件下でカーネーションまたはシロイヌナズナ老化誘導リパーゼ遺伝子とハイブリダイズする別の植物からの遺伝子または遺伝子断片に相補的なアンチセンス・オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドを提供する。
【００５９】
こうしたアンチセンス・オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイズの最小の特異性を提供するために少なくとも約６のヌクレオチド長であることが好ましく、老化誘導リパーゼをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡまたはその部分の一つの鎖に対して、あるいは老化誘導リパーゼ遺伝子発現を調節することに関与するゲノムＤＮＡの側面配列に対して相補的であることが可能である。アンチセンス・オリゴヌクレオチドは１００ヌクレオチドの大きさであることが可能であり、それがアンチセンスにある全長コード配列まで、およびそれを超えての長さにまで延長することが可能である。アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡまたはＤＮＡおよびＲＮＡのキメラ混合物またはそれらの誘導体または組み換え変形体であることができる。
【００６０】
アンチセンス・オリゴヌクレオチドの作用は、細胞中の老化誘導リパーゼ遺伝子発現の変更、主として抑制をもたらすことが可能である。アンチセンスの一般的な検討に関しては、Ａｌｂｅｒｔｓ，ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９、特に本明細書において参考として包含されるページ１９５〜１９６）を参照すること。
【００６１】
アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、老化誘導リパーゼ遺伝子のあらゆる部分に相補的であることが可能である。一つの実施形態において、アンチセンス・オリゴヌクレオチドは６〜１００ヌクレオチド長の間であることが可能であり、例えば、老化誘導リパーゼ配列の５’−非コード配列または３’末端に相補的であることが可能である。主として５’−非コード配列に相補的なアンチセンス・オリゴヌクレオチドは、転写因子をコードする遺伝子の発現の有効な阻害剤であることが知られる。Ｂｒａｎｃｈ，Ｍ．Ａ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１３： ４２８４〜４２９０（１９９３）を参照すること。
【００６２】
好ましいアンチセンス・オリゴヌクレオチドは、老化誘導リパーゼをコードするｍＲＮＡの対応部分に対して実質的に相補的である。例えば、植物中へのアンチセンス方向の老化誘導リパーゼをコードする全長ｃＤＮＡクローンの導入は、良好に変更された老化誘導リパーゼ遺伝子発現をもたらすことが期待される。さらに、老化誘導リパーゼ遺伝子の特定部分を標的にした部分配列の導入は、同等に効果的であることが可能である。
【００６３】
本発明により必要とされる相同性の最小量は、他のＲＮＡまたはＤＮＡ分子の機能および他遺伝子の発現に影響を及ぼさない一方で、特定標的ＲＮＡまたはＤＮＡ分子の認識およびその翻訳または機能の抑制または減少を提供するために十分な相補性をもたらすに十分なものである。本発明のアンチセンス・オリゴヌクレオチドが老化誘導リパーゼ遺伝子のＲＮＡ転写体の少なくとも一部に対して相補的な配列を含む一方で、絶対的な相補性は好ましいが必要とされない。ハイブリッドを形成する能力は、アンチセンス・オリゴヌクレオチドの長さおよび相補性の程度に応じて決めることが可能である。一般に、ハイブリダイズ核酸が長いほど、より多い老化誘導リパーゼ標的配列との不適正塩基対をそれは含有するが、なお安定な二重体を形成することが可能である。当業者は、標準手順の使用により不適正塩基対の許容可能な程度を確認して、例えば、ハイブリダイズ複合体の融点を測定することができる。
【００６４】
アンチセンス・ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、外生導入核酸配列からの転写により細胞内に生み出すことが可能である。アンチセンス分子は、プロモーターを含む適切な調節要素に作用可能に連結される、アンチセンス老化誘導リパーゼ配列をコードするＤＮＡが中に組み込まれるプラスミドまたはウイルスなどのベクターでの形質転換またはトランスフェクションまたは感染により細胞に送達させることが可能である。細胞内で、外生ＤＮＡ配列は老化誘導リパーゼ遺伝子のアンチセンスＲＮＡを生成して発現する。
【００６５】
ベクターは、好ましくは、プラスミドであることができるか、または、植物細胞または細菌細胞においてその上にコードされる遺伝子を複製し発現することが技術上知られるウイルス性または他のベクターであることが可能である。ベクターは、それが転写されて所期のアンチセンス老化誘導リパーゼＲＮＡを生み出すことができるように、染色体的に統合されることになる。こうしたプラスミドまたはウイルス性ベクターは、技術上標準的である組み換えＤＮＡ技術により構築することができる。
【００６６】
例えば、ベクターは、本発明による原核宿主およびアンチセンス・オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドにおいて機能的な複製システムを含有するプラスミドベクターであることが可能である。あるいは、ベクターは、本発明によるアグロバクテリウムおよびアンチセンス・オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドにおいて機能的な複製システムを含有するプラスミドであることが可能である。アグロバクテリウムにおいて複製することができるプラスミドは、技術上周知である。Ｍｉｋｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｆｏｒ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｆｏｒｅｉｇｎ ＤＮＡ Ｉｎｔｏ Ｐｌａｎｔｓ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，， Ｅｄｓ． Ｂ．Ｒ．Ｇｌｉｃｋ ａｎｄ Ｊ．Ｅ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ．ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（１９９３），ＰＰ．６７〜８３を参照すること。
【００６７】
カーネーションリパーゼ遺伝子を、以下のやり方でプラスミドベクター中にアンチセンス方向にクローン化した。カーネーションリパーゼ遺伝子をクローン化するために、ｐＵＣ１８バックボーンから構築され、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）からの３５Ｓプロモーター次に多クローン化部位およびオクタピンシンターゼ停止配列を含有するｐＣＤプラスミドを用いた。ｐＣｄのＨｉｎｄ３部位およびＥｃｏＲ１部位中に全長カーネーションリパーゼ遺伝子をアンチセンス方向にサブクローン化することにより、ｐＣｄ−リパーゼ（アンチセンス）プラスミドを構築した。
【００６８】
同様に、ｐＣｄベクターのＢａｍＨ１およびＳａｌ１部位中にカーネーショングルタチオンＳ−トランスフェラーゼ１（ＧＳＴ１）プロモーターのＰＣＲ増幅断片（−７０３〜＋１９ｂｐ）を最初にサブクローン化することにより、ｐＣＤΔ３５Ｓ−ＧＳＴ１−リパーゼ（アンチセンス）プラスミドを構築した。次に、全長カーネーションリパーゼ遺伝子を構築物のＨｉｎｄ３およびＥｃｏＲ１部位中にアンチセンス方向にサブクローン化した。ｐＣｄベクターのＢａｍＨ１およびＳａｌ１部位中にカーネーショングルタチオンＳ−トランスフェラーゼ１（ＧＳＴ１）プロモーターのＰＣＲ増幅断片（−７０３〜＋１９ｂｐ）を最初にサブクローン化することにより、別のプラスミド、ｐＧｄΔ３５Ｓ−ＧＳＴ１−ＧＵＳプラスミドを構築した。
【００６９】
次に、レポーター遺伝子ベータ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）を構築物のＳａｌ１およびＥｃｏＲ１部位中にサブクローン化した。ｐＣｄベクターのＳｍａ１およびＨｉｎｄ３部位中に二重３５Ｓプロモーター（タンデム形態でＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの２複製を含有する）を最初にサブクローン化することにより、ｐＣＤ−３５Ｓ２−リパーゼ（アンチセンス）プラスミドを構築した。次に、全長カーネーションリパーゼ遺伝子を構築物のＨｉｎｄ３およびＥｃｏＲ１部位中にアンチセンス方向にサブクローン化した。
【００７０】
好ましくは約６〜約１００ヌクレオチド長間の、および老化誘導リパーゼの標的配列に相補的なオリゴヌクレオチドは、組み換えヌクレオチド技術により調製することが可能であるか、または、例えば、モノヌクレオチドまたはより短いオリゴヌクレオチドから合成することが可能である。自動化合成器は、本発明のオリゴ−およびポリヌクレオチドの化学合成に適用可能である。本発明による組み換えヌクレオチド分子を構築するための手順は、本明細書においてその全体を包含するＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９に開示されている。
【００７１】
老化誘導リパーゼ配列に相補的なアンチセンスＲＮＡをコードするオリゴヌクレオチドは、当業者に周知の手順を用いて調製することができる。こうした手順に関する詳細は、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｅｄｓ．，Ｎｉｅｒｌｉｃｈ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ， Ｎ．Ｙ．（１９７６）に提供されている。
【００７２】
本発明の代替実施形態において、内生植物老化誘導リパーゼ発現の抑制は、植物細胞中に導入される外生老化誘導リパーゼ遺伝子または遺伝子断片の過剰発現を通しての共抑制の結果である。本発明のこの実施形態において、センス方向の老化誘導リパーゼをコードするベクターは、本明細書においてアンチセンス分子用に記載されたのと同じやり方で細胞中に導入される。好ましくは、老化誘導リパーゼは、例えば、イチジクイボモザイクウイルスプロモーターまたはＣａＭＶ３５Ｓなどの強構成的プロモーターに作用可能に連結される。
【００７３】
本発明により作製される遺伝子導入植物は、技術上公知の植物形質転換のあらゆる方法を用いるＤＮＡ形質転換によって調製することが可能である。植物形質転換法には、アグロバクテリウムツメファシエンスとの植物、組織または細胞の直接共栽培または直接感染（Ｍｉｋｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．ｉｎ ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，（１９９３），ｐ．６７〜８８）；プロトプラストまたはプロトプラスト取り込み体中への直接遺伝子導入（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ，ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１２：２７１７（１９８４））；電気穿孔法（Ｆｒｏｍｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１９：７１９（１９８６））；粒子衝突（Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：５５９〜５６３（１９８８））；苗および植物の分裂組織中への注入（Ｄｅ ＬａＰｅｎａ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ， ３２５：２７４〜２７６（１９８７））；培養細胞および組織のプロトプラスト中への注入（Ｒｅｉｃｈ，ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，４：１００１〜１００４（１９８６））が挙げられる。
【００７４】
一般に、完全な植物は形質転換法から得られる。植物はプロトプラスト、カルス、組織部分または外植体、などから再生される。葉、花、果実および種子などの、老化誘導リパーゼの発現が中で変更される再生植物から得られる植物部分は、本明細書において用いられる「植物」の定義に含まれる。再生植物の子孫、変異体および突然変異体も、また、「植物」の定義に含まれる。
【００７５】
本発明は、また、本発明のｃＤＮＡ分子によりコードされるカーネーションまたはシロイヌナズナ老化誘導リパーゼタンパク質、およびカーネーションまたはシロイヌナズナタンパク質に対する抗体と交差反応するタンパク質を提供する。こうしたタンパク質は図１に見られる配列番号：２に示されるアミノ酸配列を有するか、配列番号：２に示されるタンパク質に対する抗体との交差反応性を共有するか、配列番号：１９（図１４に見られる）に示されるアミノ酸配列を有するか、または配列番号：１９に示されるタンパク質に対する抗体との交差反応性を共有する。
【００７６】
カーネーションまたはシロイヌナズナ老化誘導リパーゼタンパク質またはその機能誘導体は、好ましくは、場合により化学合成法と組合せた組み換え技術によって生産される。本発明の一つの実施形態において、老化誘導リパーゼは、マルトース結合タンパク質と融合した老化誘導リパーゼからなる融合タンパク質として発現する。組み換え融合タンパク質をコードするクローンの発現は、リパーゼ活性の指標であり、パルミチン酸ｐ−ニトロフェニル、リン脂質およびトリアシルグリセロールを加水分解する所期の分子量の融合タンパク質を生成する。組み換え老化誘導リパーゼタンパク質は、カーネーション老化誘導リパーゼに対する抗体による免疫ブロット法後にウエスタンブロット分析において顕著なバンドを示す。
【００７７】
プロテアーゼ、活性型第Ｘ因子による融合タンパク質の処理によって放出される遊離型老化誘導リパーゼ（５０．２Ｋｄａ）も、また、ウエスタンブロット分析において老化誘導リパーゼ抗体と反応する（図３）。老化誘導リパーゼアミノ酸配列のモチーフの探索により、アミド結合を介するミリスチン酸塩の共有結合のための潜在的なＮ−ミリストイル化部位の存在が示される（図１）（Ｊｏｈｎｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６３：８６９〜９１４（１９９４）；Ｔｏｗｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ５７：６７〜９９（１９８８）；ａｎｄ Ｒ．Ｊ．Ａ．Ｇｒａｎｄ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２５８：６２５〜６３８（１９８９）を参照すること）。タンパク質のモチーフの探索により、カーネーション老化誘導リパーゼが保存されたリパーゼに共通の配列である配列、ＩＴＦＡＧＨＳＬＧＡ （配列番号：４）を含有することも示された。多様な植物からの保存リパーゼ共通配列を以下の表に示す。
【表１】
本発明の老化誘導リパーゼタンパク質は、生体外および原位置両方の検定においてリパーゼ活性を有することが示された。生体外測定のために、パルミチン酸ｐ−ニトロフェニルおよび大豆リン脂質（４０％ホスファチジルコリンおよび６０％他のリン脂質）を基質として用い、反応の産物、ｐ−ニトロフェノールおよび遊離脂肪酸をそれぞれ分光光度法により測定した（Ｐｅｎｃｒｅａｃ’ｈ ａｎｄ Ｂａｒａｔｔｉ，１９９６； Ｎｉｘｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｎ，１９７９；Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３）。リパーゼ活性を、また、Ｎｉｘｏｎ およびＣｈａｎ（１９７９）およびＬｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９８３）により記載されている方法の修正法を用いてガスクロマトグラフィーによって生体外で測定した。
【００７９】
反応混合物は、最終体積１００μｌにおいて、１００ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２．５ｍＭ基質（トリリノレイン、大豆リン脂質またはジリノレイルホスファチジルコリン）および酵素タンパク質（１００μｇ）を含有した。基質を反応混合物に添加する前に５％アラビアゴム中に乳化させた。これを達成するために、基質をクロロホルム中に溶解し、アラビアゴム溶液中に添加し、３０秒間の音波処理により乳化した。乳化後、クロロホルムをＮ２流により蒸発させた。２５℃で２時間までの変動時間にわたり反応を行った。次に、反応混合物を脂質抽出し、遊離脂肪酸をＴＬＣにより精製し、ＧＣにより誘導し定量化した（ＭｃＫｅｇｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。
【００８０】
脂質分解性アシル加水分解酵素活性を、Ｆｕｒｕｋａｗａ ｅｔ ａｌ．（１９８３）により記載されＴｓｕｂｏｉ ｅｔ ａｌ．（１９９６）により修正されたように現場で測定した。この後者のアッセイにおいて、老化誘導リパーゼをコードする全長ｃＤＮＡクローンにより形質転換された大腸菌を、唯一の炭素源として両方共に長鎖脂肪酸エステルであるツイーン（Ｔｗｅｅｎ）４０またはツイーン（Ｔｗｅｅｎ）６０で補完された最小の塩培地中において増殖させた。従って、細菌増殖用炭素は、脂肪酸エステルがリパーゼにより加水分解される場合のみに利用可能であった。
【００８１】
老化誘導リパーゼｃＤＮＡにより形質転換された大腸菌が当初の誘導期後ツイーン４０−およびツイーン６０−基礎培地中で増殖し、一方で形質転換されない大腸菌の対照培養物が増殖しないという発見は、コードされた組み換えタンパク質のリパーゼ活性を確認するものである（図５）。すなわち、老化誘導リパーゼは、増殖のために必要な炭素を得るためにステアリン酸塩（ツイーン６０）およびパルミチン酸塩（ツイーン４０）を放出する。
【００８２】
本明細書において記載される老化誘導リパーゼタンパク質の「機能誘導体」は、老化誘導リパーゼ活性の少なくとも一部、または老化誘導リパーゼに対する特定の抗体との免疫学的交差反応性を保持する老化誘導リパーゼの断片、変異体、類似物、または化学誘導体である。老化誘導リパーゼタンパク質の断片はあらゆる分子の部分を指す。変種ペプチドは、例えば、技術上周知の方法を用いて直接化学合成により生産することが可能である。老化誘導リパーゼの類似物は、全体タンパク質またはその断片のいずれかに実質的に類似の非自然タンパク質を指す。老化誘導リパーゼの化学誘導体は、通常ペプチドＧ３８の一部またはペプチド断片でない追加の化学部分を含有する。組み換えは、ペプチドの標的アミノ酸残基を、選択された側鎖または末端基と反応することができる有機誘導剤と反応させることにより、老化誘導リパーゼペプチドまたはその断片中に導入することが可能である。
【００８３】
本発明による老化誘導リパーゼタンパク質またはペプチドは、本発明のヌクレオチド配列（センス方向における）により形質転換された細胞を培養し、細胞がタンパク質を合成することを可能とし、次に、用いたクローン化プロトコルに応じてタンパク質を遊離タンパク質または融合タンパク質としてのいずれかで分離することによって、培養培地または細胞抽出物のいずれかから生産することが可能である。あるいは、タンパク質は細胞なしの系において生産することができる。Ｒａｎｕ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，６０：４５９〜４８４，（１９７９）を参照すること。
【００８４】
今、一般的に本発明を説明してきたが、同じことが、説明の目的で提供され本発明を限定しようとしては意図されていない以下の実施例を参照することを通して、さらに容易に理解されるであろう。
【００８５】
実施例
実施例 １．カーネーションリパーゼ ｃＤＮＡ を単離するために用いた植物材料
温室で生育し維持されたカーネーション植物（ナデシコ科ナデシコ属改良白色シム）を、老化誘導リパーゼ遺伝子に対応するヌクレオチド配列を単離するために用いた。老化花弁（異なる生育段階からの）の形態にある花組織を、使用するまで緩衝液中に収集しておくかまたは−７０℃で保存した。
【００８６】
細胞質ゾル脂質粒子を、老化開始直前に採取したカーネーション花弁から単離した。カーネーション花弁（２５ｇ／１５０ｍｌ緩衝液）を、４℃で均質化緩衝液（５０ｍＭＥｐｐｓ− ０．２５ＭソルビトールｐＨ７．４、１０ｍｍＥＤＴＡ、２ｍＭＥＧＴＡ、１ｍＭＰＭＳＦ、１ｍＭベンズアマジン、１０ｍｍアミノ−ｎ−カプロン酸および４％ポリビニルポリピロリドン）中において４５秒間にわたりオムニマイザー（Ｏｍｎｉｍｉｚｅｒ）で、さらに１分間にわたりポリトロン（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ）ホモジナイザーで均質化した。４層のチーズクロスを通してホモジェネートを濾過し、濾液を４℃で２０分間にわたり１０，０００ｇで遠心分離した。
【００８７】
ミクロソーム膜を単離するために２５０，０００ｇで１時間にわたり上澄みを遠心分離した。Ｈｕｄａｋ ａｎｄ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，（１９９７），Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．，１１４：７０５〜７１３の方法により浮上分離遠心分離後の粒子を収集することによって、ミクロソーム後の上澄みから脂質粒子を得た。上澄みを蔗糖により１０％（ｗ／ｖ）とし、２３ｍｌの上澄みを６０Ｔｉベックマン遠心分離管中に注ぎ、１．５ｍｌ単離緩衝液でかぶせ、４℃で１２時間にわたり３０５，０００ｇで遠心分離した。パスツールピペットにより粒子を単離緩衝液重複層から除去した。
【００８８】
滅菌ＰＢＳ（１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．５プラス０．８５％塩化ナトリウム）と平衡させたセファローズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）Ｇ−２５カラム上に粒子懸濁液の３ｍｌを担持させ、懸濁液を滅菌ＰＢＳにより溶出させた。粒子を含有する空隙体積を溶出させ、セントリコン（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）−１０濾過器（アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）から市販されている）を用いてタンパク質濃度６００μｇに濃縮した。次に、３００μｇの粒子を接種したラビット中に抗体を産生するために脂質粒子を用いた。ウエスタンブロット分析により血液のＩｇＧ滴定量を検査した。
【００８９】
メッセンジャー ＲＮＡ （ ｍＲＮＡ ）単離
本質的にＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ ａｎｄ Ｓａｃｈｉ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６２：１５６〜１５９（１９８７）に記載されているように段階Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶのカーネーション花の花弁から全体ＲＮＡを単離した。簡単に、１５ｇの花弁組織を液体窒素中で凍結させ、４Ｍチオシアン酸グアニジニウム、２５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、０．５％サルコシル（ｓａｒｋｏｓｙｌ）および０．１Ｍ β−メルカプトエタノールを含有する緩衝液中で３０秒間にわたり均質化した。
【００９０】
１５０ｍｌ水飽和フェノール、３０ｍｌのクロロホルムおよび１５ｍｌの２ＭＮａＯＡｃ、ｐＨ４．０を均質化試料に添加した。試料を１０分間にわたり１０，０００ｇで遠心分離し、水相を除去し、そこから核酸を１５０ｍｌイソプロパノールにより沈殿させた。試料を５，０００ｇで１０分間にわたり遠心分離し、ペレットを３０ｍｌの４ＭＬｉＣｌで１回洗浄し、３０ｍｌのクロロホルムにより抽出し、０．２ＭＮａＯＡｃ、ｐＨ５．０を含有する３０ｍｌイソプロパノールにより沈殿させた。ＲＮＡをＤＥＰＣ処理水中に溶解し、−７０℃で保存した。
【００９１】
プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）から市販されているＰｏｌｙＡ＋区域ｍＲＮＡ単離システムを用いて全体ＲＮＡから、ＰｏｌｙＡ＋ｍＲＮＡを単離した。ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）（カリフオルニア州、ラ・ホーヤ）から市販されているＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）ｃＤＮＡ合成システムを使用するｃＤＮＡ合成のための鋳型としてＰｏｌｙＡ＋ｍＲＮＡを用いた。
【００９２】
カーネーション花弁の ｃＤＮＡ ライブラリー選別
段階ＩＶのカーネーション花弁から単離されたｍＲＮＡを用いて作製されたｃＤＮＡライブラリーを約５ｘ１０６ＰＦＵ／ｍｌに希釈し、脂質粒子抗血清により免疫選別した。ＥｘＡｓｓｉｓｔ（登録商標）ＨｅｌｐｅｒＰｈａｇｅ／ ＳＯＬＲ菌株システムを用いて陽性ｃＤＮＡクローンを回収し、ｐブルースクリプト（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）（登録商標）ファージミド（ストラタジーン）において再円形化した。また、段階ＩＩＩのカーネーション花弁のｃＤＮＡライブラリーを、３２Ｐ標識１９塩基対プローブ（５’− ＡＣＣＴＡＣＴＡＧ ＧＴＴＣＣＧ ＣＧＴＣ−３’）（配列番号：５）を用いて選別した。陽性ｃＤＮＡクローンをファージから切り取り、製造業者の指示書にある方法を用いてＰＢＫ−ＣＭＶ（登録商標）（ストラトジーン）ファージミド中に再円形化した。全長ｃ ＤＮＡ（１．５３ｋｂ断片）をＰＢＫ−ＣＭＶベクター中に挿入した。
【００９３】
シロイヌナズナ葉の ｃＤＮＡ ライブラリー選別
シロイヌナズナからの老化誘導リパーゼ遺伝子の全長ｃＤＮＡクローン（１３３８ｂｐ）を、シロイヌナズナ老化葉ｃＤＮＡライブラリーを選別することにより単離した。ライブラリーを選別するために用いられるプローブを、老化葉ライブラリーを鋳型として用いるＰＣＲにより得た。ＰＣＲプライマーをゲンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）に存在するゲノム配列（Ｕ９３２１５）から設計した。順方向プライマーは配列５’ ＡＴＧ ＴＣＴ ＡＧＡ ＧＡＡ ＧＡＴ ＡＴＴ ＧＣＧ ＣＧＧ ＣＧＡ ３’（配列番号：２０）を有し、逆方向プライマーは配列５’ ＧＡＴ ＧＡＧ ＣＴＣ ＧＡＣ ＧＧＡ ＧＣＴ ＧＡＧ ＡＧＡ ＧＡＴ Ｇ ３’（配列番号：２１）を有した。ＰＣＲ産物を配列決定のためにブルースクリプト中にサブクローン化した。用いられたＰＣＲ産物のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図１４に示す。
【００９４】
プラスミド ＤＮＡ 単離、 ＤＮＡ 配列決定
プラスミドＤＮＡを単離するために、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，（上述）により記載されているアルカリ溶解法を用いた。ジデオキシ塩基配列決定法を用いて全長陽性ｃＤＮＡクローンを配列決定した。Ｓａｎｇｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４：５４６３〜５４６７を参照すること。読取り枠を編集し、ＢＬＡＳＴ検索（メリーランド州、ベテスダのゲンバンク）を用いて分析し、コードされた遺伝子の誘導アミノ酸配列を持つ最も相同な５タンパク質の配置構造をＢＣＭサーチランチャー：多配列配置構造パターン誘導多配置法を用いて完成させた（Ｆ． Ｃｏｒｐｅｔ，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１６：１０８８１〜１０８９０，（１９８７）を参照すること）。
誘導アミノ酸配列中に存在する機能モチーフをマルチファインダー（ＭｕｌｔｉＦｉｎｄｅｒ）により識別した。
【００９５】
融合タンパク質としてのリパーゼの発現
全長カーネーション老化誘導リパーゼを含有するファージミドｐＢＫ−ＣＭＶを、ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ消化融合ベクター、ｐＭａｌｃ（ニュー・イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ））中にサブクローン化される１．５３Ｋｂリパーゼ断片を放出するＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩにより消化した。大腸菌ＢＬ−２１（ＤＥ３）細胞を形質転換するために、ｐＭＬｉｐと表される老化誘導リパーゼを含有するｐＭａｌｃベクターを用いた。
【００９６】
ｐＭＬｉｐによりコードされた融合タンパク質（老化誘導リパーゼとマルトース結合性タンパク質の融合）を、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．（上述）およびＡｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９８７），１６．４．１〜１６．４．３に記載されているように単離し、精製した。簡単に、ｐＭＬｉｐにより形質転換された大腸菌ＢＬ−２１細胞を、細胞グラム当り８μｌの５０ｍＭ ＰＭＳＦおよび８０μｌの２０ｍｇ／ｍｌリゾチームを含有する３ｍｇ／ｇ溶解物緩衝液（５０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、１００ｍＭＮａＣｌおよび１ｍＭＥＤＴＡ）中に再懸濁し、室温で２０分間にわたり振盪しながら培養した。
【００９７】
次に、８０μｌの５％デオキシコール酸および４０単位のＤＮＡｓｅ Ｉを添加し、細胞が完全に溶解するまで室温で細胞を振盪した。細胞破片を遠心分離によりペレット化し、２ボリュームの溶解物緩衝液プラス８Ｍ尿素および０．１ｍＭＰＭＳＦ中に再懸濁した。１時間後、懸濁液を中性化するために７ボリュームの緩衝液（５０ｍＭＫＨ２ＰＯ４、１ｍＭＥＤＴＡおよび５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．０）を添加した。細胞懸濁液のｐＨをＨＣｌによりｐＨ８．０に調節し、細胞破片をペレット化した。上澄みを、４℃で一夜にわたり、２０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ８．０、１００ｍＭＮａＣｌおよび１ｍＭＥＤＴＡに対して透析した。
【００９８】
マルトース結合性タンパク質−リパーゼ融合産物（Ｍａｌｉｐ）を、アミロースカラム（ニュー・イングランド・バイオラブズから市販されている）を用いて精製した。融合タンパク質を含有する部分をプロテアーゼ活性型第Ｘ因子（１μｇ／１００μｇ融合タンパク質）により分割して、融合タンパク質からリパーゼを分離した。融合タンパク質および分割リパーゼの両方を、ＳＤＳ ＰＡＧＥ電気泳動法およびウエスタンブロット法により分析した。ｐＭａｌｃによりコードされたマルトース結合性タンパク質を対照として用いた。結果を図３に示す。
【００９９】
カーネーション ＲＮＡ のノーザンブロットハイブリダイズ
段階Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶの花から単離された全体ＲＮＡの１０μｇを、１％変性ホルムアルデヒド・アガロース・ゲル上に分離し、ナイロン膜上に固定した。ランダムプライマーキット（ベーリンガー・マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ））を用いて３２Ｐ−ｄＣＰＴにより標識化された１．５３Ｋｂ ＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩリパーゼ断片を、濾材（７ｘ１０７ ｃｐｍ）をプローブするために用いた。濾材を室温で１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにより１回、６５℃で０．２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにより３回洗浄した。濾材を乾燥し、−７０℃で一夜にわたりＸ線フィルムにさらした。結果を図４に示す。
【０１００】
シロイヌナズナ ＲＮＡ のノーザンブロットハイブリダイズ
生育２、３、４、５および６週間でのシロイヌナズナ葉から単離された全体ＲＮＡの１０μｇを、１％変性ホルムアルデヒド・アガロース・ゲル上に分離し、ナイロン膜上に固定した。ランダムプライマーキット（ベーリンガー・マンハイム）を用いて３２Ｐ−ｄＣＰＴにより標識化された全長シロイヌナズナ老化誘導リパーゼ遺伝子を、濾材（７ｘ１０７ ｃｐｍ）をプローブするために用いた。濾材を室温で１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにより１回、６５℃で０．２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにより３回洗浄した。濾材を乾燥し、−７０℃で一夜にわたりＸ線フィルムにさらした。
【０１０１】
ゲノム ＤＮＡ 単離およびサザーンブロットハイブリダイズ
新しく切断されたカーネーション花弁を液体窒素中で冷凍し、粉末に砕き、ゲノムＤＮＡを単離するために抽出緩衝液（０．１Ｍトリス、ｐＨ８．２、５０ｍＭＥＤＴＡ、０．１ＭＮａＣｌ、２％ＳＤＳ、および０．１ｍｇ／ｍｌプロティナーゼＫ）により均質化した（２ｍｌ／ｇ）。均質化材料を３７℃で１０分間にわたり培養し、フェノール−クロロホルム−イソアミルアルコール（２５：２４：１）を用いて抽出した。ＤＮＡをＮａＯＡｃおよびイソプロパノールにより沈殿させた。ＤＮＡペレットを１ｘＴＥ、ｐＨ８．０中に溶解し、フェノールで再抽出し、再度沈殿させ、１ｘＴＥ、ｐＨ８．０中に再懸濁した。
【０１０２】
ゲノムＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼ（ＢａｍＨ１、ＸｂａＩ、ＸｈｏＩ、 ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｌ１）により別々に消化し、消化されたＤＮＡを１％アガロースゲル上で分別した。分離されたＤＮＡをナイロン膜上ににじませ、３２Ｐ−ｄＣＰＴ−標識化１．５３Ｋｂリパーゼ断片を用いてハイブリダイズを行った。ハイブリダイズおよび洗浄を、高緊縮条件（６８℃）（６ＸＳＳＣ、２Ｘデンハルト試薬、０．１％ＳＤＳ）および低緊縮条件（ハイブリダイズおよび洗浄、４２℃）（６ＸＳＳＣ、５Ｘデンハルト試薬、０．１％ＳＤＳ）下で行った。結果を図６に示す。見ることができるように、リパーゼｃＤＮＡプローブは、カーネーションリパーゼ遺伝子が単一の複製遺伝子であることを示すただ一つのゲノム断片を検出する。
【０１０３】
リパーゼ酵素アッセイ
精製リパーゼ融合タンパク質の脂質分解性アシル加水分解酵素を、パルミチン酸ｐ−ニトロフェニルおよび大豆リン脂質を外生基質として用いて分光光度法で検定した。対照として機能するマルトース結合性タンパク質単独に対して、基質としてのリン脂質とのリパーゼ反応性は全く検出されなかった（表２）。パルミチン酸ｐ−ニトロフェニルをマルトース結合性タンパク質単独と合わせて基質として用いる場合、少量のｐ−ニトロフェノール、リパーゼ反応の所期産物は、パルミチン酸ｐ−ニトロフェニルの商業用製剤におけるｐ−ニトロフェノールの検出可能な反射背景強度であった（表２）。しかし、精製リパーゼ融合タンパク質の存在下では、リン脂質からの遊離脂肪酸およびパルミチン酸ｐ−ニトロフェニルからのｐ−ニトロフェノールの放出として明示される強度のリパーゼ活性が明白であった（表２）。
【０１０４】
表２
大腸菌に発現しアミロースカラムクロマトグラフィーにより精製されたマルトース結合性タンパク質およびリパーゼ融合タンパク質の脂質分解性アシル加水分解酵素活性の分光光度測定。
２基質、パルミチン酸ｐ−ニトロフェニルおよび大豆リン脂質を用いた。
活性は形成された生成物（パルミチン酸ｐ−ニトロフェニルからのｐ−ニトロフェノールおよび大豆リン脂質からの遊離脂肪酸）の量で表される。
Ｎ＝３複製に対する平均値±ＳＥで示す。
【表２】
他の実験において、リパーゼ融合タンパク質の酵素活性をガスクロマトグラフィー、基質から放出された遊離脂肪酸の計量および識別を可能とする技術により検定した。トリリノレイン、大豆リン脂質およびジリノレイルホスファチジンコリンを基質として用い、脱エステル化脂肪酸を、ガスクロマトグラフィーにより分析される前に薄層クロマトグラフィーによって精製した。分光光度アッセイ（表２）に沿って、マルトース結合性タンパク質単独と大豆リン脂質またはジリノレイルホスファチジンコリンのいずれかと一緒の場合にリパーゼ活性は全く検出されず、これらの基質は本質的に脱エステル化脂肪酸がないことを示した（表３）。
【０１０６】
しかし、リパーゼ融合タンパク質を酵素源として用いる場合、パルミチン酸、ステアリン酸およびリノール酸が大豆リン脂質抽出物から脱エステル化され、リノール酸はジリノレイルホスファチジンコリンから脱エステル化された（表３）。リン脂質基質に比べて、遊離リノール酸の検出可能レベルはトリリノレインにおいて存在するが、しかし、遊離リノール酸のレベルはリパーゼ融合タンパク質の存在下で有意に増大し、リパーゼがまたトリアシルグリセロールから脂肪酸を脱エステル化することができることを示した（表３）。
【０１０７】
表３
大腸菌に発現しアミロースカラムクロマトグラフィーにより精製されたマルトース結合性タンパク質およびリパーゼ融合タンパク質の脂質分解性アシル加水分解酵素活性のＧＣ測定。
【表３】
大腸菌におけるリパーゼｃＤＮＡの発現により得られるタンパク質のリパーゼ活性を、Ｔｓｕｂｏｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６４：２９３６〜２９４０ （１９９６）；Ｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ．， ９：７４１〜７４６（１９９５）；およびＧ． Ｓｉｅｒｒａ，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ａｎｄ Ｓｅｒｏｌ．，２３：１５〜２２（１９５７）に記載されているように生体内で測定した。ｐＭａｌにより形質転換された大腸菌 ＢＬ−２１細胞の単一コロニーおよびｐＭＬｉｐにより形質転換された別の大腸菌ＢＬ−２１コロニーを、以下（ｇ／Ｌ）： Ｋ２ＨＰＯ４（４．３）、ＫＨ２ＰＯ４（３．４）、（ＮＨ４）ＳＯ４（２．０）、ＭｇＣｌ２（０．１６）、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ（０．００１）、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（０．０００６）、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（０．０２６）、およびＮａＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ（０．００２）を含有する基礎塩培地（ｐＨ７．０）中に接種した。
【０１０９】
基質、ツイーン４０（モノパルミチン酸ポリオキシエチレンソルビタン）またはツイーン６０（モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン）を、濃度１％で添加した。振盪を伴う３７℃での細菌細胞の増殖を、６００ｎｍでの吸収値を測定することにより監視した（図５）。図５において見ることができるように、ｐＭＬｉｐにより形質転換された大腸菌細胞は、初期誘導期間後、ツイーン４０／ツイーン６０−補完基礎培地中で増殖することができた。しかし、ｐＭａｌにより形質転換された大腸菌細胞はツイーン補完培地中で増殖しなかった。
【０１１０】
実施例 ２．カーネーション老化誘導リパーゼ遺伝子のエチレン誘発
段階ＩＩカーネーション花およびカーネーション切り枝を、１５時間にわたり密閉室の中で０．５ｐｐｍエチレンにより処理した。エチレン処理段階ＩＩ花弁から、および処理された切り枝の葉から、ならびに以下に記載されるような非処理カーネーション花および切り枝の花および葉から、ＲＮＡを抽出した。
シロイヌナズナを１、２または３日間にわたり密閉室の中で５０μＭエテフォンにより処理した。ＲＮＡを以下のように植物のエテフォン処理葉から抽出した。
【０１１１】
花および葉（花１または葉５ｇ）を液体窒素中で砕いた。粉砕された粉末を、３０ｍｌのグアニジニウム緩衝液（４Ｍイソチオシアン酸グアニジニウム、２．５ｍＭＮａＯＡｃ ｐＨ８．５、０．８％β−メルカプトエタノール）と混合した。混合物を４層のチーズクロスを通して濾過し、４℃で３０分間にわたり１０，０００ｇで遠心分離した。次に、上澄みを２６，０００ｇで２０時間にわたり塩化セシウム濃度勾配遠心分離にかけた。ペレット化ＲＮＡを７５％エタノールですすぎ洗いをし、６００μｌＤＥＰＣ−処理水中に再懸濁し、そのＲＮＡを−７０℃で０．７５ｍｌの９５％エタノールおよび３０μｌの３ＭＮａＯＡｃにより沈殿させた。
【０１１２】
カーネーションまたはシロイヌナズナいずれかの１０μｇを１．２％変性ホルムアルデヒド・アガロース・ゲル上に分別し、ナイロン膜に移した。無作為に準備した３２Ｐ−ｄＣＰＴ−標識化全長カーネーションリパーゼｃＤＮＡ（配列番号：１）を、４２℃で一夜にわたりカーネーションＲＮＡを含有する膜をプローブするために用いた。無作為に準備した３２Ｐ−ｄＣＰＴ−標識化全長シロイヌナズナリパーゼｃＤＮＡを、４２℃で一夜にわたりシロイヌナズナＲＮＡを含有する膜をプローブするために用いた。次に、膜を室温で１５分間にわたり０．１％ＳＤＳを含有する１ＸＳＳＣ中で１回、それぞれ６５℃で１５分間にわたり０．１％ＳＤＳを含有する０．２ＸＳＳＣ中で３回洗浄した。膜を−７０℃で一夜にわたりＸ線フィルムにさらした。
【０１１３】
結果を図９（カーネーション）および図１６（シロイヌナズナ；レーン１、１日処理；レーン２、２日処理；レーン３、３日処理）に示す。見ることができるように、カーネーションリパーゼおよびシロイヌナズナリパーゼの転写がエチレンにより花および／または葉において誘発される。
【０１１４】
実施例 ３．カーネーションリパーゼプライマーを用いるトマト ＰＣＲ 産物の生成
トマト葉から得られるトマトゲノムＤＮＡからの部分長老化誘導リパーゼ配列を、カーネーション老化誘導リパーゼ配列から設計された一対のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてネスト状のＰＣＲにより生成した。５’プライマーは配列５’−ＣＴＣＴＡＧＡＣＴＡＴＧＡ ＧＴＧＧＧＴ（配列番号：７）を有する１９−ｍｅｒであり；３’プライマーは配列ＣＧＡＣＴＧＧＣＡＣＡＡＣＣＴＣＣＡ−３’（配列番号：８）を有する１８−ｍｅｒである。ゲノムトマトＤＮＡを用いるポリメラーゼ連鎖反応を以下のように行った：
【０１１５】
反応成分：
ゲノムＤＮＡ １００ ｎｇ
ｄＮＴＰ（それぞれ１０ｍＭ） １ μｌ
ＭｇＣｌ２（５ｍＭ）＋１０ｘ緩衝液 ５ μｌ
プライマー１および２（それぞれ２０μＭ） ０．５ μｌ
Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ １．２５ Ｕ
反応体積 ５０ μｌ
反応変数：
９４℃ ３分間
９４℃／１分、４８℃／１分、７２℃／２分、 ４５サイクルに対して
７２℃ １５分間
【０１１６】
ＰＣＲにより得られたトマト部分長配列は、ヌクレオチド配列、配列番号：６（図１０）および図１０に示されるような推論アミノ酸配列を有する。部分長配列は、２コード配列間に散らばったイントロン（図１０、下側の文字）を含有する。トマト配列は保存リパーゼの共通配列、ＩＴＦＴＧＨＳＬＧＡ（配列番号：３）を含有する。
【０１１７】
トマト配列は、カーネーション老化誘導リパーゼ配列との５３．４％配列同一性およびシロイヌナズナリパーゼとの４３．５％配列同一性を有し、この内後者はカーネーション配列との４４．３％配列同一性を有する。
【０１１８】
実施例 ４．トマト植物における細胞膜の完全性への冷却の影響
トマト植物を７℃〜８℃で４８時間にわたり冷却した。葉への冷却の影響を電解質洩れの量（μＭｈｏｓ）を測定することにより評価した。
特に、１ｇの葉組織を切って５０ｍｌ管に入れ、蒸留水により急速リンスを行い、４０ｍｌの脱イオン水を添加した。管に蓋をし、室温で２４時間にわたり回転させた。電解質漏れを反映させる伝導度（μＭｈｏ）読取り値を、対照および冷却損傷葉組織に対して６および２４時間間隔で取り込んだ。膜損傷を反映させる電解質漏れが冷却損傷葉組織における再加温期間の間に起こることは図１１から明白である。
【０１１９】
冷却トマト葉から得られた ＲＮＡ のノーザンブロット分析
非冷却トマト植物（対照）および０、６および２４時間にわたり室温に戻した冷却トマト植物の葉１５ｇから全体ＲＮＡを単離した。ＲＮＡ抽出を実施例３において記載するように実施した。各試料からの１０μｇのＲＮＡを、１．２％変性ホルムアルデヒド・ゲル上に分別し、ナイロン膜に移した。膜を３２Ｐ−ｄＣＰＴ標識化プローブ（配列番号：３）により探知し、次に、実施例３に記載したものと同じ条件下で洗浄した。結果を図１２に示す。
【０１２０】
オートラジオグラフ（図１２Ｂ）から見ることができるように、トマトリパーゼ遺伝子発現は冷却により誘発され、遺伝子誘発のパターンは冷却損傷葉における電解質漏れの増加に相関する（図１１）。
【０１２１】
実施例 ５．アンチセンス方向に老化誘導リパーゼ遺伝子を発現する遺伝子導入植物の生成
二重３５Ｓプロモーターの調節下アンチセンス方向に発現した全長シロイヌナズナ老化誘導リパーゼ遺伝子バイナリーベクター、ｐＫＹＬＸ７１により、アグロバクテリアを形質転換した。シロイヌナズナ植物をこれらのアグロバクテリアにより真空濾過を用いて形質転換し、得られるＴ０植物から形質転換された種子をアンピシリンで選択した。
【０１２２】
Ｔ１植物を温室条件下で野生型シロイヌナズナ植物と並べて育成した。遺伝子導入および野生型植物間の、葉のサイズ、全体の植物サイズ、種子収量および葉の老化における差異を長期にわたり観察した。差異は図１７、１８、１９、および２０に示される。
【０１２３】
実施例 ６．遺伝子導入植物における老化誘導リパーゼ減少生成物
４週齢シロイヌナズナ野生型、および実施例５におけるように作製された対応遺伝子導入植物の葉から単離された全体タンパク質をナイロン膜に移し、シロイヌナズナ老化誘導リパーゼタンパク質に対して引き起こされた抗体によりプローブした。ウエスタンブロットを図２１に示す（レーン１および２は９μｇのタンパク質を担持し、レーン３および４は１８μｇのタンパク質を担持した）。老化誘導リパーゼの発現は遺伝子植物において減少した。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、カーネーション花ｃＤＮＡライブラリーから得られた老化誘導リパーゼｃＤＮＡクローンによりコードされる誘導アミノ酸配列（配列番号：２）を示す。アミノ酸配列内の共通モチーフは以下の通りである：単一下線、アミド化部位；点線下線、タンパク質キナーゼＣリン酸化部位；二重下線、Ｎ−ミリストイル化部位；箱型、ｃＡＭＰリン酸化部位；影箱型、カゼインキナーゼＩＩリン酸化部位；交差斜線箱型、リパーゼ系の共通配列；および点線箱型、Ｎ−グリコシル化部位。
【図２】
図２は、リパーゼ様タンパク質の部分配列と一直線上になる誘導全長カーネーション花弁老化誘導リパーゼアミノ酸配列（配列番号：２）を示す：カーリップ（ｃａｒｌｉｐ）、カーネーション花弁老化誘導リパーゼの全長配列（配列番号：１１）；アーリップ（ａｒｌｉｐ）、シロイヌナズナ（Ｇｅｎ Ｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＬ０２１７１０）からのリパーゼ様タンパク質の部分配列（配列番号：１２）；イポリップ（ｉｐｏｌｉｐ）、イポメア（Ｇｅｎ Ｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｕ５５８６７）からのリパーゼ様配列の部分配列（配列番号：１３）；アーリピ（ａｒｌｉｐｉ）、シロイヌナズナ（Ｇｅｎ Ｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｕ９３２１５）からのリパーゼ様タンパク質の部分配列（配列番号：１４）。３または４配列間の同一アミノ酸は箱型に示す。
【図３】
図３は、大腸菌中に発現するカーネーションリパーゼｃＤＮＡから得られた融合タンパク質発現産物のウエスタンブロット分析を示す。ウエスタンブロットは老化誘導リパーゼタンパク質に対する抗体によりプローブされた：レーン１、マルトース結合タンパク質；レーン２、タンパク質分解（活性型第Ｘ因子）開裂部位を通してマルトース結合タンパク質ｃＤＮＡに融合したカーネーションリパーゼからなる融合タンパク質；レーン３、活性型第Ｘ因子により、遊離型リパーゼタンパク質（５０．２ｋＤａ）および遊離型マルトース結合タンパク質中に部分的に開裂した融合タンパク質。
【図４】
図４は、異なる生育段階のカーネーション花弁から単離されたＲＮＡのノーザンブロット分析である。図４Ａは全ＲＮＡの臭化エチジウム染色ゲルである。各レーンは１０μｇ ＲＮＡを含有した。図４Ｂは３２Ｐ−ｄＣＴＰ標識全長カーネーション老化誘導リパーゼｃＤＮＡによりプローブされたノーザンブロットのオートラジオグラフである。
【図５】
図５は、脂質分解性アシル加水分解酵素、すなわち、大腸菌中でのカーネーション老化誘導リパーゼｃＤＮＡの過剰発現により得られるタンパク質産物のリパーゼ活性の原位置での実証値である。Ｍａｌ、基礎塩培地中でマルトース結合タンパク質単独を含有する大腸菌細胞；ｍＬｉｐ、基礎塩培地中でマルトース結合タンパク質と融合したカーネーション老化誘導リパーゼからなる融合タンパク質を含有する大腸菌細胞；４０ｍａｌ／４０ｍＬｉｐ、ツイーン４０により補完された基礎塩培地中でマルトース結合タンパク質単独［ｍａｌ］か、またはリパーゼ−マルトース結合タンパク質融合産物［ｍＬｉｐ］を含有する大腸菌細胞；６０ｍａｌ／６０ｍＬｉｐ、ツイーン６０により補完された基礎塩培地中でマルトース結合タンパク質単独［ｍａｌ］か、またはリパーゼ−マルトース結合タンパク質融合産物［ｍＬｉｐ］を含有する大腸菌細胞。
【図６Ａ】
図６Ａは、カーネーション老化誘導リパーゼの読取り枠の制限酵素マップを示す。数字は読取り枠中のヌクレオチド数を指す。
【図６Ｂ】
図６Ｂは、種々の制限酵素により消化され、カーネーション老化誘導リパーゼｃＤＮＡによりプローブされたカーネーションゲノムＤＮＡのサザーンブロット分析である。
【図７】
図７は、カーネーション老化誘導リパーゼｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列（配列番号：１）である。実線下線、老化誘導リパーゼｃＤＮＡの非コード配列；下線のない配列部分は読取り枠である。
【図８】
図８は、カーネーション老化誘導リパーゼｃＤＮＡのアミノ酸配列（配列番号：２）である。
【図９】
図９Ａは１５時間にわたり０．５ｐｐｍエチレンに暴露された段階ＩＩの花弁におけるカーネーションリパーゼの発現を示すノーザンブロットである。図９Ａはそれぞれのレーンが一定量のカーネーションＲＮＡを担持していることを示す臭化エチジウム染色ゲルである（花弁：レーン１および２；葉：レーン３および４；＋、エチレン処理；−、非処理）。図９Ｂは標識化全長カーネーション花弁老化誘導リパーゼｃＤＮＡによりプローブされた図９Ａにおけるゲルのノーザンブロットのオートラジオグラムである。
【図１０】
図１０は、トマトの葉のゲノム老化誘導リパーゼの部分ヌクレオチド配列（配列番号：６）および対応する推論アミノ酸配列（配列番号：１７）である。保存されたリパーゼ共通モチーフは影を付けられている；ゲノム断片を生成するために用いられるプライマーの配列はそれぞれ下線が記されている。
【図１１】
図１１は、膜漏れへの冷却効果を示す棒グラフである。トマト植物を８℃で４８時間にわたり冷却した。冷却しなかった対照植物、ならびに６および２４時間にわたって冷却した植物に対して、リーフディスクからの拡散気体漏れ（μＭｈｏｓ）を測定した。
【図１２】
図１２は、８℃で４８時間にわたり冷却し、２４時間にわたり再度室温に暖めた植物から単離したトマトの葉ＲＮＡのノーザンブロット分析である。図１２Ｂは３２Ｐ−ｄＣＴＰ標識全長カーネーション老化誘導リパーゼｃＤＮＡによりプローブされたノーザンブロットのオートラジオグラフである。
【図１３】
図１３は、６４アミノ酸領域にわたってカーネーション老化誘導リパーゼと５５．５％同一であるシロイヌナズナＥＳＴ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ＃：Ｎ３８２２７）の部分ヌクレオチド配列（配列番号：１５）および対応推論アミノ酸配列（配列番号：１６）である。保存されたリパーゼ共通モチーフは影を付けられている。
【図１４】
図１４は、全長シロイヌナズナ老化誘導リパーゼ遺伝子のヌクレオチド配列（上側）（配列番号：１８）および誘導アミノ酸配列（下側）（配列番号：１９）である。
【図１５】
図１５は、３２Ｐ−ｄＣＴＰ標識全長シロイヌナズナ老化誘導リパーゼによりプローブされた種々の段階（レーン１、２週齢植物；レーン２、３週齢植物；レーン３、４週齢植物；レーン４、５週齢植物；レーン５、６週齢植物）でのシロイヌナズナ植物の葉から単離した全ＲＮＡのノーザンブロットである。オートラジオグラフは上側（１５Ａ）であり、臭化エチジウム染色ゲルは下側（１５Ｂ）である。
【図１６】
図１６は、５０μＭエテフォン（エチレン源）で処理した３週齢シロイヌナズナ植物の葉から単離し、３２Ｐ−ｄＣＴＰ標識全長シロイヌナズナ老化誘導リパーゼによりプローブされた全ＲＮＡのノーザンブロットである。オートラジオグラフは上側（１６Ａ）であり、臭化エチジウム染色ゲルは下側（１６Ｂ）である。
【図１７】
図１７は、４．６週齢シロイヌナズナ野生型植物（左側）および全長シロイヌナズナ老化誘導リパーゼ遺伝子をアンチセンス方向に発現する遺伝子導入植物（右側）の写真であり、遺伝子導入植物において増大した葉のサイズが見られる。
【図１８】
図１８は、６．３週齢シロイヌナズナ野生型植物（左側）および全長シロイヌナズナ老化誘導リパーゼ遺伝子をアンチセンス方向に発現する遺伝子導入植物（右側）の写真であり、遺伝子導入植物において増大した葉のサイズおよび遅延した葉の老化が見られる。
【図１９】
図１９は、７週齢シロイヌナズナ野生型植物（左側）および全長シロイヌナズナ老化誘導リパーゼ遺伝子をアンチセンス方向に発現する遺伝子導入植物（右側）の写真であり、遺伝子植物において増大した葉のサイズが見られる。
【図２０】
図２０は、老化誘導リパーゼ遺伝子をアンチセンス方向に発現する３種のＴ１遺伝子導入シロイヌナズナ植物株において種子収穫高の増大が見られるグラフである。Ｎ＝３０に対するＳＥは野生型植物に見られる。
【図２１】
図２１は、４週齢シロイヌナズナ野生型植物、および全長老化誘導リパーゼ遺伝子をアンチセンス方向に発現する対応遺伝子導入植物の葉から単離した全タンパク質のウエスタンブロットである。（レーン１および２は９μｇのタンパク質を担持し、レーン３および４は１８μｇのタンパク質を担持した）。ブロットはシロイヌナズナ老化誘導リパーゼタンパク質に対して引き起こされる抗体によりプローブされた。老化誘導リパーゼの発現はすべての遺伝子導入植物において減少する。
Claims (53)
- 低緊縮条件下で配列番号：１、配列番号：１８または両方とハイブリダイズする老化誘導リパーゼをコードする単離されたＤＮＡ分子、あるいは配列番号：１、配列番号：１８または両方とハイブリダイズする単離されたＤＮＡ分子の機能誘導体。
- 配列番号：１のヌクレオチド配列を有する請求項１に記載の単離されたＤＮＡ分子。
- 配列番号：４のヌクレオチド配列を含有する請求項１に記載の単離されたＤＮＡ分子。
- 配列番号：１８のヌクレオチド配列を有する請求項１に記載の単離されたＤＮＡ分子。
- 低緊縮条件下で配列番号：１、配列番号： １８または両方とハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされる単離された老化誘導リパーゼ、または老化誘導リパーゼの機能誘導体。
- 配列番号：２または配列番号：１９のアミノ酸配列を有する請求項５に記載の老化誘導リパーゼ。
- （ａ）（１）低緊縮条件下で配列番号：１、配列番号：１８または両方とハイブリダイズする、老化誘導リパーゼをコードするＤＮＡ分子の一つの鎖の対応部分、または（２）老化誘導リパーゼをコードするＤＮＡ分子によりコードされるＲＮＡ配列の対応部分に対して実質的に相補的なアンチセンス・ヌクレオチド配列；および
（ｂ）アンチセンス・ヌクレオチド配列が、形質転換された植物細胞中で発現されるように、アンチセンス・ヌクレオチド配列に作用可能に連結された制御配列、
を含む植物細胞の形質転換のためのベクター。 - 前記制御配列がプロモーターおよび転写終結領域を含む請求項７に記載のベクター。
- 前記制御配列が構成的プロモーターを含む請求項７に記載のベクター。
- 前記制御配列が植物組織特定プロモーターを含む請求項７に記載のベクター。
- 前記制御配列が老化誘導植物プロモーターを含む請求項７に記載のベクター。
- 前記制御配列がウイルスプロモーターを含む請求項７に記載のベクター。
- 前記制御配列が構成的プロモーターを含む請求項７に記載のベクター。
- 低緊縮条件下で配列番号：１、配列番号：１８または両方とハイブリダイズする植物老化誘導リパーゼ遺伝子のＲＮＡ転写体の対応部分に実質的に相補的である、ＲＮＡ分子をコードするアンチセンス・オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド。
- オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが約６〜約１００ヌクレオチドを含む請求項１４に記載のアンチセンス・オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド。
- 前記植物遺伝子のコード領域がヌクレオチド配列番号：１を有する請求項１４に記載のアンチセンス・オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド。
- 前記植物遺伝子のコード領域がヌクレオチド配列番号：１８を有する請求項１４に記載のアンチセンス・オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド。
- 前記植物遺伝子がカーネーション遺伝子である請求項１４に記載のアンチセンス・オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド。
- 前記植物遺伝子がシロイヌナズナ遺伝子である請求項１４に記載のアンチセンス・オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド。
- 前記植物遺伝子がトマト遺伝子である請求項１４に記載のアンチセンス・オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド。
- 前記植物遺伝子がグリーン・ビーンズ遺伝子である請求項１４に記載のアンチセンス・オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド。
- アンチセンス・オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドがＲＮＡ転写体の５’−非コード領域の対応部分に実質的に相補的である、請求項１４に記載のアンチセンス・オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド。
- （ａ）低緊縮条件下で配列番号：１、配列番号：１８または両方とハイブリダイズする、老化誘導リパーゼをコードするＤＮＡ分子；および
（ｂ）ＤＮＡ分子が、形質転換される植物細胞中に発現されるように、ＤＮＡ分子に作用可能に連結された制御配列、
を含むベクター。 - 請求項２３に記載のベクターにより形質転換された細菌細胞。
- 請求項７に記載のベクターにより形質転換された植物細胞。
- 請求項７に記載のベクターにより形質転換された植物細胞から生成される植物およびその子孫。
- 請求項２６に記載の植物、植物部分または植物子孫。
- 植物における内生老化誘導リパーゼの発現を抑制するための方法であって、
（１）（Ａ）（ｉ）配列番号：１、配列番号：１８または両方とハイブリダイズする、内生老化誘導リパーゼをコードするＤＮＡ分子の一つの鎖の対応部分、または（ｉｉ）内生老化誘導リパーゼ遺伝子によりコードされるＲＮＡ配列の対応部分に対して実質的に相補的なアンチセンス・ヌクレオチド配列；および
（Ｂ）アンチセンス・ヌクレオチド配列が発現されるように、アンチセンス・ヌクレオチド配列に作用可能に連結された制御配列、
を含むベクターを植物のゲノム中に組み込むこと、および
（２）前記植物を成長させ、それによって前記アンチセンス・ヌクレオチド配列が転写され、前記ＲＮＡ配列に結合し、それによって前記老化誘導リパーゼ遺伝子の発現が抑制されること、
を含む方法。 - アンチセンス・オリゴ−またはポリヌクレオチドがそれに対して実質的に相補的である、ＤＮＡの対応部分またはＲＮＡの対応部分が５’−非コード配列を含む請求項２８に記載の方法。
- 前記抑制が植物の変更された老化をもたらす請求項２８に記載の方法。
- 前記抑制が前記植物の環境ストレス誘導老化に対して増大した耐性をもたらす請求項２８に記載の方法。
- 前記抑制が前記植物の増強された生物体量をもたらす請求項２８に記載の方法。
- 前記抑制が前記植物における増大した種子収量をもたらす請求項２８に記載の方法。
- 制御配列が植物において活性な構成的プロモーターを含む請求項２８に記載の方法。
- 制御配列が二重３５Ｓプロモーターを含む請求項２８に記載の方法。
- 制御配列が植物において活性な組織特定プロモーターを含む請求項２８に記載の方法。
- 制御配列が植物において活性な老化誘導プロモーターを含む請求項２８に記載の方法。
- 前記植物が果実保持植物、花の咲く植物、野菜、農作物植物および森林種からなる群から選択される請求項２８に記載の方法。
- 前記植物がトマトである請求項２８に記載の方法。
- 前記植物がカーネーションである請求項２８に記載の方法。
- 植物細胞における１又は複数の内生老化誘導リパーゼ遺伝子の発現を抑制するための方法であって、
（１）（Ａ）低緊縮条件下で配列番号：１、配列番号：１８または両方とハイブリダイズする、内生老化誘導リパーゼをコードする単離されたＤＮＡ分子、または配列番号：１、配列番号：１８または両方とハイブリダイズする単離されたＤＮＡ分子機能誘導体；および
（Ｂ）それによってコードされた外生老化誘導リパーゼが発現されるように、ＤＮＡ分子に作用可能に連結された制御配列、
を含むベクターを植物の少なくとも一つの細胞ゲノム中に組み込むこと；および
（２）前記植物を成長させ、それによって前記ＤＮＡ分子が過剰発現されると共に、内生老化誘導リパーゼ遺伝子または複数の遺伝子が外生老化誘導リパーゼにより抑制されること、
を含む方法。 - 前記制御配列が構成的プロモーターを含む請求項４１に記載の方法。
- 植物における年齢関連老化および環境ストレス関連老化を変更するための方法であって、
（１）（Ａ）（ｉ）配列番号：１、配列番号：１８または両方とハイブリダイズする、内生老化誘導リパーゼをコードするＤＮＡ分子の一つの鎖の対応部分、または（ｉｉ）内生老化誘導リパーゼ遺伝子によりコードされるＲＮＡ配列の少なくとも一部に対して実質的に相補的なアンチセンス・ヌクレオチド配列；および
（Ｂ）アンチセンス・ヌクレオチド配列が発現されるように、アンチセンス・ヌクレオチド配列に作用可能に連結された制御配列、
を含むベクターを植物のゲノム中に組み込むこと、および
（２）前記植物を成長させ、それによって前記アンチセンス・ヌクレオチド配列が転写され、前記ＲＮＡ配列に結合し、それによって前記老化誘導リパーゼ遺伝子の発現が抑制されること、
を含む方法。 - 請求項７に記載のベクターを含む遺伝子導入植物細胞。
- 請求項２３に記載のベクターを含む遺伝子導入植物細胞。
- 原核宿主および請求項１４に記載のアンチセンス・オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドにおいて機能的な複製システムを含むプラスミド。
- アグロバクテリウムおよび請求項１４に記載のアンチセンス・オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドにおいて機能的な複製システムを含むプラスミド。
- 請求項７に記載のベクターを含む、老化誘導リパーゼの抑制されたまたは減少した発現を有する細胞から誘導される植物およびその子孫。
- 老化誘導リパーゼの抑制されたまたは減少した発現を有する細胞から誘導される植物およびその子孫であって、該細胞は、
（１）（Ａ）（ｉ）配列番号：１、配列番号：１８または両方とハイブリダイズする、内生老化誘導リパーゼをコードするＤＮＡ分子の一つの鎖の対応部分、または（ｉｉ）内生老化誘導リパーゼ遺伝子によりコードされるＲＮＡ配列の対応部分に対して実質的に相補的なアンチセンス・ヌクレオチド配列；および
（Ｂ）アンチセンス・ヌクレオチド配列が発現されるように、アンチセンス・ヌクレオチド配列に作用可能に連結された制御配列、
を含むベクターを細胞のゲノム中に組み込むこと、および
（２）前記植物を成長させ、それによって前記アンチセンス・ヌクレオチド配列が転写され、前記ＲＮＡ配列に結合し、それによって前記老化誘導リパーゼ遺伝子の発現が抑制されること、
を含む、ことを特徴とする植物およびその子孫。 - 前記植物がトマトである請求項４９に記載の植物および子孫。
- 前記植物がカーネーションである請求項４９に記載の植物および子孫。
- 種子老化を抑制する方法であって、
（１）（Ａ）（ｉ）配列番号：１、配列番号：１８または両方とハイブリダイズする、内生老化誘導リパーゼをコードするＤＮＡ分子の一つの鎖の対応部分、または（ｉｉ）内生老化誘導リパーゼをコードするＤＮＡ分子から転写されたＲＮＡ配列の対応部分に対して実質的に相補的なアンチセンス・ヌクレオチド配列；および
（Ｂ）アンチセンス・ヌクレオチド配列に作用可能に連結された制御配列、を含むベクターを植物のゲノム中に組み込むこと、および
（２）前記植物を成長させ、それによって前記アンチセンス・ヌクレオチド配列が転写され、前記ＲＮＡ配列に結合し、前記老化誘導リパーゼ遺伝子の発現が抑制されること、
を含む方法。 - 植物からの種子収量を増大させる方法であって、
（１）（Ａ）（ｉ）配列番号：１、配列番号：１８または両方とハイブリダイズする、内生老化誘導リパーゼをコードするＤＮＡ分子の一つの鎖の対応部分、または（ｉｉ）内生老化誘導リパーゼをコードするＤＮＡ分子から転写されたＲＮＡ配列の対応部分に対して実質的に相補的なアンチセンス・ヌクレオチド配列；および
（Ｂ）アンチセンス・ヌクレオチド配列に作用可能に連結された制御配列、を含むベクターを植物のゲノム中に組み込むこと、および
（２）前記植物を成長させ、それによって前記アンチセンス・ヌクレオチド配列が転写され、前記ＲＮＡ配列に結合し、前記老化誘導リパーゼ遺伝子の発現が抑制されること、
を含む方法。
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