【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、シミ、ソバカス、皮膚色素沈着等の原因となるメラニンの産生に関与するチロシナーゼの発現を抑制することによって美白作用を発揮することができ、シミ、ソバカス、皮膚色素沈着症等の予防・治療に有効であるチロシナーゼ発現抑制剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
シミ、ソバカス、日焼け後の皮膚色素沈着は、皮膚内に存在する色素細胞（メラノサイト）の活性化によりメラニン産生が著しく亢進した結果として生ずるものであり、中高年齢層における肌の悩みの一つになっている。
【０００３】
一般に、メラニンは色素細胞の中で生合成される酵素チロシナーゼの働きによってチロシンからドーパ、ドーパからドーパキノンに変化し、ついで５，６−ジヒドロキシインドフェノール等の中間体を経て形成されるものとされている。従って、皮膚の色黒（皮膚色素沈着症）を予防・治療するためには、メラニン産生過程を阻害すること、あるいは既に産生したメラニンを淡色漂白することが有効であると考えられる。
【０００４】
このような考えに基づき、従来から種々の美白成分が提案されてきた。例えば、チロシナーゼ活性を阻害してメラニン産生を抑制するものとして、エリカ抽出物（特許文献１）、桑葉抽出物（特許文献２）等が用いられてきた。また、産生したメラニンを淡色漂白化するものとして、グラブリジン（特許文献３）、雪蓮花抽出物（特許文献４）等が用いられてきた。さらに、チロシナーゼ発現抑制作用を有する天然素材の抽出物として、アナアオサ（非特許文献１）及びトコフェロール（非特許文献２）等が知られている。
【０００５】
【特許文献１】
特開平６−３０５９７８号公報
【特許文献２】
特開平１１−２４６４２４号公報
【特許文献３】
特開平１−３１１０１１号公報
【特許文献４】
特開２００２−２０１１２２号公報
【非特許文献１】
日本化粧品技術者会学術委員会，「ＳＣＣＪ研究討論会（第４４回）講演要旨集」，ｐ５５−５７，１９９９年６月１７日発行
【非特許文献２】
フレグランスジャーナル社，「最新のメラニン研究と美白剤の開発」，ｐ５６−６３，２００３年２月５日発行
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、安全性の高い天然物の中からチロシナーゼ発現抑制作用を有する物質を見出し、それを有効成分としたチロシナーゼ発現抑制剤を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、本発明のチロシナーゼ発現抑制剤は、タケノコ及び／又はカンゾウ根からの抽出物を有効成分として含有することを特徴とする。
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明において、「タケノコ及び／又はカンゾウ根からの抽出物」とは、タケノコ及び／又はカンゾウ根を抽出原料として得られる抽出液、該抽出液の希釈液若しくは濃縮液、該抽出液を乾燥して得られる乾燥物、又はこれらの粗精製物若しくは精製物のいずれもが含まれる。
【０００９】
タケは、中国南部が原産で、桿は高さ１０〜２５メートル、直径は８〜２０センチメートルのイネ科タケ亜科の植物であり、その若芽であるタケノコは、日本、中国及びその他の広い地域で食用されている。抽出原料として使用するタケノコの種類は特に限定されるものではないが、モウソウ竹（Ｐｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌａ ｆ． ｐｕｂｅｓｃｅｎｓ）又はハチク竹の若芽を使用することが好ましい。
【００１０】
カンゾウ（甘草）は、マメ科に属し、古代より薬用又は甘味料の原料として利用されている有用植物である。特にカンゾウの根部であるカンゾウ根には、グリチルリチンその他の有用成分が含有されていることが確認されている。抽出原料として使用するカンゾウの種類は特に限定されるものではなく、例えば、Ｇｌｙｃｈｙｒｒｈｉｚａ ｇｌａｂｒａ、Ｇｌｙｃｈｙｒｒｈｉｚａ ｉｎｆｌａｔａ、Ｇｌｙｃｈｙｒｒｈｉｚａ ｕｒａｌｅｎｓｉｓ、Ｇｌｙｃｈｙｒｒｈｉｚａ ａｓｐｅｒａ、Ｇｌｙｃｈｙｒｒｈｉｚａ ｅｕｒｙｃａｒｐａ、Ｇｌｙｃｈｙｒｒｈｉｚａ ｐａｌｌｉｄｉｆｌｏｒａ、Ｇｌｙｃｈｙｒｒｈｉｚａ ｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓ、Ｇｌｙｃｈｙｒｒｈｉｚａ ｌｅｐｉｄｏｔａ、Ｇｌｙｃｈｙｒｒｈｉｚａ ｅｃｈｉｎａｔａ、Ｇｌｙｃｈｙｒｒｈｉｚａ ａｃａｎｔｈｏｃａｒｐａ等を抽出原料として使用することができるが、Ｇｌｙｃｈｙｒｒｈｉｚａ ｇｌａｂｒａ及びＧｌｙｃｈｙｒｒｈｉｚａ ｉｎｆｌａｔａを抽出原料として用いることが好ましい。
【００１１】
抽出原料として使用するタケノコ及び／又はカンゾウ根は、採取後乾燥し粉砕したものが適当である。乾燥は天日で行ってもよいし、通常使用される乾燥機を使用して行ってもよい。また、ヘキサン、ベンゼン等の非極性溶媒によって脱脂等の前処理を施してから抽出原料として使用してもよい。脱脂等の前処理を行うことにより極性溶媒を用いた抽出処理を効率よく行うことができる。
【００１２】
抽出処理の際には、抽出溶媒として極性溶媒を使用することが好ましい。タケノコ又はカンゾウ根に含まれるチロシナーゼ発現抑制作用を示す成分は、極性溶媒を抽出溶媒とする抽出処理によって容易に抽出することができる。
【００１３】
極性溶媒の具体例としては、水、水溶性有機溶媒等が挙げられ、これらを単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。これら極性溶媒のうち、水溶性有機溶媒又は含水水溶性有機溶媒を使用することが好ましい。
【００１４】
抽出溶媒として使用し得る水には、純水、水道水、井戸水、鉱泉水、鉱水、温泉水、湧水、淡水等の他、これらに各種処理を施したものが含まれる。水に施す処理としては、例えば、精製、加熱、殺菌、滅菌、ろ過、イオン交換、浸透圧の調整、緩衝化等が含まれる。従って、本発明において抽出溶媒として使用し得る水には、精製水、熱水、イオン交換水、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等も含まれる。
【００１５】
抽出溶媒として使用し得る水溶性有機溶媒としては、低級脂肪族アルコール、アセトン、テトラヒドロフラン等が挙げられ、低級脂肪族アルコールの具体例としては、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等の１価アルコール；１，３−ブチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、イソプロピレングリコール等の多価アルコール等が挙げられる。
抽出溶媒としては、酢酸エチル、酢酸ブチル、メチルセロソルブ等の中間極性溶媒を使用することもできる。
【００１６】
２種以上の極性溶媒の混合液を抽出溶媒として使用する場合、その混合比は適宜調整することができる。例えば、含水水溶性有機溶媒を使用する場合、一価アルコール、多価アルコール、アセトン、テトラヒドロフラン等の含有量が５０重量％以上であることが好ましい。
【００１７】
抽出処理は、タケノコ又はカンゾウ根に含まれる可溶性成分を抽出溶媒に溶出させ得る限り特に限定されず、常法に従って行うことができる。抽出処理の際には、特殊な抽出方法を採用する必要はなく、室温又は還流加熱下において任意の装置を使用することができる。抽出方法としては、例えば、抽出溶媒中に抽出原料を長時間常温で浸漬して抽出する方法、抽出溶媒の沸点以下の温度に加熱し攪拌しながら抽出する方法、抽出溶媒の沸点付近の温度で加熱還流下にて抽出する方法等が挙げられる。
【００１８】
抽出処理により可溶性成分を溶出させた後、ろ過、遠心分離等の処理を施して抽出残渣を除くことにより抽出液を得ることができる。得られた抽出液は、該抽出液の希釈液若しくは濃縮液、該抽出液の乾燥物、又はこれらの粗精製物若しくは精製物を得るために、常法に従って希釈、濃縮、乾燥、精製等の処理を施してもよい。
【００１９】
タケノコ又はカンゾウ根からの抽出物は特有の匂いと味を有しているため、脱色、脱臭等を目的とする精製を行ってもよい。精製は、具体的には活性炭処理、吸着樹脂処理、イオン交換樹脂処理等によって行うことができ、これらの処理は、タケノコ又はカンゾウ根からの抽出物の生理活性、すなわちチロシナーゼ発現抑制作用の低下を招かない範囲で行う。
【００２０】
以上のようにして得られるタケノコ又はカンゾウ根からの抽出物は、チロシナーゼ発現抑制作用を有しており、この作用を利用してチロシナーゼ発現抑制剤の有効成分として使用することができる。また、タケノコ又はカンゾウ根からの抽出物は、チロシナーゼ発現抑制作用を通じて美白作用を発揮し得るので、美白剤の有効成分として使用することもできる。
【００２１】
タケノコ又はカンゾウ根からの抽出物はそのままでもチロシナーゼ発現抑制剤として使用することができるが、常法に従って製剤化して使用することもできる。製剤化する場合、保存や取扱いを容易にするために、デキストリン、シクロデキストリン等の薬学的に許容され得るキャリアーその他任意の助剤を添加することができる。タケノコ又はカンゾウ根からの抽出物は、製剤化により粉末状、顆粒状、錠剤状等、任意の剤形とすることができる。
【００２２】
本発明のチロシナーゼ発現抑制剤は、チロシナーゼｍＲＮＡ発現抑制作用等を通じて、チロシナーゼの発現を阻害することができる。メラニンは、色素細胞の中で生合成される酵素チロシナーゼの働きによって、チロシナーゼからドーパ、ドーパからドーパキノンに変化し、次いで５，６−ジヒドロキシインドフェノール等の中間体を経て形成されるものとされている。したがって、本発明のチロシナーゼ発現阻害剤によれば、メラニン産生に関与するチロシナーゼの発現を抑制することにより、メラニンの産生を抑制することができるとともに、メラニンの産生の抑制を通じて美白効果を得ることができる。
【００２３】
本発明のチロシナーゼ発現抑制剤は、チロシナーゼ発現抑制作用を通じて美白作用を発揮することができるとともに、皮膚に適用した場合の安全性に優れているので、皮膚外用剤に配合するのに好適である。ここで、「皮膚外用剤」とは、皮膚に適用される各種薬剤を意味し、例えば、化粧料、医薬部外品、医薬品等が含まれる。皮膚外用剤の具体例としては、肌に対するものとして、軟膏、パップ、クリーム、乳液、化粧水、ローション、パック、ゼリー等が挙げられ、頭皮に対するものとして、トニック、リンス、シャンプー、アストリンゼント等が挙げられる。皮膚外用剤におけるタケノコ又はカンゾウ根からの抽出物の配合量は、皮膚外用剤の種類や抽出物の生理活性等によって適宜調整することができるが、好適な配合率は、乾燥物に換算して通常０．００１〜１０重量％、好ましくは０．０１〜５重量％である。配合量が０．００１重量％よりも少ないとチロシナーゼ発現抑制作用及び美白作用が十分に発揮され難く、配合量が１０重量％を越えても増加分に見合ったチロシナーゼ発現抑制作用及び美白作用が得られ難い。
【００２４】
本発明のチロシナーゼ発現阻害剤には、必要に応じて任意の薬効成分、生理活性物質等を併せて含有させることができる。本発明のチロシナーゼ発現阻害剤において、タケノコ又はカンゾウ根からの抽出物とともに構成成分として利用可能なものとしては、水性成分、油性成分、粉末成分、界面活性剤、保湿剤、色剤、香料、防腐剤、抗酸化剤、紫外線カット剤、キレート剤、抗炎症剤、本抽出物以外の美白成分等が挙げられ、これらの成分とタケノコ又はカンゾウ根からの抽出物とを併用した場合、その相乗作用が通常期待される以上の優れた効果をもたらすことがある。
【００２５】
以上に説明した本発明のチロシナーゼ発現抑制剤は、ヒトに対して好適に適用されるものであるが、作用効果が奏される限り、ヒト以外の動物に対して適用することもできる。
【００２６】
【実施例】
以下、製造例及び試験例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
〔製造例１〕
タケノコ（モウソウ竹の若芽）の乾燥粉砕物１０ｇを抽出溶媒（５０％エタノール）１００ｍＬに投入し、穏やかに攪拌しながら２時間、８０℃に保った後、ろ過した。残渣に同様の抽出溶媒１００ｍＬを加え、上記操作をもう一度繰り返した。ろ液を合わせて４０℃で減圧下にて濃縮し、さらに減圧乾燥機で乾燥して抽出物（粉末状）を得た。得られた抽出物の重量は１．８４ｇ（収率１８．４％）であった。なお、抽出溶媒の混合比は重量基準によるものである。
【００２７】
〔製造例２〕
カンゾウ根（Ｇｌｙｃｈｙｒｒｈｉｚａ ｇｌａｂｒａの根部）の乾燥粉砕物５０ｇを抽出溶媒（８０％エタノール）５００ｍＬに投入し、３時間、８０℃で還流抽出し、ろ過した。ろ液を４０℃で減圧下にて濃縮し、さらに減圧乾燥機で乾燥して抽出物（粉末状）を得た。得られた抽出物の重量は８．５１ｇ（収率１９．８％）であった。なお、抽出溶媒の混合比は重量基準によるものである。
【００２８】
〔試験例１〕チロシナーゼ発現抑制作用試験
Ｂ１６メラノーマ細胞１×１０６個を２５ｃｍ２の培養フラスコで、１０％ＦＢＳ含有ダルベッコ−ＭＥＭ培養液を用いて、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒ下でフルシート直前まで培養した。トリプシン処理により細胞を集め、直径６０ｍｍの培養ディッシュに４×１０５個／５ｍＬ １０％ＦＢＳ含有ダルベッコ−ＭＥＭ培養液となるように播種し、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒ下で一晩培養した。培地を吸引除去した後、０．５ｍｍｏｌ／Ｌのテオフィリンを添加し、製造例１のタケノコ抽出物及び製造例２のカンゾウ根抽出物を所定濃度に溶解した１０％ＦＢＳ含有ダルベッコ−ＭＥＭ培養液に交換し、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒ下で２４時間培養した。また、コントロールとして、製造例１のタケノコ抽出物及び製造例２のカンゾウ根抽出物のいずれも溶解していない１０％ＦＢＳ含有ダルベッコ−ＭＥＭ培養液を用いて同様に培養した。
【００２９】
培養後、培地を吸引除去し、ＰＢＳ（−）２ｍＬで一度洗浄し、ＲＮＡ抽出用試薬（ＴＲＩｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ，ＧＩＢＣＯ社製）１ｍＬを添加、懸濁して細胞をディッシュから剥がし、オートクレーブ済み１．５ｍＬチューブに移した。冷却したクロロホルム２００μＬを添加して穏やかに混合し、４℃、１２０００ｒｐｍ条件下で１５分間遠心分離した。その後、上層（クロロホルム層）３００μＬを別のオートクレーブ済み１．５ｍＬチューブに移した。上層分取量の２倍量（６００μＬ）の冷却イソプロパノールを添加して穏やかに混合し、４℃、１２０００ｒｐｍの条件下で１５分間遠心分離した。その後、イソプロパノールを取り除き、直ちに冷却した７５％エタノール１ｍＬを添加してリンスし、４℃、１２０００ｒｐｍの条件下で１５分間遠心分離した。遠心分離後、７５％エタノールを十分に除去し、１０分間ほど放置し、乾燥させた。これをＤＥＰＣ処理水（ＧＩＢＣＯ社製）３０μＬに溶解させ、総ＲＮＡサンプルとした。得られた総ＲＮＡサンプル５μＬを滅菌蒸留水で１００倍希釈し、２６０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ２６０ｎｍ）を測定した。
【００３０】
次式：ＲＮＡ濃度＝吸光度（ＯＤ２６０ｎｍ）×４０μｇ／ｍＬに基づいてＲＮＡ濃度を算出し、得られた総ＲＮＡ溶液１０μＬを基にして、ＲＮＡ濃度が１００ｎｇ／μＬとなるように調製した。ＲＮＡ濃度が１００ｎｇ／μＬとなるように調製した総ＲＮＡ溶液５μＬ、ＰＣＲ用試薬（ＴＡＫＡＲＡ ＲＮＡ ＬＡ Ｋｉｔ（ＡＭＶ） Ｖｅｒ．１．１）、並びにチロシナーゼ遺伝子及びＧ３ＰＤＨ遺伝子（内部標準）に対するプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。
【００３１】
反応機器はサーマルサイクラー（ＴＡＫＡＲＡ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ＭＰ）を用い、反応条件は以下のように設定した。
逆転写反応については、４２℃で５０分、９９℃で５分及び５℃で５分からなるサイクルを１サイクル行った。また、Ｇ３ＰＤＨ遺伝子に対するＰＣＲについては、９４℃で５分、９４℃で４５秒、６５℃で４５秒及び７２℃で２分からなるサイクルを２５サイクル行った後、７２℃で１０分間処理し、その後、４℃に保持した。チロシナーゼ遺伝子に対するＰＣＲについては、９５℃で５分、９４℃で４５秒、５５℃で４５秒及び７２℃で４５秒からなるサイクルを３０サイクル行った後、７２℃で１０分間処理し、その後、４℃に保持した。
【００３２】
また、プライマーについて以下のものを用いた。
Ｇ３ＰＤＨ遺伝子に対する上流プライマー及び下流プライマーとして、それぞれ、５’− ｔｇａａｇｇｔｃｇｇｔｇｔｇａａｃｇｇａｔｔｔｇｇｃ −３’及び５’− ｃａｔｇｔａｇｇｃｃａｔｇａｇｇｔｃｃａｃｃａｃ −３’を用いた。また、チロシナーゼ遺伝子に対する上流プライマー及び下流プライマーとして、それぞれ、５’− ｔｔｃａａａｇｇｇｇｔｇｇａｔｇａｃ −３’及び５’− ｇａｃａｃａｔａｇｔａａｔｇｃａｔｃ −３’を用いた。
【００３３】
ＲＴ−ＰＣＲ終了後のサンプル８μＬずつを１．２％アガロースゲルにて電気泳動し、電気泳動後のゲルをエチジウムブロマイド溶液に２０分程度漬けてＤＮＡを染色し、トランスイルミネーター（３０２ｎｍ）上でデジタルカメラを用いてコンピューターに画像を取り込み、画像処理ソフト（Ｋｏｄａｋ ＥＤＡＳ １２０ Ａｎａｌｙｚｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）にて解析した。
【００３４】
それぞれのバンドの照度を基に補正値（チロシナーゼの照度／Ｇ３ＰＤＨの照度）を算出し、コントロールのチロシナーゼ発現量を１００％として、カンゾウ根抽出物及びタケノコ抽出物チロシナーゼによるチロシナーゼ発現抑制作用の評価を行った。結果を表１に示す。
【００３５】
［表１］
【００３６】
表１の結果から、タケノコ抽出物及びカンゾウ根抽出物が、チロシナーゼ発現抑制作用を有することが確認された。
【００３７】
【発明の効果】
本発明によれば、シミ、ソバカス、皮膚色素沈着等の原因となるメラニンの産生に関与するチロシナーゼの発現を抑制することによって美白作用を発揮することができ、シミ、ソバカス、皮膚色素沈着症等の予防・治療に有効であるチロシナーゼ発現抑制剤を提供することができる。本発明のチロシナーゼ発現抑制剤はチロシナーゼ発現抑制作用を通じて美白作用を発揮することができるとともに、皮膚に適用した場合の安全性に優れているので、皮膚外用剤に配合するのに好適である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention can exert a whitening effect by suppressing the expression of tyrosinase involved in the production of melanin causing stains, freckles, skin pigmentation, and the like, and can prevent stains, freckles, skin pigmentation, and the like. -It relates to a tyrosinase expression inhibitor that is effective for treatment.
[0002]
[Prior art]
Stain, freckles, and skin pigmentation after sunburn are the result of a marked increase in melanin production due to the activation of pigment cells (melanocytes) present in the skin. Has become.
[0003]
Generally, melanin is converted from tyrosine to dopa and dopa to dopaquinone by the action of an enzyme tyrosinase biosynthesized in pigment cells, and then formed via an intermediate such as 5,6-dihydroxyindophenol. I have. Therefore, in order to prevent and treat skin darkening (skin pigmentation), it is considered effective to inhibit the melanin production process or to bleach melanin that has already been produced in light color.
[0004]
Various whitening components have been conventionally proposed based on such a concept. For example, Erica extract (Patent Document 1), mulberry leaf extract (Patent Document 2), and the like have been used as inhibitors of tyrosinase activity to suppress melanin production. Also, glabridine (Patent Literature 3), snow lotus extract (Patent Literature 4), and the like have been used to bleach the produced melanin in light color. Furthermore, as extracts of natural materials having a tyrosinase expression-suppressing action, Anaoasa (Non-Patent Document 1), Tocopherol (Non-Patent Document 2), and the like are known.
[0005]
[Patent Document 1]
JP-A-6-305978 [Patent Document 2]
JP-A-11-246424 [Patent Document 3]
Japanese Patent Application Laid-Open No. Hei 1-311011 [Patent Document 4]
Japanese Patent Application Laid-Open No. 2002-201212 [Non-Patent Document 1]
Scientific Committee of the Japan Cosmetic Engineers Association, "SCCJ Research Symposium (44th) Lecture Abstracts", pp. 55-57, issued June 17, 1999 [Non-Patent Document 2]
Fragrance Journal, “Latest Research on Melanin and Development of Whitening Agent”, pp. 56-63, published February 5, 2003 [0006]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to find a substance having a tyrosinase expression inhibitory action from natural products having high safety, and to provide a tyrosinase expression inhibitor containing the substance as an active ingredient.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
In order to achieve the above object, the tyrosinase expression inhibitor of the present invention contains an extract from bamboo shoots and / or licorice roots as an active ingredient.
[0008]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
In the present invention, the term "extract from bamboo shoots and / or licorice roots" refers to an extract obtained by using bamboo shoots and / or licorice roots as an extraction raw material, a dilute solution or a concentrated solution of the extract, and drying the extract. Dried product obtained by the above method, or any of these crude products or purified products.
[0009]
Bamboo is native to southern China, with a rod of 10-25 meters in height and a diameter of 8-20 centimeters, a plant of the subfamily Bamboo, whose young shoots are bamboo shoots in Japan, China and other large areas. Used locally. The type of bamboo shoot used as an extraction raw material is not particularly limited, but it is preferable to use moss bamboo (Phylostachys heterocycla f. Pubescens) or young shoots of bee bamboo.
[0010]
Licorice (licorice) belongs to the legume family and is a useful plant that has been used as a raw material for medicinal or sweeteners since ancient times. In particular, it has been confirmed that licorice root, which is the root of licorice, contains glycyrrhizin and other useful components. Type of licorice to be used as raw material for extraction is not particularly limited, for example, Glychyrrhiza glabra, Glychyrrhiza inflata, Glychyrrhiza uralensis, Glychyrrhiza aspera, Glychyrrhiza eurycarpa, Glychyrrhiza pallidiflora, Glychyrrhiza yunnanensis, Glychyrrhiza lepidota, Glychyrrhiza echinata, the Glychyrrhiza acanthocarpa like Although it can be used as an extraction raw material, it is preferable to use Glychrrhiza grabra and Glychrrhiza inflata as extraction raw materials. Arbitrariness.
[0011]
The bamboo shoots and / or licorice roots used as the extraction raw material are suitably collected, dried and pulverized. Drying may be performed in the sun or using a commonly used dryer. Alternatively, the material may be subjected to a pretreatment such as degreasing with a nonpolar solvent such as hexane or benzene, and then used as an extraction raw material. By performing a pretreatment such as degreasing, an extraction treatment using a polar solvent can be efficiently performed.
[0012]
At the time of the extraction treatment, it is preferable to use a polar solvent as the extraction solvent. The component having a tyrosinase expression-suppressing action contained in the bamboo shoot or licorice root can be easily extracted by an extraction treatment using a polar solvent as an extraction solvent.
[0013]
Specific examples of the polar solvent include water and a water-soluble organic solvent, and these can be used alone or in combination of two or more. Among these polar solvents, it is preferable to use a water-soluble organic solvent or a water-containing water-soluble organic solvent.
[0014]
Water that can be used as the extraction solvent includes pure water, tap water, well water, mineral water, mineral water, hot spring water, spring water, fresh water, and the like, as well as those subjected to various treatments. The treatment applied to water includes, for example, purification, heating, sterilization, sterilization, filtration, ion exchange, adjustment of osmotic pressure, buffering, and the like. Therefore, the water that can be used as the extraction solvent in the present invention includes purified water, hot water, ion-exchanged water, physiological saline, phosphate buffer, phosphate buffered saline, and the like.
[0015]
Examples of the water-soluble organic solvent that can be used as the extraction solvent include lower aliphatic alcohols, acetone, tetrahydrofuran, and the like. Specific examples of the lower aliphatic alcohol include monohydric alcohols such as methanol, ethanol, propanol, and butanol; And polyhydric alcohols such as 3,3-butylene glycol, glycerin, propylene glycol, and isopropylene glycol.
As the extraction solvent, an intermediate polar solvent such as ethyl acetate, butyl acetate, and methyl cellosolve can be used.
[0016]
When a mixture of two or more polar solvents is used as the extraction solvent, the mixing ratio can be appropriately adjusted. For example, when a water-containing water-soluble organic solvent is used, the content of a monohydric alcohol, a polyhydric alcohol, acetone, tetrahydrofuran or the like is preferably 50% by weight or more.
[0017]
The extraction treatment is not particularly limited as long as the soluble component contained in the bamboo shoot or liquorice root can be eluted into the extraction solvent, and can be performed according to a conventional method. At the time of the extraction treatment, it is not necessary to adopt a special extraction method, and any device can be used at room temperature or under reflux heating. As the extraction method, for example, a method of immersing an extraction raw material in an extraction solvent at room temperature for a long time to perform extraction, a method of extracting while stirring at a temperature lower than the boiling point of the extraction solvent and a method of extracting at a temperature near the boiling point of the extraction solvent A method of extracting under heating and reflux is exemplified.
[0018]
After the soluble component is eluted by the extraction treatment, an extraction liquid can be obtained by removing the extraction residue by performing treatments such as filtration and centrifugation. The obtained extract is a diluted or concentrated solution of the extract, a dried product of the extract, or a crude product or a purified product thereof. Processing may be performed.
[0019]
Since the extract from bamboo shoot or licorice root has a unique odor and taste, purification for the purpose of decolorization, deodorization, etc. may be performed. Purification can be specifically performed by activated carbon treatment, adsorption resin treatment, ion exchange resin treatment, etc., and these treatments reduce the physiological activity of the extract from bamboo shoot or licorice root, that is, decrease in the tyrosinase expression inhibitory effect. Perform within the range not invited.
[0020]
The extract from bamboo shoots or licorice roots obtained as described above has a tyrosinase expression inhibitory action, and can be used as an active ingredient of a tyrosinase expression inhibitor using this action. Further, the extract from bamboo shoot or licorice root can exert a whitening effect through a tyrosinase expression-inhibiting effect, and thus can be used as an active ingredient of a whitening agent.
[0021]
The extract from bamboo shoot or licorice root can be used as it is as a tyrosinase expression inhibitor, but it can also be formulated into a conventional method and used. In the case of formulation, a pharmaceutically acceptable carrier such as dextrin and cyclodextrin and other optional auxiliaries can be added to facilitate storage and handling. The extract from bamboo shoot or licorice root can be made into any dosage form such as powder, granule, tablet and the like by formulation.
[0022]
The tyrosinase expression inhibitor of the present invention can inhibit the expression of tyrosinase through the tyrosinase mRNA expression inhibitory action and the like. Melanin is converted from tyrosinase to dopa and dopa to dopaquinone by the action of the enzyme tyrosinase biosynthesized in pigment cells, and then formed via an intermediate such as 5,6-dihydroxyindophenol. I have. Therefore, according to the tyrosinase expression inhibitor of the present invention, by suppressing the expression of tyrosinase involved in melanin production, melanin production can be suppressed, and a whitening effect can be obtained through suppression of melanin production. it can.
[0023]
INDUSTRIAL APPLICABILITY The tyrosinase expression inhibitor of the present invention can exert a whitening effect through the tyrosinase expression inhibitory effect and is excellent in safety when applied to the skin, and thus is suitable for being incorporated into a skin external preparation. Here, “skin external preparation” means various drugs applied to the skin, and includes, for example, cosmetics, quasi-drugs, and pharmaceuticals. Specific examples of skin external preparations include ointments, cataplasms, creams, milky lotions, lotions, lotions, packs, jellies, and the like, and those for the scalp include tonics, rinses, shampoos, and astringents Can be The amount of the extract from bamboo shoots or liquorice root in the external preparation for skin can be appropriately adjusted depending on the type of the external preparation for skin or the physiological activity of the extract, but the preferable mixing ratio is calculated as dry matter. It is usually 0.001 to 10% by weight, preferably 0.01 to 5% by weight. If the amount is less than 0.001% by weight, the tyrosinase expression inhibitory effect and the whitening effect are difficult to sufficiently exert, and even if the amount exceeds 10% by weight, the tyrosinase expression inhibitory effect and the whitening effect corresponding to the increase can be obtained. It is hard to be.
[0024]
The tyrosinase expression inhibitor of the present invention can contain any medicinal component, a physiologically active substance, and the like, if necessary. In the tyrosinase expression inhibitor of the present invention, those which can be used as constituents together with extracts from bamboo shoots or licorice root include aqueous components, oil components, powder components, surfactants, humectants, coloring agents, fragrances, preservatives Agents, antioxidants, UV-cutting agents, chelating agents, anti-inflammatory agents, whitening components other than the present extract, and the like, and when these components are used in combination with an extract from bamboo shoot or licorice root, their synergistic action May provide better effects than normally expected.
[0025]
The tyrosinase expression inhibitor of the present invention described above is suitably applied to humans, but can also be applied to animals other than humans as long as the effect is exhibited.
[0026]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Production Examples and Test Examples, but the scope of the present invention is not limited thereto.
[Production Example 1]
10 g of the dried and ground bamboo shoots (moso bamboo shoots) was poured into 100 mL of an extraction solvent (50% ethanol), kept at 80 ° C. for 2 hours with gentle stirring, and then filtered. The same extraction solvent (100 mL) was added to the residue, and the above operation was repeated once. The filtrates were combined, concentrated at 40 ° C. under reduced pressure, and dried with a reduced-pressure drier to obtain an extract (powder). The weight of the obtained extract was 1.84 g (18.4% yield). The mixing ratio of the extraction solvent is based on weight.
[0027]
[Production Example 2]
50 g of dried and ground licorice root (Glychyrrhiza glabra root) was placed in 500 mL of an extraction solvent (80% ethanol), extracted with reflux at 80 ° C. for 3 hours, and filtered. The filtrate was concentrated at 40 ° C. under reduced pressure, and further dried with a reduced pressure drier to obtain an extract (powder). The weight of the obtained extract was 8.51 g (19.8% yield). The mixing ratio of the extraction solvent is based on weight.
[0028]
[Test Example 1] Tyrosinase expression inhibitory test 1 × 10 6 B16 melanoma cells were placed in a 25 cm 2 culture flask using a Dulbecco-MEM culture solution containing 10% FBS at 37 ° C. and 5% CO 2 -95% air. The cells were cultured underneath just before the full sheet. The cells were collected by trypsinization, seeded in a culture dish having a diameter of 60 mm so as to form a Dulbecco-MEM culture solution containing 4 × 10 5 cells / 5 mL 10% FBS, and cultured at 37 ° C. under 5% CO 2 -95% air. Cultured overnight. After the medium was removed by suction, 0.5 mmol / L theophylline was added, and the bamboo shoot extract of Production Example 1 and the licorice root extract of Production Example 2 were dissolved at a predetermined concentration in Dulbecco-MEM culture solution containing 10% FBS. The cells were exchanged and cultured at 37 ° C. under 5% CO 2 -95% air for 24 hours. As a control, Dulbecco-MEM culture solution containing 10% FBS in which neither the bamboo shoot extract of Production Example 1 nor the licorice root extract of Production Example 2 was dissolved was cultured in the same manner.
[0029]
After the culture, the medium was removed by suction, washed once with 2 mL of PBS (-), added with 1 mL of RNA extraction reagent (TRIzol Reagent, manufactured by GIBCO), suspended, and the cells were peeled off from the dish. Moved to 200 μL of cooled chloroform was added thereto, mixed gently, and centrifuged at 4 ° C. and 12,000 rpm for 15 minutes. Thereafter, 300 μL of the upper layer (chloroform layer) was transferred to another 1.5 mL autoclaved tube. Two times the volume of the upper layer (600 μL) of cold isopropanol was added, mixed gently, and centrifuged at 4 ° C. and 12,000 rpm for 15 minutes. Thereafter, isopropanol was removed, 1 mL of cooled 75% ethanol was immediately added, rinsed, and centrifuged at 4 ° C. and 12,000 rpm for 15 minutes. After centrifugation, 75% ethanol was sufficiently removed, left for about 10 minutes, and dried. This was dissolved in 30 μL of DEPC-treated water (GIBCO) to obtain a total RNA sample. 5 μL of the obtained total RNA sample was diluted 100-fold with sterile distilled water, and the absorbance at 260 nm (OD 260 nm ) was measured.
[0030]
The RNA concentration was calculated based on the following equation: RNA concentration = absorbance (OD 260 nm ) × 40 μg / mL, and the RNA concentration was adjusted to 100 ng / μL based on 10 μL of the obtained total RNA solution. Using 5 μL of a total RNA solution prepared so that the RNA concentration becomes 100 ng / μL, a PCR reagent (TAKARA RNA LA Kit (AMV) Ver. 1.1), and primers for the tyrosinase gene and the G3PDH gene (internal standard) RT-PCR was performed.
[0031]
The reaction equipment used was a thermal cycler (TAKARA PCR Thermal Cycler MP), and the reaction conditions were set as follows.
For the reverse transcription reaction, one cycle consisting of 50 minutes at 42 ° C., 5 minutes at 99 ° C., and 5 minutes at 5 ° C. was performed. In addition, regarding the PCR for the G3PDH gene, after performing 25 cycles of 94 ° C. for 5 minutes, 94 ° C. for 45 seconds, 65 ° C. for 45 seconds and 72 ° C. for 2 minutes, treatment at 72 ° C. for 10 minutes, and then And kept at 4 ° C. Regarding the PCR for the tyrosinase gene, 30 cycles of 95 ° C. for 5 minutes, 94 ° C. for 45 seconds, 55 ° C. for 45 seconds and 72 ° C. for 45 seconds were performed, followed by treatment at 72 ° C. for 10 minutes. It was kept at 4 ° C.
[0032]
The following primers were used.
As an upstream primer and a downstream primer for the G3PDH gene, 5'-tgaaggtcggtgtgaacggattttggc-3 'and 5'-catgtagggccatgaggtccaccac-3' were used, respectively. In addition, as an upstream primer and a downstream primer for the tyrosinase gene, 5′-ttcaaaggggtggatgac-3 ′ and 5′-gacacatagtaatgcatc-3 ′ were used, respectively.
[0033]
After the RT-PCR, 8 μL of each sample is electrophoresed on a 1.2% agarose gel, and the gel after the electrophoresis is immersed in an ethidium bromide solution for about 20 minutes to stain DNA, and is transfected on a transilluminator (302 nm). Images were captured into a computer using a digital camera and analyzed with image processing software (Kodak EDAS 120 Analyzing system).
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A correction value (illuminance of tyrosinase / illuminance of G3PDH) was calculated based on the illuminance of each band, and the tyrosinase expression of the control was taken as 100% to evaluate the tyrosinase expression inhibitory effect of the licorice root extract and bamboo shoot extract tyrosinase. went. Table 1 shows the results.
[0035]
[Table 1]
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From the results shown in Table 1, it was confirmed that the bamboo shoot extract and the licorice root extract had a tyrosinase expression-suppressing action.
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【The invention's effect】
According to the present invention, spots, freckles, can exert a whitening effect by suppressing the expression of tyrosinase involved in the production of melanin causing skin pigmentation, etc., spots, freckles, skin pigmentation and the like Provided is a tyrosinase expression inhibitor that is effective for the prevention and treatment of tyrosinase. The tyrosinase expression inhibitor of the present invention can exhibit a whitening effect through the tyrosinase expression inhibitory effect and is excellent in safety when applied to the skin, and thus is suitable for being incorporated into a skin external preparation.
