JP2004347538A - 抗ガン剤効力の判定方法およびこれに用いられる判定キット - Google Patents
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Abstract
【課題】抗ガン剤の効力を、より正確に判定することが可能な抗ガン剤効力の判定方法およびこれに用いられる判定キットを提供する。
【解決手段】抗ガン剤、特にチロシンキナーゼ阻害剤の効力を判定する際に、Ｊａｂ１タンパク質を判定の指標として用い、Ｊａｂ１タンパク質の存在形態を確認する。この存在形態としては、分子量１２０ｋＤａのＪａｂ１小複合体が挙げられ、ｐ２７タンパク質の発現を確認することで、抗ガン剤の効力に感受性を有しているタイプをより正確に判定することができる。
【選択図】 なし
【解決手段】抗ガン剤、特にチロシンキナーゼ阻害剤の効力を判定する際に、Ｊａｂ１タンパク質を判定の指標として用い、Ｊａｂ１タンパク質の存在形態を確認する。この存在形態としては、分子量１２０ｋＤａのＪａｂ１小複合体が挙げられ、ｐ２７タンパク質の発現を確認することで、抗ガン剤の効力に感受性を有しているタイプをより正確に判定することができる。
【選択図】 なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ガン患者に投与する抗ガン剤が有効であるかを判別する抗ガン剤効力の判定方法およびこれに用いられる判定キットに関するものであり、例えば、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の治療に用いられるチロシンキナーゼ阻害剤が有効であるか否かを判別するために特に好ましく用いられる判定方法およびこれを実施するために用いられる判定キットに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ガンの治療においては、抗ガン剤を用いた化学療法が大きな割合を占めている。しかしながら、抗ガン剤の効力の予測が困難であること、副作用として患者の精神的・肉体的苦痛が大きいこと等が大きな問題となっている。それゆえ、あるガン患者に対して特定の抗ガン剤が有効であるか否か、すなわち、抗ガン剤の効力の予測は、化学療法において重要なポイントとなる。
【０００３】
例えば、慢性骨髄性白血病（以下、適宜ＣＭＬと略す）においては、特異的な抗ガン剤としてチロシンキナーゼ阻害剤が開発されている。このチロシンキナーゼ阻害剤は、ＣＭＬにおいてガン細胞に生じた遺伝子異常をターゲットとし、正常細胞への影響を最小限に留める効果を有しており、代表的なものとして、グリベック（ノバルティス社 登録商標）が知られている。
【０００４】
上記チロシンキナーゼ阻害剤の作用について具体的に説明すると、ＣＭＬの原因因子としてＢｃｒ−Ａｂｌ遺伝子が知られており、この遺伝子はＰ２１０タンパク質をコードしている。上記チロシンキナーゼ阻害剤は、このＰ２１０タンパク質のチロシンキナーゼ活性を阻害し、アポトーシスを誘導することによって、白血球の異常増殖を抑制する。
【０００５】
それゆえ、抗ガン剤としてチロシンキナーゼ阻害剤を用いる場合、あるＣＭＬ患者に対してチロシンキナーゼ阻害剤が有効であるか否かを判別する方法、すなわちチロシンキナーゼ阻害剤の効力の判別方法は、従来では、Ｂｃｒ−Ａｂｌ遺伝子の存在およびその発現によりなされていた（例えば、非特許文献１参照）。
【０００６】
ところで、最近、チロシンキナーゼ阻害剤に対して耐性を有する突然変異を持ったＢｃｒ−Ａｂｌ変異遺伝子や、多重突然変異の結果、Ｂｃｒ−Ａｂｌ遺伝子がコードするＰ２１０タンパク質の活性には依存しないガン細胞の例が報告されている（例えば、非特許文献２参照）。これは、ガン細胞は遺伝的変異を蓄積しつづける場合が多いことによると考えられる。
【０００７】
また、本発明者等は、Ｊａｂ１タンパク質がｐ２７タンパク質と特異的に結合すること、およびＪａｂ１タンパク質がｐ２７タンパク質の細胞内局在的な分解に関与しているとの知見を報告した（例えば非特許文献３および４参照）。
【０００８】
なお、本発明者らは、Ｂｃｒ−ＡｂｌによってＪａｂ１の発現が制御を受け、ｐ２７の分解誘導には働くことがガン化の一因となる可能性を示す知見を報告している（非特許文献５参照）。
【０００９】
【非特許文献１】
Ｍａｎｌｅｙ ＰＷ ｅｔ ａｌ． Ｅｕｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ． ２００２ Ｓｅｐ；３８ Ｓｕｐｐｌ ５：Ｓ１９−２７．
【００１０】
【非特許文献２】
Ｈｏｃｈｈａｕｓ Ａ ｅｔ ａｌ． Ｌｅｕｋｅｍｉａ． ２００２ Ｎｏｖ；１６（１１）：２１９０−６．
【００１１】
【非特許文献３】
Ｔｏｍｏｄａ Ｋ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ． １９９９ Ｍａｒ １１；３９８（６７２３）：１６０−５．
【００１２】
【非特許文献４】
Ｔｏｍｏｄａ Ｋ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２００２ Ｊａｎ １８；２７７（３）：２３０２−１０．
【００１３】
【非特許文献５】
第２５回日本分子生物学会年会プログラム・講演要旨集、２Ｐ−０７６０（第２５回日本分子生物学会年会組織委員会、２００２年１１月２５日発行）
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
上記のように、Ｂｃｒ−Ａｂｌ変異遺伝子の存在やＰ２１０タンパク質の活性に依存しないガン細胞の存在は、Ｂｃｒ−Ａｂｌ遺伝子を指標とする上記従来の判別方法を不正確なものとすることになる。
【００１５】
したがって、上記従来の判別方法を用いた場合、本来チロシンキナーゼ阻害剤に陰性の患者が、誤って陽性と判断される可能性が生じる。そのため、その患者にチロシンキナーゼ阻害剤を投与しても効力が得られないにも関わらず、不必要な投与がなされてしまう。このような事態は、抗ガン剤の有効性を低下させるだけでなく、患者に対して抗ガン剤による副作用や多額の出費を強いることになる。
【００１６】
本発明は上記課題に鑑みなされたものであって、その目的は、抗ガン剤であるチロシンキナーゼ阻害剤の効力を、より正確に判定することが可能な抗ガン剤効力の判定方法およびこれに用いられる判定キットを提供することにある。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題に鑑み鋭意検討した結果、Ｃｄｋインヒビターｐ２７タンパク質に特異的に結合する分子であるＪａｂ１タンパク質に、複数の存在形態があり、そのうちの一つの形態が、チロシンキナーゼ阻害剤の効力と対応することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１８】
すなわち、本発明にかかる抗ガン剤効力の判定方法は、上記の課題を解決するために、ガン治療に用いられる抗ガン剤の効力を判定する方法であって、検体試料中に含まれるＪａｂ１タンパク質を判定の指標として用いることを特徴としている。
【００１９】
上記抗ガン剤効力の判定方法では、ガン細胞を含む検体試料から抽出液を調製する抽出液調製工程と、当該抽出液に含まれるＪａｂ１タンパク質の存在形態を確認するＪａｂ１確認工程とを含むことが好ましく、さらには、上記抽出液を分子量分画する分画工程を含んでおり、上記Ｊａｂ１確認工程では、分画された抽出液を用いることがより好ましい。
【００２０】
上記Ｊａｂ１確認工程では、上記Ｊａｂ１タンパク質が形成しているＪａｂ１複合体の分子量を基準として、Ｊａｂ１タンパク質の存在形態を確認することが好ましい。ここで、上記Ｊａｂ１複合体としては、分子量４５０ｋＤａのＪａｂ１大複合体か、または分子量１２０ｋＤａのＪａｂ１小複合体が存在しており、Ｊａｂ１小複合体が抗ガン剤の効力に感受性を有しているため、上記Ｊａｂ１確認工程では、Ｊａｂ１小複合体の発現量を確認することによりＪａｂ１タンパク質の存在形態を確認することが好ましい。
【００２１】
さらに、本発明にかかる抗ガン剤効力の判定方法では、検体試料中に含まれるｐ２７タンパク質の発現を確認するｐ２７確認工程を含むことが好ましい。これは、上記Ｊａｂ１小複合体の存在形態には、複数のサブタイプがあり、抗ガン剤の効力に感受性を有しているタイプと感受性を有さないサブタイプとが存在するため、ｐ２７タンパク質の発現により、抗ガン剤の効力に感受性を有しているタイプをより正確に判定するためである。
【００２２】
上記Ｊａｂ１確認工程およびｐ２７確認工程の少なくとも一方では、電気泳動によりＪａｂ１小複合体またはタンパク質の発現量を確認すればよいが、上記Ｊａｂ１確認工程では、上記電気泳動として、ネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動が用いられることが好ましい。これは、タンパク質の変性により、Ｊａｂ１小複合体が解離してその存在を十分に確認できなくなることを回避するためである。
【００２３】
また、上記Ｊａｂ１確認工程では、上記Ｊａｂ１タンパク質に特異的に結合する抗体を用いて、上記抽出液からＪａｂ１小複合体を検出することが好ましい。同様に、上記ｐ２７確認工程では、上記ｐ２７タンパク質に特異的に結合する抗体を用いて、上記抽出液からｐ２７タンパク質を検出することが好ましい。ここで用いられる上記抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であればよい。
【００２４】
本発明にかかる抗ガン剤効力の判定方法が適用可能なガンとしては、特に限定されるものではないが、白血病であることが好ましく、慢性骨髄性白血病であることがより好ましい。また、本発明にかかる抗ガン剤効力の判定方法が適用可能な抗ガン剤としては、特に限定されるものではないが、チロシンキナーゼ阻害剤であることが好ましい。さらに、本発明にかかる抗ガン剤効力の判定方法は、抗ガン剤の投与前に実施されることが非常に好ましい。
【００２５】
本発明にかかる抗ガン剤効力判定キットは、上記抗ガン剤効力の判定方法を実施するために用いられるものであり、具体的には、例えば、ガン細胞を含む検体試料から調製された抽出液に含まれるＪａｂ１タンパク質の発現状態を確認する試薬群を含む構成を挙げることができる。上記試薬群には、Ｊａｂ１タンパク質に特異的に結合する抗体が含まれていることが好ましく、上記Ｊａｂ１複合体のうち、少なくともＪａｂ１小複合体が、ポリアクリルアミドゲル電気泳動用のマーカーとして上記試薬群に含まれていることが好ましい。
【００２６】
上記構成によれば、Ｊａｂ１タンパク質を判定の指標として用い、特に、Ｊａｂ１タンパク質の存在形態を確認するため、抗ガン剤に対するガンの感受性を評価することが可能となる。それゆえ、抗ガン剤の投与前に、当該抗ガン剤の効力があることを正確に判定することができる。
【００２７】
【発明の実施の形態】
本発明の実施の一形態について説明すれば、以下の通りである。なお、本発明は、これに限定されるものではない。
【００２８】
本発明は、慢性骨髄性白血病（Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ Ｌｅｕｋｅｍｉａ、ＣＭＬ）に対する抗ガン剤の効力（薬効）を、抗ガン剤の投与前に判定するために、ガン患者から得られる検体試料中に含まれるＪａｂ１タンパク質を指標として用いる。これにより、抗ガン剤の効力を使用前に判定・予測できるので、患者ごとに適格に抗ガン剤を事前選択することが可能になる。
【００２９】
以降の説明では、本発明にかかる判定方法の具体的な構成の一例、これに用いられる判定キットの一例、本発明の利用についてそれぞれ説明する。
【００３０】
（Ｉ）抗ガン剤効力の判定方法
本発明にかかる判定方法は、ガン治療に用いられる抗ガン剤の効力を判定する方法であって、検体試料中に含まれるＪａｂ１タンパク質を判定の指標として用いるものである。Ｊａｂ１タンパク質を指標として用いる具体的な手法は特に限定されるものではなく、Ｊａｂ１タンパク質の発現状態を確認できる方法であればよい。
【００３１】
＜Ｊａｂ１タンパク質およびＪａｂ１複合体＞
上記Ｊａｂ１タンパク質は、サイクリン依存性キナーゼ（Ｃｄｋ、細胞周期の制御に働いているタンパク質であるサイクリンに制御されてリン酸化を行う酵素）インヒビターであるｐ２７タンパク質と特異的に結合し、細胞内局在依存的にｐ２７タンパク質の分解に関与する因子として同定されている。ガン細胞の最大の特徴は異常増殖にあり、細胞周期、特にＧ１期制御機構の逸脱がガン化の一つの要因となる。上記ｐ２７タンパク質はＧ１期進行を負に制御する分子であり、様々なガンにおいてｐ２７タンパク質の発現量の低下とガンの悪性度とが逆相関することが示されている。
【００３２】
ここで、本発明者らは、種々の白血病由来細胞におけるＪａｂ１タンパク質の発現状態を確認したところ、Ｊａｂ１タンパク質は他の因子と複合体を形成しており、この複合体（Ｊａｂ１複合体）としては、分子量４５０ｋＤａのＣＯＰシグナロソーム複合体（Ｊａｂ１大複合体）か、または分子量１２０ｋＤａのＪａｂ１小複合体が存在していることを見出した。
【００３３】
このうち、Ｊａｂ１大複合体は、すべての細胞に共通して存在しているのに対して、Ｊａｂ１小複合体は、Ｂｃｒ−Ａｂｌ遺伝子を発現するガン細胞のみに存在するということが明らかとなった。このＢｃｒ−Ａｂｌ遺伝子は、ＣＭＬ患者の９０％以上でみられるフィラデルフィア染色体上にある遺伝子で、第９番染色体と第２２番染色体間の転座により生ずるキメラ遺伝子である。第９染色体にあるＡｂｌ遺伝子は、非受容体型のチロシンキナーゼをコードしており、ガン遺伝子であるｖ−ａｂｌ遺伝子にコードされるタンパク質は強いキナーゼ活性を有しているが、正常型のａｂｌ遺伝子にコードされるタンパク質はほとんどチロシンキナーゼ活性を有していない。Ｂｃｒ遺伝子は第２２番染色体上にある遺伝子で、セリンキナーゼをコードしている。これら遺伝子が融合してできたＢｃｒ−Ａｂｌ遺伝子は、強いセリン、チロシンキナーゼ活性を有するタンパク質（Ｐ２１０タンパク質）をコードすることが知られている。
【００３４】
また、Ｂｃｒ−Ａｂｌ遺伝子のコードするＰ２１０タンパク質のチロシンキナーゼ活性を阻害すると、上記Ｊａｂ１大複合体の量は変化しないが、Ｊａｂ１小複合体の量が減少することが明らかとなった。逆に、Ｂｃｒ−Ａｂｌ遺伝子の発現を誘導すると、上記Ｊａｂ１大複合体の量は変化しないが、Ｊａｂ１小複合体の量は増加することも明らかとなった。上記Ｊａｂ１小複合体には、さらに、電気泳動における移動度の異なる少なくとも２種類以上の形態が存在していることも明らかとなった（非特許文献５および後述する実施例１参照）。
【００３５】
上記の結果から、Ｊａｂ１複合体のうちＪａｂ１小複合体はＢｃｒ−Ａｂｌ遺伝子によって制御されているということが明らかとなった。
【００３６】
また、本発明者らは、抗ガン剤としてチロシンキナーゼ阻害剤を用いて、上記２種類のＪａｂ１小複合体と抗ガン剤の効力との関係を検討したところ、一方のＪａｂ１小複合体は、チロシンキナーゼ阻害剤を作用させると、その量が減少し、ｐ２７タンパク質の量が増加することが明らかとなった。これに対して、他方のＪａｂ１小複合体は、チロシンキナーゼ阻害剤を作用させると、Ｊａｂ１小複合体量が減少するにも関わらず、ｐ２７タンパク質の量は変化しないことが明らかとなった（非特許文献５および後述する実施例２参照）。
【００３７】
上記の結果から、Ｊａｂ１小複合体の存在形態の違いが、ｐ２７タンパク質の発現を制御する要因の一つであり、チロシンキナーゼ阻害剤に対する感受性に関与しているということが明らかとなった。
【００３８】
これら知見をまとめると、本発明者らによって、Ｊａｂ１タンパク質はＢｃｒ−Ａｂｌ遺伝子の下流、かつｐ２７遺伝子の上流で作用すること、さらにはＪａｂ１タンパク質の存在形態は複数存在し、そのうちの一つの形態とチロシンキナーゼ阻害剤の効力が対応することが見出された。
【００３９】
それゆえ、特に、チロシンキナーゼ阻害剤を抗ガン剤として用いる場合に、当該抗ガン剤をガン患者に投与する前に、ガン患者から得られた検体試料中のＪａｂ１タンパク質の存在形態を観察することにより、当該抗ガン剤の効力を判定することが可能となる。
【００４０】
＜判定方法の一例＞
本発明にかかる抗ガン剤効力の判定方法としては、上述したように、検体試料中のＪａｂ１タンパク質の存在形態を確認する方法であれば特に限定されるものではないが、具体的には、例えば、抽出液調製工程、分画工程、Ｊａｂ１確認工程、ｐ２７確認工程を含む判定方法を挙げることができる。
【００４１】
本発明で用いられる検体試料としては、ガン細胞を含むか、その可能性のある検体試料であれば特に限定されるものではないが、本発明は、ＣＭＬに特異的な抗ガン剤であるチロシンキナーゼ阻害剤を用いるため、末梢血あるいは骨髄液等の白血球を含む検体試料を好ましく挙げることができる。より具体的には、リンパ球（Ｔ細胞・Ｂ細胞）、顆粒球（好中球、好酸球、好塩基球）、単球並びにマクロファージ、マスト細胞、ナチュラルキラー細胞等の白血球や、造血幹細胞またはリンパ球幹細胞の少なくとも何れかを含む検定試料を挙げることができる。
【００４２】
本発明で用いられる検体試料としては、上記白血球が含まれている血液や骨髄液あるいは体液等をヒトから採取し、これをそのまま検体試料として用いてもよいし、採取した血液や体液に対して従来公知の処理を施すことによって、分子生物学的な分析を実施し易い分析用検体試料としてもよい。
【００４３】
上記抽出液調製工程は、上記検体試料から抽出液を調製する工程であれば特に限定されるものではない。具体的には、例えば、検体試料から分離された細胞を破壊し、その後適当な緩衝液に溶解または懸濁させることにより調製すればよい。上記細胞の破壊方法は特に限定されるものではなく、超音波破砕法等、公知の技術を用いることができる。
【００４４】
上記分画工程は、上記抽出液調製工程で得られた抽出液を分子量分画する工程であれば特に限定されるものではない。具体的には、例えば、ネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ）、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、アガロースゲル電気泳動等の電気泳動法；グリセロール等を用いた密度勾配法；限外濾過膜を用いた方法；ゲル濾過法；等を挙げることができる。これら各方法を実施する場合の条件や、分画した画分の回収方法等も特に限定されるものではない。
【００４５】
上記Ｊａｂ１確認工程は、当該抽出液に含まれるＪａｂ１タンパク質の存在形態を確認する工程であれば特に限定されるものではない。なお、本発明では、Ｊａｂ１確認工程において、上記分画工程で分画された抽出液を用いることが好ましい。これは、Ｊａｂ１タンパク質の存在形態をより正確に確認するためである。しかしながら、Ｊａｂ１確認工程では、Ｊａｂ１タンパク質の存在形態を十分に確認できるのであれば、必ずしも分画工程を経た抽出液を用いる必要はなく、粗抽出液を用いてもよい。
【００４６】
上記Ｊａｂ１確認工程におけるＪａｂ１タンパク質の存在形態を確認する手法としては、具体的には、Ｊａｂ１タンパク質が形成しているＪａｂ１複合体の分子量を基準とする手法を挙げることができる。上述したように、Ｊａｂ１複合体としては、分子量４５０ｋＤａのＪａｂ１大複合体か、または分子量１２０ｋＤａのＪａｂ１小複合体が存在している。このうち、Ｂｃｒ−Ａｂｌ遺伝子に制御されているのはＪａｂ１小複合体であるため、上記Ｊａｂ１確認工程では、Ｊａｂ１小複合体の発現量を確認することによりＪａｂ１タンパク質の存在形態を確認すればよい。
【００４７】
ここで、上記Ｊａｂ１小複合体の存在形態には、少なくとも二種類のサブタイプがあり、このうちチロシンキナーゼ阻害剤の効力に感受性を有しているタイプでは、チロシンキナーゼ阻害剤を作用させると、Ｊａｂ１小複合体の量が減少し、ｐ２７タンパク質の量が増加する。それゆえ、本発明にかかる判定方法では、Ｊａｂ１確認工程とともに、検体試料中に含まれるｐ２７タンパク質の発現を確認するｐ２７確認工程を実施することが好ましい。
【００４８】
Ｊａｂ１確認工程およびｐ２７確認工程におけるより具体的な確認手法としては、特に限定されるものではなく、公知の手法を用いることができるが、一般的には、電気泳動によりその発現量を確認する手法を好ましく用いることができる。このとき用いられる電気泳動法としては、上記分画工程で説明した各種電気泳動法を挙げることができるが、中でも、Ｊａｂ１確認工程ではＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥが用いられることが非常に好ましい。
【００４９】
上述したように、Ｊａｂ１確認工程で確認するＪａｂ１タンパク質は複合体を形成している。そのため、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのようにタンパク質を変性させて電気泳動する手法では、Ｊａｂ１複合体（Ｊａｂ１小複合体）の存在を十分に確認することが困難となる。それゆえ、本発明では、特に、Ｊａｂ１確認工程ではＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥを用いることが非常に好ましい。
【００５０】
上記Ｊａｂ１確認工程におけるＪａｂ１小複合体の検出手法は特に限定されるものではないが、一般的には、Ｊａｂ１タンパク質に特異的に結合する抗体（抗Ｊａｂ１抗体）を用いればよい。より具体的な検出手法としては、公知の手法であれば特に限定されるものではないが、例えば、酵素標識および／またはラジオアイソトープで標識した抗Ｊａｂ１抗体を用い、公知のウエスタンブロット法を用いて検出する手法を好ましく用いることができる。また、Ｊａｂ１確認工程で用いられる抽出液が密度勾配法で分画したサンプルである場合には、公知のドットブロット法で検出すればよい。
【００５１】
上記ｐ２７確認工程におけるｐ２７タンパク質の検出手法も特に限定されるものではないが、上記Ｊａｂ１確認工程と同様に、ｐ２７タンパク質に特異的に結合する抗体（抗ｐ２７抗体）を用いればよい。より具体的な検出手法も上記Ｊａｂ１確認工程と同様特に限定されるものではなく、公知のウエスタンブロット法等を用いることができる。
【００５２】
上記Ｊａｂ１確認工程で用いられる抗Ｊａｂ１抗体や、ｐ２７確認工程で用いられる抗ｐ２７抗体は、抗原であるＪａｂ１タンパク質やｐ２７タンパク質の少なくとも一部の構造を抗原決定基として認識し、これらタンパク質を免疫学的に確実に検出できる抗体であれば特に限定されるものではなく、ポリクローナル抗体であってもよいし、モノクローナル抗体であってもよい。中でも、より特異性の高いモノクローナル抗体が好ましい。
【００５３】
上記抗Ｊａｂ１抗体または抗ｐ２７抗体は、従来公知の方法で製造してもよいし、市販の抗体を用いてもよい。これら抗体の製造方法としては特に限定されるものではないが、例えば、モノクローナル抗体であれば、Ｊａｂ１タンパク質やｐ２７タンパク質で免疫したマウス脾臓リンパ球とマウスの骨髄細胞とを融合させてなるハイブリドーマにより産生する手法が挙げられる。また、ポリクローナル抗体であれば、Ｊａｂ１タンパク質やｐ２７タンパク質で免疫したウサギの免疫血清から精製する手法が挙げられる。
【００５４】
本発明にかかる判定方法の実施のタイミングは特に限定されるものではないが、原則として抗ガン剤がガン患者に投与される前に実施することが非常に好ましい。抗ガン剤投与前に、抗ガン剤の効力を判定することで、抗ガン剤の有効性を向上させることができることに加えて、ガン患者に対して、抗ガン剤による副作用を強いることを回避でき、さらには、本来必要の無い抗ガン剤によって多額の出費が生じるような事態も回避することが可能となる。
【００５５】
なお、本実施の形態で説明した上記判定方法には、他の工程（プロセス）や他の段階（ステップ）が含まれていてもよいことは言うまでも無い。また上述した各工程のうち、幾つかの工程は必要に応じて実施する順序を入れ替えても良い。
【００５６】
このように、本発明にかかる判定方法を用いれば、Ｊａｂ１タンパク質を判定の指標として用い、特に、Ｊａｂ１タンパク質の存在形態を確認することにより、チロシンキナーゼ阻害剤に対するガンの感受性を評価することが可能となる。それゆえ、抗ガン剤の投与前に、特異的抗ガン剤であるチロシンキナーゼ阻害剤の効力があることを正確に判定することが可能となる。
【００５７】
（ＩＩ）抗ガン剤効力判定キット
本発明にかかる抗ガン剤効力判定キットは、上述した抗ガン剤効力の判定方法を実施するために用いられるものであり、上記判定方法を実施するための必要最低限の試薬類や素材類が含まれていれば、その構成は特に限定されるものではないが、具体的には、例えば、Ｊａｂ１タンパク質の発現状態を確認する試薬群を含む構成を挙げることができる。
【００５８】
上記試薬群としては、例えば、ガン細胞を含む検体試料から抽出液を調製する際に好適な組成を有する緩衝液、Ｊａｂ１確認工程で用いられる抗Ｊａｂ１抗体、ｐ２７確認工程で用いられる抗ｐ２７抗体、分画工程を実施する場合に用いられる分画用試薬類（例えば、密度勾配法に用いられるグリセロール）等を挙げることができるが特に限定されるものではない。
【００５９】
ここで、本発明にかかる判定方法では、Ｊａｂ１確認工程やｐ２７確認工程において、Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥと、それに続くウエスタンブロットとを実施することが好ましい。そのため、本発明にかかる判定キットには、Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥにおけるマーカーとなるタンパク質や、上記抗Ｊａｂ１抗体および／または抗ｐ２７抗体等が含まれていることが好ましい。
【００６０】
上記マーカーとなるタンパク質としては、Ｊａｂ１複合体のうち、少なくとも分子量１２０ｋＤａのＪａｂ１小複合体が含まれていることが好ましく、さらには分子量４５０ｋＤａのＪａｂ１大複合体が含まれているとより好ましい。また、ｐ２７タンパク質も含まれていることが好ましい。これらタンパク質は、ＰＡＧＥで明確に分子量が分かる程度に精製されていればよい。また、これらタンパク質は、それぞれ独立してマーカーとして用いられてもよいし、それぞれを混合した混合マーカーとして用いられてもよい。
【００６１】
さらに、本発明にかかる判定キットには、上記試薬群以外の要素が含まれていてもよい。例えば、抽出液を分注するために好ましいサイズのマイクロチューブ等の素材（マテリアル）がキットに含まれていてもよい。また、本発明にかかる判定キットは、本発明を適用可能な抗ガン剤に組み合わせて用いられてもよい。すなわち、本発明にかかる判定キットには、チロシンキナーゼ阻害剤等の抗ガン剤が含まれていてもよい。この場合のキットは、判定キットというよりも、抗ガン剤使用キットと言うことができる。
【００６２】
このように、本発明にかかる判定方法をキット化することによって、ガン患者の抗ガン剤に対する効力の判定を、より簡便かつ正確に実施することが可能となる。それゆえ、本発明を臨床検査産業や医薬品産業等の産業レベルで利用することが可能となる。
【００６３】
（ＩＩＩ）本発明の利用
本発明者らは、ガン悪性化の負のマーカーであるｐ２７タンパク質（Ｃｄｋインヒビター）の発現を指標として、Ｂｃｒ−Ａｂｌ遺伝子が関与する細胞内シグナル伝達の経路を調べた結果、Ｊａｂ１タンパク質がＢｃｒ−Ａｂｌ遺伝子の下流でｐ２７遺伝子の上流で作用すること、さらにはＪａｂ１タンパク質の存在形態（Ｊａｂ１複合体）は複数存在し、そのうちの一つの形態と特異的抗ガン剤であるチロシンキナーゼ阻害剤の効力が対応することを見出した。それゆえ、本発明にかかる判定方法および／または判定キットの利用範囲は、上記Ｂｃｒ−Ａｂｌ遺伝子が関与するガンを化学療法で治療する場合に広く用いることができる。
【００６４】
具体的には、本発明が適用可能なガンとしては、活性化型チロシンキナーゼを有するガンであれば特に限定されるものではなく、例えば、白血病、小胞性肺ガン、前立腺ガン、乳ガン、すい臓ガン、軟部肉腫、消化器の固形ガンの一種ヒト消化管ストーマ細胞腫瘍（ＧＩＳＴ）等を挙げることができる。中でも、白血病が好ましく、その中でもＣＭＬがより好ましい。
【００６５】
また、本発明が適用可能な抗ガン剤としては、チロシンキナーゼ阻害剤であれば特に限定されるものではない。代表的なチロシンキナーゼ阻害剤としては、スイスのノバルティス社により開発・実用化された慢性骨髄性白血病治療薬、商品名「グリベック（登録商標）」（ＳＴＩ５７１）を挙げることができる。グリベックの化合物名はイマチニブメシレートで、ＣＭＬ患者のＢｃｒ−Ａｂｌ遺伝子にコードされているＰ２１０タンパク質のＡＴＰ結合部位に選択的に結合するように分子設計がなされている。その詳しい作用機序は不明であるが、Ｐ２１０タンパク質のチロシンキナーゼ活性を阻害し、アポトーシスを誘導白血球の異常増殖を抑えると考えられている。本発明を用いれば、このグリベックの抗ガン効力を正確に判定することが可能となる。また本発明は、その他アストロゼネガ社製商品名「イレッサ（登録商標）」、および日本ロッシュ商品名「ハーセプチン（登録商標）」等に適応可能である。
【００６６】
なお、本発明は、上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能である。それゆえ、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【００６７】
【実施例】
以下、本発明を実施例および図１〜図７に基づいてより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、各実施例において用いた細胞株および具体的な実験方法について先に説明する。
【００６８】
〔実験方法〕
（１）使用した白血病由来細胞株
ＨＬ６０：ヒト急性前骨髄球性白血病細胞株。Ｂｃｒ−Ａｂｌタンパク質の発現なし。Ｂｃｒ−Ａｂｌ阻害剤に耐性。
ＴＨＰ１０１：ヒト急性単球性白血病細胞株。Ｂｃｒ−Ａｂｌタンパク質の発現なし。Ｂｃｒ−Ａｂｌ阻害剤に耐性。
ＨＥＬ：ヒト赤血球性白血病細胞株。Ｂｃｒ−Ａｂｌタンパク質の発現なし。Ｂｃｒ−Ａｂｌ阻害剤に耐性。
ＣＭＫ：ヒト巨核球性白血病細胞株。Ｂｃｒ−Ａｂｌタンパク質の発現なし。Ｂｃｒ−Ａｂｌ阻害剤に耐性。
ＫＨ：ヒト骨髄球性由来細胞株。Ｂｃｒ−Ａｂｌタンパク質の発現なし。Ｂｃｒ−Ａｂｌ阻害剤に耐性。
Ｋ５６２：ヒトＣＭＬ由来細胞株。Ｂｃｒ−Ａｂｌタンパク質の発現あり。Ｂｃｒ−Ａｂｌ阻害剤に感受性。
ＭＥＧ：ヒトＣＭＬ由来細胞株。Ｂｃｒ−Ａｂｌタンパク質の発現あり。Ｂｃｒ−Ａｂｌ阻害剤に感受性。
ＴＳ９．２２：ヒトＣＭＬ由来細胞株。Ｂｃｒ−Ａｂｌタンパク質の発現あり。Ｂｃｒ−Ａｂｌ阻害剤に感受性。
ＭＯＬＭ１：ヒトＣＭＬ由来細胞株。Ｂｃｒ−Ａｂｌタンパク質の発現あり。Ｂｃｒ−Ａｂｌ阻害剤に感受性。
ＫＹＯ−１：ヒトＣＭＬ由来細胞株。Ｂｃｒ−Ａｂｌタンパク質の発現あり。Ｂｃｒ−Ａｂｌ阻害剤に耐性。Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ９： ９２１−９２６，（１９８５）参照。
ＢＡＦ３：マウスｐｒｏ−Ｂ細胞株。
ＴｏｎＢ：ＢＡＦ３由来で、テトラサイクリンまたはそのアナログであるＤｏｘｙｃｙｃｌｉｎ（Ｄｏｘ．）処理により、Ｂｃｒ−Ａｂｌ遺伝子の発現を誘導することができる細胞株。文献Ｋｌｕｃｈｅｒ ＫＭ， Ｌｏｐｅｚ ＤＶ， Ｄａｌｅｙ ＧＱ． Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｍａｉｎｔａｉｎｓ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｓｔａｔｅ ｉｎ ＢａＦ３ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ＢＣＲ／ＡＢＬ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ． Ｂｌｏｏｄ ９１：３９２７−３９３４，１９９８参照。
【００６９】
（２）実験に使用した阻害剤
ＭＧ１３２：プロテアソーム阻害剤である。
ＬＬＭ：カルパイン阻害剤である。
ＬＭＢ：核外移行阻害剤である。
Ｃｕｒ．：ＣＳＮ付随タンパクキナーゼ阻害剤である。
Ｈ８９：Ａキナーゼ阻害剤である。
Ｓｔａｕ．：タンパクキナーゼ阻害剤である。
ＰＤ：ＭＡＰキナーゼ阻害剤である。
Ｗｏｒｔ．：ＰＩ３キナーゼ阻害剤である。
【００７０】
（３）実験方法
〔細胞抽出液の調製〕
検体試料中の細胞を遠心分離によって集め、生理食塩水で洗浄し、最少量の抽出緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ， ｐＨ８．０；１２０ｍＭ ＮａＣｌ， １ｍＭ ＥＤＴＡ， ０．１％ Ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ）を加えてよく懸濁し溶解させる。遠心分離にて不可溶性の成分を除き、上澄みの可溶性成分を細胞抽出液とした。
【００７１】
〔Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ・ＳＤＳ−ＰＡＧＥ・ウエスタンブロッティング・ノーザンブロッティング〕
標準の方法で行った。
【００７２】
〔グリセロール直線密度勾配による分画〕
１ｍｌ細胞抽出液を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）；１２０ｍＭＮａＣｌ；１ｍＭ ＥＤＴＡと１ｍＭ β−ＭＥを含有する１０％〜４０％のグリセロールのグラジェントに供した。４℃、２７，０００ｒｐｍで２４時間遠心分離後（ベックマン Ｔｉ４０ローター使用）、底部から０．５ｍｌをフラクションとして回収した。
【００７３】
〔チロシンキナーゼ阻害剤による処理〕
１〜２μＭのＳＴＩ５７１を、細胞培養用の培地に直接加え処置した。
【００７４】
〔実施例１：各種白血病由来細胞株におけるｐ２７タンパク質の量、およびＪａｂ１複合体の関係の解析〕
白血病由来細胞株として、ＨＬ６０、ＫＹＯ−１、ＴＨＰ１０１、Ｋ５６２、ＨＥＬ、Ｍａｋ３、ＣＭＫ、およびＫＨを用いた。これら細胞から、細胞抽出液を調製し、ｐ２７タンパク質、Ｊａｂ１タンパク質、Ｓｋｐ２タンパク質、β―アクチンの発現量をウエスタンブロッティング法により検出した。その結果を図１Ａに示す。なお、Ｓｋｐ２タンパク質、β―アクチンおよびＧＡＰＤＨタンパク質は、解析サンプルが等量であることの指標である。
【００７５】
次に、上記白血病由来細胞株のうち、ＨＬ６０、ＫＹＯ−１、Ｋ５６２、およびＨＥＬについて、これら細胞からＲＮＡを抽出し、ｐ２７タンパク質、Ｊａｂ１タンパク質、ＧＡＰＤＨタンパク質のｍＲＮＡ発現量をノーザンブロッティングにより検出した。その結果を図１Ｂに示す。なお、ＧＡＰＤＨタンパク質は解析サンプルが等量であることの指標である。
【００７６】
次に、上記白血病由来細胞株のうち、Ｋ５６２およびＫＹＯ−１について、これら細胞から細胞抽出液を調製し、１０〜４０％グリセロール直線密度勾配法を用いて細胞抽出液を分画した。フラクションＮｏ．１１、１３、１５、１７および１９の各画分に含まれるＪａｂ１タンパク質について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した後、ウエスタンブロッティング法により検出した。その結果を図１Ｃに示す。
【００７７】
次に、Ｋ５６２から細胞抽出液を調製し、Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥを行った後、抗Ｊａｂ１抗体を用いてＪａｂ１複合体を検出した。その結果を図１Ｄの左側のパネルに示す。また、上記と同様、１０〜４０％グリセロール直線密度勾配法を用いて分画した細胞抽出液のフラクションＮｏ．１１、１３、１５、１７および１９の各画分について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した。その結果を図１Ｄの右上パネルに示す。さらに、同じフラクションＮｏ．の各画分をＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥにかけ、抗Ｊａｂ１抗体を用いてウエスタンブロッティング法によってＪａｂ１複合体を検出した。その結果を図１Ｄの右下パネルに示す。なお、図１Ｄにおける“ＣＯＰ９ ｃｏｍｐｌｅｘ”がＪａｂ１複合体のうちＪａｂ１大複合体を示し、“Ｓｍａｌｌ ｃｏｍｐｌｅｘ”がＪａｂ１小複合体を示す。
【００７８】
図１Ａ〜Ｄの結果から、種々の白血病由来細胞間でｐ２７タンパク質の発現量に大きな差異があること、および、この差異はｍＲＮＡに依存していない、つまり転写レベルの制御は受けていないことが明らかとなった。したがって、ｐ２７タンパク質の量は、発現レベルで何らかの制御を受けていることがわかる。
【００７９】
〔実施例２：白血病由来細胞間におけるＪａｂ１小複合体量の比較〕
実施例１で調製した各種白血病由来細胞株の細胞抽出液について、Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥを実施した後、抗Ｊａｂ１抗体を用いてウエスタンブッロッティングを行った。その結果を図２Ａに示す。なお、この図でも“ＣＯＰ９ ｃｏｍｐｌｅｘ”がＪａｂ１大複合体を示し、“Ｓｍａｌｌ ｃｏｍｐｌｅｘ”がＪａｂ１小複合体を示す。
【００８０】
次に、白血病由来細胞株のうち、ＣＭＬ由来細胞株として、Ｋ５６２、ＫＹＯ−１、ＭＥＧ、ＴＳ９．２２、およびＭＯＬＭ１を選択するとともに、非ＣＭＬ由来細胞株として、ＣＭＫおよびＨＥＬを選択し、これら細胞から細胞抽出液を調製した。得られた細胞抽出液についてＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥを実施した後、抗Ｊａｂ１抗体を用いてウエスタンブロッティングを行った。その結果を図２Ｂの上から１段目および２段目のパネルに示す。
【００８１】
また、上記と同じ細胞抽出液を用いて、β−アクチン、Ｊａｂ１タンパク質、ｐ２７タンパク質、Ｃｕｌ１タンパク質、Ｂｃｒ−Ａｂｌタンパク質（Ｐ２１０タンパク質）、ｃＡｂｌタンパク質の発現量について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した後、ウエスタンブロッティング法を用いて解析した。その結果を図２Ｂの上から３段目〜７段目のパネルに示す。
【００８２】
図２Ａ・Ｂの結果から、ＣＭＬ由来細胞株においては、Ｊａｂ１複合体のうち、Ｊａｂ１小複合体の発現量は、非ＣＭＬ由来細胞株に比して多いということが明らかとなった。また、Ｊａｂ１小複合体には、少なくとも２種類の形態が存在することが明らかとなった。
【００８３】
また、各細胞のチロシンキナーゼ阻害剤に対する感受性を調べた結果、Ｋ５６２、ＭＥＧ、ＭＯＬＭ１はチロシンキナーゼ阻害剤感受性であり、ＫＹＯ−１、ＣＭＫ、ＨＥＬはチロシンキナーゼ阻害剤に耐性を示した。この結果とＪａｂ１小複合体の形態とを対比すると、Ｋ５６２タイプのＪａｂ１小複合体を持つ細胞のみが、チロシンキナーゼ阻害剤に感受性であるということがわかった。
【００８４】
〔実施例３：ＣＭＬ由来細胞Ｋ５６２株とＫＹＯ−１株のチロシンキナーゼ活性阻害剤への応答〕
ＣＭＬ由来細胞株のうち、Ｂｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼ感受性株のＫ５６２と、耐性株ＫＹＯ−１とを選択し、これら細胞をＤＭＳＯまたはＳＴ５７１（Ｂｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼ特異的阻害剤）で８時間処理した後、細胞液を調製した。各細胞抽出液をＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥにかけ、抗Ｊａｂ１抗体を用いたウエスタンブロッティング法によりＪａｂ１複合体の変化を解析した。その結果を図３Ａの左側１段目および２段目のパネルに示す。
【００８５】
また同じ細胞抽出液を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した後、チロシンリン酸化レベルをウエスタンブロッティング法により解析した。その結果を図３Ａの左側３段目のパネルに示す。同様に、同じ細胞抽出液を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した後、Ｊａｂ１タンパク質発現量をウエスタンブロッティング法により解析した。その結果を図３Ａ左側４段目のパネルに示す。
【００８６】
さらに、Ｋ５６２をＳＴ５７１で８時間処理した後、ＳＴ５７１を除き、タンパク質合成阻害剤であるシクロヘキシミド（ＣＨＸ）の存在下で、２時間および３時間培養した。このときのＪａｂ１複合体の変化、チロシンリン酸化レベル、並びにＪａｂ１タンパク質の発現量を解析した。その結果を、それぞれ図３Ａの右側の各パネルに示す。なお、図３Ａ右側の上から１段目および２段目のパネルがＪａｂ１複合体の変化の結果であり、３段目のパネルがチロシンリン酸化レベルの結果であり、４段目がＪａｂ１タンパク質の発現量の結果である。
【００８７】
次に、上記細胞抽出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ｐ２７タンパク質、Ｃｕｌ１タンパク質、Ｓｋｐ２タンパク質、Ｂｃｒ−Ａｂｌタンパク質、ｃＡｂｌタンパク質、およびγ−Ｔｕｂタンパク質の発現量をウエスタンブロッティング法により解析した。その結果を図３Ｂに示す。なお、γ−Ｔｕｂタンパク質は解析サンプルが等量であることの指標である。
【００８８】
図３の結果から、Ｋ５６２およびＫＹＯ−１の両株ともに、Ｂｃｒ−Ａｂｌ遺伝子産物のチロシンキナーゼ活性を阻害すれば、Ｊａｂ１小複合体の量が減少するということが明らかとなった。またこのとき、ガン悪性化の負のマーカーであるｐ２７タンパク質については、Ｋ５６２株のみが増加した。つまり、チロシンキナーゼ阻害剤感受性株であるＫ５６２株のみにおいて、ガンの悪性度が低くなり、チロシンキナーゼ阻害剤の効力があったことが確認できた。
【００８９】
以上の結果から、Ｊａｂ１小複合体の存在形態とチロシンキナーゼ阻害剤の効力が対応することがわかり、チロシンキナーゼ阻害剤等の抗ガン剤を投与する前にガン細胞由来のＪａｂ１小複合体の存在形態（Ｋ５６２株タイプか、またはＫＹＯ−１株タイプか）を調べることによって、チロシンキナーゼ阻害剤の効力を判定することが可能であるといえる。
【００９０】
〔実施例４：Ｂｃｒ−Ａｂｌタンパク質とＪａｂ１複合体の関係〕
ＢＡＦ３およびＴｏｎＢを用い、これら細胞をＩＬ３の非存在下かつＤｏｘ．の存在下、またはＤｏｘ．の非存在下で５時間処理した。その後、それぞれの細胞を回収して細胞抽出液を調製し、Ｊａｂ１複合体の変化、γ−Ｔｕｂ、Ｊａｂ１タンパク質、ｐ２７タンパク質、Ｂｃｒ−Ａｂｌタンパク質、ｃＡｂｌタンパク質の発現量をウエスタンブロッティング法により解析した。その結果を図４に示す。
【００９１】
図４の結果から明らかなように、Ｂｃｒ−Ａｂｌタンパク質の発現誘導によって、Ｊａｂ１小複合体の量が増加しているということがわかった。
【００９２】
〔実施例５：Ｊａｂ１小複合体を制御するシグナル伝達経路の解析〕
Ｋ５６２細胞をＭＧ１３２、ＬＬＭ、ＬＭＢ、Ｃｕｒ．、Ｈ８９、Ｓｔａｕ．、ＰＤおよびＷｏｒｔ．で８時間処理した後、細胞抽出液を調製した。これを用いて、Ｊａｂ１複合体の変化、Ｊａｂ１タンパク質、ｐ２７タンパク質、γ−Ｔｕｂタンパク質、Ｃｄｋ２タンパク質、Ｃｕｌタンパク質の発現量をウエスタンブロッティング法により解析した。その結果を図５Ａに示す。なお、Ｃｄｋ２タンパク質およびＣｕｌタンパク質は、解析サンプルが等量であることの指標である。
【００９３】
また、ＫＹＯ−１を用いて同様の処理を行い、ｐ２７タンパク質発現量をウエスタンブロッティング法により解析した。その結果を図５Ｂに示す。
【００９４】
さらに、Ｋ５６２をＳＴＩ単独、ＰＤ単独、Ｗｏｒｔ．単独、ＰＤとＷｏｒｔ．の組合せ、ＳＴＩとＰＤの組合せおよびＳＴＩとＷｏｒｔ．の組合せで８時間処理し、Ｊａｂ１複合体の変化をウエスタンブロッティング法により解析した。その結果を図５Ｃに示す。
【００９５】
図５の結果から明らかなように、Ｊａｂ１小複合体はＭＡＰＫ経路およびＰＩ３Ｋ経路の阻害により減少するということがわかった。
【００９６】
実施例１〜５の結果より、ＣＭＬにおいては、Ｂｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼが、恒常的にＭＡＰＫ経路およびＰＩ３Ｋ経路を活性化する。その結果、細胞内でのＪａｂ１小複合体の量が増加していた。またＪａｂ１小複合体の量とｐ２７タンパク質発現量の間には、逆相関の関係が認められた。本発明者らは、これまでに、Ｊａｂ１タンパク質を過剰発現すると、Ｊａｂ１小複合体の量が増加し、ｐ２７タンパク質の分解が誘導されること、およびＪａｂ１小複合体によるｐ２７タンパク質の分解は、核外移行阻害剤レプトマイシンＢ（ＬＭＢ）によって阻害されるということを明らかにしている（非特許文献４及び５参照）。これらの結果をあわせみると、増加したＪａｂ１小複合体が、ｐ２７タンパク質の分解を促進している可能性がある。よって、Ｂｃｒ−Ａｂｌタンパク質によるＪａｂ１複合体の制御が、細胞のガン化の一因になっていると考えられ、この知見を利用することにより、本発明にかかる抗ガン剤効力の判定方法を実現することが可能となる。
【００９７】
【発明の効果】
以上のように、本発明では、Ｊａｂ１タンパク質を指標として用い、このＪａｂ１タンパク質の存在形態を確認することによって、抗ガン剤の効力を判定するようになっている。それゆえ、本発明によれば、抗ガン剤の有効性を高めることができるだけでなく、ガン患者に不必要な抗ガン剤投与による副作用を回避させることができ、さらには、多額の出費を防ぐことも可能になるという効果を奏する。
【００９８】
したがって、本発明は、各種臨床検査産業や医薬品産業、研究用試薬産業に好適に利用できるだけでなく、医療分野にも応用することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１Ａは、種々の白血病由来細胞株中におけるタンパク質の発現量を、ウエスタンブロッティング法により検出した結果を示す図であり、Ｂは、種々の白血病由来細胞中における各タンパク質のｍＲＮＡ発現量を、ノーザンブロッティングにより検出した結果を示す図であり、Ｃは、Ｋ５６２およびＫＹＯ−１からの細胞抽出液を分画した各画分に含まれるＪａｂ１タンパク質を、ウエスタンブロッティング法により検出した結果を示す図であり、Ｄは、Ｋ５６２の細胞抽出液、および上記画分中のＪａｂ１複合体をウエスタンブロッティング法により検出した結果を示す図である。
【図２】
図２Ａは、各細胞抽出液を、抗Ｊａｂ１抗体を用いてウエスタンブッロッティングを行った結果を示す図であり、図２Ｂは、５種類のＣＭＬ細胞株および、２種類の非ＣＭＬ細胞から得られた細胞抽出液中のＪａｂ１タンパク質およびその他のタンパク質をウエスタンブロッティング法で検出した結果を示す図である。
【図３】
チロシンキナーゼ阻害剤で処理した各種細胞抽出液と、チロシンキナーゼ阻害剤で処理しない細胞抽出液について、ウエスタンブロッティング法によりＪａｂ１複合体の変化、チロシンリン酸化レベル、Ｊａｂ１タンパク質の発現量、および各タンパク質の発現量を解析した結果を示す図である。
【図４】
マウス由来のｐｒｏ−Ｂ細胞株ＢＡＦ３およびＴｏｎＢ細胞を用いて、Ｂｃｒ−Ａｂｌ遺伝子の誘導とＪａｂ１複合体との関係を解析した結果を示す図である。
【図５】
図５Ａは、Ｋ５６２を各種薬剤で処理した細胞抽出液について、Ｊａｂ１複合体の変化、および各タンパク質の発現量をウエスタンブロッティング法により解析した結果を示す図であり、図５Ｂは、ＫＹＯ−１を各種薬剤で処理した細胞抽出液について、ｐ２７タンパク質の発現量をウエスタンブロッティング法により解析した結果を示す図であり、図５Ｃは、Ｋ５６２を各種薬剤の組合せで処理した細胞抽出液について、Ｊａｂ１複合体の変化を、ウエスタンブロッティング法により解析した結果を示す図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、ガン患者に投与する抗ガン剤が有効であるかを判別する抗ガン剤効力の判定方法およびこれに用いられる判定キットに関するものであり、例えば、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の治療に用いられるチロシンキナーゼ阻害剤が有効であるか否かを判別するために特に好ましく用いられる判定方法およびこれを実施するために用いられる判定キットに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ガンの治療においては、抗ガン剤を用いた化学療法が大きな割合を占めている。しかしながら、抗ガン剤の効力の予測が困難であること、副作用として患者の精神的・肉体的苦痛が大きいこと等が大きな問題となっている。それゆえ、あるガン患者に対して特定の抗ガン剤が有効であるか否か、すなわち、抗ガン剤の効力の予測は、化学療法において重要なポイントとなる。
【０００３】
例えば、慢性骨髄性白血病（以下、適宜ＣＭＬと略す）においては、特異的な抗ガン剤としてチロシンキナーゼ阻害剤が開発されている。このチロシンキナーゼ阻害剤は、ＣＭＬにおいてガン細胞に生じた遺伝子異常をターゲットとし、正常細胞への影響を最小限に留める効果を有しており、代表的なものとして、グリベック（ノバルティス社 登録商標）が知られている。
【０００４】
上記チロシンキナーゼ阻害剤の作用について具体的に説明すると、ＣＭＬの原因因子としてＢｃｒ−Ａｂｌ遺伝子が知られており、この遺伝子はＰ２１０タンパク質をコードしている。上記チロシンキナーゼ阻害剤は、このＰ２１０タンパク質のチロシンキナーゼ活性を阻害し、アポトーシスを誘導することによって、白血球の異常増殖を抑制する。
【０００５】
それゆえ、抗ガン剤としてチロシンキナーゼ阻害剤を用いる場合、あるＣＭＬ患者に対してチロシンキナーゼ阻害剤が有効であるか否かを判別する方法、すなわちチロシンキナーゼ阻害剤の効力の判別方法は、従来では、Ｂｃｒ−Ａｂｌ遺伝子の存在およびその発現によりなされていた（例えば、非特許文献１参照）。
【０００６】
ところで、最近、チロシンキナーゼ阻害剤に対して耐性を有する突然変異を持ったＢｃｒ−Ａｂｌ変異遺伝子や、多重突然変異の結果、Ｂｃｒ−Ａｂｌ遺伝子がコードするＰ２１０タンパク質の活性には依存しないガン細胞の例が報告されている（例えば、非特許文献２参照）。これは、ガン細胞は遺伝的変異を蓄積しつづける場合が多いことによると考えられる。
【０００７】
また、本発明者等は、Ｊａｂ１タンパク質がｐ２７タンパク質と特異的に結合すること、およびＪａｂ１タンパク質がｐ２７タンパク質の細胞内局在的な分解に関与しているとの知見を報告した（例えば非特許文献３および４参照）。
【０００８】
なお、本発明者らは、Ｂｃｒ−ＡｂｌによってＪａｂ１の発現が制御を受け、ｐ２７の分解誘導には働くことがガン化の一因となる可能性を示す知見を報告している（非特許文献５参照）。
【０００９】
【非特許文献１】
Ｍａｎｌｅｙ ＰＷ ｅｔ ａｌ． Ｅｕｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ． ２００２ Ｓｅｐ；３８ Ｓｕｐｐｌ ５：Ｓ１９−２７．
【００１０】
【非特許文献２】
Ｈｏｃｈｈａｕｓ Ａ ｅｔ ａｌ． Ｌｅｕｋｅｍｉａ． ２００２ Ｎｏｖ；１６（１１）：２１９０−６．
【００１１】
【非特許文献３】
Ｔｏｍｏｄａ Ｋ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ． １９９９ Ｍａｒ １１；３９８（６７２３）：１６０−５．
【００１２】
【非特許文献４】
Ｔｏｍｏｄａ Ｋ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２００２ Ｊａｎ １８；２７７（３）：２３０２−１０．
【００１３】
【非特許文献５】
第２５回日本分子生物学会年会プログラム・講演要旨集、２Ｐ−０７６０（第２５回日本分子生物学会年会組織委員会、２００２年１１月２５日発行）
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
上記のように、Ｂｃｒ−Ａｂｌ変異遺伝子の存在やＰ２１０タンパク質の活性に依存しないガン細胞の存在は、Ｂｃｒ−Ａｂｌ遺伝子を指標とする上記従来の判別方法を不正確なものとすることになる。
【００１５】
したがって、上記従来の判別方法を用いた場合、本来チロシンキナーゼ阻害剤に陰性の患者が、誤って陽性と判断される可能性が生じる。そのため、その患者にチロシンキナーゼ阻害剤を投与しても効力が得られないにも関わらず、不必要な投与がなされてしまう。このような事態は、抗ガン剤の有効性を低下させるだけでなく、患者に対して抗ガン剤による副作用や多額の出費を強いることになる。
【００１６】
本発明は上記課題に鑑みなされたものであって、その目的は、抗ガン剤であるチロシンキナーゼ阻害剤の効力を、より正確に判定することが可能な抗ガン剤効力の判定方法およびこれに用いられる判定キットを提供することにある。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題に鑑み鋭意検討した結果、Ｃｄｋインヒビターｐ２７タンパク質に特異的に結合する分子であるＪａｂ１タンパク質に、複数の存在形態があり、そのうちの一つの形態が、チロシンキナーゼ阻害剤の効力と対応することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１８】
すなわち、本発明にかかる抗ガン剤効力の判定方法は、上記の課題を解決するために、ガン治療に用いられる抗ガン剤の効力を判定する方法であって、検体試料中に含まれるＪａｂ１タンパク質を判定の指標として用いることを特徴としている。
【００１９】
上記抗ガン剤効力の判定方法では、ガン細胞を含む検体試料から抽出液を調製する抽出液調製工程と、当該抽出液に含まれるＪａｂ１タンパク質の存在形態を確認するＪａｂ１確認工程とを含むことが好ましく、さらには、上記抽出液を分子量分画する分画工程を含んでおり、上記Ｊａｂ１確認工程では、分画された抽出液を用いることがより好ましい。
【００２０】
上記Ｊａｂ１確認工程では、上記Ｊａｂ１タンパク質が形成しているＪａｂ１複合体の分子量を基準として、Ｊａｂ１タンパク質の存在形態を確認することが好ましい。ここで、上記Ｊａｂ１複合体としては、分子量４５０ｋＤａのＪａｂ１大複合体か、または分子量１２０ｋＤａのＪａｂ１小複合体が存在しており、Ｊａｂ１小複合体が抗ガン剤の効力に感受性を有しているため、上記Ｊａｂ１確認工程では、Ｊａｂ１小複合体の発現量を確認することによりＪａｂ１タンパク質の存在形態を確認することが好ましい。
【００２１】
さらに、本発明にかかる抗ガン剤効力の判定方法では、検体試料中に含まれるｐ２７タンパク質の発現を確認するｐ２７確認工程を含むことが好ましい。これは、上記Ｊａｂ１小複合体の存在形態には、複数のサブタイプがあり、抗ガン剤の効力に感受性を有しているタイプと感受性を有さないサブタイプとが存在するため、ｐ２７タンパク質の発現により、抗ガン剤の効力に感受性を有しているタイプをより正確に判定するためである。
【００２２】
上記Ｊａｂ１確認工程およびｐ２７確認工程の少なくとも一方では、電気泳動によりＪａｂ１小複合体またはタンパク質の発現量を確認すればよいが、上記Ｊａｂ１確認工程では、上記電気泳動として、ネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動が用いられることが好ましい。これは、タンパク質の変性により、Ｊａｂ１小複合体が解離してその存在を十分に確認できなくなることを回避するためである。
【００２３】
また、上記Ｊａｂ１確認工程では、上記Ｊａｂ１タンパク質に特異的に結合する抗体を用いて、上記抽出液からＪａｂ１小複合体を検出することが好ましい。同様に、上記ｐ２７確認工程では、上記ｐ２７タンパク質に特異的に結合する抗体を用いて、上記抽出液からｐ２７タンパク質を検出することが好ましい。ここで用いられる上記抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であればよい。
【００２４】
本発明にかかる抗ガン剤効力の判定方法が適用可能なガンとしては、特に限定されるものではないが、白血病であることが好ましく、慢性骨髄性白血病であることがより好ましい。また、本発明にかかる抗ガン剤効力の判定方法が適用可能な抗ガン剤としては、特に限定されるものではないが、チロシンキナーゼ阻害剤であることが好ましい。さらに、本発明にかかる抗ガン剤効力の判定方法は、抗ガン剤の投与前に実施されることが非常に好ましい。
【００２５】
本発明にかかる抗ガン剤効力判定キットは、上記抗ガン剤効力の判定方法を実施するために用いられるものであり、具体的には、例えば、ガン細胞を含む検体試料から調製された抽出液に含まれるＪａｂ１タンパク質の発現状態を確認する試薬群を含む構成を挙げることができる。上記試薬群には、Ｊａｂ１タンパク質に特異的に結合する抗体が含まれていることが好ましく、上記Ｊａｂ１複合体のうち、少なくともＪａｂ１小複合体が、ポリアクリルアミドゲル電気泳動用のマーカーとして上記試薬群に含まれていることが好ましい。
【００２６】
上記構成によれば、Ｊａｂ１タンパク質を判定の指標として用い、特に、Ｊａｂ１タンパク質の存在形態を確認するため、抗ガン剤に対するガンの感受性を評価することが可能となる。それゆえ、抗ガン剤の投与前に、当該抗ガン剤の効力があることを正確に判定することができる。
【００２７】
【発明の実施の形態】
本発明の実施の一形態について説明すれば、以下の通りである。なお、本発明は、これに限定されるものではない。
【００２８】
本発明は、慢性骨髄性白血病（Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ Ｌｅｕｋｅｍｉａ、ＣＭＬ）に対する抗ガン剤の効力（薬効）を、抗ガン剤の投与前に判定するために、ガン患者から得られる検体試料中に含まれるＪａｂ１タンパク質を指標として用いる。これにより、抗ガン剤の効力を使用前に判定・予測できるので、患者ごとに適格に抗ガン剤を事前選択することが可能になる。
【００２９】
以降の説明では、本発明にかかる判定方法の具体的な構成の一例、これに用いられる判定キットの一例、本発明の利用についてそれぞれ説明する。
【００３０】
（Ｉ）抗ガン剤効力の判定方法
本発明にかかる判定方法は、ガン治療に用いられる抗ガン剤の効力を判定する方法であって、検体試料中に含まれるＪａｂ１タンパク質を判定の指標として用いるものである。Ｊａｂ１タンパク質を指標として用いる具体的な手法は特に限定されるものではなく、Ｊａｂ１タンパク質の発現状態を確認できる方法であればよい。
【００３１】
＜Ｊａｂ１タンパク質およびＪａｂ１複合体＞
上記Ｊａｂ１タンパク質は、サイクリン依存性キナーゼ（Ｃｄｋ、細胞周期の制御に働いているタンパク質であるサイクリンに制御されてリン酸化を行う酵素）インヒビターであるｐ２７タンパク質と特異的に結合し、細胞内局在依存的にｐ２７タンパク質の分解に関与する因子として同定されている。ガン細胞の最大の特徴は異常増殖にあり、細胞周期、特にＧ１期制御機構の逸脱がガン化の一つの要因となる。上記ｐ２７タンパク質はＧ１期進行を負に制御する分子であり、様々なガンにおいてｐ２７タンパク質の発現量の低下とガンの悪性度とが逆相関することが示されている。
【００３２】
ここで、本発明者らは、種々の白血病由来細胞におけるＪａｂ１タンパク質の発現状態を確認したところ、Ｊａｂ１タンパク質は他の因子と複合体を形成しており、この複合体（Ｊａｂ１複合体）としては、分子量４５０ｋＤａのＣＯＰシグナロソーム複合体（Ｊａｂ１大複合体）か、または分子量１２０ｋＤａのＪａｂ１小複合体が存在していることを見出した。
【００３３】
このうち、Ｊａｂ１大複合体は、すべての細胞に共通して存在しているのに対して、Ｊａｂ１小複合体は、Ｂｃｒ−Ａｂｌ遺伝子を発現するガン細胞のみに存在するということが明らかとなった。このＢｃｒ−Ａｂｌ遺伝子は、ＣＭＬ患者の９０％以上でみられるフィラデルフィア染色体上にある遺伝子で、第９番染色体と第２２番染色体間の転座により生ずるキメラ遺伝子である。第９染色体にあるＡｂｌ遺伝子は、非受容体型のチロシンキナーゼをコードしており、ガン遺伝子であるｖ−ａｂｌ遺伝子にコードされるタンパク質は強いキナーゼ活性を有しているが、正常型のａｂｌ遺伝子にコードされるタンパク質はほとんどチロシンキナーゼ活性を有していない。Ｂｃｒ遺伝子は第２２番染色体上にある遺伝子で、セリンキナーゼをコードしている。これら遺伝子が融合してできたＢｃｒ−Ａｂｌ遺伝子は、強いセリン、チロシンキナーゼ活性を有するタンパク質（Ｐ２１０タンパク質）をコードすることが知られている。
【００３４】
また、Ｂｃｒ−Ａｂｌ遺伝子のコードするＰ２１０タンパク質のチロシンキナーゼ活性を阻害すると、上記Ｊａｂ１大複合体の量は変化しないが、Ｊａｂ１小複合体の量が減少することが明らかとなった。逆に、Ｂｃｒ−Ａｂｌ遺伝子の発現を誘導すると、上記Ｊａｂ１大複合体の量は変化しないが、Ｊａｂ１小複合体の量は増加することも明らかとなった。上記Ｊａｂ１小複合体には、さらに、電気泳動における移動度の異なる少なくとも２種類以上の形態が存在していることも明らかとなった（非特許文献５および後述する実施例１参照）。
【００３５】
上記の結果から、Ｊａｂ１複合体のうちＪａｂ１小複合体はＢｃｒ−Ａｂｌ遺伝子によって制御されているということが明らかとなった。
【００３６】
また、本発明者らは、抗ガン剤としてチロシンキナーゼ阻害剤を用いて、上記２種類のＪａｂ１小複合体と抗ガン剤の効力との関係を検討したところ、一方のＪａｂ１小複合体は、チロシンキナーゼ阻害剤を作用させると、その量が減少し、ｐ２７タンパク質の量が増加することが明らかとなった。これに対して、他方のＪａｂ１小複合体は、チロシンキナーゼ阻害剤を作用させると、Ｊａｂ１小複合体量が減少するにも関わらず、ｐ２７タンパク質の量は変化しないことが明らかとなった（非特許文献５および後述する実施例２参照）。
【００３７】
上記の結果から、Ｊａｂ１小複合体の存在形態の違いが、ｐ２７タンパク質の発現を制御する要因の一つであり、チロシンキナーゼ阻害剤に対する感受性に関与しているということが明らかとなった。
【００３８】
これら知見をまとめると、本発明者らによって、Ｊａｂ１タンパク質はＢｃｒ−Ａｂｌ遺伝子の下流、かつｐ２７遺伝子の上流で作用すること、さらにはＪａｂ１タンパク質の存在形態は複数存在し、そのうちの一つの形態とチロシンキナーゼ阻害剤の効力が対応することが見出された。
【００３９】
それゆえ、特に、チロシンキナーゼ阻害剤を抗ガン剤として用いる場合に、当該抗ガン剤をガン患者に投与する前に、ガン患者から得られた検体試料中のＪａｂ１タンパク質の存在形態を観察することにより、当該抗ガン剤の効力を判定することが可能となる。
【００４０】
＜判定方法の一例＞
本発明にかかる抗ガン剤効力の判定方法としては、上述したように、検体試料中のＪａｂ１タンパク質の存在形態を確認する方法であれば特に限定されるものではないが、具体的には、例えば、抽出液調製工程、分画工程、Ｊａｂ１確認工程、ｐ２７確認工程を含む判定方法を挙げることができる。
【００４１】
本発明で用いられる検体試料としては、ガン細胞を含むか、その可能性のある検体試料であれば特に限定されるものではないが、本発明は、ＣＭＬに特異的な抗ガン剤であるチロシンキナーゼ阻害剤を用いるため、末梢血あるいは骨髄液等の白血球を含む検体試料を好ましく挙げることができる。より具体的には、リンパ球（Ｔ細胞・Ｂ細胞）、顆粒球（好中球、好酸球、好塩基球）、単球並びにマクロファージ、マスト細胞、ナチュラルキラー細胞等の白血球や、造血幹細胞またはリンパ球幹細胞の少なくとも何れかを含む検定試料を挙げることができる。
【００４２】
本発明で用いられる検体試料としては、上記白血球が含まれている血液や骨髄液あるいは体液等をヒトから採取し、これをそのまま検体試料として用いてもよいし、採取した血液や体液に対して従来公知の処理を施すことによって、分子生物学的な分析を実施し易い分析用検体試料としてもよい。
【００４３】
上記抽出液調製工程は、上記検体試料から抽出液を調製する工程であれば特に限定されるものではない。具体的には、例えば、検体試料から分離された細胞を破壊し、その後適当な緩衝液に溶解または懸濁させることにより調製すればよい。上記細胞の破壊方法は特に限定されるものではなく、超音波破砕法等、公知の技術を用いることができる。
【００４４】
上記分画工程は、上記抽出液調製工程で得られた抽出液を分子量分画する工程であれば特に限定されるものではない。具体的には、例えば、ネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ）、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、アガロースゲル電気泳動等の電気泳動法；グリセロール等を用いた密度勾配法；限外濾過膜を用いた方法；ゲル濾過法；等を挙げることができる。これら各方法を実施する場合の条件や、分画した画分の回収方法等も特に限定されるものではない。
【００４５】
上記Ｊａｂ１確認工程は、当該抽出液に含まれるＪａｂ１タンパク質の存在形態を確認する工程であれば特に限定されるものではない。なお、本発明では、Ｊａｂ１確認工程において、上記分画工程で分画された抽出液を用いることが好ましい。これは、Ｊａｂ１タンパク質の存在形態をより正確に確認するためである。しかしながら、Ｊａｂ１確認工程では、Ｊａｂ１タンパク質の存在形態を十分に確認できるのであれば、必ずしも分画工程を経た抽出液を用いる必要はなく、粗抽出液を用いてもよい。
【００４６】
上記Ｊａｂ１確認工程におけるＪａｂ１タンパク質の存在形態を確認する手法としては、具体的には、Ｊａｂ１タンパク質が形成しているＪａｂ１複合体の分子量を基準とする手法を挙げることができる。上述したように、Ｊａｂ１複合体としては、分子量４５０ｋＤａのＪａｂ１大複合体か、または分子量１２０ｋＤａのＪａｂ１小複合体が存在している。このうち、Ｂｃｒ−Ａｂｌ遺伝子に制御されているのはＪａｂ１小複合体であるため、上記Ｊａｂ１確認工程では、Ｊａｂ１小複合体の発現量を確認することによりＪａｂ１タンパク質の存在形態を確認すればよい。
【００４７】
ここで、上記Ｊａｂ１小複合体の存在形態には、少なくとも二種類のサブタイプがあり、このうちチロシンキナーゼ阻害剤の効力に感受性を有しているタイプでは、チロシンキナーゼ阻害剤を作用させると、Ｊａｂ１小複合体の量が減少し、ｐ２７タンパク質の量が増加する。それゆえ、本発明にかかる判定方法では、Ｊａｂ１確認工程とともに、検体試料中に含まれるｐ２７タンパク質の発現を確認するｐ２７確認工程を実施することが好ましい。
【００４８】
Ｊａｂ１確認工程およびｐ２７確認工程におけるより具体的な確認手法としては、特に限定されるものではなく、公知の手法を用いることができるが、一般的には、電気泳動によりその発現量を確認する手法を好ましく用いることができる。このとき用いられる電気泳動法としては、上記分画工程で説明した各種電気泳動法を挙げることができるが、中でも、Ｊａｂ１確認工程ではＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥが用いられることが非常に好ましい。
【００４９】
上述したように、Ｊａｂ１確認工程で確認するＪａｂ１タンパク質は複合体を形成している。そのため、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのようにタンパク質を変性させて電気泳動する手法では、Ｊａｂ１複合体（Ｊａｂ１小複合体）の存在を十分に確認することが困難となる。それゆえ、本発明では、特に、Ｊａｂ１確認工程ではＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥを用いることが非常に好ましい。
【００５０】
上記Ｊａｂ１確認工程におけるＪａｂ１小複合体の検出手法は特に限定されるものではないが、一般的には、Ｊａｂ１タンパク質に特異的に結合する抗体（抗Ｊａｂ１抗体）を用いればよい。より具体的な検出手法としては、公知の手法であれば特に限定されるものではないが、例えば、酵素標識および／またはラジオアイソトープで標識した抗Ｊａｂ１抗体を用い、公知のウエスタンブロット法を用いて検出する手法を好ましく用いることができる。また、Ｊａｂ１確認工程で用いられる抽出液が密度勾配法で分画したサンプルである場合には、公知のドットブロット法で検出すればよい。
【００５１】
上記ｐ２７確認工程におけるｐ２７タンパク質の検出手法も特に限定されるものではないが、上記Ｊａｂ１確認工程と同様に、ｐ２７タンパク質に特異的に結合する抗体（抗ｐ２７抗体）を用いればよい。より具体的な検出手法も上記Ｊａｂ１確認工程と同様特に限定されるものではなく、公知のウエスタンブロット法等を用いることができる。
【００５２】
上記Ｊａｂ１確認工程で用いられる抗Ｊａｂ１抗体や、ｐ２７確認工程で用いられる抗ｐ２７抗体は、抗原であるＪａｂ１タンパク質やｐ２７タンパク質の少なくとも一部の構造を抗原決定基として認識し、これらタンパク質を免疫学的に確実に検出できる抗体であれば特に限定されるものではなく、ポリクローナル抗体であってもよいし、モノクローナル抗体であってもよい。中でも、より特異性の高いモノクローナル抗体が好ましい。
【００５３】
上記抗Ｊａｂ１抗体または抗ｐ２７抗体は、従来公知の方法で製造してもよいし、市販の抗体を用いてもよい。これら抗体の製造方法としては特に限定されるものではないが、例えば、モノクローナル抗体であれば、Ｊａｂ１タンパク質やｐ２７タンパク質で免疫したマウス脾臓リンパ球とマウスの骨髄細胞とを融合させてなるハイブリドーマにより産生する手法が挙げられる。また、ポリクローナル抗体であれば、Ｊａｂ１タンパク質やｐ２７タンパク質で免疫したウサギの免疫血清から精製する手法が挙げられる。
【００５４】
本発明にかかる判定方法の実施のタイミングは特に限定されるものではないが、原則として抗ガン剤がガン患者に投与される前に実施することが非常に好ましい。抗ガン剤投与前に、抗ガン剤の効力を判定することで、抗ガン剤の有効性を向上させることができることに加えて、ガン患者に対して、抗ガン剤による副作用を強いることを回避でき、さらには、本来必要の無い抗ガン剤によって多額の出費が生じるような事態も回避することが可能となる。
【００５５】
なお、本実施の形態で説明した上記判定方法には、他の工程（プロセス）や他の段階（ステップ）が含まれていてもよいことは言うまでも無い。また上述した各工程のうち、幾つかの工程は必要に応じて実施する順序を入れ替えても良い。
【００５６】
このように、本発明にかかる判定方法を用いれば、Ｊａｂ１タンパク質を判定の指標として用い、特に、Ｊａｂ１タンパク質の存在形態を確認することにより、チロシンキナーゼ阻害剤に対するガンの感受性を評価することが可能となる。それゆえ、抗ガン剤の投与前に、特異的抗ガン剤であるチロシンキナーゼ阻害剤の効力があることを正確に判定することが可能となる。
【００５７】
（ＩＩ）抗ガン剤効力判定キット
本発明にかかる抗ガン剤効力判定キットは、上述した抗ガン剤効力の判定方法を実施するために用いられるものであり、上記判定方法を実施するための必要最低限の試薬類や素材類が含まれていれば、その構成は特に限定されるものではないが、具体的には、例えば、Ｊａｂ１タンパク質の発現状態を確認する試薬群を含む構成を挙げることができる。
【００５８】
上記試薬群としては、例えば、ガン細胞を含む検体試料から抽出液を調製する際に好適な組成を有する緩衝液、Ｊａｂ１確認工程で用いられる抗Ｊａｂ１抗体、ｐ２７確認工程で用いられる抗ｐ２７抗体、分画工程を実施する場合に用いられる分画用試薬類（例えば、密度勾配法に用いられるグリセロール）等を挙げることができるが特に限定されるものではない。
【００５９】
ここで、本発明にかかる判定方法では、Ｊａｂ１確認工程やｐ２７確認工程において、Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥと、それに続くウエスタンブロットとを実施することが好ましい。そのため、本発明にかかる判定キットには、Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥにおけるマーカーとなるタンパク質や、上記抗Ｊａｂ１抗体および／または抗ｐ２７抗体等が含まれていることが好ましい。
【００６０】
上記マーカーとなるタンパク質としては、Ｊａｂ１複合体のうち、少なくとも分子量１２０ｋＤａのＪａｂ１小複合体が含まれていることが好ましく、さらには分子量４５０ｋＤａのＪａｂ１大複合体が含まれているとより好ましい。また、ｐ２７タンパク質も含まれていることが好ましい。これらタンパク質は、ＰＡＧＥで明確に分子量が分かる程度に精製されていればよい。また、これらタンパク質は、それぞれ独立してマーカーとして用いられてもよいし、それぞれを混合した混合マーカーとして用いられてもよい。
【００６１】
さらに、本発明にかかる判定キットには、上記試薬群以外の要素が含まれていてもよい。例えば、抽出液を分注するために好ましいサイズのマイクロチューブ等の素材（マテリアル）がキットに含まれていてもよい。また、本発明にかかる判定キットは、本発明を適用可能な抗ガン剤に組み合わせて用いられてもよい。すなわち、本発明にかかる判定キットには、チロシンキナーゼ阻害剤等の抗ガン剤が含まれていてもよい。この場合のキットは、判定キットというよりも、抗ガン剤使用キットと言うことができる。
【００６２】
このように、本発明にかかる判定方法をキット化することによって、ガン患者の抗ガン剤に対する効力の判定を、より簡便かつ正確に実施することが可能となる。それゆえ、本発明を臨床検査産業や医薬品産業等の産業レベルで利用することが可能となる。
【００６３】
（ＩＩＩ）本発明の利用
本発明者らは、ガン悪性化の負のマーカーであるｐ２７タンパク質（Ｃｄｋインヒビター）の発現を指標として、Ｂｃｒ−Ａｂｌ遺伝子が関与する細胞内シグナル伝達の経路を調べた結果、Ｊａｂ１タンパク質がＢｃｒ−Ａｂｌ遺伝子の下流でｐ２７遺伝子の上流で作用すること、さらにはＪａｂ１タンパク質の存在形態（Ｊａｂ１複合体）は複数存在し、そのうちの一つの形態と特異的抗ガン剤であるチロシンキナーゼ阻害剤の効力が対応することを見出した。それゆえ、本発明にかかる判定方法および／または判定キットの利用範囲は、上記Ｂｃｒ−Ａｂｌ遺伝子が関与するガンを化学療法で治療する場合に広く用いることができる。
【００６４】
具体的には、本発明が適用可能なガンとしては、活性化型チロシンキナーゼを有するガンであれば特に限定されるものではなく、例えば、白血病、小胞性肺ガン、前立腺ガン、乳ガン、すい臓ガン、軟部肉腫、消化器の固形ガンの一種ヒト消化管ストーマ細胞腫瘍（ＧＩＳＴ）等を挙げることができる。中でも、白血病が好ましく、その中でもＣＭＬがより好ましい。
【００６５】
また、本発明が適用可能な抗ガン剤としては、チロシンキナーゼ阻害剤であれば特に限定されるものではない。代表的なチロシンキナーゼ阻害剤としては、スイスのノバルティス社により開発・実用化された慢性骨髄性白血病治療薬、商品名「グリベック（登録商標）」（ＳＴＩ５７１）を挙げることができる。グリベックの化合物名はイマチニブメシレートで、ＣＭＬ患者のＢｃｒ−Ａｂｌ遺伝子にコードされているＰ２１０タンパク質のＡＴＰ結合部位に選択的に結合するように分子設計がなされている。その詳しい作用機序は不明であるが、Ｐ２１０タンパク質のチロシンキナーゼ活性を阻害し、アポトーシスを誘導白血球の異常増殖を抑えると考えられている。本発明を用いれば、このグリベックの抗ガン効力を正確に判定することが可能となる。また本発明は、その他アストロゼネガ社製商品名「イレッサ（登録商標）」、および日本ロッシュ商品名「ハーセプチン（登録商標）」等に適応可能である。
【００６６】
なお、本発明は、上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能である。それゆえ、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【００６７】
【実施例】
以下、本発明を実施例および図１〜図７に基づいてより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、各実施例において用いた細胞株および具体的な実験方法について先に説明する。
【００６８】
〔実験方法〕
（１）使用した白血病由来細胞株
ＨＬ６０：ヒト急性前骨髄球性白血病細胞株。Ｂｃｒ−Ａｂｌタンパク質の発現なし。Ｂｃｒ−Ａｂｌ阻害剤に耐性。
ＴＨＰ１０１：ヒト急性単球性白血病細胞株。Ｂｃｒ−Ａｂｌタンパク質の発現なし。Ｂｃｒ−Ａｂｌ阻害剤に耐性。
ＨＥＬ：ヒト赤血球性白血病細胞株。Ｂｃｒ−Ａｂｌタンパク質の発現なし。Ｂｃｒ−Ａｂｌ阻害剤に耐性。
ＣＭＫ：ヒト巨核球性白血病細胞株。Ｂｃｒ−Ａｂｌタンパク質の発現なし。Ｂｃｒ−Ａｂｌ阻害剤に耐性。
ＫＨ：ヒト骨髄球性由来細胞株。Ｂｃｒ−Ａｂｌタンパク質の発現なし。Ｂｃｒ−Ａｂｌ阻害剤に耐性。
Ｋ５６２：ヒトＣＭＬ由来細胞株。Ｂｃｒ−Ａｂｌタンパク質の発現あり。Ｂｃｒ−Ａｂｌ阻害剤に感受性。
ＭＥＧ：ヒトＣＭＬ由来細胞株。Ｂｃｒ−Ａｂｌタンパク質の発現あり。Ｂｃｒ−Ａｂｌ阻害剤に感受性。
ＴＳ９．２２：ヒトＣＭＬ由来細胞株。Ｂｃｒ−Ａｂｌタンパク質の発現あり。Ｂｃｒ−Ａｂｌ阻害剤に感受性。
ＭＯＬＭ１：ヒトＣＭＬ由来細胞株。Ｂｃｒ−Ａｂｌタンパク質の発現あり。Ｂｃｒ−Ａｂｌ阻害剤に感受性。
ＫＹＯ−１：ヒトＣＭＬ由来細胞株。Ｂｃｒ−Ａｂｌタンパク質の発現あり。Ｂｃｒ−Ａｂｌ阻害剤に耐性。Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ９： ９２１−９２６，（１９８５）参照。
ＢＡＦ３：マウスｐｒｏ−Ｂ細胞株。
ＴｏｎＢ：ＢＡＦ３由来で、テトラサイクリンまたはそのアナログであるＤｏｘｙｃｙｃｌｉｎ（Ｄｏｘ．）処理により、Ｂｃｒ−Ａｂｌ遺伝子の発現を誘導することができる細胞株。文献Ｋｌｕｃｈｅｒ ＫＭ， Ｌｏｐｅｚ ＤＶ， Ｄａｌｅｙ ＧＱ． Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｍａｉｎｔａｉｎｓ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｓｔａｔｅ ｉｎ ＢａＦ３ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ＢＣＲ／ＡＢＬ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ． Ｂｌｏｏｄ ９１：３９２７−３９３４，１９９８参照。
【００６９】
（２）実験に使用した阻害剤
ＭＧ１３２：プロテアソーム阻害剤である。
ＬＬＭ：カルパイン阻害剤である。
ＬＭＢ：核外移行阻害剤である。
Ｃｕｒ．：ＣＳＮ付随タンパクキナーゼ阻害剤である。
Ｈ８９：Ａキナーゼ阻害剤である。
Ｓｔａｕ．：タンパクキナーゼ阻害剤である。
ＰＤ：ＭＡＰキナーゼ阻害剤である。
Ｗｏｒｔ．：ＰＩ３キナーゼ阻害剤である。
【００７０】
（３）実験方法
〔細胞抽出液の調製〕
検体試料中の細胞を遠心分離によって集め、生理食塩水で洗浄し、最少量の抽出緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ， ｐＨ８．０；１２０ｍＭ ＮａＣｌ， １ｍＭ ＥＤＴＡ， ０．１％ Ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ）を加えてよく懸濁し溶解させる。遠心分離にて不可溶性の成分を除き、上澄みの可溶性成分を細胞抽出液とした。
【００７１】
〔Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ・ＳＤＳ−ＰＡＧＥ・ウエスタンブロッティング・ノーザンブロッティング〕
標準の方法で行った。
【００７２】
〔グリセロール直線密度勾配による分画〕
１ｍｌ細胞抽出液を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）；１２０ｍＭＮａＣｌ；１ｍＭ ＥＤＴＡと１ｍＭ β−ＭＥを含有する１０％〜４０％のグリセロールのグラジェントに供した。４℃、２７，０００ｒｐｍで２４時間遠心分離後（ベックマン Ｔｉ４０ローター使用）、底部から０．５ｍｌをフラクションとして回収した。
【００７３】
〔チロシンキナーゼ阻害剤による処理〕
１〜２μＭのＳＴＩ５７１を、細胞培養用の培地に直接加え処置した。
【００７４】
〔実施例１：各種白血病由来細胞株におけるｐ２７タンパク質の量、およびＪａｂ１複合体の関係の解析〕
白血病由来細胞株として、ＨＬ６０、ＫＹＯ−１、ＴＨＰ１０１、Ｋ５６２、ＨＥＬ、Ｍａｋ３、ＣＭＫ、およびＫＨを用いた。これら細胞から、細胞抽出液を調製し、ｐ２７タンパク質、Ｊａｂ１タンパク質、Ｓｋｐ２タンパク質、β―アクチンの発現量をウエスタンブロッティング法により検出した。その結果を図１Ａに示す。なお、Ｓｋｐ２タンパク質、β―アクチンおよびＧＡＰＤＨタンパク質は、解析サンプルが等量であることの指標である。
【００７５】
次に、上記白血病由来細胞株のうち、ＨＬ６０、ＫＹＯ−１、Ｋ５６２、およびＨＥＬについて、これら細胞からＲＮＡを抽出し、ｐ２７タンパク質、Ｊａｂ１タンパク質、ＧＡＰＤＨタンパク質のｍＲＮＡ発現量をノーザンブロッティングにより検出した。その結果を図１Ｂに示す。なお、ＧＡＰＤＨタンパク質は解析サンプルが等量であることの指標である。
【００７６】
次に、上記白血病由来細胞株のうち、Ｋ５６２およびＫＹＯ−１について、これら細胞から細胞抽出液を調製し、１０〜４０％グリセロール直線密度勾配法を用いて細胞抽出液を分画した。フラクションＮｏ．１１、１３、１５、１７および１９の各画分に含まれるＪａｂ１タンパク質について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した後、ウエスタンブロッティング法により検出した。その結果を図１Ｃに示す。
【００７７】
次に、Ｋ５６２から細胞抽出液を調製し、Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥを行った後、抗Ｊａｂ１抗体を用いてＪａｂ１複合体を検出した。その結果を図１Ｄの左側のパネルに示す。また、上記と同様、１０〜４０％グリセロール直線密度勾配法を用いて分画した細胞抽出液のフラクションＮｏ．１１、１３、１５、１７および１９の各画分について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した。その結果を図１Ｄの右上パネルに示す。さらに、同じフラクションＮｏ．の各画分をＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥにかけ、抗Ｊａｂ１抗体を用いてウエスタンブロッティング法によってＪａｂ１複合体を検出した。その結果を図１Ｄの右下パネルに示す。なお、図１Ｄにおける“ＣＯＰ９ ｃｏｍｐｌｅｘ”がＪａｂ１複合体のうちＪａｂ１大複合体を示し、“Ｓｍａｌｌ ｃｏｍｐｌｅｘ”がＪａｂ１小複合体を示す。
【００７８】
図１Ａ〜Ｄの結果から、種々の白血病由来細胞間でｐ２７タンパク質の発現量に大きな差異があること、および、この差異はｍＲＮＡに依存していない、つまり転写レベルの制御は受けていないことが明らかとなった。したがって、ｐ２７タンパク質の量は、発現レベルで何らかの制御を受けていることがわかる。
【００７９】
〔実施例２：白血病由来細胞間におけるＪａｂ１小複合体量の比較〕
実施例１で調製した各種白血病由来細胞株の細胞抽出液について、Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥを実施した後、抗Ｊａｂ１抗体を用いてウエスタンブッロッティングを行った。その結果を図２Ａに示す。なお、この図でも“ＣＯＰ９ ｃｏｍｐｌｅｘ”がＪａｂ１大複合体を示し、“Ｓｍａｌｌ ｃｏｍｐｌｅｘ”がＪａｂ１小複合体を示す。
【００８０】
次に、白血病由来細胞株のうち、ＣＭＬ由来細胞株として、Ｋ５６２、ＫＹＯ−１、ＭＥＧ、ＴＳ９．２２、およびＭＯＬＭ１を選択するとともに、非ＣＭＬ由来細胞株として、ＣＭＫおよびＨＥＬを選択し、これら細胞から細胞抽出液を調製した。得られた細胞抽出液についてＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥを実施した後、抗Ｊａｂ１抗体を用いてウエスタンブロッティングを行った。その結果を図２Ｂの上から１段目および２段目のパネルに示す。
【００８１】
また、上記と同じ細胞抽出液を用いて、β−アクチン、Ｊａｂ１タンパク質、ｐ２７タンパク質、Ｃｕｌ１タンパク質、Ｂｃｒ−Ａｂｌタンパク質（Ｐ２１０タンパク質）、ｃＡｂｌタンパク質の発現量について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した後、ウエスタンブロッティング法を用いて解析した。その結果を図２Ｂの上から３段目〜７段目のパネルに示す。
【００８２】
図２Ａ・Ｂの結果から、ＣＭＬ由来細胞株においては、Ｊａｂ１複合体のうち、Ｊａｂ１小複合体の発現量は、非ＣＭＬ由来細胞株に比して多いということが明らかとなった。また、Ｊａｂ１小複合体には、少なくとも２種類の形態が存在することが明らかとなった。
【００８３】
また、各細胞のチロシンキナーゼ阻害剤に対する感受性を調べた結果、Ｋ５６２、ＭＥＧ、ＭＯＬＭ１はチロシンキナーゼ阻害剤感受性であり、ＫＹＯ−１、ＣＭＫ、ＨＥＬはチロシンキナーゼ阻害剤に耐性を示した。この結果とＪａｂ１小複合体の形態とを対比すると、Ｋ５６２タイプのＪａｂ１小複合体を持つ細胞のみが、チロシンキナーゼ阻害剤に感受性であるということがわかった。
【００８４】
〔実施例３：ＣＭＬ由来細胞Ｋ５６２株とＫＹＯ−１株のチロシンキナーゼ活性阻害剤への応答〕
ＣＭＬ由来細胞株のうち、Ｂｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼ感受性株のＫ５６２と、耐性株ＫＹＯ−１とを選択し、これら細胞をＤＭＳＯまたはＳＴ５７１（Ｂｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼ特異的阻害剤）で８時間処理した後、細胞液を調製した。各細胞抽出液をＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥにかけ、抗Ｊａｂ１抗体を用いたウエスタンブロッティング法によりＪａｂ１複合体の変化を解析した。その結果を図３Ａの左側１段目および２段目のパネルに示す。
【００８５】
また同じ細胞抽出液を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した後、チロシンリン酸化レベルをウエスタンブロッティング法により解析した。その結果を図３Ａの左側３段目のパネルに示す。同様に、同じ細胞抽出液を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した後、Ｊａｂ１タンパク質発現量をウエスタンブロッティング法により解析した。その結果を図３Ａ左側４段目のパネルに示す。
【００８６】
さらに、Ｋ５６２をＳＴ５７１で８時間処理した後、ＳＴ５７１を除き、タンパク質合成阻害剤であるシクロヘキシミド（ＣＨＸ）の存在下で、２時間および３時間培養した。このときのＪａｂ１複合体の変化、チロシンリン酸化レベル、並びにＪａｂ１タンパク質の発現量を解析した。その結果を、それぞれ図３Ａの右側の各パネルに示す。なお、図３Ａ右側の上から１段目および２段目のパネルがＪａｂ１複合体の変化の結果であり、３段目のパネルがチロシンリン酸化レベルの結果であり、４段目がＪａｂ１タンパク質の発現量の結果である。
【００８７】
次に、上記細胞抽出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ｐ２７タンパク質、Ｃｕｌ１タンパク質、Ｓｋｐ２タンパク質、Ｂｃｒ−Ａｂｌタンパク質、ｃＡｂｌタンパク質、およびγ−Ｔｕｂタンパク質の発現量をウエスタンブロッティング法により解析した。その結果を図３Ｂに示す。なお、γ−Ｔｕｂタンパク質は解析サンプルが等量であることの指標である。
【００８８】
図３の結果から、Ｋ５６２およびＫＹＯ−１の両株ともに、Ｂｃｒ−Ａｂｌ遺伝子産物のチロシンキナーゼ活性を阻害すれば、Ｊａｂ１小複合体の量が減少するということが明らかとなった。またこのとき、ガン悪性化の負のマーカーであるｐ２７タンパク質については、Ｋ５６２株のみが増加した。つまり、チロシンキナーゼ阻害剤感受性株であるＫ５６２株のみにおいて、ガンの悪性度が低くなり、チロシンキナーゼ阻害剤の効力があったことが確認できた。
【００８９】
以上の結果から、Ｊａｂ１小複合体の存在形態とチロシンキナーゼ阻害剤の効力が対応することがわかり、チロシンキナーゼ阻害剤等の抗ガン剤を投与する前にガン細胞由来のＪａｂ１小複合体の存在形態（Ｋ５６２株タイプか、またはＫＹＯ−１株タイプか）を調べることによって、チロシンキナーゼ阻害剤の効力を判定することが可能であるといえる。
【００９０】
〔実施例４：Ｂｃｒ−Ａｂｌタンパク質とＪａｂ１複合体の関係〕
ＢＡＦ３およびＴｏｎＢを用い、これら細胞をＩＬ３の非存在下かつＤｏｘ．の存在下、またはＤｏｘ．の非存在下で５時間処理した。その後、それぞれの細胞を回収して細胞抽出液を調製し、Ｊａｂ１複合体の変化、γ−Ｔｕｂ、Ｊａｂ１タンパク質、ｐ２７タンパク質、Ｂｃｒ−Ａｂｌタンパク質、ｃＡｂｌタンパク質の発現量をウエスタンブロッティング法により解析した。その結果を図４に示す。
【００９１】
図４の結果から明らかなように、Ｂｃｒ−Ａｂｌタンパク質の発現誘導によって、Ｊａｂ１小複合体の量が増加しているということがわかった。
【００９２】
〔実施例５：Ｊａｂ１小複合体を制御するシグナル伝達経路の解析〕
Ｋ５６２細胞をＭＧ１３２、ＬＬＭ、ＬＭＢ、Ｃｕｒ．、Ｈ８９、Ｓｔａｕ．、ＰＤおよびＷｏｒｔ．で８時間処理した後、細胞抽出液を調製した。これを用いて、Ｊａｂ１複合体の変化、Ｊａｂ１タンパク質、ｐ２７タンパク質、γ−Ｔｕｂタンパク質、Ｃｄｋ２タンパク質、Ｃｕｌタンパク質の発現量をウエスタンブロッティング法により解析した。その結果を図５Ａに示す。なお、Ｃｄｋ２タンパク質およびＣｕｌタンパク質は、解析サンプルが等量であることの指標である。
【００９３】
また、ＫＹＯ−１を用いて同様の処理を行い、ｐ２７タンパク質発現量をウエスタンブロッティング法により解析した。その結果を図５Ｂに示す。
【００９４】
さらに、Ｋ５６２をＳＴＩ単独、ＰＤ単独、Ｗｏｒｔ．単独、ＰＤとＷｏｒｔ．の組合せ、ＳＴＩとＰＤの組合せおよびＳＴＩとＷｏｒｔ．の組合せで８時間処理し、Ｊａｂ１複合体の変化をウエスタンブロッティング法により解析した。その結果を図５Ｃに示す。
【００９５】
図５の結果から明らかなように、Ｊａｂ１小複合体はＭＡＰＫ経路およびＰＩ３Ｋ経路の阻害により減少するということがわかった。
【００９６】
実施例１〜５の結果より、ＣＭＬにおいては、Ｂｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼが、恒常的にＭＡＰＫ経路およびＰＩ３Ｋ経路を活性化する。その結果、細胞内でのＪａｂ１小複合体の量が増加していた。またＪａｂ１小複合体の量とｐ２７タンパク質発現量の間には、逆相関の関係が認められた。本発明者らは、これまでに、Ｊａｂ１タンパク質を過剰発現すると、Ｊａｂ１小複合体の量が増加し、ｐ２７タンパク質の分解が誘導されること、およびＪａｂ１小複合体によるｐ２７タンパク質の分解は、核外移行阻害剤レプトマイシンＢ（ＬＭＢ）によって阻害されるということを明らかにしている（非特許文献４及び５参照）。これらの結果をあわせみると、増加したＪａｂ１小複合体が、ｐ２７タンパク質の分解を促進している可能性がある。よって、Ｂｃｒ−Ａｂｌタンパク質によるＪａｂ１複合体の制御が、細胞のガン化の一因になっていると考えられ、この知見を利用することにより、本発明にかかる抗ガン剤効力の判定方法を実現することが可能となる。
【００９７】
【発明の効果】
以上のように、本発明では、Ｊａｂ１タンパク質を指標として用い、このＪａｂ１タンパク質の存在形態を確認することによって、抗ガン剤の効力を判定するようになっている。それゆえ、本発明によれば、抗ガン剤の有効性を高めることができるだけでなく、ガン患者に不必要な抗ガン剤投与による副作用を回避させることができ、さらには、多額の出費を防ぐことも可能になるという効果を奏する。
【００９８】
したがって、本発明は、各種臨床検査産業や医薬品産業、研究用試薬産業に好適に利用できるだけでなく、医療分野にも応用することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１Ａは、種々の白血病由来細胞株中におけるタンパク質の発現量を、ウエスタンブロッティング法により検出した結果を示す図であり、Ｂは、種々の白血病由来細胞中における各タンパク質のｍＲＮＡ発現量を、ノーザンブロッティングにより検出した結果を示す図であり、Ｃは、Ｋ５６２およびＫＹＯ−１からの細胞抽出液を分画した各画分に含まれるＪａｂ１タンパク質を、ウエスタンブロッティング法により検出した結果を示す図であり、Ｄは、Ｋ５６２の細胞抽出液、および上記画分中のＪａｂ１複合体をウエスタンブロッティング法により検出した結果を示す図である。
【図２】
図２Ａは、各細胞抽出液を、抗Ｊａｂ１抗体を用いてウエスタンブッロッティングを行った結果を示す図であり、図２Ｂは、５種類のＣＭＬ細胞株および、２種類の非ＣＭＬ細胞から得られた細胞抽出液中のＪａｂ１タンパク質およびその他のタンパク質をウエスタンブロッティング法で検出した結果を示す図である。
【図３】
チロシンキナーゼ阻害剤で処理した各種細胞抽出液と、チロシンキナーゼ阻害剤で処理しない細胞抽出液について、ウエスタンブロッティング法によりＪａｂ１複合体の変化、チロシンリン酸化レベル、Ｊａｂ１タンパク質の発現量、および各タンパク質の発現量を解析した結果を示す図である。
【図４】
マウス由来のｐｒｏ−Ｂ細胞株ＢＡＦ３およびＴｏｎＢ細胞を用いて、Ｂｃｒ−Ａｂｌ遺伝子の誘導とＪａｂ１複合体との関係を解析した結果を示す図である。
【図５】
図５Ａは、Ｋ５６２を各種薬剤で処理した細胞抽出液について、Ｊａｂ１複合体の変化、および各タンパク質の発現量をウエスタンブロッティング法により解析した結果を示す図であり、図５Ｂは、ＫＹＯ−１を各種薬剤で処理した細胞抽出液について、ｐ２７タンパク質の発現量をウエスタンブロッティング法により解析した結果を示す図であり、図５Ｃは、Ｋ５６２を各種薬剤の組合せで処理した細胞抽出液について、Ｊａｂ１複合体の変化を、ウエスタンブロッティング法により解析した結果を示す図である。
Claims (19)
- ガン治療に用いられる抗ガン剤の効力を判定する方法であって、
検体試料中に含まれるＪａｂ１タンパク質を判定の指標として用いることを特徴とする抗ガン剤効力の判定方法。 - ガン細胞を含む検体試料から抽出液を調製する抽出液調製工程と、
当該抽出液に含まれるＪａｂ１タンパク質の存在形態を確認するＪａｂ１確認工程とを含むことを特徴とする請求項１に記載の抗ガン剤効力の判定方法。 - さらに、上記抽出液を分子量分画する分画工程を含んでおり、
上記Ｊａｂ１確認工程では、分画された抽出液を用いることを特徴とする請求項２に記載の抗ガン剤効力の判定方法。 - 上記Ｊａｂ１確認工程では、上記Ｊａｂ１タンパク質が形成しているＪａｂ１複合体の分子量を基準として、Ｊａｂ１タンパク質の存在形態を確認することを特徴とする請求項２または３に記載の抗ガン剤効力の判定方法。
- 上記Ｊａｂ１複合体としては、分子量４５０ｋＤａのＪａｂ１大複合体か、または分子量１２０ｋＤａのＪａｂ１小複合体が存在しており、
上記Ｊａｂ１確認工程では、Ｊａｂ１小複合体の発現量を確認することによりＪａｂ１タンパク質の存在形態を確認することを特徴とする請求項４に記載の抗ガン剤効力の判定方法。 - さらに、検体試料中に含まれるｐ２７タンパク質の発現を確認するｐ２７確認工程を含むことを特徴とする請求項４または５に記載の抗ガン剤効力の判定方法。
- 上記Ｊａｂ１確認工程およびｐ２７確認工程の少なくとも一方では、電気泳動によりＪａｂ１小複合体またはタンパク質の発現量を確認することを特徴とする請求項４、５または６に記載の抗ガン剤効力の判定方法。
- 上記Ｊａｂ１確認工程では、上記電気泳動として、ネイティブのポリアクリルアミドゲル電気泳動が用いられることを特徴とする請求項７に記載の抗ガン剤効力の判定方法。
- 上記Ｊａｂ１確認工程では、上記Ｊａｂ１タンパク質に特異的に結合する抗体を用いて、上記抽出液からＪａｂ１小複合体を検出することを特徴とする請求項４ないし８の何れか１項に記載の抗ガン剤効力の判定方法。
- 上記ｐ２７確認工程では、上記ｐ２７タンパク質に特異的に結合する抗体を用いて、上記抽出液からｐ２７タンパク質を検出することを特徴とする請求項４ないし９の何れか１項に記載の抗ガン剤効力の判定方法。
- 上記抗体が、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であることを特徴とする請求項９または１０に記載の抗ガン剤効力の判定方法。
- 上記ガンが、白血病であることを特徴とする請求項１ないし１１の何れか１項に記載の抗ガン剤効力の判定方法。
- 上記白血病が、慢性骨髄性白血病であることを特徴とする請求項１２に記載の抗ガン剤効力の判定方法。
- 上記抗ガン剤として、チロシンキナーゼ阻害剤が用いられることを特徴とする請求項１ないし１３の何れか１項に記載の抗ガン剤効力の判定方法。
- 抗ガン剤の投与前に実施されることを特徴とする請求項１ないし１４の何れか１項に記載の抗ガン剤効力の判定方法。
- 請求項１ないし１５の何れか１項に記載の抗ガン剤効力の判定方法を実施するために用いられる抗ガン剤効力判定キット。
- ガン細胞を含む検体試料から調製された抽出液に含まれるＪａｂ１タンパク質の発現状態を確認する試薬群を含むことを特徴とする抗ガン剤効力判定キット。
- 上記試薬群には、Ｊａｂ１タンパク質に特異的に結合する抗体が含まれていることを特徴とする請求項１７に記載の抗ガン剤効力判定キット。
- 上記Ｊａｂ１タンパク質は、分子量４５０ｋＤａのＪａｂ１大複合体か、または分子量１２０ｋＤａのＪａｂ１小複合体を形成しており、
このうち、少なくともＪａｂ１小複合体が、ポリアクリルアミドゲル電気泳動用のマーカーとして上記試薬群に含まれていることを特徴とする請求項１７または１８に記載の抗ガン剤効力判定キット。
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