JP2004121026A - グリコシルトランスフェラーゼに対する抗体分子の遺伝子工学的製造法 - Google Patents
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Abstract
【課題】グリコシルトランスフェラーゼに対する抗体分子の遺伝子工学的製造法を提供することを課題とする。
【解決手段】う蝕の原因菌であるＳ． ｍｕｔａｎｓが産生するＧＴＦに対する抗体の重鎖および軽鎖の可変領域をリンカーを介して連結してなる抗体分子をコードする遺伝子が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ菌にて機能し得る複製領域、プローモーター領域、ＳＤ領域およびシグナル領域とともに発現可能なように配置された発現ベクターを構築し、該発現ベクターにてＢａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ菌を形質転換し、得られる形質転換体を培養することにより、培養液中に分泌された該抗体分子を効率良く大量に得ることができる。また、得られる抗体分子は、ＧＴＦ活性、特にシュクラーゼ活性を強力に抑制することができ、う蝕の治療に有効に使用することができる。
【選択図】 なし
【解決手段】う蝕の原因菌であるＳ． ｍｕｔａｎｓが産生するＧＴＦに対する抗体の重鎖および軽鎖の可変領域をリンカーを介して連結してなる抗体分子をコードする遺伝子が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ菌にて機能し得る複製領域、プローモーター領域、ＳＤ領域およびシグナル領域とともに発現可能なように配置された発現ベクターを構築し、該発現ベクターにてＢａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ菌を形質転換し、得られる形質転換体を培養することにより、培養液中に分泌された該抗体分子を効率良く大量に得ることができる。また、得られる抗体分子は、ＧＴＦ活性、特にシュクラーゼ活性を強力に抑制することができ、う蝕の治療に有効に使用することができる。
【選択図】 なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、う蝕の原因菌であるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓが産生するグリコシルトランスフェラーゼに対する抗体分子の遺伝子工学的製造法に関する。更に詳細には、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓが産生するグリコシルトランスフェラーゼに対する抗体の重鎖および軽鎖の可変領域をリンカーを介して連結してなる抗体分子をコードする遺伝子が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ菌にて機能し得る複製領域、プローモーター領域、ＳＤ領域およびシグナル領域とともに発現可能なように配置された発現ベクターを用い、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ菌を宿主として用いて、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓが産生するグリコシルトランスフェラーゼに対する抗体分子を製造する遺伝子工学的製造法、該製造法に用いる発現ベクターおよび該製造法によって製造される抗体分子に関する。
【０００２】
【従来の技術】
う蝕と歯周病は現代人の最も典型的な口腔疾患である。これらの疾患を予防する１つの手だてとしては、免疫を利用したものが考えられ、それらには能動および受動免疫の２つの方法が挙げられる。能動免疫は受動免疫に比べて確かに効果的ではあるものの、全く予想不可能な副作用の点を考えあわせると、医学領域とは異なり、歯科領域でワクチンを用いるということについての社会的コンセンサスが依然として得られていない現状では、後者の受動免疫システムの研究が重要視されている。
このような受動免疫システムの１つとして、歯周病の原因と考えられているＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓのベジクルに由来する赤血球凝集活性作用を、ベジクルに対する抗体分子により抑制して歯周病を治療する試みがなされている。即ち、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓのベジクル画分をマウスに免疫しマウスより脾臓を摘出し、脾臓細胞とミエローマ細胞とを融合することにより、ベジクル由来の赤血球凝集活性を抑制するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを確立し、該ハイブリドーマから該モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖の可変領域をコードする遺伝子を得、この遺伝子をＢａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓに導入して可変領域の重鎖および軽鎖からなる抗体分子を発現させ、この抗体分子により、歯周病を治療する試みがなされている（非特許文献１）。
他方、う蝕の原因と考えられているものとしてＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓが産生するグリコシルトランスフェラーゼがあり、グルコシルトランスフェラーゼはショ糖を基質としてこれを分解し、フルクトースとう蝕の直接的原因となるグルカンとを生成する酵素である。また、グルコシルトランスフェラーゼには、水に対して不溶性なグルカンと可溶性なグルカンとを生成する２種類がある。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓが産生するグリコシルトランスフェラーゼ活性を受動免疫システムにより抑制してう蝕を治療する試みもなされている。即ち、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ ＰＳ１４株より水に不溶性のグリコシルトランスフェラーゼを得、これをマウスに免役し脾臓を摘出後、ミエローマ細胞と融合させせて該グリコシルトランスフェラーゼ活性を抑制するモノクローナル抗体を産生する陽性ハイブリドーマＰ１３６を得、このモノクローナル抗体をう蝕の治療に用いる試みもなされている（非特許文献２）。
また、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ由来の水不溶性グリコシルトランスフェラーゼ活性を抑制するモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖の可変領域をコードする遺伝子を大腸菌で発現させて、発現する抗体分子をう蝕の治療に用いる試みも提案されている（非特許文献３ Ｙａｓｕｋｏ Ｓｈｉｂａｔａ ｅｔ ａｌ．， （ＩＡＤＲ ａｂｓｔｒａｃｔ）， Ｊ． Ｄｅｎｔａｌ Ｒｅｓ．， ７６， ｐｐ． １０４， （１９９７））。しかしながら、大腸菌にて発現させる場合には、発現した大部分の抗体分子は不溶性の包括体として大腸菌内に存在しており、従ってこのような方法は、十分な量の抗体分子を効率的に得る方法としては、まだ改良すべき点の多い方法といえる。
【０００３】
【非特許文献１】
Ｔｅｒｕａｋｉ Ｓｈｉｒｏｚａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ６５（２）， ３８０−３９５， ２００１
【非特許文献２】
Ｋａｚｕｏ Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ．， ６１， ３２３−３２８， １９９３
【非特許文献３】
Ｋａｚｕｏ Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ．， ６１， ３２３−３２８， １９９３
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の課題は、う蝕の原因菌であるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓが産生するグリコシルトランスフェラーゼに対する抗体分子を効率良く大量に製造することのできる遺伝子工学的製造法を提供することにある。
更に本発明の課題は、このような遺伝子工学的製方法に用いる発現ベクターを提供することにある。
更に本発明の課題は、このような遺伝子工学的製造法によって得られる抗体分子を提供することにある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、う蝕の原因菌であるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓが産生するグリコシルトランスフェラーゼに対する抗体分子の遺伝子工学的製造法であって、
該グリコシルトランスフェラーゼに対する抗体の重鎖および軽鎖の可変領域をリンカーを介して連結してなる抗体分子をコードする遺伝子が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ菌にて機能し得る複製領域、プローモーター領域、ＳＤ領域およびシグナル領域とともに発現可能なように配置された発現ベクターを構築し、該発現ベクターにてＢａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ菌を形質転換し、得られる形質転換体を培養し、次いで培養液中に分泌された該抗体分子を回収することからなることを特徴とする、
う蝕の原因菌であるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓが産生するグリコシルトランスフェラーゼに対する抗体分子の遺伝子工学的製造法である。
更に本発明は、う蝕の原因菌であるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓが産生するグリコシルトランスフェラーゼに対する抗体の重鎖および軽鎖の可変領域をリンカーを介して連結してなる抗体分子をコードする遺伝子、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来ｐＵＢ１１０の複製領域、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のα−アミラーゼ遺伝子のプローモーター領域、ＳＤ領域およびシグナル領域を含む、該抗体分子を発現するための発現ベクターである。
更に本発明は、上記遺伝子工学的製造法によって製造される、う蝕の原因菌であるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓが産生するグリコシルトランスフェラーゼに対する抗体分子である。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明の遺伝子工学的製造法で製造の対象とするものは、う蝕の原因菌であるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓが産生するグリコシルトランスフェラーゼ（ＧＴＦ）に対する抗体分子あって、該ＧＴＦに対する抗体の重鎖および軽鎖の可変領域をリンカーを介して連結してなる抗体分子である。より具体的には、重鎖および軽鎖の可変領域としては、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓが産生するＧＴＦであって、ショ糖を基質として水不溶性のグルカンを生成するＧＴＦ（ＧＴＦ−Ｉ）に対するモノクローナル抗体（Ｋａｚｕｏ Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ ｅｔ． ａｌ．， Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ．， ６１， ３２３−３２８， １９９３）の重鎖および軽鎖の可変領域（Ｆｖ）が挙げられる。これらの重鎖および軽鎖の可変領域は、それぞれ配列表の配列番号１および２に示すアミノ酸配列を有する。あるいは重鎖および軽鎖の可変領域は、配列番号１および２のアミノ酸配列において１個もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換および／または付加したアミノ酸配列を有する蛋白質であって配列番号１および２に示すアミノ酸配列からなり重鎖および軽鎖の可変領域とそれぞれ同様の機能を有する蛋白質であってもよい。ここで同様の機能を有する蛋白質とは、配列番号１および２に示すアミノ酸配列からなる重鎖および軽鎖の可変領域とそれぞれ同様の抗原結合機能を持ち、リンカーを介して連結して最終的な抗体分子とした時に同様の抗原結合機能を有する蛋白質を指す。
これらの重鎖および軽鎖の可変領域を連結するリンカーとしては、特に限定されず、重鎖と軽鎖の可変領域が一緒になって抗原結合機能を有効に発揮し得るようなペプチドであればよく、例えば、重鎖と軽鎖の可変領域が二本鎖構造を取り易いようにフレキシブルな構造のリンカーが好ましく、例えばグリシン、セリンなどのアミノ酸残基から多く構成されるものが好ましい。このようなリンカーとしては、具体的には、例えば配列番号３に示したアミノ酸配列を有するペプチドが挙げられる。
【０００７】
上記した抗体分子をコードする遺伝子としては、具体的には、例えば、ＧＴＦ−Ｉに対するモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖のＦｖをそれぞれコードする配列番号１および２に示す塩基配列からなる遺伝子を、リンカーをコードする配列番号３に示す塩基配列からなる遺伝子を介して連結した、抗体分子（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ Ｆｖ： ｓｃＦｖ）をコードする遺伝子が挙げられる。このｓｃＦｖをコードする遺伝子は、例えば、次ぎのようにして得ることができる。即ち、先ずＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓＧＴＦ−Ｉをマウスに免役し、脾臓を摘出後、ミエローマ細胞と融合させることにより、ＧＴＦ−Ｉを認識するモノクローナル抗体を分泌する陽性ハイブリドーマを得る（Ｋａｚｕｏ Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ６１， ３２３−３２８， １９９３）。続いて、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ ＧＴＦ−Ｉ活性を抑制するｓｃＦｖをコードする遺伝子の調製を、市販キットマウスｓｃＦｖモジュール／組換えファージ抗体システムｔ（ファルマシアバイオテック社製）の手順に従い行なうことができる。上記ハイブリドーマより得たｍＲＮＡからｃＤＮＡを作製し、さらにＰＣＲ、アッセンブルＰＣＲ等によりｓｃＦｖをコードするＤＮＡ断片を調製する。これを該キットの付属ｐＣＡＮＴＡＢベクターに導入して、図２に示すｓｃＦｖをコードする遺伝子を含むプラスミドｐＣＡＮＴＡＢ−Ｄ３（図２のＢ）を構築し、このプラスミド中にｓｃＦｖをコードする遺伝子Ｄ３を得ることができる。これらの方法は、Ｙａｓｕｋｏ Ｓｈｉｂａｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ６６， ２２０７−２２１２， １９９８．に記載の方法が参照される。
また、上記した配列番号１および２のアミノ酸配列において１個もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換および／または付加したアミノ酸配列を有する蛋白質から構成される抗体分子をコードする遺伝子は、上記のようにして得られたｓｃＦｖをコードする遺伝子に対して、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ Ｅｄｔ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）等の基本書に従い、例えば部位特異的突然変異誘発法などを適用することにより容易に得ることができる。
【０００８】
本発明の遺伝子工学的製造法では、以上に説明した抗体分子をコードする遺伝子が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ菌にて機能し得る複製領域、プローモーター領域、ＳＤ領域およびシグナル領域とともに発現可能なように配置された発現ベクターを構築する。ここでＢａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ菌にて機能し得る複製領域としては、特に限定されず、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ菌にて機能し得る複製領域であればいずれでもよく、例えばＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来のｐＵＢ１１０の複製領域（Ｔ． ＭｃＫｅｎｚｉｅ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｓｍｉｄ １５， ９３−１０３， （１９８６））、グラム陽性細菌由来のｐＣ１９４の複製領域（Ｓ． Ｈｏｒｉｎｏｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １５０， ８１５−８２５， （１９８２））、グラム陽性細菌由来のｐＬＳ５の複製領域（Ｓ．Ａ． Ｌａｃｋｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９２， ７５３−７６５， （１９８６））などが挙げられる。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ菌にて機能し得るプローモーター領域、ＳＤ領域およびシグナル領域としては、特に限定されず、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ菌にて機能し得るものであれはいずれでもよく、例えばＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のα−アミラーゼ遺伝子のプローモーター領域、ＳＤ領域およびシグナル領域（Ｙａｍａｚａｋｉ， Ｈ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １５６， ３２７−３３７ （１９８３））、Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｂａｃｉｌｌｕｓ由来のアミラーゼ遺伝子もしくはプロテアーゼ遺伝子のプローモーター領域、ＳＤ領域およびシグナル領域（Ａｋｉｒａ Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．， １５１， ２５−３１， （１９８８））、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ由来の主要菌体外蛋白質遺伝子のプローモーター領域、ＳＤ領域およびシグナル領域（鵜高重三、日本農芸化学会誌、第６１巻、６６９（１９８７））などが挙げられる。このような領域は、通常、上流側から、即ち５’側から複製領域、プローモーター領域、ＳＤ領域およびシグナル領域の順に配置され、シグナル領域の３’側に読み取り枠を揃えて上記した抗体分子をコードする遺伝子が配置される。このように各領域が配置されＢａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ菌にて抗体分子が発現可能な発現ベクターの構築は、既に周知の方法によって実施することができ、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ Ｅｄｔ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）等の基本書に記載された方法などが例示される。
【０００９】
発現ベクターとしては、具体的には、例えば図４に示す発現ベクターｐＹＳ１８が挙げられる。ｐＹＳ１８は、複製領域としてｐＵＢ１１０ ｒｅｐ−ＭＯ断片、プローモーター領域、ＳＤ領域およびシグナル領域として、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のα−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＥ）のプローモーター領域、ＳＤ領域およびシグナル領域を有し、シグナル領域の３’末端側に抗体分子ｓｃＦｖをコードする遺伝子Ｄ３が配置されたものである。
この発現ベクターは、図４のＢに示すＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来ｐＵＢ１１０の複製領域ｐＵＢ１１０ ｒｅｐ−ＭＯ、カナマイシン耐性遺伝子Ｋｍｒおよび大腸菌で複製するための複製領域ｐ１５Ａを有するドナープラスミドｐＨＤ１７Ｋと、図４のＡに示すＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のα−アミラーゼ遺伝子のプローモーター領域、ＳＤ領域およびシグナル領域、抗体分子ｓｃＦｖをコードする遺伝子Ｄ３、エリスロマイシン耐性遺伝子Ｅｍｒ、更に大腸菌で複製するための複製領域ｐ１５Ａを有するクローニングプラスミドｐＹＳ１４とを用いてヘテロダイマー法（Ｔｅｒｕａｋｉ Ｓｈｉｒｏｚａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ６５（２）， ３８０−３９５， ２００１）により構築することができる。
【００１０】
ヘテロダイマー法は、まず始めに、２つのドナープラスミドｐＨＤ１７ＫおよびクローニングプラスミドｐＹＳ１４を共通の制限酵素Ｎｏｔ Ｉで切断し（図４のＡおよびＢ）、直鎖としたＤＮＡ断片を脱リン酸化することなく再びリガーゼ反応に付す。このリガーゼ反応では、ほとんどの断片は単純に再び環状化されるだけであり、元のドナープラスミドあるいはクローニングプラスミドを再生する。しかしながら、ほんのわずかの分子は互いに結合して二量体を形成する。そこでこのリガーゼ反応溶液を組換え能が抑制された大腸菌、例えばＪＭ１０９株に導入すると、同一複製領域（この場合にはｐ１５Ａ）を持つ異なったプラスミドは同じ大腸菌内には共存できない、というプラスミドの和合性・不和合性の性質から、２つのプラスミドは同一の大腸菌内に共存することはできず、一方のプラスミドは他方を排除する。その結果、再結合されたプラスミドは、エリスロマイシン耐性あるいはカナマイシン耐性のいずれかとなる。そこで、形質転換体をエリスロマシンおよびカナマイシンの両薬剤を含む寒天培地上で選抜することにより、両者が結合したヘテロダイマープラスミドｐＹＳ１６（図４のＣ）を持つ大腸菌のみが選択的に得られることとなる。次に、構築されたヘテロダイマープラスミドを他の制限酵素Ａｓｃ Ｉで切断し、再環状化し（図４のＣ）、大腸菌に形質転換し、エリスロマイシンだけを含有する寒天培地で形質転換体を選抜することにより、目的とする発現ベクターｐＹＳ１８（図４のＤ）を得ることが可能となる。
【００１１】
上記へテロダイマー法に用いたクローニングプラスミドｐＹＳ１４は、図２に示すように、上記した抗体分子ｓｃＦｖをコードする遺伝子Ｄ３を有するプラスミドｐＣＡＮＴＡＢ−Ｄ３（図２のＢ）から構築することができる。即ち、クローニングプラスミドであるｐＨＤ１０Ｅ（図２のＡ）をＢａｍ ＨＩおよびＰｓｔ Ｉにて切断し、これに、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のα−アミラーゼ遺伝子の５’側領域のＢａｍ ＨＩ−Ｐｓｔ Ｉ断片（図２のＢ、１．３ｋｂ）（プロモーター領域、ＳＤ領域およびシグナル領域を含む）を導入する。次いで、抗体分子ｓｃＦｖをコードする遺伝子Ｄ３をｐＣＡＮＴＡＢ−Ｄ３よりＨｉｎｄ ＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片として回収し、これをクローン化し、ＰＣＲの鋳型となるプラスミドｐＹＳ１２（図２のＤ）を得る。次いで、抗体分子ｓｃＦｖをコードする遺伝子Ｄ３とα−アミラーゼ遺伝子のシグナル領域とが、正しい読み取り枠で連結するようにプライマーを設計してＰＣＲを実施することにより、目的とするクローニングプラスミドｐＹＳ１４（図２のＥ）が得られる。
【００１２】
クローニングプラスミドｐＹＳ１４を構築する際に原型プラスミドとして用いたクローニングプラスミドであるｐＨＤ１０Ｅ並びに上記へテロダイマー法に用いたドナープラスミドｐＨＤ１７Ｋは、図１のＡおよびＢに示した方法により構築できる。即ち、プラスミドｐＲｅｓＫｍＮｏｔ１０Ａｓｃ（図１のＡ１）のマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）をＢｇｌ ＩＩおよびＢａｍ ＨＩにて切断し、ｐＵＢ１１０の複製領域ｐＵＢ１１０ ｒｅｐ（図１のＡ２）を導入する。得られるプラスミドを更にＢａｍ ＨＩおよびＢｃｌ Ｉにて切断後、ｐＵＢ１１０の複製領域のマイナスオリジン領域（ＭＯ断片、図１のＡ３）を導入し、ドナープラスミドｐＨＤ１７Ｋを構築することができる。
次に、クローニングプラスミドｐＹＳ１４を構築する際に原型プラスミドとして用いたクローニングプラスミドであるｐＨＤ１０Ｅは、図１のＢに示した方法により構築できる。即ち、プラスミドｐＲｅｓＫｍＮｏｔｌ０Ａｓｃ（図１のＡ１）をＢｇｌ Ｉ ＩおよびＢｃｌＩで切断し、そのままリガーゼ反応を行うことによりＭＣＳ構造だけを取り除いたプラスミドｐＲｅｓＫｍＮｏｔＡｓｃ（図１のＢ１）を得る。このプラスミドに両端がＮｏｔ ＩサイトとなったＭＣＳを導入し、中間体であるプラスミドｐＲｅｓＫｍＮｏｔ１０ＮｏｔＡｓｃ（図１のＢ２）を得る。この中間体およびもう１つのプラスミドであるｐＲｅｓＥｍＰｖｕ１０（図１のＢ３）の両者をＢａｍ ＨＩおよびＢｓｔ ＢＩで切断し、それぞれより大断片および小断片を得て、リガーゼ反応後大腸菌に形質転換し、目的とするクローニングプラスミドであるｐＨＤ１０Ｅ（図１のＢ４）を得ることができる。
【００１３】
以上に詳細に説明した方法により、本発明の遺伝子工学的製造法において用いる、抗体分子をコードする遺伝子が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ菌にて機能し得る複製領域、プローモーター領域、ＳＤ領域およびシグナル領域とともに発現可能なように配置された発現ベクターを構築することがでる。かくして構築された発現ベクターにてＢａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ菌を形質転換し、得られる形質転換体を培養し、次いで培養液中に分泌された抗体分子を回収することにより、本発明で目的とする抗体分子を大量に効率良く製造することができる。
宿主として用いるＢａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ菌としては、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ ＨＰＤ３１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８７）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ ４７（ＦＥＲＭ Ｐ−７２２）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ Ｈ１０２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８７）などが挙げられる。なかでも、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ ＨＰＤ３１が好ましい。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ菌の形質転換法としては、公知のいずれの方法でもよく、例えば、高橋らの方法（Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， ｖｏｌ．１５６， １１３０， １９８３）、高木らの方法（Ａｇｒｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ｖｏｌ．５３， ３０９９， １９８９）、鵜高らの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ｖｏｌ．２１７， ２３， １９９３）などが挙げられる。得られる形質転換体の培養方法も、公知のいずれの方法でもよい。例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ ＨＰＤ３１を用いた場合には、ＴＨＢ培地で３０℃程度で数日間培養を行なう。培養後に、例えば遠心分離、濾過などの公知の方法で菌体と培養液とを分離し、培養液を、例えば塩析、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーなどの公知の精製法を組み合わせることによって、目的とする抗体分子を大量に得ることができる。
かくして得られる抗体分子は、ＧＴＦ活性を強力に抑制することができる。ＧＴＦは、ショ糖を基質として、これを分解してグルコースとフルクトースとした後、グルコースを重合させてグルカンを生成する。本発明の抗体分子は、ショ糖をグルコースとフルクトースとに分解するシュクラーゼ活性を特に強力に抑制することができる。
【００１４】
【実施例】
以下、本発明を、実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例によって何ら限定されるものではない。
実施例１
抗体分子 ｓｃＦｖ をコードする遺伝子の構築
Ｋａｚｕｏ Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ６１， ３２３−３２８， （１９９３）に記載の方法に従い、Ｓ． ｍｕｔａｎｓ由来のＧＴＦ−Ｉ活性を抑制するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作成した。
先ずＳ． ｍｕｔａｎｓ ＰＳ１４株（Ｋａｚｕｏ Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ６１， ３２３−３２８，（１９９３）より精製ＧＴＦ−Ｉタンパクを得、これを実験動物であるマウスに免役し、脾臓を摘出後、ミエローマ細胞と融合させることにより不死化細胞株を作製した。次に、ＥＬＩＳＡおよび限界希釈などの方法により、抗原として用いたＧＴＦ−Ｉタンパクを認識するモノクローナル抗体を分泌する株をスクリーニングし、陽性ハイブリドーマＰ１３６（Ｋａｚｕｏ Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ６１， ３２３−３２８， （１９９３））を得た。本ハイブリドーマからは、Ｓ． ｍｕｔａｎｓ由来のＧＴＦ−Ｉ活性を抑制するモノクローナル抗体が分泌生産される。
続いて、Ｙａｓｕｋｏ Ｓｈｉｂａｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ６６， ２２０７−２２１２， １９９８に記載の方法に従って、Ｓ． ｍｕｔａｎｓ ＧＴＦ−Ｉ活性を抑制するｓｃＦｖをコードする遺伝子の調製を、市販キットマウスｓｃＦｖモジュール／組換えファージ抗体システム（ファルマシアバイオテック社製）の手順に従い実施した。本ハイブリドーマから、酸グアニジニウムチオシアネート−フェノール−クロロホルム抽出法により全ｍＲＮＡを抽出した。全ｍＲＮＡを逆転写反応のテンプレートとして用いた。プライム化ファーストストランド反応混合物を用いてファーストストランドｃＤＮＡを合成した。モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖のそれぞれの可変領域をコードするｃＤＮＡを、マウスＳｃＦｖモジュール／組換えファージ抗体システム（ファルマシアバイオテック社製）に含まれているプライマー一式を用いて、ＰＣＲにより増幅した。増幅したＤＮＡをアガロースゲル電気泳動により精製して、プライマーを除いた。精製されたＤＮＡの塩基配列を公知のジデオキシ法により決定し、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖のそれぞれの可変領域は、配列表の配列番号１および２にそれぞれ示す塩基配列からなることが明らかになった。
重鎖および軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡを、配列番号３に示すリンカーペプチドをコードするＤＮＡリンカーフラグメントを用いてアッセンブルＰＣＲにより、正しい読み取り枠になるように連結して、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡ断片を調製した。これを付属ｐＣＡＮＴＡＢベクターに導入して、ｓｃＦｖをコードするプラスミドｐＣＡＮＴＡＢ−Ｄ３（図２のＢ）を構築した。ｐＣＡＮＴＡＢ−Ｄ３よりコードされるｓｃＦｖタンパクは、ファージＭ１３のコートタンパクのリーダ配列と融合した型となっている。また、ｐＣＡＮＴＡＢ−Ｄ３は、ペプチドｔａｇ（Ｅ ｔａｇ）をコードする遺伝子を含んでおり、これを利用してｓｃＦｖタンパクの同定を抗Ｅ−ｔａｇ抗体によるウエスタンブロットにより行なうことができる。
【００１５】
実施例２
抗体分子 ｓｃＦｖ の発現ベクター ｐＴＳ１８ のヘテロダイマー法による構築
（１）ドナープラスミド ｐＨＤ１７Ｋ の構築
ヘテロダイマー法のためのプラスミドの構築を行なった。ドナープラスミドを構築するために、原型となるプラスミドｐＲｅｓＫｍＮｏｔ１０Ａｓｃ（図１のＡ１）のマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）をＢｇｌ ＩＩおよびＢａｍ ＨＩにて切断し、ｐＵＢ１１０の複製領域ｐＵＢ１１０ ｒｅｐ（図１のＡ２）を導入した。得られたプラスミドを更にＢａｍ ＨＩおよびＢｃｌ Ｉにて切断後、ｐＵＢ１１０のマイナスオリジン領域（ＭＯ断片、図１のＡ３）を導入し、ドナープラスミドｐＨＤ１７Ｋ（図１のＡ５、３．６ｋｂ）を構築した。なお、原型となるプラスミドｐＲｅｓＫｍＮｏｔ１０Ａｓｃは、Ｔｅｒｕａｋｉ Ｓｈｉｒｏｚａ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ６１， ３７４５−３７５５， （１９９３）に記載された、Ｋｍｒ９０３、ｐ１５ＡｏｒｉおよびＭＣＳとを結合し、さらに市販ＡｓｃＩリンカーを導入することにより構築した。
（２）クローニングプラスミド ｐＨＤ１０Ｅ の構築
次に一般的なクローニングプラスミドの構築のため、原型となるプラスミドｐＲｅｓＫｍＮｏｔ１０Ａｓｃ（図１のＡ１）をＢｇｌ ＩＩおよびＢｃｌ Ｉで切断し、そのままリガーゼ反応を行うことによりＭＣＳ構造だけを取り除いたプラスミドｐＲｅｓＫｍＮｏｔＡｓｃ（図１のＢ１）を得た。このプラスミドに両端がＮｏｔｔ ＩサイトとなったＭＣＳを導入し、中間体であるプラスミドｐＲｅｓＫｍＮｏｔ１０ＮｏｔＡｓｃ（図１のＢ２）を得た。この中間体およびもう１つの原型プラスミドであるｐＲｅｓＥｍＰｖｕ１０（図１のＢ３）の両者をＢａｍＨＩおよびＢｓｔ ＢＩで切断し、それぞれより大断片および小断片を電気泳動にて精製し、リガーゼ反応後大腸菌に形質転換した。その結果、一般的なクローニングプラスミドであるｐＨＤ１０Ｅ（図１の４、１．６ｋｂ）を得た。なお、中間体であるプラスミドｐＲｅｓＫｍＮｏｔ１０ＮｏｔＡｓｃは、上記した原型となるプラスミドプラスミドｐＲｅｓＫｍＮｏｔ１０Ａｓｃに市販ＡｓｃＩリンカーを導入することにより構築した。また、中間体であるプラスミドｐＲｅｓＥｍＰｖｕ１０は、Ｔｅｒｕａｋｉ Ｓｈｉｒｏｚａ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ６１， ３７４５−３７５５， （１９９３）に記載された、Ｅｍｒ、ｐ１５ＡｏｒｉおよびＭＣＳとを結合することにより構築した。
【００１６】
（３）プラスミド ｐＹＳ１４ の構築
クローニングプラスミドであるｐＨＤ１０Ｅ（図２のＡ）をＢａｍ ＨＩおよびＰｓｔ Ｉにて切断し、これに、電気泳動により精製したα−アミラーゼ遺伝子の５’側領域のプロモーター領域、ＳＤ領域およびシグナル領域を含むＢａｍ ＨＩ−Ｐｓｔ Ｉ断片（図２のＣ、１．３ｋｂ）を導入した。つづいて、ｓｃＦｖタンパクをコードする遺伝子Ｄ３を実施例１で構築したｐＣＡＮＴＡＢ−Ｄ３（図２のＢ）より２．０ｋｂのＨｉｎｄ ＩＩＩ−Ｅｃｏ ＲＩ断片として電気泳動にて回収し、数段の操作によりこれをクローン化し、ＰＣＲの鋳型となるプラスミドｐＹＳ１２（図２のＤ）を得た。
（４）α−アミラーゼ遺伝子のシグナル領域と ｓｃＦｖ タンパクをコードする遺伝子 Ｄ３ との読み取り枠を合わせた融合
図３のＡに示したように、α−アミラーゼ遺伝子のシグナルペプチドの長さは３３アミノ酸残基と考えられており、一方、図３のＢに示したように、ｐＣＡＮＴＡＢ−Ｄ３においてコードされるｓｃＦｖタンパクは、ファージＭ１３のコートタンパクのリーダ配列と融合した型となっている。
そこで、α−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＥ）の分泌を司るシグナル領域とｓｃＦｖタンパクをコードする構造遺伝子領域とを読み取り枠を合わせた形態（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）で融合するために、以下の２本のＰＣＲプライマーをデザインした。
【００１７】
ａｍｙＥシグナル領域に対して ５’−ＧＧＣＡＣＴＣＧＣＡＧＣＣＧＣＣＧＧＴＣＣ−３’
構造遺伝子Ｄ３領域に対して ５’−ＡＴＧＧＣＣＣＡＧＧＴＣＣＡＧＣＴＧＣＡＧ−３’
図２のＤに示したプラスミドｐＹＳ１２を鋳型とし、パーキンエルマー９６００を用いてＰＣＲを行った。それぞれのプライマーは図３のＡおよびＢの点線で示した領域に結合する。標的領域の増幅には市販宝酒造のＰＣＲキットを用い、以下の条件を採用した。
１）初期変性；９４℃、３分。
２）３０サイクルの増幅：変性−９４℃、１分；プライマーアニーリング−５５℃、２分；伸長−７２℃、３分。
３）終了時の伸長；７２℃、１０分。
なお、α−アミラーゼ遺伝子側のプライマーの５’末端には、コードされるアミノ酸には影響を与えない、ＴをＣとしたミスマッチを一カ所導入した。その結果、ＰＣＲ産物をリガーゼ反応後、大腸菌に形質転換して得られる、設計通り作られたプラスミドには新規にＮｃｏ Ｉサイトが導入される（図３のＣ）。このような工夫により効率よく形質転換体をスクリーニングし、ｐＹＳ１４（Ｅ、４．４ｋｂ）を得た。塩基配列を確認することにより、本プラスミドは設計通り、両遺伝子が正しくｉｎ−ｆｒａｍｅで融合されており、プロモーター領域、ＳＤ領域およびシグナル領域が正しく機能し得るように導入されていることが確認された。
【００１８】
（５）ヘテロダイマー法による発現ベクター ｐＹＳ１８ の構築
図４に示したように、ヘテロダイマー法によりキメラプラスミドを構築した。少量のクローニングプラスミドｐＹＳ１４（図４のＡ）およびドナープラスミドｐＨＤ１７Ｋ（図４のＢ）をエッペンドルフチューブに混ぜ、８塩基認識制限酵素であるＮｏｔ Ｉにて切断（太い矢印）し、リガーゼ反応後、大腸菌ＪＭ１０９に形質転換した。形質転換体をエリスロマイシンおよびカナマイシンの両薬剤を含む寒天培地上で選抜し、ヘテロダイマープラスミドｐＹＳ１６（図４のＣ、７．９ｋｂ）を得た。次に本プラスミドをもう１つの８塩基認識制限酵素であるＡｓｃ Ｉにて切断、さらに再結合後、大腸菌ＪＭ１０９に形質転換した。形質転換体をエリスロマイシンのみを含有する寒天培地にて選抜することにより、プロモーター領域、ＳＤ領域、シグナル領域およびｓｃＦｖをコードする遺伝子をｓｃＦｖが発現可能なように含むキメラなシャトルプラスミドである、ｐＹＳ１８（図４のＤ、５．９ｋｂ）を得た。
【００１９】
実施例３
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ 菌による抗体分子 ｓｃＦｖ の産生および精製
実施例２で得られた発現ベクターであるキメラシャトルプラスミドｐＹＳ１８をＢａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ ＨＰＤ３１株に形質転換することにより、エリスロマイシン耐性の形質転換体を得た。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ形質転換体は５０ｍｇ／ｌｉｔｅｒのエリスロマイシンを含む、Ｄｉｆｃｏ社製Ｔｏｄｄ Ｈｅｗｉｔｔ Ｂｒｏｔｈ（ＴＨＢ）にて培養した。全ての精製操作は４℃にて行った。ｓｃＦｖタンパクの同定は抗Ｅ−ｔａｇ抗体によるウエスタンブロットに依った。
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ形質転換体を２リットルのＴＨＢ培地に接種し、３０℃３日間激しい撹拌を行いながら培養後、遠心により菌体を除いた。
得られた上澄に対し等量の冷エタノールを加え、生じた不溶性物質を遠心により得た。これを２００ｍｌのバッファーＡ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ ８．０、６Ｍ尿素）に懸濁し、５リットルの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に対して透析を行った。透析終了後、予めバッファーＡにて平衡化しておいたＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（２．５×２５ｃｍ）に通した。カラムをバッファーＡにて十分洗浄後、吸着タンパクを食塩の濃度勾配（０から０．５Ｍ）を含むバッファーＡにて溶出した。抗Ｅ−ｔａｇ抗体による陽性画分を集め、最終濃度が３０％飽和となるように結晶硫安を加えた。このタンパク溶液を予め３０％飽和硫安を含むバッファーＡにて平衡化しておいたブチルトヨバールによる疎水クロマト（０．５×１０ｃｍ）に付した。吸着タンパクは３０から０％飽和硫安のグラジエントにより溶出し、抗Ｅ−ｔａｇ抗体による陽性画分を集めた。本カラム操作を繰り返すことにより、他タンパクの混在しない画分を得、これを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に対して透析を行ない、抗体分子ｓｃＦｖの精製標品を得た。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ形質転換体のＴＨＢ培養液２リットルから１ｍｇの精製標品を得た。
最終精製標品のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットにより、他のタンパク質の混在の無いことが確認された（図５のＡ、Ｂ、レーン３参照）。
【００２０】
実施例４
抗体分子 ｓｃＦｖ の性質
実施例３で得られた精製ｓｃＦｖ標品を用いてＧＴＦ−Ｉ活性の抑制活性を定性的アッセイ法および定量的アッセイ法により測定した。
（１）アッセイ法に用いる ＧＴＦ−Ｉ の調製
ＧＴＦ−Ｉの精製はＫｕｗａｈａｒａ等の方法（Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ６５， １２９０−１２９５， ２００１．）に準じ、以下の様に行った。全ての精製操作は４℃にて行った。ＧＴＦ−Ｉを精製するための菌株は、Ｓ． ｍｕｔａｎｓ ＧＳ５株由来ｇｔｆＢ遺伝子が導入されたＳ． ａｎｇｉｎｏｓｕｓ形質転換体ＫＳＢ８株を使用した（Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ６０， ２８１５−２８２２， １９９３．参照）。本菌株を１００ｍｌのＴＨＢ培地に接種、３７℃、２０時間、嫌気培養を行った。遠心により菌体を除き、得られた上澄に対し等量の−８０℃冷エタノールを加え一夜置いた。生じた不溶性物質を遠心により得、これをバッファーＡ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）に溶解し、同一バッファーで２４時間透析を行った。不溶物を遠心により取り除き、上澄に最終濃度が０．２％となるようにＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を加え、予め０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含むバッファーＡで平衡化したＤＥＡＥ−Ｂｉｏ−Ｇｅｌカラム（１×５０ｃｍ）に付した。カラムを十分洗浄後、吸着タンパクを食塩の濃度勾配（０から０．５Ｍ）を含むバッファーＡにて溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる活性染色などによりＧＴＦ−Ｉ活性を有するフラクションを得、同一樹脂による再クロマト（０．５×２５ｃｍ）をＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００無しで行うことにより、精製ＧＴＦ−Ｉ標品を得た。
【００２１】
（２）抗体分子 ｓｃＦｖ の ＧＴＦ−Ｉ に対する抑制活性の定性的アッセイ法および定量的アッセイ法
抗体分子ｓｃＦｖによるＧＴＦ−Ｉ活性の抑制を定性的アッセイ法および定量的アッセイ法により測定した。
定性的アッセイ法の概略は以下の様である。０．１ユニットの精製ＧＴＦ−Ｉを含む１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．０）溶液に様々な量の精製ｓｃＦｖ（２μｇ、４μｇ、８μｇ、１６μｇ）を加え容量を３００μｌとし、３７℃、１時間置く。これに最終濃度が５０ｍＭとなるショ糖を加え、最終容量を５００μｌとして３７℃、一夜置き、生成した不溶性グルカンを観察する。
定量的アッセイ法は、Ｅｔｏ等の方法（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ， ２７４， １５７９７−１５８０２， １９９９．）に準じてＲｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製のＦ−キットを使用して以下の様に行った。１０ミリユニットの精製ＧＴＦ−Ｉを含む１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．０）溶液に４μｇの精製ｓｃＦｖを加え、容量を２００μｌとする。これを２５℃、１時間置いた後、最終濃度が２．０、４．０、８．０および１．０ｍＭとなる様なショ糖溶液を加え、最終容量を４００μｌとして３７℃、１時間反応させた。Ｆ−キットによる定量は、最終容量を１．５ｍｌとする、説明書の１／２スケールで行うこととした。上記反応溶液の５０μｌを取り、始めにＡＴＰ等を加え、ブランクとしての吸光度３４０ｎｍを読み（Ｅ０）、続いてヘキソキナーゼおよびグルコース６−リン酸脱水素酵素を加え、１０分後に３４０ｎｍの値を読み取った（Ｅ１）。続いてイソメラーゼを加え、さらに１０分後の３４０ｎｍの値を読み取った（Ｅ２）。Ｅ１−Ｅ０が反応溶液中のグルコース量に、また、Ｅ２−（Ｅ１＋Ｅ０）がフルクトース量になる。そして、フルクトース量からグルコース量を引いたものがグルカン量となる。ここで、ブランクの値Ｅ０は実質的にゼロとみなして差し支えないので、Ｅ１をグルコース量に、また、Ｅ２−Ｅ１をフルクトース量とすることができる。
精製ｓｃＦｖ標品を用いてＧＴＦ−Ｉ活性の抑制を定性的アッセイ法により測定した結果を図６に、定量的アッセイ法により測定した結果を図７に示した。図６および７に示すように、いずれの場合も、精製ｓｃＦｖはＧＴＦ−Ｉ活性を抑制することが明らかとなった。図７に示す反応条件では、１０ミリユニットのＧＴＦ−Ｉ酵素のシュークラーゼ活性により生成したグルコースのグルカンへの取り込み率は約７０％であり、４μｇのｓｃＦｖ添加によりその率が５０％前後に抑制されることが明らかとなった。
【００２２】
【発明の効果】
以上に詳細に説明した通り、う蝕の原因菌であるＳ． ｍｕｔａｎｓが産生するＧＦＴに対する抗体の重鎖および軽鎖の可変領域をリンカーを介して連結してなる抗体分子をコードする遺伝子が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ菌にて機能し得る複製領域、プローモーター領域、ＳＤ領域およびシグナル領域とともに発現可能なように配置された発現ベクターを構築し、該発現ベクターにてＢａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ菌を形質転換し、得られる形質転換体を培養することにより、培養液中に分泌された該抗体分子を効率良く大量に得ることができる。また、得られる抗体分子は、ＧＴＦ活性、特にシュクラーゼ活性を強力に抑制することができ、う蝕の治療に有効に使用することができる。
【００２３】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ドナープラスミドｐＨＤ１７ＫおよびクローニングプラスミドｐＨＤ１０Ｅの構築を示す。
【図２】図２は、クローニングプラスミドｐＹＳ１４の構築を示す。
【図３】図３は、α−アミラーゼ遺伝子のシグナル領域と抗体分子ｓｃＦｖをコードする遺伝子とのｉｎ−ｆｒａｍｅ融合を達成するためのデザインを示す。
【図４】図４は、ヘテロダイマー法による発現ベクターｐＹＳ１８の構築を示す。
【図５】図５は、本発明の製造法により得られた抗体分子ｓｃＦｖの電気泳動による分析結果を示す。
【図６】図６は、本発明の製造法により得られた抗体分子ｓｃＦｖのＧＴＦ−Ｉ活性に対する抑制効果を定性的アッセイ法によるアッセイ結果を示す。
【図７】図７は、本発明の製造法により得られた抗体分子ｓｃＦｖのＧＴＦ−Ｉ活性に対する抑制効果を定量的アッセイ法によるアッセイ結果を示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は、う蝕の原因菌であるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓが産生するグリコシルトランスフェラーゼに対する抗体分子の遺伝子工学的製造法に関する。更に詳細には、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓが産生するグリコシルトランスフェラーゼに対する抗体の重鎖および軽鎖の可変領域をリンカーを介して連結してなる抗体分子をコードする遺伝子が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ菌にて機能し得る複製領域、プローモーター領域、ＳＤ領域およびシグナル領域とともに発現可能なように配置された発現ベクターを用い、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ菌を宿主として用いて、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓが産生するグリコシルトランスフェラーゼに対する抗体分子を製造する遺伝子工学的製造法、該製造法に用いる発現ベクターおよび該製造法によって製造される抗体分子に関する。
【０００２】
【従来の技術】
う蝕と歯周病は現代人の最も典型的な口腔疾患である。これらの疾患を予防する１つの手だてとしては、免疫を利用したものが考えられ、それらには能動および受動免疫の２つの方法が挙げられる。能動免疫は受動免疫に比べて確かに効果的ではあるものの、全く予想不可能な副作用の点を考えあわせると、医学領域とは異なり、歯科領域でワクチンを用いるということについての社会的コンセンサスが依然として得られていない現状では、後者の受動免疫システムの研究が重要視されている。
このような受動免疫システムの１つとして、歯周病の原因と考えられているＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓのベジクルに由来する赤血球凝集活性作用を、ベジクルに対する抗体分子により抑制して歯周病を治療する試みがなされている。即ち、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓのベジクル画分をマウスに免疫しマウスより脾臓を摘出し、脾臓細胞とミエローマ細胞とを融合することにより、ベジクル由来の赤血球凝集活性を抑制するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを確立し、該ハイブリドーマから該モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖の可変領域をコードする遺伝子を得、この遺伝子をＢａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓに導入して可変領域の重鎖および軽鎖からなる抗体分子を発現させ、この抗体分子により、歯周病を治療する試みがなされている（非特許文献１）。
他方、う蝕の原因と考えられているものとしてＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓが産生するグリコシルトランスフェラーゼがあり、グルコシルトランスフェラーゼはショ糖を基質としてこれを分解し、フルクトースとう蝕の直接的原因となるグルカンとを生成する酵素である。また、グルコシルトランスフェラーゼには、水に対して不溶性なグルカンと可溶性なグルカンとを生成する２種類がある。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓが産生するグリコシルトランスフェラーゼ活性を受動免疫システムにより抑制してう蝕を治療する試みもなされている。即ち、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ ＰＳ１４株より水に不溶性のグリコシルトランスフェラーゼを得、これをマウスに免役し脾臓を摘出後、ミエローマ細胞と融合させせて該グリコシルトランスフェラーゼ活性を抑制するモノクローナル抗体を産生する陽性ハイブリドーマＰ１３６を得、このモノクローナル抗体をう蝕の治療に用いる試みもなされている（非特許文献２）。
また、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ由来の水不溶性グリコシルトランスフェラーゼ活性を抑制するモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖の可変領域をコードする遺伝子を大腸菌で発現させて、発現する抗体分子をう蝕の治療に用いる試みも提案されている（非特許文献３ Ｙａｓｕｋｏ Ｓｈｉｂａｔａ ｅｔ ａｌ．， （ＩＡＤＲ ａｂｓｔｒａｃｔ）， Ｊ． Ｄｅｎｔａｌ Ｒｅｓ．， ７６， ｐｐ． １０４， （１９９７））。しかしながら、大腸菌にて発現させる場合には、発現した大部分の抗体分子は不溶性の包括体として大腸菌内に存在しており、従ってこのような方法は、十分な量の抗体分子を効率的に得る方法としては、まだ改良すべき点の多い方法といえる。
【０００３】
【非特許文献１】
Ｔｅｒｕａｋｉ Ｓｈｉｒｏｚａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ６５（２）， ３８０−３９５， ２００１
【非特許文献２】
Ｋａｚｕｏ Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ．， ６１， ３２３−３２８， １９９３
【非特許文献３】
Ｋａｚｕｏ Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ．， ６１， ３２３−３２８， １９９３
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の課題は、う蝕の原因菌であるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓが産生するグリコシルトランスフェラーゼに対する抗体分子を効率良く大量に製造することのできる遺伝子工学的製造法を提供することにある。
更に本発明の課題は、このような遺伝子工学的製方法に用いる発現ベクターを提供することにある。
更に本発明の課題は、このような遺伝子工学的製造法によって得られる抗体分子を提供することにある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、う蝕の原因菌であるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓが産生するグリコシルトランスフェラーゼに対する抗体分子の遺伝子工学的製造法であって、
該グリコシルトランスフェラーゼに対する抗体の重鎖および軽鎖の可変領域をリンカーを介して連結してなる抗体分子をコードする遺伝子が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ菌にて機能し得る複製領域、プローモーター領域、ＳＤ領域およびシグナル領域とともに発現可能なように配置された発現ベクターを構築し、該発現ベクターにてＢａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ菌を形質転換し、得られる形質転換体を培養し、次いで培養液中に分泌された該抗体分子を回収することからなることを特徴とする、
う蝕の原因菌であるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓが産生するグリコシルトランスフェラーゼに対する抗体分子の遺伝子工学的製造法である。
更に本発明は、う蝕の原因菌であるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓが産生するグリコシルトランスフェラーゼに対する抗体の重鎖および軽鎖の可変領域をリンカーを介して連結してなる抗体分子をコードする遺伝子、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来ｐＵＢ１１０の複製領域、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のα−アミラーゼ遺伝子のプローモーター領域、ＳＤ領域およびシグナル領域を含む、該抗体分子を発現するための発現ベクターである。
更に本発明は、上記遺伝子工学的製造法によって製造される、う蝕の原因菌であるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓが産生するグリコシルトランスフェラーゼに対する抗体分子である。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明の遺伝子工学的製造法で製造の対象とするものは、う蝕の原因菌であるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓが産生するグリコシルトランスフェラーゼ（ＧＴＦ）に対する抗体分子あって、該ＧＴＦに対する抗体の重鎖および軽鎖の可変領域をリンカーを介して連結してなる抗体分子である。より具体的には、重鎖および軽鎖の可変領域としては、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓが産生するＧＴＦであって、ショ糖を基質として水不溶性のグルカンを生成するＧＴＦ（ＧＴＦ−Ｉ）に対するモノクローナル抗体（Ｋａｚｕｏ Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ ｅｔ． ａｌ．， Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ．， ６１， ３２３−３２８， １９９３）の重鎖および軽鎖の可変領域（Ｆｖ）が挙げられる。これらの重鎖および軽鎖の可変領域は、それぞれ配列表の配列番号１および２に示すアミノ酸配列を有する。あるいは重鎖および軽鎖の可変領域は、配列番号１および２のアミノ酸配列において１個もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換および／または付加したアミノ酸配列を有する蛋白質であって配列番号１および２に示すアミノ酸配列からなり重鎖および軽鎖の可変領域とそれぞれ同様の機能を有する蛋白質であってもよい。ここで同様の機能を有する蛋白質とは、配列番号１および２に示すアミノ酸配列からなる重鎖および軽鎖の可変領域とそれぞれ同様の抗原結合機能を持ち、リンカーを介して連結して最終的な抗体分子とした時に同様の抗原結合機能を有する蛋白質を指す。
これらの重鎖および軽鎖の可変領域を連結するリンカーとしては、特に限定されず、重鎖と軽鎖の可変領域が一緒になって抗原結合機能を有効に発揮し得るようなペプチドであればよく、例えば、重鎖と軽鎖の可変領域が二本鎖構造を取り易いようにフレキシブルな構造のリンカーが好ましく、例えばグリシン、セリンなどのアミノ酸残基から多く構成されるものが好ましい。このようなリンカーとしては、具体的には、例えば配列番号３に示したアミノ酸配列を有するペプチドが挙げられる。
【０００７】
上記した抗体分子をコードする遺伝子としては、具体的には、例えば、ＧＴＦ−Ｉに対するモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖のＦｖをそれぞれコードする配列番号１および２に示す塩基配列からなる遺伝子を、リンカーをコードする配列番号３に示す塩基配列からなる遺伝子を介して連結した、抗体分子（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ Ｆｖ： ｓｃＦｖ）をコードする遺伝子が挙げられる。このｓｃＦｖをコードする遺伝子は、例えば、次ぎのようにして得ることができる。即ち、先ずＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓＧＴＦ−Ｉをマウスに免役し、脾臓を摘出後、ミエローマ細胞と融合させることにより、ＧＴＦ−Ｉを認識するモノクローナル抗体を分泌する陽性ハイブリドーマを得る（Ｋａｚｕｏ Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ６１， ３２３−３２８， １９９３）。続いて、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ ＧＴＦ−Ｉ活性を抑制するｓｃＦｖをコードする遺伝子の調製を、市販キットマウスｓｃＦｖモジュール／組換えファージ抗体システムｔ（ファルマシアバイオテック社製）の手順に従い行なうことができる。上記ハイブリドーマより得たｍＲＮＡからｃＤＮＡを作製し、さらにＰＣＲ、アッセンブルＰＣＲ等によりｓｃＦｖをコードするＤＮＡ断片を調製する。これを該キットの付属ｐＣＡＮＴＡＢベクターに導入して、図２に示すｓｃＦｖをコードする遺伝子を含むプラスミドｐＣＡＮＴＡＢ−Ｄ３（図２のＢ）を構築し、このプラスミド中にｓｃＦｖをコードする遺伝子Ｄ３を得ることができる。これらの方法は、Ｙａｓｕｋｏ Ｓｈｉｂａｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ６６， ２２０７−２２１２， １９９８．に記載の方法が参照される。
また、上記した配列番号１および２のアミノ酸配列において１個もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換および／または付加したアミノ酸配列を有する蛋白質から構成される抗体分子をコードする遺伝子は、上記のようにして得られたｓｃＦｖをコードする遺伝子に対して、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ Ｅｄｔ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）等の基本書に従い、例えば部位特異的突然変異誘発法などを適用することにより容易に得ることができる。
【０００８】
本発明の遺伝子工学的製造法では、以上に説明した抗体分子をコードする遺伝子が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ菌にて機能し得る複製領域、プローモーター領域、ＳＤ領域およびシグナル領域とともに発現可能なように配置された発現ベクターを構築する。ここでＢａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ菌にて機能し得る複製領域としては、特に限定されず、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ菌にて機能し得る複製領域であればいずれでもよく、例えばＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来のｐＵＢ１１０の複製領域（Ｔ． ＭｃＫｅｎｚｉｅ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｓｍｉｄ １５， ９３−１０３， （１９８６））、グラム陽性細菌由来のｐＣ１９４の複製領域（Ｓ． Ｈｏｒｉｎｏｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １５０， ８１５−８２５， （１９８２））、グラム陽性細菌由来のｐＬＳ５の複製領域（Ｓ．Ａ． Ｌａｃｋｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９２， ７５３−７６５， （１９８６））などが挙げられる。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ菌にて機能し得るプローモーター領域、ＳＤ領域およびシグナル領域としては、特に限定されず、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ菌にて機能し得るものであれはいずれでもよく、例えばＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のα−アミラーゼ遺伝子のプローモーター領域、ＳＤ領域およびシグナル領域（Ｙａｍａｚａｋｉ， Ｈ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １５６， ３２７−３３７ （１９８３））、Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｂａｃｉｌｌｕｓ由来のアミラーゼ遺伝子もしくはプロテアーゼ遺伝子のプローモーター領域、ＳＤ領域およびシグナル領域（Ａｋｉｒａ Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．， １５１， ２５−３１， （１９８８））、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ由来の主要菌体外蛋白質遺伝子のプローモーター領域、ＳＤ領域およびシグナル領域（鵜高重三、日本農芸化学会誌、第６１巻、６６９（１９８７））などが挙げられる。このような領域は、通常、上流側から、即ち５’側から複製領域、プローモーター領域、ＳＤ領域およびシグナル領域の順に配置され、シグナル領域の３’側に読み取り枠を揃えて上記した抗体分子をコードする遺伝子が配置される。このように各領域が配置されＢａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ菌にて抗体分子が発現可能な発現ベクターの構築は、既に周知の方法によって実施することができ、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ Ｅｄｔ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）等の基本書に記載された方法などが例示される。
【０００９】
発現ベクターとしては、具体的には、例えば図４に示す発現ベクターｐＹＳ１８が挙げられる。ｐＹＳ１８は、複製領域としてｐＵＢ１１０ ｒｅｐ−ＭＯ断片、プローモーター領域、ＳＤ領域およびシグナル領域として、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のα−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＥ）のプローモーター領域、ＳＤ領域およびシグナル領域を有し、シグナル領域の３’末端側に抗体分子ｓｃＦｖをコードする遺伝子Ｄ３が配置されたものである。
この発現ベクターは、図４のＢに示すＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来ｐＵＢ１１０の複製領域ｐＵＢ１１０ ｒｅｐ−ＭＯ、カナマイシン耐性遺伝子Ｋｍｒおよび大腸菌で複製するための複製領域ｐ１５Ａを有するドナープラスミドｐＨＤ１７Ｋと、図４のＡに示すＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のα−アミラーゼ遺伝子のプローモーター領域、ＳＤ領域およびシグナル領域、抗体分子ｓｃＦｖをコードする遺伝子Ｄ３、エリスロマイシン耐性遺伝子Ｅｍｒ、更に大腸菌で複製するための複製領域ｐ１５Ａを有するクローニングプラスミドｐＹＳ１４とを用いてヘテロダイマー法（Ｔｅｒｕａｋｉ Ｓｈｉｒｏｚａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ６５（２）， ３８０−３９５， ２００１）により構築することができる。
【００１０】
ヘテロダイマー法は、まず始めに、２つのドナープラスミドｐＨＤ１７ＫおよびクローニングプラスミドｐＹＳ１４を共通の制限酵素Ｎｏｔ Ｉで切断し（図４のＡおよびＢ）、直鎖としたＤＮＡ断片を脱リン酸化することなく再びリガーゼ反応に付す。このリガーゼ反応では、ほとんどの断片は単純に再び環状化されるだけであり、元のドナープラスミドあるいはクローニングプラスミドを再生する。しかしながら、ほんのわずかの分子は互いに結合して二量体を形成する。そこでこのリガーゼ反応溶液を組換え能が抑制された大腸菌、例えばＪＭ１０９株に導入すると、同一複製領域（この場合にはｐ１５Ａ）を持つ異なったプラスミドは同じ大腸菌内には共存できない、というプラスミドの和合性・不和合性の性質から、２つのプラスミドは同一の大腸菌内に共存することはできず、一方のプラスミドは他方を排除する。その結果、再結合されたプラスミドは、エリスロマイシン耐性あるいはカナマイシン耐性のいずれかとなる。そこで、形質転換体をエリスロマシンおよびカナマイシンの両薬剤を含む寒天培地上で選抜することにより、両者が結合したヘテロダイマープラスミドｐＹＳ１６（図４のＣ）を持つ大腸菌のみが選択的に得られることとなる。次に、構築されたヘテロダイマープラスミドを他の制限酵素Ａｓｃ Ｉで切断し、再環状化し（図４のＣ）、大腸菌に形質転換し、エリスロマイシンだけを含有する寒天培地で形質転換体を選抜することにより、目的とする発現ベクターｐＹＳ１８（図４のＤ）を得ることが可能となる。
【００１１】
上記へテロダイマー法に用いたクローニングプラスミドｐＹＳ１４は、図２に示すように、上記した抗体分子ｓｃＦｖをコードする遺伝子Ｄ３を有するプラスミドｐＣＡＮＴＡＢ−Ｄ３（図２のＢ）から構築することができる。即ち、クローニングプラスミドであるｐＨＤ１０Ｅ（図２のＡ）をＢａｍ ＨＩおよびＰｓｔ Ｉにて切断し、これに、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のα−アミラーゼ遺伝子の５’側領域のＢａｍ ＨＩ−Ｐｓｔ Ｉ断片（図２のＢ、１．３ｋｂ）（プロモーター領域、ＳＤ領域およびシグナル領域を含む）を導入する。次いで、抗体分子ｓｃＦｖをコードする遺伝子Ｄ３をｐＣＡＮＴＡＢ−Ｄ３よりＨｉｎｄ ＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片として回収し、これをクローン化し、ＰＣＲの鋳型となるプラスミドｐＹＳ１２（図２のＤ）を得る。次いで、抗体分子ｓｃＦｖをコードする遺伝子Ｄ３とα−アミラーゼ遺伝子のシグナル領域とが、正しい読み取り枠で連結するようにプライマーを設計してＰＣＲを実施することにより、目的とするクローニングプラスミドｐＹＳ１４（図２のＥ）が得られる。
【００１２】
クローニングプラスミドｐＹＳ１４を構築する際に原型プラスミドとして用いたクローニングプラスミドであるｐＨＤ１０Ｅ並びに上記へテロダイマー法に用いたドナープラスミドｐＨＤ１７Ｋは、図１のＡおよびＢに示した方法により構築できる。即ち、プラスミドｐＲｅｓＫｍＮｏｔ１０Ａｓｃ（図１のＡ１）のマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）をＢｇｌ ＩＩおよびＢａｍ ＨＩにて切断し、ｐＵＢ１１０の複製領域ｐＵＢ１１０ ｒｅｐ（図１のＡ２）を導入する。得られるプラスミドを更にＢａｍ ＨＩおよびＢｃｌ Ｉにて切断後、ｐＵＢ１１０の複製領域のマイナスオリジン領域（ＭＯ断片、図１のＡ３）を導入し、ドナープラスミドｐＨＤ１７Ｋを構築することができる。
次に、クローニングプラスミドｐＹＳ１４を構築する際に原型プラスミドとして用いたクローニングプラスミドであるｐＨＤ１０Ｅは、図１のＢに示した方法により構築できる。即ち、プラスミドｐＲｅｓＫｍＮｏｔｌ０Ａｓｃ（図１のＡ１）をＢｇｌ Ｉ ＩおよびＢｃｌＩで切断し、そのままリガーゼ反応を行うことによりＭＣＳ構造だけを取り除いたプラスミドｐＲｅｓＫｍＮｏｔＡｓｃ（図１のＢ１）を得る。このプラスミドに両端がＮｏｔ ＩサイトとなったＭＣＳを導入し、中間体であるプラスミドｐＲｅｓＫｍＮｏｔ１０ＮｏｔＡｓｃ（図１のＢ２）を得る。この中間体およびもう１つのプラスミドであるｐＲｅｓＥｍＰｖｕ１０（図１のＢ３）の両者をＢａｍ ＨＩおよびＢｓｔ ＢＩで切断し、それぞれより大断片および小断片を得て、リガーゼ反応後大腸菌に形質転換し、目的とするクローニングプラスミドであるｐＨＤ１０Ｅ（図１のＢ４）を得ることができる。
【００１３】
以上に詳細に説明した方法により、本発明の遺伝子工学的製造法において用いる、抗体分子をコードする遺伝子が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ菌にて機能し得る複製領域、プローモーター領域、ＳＤ領域およびシグナル領域とともに発現可能なように配置された発現ベクターを構築することがでる。かくして構築された発現ベクターにてＢａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ菌を形質転換し、得られる形質転換体を培養し、次いで培養液中に分泌された抗体分子を回収することにより、本発明で目的とする抗体分子を大量に効率良く製造することができる。
宿主として用いるＢａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ菌としては、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ ＨＰＤ３１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８７）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ ４７（ＦＥＲＭ Ｐ−７２２）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ Ｈ１０２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８７）などが挙げられる。なかでも、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ ＨＰＤ３１が好ましい。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ菌の形質転換法としては、公知のいずれの方法でもよく、例えば、高橋らの方法（Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， ｖｏｌ．１５６， １１３０， １９８３）、高木らの方法（Ａｇｒｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ｖｏｌ．５３， ３０９９， １９８９）、鵜高らの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ｖｏｌ．２１７， ２３， １９９３）などが挙げられる。得られる形質転換体の培養方法も、公知のいずれの方法でもよい。例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ ＨＰＤ３１を用いた場合には、ＴＨＢ培地で３０℃程度で数日間培養を行なう。培養後に、例えば遠心分離、濾過などの公知の方法で菌体と培養液とを分離し、培養液を、例えば塩析、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーなどの公知の精製法を組み合わせることによって、目的とする抗体分子を大量に得ることができる。
かくして得られる抗体分子は、ＧＴＦ活性を強力に抑制することができる。ＧＴＦは、ショ糖を基質として、これを分解してグルコースとフルクトースとした後、グルコースを重合させてグルカンを生成する。本発明の抗体分子は、ショ糖をグルコースとフルクトースとに分解するシュクラーゼ活性を特に強力に抑制することができる。
【００１４】
【実施例】
以下、本発明を、実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例によって何ら限定されるものではない。
実施例１
抗体分子 ｓｃＦｖ をコードする遺伝子の構築
Ｋａｚｕｏ Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ６１， ３２３−３２８， （１９９３）に記載の方法に従い、Ｓ． ｍｕｔａｎｓ由来のＧＴＦ−Ｉ活性を抑制するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作成した。
先ずＳ． ｍｕｔａｎｓ ＰＳ１４株（Ｋａｚｕｏ Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ６１， ３２３−３２８，（１９９３）より精製ＧＴＦ−Ｉタンパクを得、これを実験動物であるマウスに免役し、脾臓を摘出後、ミエローマ細胞と融合させることにより不死化細胞株を作製した。次に、ＥＬＩＳＡおよび限界希釈などの方法により、抗原として用いたＧＴＦ−Ｉタンパクを認識するモノクローナル抗体を分泌する株をスクリーニングし、陽性ハイブリドーマＰ１３６（Ｋａｚｕｏ Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ６１， ３２３−３２８， （１９９３））を得た。本ハイブリドーマからは、Ｓ． ｍｕｔａｎｓ由来のＧＴＦ−Ｉ活性を抑制するモノクローナル抗体が分泌生産される。
続いて、Ｙａｓｕｋｏ Ｓｈｉｂａｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ６６， ２２０７−２２１２， １９９８に記載の方法に従って、Ｓ． ｍｕｔａｎｓ ＧＴＦ−Ｉ活性を抑制するｓｃＦｖをコードする遺伝子の調製を、市販キットマウスｓｃＦｖモジュール／組換えファージ抗体システム（ファルマシアバイオテック社製）の手順に従い実施した。本ハイブリドーマから、酸グアニジニウムチオシアネート−フェノール−クロロホルム抽出法により全ｍＲＮＡを抽出した。全ｍＲＮＡを逆転写反応のテンプレートとして用いた。プライム化ファーストストランド反応混合物を用いてファーストストランドｃＤＮＡを合成した。モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖のそれぞれの可変領域をコードするｃＤＮＡを、マウスＳｃＦｖモジュール／組換えファージ抗体システム（ファルマシアバイオテック社製）に含まれているプライマー一式を用いて、ＰＣＲにより増幅した。増幅したＤＮＡをアガロースゲル電気泳動により精製して、プライマーを除いた。精製されたＤＮＡの塩基配列を公知のジデオキシ法により決定し、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖のそれぞれの可変領域は、配列表の配列番号１および２にそれぞれ示す塩基配列からなることが明らかになった。
重鎖および軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡを、配列番号３に示すリンカーペプチドをコードするＤＮＡリンカーフラグメントを用いてアッセンブルＰＣＲにより、正しい読み取り枠になるように連結して、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡ断片を調製した。これを付属ｐＣＡＮＴＡＢベクターに導入して、ｓｃＦｖをコードするプラスミドｐＣＡＮＴＡＢ−Ｄ３（図２のＢ）を構築した。ｐＣＡＮＴＡＢ−Ｄ３よりコードされるｓｃＦｖタンパクは、ファージＭ１３のコートタンパクのリーダ配列と融合した型となっている。また、ｐＣＡＮＴＡＢ−Ｄ３は、ペプチドｔａｇ（Ｅ ｔａｇ）をコードする遺伝子を含んでおり、これを利用してｓｃＦｖタンパクの同定を抗Ｅ−ｔａｇ抗体によるウエスタンブロットにより行なうことができる。
【００１５】
実施例２
抗体分子 ｓｃＦｖ の発現ベクター ｐＴＳ１８ のヘテロダイマー法による構築
（１）ドナープラスミド ｐＨＤ１７Ｋ の構築
ヘテロダイマー法のためのプラスミドの構築を行なった。ドナープラスミドを構築するために、原型となるプラスミドｐＲｅｓＫｍＮｏｔ１０Ａｓｃ（図１のＡ１）のマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）をＢｇｌ ＩＩおよびＢａｍ ＨＩにて切断し、ｐＵＢ１１０の複製領域ｐＵＢ１１０ ｒｅｐ（図１のＡ２）を導入した。得られたプラスミドを更にＢａｍ ＨＩおよびＢｃｌ Ｉにて切断後、ｐＵＢ１１０のマイナスオリジン領域（ＭＯ断片、図１のＡ３）を導入し、ドナープラスミドｐＨＤ１７Ｋ（図１のＡ５、３．６ｋｂ）を構築した。なお、原型となるプラスミドｐＲｅｓＫｍＮｏｔ１０Ａｓｃは、Ｔｅｒｕａｋｉ Ｓｈｉｒｏｚａ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ６１， ３７４５−３７５５， （１９９３）に記載された、Ｋｍｒ９０３、ｐ１５ＡｏｒｉおよびＭＣＳとを結合し、さらに市販ＡｓｃＩリンカーを導入することにより構築した。
（２）クローニングプラスミド ｐＨＤ１０Ｅ の構築
次に一般的なクローニングプラスミドの構築のため、原型となるプラスミドｐＲｅｓＫｍＮｏｔ１０Ａｓｃ（図１のＡ１）をＢｇｌ ＩＩおよびＢｃｌ Ｉで切断し、そのままリガーゼ反応を行うことによりＭＣＳ構造だけを取り除いたプラスミドｐＲｅｓＫｍＮｏｔＡｓｃ（図１のＢ１）を得た。このプラスミドに両端がＮｏｔｔ ＩサイトとなったＭＣＳを導入し、中間体であるプラスミドｐＲｅｓＫｍＮｏｔ１０ＮｏｔＡｓｃ（図１のＢ２）を得た。この中間体およびもう１つの原型プラスミドであるｐＲｅｓＥｍＰｖｕ１０（図１のＢ３）の両者をＢａｍＨＩおよびＢｓｔ ＢＩで切断し、それぞれより大断片および小断片を電気泳動にて精製し、リガーゼ反応後大腸菌に形質転換した。その結果、一般的なクローニングプラスミドであるｐＨＤ１０Ｅ（図１の４、１．６ｋｂ）を得た。なお、中間体であるプラスミドｐＲｅｓＫｍＮｏｔ１０ＮｏｔＡｓｃは、上記した原型となるプラスミドプラスミドｐＲｅｓＫｍＮｏｔ１０Ａｓｃに市販ＡｓｃＩリンカーを導入することにより構築した。また、中間体であるプラスミドｐＲｅｓＥｍＰｖｕ１０は、Ｔｅｒｕａｋｉ Ｓｈｉｒｏｚａ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ６１， ３７４５−３７５５， （１９９３）に記載された、Ｅｍｒ、ｐ１５ＡｏｒｉおよびＭＣＳとを結合することにより構築した。
【００１６】
（３）プラスミド ｐＹＳ１４ の構築
クローニングプラスミドであるｐＨＤ１０Ｅ（図２のＡ）をＢａｍ ＨＩおよびＰｓｔ Ｉにて切断し、これに、電気泳動により精製したα−アミラーゼ遺伝子の５’側領域のプロモーター領域、ＳＤ領域およびシグナル領域を含むＢａｍ ＨＩ−Ｐｓｔ Ｉ断片（図２のＣ、１．３ｋｂ）を導入した。つづいて、ｓｃＦｖタンパクをコードする遺伝子Ｄ３を実施例１で構築したｐＣＡＮＴＡＢ−Ｄ３（図２のＢ）より２．０ｋｂのＨｉｎｄ ＩＩＩ−Ｅｃｏ ＲＩ断片として電気泳動にて回収し、数段の操作によりこれをクローン化し、ＰＣＲの鋳型となるプラスミドｐＹＳ１２（図２のＤ）を得た。
（４）α−アミラーゼ遺伝子のシグナル領域と ｓｃＦｖ タンパクをコードする遺伝子 Ｄ３ との読み取り枠を合わせた融合
図３のＡに示したように、α−アミラーゼ遺伝子のシグナルペプチドの長さは３３アミノ酸残基と考えられており、一方、図３のＢに示したように、ｐＣＡＮＴＡＢ−Ｄ３においてコードされるｓｃＦｖタンパクは、ファージＭ１３のコートタンパクのリーダ配列と融合した型となっている。
そこで、α−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＥ）の分泌を司るシグナル領域とｓｃＦｖタンパクをコードする構造遺伝子領域とを読み取り枠を合わせた形態（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）で融合するために、以下の２本のＰＣＲプライマーをデザインした。
【００１７】
ａｍｙＥシグナル領域に対して ５’−ＧＧＣＡＣＴＣＧＣＡＧＣＣＧＣＣＧＧＴＣＣ−３’
構造遺伝子Ｄ３領域に対して ５’−ＡＴＧＧＣＣＣＡＧＧＴＣＣＡＧＣＴＧＣＡＧ−３’
図２のＤに示したプラスミドｐＹＳ１２を鋳型とし、パーキンエルマー９６００を用いてＰＣＲを行った。それぞれのプライマーは図３のＡおよびＢの点線で示した領域に結合する。標的領域の増幅には市販宝酒造のＰＣＲキットを用い、以下の条件を採用した。
１）初期変性；９４℃、３分。
２）３０サイクルの増幅：変性−９４℃、１分；プライマーアニーリング−５５℃、２分；伸長−７２℃、３分。
３）終了時の伸長；７２℃、１０分。
なお、α−アミラーゼ遺伝子側のプライマーの５’末端には、コードされるアミノ酸には影響を与えない、ＴをＣとしたミスマッチを一カ所導入した。その結果、ＰＣＲ産物をリガーゼ反応後、大腸菌に形質転換して得られる、設計通り作られたプラスミドには新規にＮｃｏ Ｉサイトが導入される（図３のＣ）。このような工夫により効率よく形質転換体をスクリーニングし、ｐＹＳ１４（Ｅ、４．４ｋｂ）を得た。塩基配列を確認することにより、本プラスミドは設計通り、両遺伝子が正しくｉｎ−ｆｒａｍｅで融合されており、プロモーター領域、ＳＤ領域およびシグナル領域が正しく機能し得るように導入されていることが確認された。
【００１８】
（５）ヘテロダイマー法による発現ベクター ｐＹＳ１８ の構築
図４に示したように、ヘテロダイマー法によりキメラプラスミドを構築した。少量のクローニングプラスミドｐＹＳ１４（図４のＡ）およびドナープラスミドｐＨＤ１７Ｋ（図４のＢ）をエッペンドルフチューブに混ぜ、８塩基認識制限酵素であるＮｏｔ Ｉにて切断（太い矢印）し、リガーゼ反応後、大腸菌ＪＭ１０９に形質転換した。形質転換体をエリスロマイシンおよびカナマイシンの両薬剤を含む寒天培地上で選抜し、ヘテロダイマープラスミドｐＹＳ１６（図４のＣ、７．９ｋｂ）を得た。次に本プラスミドをもう１つの８塩基認識制限酵素であるＡｓｃ Ｉにて切断、さらに再結合後、大腸菌ＪＭ１０９に形質転換した。形質転換体をエリスロマイシンのみを含有する寒天培地にて選抜することにより、プロモーター領域、ＳＤ領域、シグナル領域およびｓｃＦｖをコードする遺伝子をｓｃＦｖが発現可能なように含むキメラなシャトルプラスミドである、ｐＹＳ１８（図４のＤ、５．９ｋｂ）を得た。
【００１９】
実施例３
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ 菌による抗体分子 ｓｃＦｖ の産生および精製
実施例２で得られた発現ベクターであるキメラシャトルプラスミドｐＹＳ１８をＢａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ ＨＰＤ３１株に形質転換することにより、エリスロマイシン耐性の形質転換体を得た。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ形質転換体は５０ｍｇ／ｌｉｔｅｒのエリスロマイシンを含む、Ｄｉｆｃｏ社製Ｔｏｄｄ Ｈｅｗｉｔｔ Ｂｒｏｔｈ（ＴＨＢ）にて培養した。全ての精製操作は４℃にて行った。ｓｃＦｖタンパクの同定は抗Ｅ−ｔａｇ抗体によるウエスタンブロットに依った。
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ形質転換体を２リットルのＴＨＢ培地に接種し、３０℃３日間激しい撹拌を行いながら培養後、遠心により菌体を除いた。
得られた上澄に対し等量の冷エタノールを加え、生じた不溶性物質を遠心により得た。これを２００ｍｌのバッファーＡ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ ８．０、６Ｍ尿素）に懸濁し、５リットルの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に対して透析を行った。透析終了後、予めバッファーＡにて平衡化しておいたＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（２．５×２５ｃｍ）に通した。カラムをバッファーＡにて十分洗浄後、吸着タンパクを食塩の濃度勾配（０から０．５Ｍ）を含むバッファーＡにて溶出した。抗Ｅ−ｔａｇ抗体による陽性画分を集め、最終濃度が３０％飽和となるように結晶硫安を加えた。このタンパク溶液を予め３０％飽和硫安を含むバッファーＡにて平衡化しておいたブチルトヨバールによる疎水クロマト（０．５×１０ｃｍ）に付した。吸着タンパクは３０から０％飽和硫安のグラジエントにより溶出し、抗Ｅ−ｔａｇ抗体による陽性画分を集めた。本カラム操作を繰り返すことにより、他タンパクの混在しない画分を得、これを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に対して透析を行ない、抗体分子ｓｃＦｖの精製標品を得た。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ形質転換体のＴＨＢ培養液２リットルから１ｍｇの精製標品を得た。
最終精製標品のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットにより、他のタンパク質の混在の無いことが確認された（図５のＡ、Ｂ、レーン３参照）。
【００２０】
実施例４
抗体分子 ｓｃＦｖ の性質
実施例３で得られた精製ｓｃＦｖ標品を用いてＧＴＦ−Ｉ活性の抑制活性を定性的アッセイ法および定量的アッセイ法により測定した。
（１）アッセイ法に用いる ＧＴＦ−Ｉ の調製
ＧＴＦ−Ｉの精製はＫｕｗａｈａｒａ等の方法（Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ６５， １２９０−１２９５， ２００１．）に準じ、以下の様に行った。全ての精製操作は４℃にて行った。ＧＴＦ−Ｉを精製するための菌株は、Ｓ． ｍｕｔａｎｓ ＧＳ５株由来ｇｔｆＢ遺伝子が導入されたＳ． ａｎｇｉｎｏｓｕｓ形質転換体ＫＳＢ８株を使用した（Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ６０， ２８１５−２８２２， １９９３．参照）。本菌株を１００ｍｌのＴＨＢ培地に接種、３７℃、２０時間、嫌気培養を行った。遠心により菌体を除き、得られた上澄に対し等量の−８０℃冷エタノールを加え一夜置いた。生じた不溶性物質を遠心により得、これをバッファーＡ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）に溶解し、同一バッファーで２４時間透析を行った。不溶物を遠心により取り除き、上澄に最終濃度が０．２％となるようにＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を加え、予め０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含むバッファーＡで平衡化したＤＥＡＥ−Ｂｉｏ−Ｇｅｌカラム（１×５０ｃｍ）に付した。カラムを十分洗浄後、吸着タンパクを食塩の濃度勾配（０から０．５Ｍ）を含むバッファーＡにて溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる活性染色などによりＧＴＦ−Ｉ活性を有するフラクションを得、同一樹脂による再クロマト（０．５×２５ｃｍ）をＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００無しで行うことにより、精製ＧＴＦ−Ｉ標品を得た。
【００２１】
（２）抗体分子 ｓｃＦｖ の ＧＴＦ−Ｉ に対する抑制活性の定性的アッセイ法および定量的アッセイ法
抗体分子ｓｃＦｖによるＧＴＦ−Ｉ活性の抑制を定性的アッセイ法および定量的アッセイ法により測定した。
定性的アッセイ法の概略は以下の様である。０．１ユニットの精製ＧＴＦ−Ｉを含む１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．０）溶液に様々な量の精製ｓｃＦｖ（２μｇ、４μｇ、８μｇ、１６μｇ）を加え容量を３００μｌとし、３７℃、１時間置く。これに最終濃度が５０ｍＭとなるショ糖を加え、最終容量を５００μｌとして３７℃、一夜置き、生成した不溶性グルカンを観察する。
定量的アッセイ法は、Ｅｔｏ等の方法（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ， ２７４， １５７９７−１５８０２， １９９９．）に準じてＲｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製のＦ−キットを使用して以下の様に行った。１０ミリユニットの精製ＧＴＦ−Ｉを含む１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．０）溶液に４μｇの精製ｓｃＦｖを加え、容量を２００μｌとする。これを２５℃、１時間置いた後、最終濃度が２．０、４．０、８．０および１．０ｍＭとなる様なショ糖溶液を加え、最終容量を４００μｌとして３７℃、１時間反応させた。Ｆ−キットによる定量は、最終容量を１．５ｍｌとする、説明書の１／２スケールで行うこととした。上記反応溶液の５０μｌを取り、始めにＡＴＰ等を加え、ブランクとしての吸光度３４０ｎｍを読み（Ｅ０）、続いてヘキソキナーゼおよびグルコース６−リン酸脱水素酵素を加え、１０分後に３４０ｎｍの値を読み取った（Ｅ１）。続いてイソメラーゼを加え、さらに１０分後の３４０ｎｍの値を読み取った（Ｅ２）。Ｅ１−Ｅ０が反応溶液中のグルコース量に、また、Ｅ２−（Ｅ１＋Ｅ０）がフルクトース量になる。そして、フルクトース量からグルコース量を引いたものがグルカン量となる。ここで、ブランクの値Ｅ０は実質的にゼロとみなして差し支えないので、Ｅ１をグルコース量に、また、Ｅ２−Ｅ１をフルクトース量とすることができる。
精製ｓｃＦｖ標品を用いてＧＴＦ−Ｉ活性の抑制を定性的アッセイ法により測定した結果を図６に、定量的アッセイ法により測定した結果を図７に示した。図６および７に示すように、いずれの場合も、精製ｓｃＦｖはＧＴＦ−Ｉ活性を抑制することが明らかとなった。図７に示す反応条件では、１０ミリユニットのＧＴＦ−Ｉ酵素のシュークラーゼ活性により生成したグルコースのグルカンへの取り込み率は約７０％であり、４μｇのｓｃＦｖ添加によりその率が５０％前後に抑制されることが明らかとなった。
【００２２】
【発明の効果】
以上に詳細に説明した通り、う蝕の原因菌であるＳ． ｍｕｔａｎｓが産生するＧＦＴに対する抗体の重鎖および軽鎖の可変領域をリンカーを介して連結してなる抗体分子をコードする遺伝子が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ菌にて機能し得る複製領域、プローモーター領域、ＳＤ領域およびシグナル領域とともに発現可能なように配置された発現ベクターを構築し、該発現ベクターにてＢａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ菌を形質転換し、得られる形質転換体を培養することにより、培養液中に分泌された該抗体分子を効率良く大量に得ることができる。また、得られる抗体分子は、ＧＴＦ活性、特にシュクラーゼ活性を強力に抑制することができ、う蝕の治療に有効に使用することができる。
【００２３】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ドナープラスミドｐＨＤ１７ＫおよびクローニングプラスミドｐＨＤ１０Ｅの構築を示す。
【図２】図２は、クローニングプラスミドｐＹＳ１４の構築を示す。
【図３】図３は、α−アミラーゼ遺伝子のシグナル領域と抗体分子ｓｃＦｖをコードする遺伝子とのｉｎ−ｆｒａｍｅ融合を達成するためのデザインを示す。
【図４】図４は、ヘテロダイマー法による発現ベクターｐＹＳ１８の構築を示す。
【図５】図５は、本発明の製造法により得られた抗体分子ｓｃＦｖの電気泳動による分析結果を示す。
【図６】図６は、本発明の製造法により得られた抗体分子ｓｃＦｖのＧＴＦ−Ｉ活性に対する抑制効果を定性的アッセイ法によるアッセイ結果を示す。
【図７】図７は、本発明の製造法により得られた抗体分子ｓｃＦｖのＧＴＦ−Ｉ活性に対する抑制効果を定量的アッセイ法によるアッセイ結果を示す。
Claims (6)
- う蝕の原因菌であるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓが産生するグリコシルトランスフェラーゼに対する抗体分子の遺伝子工学的製造法であって、
該グリコシルトランスフェラーゼに対する抗体の重鎖および軽鎖の可変領域をリンカーを介して連結してなる抗体分子をコードする遺伝子が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ菌にて機能し得る複製領域、プローモーター領域、ＳＤ領域およびシグナル領域とともに発現可能なように配置された発現ベクターを構築し、該発現ベクターにてＢａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ菌を形質転換し、得られる形質転換体を培養し、次いで培養液中に分泌された該抗体分子を回収することからなることを特徴とする、
う蝕の原因菌であるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓが産生するグリコシルトランスフェラーゼに対する抗体分子の遺伝子工学的製造法。 - 抗体分子をコードする遺伝子が、配列表の配列番号１および２のそれぞれのアミノ酸配列からなる、グリコシルトランスフェラーゼに対する抗体の重鎖および軽鎖の可変領域をそれぞれコードする遺伝子、または配列番号１および２のアミノ酸配列において１個もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換および／または付加したアミノ酸配列を有する蛋白質であって配列番号１および２に示すアミノ酸配列からなる重鎖および軽鎖の可変領域のそれぞれと同様の機能を有する蛋白質をそれぞれコードする遺伝子を、リンカーをコードする遺伝子を介して連結したものである請求項１の遺伝子工学的製造法。
- Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ菌にて機能し得る複製領域が、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来ｐＵＢ１１０の複製領域であり、プローモーター領域、ＳＤ領域およびシグナル領域が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のα−アミラーゼ遺伝子のプローモーター領域、ＳＤ領域およびシグナル領域である請求項１または２の遺伝子工学的製造法。
- 発現ベクターを、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来ｐＵＢ１１０の複製領域を有するドナープラスミドと、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のα−アミラーゼ遺伝子のプローモーター領域、ＳＤ領域およびシグナル領域並びに抗体分子をコードする遺伝子を有するクローニングプラスミドとを用いてヘテロダイマー法により構築する請求項１から３のいずれかに記載の遺伝子工学的製造法。
- う蝕の原因菌であるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓが産生するグリコシルトランスフェラーゼに対する抗体の重鎖および軽鎖の可変領域をリンカーを介して連結してなる抗体分子をコードする遺伝子、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来ｐＵＢ１１０の複製領域、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のα−アミラーゼ遺伝子のプローモーター領域、ＳＤ領域およびシグナル領域を含む、該抗体分子を発現するための発現ベクター。
- 請求項１から４のいずれかの遺伝子工学的製造法によって製造される、う蝕の原因菌であるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓが産生するグリコシルトランスフェラーゼに対する抗体分子。
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| WO2010002862A3 (en) * | 2008-07-01 | 2010-05-27 | Aveo Pharmaceuticals, Inc. | Fibroblast growth factor receptor 3 (fgfr3) binding proteins |
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