JP2004290121A

JP2004290121A - 植物の細胞形態と細胞壁成分の改変方法

Info

Publication number: JP2004290121A
Application number: JP2003089397A
Authority: JP
Inventors: Shigeru Sato; 茂佐藤; Nanae Yamada; 奈々江山田
Original assignee: Oji Paper Co Ltd
Current assignee: New Oji Paper Co Ltd
Priority date: 2003-03-27
Filing date: 2003-03-27
Publication date: 2004-10-21

Abstract

【課題】植物の細胞壁合成と細胞伸長に関与するＡＣＷ６遺伝子、その類似遺伝子、およびこれら遺伝子がコードするタンパク質を提供することを課題とする。また、本発明は、これら遺伝子を利用して植物の細胞壁成分や細胞形態を改変することを課題とする。
【解決手段】ポジショナルクローニングの手法を用いることにより、植物の細胞壁合成と細胞伸長に異常をもたらすａｃｗ６変異の原因となる単一の遺伝子を広大な染色体領域において同定し、単離することに成功した。また、本発明者らは、単離したＡＣＷ６遺伝子が植物の細胞壁合成や細胞伸長に影響を与えていることから、ＡＣＷ６遺伝子やその類似遺伝子を利用することにより、植物の細胞壁成分や細胞形態を改変することが可能であることを見出した。
【選択図】なし

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、植物の細胞壁合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子を利用した、植物の細胞壁成分と細胞形態の改変に関する。
【０００２】
【従来の技術】
植物において細胞壁合成と細胞形態形成を制御することは、工業や農業の分野において、様々な重要な意義を有する。例えば、植物の細胞璧成分の改変は、セルロース・ヘミセルロース含量を高めることによるパルプ等の優良繊維原材料供給や、有用な農作物および飼料作物の消化吸収効率の向上などをもたらし、経済性や収益性の点で有意義である。また、細胞壁成分である多糖の構造変化により、新たな産業的価値を有する原材料植物の作出をもたらすことも可能である。さらに細胞形態の改変は、パルプ等繊維原材料の繊維特性の向上などの点で有意義である。
【０００３】
細胞壁およびそれに類する多糖成分の合成は、バクテリア・菌類・植物だけでなく動物でも行われている。細胞壁合成の分子レベルでの研究は、その産業的重要性にもかかわらず、あまり解析は行われていない。植物の細胞壁合成の分子レベルでの研究に関しては、近年、分子遺伝学の手法を用いて解析が行われはじめてきた。細胞壁合成に関与する遺伝子としては、これまでに例えば、セルロース合成酵素などが報告されている（Ｔ．Ａｒｉｏｌｉｅｔａｌ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒａｎａｌｙｓｉｓｏｆｃｅｌｌｕｌｏｓｅｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９８）２７９：７１７−７２０）。しかし、細胞壁合成に関わる遺伝子としては、いまだ単離されていない多くの遺伝子が存在すると考えられ、細胞壁合成に関しては未知の機構が存在すると考えられている（参考文献：Ｋａｗａｇｏｅ，Ｙ．ａｎｄＤｅｌｍｅｒ，Ｄ．Ｐ．，Ｐａｔｈｗａｙａｎｄｇｅｎｅｓｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｃｅｌｌｕｌｏｓｅｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；Ｇｅｎｅｔｉｃｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ１９ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９９７；Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｋ．ＨｏｗｔｈｅＣｅｌｌＷａｌｌＡｃｑｕｉｒｅｄａＣｅｌｌｕｌａｒＣｏｎｔｅｘｔ．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．１２５：１２７−１３０，２００１）。
【０００４】
植物の形態形成において、細胞（繊維）の伸長生長は大変重要である。細胞伸長の分子レベルでの研究は、近年、分子遺伝学の手法を用いて解析が行われている。細胞伸長に関与する遺伝子としては、これまでに例えば、微小管結合タンパクなどが報告されている（Ｗｈｉｔｔｉｎｇｔｏｎ，Ａ．Ｔ．ｅｔａｌ．ＭＯＲ１ｉｓｅｓｓｅｎｔｉａｌｆｏｒｏｒｇａｎｉｚｉｎｇｃｏｒｔｉｃａｌｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅｓｉｎｐｌａｎｔｓ．Ｎａｔｕｒｅ（２００１）４１１：６１０−６１３）。しかし、細胞伸長に関わる遺伝子としては、いまだ単離されていない多くの遺伝子が存在すると考えられ、細胞伸長に関しては未知の機構が存在すると考えられている（Ｋ．Ｎｉｓｈｉｔａｎｉ，ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎａｎｄＲｅｓｔｒｕｃｔｕｒｉｎｇｏｆｔｈｅｃｅｌｌｕｌｏｓｅ−ｘｙｌｏｇｌｕｃａｎｆｒａｍｅｗｏｒｋｉｎｔｈｅａｐｏｐｌａｓｔａｓｍｅｄｉａｔｅｄｂｙｔｈｅｘｙｌｏｇｌｕｃａｎ−ｒｅｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｆａｍｉｌｙ−Ａｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌｓｃｈｅｍｅ．Ｊ．ＰｌａｎｔＲｅｓ．１１１：１５９−１６６，１９９８）。
【０００５】
一方、ユビキチンリガーゼ（ユビキチン化因子）は、細胞タンパク質分解の主要経路であるユビキチン・プロテアソーム系で働く酵素である。ユビキチンリガーゼは、特定の標的タンパクに低分子タンパク質であるユビキチンを多数付加する役割を持つ。ユビキチンが多数付加された標的タンパク（ポリユビキチン化タンパク）は、細胞内のタンパク分解装置である２６Ｓ−プロテアソームによって認識され分解される。ユビキチンリガーゼは、動物・植物などの生物一般に広く存在し、ゲノム中で遺伝子ファミリーを形成している。各ユビキチンリガーゼは、それぞれ特有の生命現象に関わるタンパク群をユビキチン化しており、ユビキチン化された標的タンパクは、それぞれに特異的なプロテアソームによって分解される。植物のユビキチンリガーゼとしては、Ｆ−ボックスタンパクを中心とするＳＣＦ（Ｓｋｐ１タンパク＋Ｃｕｌ１タンパク＋Ｆ−ｂｏｘタンパク）複合体が知られているが、近年、Ｕ−ボックスタンパク質もユビキチンリガーゼとして機能することが示唆されている。高等植物ではアラビドプシス、タバコ、ダイズなどから、Ｕ−ボックスタンパク質遺伝子が単離同定されており、高いホモロジーを示している。しかしながら、ごく一部を除いて、それらがどのような生命現象に関わっているかは、未だ明確にされていない。（Ｓｐｒｅｍｕｌｌｉ，Ｌ．（２０００）ＰｒｏｔｅｉｎＳｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａｓｓｅｍｂｌｙ，ａｎｄＤｅｇｒａｄａｔｉｏｎ．ＩｎＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙｏｆＰｌａｎｔｓ．ＥｄｉｔｅｄｂｙＢｕｃｈａｎａｎ，Ｂ．Ｂ．，Ｇｒｕｉｓｓｅｍ，Ｗ．ａｎｄＪｏｎｅｓ，Ｒ．Ｌ．ｐｐ．４１２−４５４，ＡｚｅｖｅｄｏＣ．ｅｔａｌ．，ＴｈｅＵ−ｂｏｘｐｒｏｔｅｉｎｆａｍｉｌｙｉｎｐｌａｎｔｓ．（２００１）．ＴｒｅｎｄｓｉｎＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅ６：３５４−３５８）。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
ところで化学突然変異剤ＥＭＳによって処理されたシロイヌナズナの集団の中に、＃６８という検索番号が付けられた、細胞や器官の形、細胞壁合成が異常な突然変異体が見出された。この突然変異はａｌｔｅｒｅｄｃｅｌｌｗａｌｌ（ａｃｗ）６と名付けられ、この突然変異の原因となっている遺伝子がＡＣＷ６遺伝子と命名された。光学顕微鏡による組織観察の結果から、ＡＣＷ６遺伝子は細胞（繊維）伸長や細胞分化に関与していることが示唆された。また、電子顕微鏡による組織化学的解析から、ＡＣＷ６遺伝子は細胞壁合成にも関与していることが示唆された。しかしながら、ＡＣＷ６遺伝子についてはいまだ単離・同定されていない。
【０００７】
そこで、本発明は、植物の細胞壁合成と細胞伸長に関与するＡＣＷ６遺伝子、その類似遺伝子、およびこれら遺伝子がコードするタンパク質を提供することを課題とする。また、本発明は、これら遺伝子を利用して植物の細胞壁成分や細胞形態を改変することを課題とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行い、ポジショナルクローニングの手法を用いることにより、植物の細胞壁合成と細胞伸長に異常をもたらすａｃｗ６変異の原因となる単一の遺伝子を広大な染色体領域において同定し、単離することに成功した。また、本発明者らは、単離したＡＣＷ６遺伝子が植物の細胞壁合成や細胞伸長に影響を与えていることから、ＡＣＷ６遺伝子やその類似遺伝子を利用することにより、植物の細胞壁成分や細胞形態を改変することが可能であることを見出した。
【０００９】
即ち、本発明は、植物の細胞壁合成に関わるＡＣＷ６遺伝子、その類似遺伝子、およびこれら遺伝子がコードするタンパク質、並びにこれら遺伝子を利用した植物の細胞壁成分と細胞形態の改変などに関し、より具体的には、
（１）植物由来の下記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡ、
（ａ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号：２に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ
（ｃ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｄ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
（２）（１）に記載のＤＮＡを含むベクター、
（３）（１）に記載のＤＮＡを発現可能に保持する形質転換細胞、
（４）（１）に記載のＤＮＡによりコードされるタンパク質、
（５）（３）に記載の形質転換細胞を培養し、発現した組み換えタンパク質を回収する工程を含む、（４）に記載のタンパク質の製造方法、
（６）下記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡ、
（ａ）（１）に記載のＤＮＡの転写産物と相補的なアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ
（ｂ）（１）に記載のＤＮＡの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡ
（ｃ）植物細胞における発現時に、ＲＮＡｉ効果により、（１）に記載のＤＮＡの発現を抑制するＲＮＡをコードするＤＮＡ
（ｄ）植物細胞における発現時に、共抑制効果により、（１）に記載のＤＮＡの発現を抑制するＲＮＡをコードするＤＮＡ
（７）（６）に記載のＤＮＡを含むベクター、
（８）（１）または（６）に記載のＤＮＡを発現可能に保持する形質転換植物細胞、
（９）（８）に記載の形質転換植物細胞を含む植物体、
（１０）細胞壁成分が改変されている、（９）に記載の植物体、
（１１）細胞壁成分の改変がグルカン量の変化である、（１０）に記載の植物体、
（１２）細胞壁成分の改変がセルロース量の変化である、（１０）に記載の植物体、
（１３）細胞形態が改変されている、（９）に記載の植物体、
（１４）細胞形態の改変が細胞伸長の変化である、（１３）に記載の植物体、
（１５）細胞形態の改変が細胞の大きさの変化である、（１４）に記載の植物体、
（１６）発生分化が改変されている、（９）に記載の植物体、
（１７）発生分化の改変が細胞分裂の変化である、（１６）に記載の植物体、
（１８）発生分化の改変が細胞数と細胞の大きさの変化である、（１７）に記載の植物体、
（１９）（９）に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換植物体、
（２０）（９）または（１９）に記載の植物体の繁殖媒体、
（２１）（４）に記載のタンパク質に結合する抗体、
（２２）（１）に記載のＤＮＡと特異的にハイブリダイズし、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するＤＮＡ、を提供するものである。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明は、植物の細胞壁合成に関与するＡＣＷ６タンパク質をコードするＤＮＡを提供する。シロイヌナズナの細胞形態（伸長）と細胞壁合成に異常を示すａｃｗ６変異の原因遺伝子として、ポジショナルクローニングの手法を用いて、本発明者らが単離したＡＣＷ６遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列を配列番号：２に、ゲノムＤＮＡの塩基配列を配列番号：３に、これら遺伝子がコードするＡＣＷ６タンパク質のアミノ酸配列を配列番号：１に示す。
【００１１】
植物の細胞伸長と細胞壁成分に異常な表現型をもたらすａｃｗ６変異遺伝子座において、ａｃｗ６変異では本発明者らが単離したＡＣＷ６遺伝子の１８１１位の塩基の置換（Ｃ→Ｔ）と、それによる６０４位のアミノ酸の置換（Ｔ→Ｉ）として見出された（実施例３）。この事実は、本発明者らが単離したＡＣＷ６遺伝子が、植物の細胞伸長と細胞壁合成において機能しており、その変異により植物の細胞伸長と細胞壁合成の異常を生じることを証明するものである。このようなＡＣＷ６遺伝子と植物の細胞伸長や細胞壁合成との密接な関係は、植物においてＡＣＷ６遺伝子の発現を調節することにより、植物の細胞形態や細胞壁の合成を改変しうることを証明するものである。従って、ＡＣＷ６タンパク質およびＡＣＷ６遺伝子は、植物の細胞形態や細胞壁の合成を改変するために、もしくは改変するための標的として利用することが可能である。
【００１２】
本発明は、配列番号：１に記載のアミノ酸配列を有するＡＣＷ６タンパク質と構造的に類似しており、該タンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡを包含する。ここで「機能的に同等」とは、タンパク質が植物の細胞壁合成や細胞伸長において機能することを指す。タンパク質が植物の細胞壁合成や細胞伸長において機能するか否かは、変異株におけるタンパク質の発現による機能相補試験や、インビボにおけるタンパク質の機能阻害による細胞壁合成や細胞伸長の変化（細胞壁成分の変化や器官・細胞形態の変化）の検出により、決定することが可能である。
【００１３】
このようなＤＮＡには、例えば、配列番号：１に記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする変異体、誘導体、アリル、バリアントおよびホモログが含まれる。このようなＤＮＡが由来する植物としては、特に制限はないが、例えば、イネ・綿・ケナフ・ユーカリ・ポプラ・マツ、シロイヌナズナ、トウモロコシ、ジャガイモ、タバコなどが挙げられる。
【００１４】
アミノ酸配列が改変されたタンパク質をコードするＤＮＡを調製するための当業者によく知られた方法としては、例えば、ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ法（ＫｒａｍｅｒＷ＆ＦｒｉｔｚＨ−Ｊ：ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ１５４：３５０，１９８７）が挙げられる。また、アミノ酸の改変は、市販のキットを用いて行うこともできる。例えば、変異や置換であれば「ＴｒａｎｓｆｏｒｍｅｒＳｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＫｉｔ」や「ＥｘＳｉｔｅＰＣＲ−ＢａｓｅｄＳｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＫｉｔ」（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を、欠失であれば「ＱｕａｎｔｕｍｌｅａｐＮｅｓｔｅｄＤｅｌｅｔｉｏｎＫｉｔ」（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）などを用いて行うことが可能である。一方、自然界においても、塩基配列の変異によりコードするタンパク質のアミノ酸配列が変異することは起こり得る。このように、「ＡＣＷ６」タンパク質のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡであっても、天然型のタンパク質（配列番号：１）と同等の機能を有するタンパク質をコードする限りは、本発明のＤＮＡに含まれる。タンパク質におけるアミノ酸の改変は、通常、全アミノ酸の５０アミノ酸以内であり、好ましくは３０アミノ酸以内であり、さらに好ましくは１０アミノ酸以内であり、さらに好ましくは３アミノ酸以内である。好ましいアミノ酸の改変は、保存的置換である。また、たとえ塩基配列が変異していても、その変異がタンパク質中のアミノ酸の変異を伴わないこと（縮重変異）があるが、このような縮重変異体も本発明のＤＮＡに含まれる。
【００１５】
配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるＡＣＷ６タンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするＤＮＡを調製するために、当業者によく知られた他の方法としては、ハイブリダイゼーション技術（ＳｏｕｔｈｅｒｎＥＭ：ＪＭｏｌＢｉｏｌ９８：５０３，１９７５）やポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術（ＳａｉｋｉＲＫ，ｅｔａｌ：Ｓｃｉｅｎｃｅ２３０：１３５０，１９８５、ＳａｉｋｉＲＫ，ｅｔａｌ：Ｓｃｉｅｎｃｅ２３９：４８７，１９８８）を利用する方法が挙げられる。すなわち、当業者であれば、本発明のｃＤＮＡ塩基配列（配列番号：２）またはその一部をプローブとして、また、これらｃＤＮＡに特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして、イネや他の植物からこれらｃＤＮＡと高い相同性を有するＤＮＡを単離することは、通常行い得る。このように、ハイブリダイゼーション技術やＰＣＲ技術によって単離し得る、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡもまた、本発明のＤＮＡに含まれる。
【００１６】
このようなＤＮＡを単離するためには、好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション反応を行う。本発明においてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、６Ｍ尿素、０．４％ＳＤＳ、０．５×ＳＳＣの条件またはこれと同等のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を指す。よりストリンジェンシーの高い条件、例えば、６Ｍ尿素、０．４％ＳＤＳ、０．１×ＳＳＣの条件下では、より相同性の高いＤＮＡの単離が期待できる。高い相同性とは、アミノ酸配列全体で少なくとも５０％以上、好ましくは７０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％（例えば、９６，９７，９８，９９％）以上の配列の同一性を指す。
【００１７】
アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：２２６４−２２６８，１９９０、ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ９０：５８７３，１９９３）を用いて決定できる。ＢＬＡＳＴのアルゴリズムに基づいたＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（ＡｌｔｓｃｈｕｌＳＦ，ｅｔａｌ：ＪＭｏｌＢｉｏｌ２１５：４０３，１９９０）。ＢＬＡＳＴＮを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴＸを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）。
【００１８】
本発明のＤＮＡは、本発明のタンパク質をコードし得るものであれば特に制限はなく、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、化学合成ＤＮＡなどが含まれる。ゲノムＤＮＡは、例えば、文献（ＲｏｇｅｒｓａｎｄＢｅｎｄｉｃｈ，ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．５：６９（１９８５））記載の方法に従って調製したゲノムＤＮＡを鋳型として、本発明のＤＮＡの塩基配列（例えば、配列番号：２に記載の塩基配列）を基に作製したプライマーを用いてＰＣＲ（Ｓａｉｋｉｅｔａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２３９：４８７（１９８８））を行うことにより調製することが可能である。また、ｃＤＮＡであれば、常法（Ｍａｎｉａｔｉｓｅｔａｌ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇｈａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｒｙＰｒｅｓｓ）により植物からｍＲＮＡを調製し、逆転写反応を行い、上記と同様のプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより調製することが可能である。また、ゲノムＤＮＡやｃＤＮＡは、常法によりゲノムＤＮＡライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーを作製し、このライブラリーに対し、例えば本発明のＤＮＡの塩基配列（例えば、配列番号：２に記載の塩基配列）を基に合成したプローブを用いてスクリーニングすることによっても調製することが可能である。なお、得られたＤＮＡの塩基配列は、例えば「シークエンサーＭｏｄｅｌ３７３」（ＡＢＩ社製）を利用することにより容易に決定することが可能である。
【００１９】
本発明のＤＮＡは、また、形質転換植物体の作出に用いることができる。本発明のＤＮＡを発現する形質転換植物体を作製するには、上記ＤＮＡを適当なベクターに挿入して、これを植物細胞に導入し、これにより得られた形質転換植物細胞を再生させる。
【００２０】
植物細胞の形質転換に用いられるベクターは、植物細胞で転写可能なプロモーター配列と転写産物の安定化に必要なポリアデニレーション部位を含むターミネーター配列を含んでいれば特に制限されず、例えば、プラスミド「ｐＢＩ１２１」、「ｐＢＩ２２１」、「ｐＢＩ１０１」（いずれもＣｌｏｎｔｅｃｈ社製）などが挙げられる。本発明のベクターは、本発明のタンパク質を恒常的または誘導的に発現させるためのプロモーターを含有しうる。恒常的に発現させるためのプロモーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター（Ｏｄｅｌｌｅｔａｌ．１９８５Ｎａｔｕｒｅ３１３：８１０）、イネのアクチンプロモーター（Ｚｈａｎｇｅｔａｌ．１９９１ＰｌａｎｔＣｅｌｌ３：１１５５）、トウモロコシのユビキチンプロモーター（Ｃｏｒｎｅｊｏｅｔａｌ．１９９３ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３：５６７）などが挙げられる。
【００２１】
また、誘導的に発現させるためのプロモーターとしては、例えば糸状菌・細菌・ウイルスの感染や侵入、低温、高温、乾燥、紫外線の照射、特定の化合物の散布などの外因によって発現することが知られているプロモーターなどが挙げられる。このようなプロモーターとしては、例えば、糸状菌・細菌・ウイルスの感染や侵入によって発現するイネキチナーゼ遺伝子のプロモーター（Ｘｕｅｔａｌ．１９９６ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０：３８７）やタバコのＰＲタンパク質遺伝子のプロモーター（Ｏｈｓｈｉｍａｅｔａｌ．１９９０ＰｌａｎｔＣｅｌｌ２：９５）、低温によって誘導されるイネの「ｌｉｐ１９」遺伝子のプロモーター（Ａｇｕａｎｅｔａｌ．１９９３Ｍｏｌ．ＧｅｎＧｅｎｅｔ．２４０：１）、高温によって誘導されるイネの「ｈｓｐ８０」遺伝子と「ｈｓｐ７２」遺伝子のプロモーター（ＶａｎＢｒｅｕｓｅｇｅｍｅｔａｌ．１９９４Ｐｌａｎｔａ１９３：５７）、乾燥によって誘導されるシロイヌナズナの「ｒａｂ１６」遺伝子のプロモーター（Ｎｕｎｄｙｅｔａｌ．１９９０Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：１４０６）、紫外線の照射によって誘導されるパセリのカルコン合成酵素遺伝子のプロモーター（Ｓｃｈｕｌｚｅ−Ｌｅｆｅｒｔｅｔａｌ．１９８９ＥＭＢＯＪ．８：６５１）、嫌気的条件で誘導されるトウモロコシのアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター（Ｗａｌｋｅｒｅｔａｌ．１９８７Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：６６２４）などが挙げられる。また、イネキチナーゼ遺伝子のプロモーターとタバコのＰＲタンパク質遺伝子のプロモーターはサリチル酸などの特定の化合物によって、「ｒａｂ１６」は植物ホルモンのアブシジン酸の散布によっても誘導される。ベクターを導入する「植物細胞」には、種々の形態の植物細胞、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片、苗条原基、多芽体、毛状根、カルスなどが含まれる。また、植物体中の細胞も含まれる。植物細胞としては特に制限はなく、例えば、イネ・綿・ケナフ・ユーカリ・ポプラ・マツ、シロイヌナズナ、トウモロコシ、ジャガイモ、タバコなどの細胞が挙げられる。
【００２２】
植物細胞へのベクターの導入は、例えば、アグロバクテリウムを利用した導入方法（Ｈｏｏｄｅｔａｌ．１９９３ＴｒａｎｓｇｅｎｉｃＲｅｓ．２：２１８、Ｈｉｅｉｅｔａｌ．１９９４ＰｌａｎｔＪ．６：２７１）、エレクトロポレーション法（Ｔａｄａｅｔａｌ．１９９０Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ８０：４７５）、ポリエチレングリコール法（Ｌａｚｚｅｒｉｅｔａｌ．１９９１Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ８１：４３７）、パーティクルガン法（Ｓａｎｆｏｒｄｅｔａｌ．１９８７Ｊ．Ｐａｒｔ．Ｓｃｉ．ｔｅｃｈ．５：２７）など、当業者に公知の種々の方法を用いることができる。形質転換植物細胞からの植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である（ＴｏｋｉＳ，ｅｔａｌ：ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ１００：１５０３，１９９５）。
【００２３】
例えば、イネであればＦｕｊｉｍｕｒａら（ＰｌａｎｔＴｉｓｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅＬｅｔｔ．２：７４（１９９５））の方法が挙げられ、トウモロコシであればＳｈｉｌｌｉｔｏら（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ７：５８１（１９８９））の方法やＧｏｒｄｅｎ−Ｋａｍｍら（ＰｌａｎｔＣｅｌｌ２：６０３（１９９０））が挙げられ、ジャガイモであればＶｉｓｓｅｒら（Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ７８：５９４（１９８９））の方法が挙げられ、タバコであればＮａｇａｔａとＴａｋｅｂｅ（Ｐｌａｎｔａ９９：１２（１９７１））の方法が挙げられ、シロイヌナズナであればＡｋａｍａら（ＰｌａｎｔＣｅｌｌＲｅｐｏｒｔｓ１２：７−１１（１９９２））の方法が挙げられ、ユーカリであれば土肥ら（特許番号特開平８−８９１１３）の方法が挙げられる。
【００２４】
一方、本発明のＤＮＡの発現が抑制された植物体を作製するには、例えば、本発明のＤＮＡの発現を抑制するＤＮＡを上述した適当なベクターに挿入して、これを植物細胞に導入し、これにより得られた形質転換植物細胞を再生させればよい。ここで「ＤＮＡの発現の抑制」には、これらＤＮＡの転写の抑制およびタンパク質への翻訳の抑制が含まれる。また、ＤＮＡの発現の完全な停止のみならず発現の減少も含まれる。また、翻訳されたタンパク質が植物細胞内で本来の機能を発揮することを妨げることも含まれる。
【００２５】
植物における特定の内在性遺伝子の発現を抑制する方法としては、アンチセンス技術を利用する方法が当業者に最もよく利用されている。植物細胞におけるアンチセンス効果は、電気穿孔法で導入したアンチセンスＲＮＡが植物においてアンチセンス効果を発揮することをエッカーらが示したことで初めて実証された（ＥｃｋｅｒＪＲ＆ＤａｖｉｓＲＷ：ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ８３：５３７２，１９８６）。その後、タバコやペチュニアにおいてもアンチセンスＲＮＡの発現により標的遺伝子の発現が低下した例が報告されており（ｖａｎｄｅｒＫｒｏｌＡＲ，ｅｔａｌ：Ｎａｔｕｒｅ３３３：８６６，１９８８）、現在では、アンチセンス技術は植物における遺伝子発現を抑制させる手段として確立している。
【００２６】
アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を抑制する作用としては、以下のような複数の要因が存在する。例えば、三重鎖形成による転写開始阻害、ＲＮＡポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造が作られた部位とのハイブリッド形成による転写阻害、合成の進みつつあるＲＮＡとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエクソンとの接合点におけるハイブリッド形成によるスプライシング阻害、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング阻害、ｍＲＮＡとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行阻害、キャッピング部位やポリ（Ａ）付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング阻害、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始阻害、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳阻害、ｍＲＮＡの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻害、および−核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現阻害が挙げられる。
【００２７】
このようにアンチセンス核酸は、転写、スプライシングまたは翻訳など様々な過程を阻害することで、標的遺伝子の発現を抑制する（平島および井上：新生化学実験講座２核酸ＩＶ遺伝子の複製と発現（日本生化学会編，東京化学同人）ｐｐ．３１９−３４７，１９９３）。
【００２８】
本発明で用いられるアンチセンス配列は、上記のいずれの作用により標的遺伝子の発現を抑制してもよい。一つの態様としては、遺伝子のｍＲＮＡの５’端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的と考えられる。また、コード領域もしくは３’側の非翻訳領域に相補的な配列も使用することができる。このように、遺伝子の翻訳領域だけでなく非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含むＤＮＡも、本発明で利用されるアンチセンスＤＮＡに含まれる。
【００２９】
使用されるアンチセンスＤＮＡは、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましくは３’側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。このようにして調製されたＤＮＡは、公知の方法を用いることで、所望の植物へ形質転換できる。アンチセンスＤＮＡの配列は、形質転換される植物が持つ内在性遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に抑制できる限りにおいて、完全に相補的でなくてもよい。転写されたＲＮＡは、標的遺伝子の転写産物に対して好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相補性を有する。アンチセンス配列を用いて標的遺伝子の発現を効果的に抑制するには、アンチセンスＤＮＡの長さは少なくとも１５塩基以上であり、好ましくは１００塩基以上であり、さらに好ましくは５００塩基以上である。通常用いられるアンチセンスＤＮＡの長さは５ｋｂよりも短く、好ましくは２．５ｋｂよりも短い。
【００３０】
内在性遺伝子の発現の抑制は、また、リボザイムをコードするＤＮＡを利用して行うことも可能である。リボザイムとは触媒活性を有するＲＮＡ分子のことを指す。リボザイムには種々の活性を有するものが存在するが、中でもＲＮＡを切断する酵素としてのリボザイムに焦点を当てた研究により、ＲＮＡを部位特異的に切断するリボザイムの設計が可能となった。リボザイムには、グループＩイントロン型やＲＮａｓｅＰに含まれるＭ１ＲＮＡのように４００ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる４０ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある（小泉誠および大塚栄子：タンパク質核酸酵素，３５：２１９１，１９９０）。
【００３１】
例えば、ハンマーヘッド型リボザイムの自己切断ドメインは、Ｇ１３Ｕ１４Ｃ１５という配列のＣ１５の３’側を切断するが、その活性にはＵ１４とＡ９との塩基対形成が重要とされ、Ｃ１５の代わりにＡ１５またはＵ１５でも切断され得ることが示されている（ＫｏｉｚｕｍｉＭ，ｅｔａｌ：ＦＥＢＳＬｅｔｔ２２８：２２８，１９８８）。基質結合部位が標的部位近傍のＲＮＡ配列と相補的なリボザイムを設計すれば、標的ＲＮＡ中のＵＣ、ＵＵまたはＵＡという配列を認識する制限酵素的なＲＮＡ切断リボザイムを作出することができる（ＫｏｉｚｕｍｉＭ，ｅｔａｌ：ＦＥＢＳＬｅｔｔ２３９：２８５，１９８８、小泉誠および大塚栄子：タンパク質核酸酵素３５：２１９１，１９９０、ＫｏｉｚｕｍｉＭ，ｅｔａｌ：ＮｕｃｌＡｃｉｄｓＲｅｓ１７：７０５９，１９８９）。例えば、本発明のＤＮＡ（配列番号：２）中には、標的となり得る部位が複数存在する。
【００３２】
また、ヘアピン型リボザイムも本発明の目的に有用である。このリボザイムは、例えばタバコリングスポットウイルスのサテライトＲＮＡのマイナス鎖に見出される（ＢｕｚａｙａｎＪＭ：Ｎａｔｕｒｅ３２３：３４９，１９８６）。ヘアピン型リボザイムからも、標的特異的なＲＮＡ切断リボザイムを作出できることが示されている（ＫｉｋｕｃｈｉＹ＆ＳａｓａｋｉＮ：ＮｕｃｌＡｃｉｄｓＲｅｓ１９：６７５１，１９９１、菊池洋：化学と生物３０：１１２，１９９２）。
【００３３】
標的を切断できるように設計されたリボザイムは、植物細胞中で転写されるように、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーターなどのプロモーターおよび転写終結配列に連結される。このとき、転写されたＲＮＡの５’端や３’端に余分な配列が付加されていると、リボザイムの活性が失われることがあるが、こういった場合は、転写されたリボザイムを含むＲＮＡからリボザイム部分だけを正確に切り出すために、リボザイム部分の５’側や３’側にシスに働く別のトリミングリボザイムを配置させることも可能である（ＴａｉｒａＫ，ｅｔａｌ：ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇ３：７３３，１９９０、ＤｚｉａｎｏｔｔＡＭ＆ＢｕｊａｒｓｋｉＪＪ：ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ８６：４８２３，１９８９、ＧｒｏｓｓｈａｎｓＣＡ＆ＣｅｃｈＴＲ：ＮｕｃｌＡｃｉｄｓＲｅｓ１９：３８７５，１９９１、ＴａｉｒａＫ，ｅｔａｌ：ＮｕｃｌＡｃｉｄｓＲｅｓ１９：５１２５，１９９１）。また、このような構成単位をタンデムに並べ、標的遺伝子内の複数の部位を切断できるようにすることで、より効果を高めることもできる（ＹｕｙａｍａＮ，ｅｔａｌ：ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓＲｅｓＣｏｍｍｕｎ１８６：１２７１，１９９２）。このように、リボザイムを用いて本発明における標的遺伝子の転写産物を特異的に切断することで、該遺伝子の発現を抑制することができる。
【００３４】
内在性遺伝子の発現の抑制は、さらに、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二本鎖ＲＮＡを用いたＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒａｎｃｅ（ＲＮＡｉ）によっても行うことができる。ＲＮＡｉとは、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二重鎖ＲＮＡを細胞内に導入すると、導入した外来遺伝子および標的内在性遺伝子の発現がいずれも抑制される現象のことを指す。ＲＮＡｉの機構の詳細は明らかではないが、最初に導入した二本鎖ＲＮＡが小片に分解され、何らかの形で標的遺伝子の指標となることにより、標的遺伝子が分解されると考えられている。ＲＮＡｉは植物においても効果を奏することが知られている（ＣｈｕａｎｇＣＦ＆ＭｅｙｅｒｏｗｉｔｚＥＭ：ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ９７：４９８５，２０００）。例えば、植物体におけるＡｃｗ６タンパク質をコードするＤＮＡの発現をＲＮＡｉにより抑制するためには、Ａｃｗ６タンパク質をコードするＤＮＡ（配列番号：２）またはこれと類似した配列を有する二本鎖ＲＮＡを目的の植物へ導入し、得られた植物体から野生型植物体と比較して、細胞壁成分、細胞の形態、あるいは発生分化が改変された植物を選択すればよい。ＲＮＡｉに用いる遺伝子は、標的遺伝子と完全に同一である必要はないが、少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列の同一性を有する。また、配列の同一性は上述した手法により決定できる。
【００３５】
内在性遺伝子の発現の抑制は、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有するＤＮＡの形質転換によって起こる共抑制によっても達成できる。「共抑制」とは、植物に標的内在性遺伝子と同一もしくは類似した配列を有する遺伝子を形質転換により導入すると、導入した外来遺伝子および標的内在性遺伝子の発現がいずれも抑制される現象のことを指す。共抑制の機構の詳細は明らかではないが、少なくともその機構の一部はＲＮＡｉの機構と重複していると考えられている。共抑制は植物においても観察される（ＳｍｙｔｈＤＲ：ＣｕｒｒＢｉｏｌ７：Ｒ７９３，１９９７、ＭａｒｔｉｅｎｓｓｅｎＲ：ＣｕｒｒＢｉｏｌ６：８１０，１９９６）。例えば、Ａｃｗ６タンパク質をコードするＤＮＡが共抑制された植物体を得るためには、Ａｃｗ６タンパク質をコードするＤＮＡまたはこれと類似した配列を有するＤＮＡを発現できるように作製したベクターＤＮＡを目的の植物へ形質転換し、得られた植物体から野生型植物体と比較して細胞壁成分、細胞の形態、あるいは発生分化が改変された植物を選択すればよい。共抑制に用いる遺伝子は、標的遺伝子と完全に同一である必要はないが、少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列の同一性を有する。また、配列の同一性は上述した手法により決定できる。
【００３６】
これにより作出された本発明のＤＮＡの発現が増加された、あるいは抑制された植物体は、細胞壁や細胞形態が正常の個体と比較して変化しうる。ここで「細胞壁の変化」とは、例えば、セルロースなどの細胞壁成分の量的変化、質的変化の変化を指す。また「細胞形態の変化」とは、例えば、細胞の長さや体積の量的変化を指す。子のような改変により、例えば、パルプ等繊維原材料植物の供給効率の増加、細胞壁合成制御による新素材の開発、農作物の有用成分の増加、飼料作物の消化吸収効率の増加、細胞壁合成量増大による植物の成長量の増加、細胞形態の変化による新たな価値を有する植物の作出などを行うことが可能である。
【００３７】
ゲノム内に本発明のＤＮＡが導入された形質転換植物体がいったん得られれば、該植物体から有性生殖または無性生殖により子孫を得ることができる。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラストなど）を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。
【００３８】
また本発明は、本発明のＤＮＡによりコードされるタンパク質を提供する。蛋白質は、当業者に公知の方法により、天然のタンパク質としての他、遺伝子組み換え技術を利用して調製した組み換えタンパク質として調製することができる。天然のタンパク質は、例えば、後述する方法により調製された組み換えタンパク質をウサギなどの小動物に免疫して得た抗体を適当な吸着体（ＣＮＢｒ活性化アガロースやトシル活性化アガロース）に結合させてカラムを作製し、得られたカラムを利用して本発明のタンパク質を発現する細胞や組織から得た抽出液を精製することにより調製することが可能である。一方、組み換えタンパク質は、常法、例えば、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを適当な発現ベクターに挿入し、該ベクターを適当な細胞に導入し、該形質転換細胞から精製することにより調製することが可能である。組み換えタンパク質を生産するために用いられる細胞としては、例えば、植物細胞、大腸菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞などが挙げられる。また、細胞内で組み換えタンパク質を発現させるためのベクターとしては、例えば、植物、酵母細胞用にはプラスミド「ｐＢＩ１２１」や「ｐＢＩ１０１」（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、大腸菌用にはプラスミド「ｐＥＴＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍ」（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）や「ＧＳＴｇｅｎｅｆｕｓｉｏｎＶｅｃｔｏｒｓ」（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ほ乳類細胞用にはプラスミド「ｐＭＡＭ」（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、昆虫細胞用にはプラスミド「ｐＢａｃＰＡＫ８．９」（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）などが挙げられる。ベクターへのＤＮＡの挿入は、常法、例えば、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ（Ｍａｎｉａｔｉｓｅｔａｌ．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇｈａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｒｙＰｒｅｓｓ）に記載の方法により行うことができる。また、宿主細胞へのベクターの導入は、常法により宿主細胞に応じてエレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法などの方法で行うことが可能である。得られた形質転換細胞からの本発明の組み換えタンパク質の精製は、タンパク質の性質に応じ、塩析や有機溶媒による沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、免疫吸着体によるカラムクトマトグラフィー、ゲルろ過、ＳＤＳ電気泳動、等電点電気泳動などを適宜組み合わせて行うことが可能である。また、本発明の組み換えタンパク質をグルタチオンＳ−トランスフェラーゼなどの標識との融合タンパク質として発現させた場合には、該標識に対するアフィニティークロマトグラフィーなどにより精製することも可能である。
【００３９】
また、本発明は、上記本発明のタンパク質に結合する抗体を提供する。本発明の抗体には、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体が含まれる。本発明の抗体の調製は当業者に公知の方法（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ（Ｍａｎｉａｔｉｓｅｔａｌ．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇｈａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｒｙＰｒｅｓｓ）に記載の方法）により行うことができる。本発明の抗体の調製を行う場合には、本発明のタンパク質全体を免疫する方法の他に、部分ペプチドを免疫して調製することも可能である。本発明の抗体は、本発明のタンパク質の精製や検出などに用いることが可能である。
【００４０】
また、本発明は、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡと特異的にハイブリダイズし、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するＤＮＡを提供する。ここで「特異的にハイブリダイズする」とは、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡに実質的にハイブリダイズし、他のタンパク質をコードするＤＮＡに実質的にハイブリダイズしないことを指す。このようなハイブリダイズの条件としては、上述したストリンジェントな条件を例示できる。このようなＤＮＡは、例えば、本発明のＤＮＡを検出または単離するためのプローブとして、また増幅するためのプライマーとして利用することが可能である。
【００４１】
【実施例】
以下に本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。なお、ＤＮＡの切断、連結、大腸菌の形質転換、遺伝子の塩基配列決定、ハイブリダイゼーション等一般の遺伝子組換えに必要な方法は、各操作に使用する市販の試薬、機械装置等に添付されている説明書や、実験書（例えば「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ（ＭａｎｉａｔｉｓＴ．ｅｔａｌ．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ）」）に基本的に従った。また、シロイヌナズナの寒天培地や土壌を用いた育成、交配、ゲノムＤＮＡの調製は実験書（例えば「モデル植物の実験プロトコール（秀潤社）」）に基本的に従った。
【００４２】
［実施例１］ａｃｗ６変異体の形態観察
播種後２１℃で生育させた５日目の実生を、非許容温度３１℃で２日間生育させ、その根端を光学顕微鏡で観察した。非許容温度下では、実生の各器官の伸長生長は地上部・地下部とも阻害され、細胞の伸長阻害も生じていた。より詳細に変異の影響を調べるため、Ｓａｔｏらの方法（ＰｌａｎｔＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌ．２００１，４２：２５１−６３）に従い組織を固定・包埋し、光学・電子顕微鏡観察を行った。根端の切片を観察した結果、細胞が膨張しており、組織・細胞分化の異常が生じていることがわかった。電子顕微鏡による細胞壁微細構造の観察では、細胞壁が波打っていることが明らかとなり、細胞壁の力学的強度に異常が生じていることが示された。
【００４３】
［実施例２］ａｃｗ６変異体の細胞壁の分析
細胞壁粗精製サンプルの調整は、Ｚａｂｌａｃｋｉｓ（Ｚａｂｌａｃｋｉｓ，Ｅ．ｅｔａｌ．，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｃｅｌｌ−ｗａｌｌｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｏｆＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａｌｅａｖｅｓ．（１９９５）ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．１０７，１１２９−１１３８．）らの方法に従った。調整した細胞壁粗精製サンプルは−８０℃で保存し、必要な量を解凍して分析に用いた。
調整した細胞壁サンプルをガラス管に適当量測り取り、２Ｍのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を加え、１２１℃・１時間非結晶多糖（ヘミセルロース・ペクチン）を加水分解する。室温まで自然冷却した後、遠心して上清と結晶多糖（セルロース）に分ける。セルロースは７２％Ｈ_２ＳＯ_４で完全に加水分解する。糖定量は、全糖量をフェノール硫酸法（Ｄｕｂｏｉｓ，Ｍ．ｅｔａｌ．，Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃｍｅｔｈｏｄｆｏｒｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｓｕｇａｒｓａｎｄｒｅｌａｔｅｄｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ．（１９５６）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８，３５０−３５６．２８，３５０−３５６）で、ウロン酸量をｍ−ヒドロキシビフェニル法（Ｂｌｕｍｅｎｋｒａｎｔｚ，Ｎ．ａｎｄＡｓｂｏｅ−ｈａｎｓｅｎ，Ｈ．Ｍ．（１９７３）Ｎｅｗｍｅｔｈｏｄｆｏｒｑｕａｎｔｉｔａｉｖｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｕｒｏｎｉｃａｃｉｄｓ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５４，４８４−４８９）で行った。その結果、ａｃｗ６変異体の非結晶糖とセルロース画分の全糖量が著しく変化していることがわかった。減少の原因を詳細に調べるため、アルディトールアセテート法（Ｙｏｒｋ，Ｗ．Ｓ．，ｅｔａｌ．，Ｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｐｌａｎｔｃｅｌｌｗａｌｌａｎｄｐｌａｎｔｃｅｌｌｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ．（１９８６）Ｍｅｔｈｏｄｓｅｎｚｙｍｏｌ．１１８，３−４０）による構成等分析を行った。その結果、ａｃｗ６変異体の非結晶糖画分では、ｇｌｕｃｏｓｅの量（１１８１．７±２８．８ｎｍｏｌ／ｍｇｃｅｌｌｗａｌｌ）は、ｗｔのそれら（１９０７．６±１５８．４ｎｍｏｌ／ｍｇｃｅｌｌｗａｌｌ）より減少していた。セルロース画分ではグルコースの量（９９８．０±１７．６ｎｍｏｌ／ｍｇｃｅｌｌｗａｌｌ）は、ｗｔ（１３４２．５±３１．５ｎｍｏｌ／ｍｇｃｅｌｌｗａｌｌ）より減少していた。非結晶糖画分のグルコースは、主としてヘミセルロース由来であり、セルロース画分でのそれはセルロース由来である。ガラクトースやウロン酸などの糖量も変化していた。以上の結果から、ａｃｗ６変異は細胞壁合成全体に影響を与えることが明らかになった。
【００４４】
［実施例３］ＡＣＷ６遺伝子の単離
まず、ＡＣＷ６遺伝子の染色体上の位置を決定するために、分子マーカーを用いてマッピングを行った。ａｃｗ（ａｌｔｅｒｅｄｃｅｌｌｗａｌｌ）６変異体はシロイヌナズナのコロンビアエコタイプにおいて見出されているので、この同変異体に、別のエコタイプであるランズバーグ・エレクタを交配し、次世代の種子を採種し、それを生育させ、自殖させてＦ２世代の種子を得た。このＦ２世代の種子を発芽させ、育成した植物（４４２個体）からゲノムＤＮＡを抽出した。これらのゲノムＤＮＡを、マーカーとして既知のｎｇａ１１１、ＳＭ３３および自ら作製したＦ１４Ｋ１４−ｆ１，ｒ１、Ｆ２６Ａ９−ｆ１，ｒ１を用いて、同ゲノムＤＮＡに対して、ＰＣＲ法により組換価を算出した。具体的には、Ｆ１４Ｋ１４−ｆ１，ｒ１を増幅することができる２種類のＰＣＲプライマー「配列番号：４／５−ＧＴＴＴＴＧＴＴＡＣＴＡＡＴＧＴＣＡＡＴＡＣＧＧＧＧ−３」、「配列番号：５／５−ＧＣＴＣＡＴＴＧＧＴＣＴＡＧＴＧＣＣＡＴＧＧＣＡＣ−３」を用いてＦ２世代のゲノムＤＮＡをＰＣＲ法を用いて増幅させ、アガロース電気泳動で遺伝子型を調べた。その結果、ＡＣＷ６遺伝子と同マーカーとの間には４５染色体で組み換えが認められた。次にｎｇａ１１１を増幅することができる２種類のＰＣＲプライマー「配列番号：６／５−ＣＴＣＣＡＧＴＴＧＧＡＡＧＣＴＡＡＡＧＧＧ−３」、「配列番号：７／５−ＴＧＴＴＴＴＴＴＡＧＧＡＣＡＡＡＴＧＧＣＧ−３」を用いて、Ｆ２世代のゲノムＤＮＡをＰＣＲにより増幅させ、アガロース電気泳動で遺伝子型を調べた。その結果、ＡＣＷ６遺伝子と同マーカーとの間には１４染色体で組み換えが認められた。さらに詳細なマッピングを行うため、ＳＭ３３を増幅することができる２種類のＰＣＲプライマー「配列番号：８／５−ＡＡＡＴＡＡＧＡＧＡＧＧＡＴＣＴＡＡＧＧＴＡＡＴＣ−３」、「配列番号：９／５−ＡＣＴＡＴＴＣＴＣＧＧＴＴＴＡＣＡＣＡＴＴＣＣＴＣ−３」を合成し、これらを用いて、Ｆ２世代のゲノムＤＮＡをＰＣＲ法で増幅させ、アガロース電気泳動で調べた。その結果、ＡＣＷ６遺伝子と同マーカーとの間には４染色体で組み換えが認められた。次にＦ２６Ａ９−ｆ１，ｒ１を増幅することができる２種類のＰＣＲプライマー「配列番号：１０／５−ＴＡＡＧＡＡＴＡＴＣＧＴＴＧＧＣＴＡＴＡＡＧＧ−３」、「配列番号：１１／５−ＣＡＴＣＡＧＡＧＧＡＧＴＴＣＴＡＣＴＡＡＴＡＧＡＧＴＣ−３」を合成し、これらを用いて、Ｆ２世代のゲノムＤＮＡをＰＣＲ法で増幅させ、アガロース電気泳動で調べた。その結果、ＡＣＷ６遺伝子と同マーカーとの間には４染色体で組み換えが認められた。ＳＭ３３マーカーで組み換えが認められた４染色体は、Ｆ２６Ａ９−ｆ１，ｒ１マーカーでは全て組み換えが認められなかった。同様に、Ｆ２６Ａ９−ｆ１，ｒ１マーカーで組み換えが認められた４染色体も、ＳＭ３３マーカーでは組み換えが認められなかった。これらの結果から、ＡＣＷ６遺伝子が両マーカーの間に存在することが明らかとなった。
【００４５】
以上のようにして、ＡＣＷ６遺伝子を含む染色体上の領域が、ＳＭ３３、２６Ａ９−ｆ１，ｒ１の２つの分子マーカーによって挟まれていることが確認された。そこで、ＳＭ３３、２６Ａ９−ｆ１，ｒ１マーカー間に推定される遺伝子を公的データベース（ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＳｅｑｕｅｎｃｅＭａｐＯｖｅｒｖｉｅｗ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．ｏｒｇ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｍａｐｓ／Ｓｃｈｒｏｍ）にて調べ領域の塩基配列チェックを行った。その結果、ａｃｗ６変異では、機能未知遺伝子の１８１１位の塩基置換（Ｃ→Ｔ）と、それによる６０４位のアミノ酸置換（Ｔ→Ｉ）として見出された。該遺伝子の全長ｃＤＮＡを、λＺＡＰＩＩｃＤＮＡライブラリー（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）より単離し、これをｐＢＩ１２１ベクターにサブクローニング後、アグロバクテリアを介しＦｌｏｒａｌＤｉｐ法（ＣｌｏｕｇｈＳ．Ｊ．，ＢｅｎｔＡ．Ｆ．Ｆｌｏｒａｌｄｉｐ：ａｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄｍｅｔｈｏｄｆｏｒＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−ｍｅｄｉａｔｅｄｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ．ＰｌａｎｔＪ．（１９９８）１６：７３５−７４３）により、ａｃｗ６変異体に導入した。その結果、ａｃｗ６表現型を野生型に回復することができた。したがって、該遺伝子が、ＡＣＷ６遺伝子であることが明らかになった。該遺伝子の機能解析のため、推定されるタンパクのアミノ酸配列をもとに、公的データベース検索（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）を行ったところ、Ｕ−ボックスモチーフを持つタンパクと高い相同性が認められた。したがって、ＡＣＷ６遺伝子は、Ｕ−ボックスタンパクをコードしていることが明らかとなった。
【００４６】
Ｕ−ボックスモチーフは、ユビキチンリガーゼとして機能することが酵母などで報告されている。ユビキチンリガーゼ（ユビキチン化因子）は、細胞タンパク質分解の主要経路であるユビキチン・プロテアソーム系で働く酵素であり、特定の標的タンパクに低分子タンパク質であるユビキチンを多数付加する役割を持つ。ユビキチンが多数付加された標的タンパク（ポリユビキチン化タンパク）は、細胞内のタンパク分解装置である２６Ｓ‐プロテアソームによって認識され分解される。様々な生命現象には、それぞれ特有のタンパク群が関わっているが、それらは特異的なユビキチンリガーゼによってユビキチン化され、特定のプロテアソームによって分解される。したがって、ユビキチンリガーゼは、ユビキチン化によりタンパクを適切な時間と場所で分解させることで、生命現象を制御する役割を持つ（Ｇｒｉｍａ，Ｂ．ｅｔａｌ．（２００２），ＴｈｅＦ−ｂｏｘｐｒｏｔｅｉｎｓｌｉｍｂｃｏｎｔｒｏｌｓｔｈｅｌｅｖｅｌｓｏｆｃｌｏｃｋｐｒｏｔｅｉｎｓｐｅｒｉｏｄａｎｄｔｉｍｅｌｅｓｓ．Ｎａｔｕｒｅ４２０：１７８−１８２；ＤｅｌＰｏｚｏ，Ｊ．Ｃ．ｅｔａｌ．（２００２），ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＥ２ＦｃＦｕｎｃｔｉｏｎｓｉｎＣｅｌｌＤｉｖｉｓｉｏｎａｎｄＩｓＤｅｇｒａｄｅｄｂｙｔｈｅＵｂｉｑｕｉｔｉｎ−ＳＣＦ（ＡｔＳＫＰ２）ＰａｔｈｗａｙｉｎＲｅｓｐｏｎｓｅｔｏＬｉｇｈｔ．ＰｌａｎｔＣｅｌｌ１４：３０５７−７１）。
【００４７】
ユビキチンリガーゼは、動物・植物などの生物一般に広く存在し、ゲノム中で遺伝子ファミリーを形成している。植物のユビキチンリガーゼとしては、Ｆ‐ボックスタンパクを中心とするＳＣＦ（Ｓｋｐ１タンパク＋Ｃｕｌ１タンパク＋Ｆ−ｂｏｘタンパク）複合体が知られているが（Ｓｐｒｕｃｋ，Ｃ．Ｈ．ａｎｄＳｔｒｏｈｍａｉｅｒ，Ｈ．Ｍ．，（２００２），Ｓｅｅｋａｎｄｄｅｓｔｒｏｙ：ＳＣＦｕｂｉｑｕｉｔｉｎｌｉｇａｓｅｓｉｎｍａｍｍａｌｉａｎｃｅｌｌｃｙｃｌｅｃｏｎｔｒｏｌ．ＣｅｌｌＣｙｃｌｅ１：２５０−２５４）、近年、Ｕ−ボックスタンパクもユビキチンリガーゼとして機能することが酵母などで証明されている（Ｋｏｅｇｌ，ｅｔａｌ．（１９９９）Ａｎｏｖｅｌｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ，Ｅ４，ｉｓｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｍｕｌｔｉｕｂｉｑｕｉｔｉｎｃｈａｉｎａｓｓｅｍｂｌｙ．Ｃｅｌｌ９６：６３５−６４４）。
【００４８】
Ｕ−ボックスタンパク遺伝子は、高等植物にも一般的に存在しており、高いホモロジーを示している。アラビドプシスゲノム中には、Ａｚｅｖｅｄｏらにより３７個のＵ−ボックスモチーフを持ったタンパク質遺伝子（ＡｔＰＵＢ１〜３７）の存在が推定されている。それらは、Ｕ−ボックス以外のモチーフ・ドメインの有無からクラスＩ〜Ｖに分類されている。各クラスは、ＩではＵ−ボックスモチーフに加えてＵＦＤ２−ｓｐｅｃｉｆｉｃモチーフを、ＩＩではアルマジロリピートを、ＩＩＩではロイシンリッチドメインを、ＩＶではＳｅｒ／Ｔｈｒキナーゼドメインを持ち、ＶはＵ−ボックスモチーフのみを持つ。３７個のＵ−ボックスタンパク遺伝子の中で、関与する生命現象が明らかとなっているのはＡＲＣ１（ＡｔＰＵＢ１７）のみであり、他がどのような生命現象に関わっているかは、未だ明確にされていない。ＡＣＷ６Ｕ−ボックスタンパクは、上記のＡｚｅｖｅｄｏらの分類に従うと、クラスＩＩのＡｔＰＵＢ１０に相当する。ＡｔＰＵＢ１０は、Ｃ末端側にアルマジロリピートと呼ばれるタンパク間の結合に関与するモチーフを持っている。このアルマジロリピートモチーフにより標的タンパクと結合し、それをユビキチン化する機能を持っていると考えられる。（Ｓｐｒｅｍｕｌｌｉ，Ｌ．（２０００）ＰｒｏｔｅｉｎＳｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａｓｓｅｍｂｌｙ，ａｎｄＤｅｇｒａｄａｔｉｏｎ．ＩｎＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙｏｆＰｌａｎｔｓ．ＥｄｉｔｅｄｂｙＢｕｃｈａｎａｎ，Ｂ．Ｂ．，Ｇｒｕｉｓｓｅｍ，Ｗ．ａｎｄＪｏｎｅｓ，Ｒ．Ｌ．ｐｐ．４１２−４５４，ＡｚｅｖｅｄｏＣ．ｅｔａｌ．，ＴｈｅＵ−ｂｏｘｐｒｏｔｅｉｎｆａｍｉｌｙｉｎｐｌａｎｔｓ．（２００１）．ＴｒｅｎｄｓｉｎＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅ６：３５４−３５８）。
【００４９】
ところで、植物の形態形成は、細胞分裂、細胞伸長、細胞分化の各ステップによっておきるが、次のステップへ移行するためには、前ステップに関わるタンパク群のユビキチン化による分解が必須であると言われている（Ｔｒｅｗａｖａｓ，Ａ．（２０００）ＳｉｇｎａｌＰｅｒｃｅｐｔｉｏｎａｎｄＴｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ．ＩｎＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙｏｆＰｌａｎｔｓ．ＥｄｉｔｅｄｂｙＢｕｃｈａｎａｎ，Ｂ．Ｂ．，Ｇｒｕｉｓｓｅｍ，Ｗ．ａｎｄＪｏｎｅｓ，Ｒ．Ｌ．ｐｐ．９３０−９８７）。しかしながら、そのような現象に働くユビキチン化因子は未だ同定されていない。
【００５０】
以上の結果から本発明者らは、Ｕ−ボックスタンパクＡＣＷ６／ＡｔＰＵＢ１０遺伝子が、細胞（繊維）伸長、細胞分化、細胞壁合成に関与しているという新規な機能を初めて明らかにした。細胞伸長や分化・細胞壁合成に必要なＵ−ボックスタンパクの同定は世界で初めてであり、Ｕ−ボックスタンパクにより植物の形態形成を制御しうることを証明した最初の例である。
【００５１】
【発明の効果】
本発明により、植物の細胞壁合成に関与するタンパク質および遺伝子、並びに該遺伝子の発現を調節することにより細胞壁成分と細胞形態が改変された植物を作出する技術が提供された。植物の細胞壁成分と細胞形態の改変は、例えば、パルプ等繊維原材料植物の供給効率の増加、細胞壁合成制御による新素材の開発、農作物の有用成分の増加、飼料作物の消化吸収効率の増加、細胞壁合成量増大による植物の成長量の増加、繊維細胞形態の変化による新たな価値を有する植物の作出などをもたらすことができるため、農業や工業・園芸の分野において有益である。
【００５２】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】ａｃｗ６変異体の表現型を示す写真である。Ａは野生株、Ｂはａｃｗ６変異体を示す。
【図２】ａｃｗ６変異体の細胞分化を示す写真である。Ａは野生株、Ｂはａｃｗ６変異体を示す。
【図３】ａｃｗ６の細胞壁微細構造を示す写真である。Ａは野生株、Ｂはａｃｗ６変異体を示す
【図４】細胞壁成分の分析結果を示す図である。各略語はＲｈａ：ラムノース、Ｆｕｃ：フコース、Ａｒａ：アラビノース、Ｘｙｌ：キシロース、Ｍａｎ：マンノース、Ｇａｌ：ガラクトース、Ｇｌｃ：グルコース、Ｕｒｏｎｉｃａｃｉｄ：ウロン酸を示す。

Claims

植物由来の下記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡ。
（ａ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号：２に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ
（ｃ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｄ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
請求項１に記載のＤＮＡを含むベクター。
請求項１に記載のＤＮＡを発現可能に保持する形質転換細胞。
請求項１に記載のＤＮＡによりコードされるタンパク質。
請求項３に記載の形質転換細胞を培養し、発現させた組み換えタンパク質を回収する工程を含む、請求項４に記載のタンパク質の製造方法。
下記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡ。
（ａ）請求項１に記載のＤＮＡの転写産物と相補的なアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ
（ｂ）請求項１に記載のＤＮＡの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡ
（ｃ）植物細胞における発現時に、ＲＮＡｉ効果により、請求項１に記載のＤＮＡの発現を抑制するＲＮＡをコードするＤＮＡ
（ｄ）植物細胞における発現時に、共抑制効果により、請求項１に記載のＤＮＡの発現を抑制するＲＮＡをコードするＤＮＡ
請求項６に記載のＤＮＡを含むベクター。
請求項１または６に記載のＤＮＡを発現可能に保持する形質転換植物細胞。
請求項８に記載の形質転換植物細胞を含む植物体。
細胞壁成分が改変されている、請求項９に記載の植物体。
細胞壁成分の改変がグルカン量の変化である、請求項１０に記載の植物体。
細胞壁成分の改変がセルロース量の変化である、請求項１０に記載の植物体。
細胞形態が改変されている、請求項９に記載の植物体。
細胞形態の改変が細胞伸長の変化である、請求項１３に記載の植物体。
細胞形態の改変が細胞の大きさの変化である、請求項１４に記載の植物体。
発生分化が改変されている、請求項９に記載の植物体。
発生分化の改変が細胞分裂の変化である、請求項１６に記載の植物体。
発生分化の改変が細胞数と細胞の大きさの変化である、請求項１７に記載の植物体。
請求項９に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換植物体。
請求項９または１９に記載の植物体の繁殖材料。
請求項４に記載のタンパク質に結合する抗体。
請求項１に記載のＤＮＡと特異的にハイブリダイズし、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するＤＮＡ。