JP2004307505A

JP2004307505A - 糖尿病治療用のインスリン産生細胞を播種した埋め込み可能なパウチ

Info

Publication number: JP2004307505A
Application number: JP2004110260A
Authority: JP
Inventors: Alireza Rezania; アリレザ・レザニア; Mark Zimmerman; マーク・ジマーマン; Ragae M Ghabrial; ラガ・エム・ガブリアル
Original assignee: LifeScan Inc
Current assignee: LifeScan Inc
Priority date: 2003-04-02
Filing date: 2004-04-02
Publication date: 2004-11-04
Also published as: CN100404074C; CN1569236A; CA2462999A1; TW200501924A; EP1466632A1; AU2004201398A1; US20040197374A1

Abstract

【課題】播種およびその後のインスリン産生細胞を含む複数の哺乳類細胞の移植に使用するのに好適な埋め込み可能なパウチおよびその製造方法を提供する。
【解決手段】埋め込み可能なパウチは補強された多孔質フォームと内腔を有し、細胞または細胞性物質を哺乳類に埋め込む方法はこのパウチを使用する。内腔は移植前に取り外しても取り外さなくてもよいインサートを含む。この内腔には哺乳類の膵臓のβ細胞に特徴的な少なくとも１つの転写因子を発現する少なくとも１種の細胞タイプを装荷してもよい。
【選択図】図１

Description

本発明は、糖尿病治療用のインスリン産生細胞を播種した埋め込み可能なパウチに関するものである。さらに詳しくは、本発明は糖尿病治療用のインスリン産生細胞を装填する開口部を含み、この開口部はその後、閉じかつ所望により密封することもできる埋め込み可能な多孔質パウチを提供する。

膵臓組織は３つの部分：外分泌腺、内分泌腺および導管からなる。内分泌膵臓は４種類の異なるホルモンを放出する役割を担う島細胞を含み、そのような島は４種類の別個の細胞型：α、β、δおよびポリペプチド細胞であり、それぞれグルカゴン、インスリン、ソマトスタチンおよび膵ポリペプチドを産生する。内分泌細胞の特定に関する従来技術において確立されているように、β細胞の発生に必須である重要な転写因子がいくつか同定されており、Ｐｄｘ１、Ｎｇｎ３、Ｈｌｘｂ９、Ｎｋｘ６、Ｉｓ１１、Ｐａｘ６、Ｎｅｕｒｏｄ、Ｈｎｆ１ａ、Ｈｎｆ６等が挙げられている。例えば、非特許文献１を参照されたい。

内分泌膵臓の一般的な疾患である糖尿病（ＤＭ）はベータ細胞の破壊（Ｉ型ＤＭ）あるいは筋肉または脂肪組織がインスリンホルモンに感受性を失う（ＩＩ型ＤＭ）ことにより引き起こされる。現在行われているＩ型およびＩＩ型ＤＭの治療方法としてはともに食餌と運動、経口血糖降下薬、インスリン注射、インスリンポンプ療法、全膵臓または島の移植が挙げられる。

最も一般的な治療方法としては内因性インスリン源、例えばブタ、ウシまたはヒトインスリンを毎日注射することが挙げられる。患者は普通、血糖値を自己監視し、かかる血液分析の結果に基づいて所定のプランに従ってインスリンを注射するという処方計画に従う。

もう一つの、それほど一般的ではない治療方法としては、全膵臓器官の移植がある。成人の膵臓全体のそのような移植体を移植することは大きな、技術的に複雑な重要な操作であり、これらの操作はまた新しく移植された器官の拒絶反応を回避するための免疫抑制薬を用いた積極的な治療を必要とする。そのような器官は典型的には死亡したヒトのドナーから得られており、そのような死体膵臓の入手可能性は限られているのでこの方法を広く利用することができない。

移植の分野では、膵臓組織の残りの部分からインスリン産生島を分離するとよいという者が多い。そのような利点としては、より小さい組織塊を移植すればすむことから侵襲的外科手術が少なくなることが挙げられる。さらに、免疫操作および移植片の組成物の技術に対するアクセスが増す。

最近まで、島の強い免疫拒絶反応のせいで島を移植することは一般に不成功に終わっていた。最近の報文（非特許文献２）から、グルココルチコイドを含まない免疫抑制処方計画が不安定なＩ型糖尿病患者に特に有利であることが判る。しかしながら、この治療法を利用する患者は腎臓の合併症、口腔潰瘍にかかり易いとともに、正常血糖症（normoglycemia）を誘発させるためには多数の島（〜９０００島当量／患者の体重ｋｇを必要とする。従って、免疫抑制薬を多量に投与することを回避し、かつ商業的に実現可能な島細胞源を使用する島細胞移植戦略を案出する努力が鋭意なされた。その結果、島を選択的に透過性の膜で遮断することを含む免疫分離（immunoisolation）（ダイアベトロギア、第４５巻第１５９行〜１７３行、２００２年（Diabetologia, 45:159-173, 2002））の概念が導かれた。この膜は小分子、例えば栄養物、酸素、グルコースおよびインスリンを通過させるが、より大きな体液性免疫分子および免疫細胞の通過を正弦する。理論上は、免疫分離装置を十分な動物島細胞源、例えばブタ島細胞源とともに用いてＤＭを治療することが可能であろう。しかしながら、実際上は、この方法は装置が繊維形成を引き起こすこと、装置内の酸素供給が制限されること、および小さな体液性免疫分子が通過するため島が失われることにより、大型動物モデルまたは臨床では成功していない。

免疫分離以外の方法としては、セルトリ細胞を哺乳類の非精巣部位に移植することにより免疫学的特権部位を創出することがある（特許文献１、特許文献２、特許文献３）。この部位は引き続きインスリンを産生する島の移植をすることが可能である。免疫特権部位はヒトまたは動物由来の島を移植することが可能であろう。この方法の欠点の一つは移植されたセルトリ細胞および島細胞は移植部位に物理的に制限されていないことである。そのため、これらの細胞が不所望の組織部位に移動することがあり得る。島が移動してセルトリ細胞から離れると最終的にはセルトリ細胞の免疫抑制効果が失われることにより島が失われることになる。これはセルトリ細胞により創出される免疫特権環境は島が密接しているときに最も効果的であるためである。

最近出現した組織工学は糖尿病を治療する別の方法を提供している。組織工学的戦略は種々の生物材料を細胞および／または成長因子と併用して組織の機能を最終的に回復または改善することができる生物学的代替物を開発することを探求している。例えば、足場（scaffold）材料が組織の修復に有用な組織の鋳型、導管、障壁および貯蔵所として広く検討されている。特に、フォーム、スポンジ、ゲル、ヒドロゲル、織物、および不織物の形の合成および天然材料が生体組織を再構築および／または再生並びに組織成長を誘導する化学遊走剤（chemotactic agent）を送達するためにインビトロおよびインビボで用いられてきた（特許文献４、特許文献５、特許文献６、特許文献７）。

足場に必要な重要な要件の一つは、該足場に播種した後に細胞が保持されることである。これまで、足場は細胞、例えば島細胞をその上に播種する基体材料として構築されてきた。従来の多孔質マトリックス、例えばポリグリコール酸不織物またはポリ乳酸フォームは細孔径が膵臓の島または島状構造を十分に保持するには大き過ぎたり小さ過ぎたりする。

米国特許第５、８４９、２８５号米国特許第６、１４９、９０７号米国特許第５、９５８、４０４号米国特許第５、７７０、４１７号米国特許第６、０２２、７４３号米国特許第５、５６７、６１２号米国特許第５、７５９、８３０号ネイチャー・リビューズ・ジェネティクス、第１３巻第５２４頁〜６３２頁２００２年（Nature Reviews Genetics, Vol3, 524-632, 2002）ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディスン、第３４３巻、第２３０頁〜２３８頁、２０００年（N.Eng. J.Med. 343:230-238, 2000）

インスリン分泌細胞を装填した足場の重要な要件は必須栄養物を交換するとともに高酸素圧を維持することができる機能的な微小血管床（microvascular bed）を入手できることである。従って、多数のインスリン産生細胞を播種され、移植後に細胞の過半数が保持され、細胞の生存のための血管環境が与えられる３次元構築物に対する需要が依然として存在する。本発明の生分解性構築物はそのような３次元多孔質マトリックスを提供する。

本発明は播種およびその後のインスリン産生細胞を含む複数の哺乳類細胞の移植に使用するのに好適な埋め込み可能なパウチを対象としている。好適な一実施形態では、パウチの壁は生体適合性であり、生体適合性のメッシュで補強されたフォーム・マトリックスからなる。使用時、パウチの内腔はインスリン分泌細胞の懸濁液を装填される。このメッシュを包埋する生体適合性のマトリックスは、好ましくは凍結乾燥法を用いて形成された多孔質のポリマーフォームであるのが好ましい。この構築物はインスリン分泌細胞の導入に先立って血管床を備えるのにも使用してもよい。パウチの内腔は生体適合性の栓で満たして組織成長して内腔内に侵入するのを制限し、臨床的に関連する部位に埋め込んだ後で栓を除去し、パウチの内腔内にインスリン分泌細胞を注入してもよい。パウチには生物学的に活性な化合物またはヒドロゲルを任意に１種以上装填してもよい。パウチの壁はガラス転移温度が生理学的温度より低いポリマーで構成してパウチが軟質組織に埋め込まれたときに刺激を最低限にするようにするのが好ましい。

本発明の構築物は細胞が分泌した生物学的因子または合成医薬品を送達するベヒクルとしても作用することができる。そのような剤は成長因子、タンパク質、サイトカイン類の増加調節（up-regulation）または減少調節（down-regulation）を指令する。疾患にかかった哺乳類に埋め込む前にまたは埋め込んだ後に多数の細胞をそのようなパウチに播種することができる。

本発明に従えば、多数のインスリン産生細胞を播種され、移植後に細胞の過半数が保持され、細胞の生存のための血管環境が与えられる３次元構築物が得られる。

埋め込み可能な組織足場パウチはここでは糖尿病の治療に使用されるものとして開示されている。埋め込み可能な組織足場パウチの斜視図を図１に示す。埋め込み可能なパウチ１は壁２それに囲まれる内腔５からなる。壁２は多孔質フォームマ・トリックス３からなるのが好ましく、このマトリックス３はメッシュ４で補強されているのがもっとも好ましい。内腔の容積は少なくとも１×１０^-3ｃｍ³である。この容積は少なくとも０．１ｃｍ³であるのが好ましい。インスリン産生細胞の数とサイズ並びに埋め込み部位によってパウチ１の多さが決まる。多孔質パウチ１は一般に長軸と円形、卵形または多角形の断面を有する。製造が容易なために好ましいのは卵形断面である。

図１は３つの側面が密封され、１端部が開いている２つの矩形シートから構築されたパウチを示す図である。しかし、図１から明らかなように、内腔が壁２により形成され島または島状細胞を載置するのに十分な空洞が形成されるようにすることが必要とされることのすべてである。従って、パウチは１枚のシートから構築することもでき、複数枚のシートから構築し、何らかの適当な方法により合わせて密封することもできる。

パウチ１の壁２は細孔６を有し、その大きさは約０．１μｍ〜約５００μｍの範囲内であり、約５μｍ〜約４００μｍの範囲内が好ましい。埋め込み可能なパウチ１の内腔５は細胞懸濁液を含むヒドロゲルまたはマトリックスを充填してもよく、移植後のある時点で除去して細胞懸濁液と置き替えることができる非分解性材料からなる非多孔質スラブを充填してもよい。

壁２のフォーム部品３はエラストマー性であることが好ましく、その細孔径は５μｍ〜４００μｍの範囲内である。フォーム３は生物学的に活性なまたは製薬的に活性な化合物（例えばサイトカイン類（例えば、インターロイキン１〜１８；インターフェロンα、βおよびγ；成長因子類；コロニー刺激因子類、ケモカイン類等）、非サイトカイン白血球化学遊走剤類（例えば、Ｃ５ａ、ＬＴＢ₄等）、付着因子、遺伝子、ペプチド、タンパク質、ヌクレオチド、抗炎症剤、抗アポトーシス剤、炭水化物または合成分子類）を装填することができる。

好適な実施形態では、壁２の補強部品４は任意の吸収性または非吸収性の生体適合性材料からなっていてもよく、このような材料としては織られた、編まれた、縦編みされた（すなわち、レース様）、不織のおよび三つ編みされた構造を持つ繊維製品が挙げられる。例示的な一実施形態では、補強部品４はメッシュ状構造を有する。

上記構造のいずれにおいても、材料の機械的性質は材料の密度または風合（テキスチャー）を変えることにより、または材料中に粒子を埋設することにより変更することが可能である。補強部品４を作製するのに使用される繊維は単フィラメント、ヤーン、糸、ブレードまたは繊維束であってもよい。これらの繊維は任意の生体適合性材料からなっていてもよく、そのような材料としては生体吸収性材料、例えばポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリジオキサノン（ＰＤＯ）、トリメチレンカーボネート（ＴＭＣ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、それらの共重合体およびブレンド物が挙げられる。一実施形態では、これら繊維はポリグリコール酸とポリ乳酸の９５：５のモル比の共重合体から形成される。別の一実施形態では、これら繊維は１００％ＰＤＯポリマーから形成される。

埋め込み可能なパウチ１の壁２は吸収性または非吸収性のいずれでもよい生体適合性材料で作製される。壁２は可撓性の生体適合性材料から作製して患者に対する刺激を最低限にすることが好ましい。壁２はガラス転移温度が生理学的温度より低いポリマーまたはポリマーブレンドから作製されるのが好ましい。あるいはまた、パウチは可撓性にする可塑剤を配合したポリマーで作製することができる。

多数の生体適合性の吸収性および非吸収性材料を使用してフォーム部品３を作製することができる。好適な非吸収性材料としては、限定されないが、ポリアミド、ポリエステル（例えば、ポリエチレンテレフタレート、ポリブチルテレフタレート、それらの共重合体およびブレンド）、フッ素ポリマー（例えば、ポリテトラフルオロエチレン、ポリビニリデンフルオライド、それらの共重合体およびブレンド）、ポリオレフィン、ポリビニル樹脂（例えば、ポリスチレン、ポリビニルピロリドン、等）、およびそれらのブレンドが挙げられる。

種々の生体吸収性ポリマーを用いて本発明の壁２を作製することができる。好適な生体適合性・生体吸収性ポリマーの例としては、限定されないが、脂肪族ポリエステル、ポリ（アミノ酸）、コポリ（エーテル−エステル）、ポリアルキレンオキサレート、ポリアミド、チロシン誘導ポリカーボネート、ポリ（イミノカーボネート）、ポリオルトエステル、ポリオキサエステル、ポリアミドエステル、アミン基含有ポリオキサエステル、ポリ（酸無水物）、ポリホスファゼン、生体分子（すなわち、生体ポリマー、例えばコラーゲン、エラスチン、生体吸収性澱粉等）およびそれらのブレンドからなる群から選ばれるポリマーが挙げられる。

本発明において使用するのに特に好適なのは、脂肪族ポリエステル、共重合体およびブレンドであって、限定されないが、ラクチド（Ｄ−、Ｌ−乳酸およびＤ−、Ｌ−およびメソラクチドを含む）、グリコリド（グリコール酸を含む）、オキサエステル、ε−カプロラクトン、ｐ−ジオキサノン、ｐ−ジオキサノンのアルキル置換誘導体（例えば、６，６−ジメチル−１，４−ジオキサン−２−オン）、トリメチレンカーボネート（１，３−ジオキサン−２−オン）、１，３−ジオキサノンのアルキル置換誘導体、δ−バレロラクトン、β−ブチロラクトン、γ−ブチロラクトン、ε−デカラクトン、ヒドロキシブチレート、１，４−ジオキセパン−２−オンおよびそのダイマーの１，５，８，１２−テトラオキサシクロテトラデカン−７，１４−ジオン、１，５−ジオキセパン−２−オン、およびそれらのポリマーブレンドからなる群から選ばれる生体適合性吸収性ポリマーが挙げられる。

壁２の補強部品４は、ラクチドおよびグリコリドからなるのが好ましく、場合によって本明細書においては、単に単独重合体、ラクチドとグリコリドの共重合体、グリコリドとε−カプロラクトンの共重合体と呼ばれる。メッシュとして用いるのにもっとも好適なのは約８０重量％〜約１００重量％のグリコリドと残部ラクチドとの共重合体である。より好適なのは、約８５重量％〜約９５重量％のグリコリドと残部ラクチドとの共重合体である。もう一つの好適なポリマーは１００％ＰＤＯである。

好適なフォーム部品３はグリコリド、ラクチド、ポリジオキサノン、およびε−カプロラクトンの単独重合体、共重合体またはブレンドである。より好適なのはグリコリドとカプロラクトンの共重合体である。もっとも好適なのは６５：３５グリコリド：カプロラクトン共重合体である。

本明細書において使用されているように、「グリコリド」という用語はポリグリコール酸を含むと理解される。さらに、「ラクチド」という用語はＬ−ラクチド、Ｄ−ラクチド、それらのブレンド、並びに乳酸重合体および共重合体を含むと理解される。

とくに望ましい組成物としては約３５重量％〜約４５重量％のε−カプロラクトンと約５５重量％〜約６５重量％のグリコリド、ラクチド（または乳酸）およびそれらの混合物とのエラストマー性共重合体が挙げられる。もう一つの特に望ましい組成物としては、ｐ−ジオキサノン単独重合体または約０重量％〜約８０重量％のｐ−ジオキサノンと、約０重量％〜約２０重量％のラクチド、グリコリドおよびそれらの組み合わせのいずれかとの共重合体が挙げられる。インビボにおける膜の分解時間は１ヶ月より長く６カ月よりも短いのが好ましく、１カ月より長く４カ月より短いのがさらに好ましい。

本発明で使用されるポリマーの分子量は、当業界でよく知られているように、変更して所望の性能特性をもたせることができる。しかしながら、脂肪族ポリエステルが、２５℃において０．１ｇ／ｄｌヘキサフルオロイソプロパノール溶液中で測定して約０．５デシリットル／グラム（ｄｌ／ｇ）〜約５．０デシリットル／グラム（ｄｌ／ｇ）、好ましくは約０．７デシリットル／グラム（ｄｌ／ｇ）〜３．５デシリットル／グラム（ｄｌ／ｇ）の固有粘度を与える分子量を持つようにするのが好ましい。

あるいはまた、壁２の補強部品４は不織足場であってもよい。不織足場は湿式積層または乾式積層作製技術を用いて作製することができる。組織足場パウチ１の不織足場の繊維をもう一つの生分解性ポリマーと熱的方法を用いて融合することで組織足場パウチ１の繊維性不織足場の構造的一体性をさらに向上させることができる。例えば、生体吸収性熱可塑性重合体または共重合体、例えば粉末形状のポリカプロラクトン（ＰＣＬ）を不織足場に添加し、穏やかに加熱処理するとＰＣＬ粒子が溶融するが、繊維の構造には影響を与えない。この粉末の融点は低いので、この方法の後の段階で結合剤として働き不織足場の引張強度と剪断強度とが増加する。ＰＣＬの微粉状粉末の好ましいサイズは直径１０μｍ〜５００μｍ、さらに好ましくは直径１０μｍ〜１５０μｍである。追加の結合剤としては、ポリ乳酸、ポリジオキサノン、およびポリグリコール酸またはそれらの組み合わせからなる群から選ばれる生分解性結合剤が挙げられる。

あるいはまた、不織足場の繊維は不織足場を別の生分解性ポリマーの溶液を噴霧するか同溶液中に浸漬することによって相互に融着させてもよい。

本発明のパウチ１の内腔５を包囲するフォーム３は当技術において通常の伎倆を有する者によく知られた種々の技術により形成することができる。例えば、ポリマー性出発材料を凍結乾燥、超臨界溶媒フォーミング、ガス注入押出、ガス注入成形、または抽出可能な材料（例えば、塩、糖などの適当な材料）とともにキャスチングすることにより形成してもよい。

一実施形態では、パウチ１のフォーム部分３はポリマー−溶媒相分離技術、例えば凍結融解により作製することができる。一般には、しかしながら、ポリマー溶液は４つの技術：（ａ）熱的に誘導されるゲル化／結晶化、（ｂ）非溶媒的に誘導される溶媒相とポリマー相の分離、（ｃ）化学的に誘導される相分離、および（ｄ）熱的に誘導される尖点（spinodal）分解のいずれか一つにより２つの相に分離することができる。このポリマー溶液は調節された仕方で２つの明瞭に分かれた相にまたは２つの同相写像的な相に分離される。次いで、溶媒を除去すると、通常はバルクのポリマーよりも密度が低く、細孔がμｍの範囲である多孔質構造が残る。

壁２のフォーム部品３の調製に係わる工程としては、ポリマーを凍結融解するのに適した溶媒を選択し、このポリマーの上記溶液における均質な溶液を調製することが挙げられる。次いで、このポリマー溶液を凍結と真空乾燥のサイクルにかける。凍結工程によりポリマー溶液が相分離し、真空乾燥工程により溶媒が昇華および／または乾燥により分離され、多孔質のポリマー構造または相互に結合した開放気泡フォームが残る。

フォーム足場部品３の調製に用いることができる好適な溶媒としては、限定されないが、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジメチレンフルオライド（ＤＭＦ）、およびポリジオキサノン（ＰＤＯ）、ｐ−キシレン、Ｎ−メチルピロリドン、ジメチルホルムアミド、クロロホルム、１，２−ジクロロメタン、ジメチルスルホキシド、およびそれらの混合物が挙げられる。これらの溶媒の中で、好ましい溶媒は１，４−ジオキサンである。この溶媒におけるポリマーの均質な溶液は標準的な技術を用いて調製される。

適用可能なポリマー濃度または使用することができる溶媒の量は各系によって変わる。一般に、溶液中のポリマーの量は、所与の溶媒に対するポリマーの溶解度およびフォーム足場に望まれる最終的な性質のような因子によって、約０．０１重量％から約９０重量％まで変化し得るものであり、好ましくは約０．０５重量％から約３０重量％まで変化し得る。

メッシュ補強材料４を使用する場合は、２つの薄い（例えば、０．４ｍｍ）のシムの間に配置される。この補強材は金型中の所望の深さにほぼ平坦な向きに配置する必要がある。パウチ１に必要とされる断面積に相当する断面積をもつ金属製またはテフロン（登録商標）製インサートが２つの伸長されたメッシュ層の間に配置される。ポリマー溶液は空気の気泡がメッシュ部品の層間から逃れることができるような仕方で注入される。金型を所望の角度だけ傾斜させて調節された速度で注入を行い気泡の形成が最大限に抑制されるようにするのが好ましい。当業者には判るように、多数の変数が傾斜角と注入速度を調節している。一般に、金型を約１°よりも大きい角度で傾斜させて気泡の形成を回避する必要がある。加えて、注入速度は十分低くして空気の気泡があれば金型内に閉じ込められずに、金型から逃れることができるようにする必要がある。

メッシュ材料が補強部品４として使用されている場合は、メッシュ開口部の密度は所望の機械的性質を持つ組織の移植片の形成における重要な因子である。低い密度または開放編みメッシュ材料が好ましい。特に好適な材料の一つはＰＧＡ／ＰＬＡの９０／１０共重合体であり、商品名ビクリル（VICRYL）（ニュージャージー州サマービル、エシコン社（Ethicon, Inc.）から販売されている。例示的な低密度、開放編みメッシュの一例は、ニュージャージー州サマービル、エシコン社から入手できるニット・ビクリル（Knitted VICRYL）ＶＫＭ−Ｍである。パウチに使用できる他の編まれたまたは織られたメッシュ材料は、商品名パナクリル（PANACRYL）（ニュージャージー州サマービル、エシコン社）で販売されているＰＬＡ／ＰＧＡの９５／５共重合体、または１００％ＰＤＯポリマーである。

パウチ１の内腔５内に装填される哺乳類細胞は膵臓の外分泌、内分泌および導管成分を含む膵臓組織から分離される。あるいはまた、ミンチした膵臓組織または導管のフラグメントをパウチ１の内腔５に装荷してもよい。さらに、これらの細胞を標準的培養条件下で培養して細胞数を増やしたのち、これら細胞を培養プレートから分離して装置に投与してから装置を埋め込んでもよい。あるいはまた、分離した細胞を直接パウチ１内に注入し、次いで増殖および適当な生物学的マトリックスの堆積を促進する条件下で培養してからインビボ埋め込みをしてもよい。この好適な実施形態では、分離された細胞はインビボ埋め込みに先立ってそれ以上インビトロで培養することなく直接パウチ１に注入される。他の実施形態では、細胞を他の多孔質生体適合性マトリックス、例えば不織マット、ヒドロゲルまたはそれらの組み合わせ内に播種したのち、パウチの内腔５内に置く。

本発明の構築物上に播種または培養することができる細胞としては、限定されないが、膵臓のβ細胞の特徴的マーカーを少なくとも一つ表現する細胞が挙げられる。これらの細胞は埋め込みの直前に本発明のパウチの内腔５内に短期間（＜１日）播種するか、または長期間（＞１日）培養してパウチ１内で細胞を増殖させるとともにマトリックスの合成をさせてから埋め込む。

糖尿病（ＤＭ）のような疾患の治療のためには、細胞を播種した足場パウチ１を臨床的に適した部位、例えば皮下スペース、腸管膜または網（omentum）に置くことができる。この特定の場合、本発明のパウチ１は投与された細胞を異所性の部位（ectopic site）に移植した後その場所に閉じ込めるベヒクルとして働く。

島を門脈循環に注入することにより直接移植する従前の試みは糖尿病の長期治療には不十分であることが判った。さらに、同種または異種β細胞を生分解性または非分解性の微小球とともにカプセル化する方法の多くは血糖値の長期間のコントロールを維持できなかった。これらの失敗の原因は脈管構造が不十分であること、および／または移植された島の免疫拒絶に帰せられる。

これらの失敗は異種または同種インスリン産生細胞を、島の生存および移植された島の免疫応答の防止に役立つと考えられる同種または異種セルトリ細胞と組み合わせて投与することにより回避することができる。異種、同種または形質転換されたセルトリ細胞は腎臓被膜（capsule）内でそれ自体を保護する一方、同種または異種の島を免疫保護する。

本発明のさらに別の実施形態では、パウチ１の壁２は物理的手段または化学的手段のいずれかにより改変して目的の細胞タイプの付着、増殖、分化およびマトリックス合成を促進する生物学的または合成因子を含有させることができる。さらに、これら生理活性因子はマトリックスの一部を構成して徐々に放出されるようにして所望の生物学的機能を引き出すようにしてもよい。他の実施形態としては、内因性成長因子の増加調節または減少調節に影響する小分子の送達を挙げてもよいであろう。本発明のマトリックスとともに使用できる成長因子、細胞該マトリックスタンパク質および生物学的に関連するペプチド断片としては、限定されないが、ＴＧＦ−β１、２、および３を始めとするＴＧＦ−β族のメンバー、骨形成タンパク質（ＢＭＰ−２、−４、−６、−１２、−１３および−１４）、線維芽細胞成長因子−１および−２、血小板由来成長因子−ＡＡおよび−ＢＢ、血小板に富む血漿、インスリン成長因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＩ）、成長分化因子（ＧＤＦ−５、−６、−８、−１０）、アンギオジェン（angiogen）、エリスロポイエチン、胎盤成長因子、血管上皮細胞由来成長因子（ＶＥＧＦ）のような血管新成促進因子、カテリシジン（cathelicidins）、デフェンシン（defensins）、グルカゴン様ペプチドＩ、エクセンジン（exendin）−４、プレイオトロフィン（pleiotrophin）、エンドセリン（endothelin）、副甲状腺ホルモン、幹細胞因子、コロニー刺激因子、テエネイシン（tenascin）−Ｃ、トロポエラスチン（tropoelastin）、スロンビン由来ペプチド、抗拒絶剤、鎮痛剤、抗炎症剤、例えばアセトアミノフェノン、抗アポトーシス剤、スタチン、細胞分裂抑制剤、例えばラパマイシン、並びに粘着性細胞該マトリックスタンパク質の細胞−およびヘパリン−結合領域を含む生物学的ペプチド、例えばフィブロネクチン、ビトロネクチンが挙げられる。これら生物学的因子は組織から分離精製された、または化学的に合成された商業的供給源から得ることができる。

実施例
以下の実施例は細胞および細胞性物質を哺乳類に埋め込むためのパウチの硬質を説明する。当業者には、本発明の範囲はこれらの具体的な実施例により限定されず、パウチ１の多くの選択的な形態を本発明の範囲内で創成することができることが判る。

埋め込み可能なパウチの製造
パウチ内に凍結乾燥すべきポリマーの溶液を調製した。フォーム成分を製造するのに用いたポリマーはバーミンガム・ポリマー社（Birmingham Polymers Inc.）製の３５％ＰＣＬと６５％ＰＧＡ（３５／６５ＰＣＬ／ＰＧＡ）共重合体であり、ＨＦＩＰ中３０℃で測定した固有粘度（Ｉ．Ｖ．）は１．７９ｄＬ／ｇである。９５／５重量比の１，４−ジオキサン／（３５／６５ＰＣＬ／ＰＧＡ）を計り分けた。このポリマーと溶媒をフラスコ内に入れ、このフラスコを水浴中に置き、７０℃で５時間撹拌した。この溶液を抽出シンブル（thimble）（超粗多孔度、ＡＳＴＭ１７０−２２０（ＥＣ）型）を用いてろ過し、フラスコ中に貯蔵した。

商品名ビクリル（VICRYL）で販売されている、ポリグリコール酸／ポリ乳酸（ＰＧＡ／ＰＬＡ）の９０／１０共重合体編成（コードＶＫＭ−Ｍ）メッシュを、圧縮成形機を用いて８０℃で２分間アイロンがけして平坦にした。メッシュを調製した後、０．４ｍｍの詰め木を１５．３×１５．３ｃｍアルミニウム金型の各端部に置き、２つのメッシュのサイズを決めて所望のサイズのパウチを製造した。これら２つのメッシュ層を、図３に示すように、それぞれの頂部が接するようにフレームＡとＢの間で伸ばし、次いでこの複合体を詰め木の上に配置してメッシュが添加される液中に懸垂されるようにした。必要とされるパウチの開口部の断面積に相当する断面積（０．４×８．０または０．４×４．０ｍｍ²）を持つ金属またはテフロン（登録商標）製のインサートをメッシュの２つの新調された層の間に置く。５０℃に加熱されたポリマー溶液を側方から頂部メッシュ層が完全に覆われるまで徐々に注ぐ。ポリマー溶液約６０ｍｌを金型内に徐々に移し、上記溶液が金型内に確実に十分に分散されるようにした。次いで、この金型をバーティス（Virtis）社のフリーズ・モバイル（Freeze Mobile）Ｇ凍結乾燥機内の棚に置いた。本実施例で用いた凍結乾燥シーケンスは次の通りである：１）−１７℃６０分間、２）１００ｍＴ真空下、−５℃６０分間、３）２０ｍＴ真空下、５℃６０分間、４）２０ｍＴ真空下、２０℃６０分間。

図１はインサートを除去した後の得られたパウチを示し、パウチの内腔を包囲する補強フォーム３を含む。図２はパウチの断面の走査電子顕微鏡図（ＳＥＭｓ）を示す。このＳＥＭはパウチ内の凍結乾燥した補強フォーム足場を明瞭に示している。次いで、金型アッセンブリを凍結乾燥機から取り出し、窒素箱内に一晩置いた。この工程の完了後、得られた構築物を注意深く金型から剥離して取り外し可能なインサートを含むフォーム／メッシュ・シートの形のものを得た。インサートは細胞を装荷し、インビボ埋め込みする前に取り外してもよく、または移植後の後の時期に取り外してもよい。後者の場合、細胞はインサートを取り外した際に内腔内に装荷される。

埋め込み可能なパウチの製造
織られたビクリル（コードＶＷＭ−Ｍ）、すなわちポリグリコール酸／ポリ乳酸（ＰＧＡ／ＰＬＡ）の９０／１０共重合体から形成された補強メッシュ材料を用いた以外は実施例１の方法に従って生分解性パウチを製造した。

埋め込み可能なパウチの製造
１００％ＰＤＳから形成された、編まれた補強メッシュ材料を用いた以外は実施例１の方法に従って生分解性パウチを製造した。

哺乳類細胞を有する埋め込み可能な足場
本実施例はマウスの島を本発明に記載のパウチの内腔内に播種することを説明する。
マウスの島の分離は、Ｂａｌｂ／ｃマウスから膵臓のコラゲナーゼ消化とフィコール密度勾配遠心分離したのち島を手で取り上げることにより行った。

パウチを実施例１に記載したように調製し、５００個の新鮮な島を播種し、ハムズ（Hams）−Ｆ１０（ジブコ・ライフ・テクノロジーズ（Gibco Life Technologies）社、メリーランド州ロックビル）に、ウシ血清アルブミン（０．５％）、ニコチンアミド（１０ｍＭ）、Ｄ−グルコース（１０ｍＭ）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ＩＢＭＸ（３−イソブチル−１−メチルキサンチン、５０ｍＭ）およびペニシリン／ストレプトマイシンを添加した培地中で１週間培養した。１週間後、パウチ内に存在する島をカルセイン（calcein）とエチジウム・ホモダイマー（モレキュラー・プローブズ（Molecular Probes）社、オレゴン州）で染色して播種した細胞の生存率を評価した。カルセイン染色陽性の島が過半数であることから、パウチの内腔内で生存可能の細胞であることが示された。

以下に本発明の好適な実施態様の例を示すが、本発明はこれらの例に限定されない。
（１）前記疾患は糖尿病であることを特徴とする請求項１に記載のパウチ。
（２）前記孔径は約０．１μｍ〜約５００μｍであることを特徴とする実施態様（１）に記載のパウチ。
（３）前記孔径は約５μｍ〜約４００μｍであることを特徴とする実施態様（２）に記載のパウチ。
（４）前記内腔は少なくとも約１×１０^-3ｃｍ³の容積を有することを特徴とする請求項１に記載のパウチ。
（５）前記内腔は少なくとも約０．１ｃｍ³の容積を有することを特徴とする実施態様（４）に記載のパウチ。

（６）さらに補強部品を含むことを特徴とする請求項１に記載のパウチ。
（７）前記補強部品はメッシュであることを特徴とする実施態様（６）に記載のパウチ。
（８）前記壁は生体適合性材料であることを特徴とする請求項１に記載のパウチ。
（９）前記壁はフォームを含むことを特徴とする請求項１に記載のパウチ。
（１０）前記フォームは生体適合性活性化剤を含浸されていることを特徴とする実施態様（９）に記載のパウチ。

（１１）前記内腔もセルトリ細胞を含むことを特徴とする請求項２に記載のパウチ。
（１２）前記ポリマーはフォームであることを特徴とする請求項３に記載の方法。
（１３）前記ポリマーはグリコリド、ラクチド、ポリジオキサノンおよびε−カプロラクトンの単独重合体、共重合体またはブレンドであることを特徴とする実施態様（１２）に記載の方法。
（１４）前記ポリマーはグリコリドとカプロラクトンの共重合体であることを特徴とする実施態様（１３）に記載の方法。
（１５）さらにメッシュ補強部品を前記壁に隣接して形成することを特徴とする請求項３に記載の方法。

（１６）前記メッシュ補強部品はグリコリド、ラクチド、ポリジオキサノンおよびε−カプロラクトンの単独重合体、共重合体またはブレンドであることを特徴とする実施態様（１５）に記載の方法。
（１７）前記メッシュ補強部品は約８０重量％〜約１００重量％のグリコリドと残部ラクチドからなることを特徴とする実施態様（１６）に記載の方法。

本発明にかかる埋め込み可能なパウチの一実施形態を示す斜視図である。実施例１に記載の方法により作製された本発明のパウチ足場の一実施形態の走査電子顕微鏡図である。本発明にかかる埋め込み可能なパウチの製造方法の一実施形態を示す斜視図である。

符号の説明

１パウチ
２壁
３マトリックス
４メッシュ
５内腔

Claims

埋め込みに適し、かつ疾患の治療に適したパウチであって、生体適合性の壁と内腔とを備え、該壁は複数個の細孔を有し、該細孔は特定のサイズの細胞および栄養物の進入進出を許容するが、該特定のサイズよりもサイズの大きい細胞の進入進出を許容しない適切なサイズを有することを特徴とするパウチ。
埋め込みに適し、かつ糖尿病の治療に適したパウチであって、生体適合性の壁と内腔とを備え、該壁は複数個の細孔を有し、該細孔は特定のサイズの細胞および栄養物の進入進出を許容するが、該特定のサイズよりもサイズの大きい細胞の進入進出を許容しない適切なサイズを有し、該内腔インスリン産生細胞を含む材料で充填されていることを特徴とするパウチ。
生体適合性の壁と内腔とを備え、該壁は複数個の細孔を有し、該細孔は特定のサイズの細胞および栄養物の進入進出を許容するが、該特定のサイズよりもサイズの大きい細胞の進入進出を許容しない適切なサイズを有する、埋め込みに適し、かつ疾患の治療に適したパウチの製造方法であって、ポリマーを選択し、該ポリマーを凍結乾燥し、得られた凍結乾燥されたポリマーを包装材料に成形することを特徴とするパウチの製造方法。