JP2004147653A - ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体、これをコードする核酸およびその用途 - Google Patents
ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体、これをコードする核酸およびその用途 Download PDFInfo
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Abstract
【解決手段】ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体のmGluR1、mGluR2、mGluR3およびmGluR5サブタイプをコードする。これらの核酸はメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプの産生に有用である以外に、プローブとしても有用であり、従って当業者は不要な実験をすることなく、関連する受容体サブユニットを同定し単離することが可能である。新規のメタボトロピックグルタミン酸受容体蛋白サブタイプを開示する以外に、このような受容体の機能に影響を与える化合物(例えば、グルタミン酸受容体機能のアゴニスト、アンタゴニスト、およびモジュレーター(活性調節因子))を同定し性状解析するための、このような受容体サブタイプの使用方法を包含する。
【選択図】なし
Description
グンデルセン(Gundersen)ら、Proc. R. Soc. London Ser. 221:127(1984) スラデツェック(Sladeczek)ら、Nature 317:717(1985) ニコレッティ(Nicoletti)ら、J. Neurosci. 6:1905(1986) スギヤマ(Sugiyama)ら、Nature 325:531(1987)
本発明は、ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体蛋白サブタイプをコードする新規の核酸、およびこれにコードされる蛋白を開示する。具体的な実施態様において、新規の核酸は、ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体の全長mGluR1、mGluR2、mGluR3およびmGluR5サブタイプまたはその一部をコードする。これらの核酸はメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプ蛋白の産生に有用である以外に、プローブとしても有用であり、従って当業者は不要な実験をすることなく、関連する受容体サブタイプをコードする核酸を同定し単離することが可能である。
本発明において、ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプをコードする単離された核酸が提供される。本発明の1つの面において、mGluR1サブタイプのヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプをコードする核酸が提供される。別の面において、mGluR2サブタイプのメタボトロピックグルタミン酸受容体の少なくとも1部分をコードする核酸が提供される。さらに別の面において、mGluR3サブタイプのメタボトロピックグルタミン酸受容体をコードする核酸が提供される。さらなる面において、mGluR5サブタイプのメタボトロピックグルタミン酸受容体をコードする核酸が提供される。さらに別の面において、そのような核酸を含有する真核細胞、およびそのような核酸を発現する真核細胞が提供される。
式: 81.5℃−16.6(log10[Na+])+0.41(%G+C)−600/l
(式中、lはヌクレオチド中のハイブリッドの長さである)により近似的に表される。
(1)断片のハイブリダイゼーションに関して、高緊縮性条件とは、65℃で0.018MのNaCl中で安定なハイブリッドを形成する核酸配列のみのハイブリダイゼーションを可能にする条件を意味する(すなわち、本明細書で企図されるように、もしハイブリッドが65℃で0.018MのNaCl中で安定でない場合、高緊縮性条件下で安定ではないであろう)。高緊縮性条件は、例えば50%ホルムアミド、5×デンハルツ(Denhart's)溶液、5×SSPE、0.2%SDS中で42℃でハイブリダイゼーションし、次に65℃で0.1×SSPE、そして0.1%SDSによる洗浄により提供される。
(2)断片のハイブリダイゼーションに関して、中緊縮性条件とは、42℃で50%ホルムアミド、5×デンハルツ溶液、5×SSPE、0.2%SDS中でハイブリダイゼーションし、次に65℃で0.2×SSPE、そして0.2%SDSによる洗浄と同等の条件を意味する。
(3)断片のハイブリダイゼーションに関して、低緊縮性条件とは、42℃で10%ホルムアミド、5×デンハルツ溶液、6×SSPE、0.2%SDS中でハイブリダイゼーションし、次に50℃で1×SSPE、そして0.2%SDSによる洗浄と同等の条件を意味する。そして、
(4)オリゴヌクレオチド(すなわち、長さが約30ヌクレオチド以下の合成DNA)に関して、高緊縮性条件とは、42℃で10%ホルムアミド、5×デンハルツ溶液、6×SSPE、0.2%SDS中でハイブリダイゼーションし、次に50℃で1×SSPE、そして0.2%SDSによる洗浄に等しい条件を意味する。
本明細書において、発現とはポリ核酸がmRNAに転写され、ペプチド、ポリペプチドまたは蛋白に翻訳される過程を意味する。ポリ核酸がゲノムDNAから得られる場合、適当な真核生物宿主細胞または微生物が選択されるなら、発現にはmRNAのスプライシングを含む。
(a)ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプをコードするDNAを含有する細胞(この細胞は機能性メタボトロピックグルタミン酸受容体を発現する)を、受容体の活性の調節能力を測定すべき少なくとも1つの化合物に暴露させて、
(b)第二メッセンジャー活性の変化について細胞を追跡する
ことよりなる。
内因性または組換えサイクリックヌクレオチドゲートのチャネルを発現する宿主細胞に、細胞内サイクリックヌクレオチドレベルに影響を与えることが疑われる受容体をコードする核酸を導入し、そして
細胞内サイクリックヌクレオチドレベルに影響を与えることが疑われる、該受容体に対するリガンドの存在下または非存在下で、サイクリックヌクレオチドゲートのチャネルのサイクリックヌクレオチド活性化の量の変化を追跡することよりなる。
A.mGluR5受容体cDNA
cDNAライブラリースクリーニング
制限酵素マッピングとDNA配列解析による精製したプラークの挿入体の性状解析から、単離されたクローンによりヒトmGluR5転写体の少なくとも3つの明らかなスプライス変種が表されていることが判明した。METAB1の分析により、これは翻訳開始コドンを含有するが翻訳停止コドンは含有しないことが示された。推測されるアミノ酸配列は、ラットのmGluR1の推測されるアミノ酸配列に約70%同一であり、ラットのmGluR5の推測されるアミノ酸配列とは>90%の同一性を有している[アベ(Abe)ら、(1992)J. Biol. Bhem. 267:13361−13368]。
cDNAのインビトロ転写体の調製および/または哺乳動物細胞でのcDNAの発現に使用するために、ヒトmGluR5転写体の3つの推定スプライス変種を表す全長作成体(mGluR5a、mGluR5bそしてmGluR5cと呼ぶ)を作成し、発現ベクター中に取り込むことができる。典型的に使用される基礎となる発現ベクターは、pCMV−T7−3またはpCMV−T7−2である(図1を参照)。プラスミドpCMV−T7−3はpUC19ベースのベクターであり、CMV(CMV)プロモーター/エンハンサー、プロモーターのすぐ下流に位置するSV40スプライスドナー/スプライスアクセプター部位、SV40スプライス部位のすぐ下流に位置するT7バクテリオファージRNAポリメラーゼプロモーター、T7プロモーターの下流のSV40ポリアデニル化シグナル、およびT7プロモーターとポリアデニル化シグナルの間のポリリンカーを含有する。すなわちこのベクターは、哺乳動物宿主細胞中での異種DNAの発現に必要なすべての制御成分を含有する(異種DNAはポリリンカーでベクターに取り込まれる)。さらにT7プロモーターはポリリンカーのすぐ上流に位置するため、このプラスミドは、ポリリンカーでベクターにサブクローニングされた異種DNAのインビトロ転写体の合成に使用される。pCMV−T7−3とpCMV−T7−2は、ポリリンカー中の制限酵素部位の配向のみが異なる。
(mGluR1a1、mGluR5a2またはmGluR5a3)をNheI/PmlIで消化し、配列番号7のヌクレオチド2725−3020を含有する断片を放出させる。次に残りのベクター断片を、METAB1からの単離したNheI/PmlI断片に結合させる。得られるベクター(mGluR5b)は、配列番号7のヌクレオチド2999と3000の間に位置する96塩基対の挿入体(配列番号9のヌクレオチド3000−3095)を含有する以外は、これが得られたmGluR5a作成体と同じである。配列番号9は、ベクターmGluR5a1から調製した全長mGluR5b cDNAの完全なヌクレオチド配列である。
(mGluR1a1、mGluR5a2またはmGluR5a3)をNheI/HindIII(Hind III部位は、mGluR5aベクターのpCMV−T7−3部分のポリリンカー内に存在する)で消化し、配列番号7のヌクレオチド2725−4085を含有する断片を放出させる。次に残りのベクター断片を、METAB2から単離したNheI/Hind III断片に結合させる。得られる全長cDNA(mGluR5c)(配列番号11)は、コーディング配列の最初の2630ヌクレオチドについては、これが調製されたmGluR5a作成体と同じであるが、コーディング配列のヌクレオチド2631で、mGluR5cとmGluR5aのコーディング配列は分岐(例えば、配列番号7のヌクレオチド3000で始まる)し、mGluR5cコーディング配列はコーディング配列のヌクレオチド2631としてグアニンヌクレオチドを有し、その後に翻訳停止コドン(配列番号11のヌクレオチド3001−3003)が続く。
cDNAライブラリースクリーニング
中挿入体小脳ライブラリーを、ラットのmGluR1受容体(ヌクレオチド1から3031および5’非翻訳配列:マス(Masu)ら、(1991)Nature 349:760−765)をコードするDNAの断片へのハイブリダイゼーションについてスクリーニングした。ハイブリダイゼーションは、42℃で5×SSPE、5×デンハルツ(Denhart's)溶液、50%ホルムアルミド、0.2%SDSおよび200μg/mlの変性した超音波処理したニシン精子DNA中で行ない、洗浄は55℃で1×SSPEと0.2%SDS中で行なった。3つのハイブリダイズするクローン(METAB7−METAB9)が同定された。
精製したプラークの挿入体を制限酵素マッピングとDNA配列解析により性状解析した。METAB58は、約2.8kbであり、5’非翻訳配列、翻訳開始コドンおよび約2.3kbのコーディング配列を含有する。METAB58の3’末端は、METAB14の5’末端と重複する。METAB14は3’方向へ約700塩基対延長し、翻訳停止コドンを含有する。すなわち、METAB58とMETAB14は重複して、全長mGluR1受容体をコードする(配列番号1を参照)。他のクローンも、翻訳開始コドンと翻訳停止コドンの間に位置するmGluR1コーディング配列の部分からのヌクレオチド配列を含有する、部分mGluR1 cDNAである。
ヒトmGluR1受容体のB型をコードする全長作成体を調製するために、クローンMETAB58とMETAB14の一部を結合させた。METAB58をEcoRI/AccIで消化し、配列番号1のヌクレオチド154−2612を含有する2459塩基対の断片を単離する。METAB14の704塩基対断片(配列番号1のヌクレオチド2613−3321を含有する)を、METAB14のAccI/XhoI消化により単離する。次にこの断片をMETAB58の2459塩基対に結合させて、EcoRI/SalI消化ベクターpCMV−T7−3に結合させる。ヒトmGluR1Bをコードする得られた作成体は、5’非翻訳配列の234ヌクレオチド(配列番号1のヌクレオチド154−387)、全mGluR1Bコーディング配列(配列番号1のヌクレオチド388−3108)、および3’非翻訳配列の213ヌクレオチド(配列番号1のヌクレオチド3109−3321)を含有する。mGluR1Bをコードする配列は、哺乳動物細胞中での発現のためのpCMV−T7−3中の制御成分に機能的に結合している。
cDNAライブラリースクリーニング
ヒト海馬cDNAライブラリー(ランダムプライマーを用いてcDNA合成をプライムさせ、次にλgt10ベクターへの結合について1.0−2.8kbのcDNAを選択することにより作成された)を、ラットmGluR2 cDNAの500塩基対のSmaI/XbaI断片とラットmGluR3 cDNAの3kbのAccI/BamHI断片へのハイブリダイゼーションについて選択した[タナベ(Tanabe)ら、(1992)Neuron 8:169−179]。ハイブリダイゼーションは、42℃で5×SSPE、5×デンハルツ(Denhart's)溶液、50%ホルムアミド、0.2%SDSおよび200μg/mlの変性した超音波処理したニシン精子DNA中で行ない、洗浄は65℃で0.5×SSPEと0.2%SDS中で行なった。3つのハイブリダイズするクローン(METAB40、METAB41、およびMETAB45)が同定された。
精製したプラークの挿入体を、制限酵素マッピングとDNA配列解析により性状解析した。単離したクローンのおのおのは、ヒトmGluR2受容体の一部をコードするクローンメタボトロピック40(例えば実施例1.D.を参照)を除いて、ヒトmGluR3受容体の一部である。クローンMETAB41、METAB45、METAB47−49は、mGluR3コーディング配列の3’からの配列および翻訳停止コドンを含有する。クローンMETAB46、METAB50およびMETAB51Bは、mGluR3 cDNAの5’末端からの配列(翻訳開始コドンと種々の量の5’非翻訳配列を含む)を含有する。
METAB48とMETAB46またはMETAB51Bの一部を結合させて、全長ヒトmGluR3コーディング配列を含有する4つの作成体を調製した。この全長コーディング配列は配列番号5(ヌクレオチド1064−3703)に与えられる。クローンMETAB46とMETAB51Bの挿入体は、EcoRI断片としてpCMV−T7−3中に別々にサブクローニングされた。クローンMETAB48の挿入体は、EcoRI断片としてpCMV−T7−2にサブクローニングされた。
実施例1.C.に記載したようにヒト海馬cDNAライブラリーからクローンMETAB40を単離した。このMETAB40の挿入体cDNAは長さが1100塩基対であり、ヒトmGluR2受容体の3’末端(翻訳停止コドンと3’末端非翻訳配列を含む)をコードする。METAB40の最初の355ヌクレオチドは配列番号3に提供され、METAB40の最後の343ヌクレオチド(すべて3’非翻訳配列からである)は配列番号13に提供される。
ヒトメタボトロピック受容体をコードするDNAを含有する作成体から調製したインビトロ転写体を、ツノガエル(Xenopus)卵母細胞に注入した。2電極の電位固定法(例えば、スツマー(Stuhmer)(1992)Meth. Enzymol. 207:319−339を参照)を用いて、卵母細胞トランスメンブレン電流の電気生理的測定を行なった。
作成体mGluR5a3中に含有されるメタボトロピック受容体cDNAのキャップされた組換え転写体を、メガスクリプト(Megascript)キット(カタログ番号#1334、アンビオン社(Ambion Inc.)、オースチン、テキサス州)を用いて、線状化したプラスミドから合成した。各合成転写体の質量を紫外吸光度法により測定し、各転写体の完全性をアガロースゲルの電気泳動により測定した。
卵母細胞1つにつき、10−50ngのメタボトロピック受容体転写体を、ツノガエル(Xenopus)卵母細胞に注入した。卵母細胞の調製と注入は、ダスカル(Dascal)の方法[(1987)Crit. Rev. Biochem. 22:317−387]に従って行なった。mRNA注入の2から6日後、2電極電位固定法を用いて卵母細胞を試験した。細胞はリンゲル溶液(115mM NaCl、2.5mM KCl、1.8mM CaCl2、10mM HEPES、pH7.3)浴に浸漬し、膜電位は−80から−100mVに固定した。薬剤含有溶液の60μlずつをピペットで直接浴に入れた。アクソテープ(AXOTAPE)バージョン1.2ソフトウェア(アクソン・インスツルメンツ(Axon Instruments)、フォスターシティ、カリホルニア州)を用いてPC−386中のラボマスター(Labmaster)データ採取ボードを用いて2−5Hzでデータをサンプリングした。データをレーザープリンターに取り出すか、またはシグマプロット(Sigmaplot)バージョン5.0を用いてプロットした。
ヒト胎児性腎(HEK)細胞とチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞(すなわち、DG44細胞;ウーラウプ(Urlaub)ら(1986)Som. Cell. Molec. Genet. 12:555を参照)を、ヒトメタボトロピック受容体をコードするDNAでトランスフェクションさせた。種々の方法(例えば、イノシオトールリン酸(IP1)測定法、Ca++−感受性蛍光指示薬ベースの測定法、および[3H]−グルタミン酸結合測定法)を用いて、メタボトロピック受容体の発現について解析した。
HEK293細胞を、mGluR5a(作成体mGluR5a2とmGluR5a3および作成体MMTV−hmGluR5a)受容体をコードするDNAで一時的トランスフェクションを行なった。約2×106のHEK293細胞を標準的CaPO4トランスフェクション法[ウィグラー(Wigler)ら、(1979)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 76:1373−1376を参照]に従い、目的のプラスミドの5−18μg(あるトランスフェクション体においては0.18μg、実施例3.C.2.を参照)で一時的にトランスフェクションした。さらにCMVプロモーターに融合した大腸菌β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含有する、プラスミドpCMVβgal(クロンテック・ラボラトリーズ(Clontech Laboratories)、パロアルト(Palo Alto)、カリホルニア州)0.5−2μgを、レポーター遺伝子として同時トランスフェクションして、トランスフェクションの効率を追跡した。β−ガラクトシダーゼとX−gal基質を含む反応の生成物の直接染色により、β−ガラクトシダーゼ発現についてトランスフェクション体を解析した[ジョーンズ(Jones)(1986)EMBO 5:3133−3142]。トランスフェクション体はまた、β−ガラクトシダーゼ活性の測定によるβ−ガラクトシダーゼ発現について解析することもできる[ミラー(Miller)(1972)分子遺伝子学実験(Experiments in Molecular Genetics)のPP. 352−355, コールド・スプリング・ハーバー・プレス(Cold Spring Harbor Press)]。
HEK293細胞、Ltk−細胞およびCHO細胞のような哺乳動物細胞は、リン酸カルシウムトランスフェクション法を用いて安定にトランスフェクションすることができる[Current Protocols in Molecular Biology, Vol.1,ワイリー・インターサイエンス(Wiley Inter-Science)、増刊14号、単元9.1.1.−9.1.9(1990)]。CHO細胞を宿主として使用するときは、ヒトメタボトロピック受容体をコードするcDNAの発現を制御するにはSV40プロモーターの使用が一般に好ましい。それぞれ1−2×106細胞を含有する10cmのプレートを、メタボトロピック受容体をコードするDNA約5−10μgと選択マーカー(例えば、ネオマイシン−耐性遺伝子(すなわち、HEK293形質転換体の選択にはネオマイシン耐性遺伝子(すなわち、pSV2neo)、Ltk−細胞トランスフェクション体にはチミジンキナーゼ遺伝子、またはDG44細胞形質転換体の選択にはジヒドロ葉酸還元酵素(dhfr)遺伝子))をコードするDNA 0.5−1μgを含有するDNA/リン酸カルシウム沈殿物でトランスフェクションする。適当な培地中で約14日間の増殖の後、コロニーが形成され、クローニングシリンダーを用いて個々に単離される。次に単離物を限界希釈を行いスクリーニングして、例えば後述の方法を用いてメタボトロピック受容体を発現するものを同定する。
1.蛍光指示薬に基づく測定
アゴニストによるG蛋白結合メタボトロピック受容体の活性化により、ホスファチジルイノシトール(PI)加水分解/細胞内Ca++シグナル化経路および/または阻害性cAMPカスケードが刺激される。細胞内カルシウム濃度の一時的上昇の検出法は、PI加水分解/Ca++動員(mobilization)経路またはPI加水分解/Ca++動員(mobilization)経路と阻害性cAMPカスケードの両方にカップリングしたメタボトロピック受容体の機能性発現の解析に適用できる。細胞内カルシウムレベルを測定する1つの方法は、カルシウム感受性蛍光指示薬を用いる。
2×105細胞/ウェルの濃度でポリ−L−リジンでプレコーティングし、20μMフルオ−3、0.2%プルロニック(Pluronic)F−127をHBS(125mM NaCl、5mM KCl、1.8mM CaCl2、0.62mM MgCl2、20mMグルコース、20mM HEPES、pH7.4)中に含有する培地中で、20℃で2時間インキュベートしてフルオ−3を充填した96ウェルマイクロタイタープレート(ヌンク(Nunc)、カタログ番号1−6708、アラメダ・インダストリーズ(Alameda Industries)、エスコンジド(Escondido)、カリホルニア州)に、トランスフェクションしていないHEK293細胞(またはpCMV−T7−3で一時的にトランスフェクションしたHEK293細胞)およびmGluR5aをコードするDNAでトランスフェクションしたHEK293細胞を広げた。次に細胞を測定緩衝液(すなわち、HBS)で洗浄した。次にマイクロタイタープレートを蛍光プレートリーダー(例えば、フルオロスカン(Fluoroskan)II、ラボ・プロダクツ・インターナショナル社(Lab Products International, Ltd.)、ラレー(Raleigh)、ノースカロライナ州)に入れ、各ウェルの基礎蛍光を測定し記録してから、ウェルにキスカル酸、グルタミン酸、トランス−ACPD(1−アミノ−シクロペンタン−1,3−ジカルボン酸)、1S,3R−ACPD、AP3(2−アミノ−3−ホスホノプロピオン酸)、AP5(2−アミノ−5−ホスホノペンタノン酸)、およびCNQX(6−シアノ−7−ニトロキノキサリン−2,3−ジオン)を添加した。アゴニストの添加後ウェルの蛍光を繰り返し(0.63秒間隔で75回読む)追跡する。
細胞内Ca++濃度のメタボトロピック受容体介在変化を目視できるようにするために、mGluR5a3で一時的にトランスフェクションしたHEK293細胞とトランスフェクションしていないHEK293細胞(対照)を、デジタルビデオイメージングで解析した。暗所中で室温で25分間細胞を1μMのフラ−2(アセトキシメチルエステル)に暴露することにより、トランスフェクション体(ガラス挿入底を有する35mm培養皿あたり4×105細胞)をフラ−2で充填した。次に細胞をDMEMで3回そしてリンゲル溶液(160mM NaCl、5mM KCl、2mM CaCl2、1mM MgCl2、11mMグルコース、5mM HEPES、pH7.3)で4回洗浄した。
G蛋白結合メタボトロピック受容体のアゴニストによる活性化により、ホスファチジルイノシトール(PI)加水分解経路が刺激されるため、PI加水分解の生成物(例えば、IP3、IP2またはIP1)の増加を検出する方法は、PI加水分解/Ca++動員経路またはPI加水分解/Ca++動員経路と阻害性cAMPカスケードにカップリングしたメタボトロピック受容体の機能性発現の解析に応用することができる。PIの加水分解により生成されるIP1および/またはIP2および/またはIP3を測定する1つの方法は、細胞膜リン脂質内への[3H]−ミオ−イノシトールを取り込み、次に[3H]−IP1、[3H]−IP2および[3H]−IP3を分離し、以下のように各画分の放射能を定量する。
mGluR5a3で一時的にトランスフェクションしたHEK293細胞を、8×105細胞/ウェルで24ウェルのマイクロタイタープレートに広げた。細胞を数時間沈降させ、プレートの底に付着させた後、2μCiの[3H]−ミオ−イノシトール(アマーシャム(Amersham)、カタログ番号#PT6−271、アーリントンハイツ(Arlington Heights)、イリノイ州;比活性=17.7Ci/mmol)を各ウェルに添加し37℃で一晩インキュベートした。翌日、ニコンダイアフォト(Nikon Diaphot)倒立顕微鏡下で細胞を観察し、細胞の形態の健常性を評価し、ウェルがコンフルエント(confluent)な細胞層を含有するか否かを測定した。次に培地を吸引し、細胞を0.5mlのクレブス重炭酸緩衝液[117.9mM NaCl、4.72mM KCl、2.54mM CaCl2、1.18mM MgSO4、1.19mM KH2PO4、25mM NaHCO3、11.1mMデキストロース(95% O2、5% CO2、pH7.4で平衡化されている)]で2回洗浄した。細胞を室温で45分間インキュベートした。次に各ウェルから緩衝液を吸引し、細胞を洗浄し、0.5ml/ウェルで室温で45分間インキュベートした。次に緩衝液を各ウェルから吸引し、次に10mM NaClの代わりに10mMのLiClを含有する450μlのクレブス重炭酸緩衝液(IP1のイノシトールと無機リンへの加水分解を防ぐために)とともに細胞を37℃で20分間インキュベートした。
mGluR5a3またはpUC19(陰性対照)で一時的にトランスフェクションしたHEK細胞を、[3H]−グルタミン酸結合について解析した。陽性対照として結合測定法にラット脳の膜を加えた。
i.ラット前脳膜
シェープ(Schoepp)ら[(1992)Neurosci. Lett. 145:100]が記載したように、ラット前脳膜を調製した。簡単に説明すると、10個のラット脳からの基本的に脳皮質、線条体と海馬よりなる前脳を、2.5mM CaCl2、pH7.6を含有する50部の30mMの氷冷トリス−塩酸中で、ポリトロン(Polytron)(ブリンクマン(Brinkman)、ウェストベリー(Westbury)、ニューヨーク州))を用いてホモゲナイズした。ホモゲネートを4℃で30、000×gで15分間遠心分離した。上澄液を捨て、ポリトロンを用いてペレットを50部の緩衝液に再懸濁し、懸濁物を30、000×gで15分間遠心分離した。この工程を2回繰り返した。ペレットを緩衝液に再懸濁し、37℃で30分間インキュベートした。次に懸濁物を4℃で30、000×gで15分間遠心分離した。この工程を3回繰り返した。最終ペレットを15部の50mM トリス−塩酸、pH7.6に再懸濁し、分注し、急速に凍結し、−70℃で保存した。
mGluR5aをコードするDNAまたはpUC19(陰性対照)でトランスフェクションしたHEK293細胞から膜を調製するために、組織培養プレートから細胞を掻き取り、プレートを5mlのPBS(リン酸緩衝化生理食塩水:137mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na2HPO4、1.7mM KH2PO4)で洗浄した。卓上型遠心分離機で細胞を低速度で遠心分離し、細胞ペレットをPBSで洗浄した。0.5mM PMSF、pH7.6を含有する50mMトリス−塩酸20部に、細胞ペレットを再懸濁した。ダウンス(Dounce)(テフロン(登録商標)/ガラス)ホモゲナイザー中で10−20ストロークを用いて、細胞を氷の上でホモゲナイズした。ホモゲネートを4℃で120、000×gで30分間遠心分離した。最終の膜ペレットを、0.5mM PMSF、pH7.6を含有する50mMトリス−塩酸再懸濁した。膜調製物を分注し、急速に凍結し、−701℃で保存した。蛋白濃度は、ブラッドフォード(Bradford)[(1976)Anal. Biochem.72:248]の方法で測定した。
ラット前脳の膜中のメタボトロピック受容体への[3H]−グルタミン酸の特異的結合は、基本的にシェープ(Schoepp)ら(前述)が記載したように調製した。測定の日に凍結ホモゲネートを融解し、50mMトリス−塩酸、pH7.6で3回洗浄した。最終ペレットを50mMトリス−塩酸、pH7.6に再懸濁した。蛋白濃度は、ブラッドフォード(Bradford)[(1976)Anal. Biochem.72:248]の方法で測定した。懸濁物を30、000×gで15分間遠心分離し、ペレットを1mg/mlの濃度で測定緩衝液(50mMトリス−塩酸、0.5mM PMSF、0.1%BSA、pH7.6)に再懸濁した。膜懸濁物を、総量0.5mlの測定緩衝液[イオノトロピックグルタミン酸受容体への[3H]−グルタミン酸の結合を組織するために、100μM NMDA(シグマ(Sigma)、セントルイス、ミズーリ州)、100μM AMPAおよび100μMカイニン酸(リサーチ・バイオケミカルズ社(Research Biochemiclas Inc)、ナチック(Natick)、マサチューセッツ州)を含有し、塩化物依存性摂取部位への[3H]−グルタミン酸の結合を阻害するために、100μM SITS(シグマ(Sigma)、セントルイス、ミズーリ州)を含有する]中で、3重測定で10または100nMの[3H]−グルタミン酸(ニュー・イングランド・ニュクレア(New England Nuclear)、ボストン、マサチューセッツ州;カタログ番号NET−490、比活性=57.4Ci/mmol)と、氷上で45分間インキュベートした。SM−24ローター(ソーバル(Sorvall)、ウィルミントン(Wilmington)、デラウェア(Delaware))中で4℃で20、000×gで5分間遠心分離して、結合した放射能を遊離の放射能から分離した。ペレットを5−6mlの氷冷50mMトリス−塩酸、pH7.6で2回洗浄した。ペレットを5mlのエコルメシンチレーションカクテル(Ecolume scintillation cocktail)中でボルテックス混合して可溶化させた。ベックマン(Beckman)シンチレーション計測機で放射能を測定した。総結合量から、1mMのグルタミン酸の存在下で得られた非特異的結合量を引いて、特異的結合量を求めた。
a.RIAベースの測定
ある種のG蛋白結合受容体の活性化は、cAMPの(増加ではなく)低下を引き起こすため、細胞内cAMPレベルの測定法は、哺乳動物宿主細胞中で発現される組換えヒトメタボトロピック受容体を評価するのに使用される。ヒトメタボトロピック受容体をコードするDNAまたはpUC19(陰性対照)で一時的にまたは安定にトランスフェクションした哺乳動物細胞を、5×105細胞/ウェルの濃度で24ウェルのマイクロタイタープレートに広げ、一晩インキュベートさせる。翌日、ニコンダイアフォト(Nikon Diaphot)倒立顕微鏡下で細胞を観察し、細胞の形態の健常性を評価し、ウェルはコンフルエントな細胞層を含有するか否かを測定した。次に培地を吸引し、細胞を、1mMのIBMX(3−イソブチル−1−メチルキサンチン;シグマ(Sigma)、セントルイス、ミズーリ州)と0.1%BSAを含有するクレブス重炭酸緩衝液0.5ml(PI加水分解測定法で使用したものと同じ緩衝液:実施例3.C.2を参照)で2回洗浄した。あるいはクレブス重炭酸緩衝液の代わりに1×PBSを使用することもできる。各洗浄の後に37℃で30分間インキュベートを行う。各ウェルから緩衝液を吸引し、次に細胞を、1mMのIBMXと0.1%BSAを含有する0.2mlのクレブス重炭酸緩衝液で37℃で20分間インキュベートする。
5%の規定補足ウシ血清(ハイクローン(Hyclone))を含有するダルベッコー改変イーグル培地(DMEM;ギブコ(GIBCO))(100U/mlのペニシリンと100μg/mlの硫酸ストレプトマイシンを含む)中で、HEK293細胞を単層で増殖させた(10cmのポリ−D−リジン被覆プレート当たり約2×106細胞)。CMVプロモーターに結合した5μgのpCMV−OCNA(嗅覚性サイクリックヌクレオチドゲートのチャネル(ダレン(Dhallen)らを参照、前述)、2μgのpCMV−βgal(クロンテック(Clontech)、パロアルト(Palo Alto)、カリホルニア州)、および対照プラスミドとしての13μgのpUC19を用いて、細胞をリン酸カルシウム法(アウスベル(Ausubel)ら、前述、pp9.1.1−9.1.7)で一時的にトランスフェクションした。ベクターpCMV−OCNAは、pBluescriptKSからの約3.0kbのEcoRI断片として嗅覚性サイクリックヌクレオチドゲートのチャネルをコードするDNAを単離し、得られた断片をEcoRI消化pCMV−T7−3に結合させることにより、作成した。トランスフェクションの6時間後、リン酸カルシウム沈殿物を洗い流し、10%透析胎児牛血清(ハイクローン(Hyclone))、100U/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシン、および2mMグルタミンが補足されたDMEMを細胞に与えた。β−ガラクトシダーゼ活性の測定によるトランスフェクション効率は、50−70%であった。
ヒトメタボトロピック受容体をコードするDNAでトランスフェクションした細胞はまた、ノーザンブロット解析により対応する転写体の発現について解析することができる。ヒトメタボトロピック受容体をコードするDNAでトランスフェクションした約1×107個の細胞から総RNAを単離し、10−15μgのRNAをノーザンハイブリダイゼーション解析に使用した。ヒトメタボトロピック受容体をコードするプラスミドからの挿入体をニックトランスレーションし、プローブとして使用した。ノーザンブロットハイブリダイゼーションの典型的な条件は以下の通りである:
ハイブリダイゼーションは、42℃で5×SSPE、5×デンハルツ(Denhart's)溶液、50%ホルムアルミド中で行ない、洗浄は65℃で0.2×SSPEと0.1%SDS中で行なった。
配列番号1は、本発明のメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプ(mGluR1B)をコードするDNAの核酸配列(およびその推定アミノ酸配列)である。
配列番号2は、配列番号1のヌクレオチド配列の推定アミノ酸配列である。
配列番号3は、ヒトmGluR2受容体サブタイプの一部をコードする部分クローンのヌクレオチド配列(および推定アミノ酸配列)である。
配列番号4は、配列番号3のヌクレオチド配列によりコードされるヒトmGluR2受容体サブタイプの一部のアミノ酸配列である。
配列番号5は、本発明のメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプ(mGluR3)をコードするDNAの核酸配列(および推定アミノ酸配列)である。
配列番号6は、配列番号5のヌクレオチド配列の推定アミノ酸配列である。
配列番号7は、本発明のメタボトロピックグルタミン酸受容体(mGluR5a1)をコードするDNAの核酸配列(および推定アミノ酸配列)である。
配列番号8は、配列番号7のヌクレオチド配列の推定アミノ酸配列である。
配列番号9は、本発明のmGluR5変種メタボトロピックグルタミン酸受容体(mGluR5b)をコードするDNAの核酸配列(および推定アミノ酸配列)である。
配列番号10は、配列番号9のヌクレオチド配列の推定アミノ酸配列である。
配列番号11は、本発明のmGluR5変種メタボトロピックグルタミン酸受容体(mGluR5c)をコードするDNAの核酸配列(および推定アミノ酸配列)である。
配列番号12は、配列番号11のヌクレオチド配列の推定アミノ酸配列である。
配列番号13は、ヒトmGluR2受容体サブタイプの3’非翻訳配列の343ヌクレオチドである。
(1)一般情報:
(i) 出願人:ダゲット,ロリー(Daggett, Lorrie)
エリス,スティーブン・ビー(Ellis, Steven B.)
ルー,チェン(Lu, Chen)
ポンツラー,アーロン(Pontsler, Aaron)
ジョンソン,エドウィン・シー(Johnson, Edwin C.)
ヘス,ステファン・ディー(Hess, Stephen D.)
(ii)発明の名称:ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体、これをコードする核酸およびその用途
(iii)配列の数:13
(iv)連絡住所:
(A)宛名:プリティー、シュレーダー、ブルーゲマンおよびクラーク(Pretty, Schroeder, Brueggemann & Clark)
(B)通り:444サウス・フラワー通り、スイート2000(444 South Flower Street, Suite 2000 )
(C)市:ロサンゼルス
(D)州:カリホルニア
(E)国:米国
(F)郵便番号:90071
(v) コンピューターで読める形式:
(A)媒体の型:フロッピー(登録商標)ディスク
(B)コンピューター:IBM PCコンパチブル
(C)オペレーティング・システム:PC−DOS/MS−DOS
(D)ソフトウェア:パテントイン・リリース#1.0(PatentIn Release #1.0)、バージョン#1.25
(vi)現行出願のデータ:
(A)出願番号:
(B)出願日:1994年6月2日
(C)分類:
(vii)先行出願のデータ:
(A)出願番号:US08/072、574
(B)出願日:1993年6月4日
(viii)弁理士/代理人情報:
(A)氏名:ライター,ステファン・イー(Reiter, Stephen E.)
(B)登録番号:31,192
(C)参照/整理番号:FP41 9772
(ix)電話連絡先情報:
(A)電話:619−546−4737
(B)ファックス:619−546−9392
(2)配列番号:1の情報:
(i) 配列の特色:
(A)長さ:3321塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:両形態
(D)トポロジー:両形態
(ii)分子の型:cDNA
(ix)配列の特徴:
(A)名称/記号:CDS
(B)存在位置:388..3108
(D)他の情報:/生成物=“ヒトmGluR1B”
(xi)配列:配列番号:1:
(i) 配列の特色:
(A)長さ:355塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:両形態
(D)トポロジー:両形態
(ii)分子の型:cDNA
(ix)配列の特徴:
(A)名称/記号:CDS
(B)存在位置:1..354
(D)他の情報:/生成物=“ヒトmGluR2断片”
(xi)配列:配列番号:3:
(i) 配列の特色:
(A)長さ:3919塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:両形態
(D)トポロジー:両形態
(ii)分子の型:cDNA
(ix)配列の特徴:
(A)名称/記号:CDS
(B)存在位置:1064..3703
(D)他の情報:/生成物=“ヒトmGluR3”
(xi)配列:配列番号:5:
(i) 配列の特色:
(A)長さ:4085塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:両形態
(D)トポロジー:両形態
(ii)分子の型:cDNA
(ix)配列の特徴:
(A)名称/記号:CDS
(B)存在位置:370..3912
(D)他の情報:/生成物=“ヒトmGluR5A”
(xi)配列:配列番号:7:
(i) 配列の特色:
(A)長さ:4181塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:両形態
(D)トポロジー:両形態
(ii)分子の型:cDNA
(ix)配列の特徴:
(A)名称/記号:CDS
(B)存在位置:370..4008
(D)他の情報:/生成物=“ヒトmGluR5B”/注=“ヌクレオチド2998と2999の間に96塩基対が挿入されたmGluR5A変種”
(xi)配列:配列番号:9:
(i) 配列の特色:
(A)長さ:3282塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:両形態
(D)トポロジー:両形態
(ii)分子の型:cDNA
(ix)配列の特徴:
(A)名称/記号:CDS
(B)存在位置:370..3003
(D)他の情報:/生成物=“ヒトmGluR5C”/注=“3’末端が切り取られたmGluR5aの変種”
(xi)配列:配列番号:11:
Claims (19)
- 以下の(a)または(b)から選択されることを特徴とする単離されたDNA:
(a)配列番号3に記載の全コード領域を有するDNA、
(b)配列番号3に記載の全コード領域を有するDNAと相補的な塩基配列からなるDNAと、高緊縮性条件下でハイブリダイズし、かつヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプ2(ヒトmGluR2)としての活性を有する蛋白をコードするDNA。 - 以下の(a)または(b)の蛋白をコードすることを特徴とする単離されたDNA:
(a)配列番号4に記載のアミノ酸配列を有する蛋白、
(b)配列番号4に記載のアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸を欠失、置換および/または付加して(a)の蛋白から得られ、ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプ2(ヒトmGluR2)としての活性を有する蛋白。 - 以下の(a)または(b)から選択されることを特徴とする単離されたDNA:
(a)配列番号5に記載の全コード領域を有するDNA、
(b)配列番号5に記載の全コード領域を有するDNAと相補的な塩基配列からなるDNAと、高緊縮性条件下でハイブリダイズし、かつヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプ3(ヒトmGluR3)としての活性を有する蛋白をコードするDNA。 - 以下の(a)または(b)の蛋白をコードすることを特徴とする単離されたDNA:
(a)配列番号6に記載のアミノ酸配列を有する蛋白、
(b)配列番号6に記載のアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸を欠失、置換および/または付加して(a)の蛋白から得られ、ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプ3(ヒトmGluR3)としての活性を有する蛋白。 - 以下の(a)または(b)から選択されることを特徴とする単離されたDNA:
(a)配列番号7に記載の全コード領域を有するDNA
(b)配列番号7に記載の全コード領域を有するDNAと相補的な塩基配列からなるDNAと、高緊縮性条件下でハイブリダイズし、かつヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプ5(ヒトmGluR5)としての活性を有する蛋白をコードするDNA。 - 以下の(a)または(b)の蛋白をコードすることを特徴とする単離されたDNA:
(a)配列番号8に記載のアミノ酸配列からなる蛋白
(b)配列番号8に記載のアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸を欠失、置換および/または付加して(a)の蛋白から得られ、ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプ5(ヒトmGluR5)としての活性を有する蛋白。 - 請求項1から6のいずれか1項に記載のDNAによりコードされる単離された蛋白。
- 請求項1から6のいずれか1項に記載のDNAのうち、少なくとも14の連続する塩基、またはその相補的な塩基よりなる、核酸プローブ。
- 請求項1から6のいずれか1項に記載のDNAに相補的な単離されたmRNA。
- 請求項1から6のいずれか1項に記載のDNAを含有する真核細胞。
- 請求項1から6のいずれか1項に記載のDNAを発現する真核細胞。
- 請求項9に記載のmRNAを発現する両生類卵母細胞。
- ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体蛋白サブタイプをコードするDNAの同定方法であって、
請求項8に記載の核酸プローブと、ヒトDNAを、該核酸プローブがポリ核酸断片の時は低緊縮性ハイブリダイゼーション条件から中緊縮性ハイブリダイゼーション条件下で、該核酸プローブがオリゴヌクレオチドの時は高緊縮性ハイブリダイゼーション条件下で、接触させて、該プローブにハイブリダイズするDNAを同定することを特徴とするDNAの同定方法。 - 競合的結合測定法において、請求項7に記載の蛋白を用いることを特徴とする、ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプに結合する化合物の同定方法。
- ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプの活性を調節する化合物を同定するための生物学的測定法であって、
(a)請求項11に記載の真核細胞を、受容体サブタイプの第二メッセンジャー活性の調節能力を測定すべき少なくとも1つの化合物に暴露させ、
(b)その後、該第二メッセンジャー活性の変化について該真核細胞を追跡することを特徴とする生物学的測定法。 - ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体を、請求の範囲第15項に記載の生物測定法により同定される少なくとも1つの化合物に、該化合物が有効量存在する状態で接触させることを特徴とする、ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプの第二メッセンジャー活性の調節方法。
- 請求項7に記載の蛋白またはその免疫原性を発現する部位に対する抗体。
- 該抗体はモノクローナル抗体である、請求項17に記載の抗体。
- ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体を、請求項18項に記載のモノクロナール抗体に、該抗体が有効量存在する状態で接触させることよりなる、ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプの第二メッセンジャー活性の調節方法。
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