JP2004263065A

JP2004263065A - 新規キトサン類

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Publication number: JP2004263065A
Application number: JP2003054514A
Authority: JP
Inventors: Hing-Yuen Chen; ヒン−ユエンチャン; Chang Hsueh-O; スイ−オーチャン; Shu-Wan Wan; シュ−ワンワン; Jan-Chii Chen; ジャン−チイチェン; Hwang Shian-Min; シャオ−ミンファン; Mei-Huei Chen; メイ−フェイチェン; Su-Hui Chuang; ス−フイチャン; Uu-Fan En; ウー−ファンエン
Original assignee: Food Industry Research and Development Institute
Current assignee: Food Industry Research and Development Institute
Priority date: 2003-02-26
Filing date: 2003-02-28
Publication date: 2004-09-24
Anticipated expiration: 2023-02-28
Also published as: US20040167323A1; JP4484438B2; EP1452545A1; US6890913B2; EP1452545B1

Abstract

【課題】
【解決手段】５０，０００−１４０，０００ｇ／モルの重量平均分子量と、８５−９５％の脱アセチル化率を有するキトサン。菌からキトサンを調製する方法、および乳がんまたは子宮頚がんを治療するためにキトサンを利用する方法も開示される。
【選択図】なし

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は新規なキトサン、菌からのキトサンの生産、およびがんを治療するためのキトサンの使用方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
キチンは、不溶性が高い、β−（１，４）−Ｄ−グルコサミンのＮ−アセチル化ポリマーである。キトサンは、キチンの酸可溶性の脱アセチル化体である。キチンは海洋無脊椎動物の外骨格および昆虫の外皮に普通に見出される。キチンおよびキトサンは共に、ほとんどの接合菌綱（Ｚｙｇｏｍｙｃｅｔｅｓ）の細胞壁にも存在する。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
キトサンはカニまたはエビの殻から調製されたキチンを脱アセチル化することによって得られる。しかしながら、この処理では均一な品質のキトサンを生産することができない。そのうえ、カニやエビの殻の組成は季節要因や環境要因に大きく依存している。従って、カニやエビの殻から一定の物理化学的性質を有するキトサンを得ることは困難である。キトサンはケカビ科（Ｍｕｃｏｒａｃｅａｅ）の糸状菌からも得ることができる。この処理では化学的な脱アセチル化は必要ない。その結果、菌由来のキトサンの品質はより一定している。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明は新規なキトサン、菌からのキトサンの生産、およびがんを治療するためのキトサンの使用方法に関するものである。
【０００５】
本発明のキトサンは、５０，０００−１４０，０００ｇ／モルの重量平均分子量と８５−９５％の脱アセチル化率を有する。
重量平均分子量（Ｍ_ｗ）は、各分子量域のポリマーの重量を分子量に対してプロットした１次積率である。重量平均分子量は下式のとおりに算出される：
【０００６】
【数１】

異なる大きさの全てのポリマー分子（ｉ＝１〜ｉ＝∞）について総和され、Ｎ_ｉは分子量がＭ_ｉである分子の数（モル）である。Ｍ_Ｗ値は、例えば光散乱法、沈降平衡測定法、または当該分野において知られた任意の他の方法によって決定することができる。
【０００７】
脱アセチル化は、キチンの分子鎖からアセチル基を除き、アミノ基（−ＮＨ_２）を残すことを意味する。脱アセチル化率（ＤＤ）は、多糖類中の遊離アミノ基の含量を表すが、例えばニンヒドリンテスト、直線的電位差滴定法、コロイド滴定法、近赤外線分光分析法、核磁気共鳴分光法、臭化水素滴定法、赤外線分光分析法、紫外線分光分析法、一次導関数紫外線分光分析法、酵素的測定法、または当該分野において既知の任意の他の方法によって決定することができる。
【０００８】
本発明のキトサンは、例えば菌から調製することができる。適当な菌類には、シャジクケカビ属（Ａｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒ）の菌類のようなケカビ科の菌類が含まれる。本発明に有用な菌類の特定の例は、Ａｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒｔａｉｗａｎｅｓｉｓである。キトサンは、菌の培養物を１５−２４℃で培養することと、該培養物からキトサンを単離することによって得られる。
【０００９】
キトサンは、がんを治療するために、医薬として許容可能な担体とともに医薬組成物に利用可能である。１つの態様では、本発明は乳がんを治療する方法を特徴とする。該方法は、該治療を必要とする患者に有効な量のキトサン、例えば５０，０００−１４０，０００ｇ／モルの重量平均分子量と８５−９５％の脱アセチル化率とを有するキトサンを投与することを含む。別の態様では、本発明は、該治療を必要とする患者に有効な量の本発明のキトサンを投与することによって子宮頚がんを治療する方法を特徴とする。
【００１０】
本発明は、抗がん活性を有する新規なキトサンを提供する。本発明の１つまたはそれ以上の実施形態の詳細を、以下に続く発明の実施の形態の中で述べる。本発明の他の特徴、目的、および利点は、発明の実施の形態および請求項から明らかとなるであろう。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明は、Ａｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒｔａｉｗａｎｅｓｉｓから調製されたキトサンがヒト子宮頚類上皮がん細胞（ＨｅＬａ）およびヒト乳がん細胞（ＭＣＦ−７）の成長をインビトロで抑制するという、予期せぬ発見に基づく。
【００１２】
従って、本発明は菌からキトサンを調製する方法を特徴とする。該方法は菌の培養物を１５−２４℃で培養することと、該培養物からキトサンを単離することを含む。
【００１３】
本発明にとって有用な菌類には、ケカビ科の菌類（例えばシャジクケカビ属）が含まれる。これらの菌類は、公的に利用可能な種々の菌類保存資源から入手可能である。例えば、以下に述べる実施例で使用される菌（Ａｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒｔａｉｗａｎｅｓｉｓ）は、生物資源保存研究センター（ＢＣＲＣ：ＢｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎａｎｄＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒ、カタログ番号ＢＣＲＣ３１１５９）や、中華民国台湾シンチュ（Ｈｓｉｎｃｈｕ）３００、シーピン（Ｓｈｉｈ−Ｐｉｎｇ）ロード、３３１番に所在のフードインダストリーリサーチアンドディヴェロップメントインスティテュート（ＦｏｏｄＩｎｄｕｓｔｒｙａｎｄＲｅｓｅａｒｃｈＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔＩｎｓｔｉｔｕｔｅ）から、請求により入手可能である。
【００１４】
菌類は当該分野でよく知られた手順に従って培養することができる。例えば、ＹＭ寒天に菌を接種し、その接種された寒天を２５−３７℃で３〜６日間インキュベートすることができる。該菌から得た胞子を、１０^４〜１０^７ｃｆｕ／ｍｌのストックとなるように液体中に懸濁する。このストックを培養用培地に直接接種する。
【００１５】
培養用培地は３〜６の範囲（例えば３と５の間）の初期ｐＨを有し、５〜５０ｇ／Ｌ（例えば２０ｇ／Ｌ）のグルコース、５〜６０ｇ／Ｌ（例えば１０ｇ／Ｌ）のペプトン、０．１〜５ｇ／Ｌ（例えば１ｇ／Ｌ）の酵母エキス、または他の適当な成分を含みうる。該培地は０．０１〜３０ｇ／Ｌの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、０〜３ｇのＫ_２ＨＰＯ_４、０〜３ｇのＮａＣｌ、０〜１５ｇのＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏおよび０〜０．３ｇ／ＬのＣａＣｌ_２をさらに含みうる。該菌を、培養用培地中で１５−２４℃でさらに２〜４日間培養する。
【００１６】
キトサンは、米国特許第６，２５５，０８５Ｂ１号に記載のアルカリおよび酸処理によって菌糸体から単離および精製可能である。細胞集団を培養液から分離し、蒸留水で洗浄する。次いで細胞を０．５〜２ＮＮａＯＨで処理し、該アルカリ混合物を１２１℃で１５分間インキュベートする。次に固形物を遠心分離によりペレットにし、蒸留水とエタノールで洗浄する。該洗浄物を２％酢酸溶液で処理し、９５℃で１２時間インキュベートする。次いで生じたスラリーを遠心分離により単離し、酸可溶性の上清を生じる。上清のｐＨを２ＮＮａＯＨで１０に調整し、これによってキトサンを沈殿させる。精製されたキトサンを最後に蒸留水で洗浄し、凍結乾燥する。
【００１７】
キトサンの重量平均分子量（Ｍ_ｗ）および脱アセチル化率（ＤＤ）は、例えばそれぞれＧＰＣ／ＳＥＣ^３および一次導関数紫外線分光分析法の手法によって、または当該分野で知られた任意の他の方法によって測定可能である。以下の実施例で述べるように、上述の方法に従って調製された菌由来のキトサンのＭ_ＷおよびＤＤは、５０，０００−１４０，０００ｇ／モルおよび８５−９５％である。
【００１８】
予想外なことに、菌由来のキトサンは濃度１０ｐｐｍ（約１０^−７Ｍ）でＨｅＬａ細胞およびＭＣＦ−７細胞の成長に対して強力な細胞毒性を示すが、甲殻類由来のキトサンはそのような効果を示さない。さらに、菌由来のキトサンはヒト胎児肺細胞（ＭＲＣ−５）、またはヒト胃がん細胞株（ＡＧＳ）やヒト肝臓がん細胞株（ＨｅｐＧ２）のような他の腫瘍細胞株に対する細胞毒性を持たない。
【００１９】
従って本発明は、医薬として許容可能な担体と、５０，０００−１４０，０００ｇ／モルの重量平均分子量と８５−９５％の脱アセチル化率とを有する有効な量のキトサンとを含む、医薬組成物を特徴とする。該医薬組成物は、乳がんまたは子宮頚がんを予防および治療するために使用可能である。医薬として許容可能な担体には、溶媒、分散媒、コーティング剤、抗細菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤が含まれる。「有効な量」とは治療効果を与えるために必要な量である。（体表面の１メートル平方あたりのミリグラム数に基づいた）動物とヒトでの用量の相関関係は、Ｆｒｅｉｒｅｉｃｈ，ｅｔａｌ．（１９６６）ＣａｎｃｅｒＣｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｒｅｐ．５０：２１９によって説明されている。体表面積は、患者の体長と体重から概算可能である。例えば、ニューヨーク州アードレイに所在のガイギー製薬（ＧｅｉｇｙＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）によるＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＴａｂｌｅｓ、１９７０年、ｐ．５３７を参照のこと。当業者には認識されるように、有効な用量は投与経路、賦形剤の使用などによっても変動する。
【００２０】
本発明のキトサンは、従来の方法を利用して、様々な投与経路のための投与形態に製剤化可能である。例えば、キトサンを経口投与のためのカプセル剤、ゲル封入剤、または錠剤に製剤化することができる。カプセル剤は、ゼラチンまたはセルロースのような医薬として許容可能な任意の標準的な物質を含みうる。錠剤は、キトサンを固形の担体および潤滑剤とともに圧縮することにより従来の手順に従って製剤化可能である。固形の担体の例には、デンプンおよびシュガーベントナイトが含まれる。本発明のキトサンは、結合剤（例えばラクトースまたはマンニトール）、従来の充填剤、および製錠剤を含んだ、硬い外殻の錠剤またはカプセルの形態でも投与可能である。医薬組成物は、非経口経路で投与可能である。非経口の投与形態の例には、活性物質の、水溶液、等張生理食塩水、もしくは５％グルコース溶液、または他の周知の医薬として許容可能な賦形剤が含まれる。シクロデキストリンまたは当業者によく知られた他の可溶化剤を、治療薬の送達のための医薬用賦形剤として利用することができる。
【００２１】
本発明の組成物の有効性を、インビトロおよびインビボの両方で評価することができる。例えば以下の実施例を参照のこと。簡潔に言えば、組成物を、インビトロにおいて乳がん細胞または子宮頚がん細胞の成長を抑制する能力についてテストすることができる。インビボの検討については、組成物を動物に注射することが可能であり、次いでそのがん抑制効果にアクセスする。結果に基づき、妥当な用量範囲および投与経路を決定することができる。
【００２２】
予防・治療を必要とする患者に有効な量のキトサン（例えば上述の菌由来のキトサン）を投与することにより、乳がんまたは子宮頚がんを予防・治療する方法も、本発明の範囲内にある。処置を受ける患者は、がん患者、または遺伝要因もしくは環境要因により乳がんもしくは子宮頚がんを発症するリスクのある個人でありうる。本方法は、単独でも、他の薬剤または治療と併せても実施可能である。
【００２３】
一般には、キトサンは、医薬として許容可能な担体（例えば生理食塩水）に懸濁し、経口もしくは静注で投与するか、または皮下、筋肉内、クモ膜下、腹腔内、直腸内、膣内、鼻腔内、胃内、気管内、肺内に注入もしくは埋め込んで投与する。必要とされる用量は、投与経路の選択；製剤の性質；患者の疾患の状態；患者の大きさ、体重、体表面積、年齢、および性別；投与される他の薬剤；および担当医師の判断；によって変わる。適当な用量は０．０１−１００．０ｍｇ／ｋｇの範囲内にある。必要用量の変動が大きいことは、利用可能なキトサンの多様性および種々の投与経路の有効性の違いを考慮すれば、予想されるべきことである。例えば、経口投与は静脈注射による投与よりも高い用量を必要とすることが予想されるであろう。このような用量水準の変動は、当業界ではよく知られているように、最適化のための標準的経験的手順を用いて調節可能である。該化合物を適当な送達媒体（例えば高分子体の微小粒子または埋め込み可能な装置）に封入すると、送達効率を、特に経口での送達について増大できることがある。
【００２４】
以下の特定の実施例は単に例証的なものであり、何であれ決して開示内容の残りの部分を限定するものではないと解釈されるべきである。さらに詳しく述べるまでもなく、当業者は本明細書の説明に基づいて本発明を最大限まで利用可能であると考えられる。本明細書で挙げられた全ての公開資料は、その全体が引用により本願に組み込まれる。
【００２５】
（菌由来キトサンの調製）
（１）菌由来キトサンＡの調製
４日間のスラント培養から得たＡｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒｔａｉｗａｎｅｓｉｓの胞子の懸濁液を、４００ｍｌの新鮮な培養用培地の入った１Ｌ容振とうフラスコに直接接種した。培養を、２００往復／分で振とうしながら温度２２℃で５０時間実施した。リットルあたりの培地には１０ｇのペプトン、２０ｇのグルコース、１ｇの酵母エキス、５ｇの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、１ｇのＫ_２ＨＰＯ_４、１ｇのＮａＣｌ、５ｇのＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、および０．１ｇのＣａＣｌ_２が含まれた。初期ｐＨを４．０に調整した。
【００２６】
培養液から細胞集団を回収し、１Ｎ水酸化ナトリウム溶液で１２１℃で１５分間処理した。アルカリ不溶物を２％酢酸に懸濁し、キトサンを溶解すべく混合物を９５℃で１２時間インキュベートした。酸可溶な上清のｐＨを１０に調整することにより、前記の可溶化キトサンを沈殿させた。次いで沈殿物（菌由来キトサンＡ）を洗浄し乾燥させた。
【００２７】
（２）菌由来キトサンＢの調製
４日間のスラント培養から得たＡｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒｔａｉｗａｎｅｓｉｓの胞子の懸濁液を、３Ｌの新鮮な培養用培地の入った５Ｌ容培養槽に直接接種した。培養を、温度２２℃で、４００ｒｐｍで撹拌し、３Ｌ／分で通気しながら、５０時間実施した。リットルあたりの培地には１０ｇのペプトン、２０ｇのグルコース、１ｇの酵母エキス、５ｇの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、１ｇのＫ_２ＨＰＯ_４、１ｇのＮａＣｌ、５ｇのＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、および０．１ｇのＣａＣｌ_２が含まれた。初期ｐＨを４．０に調整した。
培養液から細胞集団を分離し、キトサン（菌由来キトサンＢ）を上記（１）に記載したようにして調製した。
【００２８】
（菌由来キトサンの抗腫瘍活性）
ＨｅＬａ細胞（ＢＣＲＣ６０００５）およびＭＣＦ−７細胞（ＢＣＲＣ６０４３６）を、中華民国台湾に所在の生物資源保存研究センターから入手した。細胞懸濁液を、ハンクの緩衝塩類溶液（ＨＢＳＳ）中の０．０５％トリプシン／０．５３ｍＭＥＤＴＡ・４Ｎａで処理し、ピペッティングによりバラバラにし、血球計数器で細胞数を数えた。細胞をＭＥＭ培地（１０％血清含有）に再懸濁し、８．３５×１０^３個／ｍｌ（ＨｅＬａ）または１．６７×１０^４個／ｍｌ（ＭＣＦ−７）とした。細胞懸濁液（１８０μｌ）を９６ウェル組織培養プレートに植え、３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気中で１７−２０時間インキュベートした。
【００２９】
種々のキトサン溶液（５×１０^−３Ｍ酢酸を含んだダルベッコのリン酸緩衝液（Ｄ−ＰＢＳ）溶液、各２０μｌ）をウェルに添加し、細胞を３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気中で３日間インキュベートした。各キトサンの終濃度を１０ｐｐｍ（約１０^−７Ｍ）とした。
【００３０】
細胞の生存率を、ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチル−チアゾール−２−イル）２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド）法を用いて解析した。Ｄ−ＰＢＳ中の５ｍｇ／ｍｌＭＴＴ溶液２０μｌを各ウェルに添加し、細胞を３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気中で４時間インキュベートした。次に培地を取り除いた。１００μｌのＤＭＳＯを各ウェルに添加し、プレートを５分間振とうした。次いで各ウェルの光学密度を、試験波長（５４０ｎｍ）と対照波長（６９０ｎｍ）の両方について測定した。
【００３１】
本検討に使用したキトサンには菌由来キトサンＡ、菌由来キトサンＢ、カニ殻由来キトサンＩ、カニ殻由来キトサンＩＩ、カニ殻由来キトサンＩＩＩ、およびカニ殻由来キトサンＩＶが含まれる。
【００３２】
各キトサンの脱アセチル化率を、Ｔａｎｅｔａｌ．（１９９８）Ｔａｌａｎｔａ４５：７１３−７１９に記載のように一次導関数紫外線分光分析法を用いて測定した。
【００３３】
各キトサンの分子特性をトリプル検出ＧＰＣ／ＳＥＣ^３を用いて測定した。キトサン試料を移動相中に２．５ｍｇ／ｍｌに調製し、９０℃で３時間加熱した。上記移動相は０．３５Ｎ酢酸、８．２ｇ／Ｌ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．１とし、流速を０．７ｍｌ／分とした。試料の注入容量を１００μｌとし、ＳＥＣ^３分離を日本国所在の東ソー社のＴＳＫＧＰＣカラムＧＭＰＷ_ＸＬを用いて実施した。トリプル検出分析に使用する検出器は屈折率検出器（ウォーターズ社）、差圧粘度検出器（ビスコテック（Ｖｉｓｃｏｔｅｋ）社、モデルＴ６０）、および光散乱検出器（ビスコテック社、モデルＴ６０）とした。上記の３つの検出器を同時に用いて、データを収集しＴｒｉＳＥＣソフトウェアで処理した。
【００３４】
各キトサンの重量平均分子量（Ｍ_ｗ）、数平均分子量（Ｍ_ｎ）、多分散性係数（Ｍ_ｗ／Ｍ_ｎ）、回転半径（Ｒｇｗ）、重量平均固有粘度（［ η］ _ｗ）、および脱アセチル化率（ＤＤ）を下表１に記載する。
【００３５】
【表１】

【００３６】
予想外なことに、ＨｅＬａ細胞およびＭＣＦ−７細胞はいずれも菌由来キトサン（Ａ，Ｂ）感受性であるが、カニ殻由来キトサン（Ｉ−ＩＶ）感受性ではないことが見出された。菌由来キトサン（Ａ，Ｂ）は３０％を上回る抑制率で腫瘍の成長を選択的に抑制した（下表２を参照のこと）。一方、菌由来キトサン（Ａ，Ｂ）は、ヒト胎児肺細胞（ＭＲＣ−５）、またはヒト胃がん細胞株（ＡＧＳ）やヒト肝臓がん細胞株（ＨｅｐＧ２）のような他の腫瘍細胞株の成長を、有意には抑制しなかった。
【００３７】
【表２】

【００３８】
（他の実施形態）
本明細書で開示された全ての特徴は、任意の組み合わせで組み合わせることが可能である。本明細書で開示された各々の特徴を、同一の、同等の、または類似の目的を果たす別の特徴で置き換えることが可能である。従って、特に明示のないかぎり、開示された各特徴は、一般的な一連の同等または類似の特徴のうちの単なる一例である。
【００３９】
以上の説明から、当業者は本発明の本質的な特徴を簡単に確認することが可能であり、その趣旨および範囲を逸脱することなく、様々な利用および状態に合わせて本発明の種々の変形形態および修正形態を作製することが可能である。従って、他の実施形態も本明細書に記載の請求項の範囲内にある。

Claims

５０，０００−１４０，０００ｇ／モルの重量平均分子量と８５−９５％の脱アセチル化率とを有するキトサン。
請求項１のキトサンと、医薬として許容可能な担体とを含む医薬組成物。
乳がんを治療する方法であって、該治療を必要とする患者に有効な量のキトサンを投与することからなる方法。
前記キトサンが５０，０００−１４０，０００ｇ／モルの重量平均分子量と８５−９５％の脱アセチル化率とを有する、請求項３に記載の方法。
前記キトサンが菌から調製される、請求項４に記載の方法。
前記キトサンがケカビ科の菌から調製される、請求項５に記載の方法。
前記キトサンがシャジクケカビ属の菌から調製される、請求項６に記載の方法。
前記キトサンがＡｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒｔａｉｗａｎｅｓｉｓから調製される、請求項７に記載の方法。
前記キトサンが菌から調製される、請求項３に記載の方法。
前記キトサンがケカビ科の菌から調製される、請求項９に記載の方法。
前記キトサンがシャジクケカビ属の菌から調製される、請求項１０に記載の方法。
前記キトサンがＡｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒｔａｉｗａｎｅｓｉｓから調製される、請求項１１に記載の方法。
子宮頚がんを治療する方法であって、該治療を必要とする患者に、５０，０００−１４０，０００ｇ／モルの重量平均分子量と８５−９５％の脱アセチル化率とを有するキトサンを有効な量投与することからなる方法。
前記キトサンがケカビ科の菌から調製される、請求項１３に記載の方法。
前記キトサンがシャジクケカビ属の菌から調製される、請求項１４に記載の方法。
前記キトサンがＡｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒｔａｉｗａｎｅｓｉｓから調製される、請求項１５に記載の方法。
子宮頚がんを治療する方法であって、該治療を必要とする患者に、ケカビ科の菌から調製されるキトサンを有効な量投与することからなる方法。
前記キトサンがシャジクケカビ属の菌から調製される、請求項１７に記載の方法。
前記キトサンがＡｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒｔａｉｗａｎｅｓｉｓから調製される、請求項１８に記載の方法。
菌からキトサンを調製する方法であって、
菌の培養物を１５−２４℃の温度で培養すること；および
前記培養物からキトサンを単離すること；からなる方法。
前記菌がケカビ科の菌である、請求項２０に記載の方法。
前記菌がシャジクケカビ属の菌である、請求項２１に記載の方法。
前記菌がＡｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒｔａｉｗａｎｅｓｉｓである、請求項２２に記載の方法。
５０，０００−１４０，０００ｇ／モルの重量平均分子量と８５−９５％の脱アセチル化率とを有する、請求項２０に記載の方法で調製されるキトサン。
前記菌がケカビ科の菌である、請求項２４に記載のキトサン。
前記菌がシャジクケカビ属の菌である、請求項２５に記載のキトサン。
前記菌がＡｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒｔａｉｗａｎｅｓｉｓである、請求項２６に記載のキトサン。