JP2004131507A - 脳機能障害による疾患の予防・治療薬 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 顆粒球コロニー刺激因子を有効成分として含有する脳機能障害による疾患の予防・治療薬である。
【選択図】 なし
Description
また、本発明の目的は、細胞生存延長作用及び/又はアセチルコリントランスフェラーゼ賦活作用が有効な疾患の予防と治療に有効である予防・治療薬を提供することにある。更に、本発明の目的は、アルツハイマー病、アルツハイマー型老人性痴呆症又は脳血管性痴呆症の予防と治療に有効である予防・治療薬を提供することにある。
〔1〕初代培養細胞の調製
胎児期15日のBALB/マウス(三共実験サービス、東京)から前脳基底を含んだ中隔野を得た。ハンクスの平衡塩類溶液(HBSS溶液、pH7.4)中で組織を摘出して細断し、これを37℃で3分間0.03%のトリプシンを含んだHBSS溶液(pH6.5)で処理した。63μmのナイロンメッシュで濾過した後、無血清培地に再度懸濁した。培養は、細胞6×105個/mlで開始した。細胞の培養開始時にマウスβNGF(mβNGF、シグマ社、ミズリー州)100ng/ml、リコンビナントヒトマクロファージコロニー刺激因子(rhM-CSF)(ゲンザイム社製、米国マサチューセッツ州)10CFU/ml、50CFU/ml又は100CFU/ml、リコンビナントヒト顆粒球コロニー刺激因子(rhG-CSF)(中外製薬株式会社製)10CFU/ml、50CFU/ml又は100CFU/ml、若しくはリコンビナントヒトエリスロポイエチン(rhEPO)(中外製薬株式会社製)1IU/ml、5IU/ml又は10IU/mlをそれぞれ加え、3日後に培養液交換を行い、5日目に細胞をラバーポリスマン(ガラス管の先にゴムを嵌め込んだ器具)で回収し、下記の方法でコリンアセチルトランスフェラーゼ(ChAT)活性を測定した。
結果を表1に示す。
米国シカゴ大学に保管されており、この大学のWainer博士から提供されたSN6.10.2.2細胞は、マウス中隔野神経細胞とマウス神経芽細胞腫N18TG2との融合雑種細胞として樹立されたSN6細胞〔Hanmondら、Science, 234, 1237〜1240 (1986)〕のサブクローンである。細胞は、10%ウシ胎児血清を含むDMEM中に維持した。使用の前に、細胞2×105個/mlをHBSS溶液(pH7.4)で2回、無血清培地で1回洗浄した。rhM-CSF、rhG-CSF又はrhEPOを含んだ試験培地で35mm皿(ベクトン ディッキンソン社製、米国ニュージャージー州)中で2日間培養した後、3日目に細胞をラバーポリスマンで回収し、下記の方法でChAT活性を測定した。
結果を表2に示す。
体重300〜350gのWister系アルビノ雄ラット(日本クレア、東京)を30〜50mg/kgのペントバルビタールナトリウム(sodium pentobarbital)で麻酔し、頭部を脳定位装置(ナリシゲ器械社、東京)に固定した。次いで、以下に示す手順でFimbria-Fornix切断を行った。すなわち、左側頭蓋骨のBregmaより0.5mm後方の線及び正中線を直交二辺とする3mm角の部分を切除し、左背側のFimbriaとFornixを皮質と共に吸引除去した。右側頭蓋骨のBregmaから0.2mm前方及び正中線より1mm右側の位置に穿孔し、この孔に直径1mmのカニューレ(クニイ社、東京)を挿入した。
なお、図中のカラムはMean±1S.D.であり、**はp<0.01を示し、また、EPO-Hは125I.U./15μl/day投与群を、EPO-Lは12.5I.U./15μl/day投与群をそれぞれ示す。
ChAT活性は、Fonnumの方法〔F. Fonnum, J. Neurochem., 24, 407〜409 (1975)〕に基づいて求めた。すなわち、上記の初代培養細胞あるいはSN6.10.2.2培養細胞をラバーポリスマンで回収した後、30μlの10mM-EDTA液中でホモジナイズし、更に最終濃度0.5%(v/v)Triton-X100を加えたものを酵素源とした。酵素反応溶液は300mM-NaCl、50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.4)、20mM-EDTAに基質として0.2mM〔1-14C〕acetyl-CoA(アマシャム ジャパン社より購入)及び8mM-Choline bromide及びアセチルコリンエステラーゼ阻害剤として0.1mM-Physostigmineを加えたものである。この反応溶液5μlを1.5mlのマイクロチューブ(エッペンドルフ社製、ドイツ)に入れ、酵素液サンプル2μlを加えて軽く振とう攪拌し、37℃で15分間反応させた。氷冷することによって反応を停止させ、マイクロチューブを液体シンチレーション用バイアルの中に入れて中身の反応混液を5mlの10mM-Phosphate bufferで洗いだした。このバイアルに10mg/mlのカリグノスト(Sodium Tetraphenylborate)を含む2mlのアセトニトリルと10mlのトルエン系シンチレーターを加え、1分間軽く振とうした。バイアルを10分間静置した後、液体シンチレーションカウンターによって14Cで標識されたアセチルコリンの量を決定し、ChAT活性を求めた。
そして、これらの値を基に比活性、総蛋白量及び総ChAT活性をそれぞれ算出した。ChAT活性、タンパク質濃度及び生存率についてはt-testを行った。
片側性にFimbria-Fornix切断したラットの中隔野で、rhEPOのアセチルコリン作動性神経細胞に対するin vivoの効果が確認されたことは、実際の臨床的展開を考える上で意義深い。
以上の実験から明らかなように、本発明のrhM-CSF、rhG-CSF及びrhEPOは、元々血液細胞系に対して作用を有するものとして発見された造血因子であるが、中枢神経細胞系に対してもmβNGFと同様の活性を有することが判明した。すなわち、マウス中隔野神経細胞のin vitro初代培養において総蛋白量を顕著に増加させると共にChAT比活性や総ChAT活性を増加させ、また、マウス中隔野由来コリン作動性神経細胞株SN6.10.2.2細胞においてもChAT比活性や総ChAT活性を増加させ、従って、これらの造血因子、rhM-CSF、rhG-CSF及びrhEPOは、優れた細胞生存延長作用を発揮すると共にChAT賦活作用を発揮するという二通りの作用を発揮する。
実施例1
エリスロポイエチン 8μg
注射用蒸留水にて全量 2ml
上記組成比で無菌的に溶液を調製し、バイアル瓶に分注し、密封した。
エリスロポイエチン 8μg
注射用蒸留水にて全量 2ml
上記組成比で無菌的に溶液を調製し、バイアル瓶に分注し、凍結乾燥して密封した。
エリスロポイエチン 16μg
注射用蒸留水にて全量 2ml
上記組成比で無菌的に溶液を調製し、バイアル瓶に分注し、密封した。
エリスロポイエチン 16μg
注射用蒸留水にて全量 2ml
上記組成比で無菌的に溶液を調製し、バイアル瓶に分注し、凍結乾燥して密封した。
エリスロポイエチン 8μg
ヒト血清アルブミン 5mg
注射用蒸留水にて全量 2ml
上記組成比で無菌的に溶液を調製し、バイアル瓶に分注し、密封した。
エリスロポイエチン 8μg
ヒト血清アルブミン 5mg
注射用蒸留水にて全量 2ml
上記組成比で無菌的に溶液を調製し、バイアル瓶に分注し、凍結乾燥して密封した。
エリスロポイエチン 16μg
ヒト血清アルブミン 5mg
注射用蒸留水にて全量 2ml
上記組成比で無菌的に溶液を調製し、バイアル瓶に分注し、密封した。
エリスロポイエチン 16μg
ヒト血清アルブミン 5mg
注射用蒸留水にて全量 2ml
上記組成比で無菌的に溶液を調製し、バイアル瓶に分注し、凍結乾燥して密封した。
実施例5〜8におけるヒト血清アルブミンに代えて5mgのデキストラン40を用い、これら実施例5〜8と同様にして注射剤を調製した。
注射用蒸留水100ml中にD-マンニトール5g、エリスロポイエチン1mg、ヒト血清アルブミン100mgを無菌的に溶解して水溶液を調製し、1mlずつバイアル瓶に分注し、凍結乾燥して密封した。
pH7.0の0.05M-リン酸緩衝液50ml中にエリスロポイエチン0.5mgとソルビトール1gとを無菌的に溶解して水溶液を調製し、0.5mlずつバイアル瓶に分注し、凍結乾燥して密封した。別に0.1%-メチルセルロース水溶液を無菌的に調製し、1mlずつアンプルに分注し、溶解用溶液とした。
精製されたヒトG-CSF(10mM-リン酸緩衝液 pH7.0)の75μg/ml及びD-マンニトールの15mg/mlを注射用蒸留水に溶解して0.3mlとした後、0.22μmのポアサイズを有するメンブランフィルターで濾過滅菌した。得られた溶液を滅菌処理したバイアル瓶中に充填し、同様に滅菌処理したゴム栓を半打栓し、続いてアルミニウムキャップに巻き締めて注射用溶液製剤を得た。この注射用溶液製剤の保存は10℃以下の冷暗所で行う。
精製されたヒトG-CSF(10mM-リン酸緩衝液 pH7.0)の50μg/mlをNaClで浸透圧比を1に調整した後、0.22μmのポアサイズを有するメンブランフィルターで濾過滅菌した。得られた溶液を滅菌処理したバイアル瓶中に充填し、同様に滅菌処理したゴム栓を打栓し、続いてアルミニウムキャップに巻き締めて注射用溶液製剤を得た。この注射用溶液製剤の保存は10℃以下の冷暗所で行う。
精製されたヒトG-CSF(10mM-リン酸緩衝液 pH7.0)の100μg/mlをNaClで浸透圧比を1に調整した後、0.22μmのポアサイズを有するメンブランフィルターで濾過滅菌した。得られた溶液を滅菌処理したバイアル瓶中に充填し、同様に滅菌処理したゴム栓を打栓し、続いてアルミニウムキャップに巻き締めて注射用溶液製剤を得た。この注射用溶液製剤の保存は10℃以下の冷暗所で行う。
精製されたヒトG-CSF(10mM-リン酸緩衝液 pH7.0)の50μg/mlにHSA濃度10mg/ml及びD-マンニトール濃度50mg/mlとなるように加えて溶解した後、0.22μmのポアサイズを有するメンブランフィルターで濾過滅菌した。得られた溶液を滅菌処理したバイアル瓶中に充填し、同様に滅菌処理したゴム栓を半打栓し、続いてアルミニウムキャップに巻き締めて注射用溶液製剤を得た。この注射用溶液製剤は室温以下の温度条件で保存し、使用時に注射用蒸留水で希釈して使用する。
精製されたヒトG-CSF(10mM-リン酸緩衝液 pH7.0)の100μg/mlにゼラチン濃度10mg/ml及びD-マンニトール濃度50mg/mlとなるように加えて溶解した後、0.22μmのポアサイズを有するメンブランフィルターで濾過滅菌した。得られた溶液を滅菌処理したバイアル瓶中に充填し、同様に滅菌処理したゴム栓を半打栓し、続いてアルミニウムキャップに巻き締めて注射用溶液製剤を得た。この注射用溶液製剤は室温以下の温度条件で保存し、使用時に注射用蒸留水で希釈して使用する。
精製されたヒトM-CSF(10mM-リン酸緩衝液 pH7.0)の75μg/ml及びD-マンニトールの15mg/mlを注射用蒸留水に溶解して0.3mlとした後、0.22μmのポアサイズを有するメンブランフィルターで濾過滅菌した。得られた溶液を滅菌処理したバイアル瓶中に充填し、同様に滅菌処理したゴム栓を半打栓し、続いてアルミニウムキャップに巻き締めて注射用溶液製剤を得た。この注射用溶液製剤の保存は10℃以下の冷暗所で行う。
精製されたヒトM-CSF(10mM-リン酸緩衝液 pH7.0)の50μg/mlをNaClで浸透圧比を1に調整した後、0.22μmのポアサイズを有するメンブランフィルターで濾過滅菌した。得られた溶液を滅菌処理したバイアル瓶中に充填し、同様に滅菌処理したゴム栓を打栓し、続いてアルミニウムキャップに巻き締めて注射用溶液製剤を得た。この注射用溶液製剤の保存は10℃以下の冷暗所で行う。
Claims (3)
- 顆粒球コロニー刺激因子を有効成分として含有する脳機能障害による疾患の予防・治療薬。
- 脳機能障害による疾患が、細胞生存延長作用及び/又はアセチルコリントランスフェラーゼ賦活作用が有効な疾患である請求項1記載の脳機能障害による痴呆症の予防・治療薬。
- 脳機能障害による疾患が、アルツハイマー病、アルツハイマー型老人性痴呆症又は脳血管性痴呆症である請求項1記載の脳機能障害による疾患の予防・治療薬。
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