JP2004212188A

JP2004212188A - Optical waveguide glucose sensor and coloring reagent film fixing method

Info

Publication number: JP2004212188A
Application number: JP2002381496A
Authority: JP
Inventors: Kenichi Uchiyama; 兼一内山; Ichiro Tono; 一郎東野; Hideo Eto; 英雄江藤; Miki Nagatomo; 美樹長友
Original assignee: Toshiba Corp
Current assignee: Toshiba Corp
Priority date: 2002-12-27
Filing date: 2002-12-27
Publication date: 2004-07-29

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide an optical waveguide glucose sensor and a coloring reagent film fixing method for sensitively and accurately analyzing a very minute quantity of glucose in a specimen material 100 such as a body fluid. <P>SOLUTION: The optical waveguide glucose sensor is provided with a substrate 1, a first optical waveguide layer 2 contacting the substrate 1, an entrance grating 3a and an exit grating 3b contacting the first optical waveguide layer 2 and spaced from each other, a second optical waveguide layer 4 contacting the first optical waveguide layer 2, provided between the entrance grating 3a and the exit grating 3b and having a refractive index higher than the first optical waveguide layer 2, a coloring reagent film 8 comprising a monomolecular layer of coloring reagent molecules formed on the second optical waveguide layer 4 and an enzyme catalyst fixing layer 9 containing an enzyme and a catalyst provided and contacting the coloring reagent layer 8. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO&NCIPI

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、グルコースセンサに関し、特に血液等の溶液中のグルコース濃度を測定するための光導波路型グルコースセンサ及び発色試薬膜固定化方法に係わる。
【０００２】
【従来の技術】
平面光導波路型グルコースセンサは、基板表面に一対のグレーティング（回折格子）を配置し、一方のグレーティングに光が入射され、もう一方のグレーティングから光が出射される。これらグレーティング間に位置する基板表面に単一の光導波路層を形成し、さらにこの光導波路層上に分子認識機能および情報変換機能を有する膜を形成した構造を有する。
【０００３】
このような構造のグルコースセンサにおいて、検体から抽出した血液等に含まれる生体分子を分子認識機能および情報交換機能を有する膜に接触した状態でレーザ光のような光をグレーティングを通して光導波路層に入射させ、エバネッセント波を発生させ、光導波路層上の膜による血液等に含まれる生体分子との反応に起因するエバネッセント波の変化量をグレーティングから出射される光を受光する受光素子により検出して、血液等に含まれる生体分子を分析する（例えば、特許文献１参照。）。
【０００４】
【特許文献１】
特開平９−６１３４６号公報
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、従来のグルコースセンサは光導波路層が単層で、ここで発生するエバネッセント波の変化量の検出には感度的に限界があり、また光導波路層上の膜構造から、検体から抽出した血液等に含まれる極微量の生体分子分析には不向きであるという問題があった。
【０００６】
本発明は、検体から抽出した、例えば体液中の極微量のグルコースを高感度かつ高精度で分析することが可能な光導波路型グルコースセンサと、その光導波路型グルコースセンサにおける発色試薬膜固定化方法を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、本発明の第１の特徴は、基板と、基板に接して設けられた第１光導波路層と、第１光導波路層に接して、互いに離間して設けられた入射側グレーティング及び出射側グレーティングと、第１光導波路層に接して、入射側グレーティングと出射側グレーティングの間に設けられた第１光導波路層より高屈折率を有する第２光導波路層と、第２光導波路層上に形成された発色試薬分子の単分子層からなる発色試薬膜と、発色試薬膜に接して設けられた酵素と触媒を含有する酵素触媒固定化層とを具備する光導波路型グルコースセンサを要旨とする。
【０００８】
本発明の第１の特徴によれば、酵素触媒固定化層上部から浸透される溶液中の極微量のグルコースを高感度かつ高精度で分析できる。
【０００９】
また本発明の第２の特徴は、金属酸化膜の表面を有する基板に、エポキシ基を有するシランカップリング剤溶液を塗布する工程と、シランカップリング剤溶液を焼き付けて金属シラン化膜を形成する工程と、金属シラン化膜に、アミノ基を有する発色試薬溶液を塗布する工程と、金属シラン化膜のエポキシ基とアミノ基とを結合させ単分子層の発色試薬膜を形成する工程とを含む発色試薬膜固定化方法を要旨とする。
【００１０】
本発明の第２の特徴によれば、発色試薬を単分子層として第２光導波路層上に固定できるため、形成される発色試薬膜を１００ｎｍ以内の厚さにすることができる。これにより光導波路型グルコースセンサのグルコース分析の感度及び精度を向上できる。
【００１１】
【発明の実施の形態】
次に、図面を参照して、本発明の第１の実施の形態及び変形例について説明する。以下の図面の記載において、同一または類似の部分には同一または類似の符号を付している。ただし、図面は模式的なものであり、各寸法の比率等は現実のものとは異なることに留意すべきである。従って、具体的な寸法等は以下の説明を参酌して判断すべきものである。また図面相互間においても互いの寸法の関係や比率が異なる部分が含まれていることは勿論である。
【００１２】
（第１の実施の形態）
本発明の第１の実施の形態に係る光導波路型グルコースセンサは、図１に示すように、基板１と、基板１に接して設けられた第１光導波路層２と、第１光導波路層２の両端部付近の基板１に接して設けられた入射側グレーティング３ａおよび出射側グレーティング３ｂと、第１光導波路層２に接して設けられ、入射側グレーティング３ａと出射側グレーティング３ｂの間に位置する第１光導波路層２より高屈折率を有する第２光導波路層４と、第２光導波路層４上に形成された発色試薬分子の単分子層からなる発色試薬膜８と、発色試薬膜８に接して設けられた酵素と触媒を含有する酵素触媒固定化層９とを具備する。
【００１３】
さらに、酵素触媒固定化層９に接して設けられた多孔質膜１０と、多孔質膜１０に接して設けられたメッシュ状導電性薄膜１１と、入射側グレーティング３ａと出射側グレーティング３ｂを覆うように第１光導波路層２に接して設けられた保護膜５と、保護膜５をさらに覆うように設けられた迷光トラッピング膜７とを具備する。
【００１４】
ここで、基板１は例えばホウケイ酸ガラス等からなる。第１光導波路層２は基板１より高屈折率を有する材質からなる。入射側グレーティング３ａと出射側グレーティング３ｂは、例えば酸化チタン（ＴｉＯ_２）、酸化亜鉛（ＺｎＯ）、ニオブ酸リチウム（ＬｉＮｂＯ_３）、ガリウム砒素（ＧａＡｓ）、インジウム錫酸化物（ＩＴＯ）、酸化タンタル（Ｔａ_２Ｏ_５）またはポリイミド等の第１光導波路層２より高い屈折率を有する材質からなる。第２光導波路層４は、例えばＴｉＯ_２、ＺｎＯ、ＬｉＮｂＯ_３、ＧａＡｓ、ＩＴＯ、Ｔａ_２Ｏ_５またはポリイミド等からなり、外周が傾斜した形状をしている。発色試薬膜８は、例えば３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン等を含有する。酵素触媒固定化層９は、例えばグルコースオキシダーゼと、α−Ｄ−グルコースをβ−Ｄ−グルコースに転換するためのムタロターゼ等を含有し、触媒として例えばエチレンジアミン４酢酸鉄（Ｆｅ−ＥＤＴＡ）等を含有する。
【００１５】
さらに、多孔質膜１０は例えば含水ゲル等からなる。メッシュ状導電性薄膜１１は例えばチタン薄膜等からなる。保護膜５は例えばフッ素樹脂等からなる。そして迷光トラッピング膜７は例えば液晶表示装置に用いられるブラックマトリックス（顔料入りレジスト）等からなる。
【００１６】
なお、基板１の屈折率をｎ_１、第１光導波路層２の屈折率をｎ_２、入射側グレーティング３ａと出射側グレーティング３ｂの屈折率をｎ_３、第２光導波路層４の屈折率をｎ_４および保護膜５の屈折率をｎ_５とすると、それらの屈折率の大小関係は、ｎ_４≧ｎ_３＞ｎ_２＞ｎ_１＞ｎ_５となる。
【００１７】
次に、図１に示した光導波路型グルコースセンサの製造方法の一例を図２、図３を参照して説明する。
【００１８】
（イ）まず、図２（ａ）に示すように、例えばホウケイ酸ガラスからなる基板１の表面を例えば３８０〜４００℃程度の硝酸カリウム溶液塩等のイオン交換溶液に浸漬してカリウム、ナトリウム等の高屈折率元素をイオン交換することにより第１光導波路層２を形成する。その後、化学蒸着（ＣＶＤ）法等により、第１光導波路層２上に例えばＴｉＯ_２、ＺｎＯ、ＬｉＮｂＯ_３、ＧａＡｓ、ＩＴＯ、Ｔａ_２Ｏ_５またはポリイミド等の第１光導波路層２より屈折率の高い材料の層１２を形成する。
【００１９】
（ロ）次に、図２（ｂ）に示すように第１光導波路層２より屈折率の高い材料の層１２をフォトエッチング技術等を用いてパターニングすることにより第１光導波路層２の中央付近に外周が傾斜した形状の第２光導波路層４を形成する。
【００２０】
（ハ）次に、例えばＣＶＤ法等により、第１光導波路層２の全面に第１光導波路層２より屈折率の高い材料の層１２を再度形成する。その後、フォトエッチング技術等を用いて第１光導波路層２より屈折率の高い材料の層１２をパターニングすることにより、図２（ｃ）に示すように第１光導波路層２の両端部付近表面上に入射側グレーティング３ａと出射側グレーティング３ｂを形成する。
【００２１】
（ニ）次に、入射側グレーティング３ａと出射側グレーティング３ｂおよび第２光導波路層４を含む第１光導波路層２上に、例えば感光性フッ素系樹脂のような入射側グレーティング３ａと出射側グレーティング３ｂに比べて低屈折率を有する材料の被膜をスピン塗布する。つづいて、この被膜に露光、現像処理を施すことにより図２（ｄ）に示すように第２光導波路層４の表面に対応する箇所に矩形状の開口部６を有する感光性フッ素系樹脂からなる保護膜５を形成する。
【００２２】
（ホ）次に、ＣＶＤ法や真空蒸着法により、図３（ｅ）に示すように保護膜５の表面（開口部６の内面を除く）に例えば液晶表示装置に用いられるブラックマトリックスからなる迷光トラッピング膜７を形成する。
【００２３】
（ヘ）次に、図３（ｆ）に示すように保護膜５の開口部６から露出した第２光導波路層４表面部分に発色試薬膜８を形成する。具体的な発色試薬膜８の形成方法については、後で詳細に記述する。
【００２４】
（ト）次に、図３（ｇ）に示すように酵素触媒固定化層９は、例えば下記式（１）に示す構造式の化合物のような脂質の膜で固定化することにより形成される。
【化１】

【００２５】
（チ）次に、保護膜５の開口部６から露出した酵素触媒固定化層９上に、例えば有機モノマー、光反応開始剤およびデカン酸メチルのような貧溶媒を含む溶液をスピン塗布し、乾燥させ光重合させた後、洗浄処理することにより図３の（ｈ）に示すように多孔質膜１０を形成する。
【００２６】
（リ）最後に、チタンアルコキシドを加水分解して原液を作り、これをスピン塗布し、乾燥後加熱して酸化チタン薄膜を得るゾルゲル方法等によって、図３（ｉ）に示すようにメッシュ状導電性薄膜１１を多孔質膜１０上に形成する。そして検体１００に電界（例えばパルス状の電界）が印加されるように、検体１００の電極板１０１に電源１０２の陽極を接続し、メッシュ状導電性薄膜１１に電源１０２の陰極を接続する。この結果、図１に示す光導波路型グルコースセンサが完成する。
【００２７】
つづいて本発明の第１の実施の形態に係る発色試薬膜固定化方法について、図４、図５を参照しながら詳細に説明する。図１に示した光導波路型グルコースセンサは、第２光導波路層４上での発色試薬と生体分子との発色反応に起因するエバネッセント波の吸光量を検出することで、その生体分子量を測定しようとするものである。しかしエバネッセント波は第２光導波路層４表面から約１００ｎｍの厚さまでしかしみ出さない。そこで本発明の第１の実施の形態では、分析精度を向上させるため発色試薬膜８を第２光導波路層４表面から約１００ｎｍ以内に設けるように形成する。
【００２８】
（Ｉ）シランカップリング剤溶液の調製：
例えば図４（Ａ）に示すようなエポキシ基を有する構造をしたシランカップリング剤を、アルコールと少量の純水からなる溶液に溶かし、シランカップリング剤溶液を調製する。
【００２９】
（ＩＩ）発色試薬溶液の調製：
発色試薬として、例えば図４（Ｂ）に示すようにアミノ基を有する３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンを使用し、この発色試薬を室温で純水に溶かし、発色試薬溶液を調製する。
【００３０】
（ＩＩＩ）膜構造発色試薬の固定：
１）第２光導波路層４表面にＣＶＤ法等により、図４（ａ）に示す金属酸化膜８ａを形成する。なお、第２光導波路層４が金属酸化物で形成されているのであれば、その表面が図４（ａ）のような状態になっているので特にこの操作は必要としない。
２）（Ｉ）で調製したシランカップリング剤溶液を図４（ａ）に示す金属酸化膜８ａ表面上にスピン塗布するか、図４（ａ）に示した構造体を（Ｉ）で調製したシランカップリング剤溶液中に３０分から６０分程度浸漬した後に純水で洗浄する。
３）続いて１２０℃で焼き付け、図４（ｂ）に示す金属シラン化膜８ｂを形成する。
４）次に、（ＩＩ）で調製した発色試薬溶液を金属シラン化膜８ｂ上にスピン塗布するか、図４（ｂ）に示した構造体を（ＩＩ）で調製した発色試薬溶液中に３０分から６０分程度浸漬した後に純水で洗浄する。
５）続いて常温で乾燥させ、図４（Ｂ）の発色試薬のアミノ基と金属シラン化膜８ｂのエポキシ基と結合させ、図４（ｃ）に示す発色試薬膜８を形成する。この固定方法により形成される発色試薬膜８の立体的な構造は、図５に示すように、発色試薬分子がシランカップリング剤によって第２光導波路層４表面に対してほぼ垂直に結合し配列した単分子層となる。そして、発色試薬分子が酵素触媒固定化層９と接する構造となる。この単分層子は高々数ｎｍ〜数十ｎｍレベルの厚さしかないため、発色を起こす部位が第２光導波路層表面から１００ｎｍ以内のところに位置するようになる。そのために、発色すれば、確実にエバネッセント波を吸収することになる。
【００３１】
続いて、検体１００のグルコースの測定方法について説明する。図１に示す光導波路型グルコースセンサのメッシュ状導電性薄膜１１側に検体１００、例えば人体の皮膚の一部を接触させ、さらに検体１００の別の部位に電極板１０１を接触させる。ここで、多孔質膜１０の上部に配置されたメッシュ状導電性薄膜１１と電極板１０１の間に電源１０２から所望の電界（例えばパルス状電界）を印加すると、検体１００からグルコースを含む体液が多孔質膜１０を通して酵素触媒固定化層９に効率よく抽出される、いわゆる微侵襲作用がなされる。この体液中のグルコースは、酵素触媒固定化層９でグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）等との酸化酵素反応により過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）を発生させる。さらに過酸化水素からＦｅ−ＥＤＴＡを触媒としてラジカル酸素原子（Ｏ^＊）が生成される。このラジカル酸素原子により発色試薬膜８で発色試薬を発色させる。この反応を模式すると（２）、（３）、（４）のようになる。
グルコース＋酸化酵素（ＧＯＤ等）→ Ｈ_２Ｏ_２・・・・・（２）
Ｈ_２Ｏ_２＋Ｆｅ−ＥＤＴＡ → Ｏ^＊・・・・・（３）
Ｏ^＊＋発色試薬 → 発色・・・・・（４）
【００３２】
このような状態で、図１に示すように光源２１（例えば波長６５０ｎｍの半導体レーザ）および受光素子２２をそれぞれグルコースセンサの基板１の裏面左側および右側に配置する。そして光源２１からレーザ光を偏光フィルタ２３を通してグルコースセンサの基板１裏面側に入射する。そのレーザ光は基板１を通して入射側グレーティング３ａと第１光導波路層２の界面で屈折されて、その第１光導波路層２を伝播される。第１光導波路層２を伝播されるレーザ光は、この第１光導波路層２より高屈折率の第２光導波路層４との界面で２つのモード（ＴＭモード、ＴＥモード）に分割され、ＴＭモードレーザ光は第１光導波路層２を、ＴＥモードレーザ光は第２光導波路層４を伝播する。このとき、発色試薬膜８における発色試薬の発色に基づく変化（例えば吸光度変化）によりこの発色試薬膜８直下の第２光導波路層４を伝播する光の強度が変化する。第１光導波路層２と第２光導波路層４を伝播した光は、受光素子２２側端付近において第１光導波路層２と第２光導波路層４の界面で再び結合、干渉するため、第２光導波路層４を伝播する光の強度変化を増幅される。その結果、第２光導波路層４を伝播する光の極微な変化も偏光フィルタ２４を通して受光素子２２で検出される。
【００３３】
したがって、光導波路を第１光導波路層２と第２光導波路層４により構成し、本発明の発色試薬膜固定化方法により、発色試薬膜８を第２光導波路層４上に接して１００ｎｍ以内に設けることで、検体１００（人体の皮膚下）から抽出されたグルコースと酵素の反応による発色試薬の発色に基づく第２光導波路層４を伝播する光の極微な変化を第１光導波路層２と第２光導波路層４の界面で検出できる。したがって、検体１００から抽出された体液中の極微量のグルコースを一層高感度で分析できる。
【００３４】
また、図１に示すように入射側グレーティング３ａと出射側グレーティング３ｂを含む第１光導波路層２上に保護膜５を設けることによって、第１光導波路層２および入射側グレーティング３ａと出射側グレーティング３ｂに外部圧力が直接加わるのを防止できる。このため、第１光導波路層２および入射側グレーティング３ａと出射側グレーティング３ｂに外部圧力が直接加わることに伴う部材の屈折率変化によって、その第１光導波路層２を伝播する光が外部に漏れるのを防止できる。しかも、保護膜５を第１光導波路層２に比べて低屈折率材料で形成することによって、その第１光導波路層２を伝播する光を第１光導波路層２と保護膜５との界面で効果的に全反射させて第１光導波路層２内に封じ込めることができる。したがって、第１光導波路層２から光が外部に漏れるのを防止できる。その結果、検体１００中の極微量のグルコースをより高感度で分析することが可能となる。
【００３５】
さらに、第１光導波路層２を伝播する光が保護膜５との界面から保護膜５側に漏れた場合、迷光トラッピング膜７を保護膜５の表面（開口部６の内面を除く）に設けることによって、漏光を迷光トラッピング膜７でトラップすることができる。すなわち、第１光導波路層２を伝播する光が保護膜５との界面から保護膜５側に漏れると、保護膜５表面と外界（空気）との屈折率の差により漏光は保護膜５表面で全反射して第２光導波路層４に迷光として入射されるため、前述した検体１００中のグルコースの検出感度を低下させる。これに対し、迷光トラッピング膜７を保護膜５の表面に設けることによって、漏光が保護膜５表面で全反射することなく迷光トラッピング膜７でトラップできる。したがって、漏光が第２光導波路層４に迷光として入射するのを防止でき、検体１００中のグルコースをより高感度で分析することが可能となる。
【００３６】
さらに、酵素触媒固定化層９を多孔質膜１０で覆うことによって、酵素触媒固定化層９に検体１００から抽出される溶液（例えば体液）中のグルコース以外の蛋白や血球等の不純物の影響を防止できる。つまり酵素触媒固定化層９における酵素とグルコースの酵素反応および発色試薬膜８での発色試薬の発色反応に基づく変化による第２光導波路層４を伝播する光の強度変化に対して作用する外乱を低減できる。したがって、検体１００から抽出された体液中の極微量のグルコースをより一層高感度で分析することが可能となる。
【００３７】
（第１の実施の形態の変形例）
本発明の第１の実施の形態の変形例として、図６に示すように電源１０２の陰極を導電性のある金属酸化物でできた第２光導波路層４に接続し、検体１００の電極板１０１に電源１０２の陽極を接続する。このようにすることでメッシュ状導電性薄膜１１は不要となる。そして多孔質膜１０側に検体１００、例えば人体の皮膚の一部を接触させ、さらに検体１００の別の部位に電極板１０１を接触させる。ここで、この多孔質膜１０の後方に配置された導電性の第２光導波路層４と電極板１０１の間に電源１０２から所望の電界（例えばパルス状電界）を印加すると、微侵襲作用により、検体１００からグルコースを含む体液が多孔質膜１０を通して酵素触媒固定化層９に効率よく抽出される。
【００３８】
第１の実施の形態で記述したグルコースの測定方法と同様に、抽出された体液中のグルコースは酵素触媒反応を起こし、この酵素触媒反応によるラジカル酸素原子により酵素触媒固定化層９直下の発色試薬膜８の発色試薬を発色させる。そして発色に基づく第２光導波路層４を伝播する光の極微な変化を偏光フィルタ２４を通して受光素子２２で検出することが可能になる。したがって検体１００から抽出された体液中の極微量のグルコースを高感度で分析することができる。
【００３９】
（その他の実施の形態）
ここで、図１と図６は微侵襲作用を利用して体液を抽出する場合について示しているが、本発明のその他の実施の形態として、検体１００への電界の印加に代えて、検体１００への穿刺等によって得られる血液等を直接メッシュ状導電性薄膜１１または多孔質膜１０上から滴下して分析することも可能であることは勿論である。したがって、本発明の技術的範囲は上記の説明から妥当な特許請求の範囲に係る発明特定事項によってのみ定められるものである。
【００４０】
【発明の効果】
本発明によれば、検体１００から抽出される例えば体液中の極微量のグルコースを高感度かつ高精度で分析することが可能な光導波路型グルコースセンサと、光導波路型グルコースセンサの第２光導波路層４に接して１００ｎｍ以内の厚さに発色試薬膜８を固定化する発色試薬膜固定化方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第１の実施の形態に係る光導波路型グルコースセンサを示す断面図である。
【図２】図１の光導波路型グルコースセンサの製造工程を示す行程断面図である（その１）。
【図３】図１の光導波路型グルコースセンサの製造工程を示す行程断面図である（その２）。
【図４】膜構造発色試薬の固定化方法の図である。
【図５】発色試薬膜の立体的な構造を示す図である。
【図６】本発明の第１の実施の形態の変形例に係る光導波路型グルコースセンサを示す断面図である。
【符号の説明】
１…基板、２…第１光導波路層、３ａ…入射側グレーティング、３ｂ…出射側グレーティング、４…第２光導波路層、５…保護膜、６…開口部、７…迷光トラッピング膜、８…発色試薬膜、８ａ…金属酸化膜、８ｂ…金属シラン化膜、９…酵素触媒固定化層、１０…多孔質膜、１１…メッシュ状導電性薄膜、１２…第１光導波路層より屈折率の高い材料の層、２１…光源、２２…受光素子、２３…偏光フィルタ、２４…偏光フィルタ、１００…検体、１０１…電極板、１０２…電源。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a glucose sensor, and more particularly to an optical waveguide type glucose sensor for measuring the concentration of glucose in a solution such as blood, and a method of fixing a color reagent film.
[0002]
[Prior art]
In the planar optical waveguide type glucose sensor, a pair of gratings (diffraction gratings) is arranged on a substrate surface, and light is incident on one grating and light is emitted from the other grating. A single optical waveguide layer is formed on the substrate surface located between these gratings, and a film having a molecular recognition function and an information conversion function is formed on the optical waveguide layer.
[0003]
In a glucose sensor having such a structure, light such as laser light is incident on an optical waveguide layer through a grating in a state where biomolecules contained in blood or the like extracted from a sample are in contact with a film having a molecular recognition function and an information exchange function. The evanescent wave is generated, and the amount of change in the evanescent wave caused by the reaction of the film on the optical waveguide layer with biomolecules contained in blood or the like is detected by a light receiving element that receives light emitted from the grating, Biomolecules contained in blood and the like are analyzed (for example, see Patent Document 1).
[0004]
[Patent Document 1]
JP-A-9-61346 [0005]
[Problems to be solved by the invention]
However, the conventional glucose sensor has a single optical waveguide layer, and there is a limit in sensitivity in detecting the amount of change in the evanescent wave generated here, and the blood structure extracted from the sample is determined by the membrane structure on the optical waveguide layer. However, there is a problem that it is not suitable for analysis of a very small amount of biomolecules contained in the above.
[0006]
The present invention provides an optical waveguide glucose sensor capable of analyzing a very small amount of glucose extracted from a specimen, for example, in a body fluid with high sensitivity and high accuracy, and a method for immobilizing a color reagent film on the optical waveguide glucose sensor. The purpose is to provide.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
In order to achieve the above object, a first feature of the present invention is that a substrate, a first optical waveguide layer provided in contact with the substrate, and a first optical waveguide layer provided in contact with the first optical waveguide layer and separated from each other are provided. An entrance-side grating and an exit-side grating, a second optical waveguide layer in contact with the first optical waveguide layer and having a higher refractive index than the first optical waveguide layer provided between the entrance-side grating and the exit-side grating, (2) An optical waveguide type comprising: a coloring reagent film formed of a monolayer of a coloring reagent molecule formed on an optical waveguide layer; and an enzyme catalyst-immobilized layer containing an enzyme and a catalyst provided in contact with the coloring reagent film. The gist is a glucose sensor.
[0008]
According to the first feature of the present invention, a trace amount of glucose in a solution permeated from the upper portion of the enzyme catalyst immobilization layer can be analyzed with high sensitivity and high accuracy.
[0009]
A second feature of the present invention is a step of applying a silane coupling agent solution having an epoxy group to a substrate having a surface of a metal oxide film, and baking the silane coupling agent solution to form a metal silanized film. And a step of applying a color-forming reagent solution having an amino group to the metal silanized film, and a step of forming a monomolecular color-forming reagent film by bonding the epoxy group and the amino group of the metal silanized film. The gist of the method for immobilizing a coloring reagent film is as follows.
[0010]
According to the second aspect of the present invention, since the coloring reagent can be fixed as a monomolecular layer on the second optical waveguide layer, the thickness of the formed coloring reagent film can be made within 100 nm. Thereby, the sensitivity and accuracy of glucose analysis of the optical waveguide glucose sensor can be improved.
[0011]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Next, a first embodiment and modifications of the present invention will be described with reference to the drawings. In the following description of the drawings, the same or similar parts are denoted by the same or similar reference numerals. However, it should be noted that the drawings are schematic and ratios of dimensions are different from actual ones. Therefore, specific dimensions and the like should be determined in consideration of the following description. In addition, it goes without saying that parts having different dimensional relationships and ratios are included between the drawings.
[0012]
(First Embodiment)
As shown in FIG. 1, an optical waveguide glucose sensor according to a first embodiment of the present invention includes a substrate 1, a first optical waveguide layer 2 provided in contact with the substrate 1, and a first optical waveguide layer. 2 is provided between the incident-side grating 3a and the output-side grating 3b provided in contact with the substrate 1 near both ends and the first optical waveguide layer 2, and is located between the incident-side grating 3a and the output-side grating 3b. A second optical waveguide layer 4 having a higher refractive index than the first optical waveguide layer 2 to be formed, a color reagent film 8 formed on the second optical waveguide layer 4 and formed of a monolayer of color reagent molecules, and a color reagent film 8 and an enzyme-catalyst-immobilized layer 9 containing a catalyst and a catalyst provided in contact with 8.
[0013]
Furthermore, the porous membrane 10 provided in contact with the enzyme catalyst immobilization layer 9, the mesh-like conductive thin film 11 provided in contact with the porous membrane 10, and the entrance-side grating 3 a and the exit-side grating 3 b are covered. A protective film 5 provided in contact with the first optical waveguide layer 2 and a stray light trapping film 7 provided so as to further cover the protective film 5.
[0014]
Here, the substrate 1 is made of, for example, borosilicate glass. The first optical waveguide layer 2 is made of a material having a higher refractive index than the substrate 1. The entrance-side grating 3a and the exit-side grating 3b are made of, for example, titanium oxide (TiO ₂ ), zinc oxide (ZnO), lithium niobate (LiNbO ₃ ), gallium arsenide (GaAs), indium tin oxide (ITO), tantalum oxide ( It is made of a material having a higher refractive index than the first optical waveguide layer 2, such as Ta ₂ O ₅ ) or polyimide. The second optical waveguide layer 4 is made of, for example, TiO ₂ , ZnO, LiNbO ₃ , GaAs, ITO, Ta ₂ O ₅ or polyimide, and has a shape whose outer periphery is inclined. The coloring reagent film 8 contains, for example, 3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine. The enzyme catalyst-immobilized layer 9 contains, for example, glucose oxidase, mutarotase for converting α-D-glucose into β-D-glucose, and contains, for example, iron ethylenediaminetetraacetate (Fe-EDTA) as a catalyst. I do.
[0015]
Further, the porous membrane 10 is made of, for example, a hydrogel. The mesh conductive thin film 11 is made of, for example, a titanium thin film. The protective film 5 is made of, for example, a fluorine resin. The stray light trapping film 7 is made of, for example, a black matrix (a pigment-containing resist) used in a liquid crystal display device.
[0016]
The refractive index of the substrate 1 is n ₁ , the refractive index of the first optical waveguide layer 2 is n ₂ , the refractive indexes of the incident-side grating 3a and the output-side grating 3b are n ₃ , and the refractive index of the second optical waveguide layer 4 is Assuming that n ₄ and the refractive index of the protective film 5 are n ₅ , the magnitude relationship between the refractive indices is n ₄ ≧ n ₃ > n ₂ > n ₁ > n ₅ .
[0017]
Next, an example of a method of manufacturing the optical waveguide glucose sensor shown in FIG. 1 will be described with reference to FIGS.
[0018]
(A) First, as shown in FIG. 2A, the surface of a substrate 1 made of, for example, borosilicate glass is immersed in an ion exchange solution such as a potassium nitrate solution salt at about 380 to 400 ° C. to remove potassium, sodium, or the like. The first optical waveguide layer 2 is formed by ion exchange of a high refractive index element. Thereafter, the first optical waveguide layer 2 made of, for example, TiO ₂ , ZnO, LiNbO ₃ , GaAs, ITO, Ta ₂ O _5, or polyimide has a higher refractive index on the first optical waveguide layer 2 by a chemical vapor deposition (CVD) method or the like. A high material layer 12 is formed.
[0019]
(B) Next, as shown in FIG. 2B, the layer 12 of a material having a higher refractive index than that of the first optical waveguide layer 2 is patterned by using a photo-etching technique or the like so that the center of the first optical waveguide layer 2 is formed. A second optical waveguide layer 4 having an inclined outer periphery is formed in the vicinity.
[0020]
(C) Next, a layer 12 of a material having a higher refractive index than the first optical waveguide layer 2 is formed again on the entire surface of the first optical waveguide layer 2 by, for example, a CVD method. Thereafter, the layer 12 made of a material having a higher refractive index than the first optical waveguide layer 2 is patterned by using a photo-etching technique or the like, thereby forming a surface near both ends of the first optical waveguide layer 2 as shown in FIG. The incident side grating 3a and the exit side grating 3b are formed thereon.
[0021]
(D) Next, on the first optical waveguide layer 2 including the entrance-side grating 3a, the exit-side grating 3b, and the second optical waveguide layer 4, the entrance-side grating 3a such as a photosensitive fluororesin and the exit-side grating are provided. A coating of a material having a lower refractive index than that of 3b is applied by spin coating. Subsequently, the coating film is subjected to exposure and development treatments, whereby a photosensitive fluorine-based resin having a rectangular opening 6 at a position corresponding to the surface of the second optical waveguide layer 4 as shown in FIG. A protective film 5 is formed.
[0022]
(E) Next, as shown in FIG. 3E, stray light composed of, for example, a black matrix used in a liquid crystal display device is formed on the surface of the protective film 5 (excluding the inner surface of the opening 6) by the CVD method or the vacuum evaporation method as shown in FIG. A trapping film 7 is formed.
[0023]
(F) Next, as shown in FIG. 3 (f), a coloring reagent film 8 is formed on the surface of the second optical waveguide layer 4 exposed from the opening 6 of the protective film 5. A specific method of forming the color reagent film 8 will be described later in detail.
[0024]
(G) Next, as shown in FIG. 3 (g), the enzyme catalyst-immobilized layer 9 is formed by, for example, immobilizing with a lipid membrane such as a compound of the structural formula represented by the following formula (1). .
Embedded image

[0025]
(H) Next, a solution containing a poor solvent such as an organic monomer, a photoreaction initiator and methyl decanoate is spin-coated on the enzyme catalyst fixing layer 9 exposed from the opening 6 of the protective film 5, After drying and photopolymerization, a washing treatment is performed to form the porous film 10 as shown in FIG.
[0026]
(I) Finally, a titanium alkoxide is hydrolyzed to form a stock solution, which is spin-coated, dried and heated to obtain a titanium oxide thin film by a sol-gel method or the like, as shown in FIG. The conductive thin film 11 is formed on the porous film 10. Then, the anode of the power source 102 is connected to the electrode plate 101 of the sample 100, and the cathode of the power source 102 is connected to the mesh-shaped conductive thin film 11 so that an electric field (for example, a pulsed electric field) is applied to the sample 100. As a result, the optical waveguide glucose sensor shown in FIG. 1 is completed.
[0027]
Next, a method for fixing a color reagent film according to the first embodiment of the present invention will be described in detail with reference to FIGS. The optical waveguide glucose sensor shown in FIG. 1 measures the amount of the biomolecule by detecting the amount of evanescent wave absorbed due to the color reaction between the coloring reagent and the biomolecule on the second optical waveguide layer 4. It is assumed that. However, the evanescent wave does not protrude from the surface of the second optical waveguide layer 4 to a thickness of about 100 nm. Therefore, in the first embodiment of the present invention, the color-forming reagent film 8 is formed so as to be provided within about 100 nm from the surface of the second optical waveguide layer 4 in order to improve the analysis accuracy.
[0028]
(I) Preparation of silane coupling agent solution:
For example, a silane coupling agent having a structure having an epoxy group as shown in FIG. 4A is dissolved in a solution composed of alcohol and a small amount of pure water to prepare a silane coupling agent solution.
[0029]
(II) Preparation of chromogenic reagent solution:
As a coloring reagent, for example, 3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine having an amino group is used as shown in FIG. 4 (B), and this coloring reagent is dissolved in pure water at room temperature, and a coloring reagent solution is prepared. Prepare.
[0030]
(III) Immobilization of the membrane structure coloring reagent:
1) A metal oxide film 8a shown in FIG. 4A is formed on the surface of the second optical waveguide layer 4 by a CVD method or the like. If the second optical waveguide layer 4 is made of a metal oxide, this operation is not particularly necessary since the surface is in a state as shown in FIG.
2) The silane coupling agent solution prepared in (I) was spin-coated on the surface of the metal oxide film 8a shown in FIG. 4A, or the structure shown in FIG. 4A was prepared in (I). After being immersed in the silane coupling agent solution for about 30 to 60 minutes, it is washed with pure water.
3) Subsequently, baking is performed at 120 ° C. to form a metal silanized film 8b shown in FIG. 4B.
4) Next, the color reagent solution prepared in (II) is spin-coated on the metal silanized film 8b, or the structure shown in FIG. 4 (b) is added to the color reagent solution prepared in (II). After immersion for about 1 to 60 minutes, the substrate is washed with pure water.
5) Subsequently, it is dried at normal temperature, and is bonded to the amino group of the coloring reagent of FIG. 4B and the epoxy group of the metal silanized film 8b to form the coloring reagent film 8 shown in FIG. 4C. As shown in FIG. 5, the three-dimensional structure of the coloring reagent film 8 formed by this fixing method is such that the coloring reagent molecules are bonded almost perpendicularly to the surface of the second optical waveguide layer 4 by the silane coupling agent and arranged. A monolayer is formed. Then, a structure is obtained in which the coloring reagent molecules are in contact with the enzyme catalyst immobilization layer 9. Since the single-layer element has a thickness of at most several nm to several tens nm at the most, the portion that causes color development is located within 100 nm from the surface of the second optical waveguide layer. For this reason, if the color is developed, the evanescent wave will surely be absorbed.
[0031]
Subsequently, a method of measuring glucose in the sample 100 will be described. A sample 100, for example, a part of the skin of a human body is brought into contact with the mesh-shaped conductive thin film 11 side of the optical waveguide glucose sensor shown in FIG. 1, and an electrode plate 101 is brought into contact with another part of the sample 100. Here, when a desired electric field (for example, a pulsed electric field) is applied from the power supply 102 between the mesh-shaped conductive thin film 11 disposed on the porous film 10 and the electrode plate 101, the body fluid containing glucose is generated from the specimen 100. A so-called micro-invasive action, which is efficiently extracted through the porous membrane 10 to the enzyme catalyst-immobilized layer 9, is performed. Glucose in this body fluid generates hydrogen peroxide (H ₂ O ₂ ) by an oxidase reaction with glucose oxidase (GOD) or the like in the enzyme catalyst immobilization layer 9. Further, radical oxygen atoms (O ^* ) are generated from hydrogen peroxide using Fe-EDTA as a catalyst. The color reagent is colored by the color reagent film 8 by the radical oxygen atoms. This reaction is schematically represented as (2), (3), and (4).
Glucose + oxidase (GOD etc.) → H ₂ O ₂ ··· (2)
H ₂ O ₂ + Fe-EDTA → O ^* ... (3)
O ^* + coloring reagent → coloring ... (4)
[0032]
In this state, as shown in FIG. 1, the light source 21 (for example, a semiconductor laser having a wavelength of 650 nm) and the light receiving element 22 are arranged on the left and right sides of the back surface of the substrate 1 of the glucose sensor, respectively. Then, laser light from the light source 21 is incident on the back surface of the substrate 1 of the glucose sensor through the polarizing filter 23. The laser light is refracted at the interface between the incident-side grating 3a and the first optical waveguide layer 2 through the substrate 1, and propagates through the first optical waveguide layer 2. The laser light propagating through the first optical waveguide layer 2 is split into two modes (TM mode and TE mode) at the interface with the second optical waveguide layer 4 having a higher refractive index than the first optical waveguide layer 2. The TM mode laser beam propagates through the first optical waveguide layer 2 and the TE mode laser beam propagates through the second optical waveguide layer 4. At this time, the intensity of the light propagating through the second optical waveguide layer 4 immediately below the coloring reagent film 8 changes due to a change (for example, a change in absorbance) based on the coloring of the coloring reagent in the coloring reagent film 8. The light that has propagated through the first optical waveguide layer 2 and the second optical waveguide layer 4 couples and interferes again at the interface between the first optical waveguide layer 2 and the second optical waveguide layer 4 near the end on the light receiving element 22 side. A change in the intensity of light propagating through the two optical waveguide layers 4 is amplified. As a result, even a minute change in the light propagating through the second optical waveguide layer 4 is detected by the light receiving element 22 through the polarizing filter 24.
[0033]
Therefore, the optical waveguide is constituted by the first optical waveguide layer 2 and the second optical waveguide layer 4, and the color reagent layer 8 is brought into contact with the second optical waveguide layer 4 within 100 nm by the color reagent layer fixing method of the present invention. , The minute change of the light propagating through the second optical waveguide layer 4 based on the coloring of the coloring reagent due to the reaction between the glucose extracted from the sample 100 (under the skin of the human body) and the enzyme, and the first optical waveguide layer 2 And the second optical waveguide layer 4. Therefore, a trace amount of glucose in the body fluid extracted from the specimen 100 can be analyzed with higher sensitivity.
[0034]
In addition, as shown in FIG. 1, by providing a protective film 5 on the first optical waveguide layer 2 including the incident-side grating 3a and the output-side grating 3b, the first optical waveguide layer 2, the incident-side grating 3a, and the output-side grating are provided. 3b can be prevented from directly applying external pressure. Therefore, light propagating through the first optical waveguide layer 2 leaks to the outside due to a change in the refractive index of the member caused by the external pressure being directly applied to the first optical waveguide layer 2 and the incident-side grating 3a and the output-side grating 3b. Can be prevented. Moreover, since the protective film 5 is formed of a material having a lower refractive index than that of the first optical waveguide layer 2, light propagating through the first optical waveguide layer 2 is transmitted to the interface between the first optical waveguide layer 2 and the protective film 5. And can be effectively totally reflected and sealed in the first optical waveguide layer 2. Therefore, it is possible to prevent light from leaking from the first optical waveguide layer 2 to the outside. As a result, a trace amount of glucose in the sample 100 can be analyzed with higher sensitivity.
[0035]
Further, when light propagating through the first optical waveguide layer 2 leaks from the interface with the protective film 5 to the protective film 5 side, the stray light trapping film 7 is provided on the surface of the protective film 5 (excluding the inner surface of the opening 6). Thus, light leakage can be trapped by the stray light trapping film 7. That is, when light propagating through the first optical waveguide layer 2 leaks from the interface with the protective film 5 to the protective film 5 side, the light leaks due to a difference in the refractive index between the surface of the protective film 5 and the outside world (air). The light is totally reflected and enters the second optical waveguide layer 4 as stray light, so that the detection sensitivity of glucose in the sample 100 described above is reduced. On the other hand, by providing the stray light trapping film 7 on the surface of the protective film 5, light leakage can be trapped by the stray light trapping film 7 without being totally reflected on the surface of the protective film 5. Therefore, it is possible to prevent light leakage from entering the second optical waveguide layer 4 as stray light, and it is possible to analyze glucose in the sample 100 with higher sensitivity.
[0036]
Further, by covering the enzyme catalyst-immobilized layer 9 with the porous membrane 10, the enzyme catalyst-immobilized layer 9 is not affected by impurities such as proteins and blood cells other than glucose in a solution (for example, a body fluid) extracted from the specimen 100. Can be prevented. That is, a disturbance acting on a change in the intensity of light propagating through the second optical waveguide layer 4 due to a change based on an enzyme reaction between the enzyme and glucose in the enzyme catalyst immobilization layer 9 and a coloring reaction of the coloring reagent in the coloring reagent film 8. Can be reduced. Therefore, it is possible to analyze a trace amount of glucose in the body fluid extracted from the sample 100 with higher sensitivity.
[0037]
(Modification of First Embodiment)
As a modification of the first embodiment of the present invention, as shown in FIG. 6, a cathode of a power supply 102 is connected to a second optical waveguide layer 4 made of a conductive metal oxide, The anode of the power supply 102 is connected to 101. By doing so, the mesh-shaped conductive thin film 11 becomes unnecessary. Then, the specimen 100, for example, a part of the skin of a human body is brought into contact with the porous membrane 10 side, and the electrode plate 101 is brought into contact with another part of the specimen 100. Here, when a desired electric field (for example, a pulsed electric field) is applied from the power source 102 between the conductive second optical waveguide layer 4 and the electrode plate 101 disposed behind the porous film 10, a slight invasive action occurs. In addition, the body fluid containing glucose is efficiently extracted from the specimen 100 through the porous membrane 10 into the enzyme catalyst-immobilized layer 9.
[0038]
As in the glucose measurement method described in the first embodiment, glucose in the extracted body fluid causes an enzyme-catalyzed reaction, and a radical oxygen atom generated by the enzyme-catalyzed reaction causes a coloring reagent directly below the enzyme-catalyst-immobilized layer 9. The color reagent of the membrane 8 is colored. Then, it becomes possible for the light receiving element 22 to detect a minute change of light propagating through the second optical waveguide layer 4 based on the color development through the polarizing filter 24. Therefore, a trace amount of glucose in the body fluid extracted from the specimen 100 can be analyzed with high sensitivity.
[0039]
(Other embodiments)
Here, FIGS. 1 and 6 show a case in which a body fluid is extracted using a microinvasive action. However, as another embodiment of the present invention, instead of applying an electric field to the specimen 100, the specimen 100 Needless to say, blood or the like obtained by puncturing into the mesh-like conductive thin film 11 or the porous film 10 can be directly dropped and analyzed. Therefore, the technical scope of the present invention is determined only by the invention specifying matters according to the claims that are appropriate from the above description.
[0040]
【The invention's effect】
According to the present invention, an optical waveguide glucose sensor capable of analyzing, with high sensitivity and high accuracy, a trace amount of glucose extracted from a specimen 100, for example, in a body fluid, and a second optical waveguide of the optical waveguide glucose sensor It is possible to provide a method for fixing the color reagent film 8 in which the color reagent film 8 is fixed to a thickness of 100 nm or less in contact with the layer 4.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a cross-sectional view showing an optical waveguide glucose sensor according to a first embodiment of the present invention.
FIG. 2 is a process sectional view showing a manufacturing process of the optical waveguide glucose sensor of FIG. 1 (part 1).
FIG. 3 is a process sectional view showing a manufacturing process of the optical waveguide glucose sensor of FIG. 1 (part 2).
FIG. 4 is a diagram of a method for immobilizing a membrane structure coloring reagent.
FIG. 5 is a diagram showing a three-dimensional structure of a coloring reagent film.
FIG. 6 is a cross-sectional view illustrating an optical waveguide glucose sensor according to a modification of the first embodiment of the present invention.
[Explanation of symbols]
DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 ... board | substrate, 2 ... 1st optical waveguide layer, 3a ... incident side grating, 3b ... outgoing side grating, 4 ... 2nd optical waveguide layer, 5 ... protective film, 6 ... opening part, 7 ... stray light trapping film, 8 ... Coloring reagent film, 8a: metal oxide film, 8b: metal silanized film, 9: enzyme catalyst immobilized layer, 10: porous film, 11: mesh-shaped conductive thin film, 12: refractive index higher than that of the first optical waveguide layer High material layer, 21 light source, 22 light receiving element, 23 polarizing filter, 24 polarizing filter, 100 specimen, 101 electrode plate, 102 power supply.

Claims

Board and
A first optical waveguide layer provided in contact with the substrate;
An entrance-side grating and an exit-side grating that are in contact with the first optical waveguide layer and that are provided apart from each other;
A second optical waveguide layer provided in contact with the first optical waveguide layer and provided between the incident-side grating and the output-side grating and having a higher refractive index than the first optical waveguide layer;
A color reagent layer formed of a monolayer of color reagent molecules formed on the second optical waveguide layer;
An optical waveguide glucose sensor, comprising: an enzyme provided in contact with the color reagent film; and an enzyme-catalyst-immobilized layer containing a catalyst.

A mesh-shaped conductive thin film provided on the enzyme catalyst immobilization layer,
The optical waveguide glucose sensor according to claim 1, further comprising: a power source connected to the mesh-shaped conductive thin film to a cathode and an electrode plate connected to an anode.

The second optical waveguide layer is made of a conductive material;
The optical waveguide glucose sensor according to claim 1, further comprising: a power source connected to the second optical waveguide layer to a cathode and an electrode plate connected to an anode.

The optical waveguide glucose sensor according to any one of claims 1 to 3, wherein the coloring reagent is 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine.

The optical waveguide glucose sensor according to any one of claims 1 to 4, wherein the enzyme includes glucose oxidase.

The optical waveguide glucose sensor according to any one of claims 1 to 5, wherein the catalyst is ethylenediamine iron tetraacetate.

A step of applying a silane coupling agent solution having an epoxy group to a substrate having a surface of a metal oxide film,
Baking the silane coupling agent solution to form a metal silanized film,
A step of applying a color reagent solution having an amino group to the metal silanized film,
Bonding the epoxy group and the amino group of the metal silanized film to form a monomolecular color forming reagent film.

The method according to claim 7, wherein the color reagent is 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine.