JP2004354397A - 蛍光光度計 - Google Patents

Abstract

【課題】試料の光学的特性を測定する蛍光光度計を提供する。
【解決手段】蛍光光度計は、光源からの励起光を試料へ方向付ける手段と、試料からの放射光を検出器へ方向付ける手段と、試料までの距離の変化によって発生する、放射光における誤差を除去する誤差除去手段(２８,３１)とを有している。
【選択図】図２ａ

Description

技術の分野
本発明は、計測器技術に関し、研究室で使用される蛍光光度計に関するが、この蛍光光度計は、例えば、臨床科学や食品生産技術での分析評価で使用される。本発明は、詳細には、同時に複数の試料を有する蛍光光度計への適用に適している。

背 景
蛍光分析では、短い波長の励起光が試料に導かれ、分析される物質がより長い波長の光を放射するようにする。放射光の量が測定され、それによって分析される物質の量が検出される。一般に、蛍光光度計は１つの測定チャネルを有し、分析は多数のくぼみを有するプレートの上で行われる。この場合、プレートは、各くぼみが順番に測定位置に達するような方法で、測定チャネルに対して移動する。

分析される試料の外側に入射する励起光によって引き起こされる背景蛍光が蛍光光度計にまつわる１つの問題を構成する。これは不透明な遮蔽物によって低減できる。しかし、実際にはこの方法で十分な光密性を得ることは困難である。

容器を通じた蛍光測定は、この場合、多量の励起光も容器を通過し、放射光の測定を複雑にするので特に推奨できるものではない。容器の材料によって発生しうる背景蛍光は別の問題を構成する。現在日常的な分析のために使用されている蛍光光度計の大部分では、励起光は上から容器に導かれ、放射光も上から収集される。それにも拘わらず、分析によっては、試料を保持する容器の底を通じて測定を実行することが最良である。

欧州公開公報第１０８５２４号から上からの蛍光測定が知られる。そこでは励起光は開口によって境界画定され、光の発散ビームがレンズによって収束され、光の収束ビームはフィルタとミラーを経由してスポットとして試料保持容器に導かれる。放射光はそれぞれ容器から、別のミラー、フィルタ、収束レンズおよび境界画定開口を経由して検出器に導かれる。

欧州公開公報第６４０８２８号から上からの蛍光測定が知られるが、ここでは励起光は二色性ミラーを通じて複数の試料に同時に導かれ、試料保持容器からの放射光は同じミラーを経由してカメラに反射される。

発明の概要
請求項１に記載の蛍光光度計がここに発明された。本発明の好適実施形態は他の請求項に示される。

本発明によれば、本蛍光光度計は分析される対象までの距離の変化によって発生する誤差を除去するための手段を有する。本装置は放射光を平行にするためのレンズシステムと、散乱光線を光のビームの外に境界画定する境界画定器とを含む。

本蛍光光度計は部分透過性ミラーを有し得る。この場合、励起チャネルの軸と放射チャネルの軸はミラーと試料の間で一致し、試料保持容器の開口全体の立体角が利用される。従って、容器内の最大限に均一な測定感度分布とともに、高い感度が達成される。測定は上からも下からも行うことができる。

本発明によるシステムを実現するために特に大きなレンズまたはフィルタは必要とされない。

部分反射性ミラーは二色性誘電性フィルムを有することがある。しかし、このフィルムは一般にきわめて狭い波長の範囲内（例えば、４００〜６００ｎｍ）でのみ動作し、ほとんどすべての蛍光分析で十分ではない。ミラーは、例えば２６０〜８００ｎｍの範囲で動作すべきである。光帯域誘電性ミラーは、ガラスの表面に、部分光透過性の薄いフィルムを蒸着することによって製造できる。しかし、こうしたフィルムは多くの損失を生じる。好適に、完全に反射性の領域と完全に透明な領域からなるミラーが使用される。こうしたミラーは、例えば、アルミニウムを適当なガラスの表面に蒸着することによって容易に製造される。ミラーを使用することによってきわめて広い波長範囲が達成され、反射能力または透明度は波長にあまり依存しない。また、二色性フィルムで発生するような極性はこのミラーでは発生しない。さらに、反射性領域の形状が、例えば、反射または屈折の影響を除去するために、光学上利用される。

ミラーから反射されるかまたはミラーを通過する励起光は、基準光として使用され、光源の変化による誤差を除去する。励起光フィルタが使用されることがあるが、その場合、好適に、ミラーの前の位置に配置される。

本発明の１つの独立した特性によれば、本蛍光光度計は励起チャネルにレンズ装置を有しており、それによって励起光線の単向性ビームが形成される。本装置は好適に収束レンズをも有しており、それによって単向性光ビームから励起光の境界画定スポットが分析される対象の上に形成される。従って、所望されている測定領域の外側で発生する蛍光発光は減少する。

本発明の第２の独立した特性によれば、本蛍光光度計は放射チャネルにレンズ装置を有し、それによって放射光から光の単向性ビームが形成される。本装置は好適にまた、放射光を境界画定領域からのみ放射チャネルに導くための手段を有する。従って、所望されている測定領域の外側で発生する放射の検出は減少する。好適に、本装置はまた放射境界画定手段と励起境界画定手段の両方を有する。この場合、分析される対象にもっとも近い位置に、両者に共通の部分として機能するレンズシステムがある。

光の単向性ビームの波長は、フィルタにより、所望されている波長範囲に有効に境界画定される。これは詳細には干渉フィルタに関する。

本発明の第３の実施形態によれば、本蛍光光度計は、励起光境界画定器と光源の像を境界画定器の上に形成するための手段とを含む励起光境界画定装置を有する。境界画定装置によって、光源の反射・屈折表面によって発生するベールが除去されるので、励起光は可能な限り正確に、所望されている領域にだけ導かれる。レンズまたはミラー光学が本装置で使用される。境界画定器から光はさらに制御された方法で試料に導かれる。境界画定器の開口から、所望されている測定領域の像が好適に形成されるので、所望されている領域の外側で発生する蛍光発光は除去される。好適に、境界画定器は交換可能であり、その場合、所望されている形状と寸法の励起領域が各所定の時間において試料中に得られる。

本発明の第４の独立した特性によれば、本蛍光光度計は放射光境界画定器、開口中に試料の境界画定領域の像を形成するための装置および開口の後の位置にあるフィルタを有する。従って、所望されている領域の外側から達する光の量が減少し、フィルタリングが所望されている方法で容易に配置される。境界画定器は、好適に、交換可能であり、その場合、境界画定開口は変化するので、測定光は所望されている種類の領域から各所定の時間に収集される。好適に、像形成手段は、試料から放射された光を収束するためのレンズシステム、光の収束ビームが導かれるミラーおよび境界画定器開口中にミラーから反射された光の像を形成するためのもう１つの収束レンズが含まれる。

本発明の第５の独立した特性によれば、本装置は、その上または下に配置可能な、光源と検出器の両方を有する光学モジュールを有する。従って、本装置は、必要に応じて上または下から測定を行うために使用される。しかし、必要な光学的手段は可動モジュールの一部であり、従って検出器に対して固定して設置されるので、本装置では光を検出器に向けるための光ファイバは必要ない。紫外線領域で使用可能な光ファイバは特に高価であるため、光ファイバが不要であることは特に有利である。光ファイバはまた背景蛍光発光を発生するが、これも本発明により回避される。

本発明の第６の独立した特性によれば、光源は交換可能な白熱電球またはファイバ束ヘッドであり、それによって励起光が外部から励起光学装置に導入される。

使用される光源は、目的にかなった十分な短波長放射が得られるならば、好適に、白熱電球である。白熱電球は特殊な装置を必要とせず、さらに、電球全体の光度を使用することによってその境界画定像が容易に形成される。

本装置は、好適に、異なった容器に保持された試料をその内部で分析できる。試料容器は普通複数の容器、例えば、マイクロタイタ（microtiter）プレートの全体を形成する。好適に、本装置は試料用可動測定キャリアを有し、そのキャリアによって各試料は順番に測定位置にもたらされる。キャリアの適切な動作によって、試料は、所望されるならば、さらに攪拌されることもある。試料を移動させることによっていわゆる走査測定も実行できる。

詳細な説明
図１の蛍光光度計は、とりわけ制御ユニット２と電源および装置外の機能への接続部を収容する下部ハウジング１を有する。下部ハウジングの頂部には、光密性測定ユニット３がある。その後部エッジは下部ハウジングの後部エッジと蝶番４で取り付けられているので、測定ユニットは蝶番によって上向きに旋回し、その下の部品への接近が容易である。蝶番付き測定ユニットは、空気ばね５によって（図１の点線で示される）上部の位置に保持される。下部ハウジングと測定ユニットの上に着脱可能な上部ハウジング６がある。測定ユニットと上部ハウジングの前部壁に光密性ハッチを備えた開口７があり、その開口を通じて試料が測定ユニットの内外に移送される。

測定ユニット３は下部デッキ８と上部デッキ９を有する。これらの間の空間を測定キャリア１０が移送手段１１によって移動させられる。分析される試料を有するプレート１２が測定キャリアに配置される。測定キャリアは開口７を通じて取り出される。

測定ユニット３の下部デッキ８には下部測定開口１３があり、上部デッキ９には上部測定開口１４がある。測定ユニットは光学モジュール１５を有するが、これは測定ユニットの上または下のどちらかに配置される。上部デッキはさらに液体注入ユニット１６と注入開口１７を有し、これを通じて液体がプレート１２のくぼみの中に注入される。

光学モジュール１５の主要な部品は光源ユニット１８、ミラーユニット１９および検出器ユニット２０である。光学モジュールは、試料への励起光と試料からの放射光の両方を、上または下から導くために使用される。

光源ユニット１８は白熱電球２１を有する。電球のフィラメントの像はレンズシステム２２によってミラーユニット１９の励起境界画定器２３の開口２４に集光される。有効寿命を延ばすために、電球は測定中にだけ電源が入るようにすることが好適である。

開口２４から来る励起光はレンズシステム２５を使用して平行にされ、平行にされた光はフィルタ２６を通じて部分透過性ミラー２７に導かれる。フィルタによって励起光の波長は所望されている範囲に境界画定される。

ミラー２７を通過する光は合焦レンズシステム２８を経由して試料に収束される。従って光のスポット２９が試料の境界画定空間領域に得られる。

励起光のミラー２７から反射された部分は基準検出器３０に導かれる。それによって励起光の強度の変化によって測定結果中に発生する誤差が補償される。励起光の代表的なサンプルがミラーから得られる。光の半分は励起のために使用され、残りの半分は励起の振幅を定めるために利用される。光の単向性ビームは大きな表面積を有する検出器に送られるか、または収束レンズによってもっと小さな検出器に送られる。

試料のスポット２９から放射された光は合焦レンズシステム２８を経由してミラー２７の下部表面に伝わる。ミラーから反射された部分から、放射境界画定器３２の開口３３に、収束レンズシステム３１によってスポットの像が形成される。開口から放射光はレンズシステム３４によって平行にされてフィルタ３５に達し、そこから集光レンズシステム３６を経由して検出器３７に導かれる。フィルタによって、所望されている波長範囲が放射光から境界画定される。ここではフィルタは干渉フィルタである。検出器は光電子増倍管である。

ミラー２７が励起チャネルと放射チャネルに共通の結像レンズシステム２８の近くに配置されている時、ミラー中の像は分析される対象から離れた位置に形成される。ミラーが焦点距離未満の距離にある時は像は形成されない。

本装置は複数の異なった励起フィルタ２６と放射フィルタ３５を有する。フィルタは円盤に設置されており、所望されているフィルタが円盤を回転することによって設置される。フィルタの円盤も交換可能である。

励起境界画定器２３は交換可能であるので、所望されている寸法と形状の最適な励起開口２４が常にモジュールに配置される。従って励起光は有効な効率比で、所定の時間に分析される試料または、その好適または十分な範囲に正確に焦点を合わせることができる。境界画定器によって、詳細には隣接する試料の蛍光発光によって発生する妨害を除去することができる。

境界画定開口２４の形状も実施形態によって変化する。例えば、ある実施形態では試料の電気泳動によって形成された線の蛍光発光が測定される。この場合には、適切な線状開口が使用される。

使用者は、必要な場合には、形成される光のスポットの寸法と形状を視覚的に確認することができる。

放射境界画定器３２も交換可能であるので、検出器に達する光は開口３３によって境界画定される。光は常に正確に決定された範囲から測定される。これは検出器に達する背景放射を最小にするために使用されるが、こうした放射は詳細には隣接するくぼみから来る。開口の形状も分析される試料またはその部分的な範囲によって変化する。

所望されるならば、測定範囲の寸法と形状を決定するために励起境界画定開口２４と放射境界画定開口３３の両方を使用することが可能である。妨害の原因となる隣接する試料はどんな場合でも広い方の境界画定開口の範囲外にあるため、境界画定器を１つだけ交換すれば十分であることが多い。好適に、励起光領域は放射測定領域よりも小さくされている。

説明された放射光処理光学装置は、分析される対象までの距離の変化によって発生する誤差を除去するためにも使用される。こうした誤差は例えば、プレートの湾曲、通路の傾きおよび試料の量の変化によって発生する。放射感度は、測定の立体角を一定にすることによって一定にされる。これは、ミラー２７の後の位置に配置された、平行光線を境界画定する開口によって達成される。図示した実施形態では、レンズの保持器３１が境界画定器として機能する。適切な寸法決定によって、深度効果がほぼ完全に除去される。

光源ユニット１８も交換可能である。その位置には境界画定開口２４に対して光ファイバ束が設置できるが、それによって励起光が外部光源から送られる。この場合、像はファイバ束の端部に形成される。この装置は、例えば、特殊な安全装置を要求するクセノン電球が必要な場合に使用される。光を導くために使用されるファイバ特有の蛍光発光は、ファイバの後で光が励起フィルタ２６を通過するためここでは問題を発生しない。図２ｂはこうした光学モジュール１５’を示すが、これは独立した光源ユニット１８’を有しており、そこから電球２１’の光がレンズ２２’とファイバ束２３’によって導かれる。

有用な部分透過性ミラー２７は、ガラス薄板の上に反射性のスポット（直径は、例えば、約１mm）を形成することによって製造されるが、こうしたスポットは光透過性表面の半分を覆う。反射材料は好適に、非常に広い反射波長範囲（約２００〜１５００nm）を有するアルミニウムである。ガラス薄板は、好適に、ガラスの内部反射による散乱光の量を最小にするできるだけ薄いものである。

しかし、好適に、適切な形状の反射領域が使用される。図３の部分透過性ミラー２７．１の反射領域は、円形の中心３８．１とその周囲の個別の放射状セクタ３９．１からなり、透過性領域４０．１は対応する車輪形状である。図４によるミラーでは、その部分の代わりに連続反射領域があるが、これは車輪形状の中心３８．２およびそれに結合する放射状のセクタ３９．２と、個別の放射状セクタ４０．２によって形成される透過性領域とからなる。中心領域は光学装置の内部反射を最小にする。放射状反射領域のエッジのため、光の屈折が半径に対して直角の接線の方向に発生する。

１つの実施形態によれば、ミラー２７．１または２７．２は、その４５°射影が円である楕円である。

図５による移送手段１１では、キャリア１０が縦のスライドバー４１に沿ってスライドするように設置され、そのスライドバーが横のスライドバー４２に沿ってスライドするように設置される。スライドバーは電動機とベルト４３および４４を使用することによって動かせるので、キャリアは測定ユニット内または前部壁の開口の外の所望されている位置にもたらされる。

キャリア１０は矩形で、後部壁４５と側壁４６を有している。側壁の下部には中央に開いた空間が残るような支え４７がある。支えの端部には内向きの突起がある。突起はその前縁に着脱可能な垂直ピン４８を有する。キャリア１０は、くぼみの底部が開口の範囲にあるように、分析用プレートが支え４７の上に乗るよう配置できる寸法である。使用されるプレートが開口より小さい場合、適切なアダプタトレーが支えの上に乗るよう配置される。

キャリア１０の１つの側面エッジはプレート保持器４９を有する。これは鈍角Ｖの基本的形状を有し、その頂点がキャリアの垂直ピン５０に蝶番式に取り付けられるレバーである。それにばね５１が結合され、その一端はキャリアの枠に接し、もう一端は保持器に接するので、保持器の外側の枝をキャリアの中央の方向に（図５では時計回り方向に）回転させようとする。保持器の外側の枝の端部にはキャリアの方向を向いた突起５２がある。保持器は、開放された状態にある時、キャリア内のプレートを後部壁と、保持器の反対にある側壁に押しつける。従ってプレートは常にキャリア内で角に接する同じ位置に自動的に配置される。キャリアが測定装置から取り出される時、保持器の内側の枝は移送装置のストップ壁５３に衝突するので、ストップ壁は保持器が開くようにする。従って、プレートはキャリアに配置されるか、またはそれから取り外される。ピン４８を取り外すと、プレートはやはり水平な通路に沿ってキャリアに移送できる。

キャリア１０の後部エッジは４つの異なった蛍光基準面５４を有し、それによって必要な場合に検出器の感度が検査できる。

図６はキャリア１０内のプレート１２への液体の注入を示す。注入開口１７から、内側の斜面に２つの注入ヘッド５６および５７が入る。第１のヘッドは液体を測定位置のくぼみに注入するために使用され、第２のヘッドは液体を測定位置に隣接する、詳細には次に測定位置に達するくぼみに注入するために使用される。さらに、開口は好適に第３の注入ヘッドを有し、測定位置の横に隣接するくぼみ（図６では測定されるくぼみの後方）に流体を注入するために使用される。

本発明による１つの蛍光光度計の側面図を示す。 図１の蛍光光度計の光学装置を示す。 他の光学装置を示す。 光学装置中で使用可能な１つのミラーを示す。 光学装置中で使用可能なもう１つのミラーを示す。 図１の蛍光光度計の試料プレート移送装置の平面図を示す。 注入および測定位置にあるプレートを伴う図の蛍光光度計の詳細を示す。

符号の説明

１５ 光学モジュール
１８ 光源ユニット
１９ ミラーユニット
２０ 検出器ユニット
２１ 白熱電球
２２ レンズシステム
２３ 励起境界画定器
２５ レンズシステム
２８ 合焦レンズシステム
３１ 収束レンズシステム
３３ 開口
３４ レンズシステム
３５ フィルタ

Claims (8)

1. 試料の光学的特性を測定する蛍光光度計であって、光源からの励起光を試料へ方向付ける手段と、試料からの放射光を検出器へ方向付ける手段とを有しているものにおいて、
   蛍光光度計が、試料までの距離の変化によって発生する、放射光における誤差を除去する誤差除去手段(２８，３１)を有していることを特徴とする蛍光光度計。
2. 誤差除去手段が、放射光を平行にするレンズシステム(２８)と、散乱光線を光のビームの外に境界画定する境界画定器(３１)とを備えていることを特徴とする請求項１に記載の蛍光光度計。
3. 試料の光学的特性を測定する蛍光光度計であって、光源からの励起光を試料へ方向付ける手段と、試料からの放射光を検出器へ方向付ける手段とを有しているものにおいて、
   蛍光光度計が、励起光を平行にする手段(２５)を有していることを特徴とする蛍光光度計。
4. 試料の光学的特性を測定する蛍光光度計であって、光源からの励起光を試料へ方向付ける手段と、試料からの放射光を検出器へ方向付ける手段とを有しているものにおいて、
   蛍光光度計が、放射光を平行にする手段(３４)を有していることを特徴とする蛍光光度計。
5. 試料の光学的特性を測定する蛍光光度計であって、光源からの励起光を試料へ方向付ける手段と、試料からの放射光を検出器へ方向付ける手段とを有しているものにおいて、
   蛍光光度計が、励起光の光源の像を境界画定器(２３；２３’)に形成する手段(２２；２２’)を有していることを特徴とする蛍光光度計。
6. 試料の光学的特性を測定する蛍光光度計であって、光源からの励起光を試料へ方向付ける手段と、試料からの放射光を検出器へ方向付ける手段とを有しているものにおいて、
   蛍光光度計が、放射光を境界画定する手段(３３)と、放射光をフィルタリングする手段(３５)とを有していることを特徴とする蛍光光度計。
7. 試料の光学的特性を測定する蛍光光度計であって、光源からの励起光を試料へ方向付ける手段と、試料からの放射光を検出器へ方向付ける手段とを有しているものにおいて、
   蛍光光度計が、交換可能な光源(２１)を有していることを特徴とする蛍光光度計。
8. 試料の光学的特性を測定する蛍光光度計であって、光源からの励起光を試料へ方向付ける手段と、試料からの放射光を検出器へ方向付ける手段とを有しているものにおいて、
   蛍光光度計が、交換可能な励起光境界画定器(２３；２３’)又は交換可能な放射光境界画定器(３３)を有していることを特徴とする蛍光光度計。
   

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